Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Очистка та характеристика гiалуронат/гепаринзв'язуючого лектину з головного мозку

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Очистка та характеристика гiалуронат/гепаринзв'язуючого лектину з головного мозку"

на правах рукопису

ДОЛЖЕНКО Михайло Іванович

ОЧИСТКА ТА ХАРАКТЕРИСТИКА ГІАЛУРОНАТ/ГЕПАЯИНЗВ ’ЯЗУЮЧОГО ЛЕКТИНУ

З ГОЛОВНОГО МОЗКУ

03.0o.04 - Біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового оіупеня кандидата біологічних наук

Дніпропетровськ ' 1992

Робота виконана на кафедрі біофізики та біохімії Дніпропетровського державного університету.

Наукові керівники - доктор біологічних наук, професор ~ Березі» Володимир Олександрович.

- кандидат біологічних наук ’ Лепьохін Євген Олекоійович.

Офіційні опоненти - доктор біологічних наук

Стародуб Микола Федорович.

- кандидат біологічних наук,

- старшин науковий співробітник

' . Назаренко Володимир Іванович.

Провідна установа - Львовське відділення інституту

біохімії АН України.

, Захист відбудеться -'1993 року у ¿£ годин

на засіданні спеціалізованої вченої ради К 053.24.06 по присудженню наукового ступеня кандидата біологічних наук при Діїіпгхтетровськсму державному університеті за адресою: 320626, и.Дніпропетровськ, ГСП-10, пр.Гагаріна, 72, університет, біолого-екологічішй факультет, корп. 17, ауд. 407.

З дисертаціє» ножна ознайомитись у бібліотеці Дніпропетровського державного університету.

. Автореферат розісланий грудня 1992 року; ,

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

ВСТУП

¿КїуальїШаь____паоблілн. Лектин-рецепторна взаємодія

привертає до себе увагу не тільки із-за специфічності та широкого розповсюдження у живій природі, але і як' така, що забезпечує взаємодію у системі "лектин-рецептор" при розвитку важливих біологічних процесів (гісто- та морфогенпзу, заплідненгі, канцерогенезу і т.п.). Докладне вивчення цих взаємодій може поширити розумігіг.і тонких молекулярних

механізмів, які забезпечують віщевазваяі процеси.

Лектини та відповідні їм глікокон’югати виявляються практично у всіх органах і ї:-анинах тварин - у серці,

печїнці, легенях, клітинах нервової . системи, плаценті,

статевих клітинах та інш. .

Взаємодія ендогенних лектинів з їх рецепторам!

відбувається у всі періоди онтогенезу, що забезпечує спе іфічну взаємодію клітин організму. Лектин-рецепторні системи забезпечують адгезію ха зливання сперматозоїда з яйцеклітиною. Такі ж системи Сопуть участь ’ регул«!і"

адгезії та міграції клітин у процесі ембріогенезу! п дорослому організмі вони забезпечують утворювання

міжклітинних контактів, ендоцитоз, імунологічні реакції, найпростіші процеси розпізнавання по тшіу "свіЛ - чузшП".

У рамках досить великого класу вуглеводзв’язуючих білків тварин зиачнкЯ інтерес викликають декілька груп лектинів, виявлених досить недавно, які у теперішній час активно досліджуються. До їх кола входять гіалуронат-

зв’язуючі та гепаринзв'язуючі лектнші. Встановлено, що

гіадуронатзв'язуючі лектини беруть участь у процесах диференціації, міграції ґа проліферації клітин (у тому числі - міграції і проліферації нервових клітин у ході ембріогенезу), адгезії клітин по типу "клітина - клітина" та "клітина - субстрат", у процесі запалення. Висунено також гіпотезу про можливу участь цих лектинів у процесі

інгібування аксонального росту.

Дослідження гепаринзв’язуючих лектинів тварин та людини привертає до себе увагу напередусе • у зв'яжу з можливістю з’яоування -молекулярного механізму > надзвичайно широкого ; г^ектру дії иа клітини тварин їх специфічного

ліганду - гепарину, який мас здатність стимулювати або х інгібувати проліферацію клітин, деякі ферменти; гальмувати Фагоцитоз та інше, Названу групу лектинів виявлено і у мозку ссавців, де, як вважають, вони беруть участь у стимулюванні міграції та диференціації нервових клітин. Однак, детальні механізми вищеописаних процесів, як і конкретна роль вуглеводзв’язуючих білків до теперішнього часу ще невідомі.

Мата представленої роботи , була у очистці та характеристиці гіалуронат/гепаринзв’язуючого лектину з головного мозку людини. При виконанні цієї роботи було поставлено такі' завдання: •

1.Очистити гіалуронат/гепаринзв'язуючий лектин з екстракту мозку людини. •

2.Дати Фізико-хімічну та руглеводзв’язуючу характеристику властивостям лектину з головного мозку.

З.Одоїжатч специфічну антисироватку проти лектину з головного мозку. .

4.З’ясувати поліпептидний склад і регіональний розподіл гіалуронат/гепаринзв’язуючого лектину У різних відділах мозку людини та щура, а також його тканинну та видову специфічність, . ' ■

5.Проаналізували можлииість використання кількісного ' визначення різних форм високомолекулярного гіалуронат/ гепаринзв’язуючого лектину (ВГЛ) у тканинах як діагностичного тесту при деяких патологічних процесах.

Наукова новітність тп практичне значення. Вперше одержано дані про поліпептидний склад, фізико-хінічні та вуглеводзв’язуюч) властивості гіалуронат/гепаринзв'язуючого лектину з мозку. людини', одержано специфічну антисироватку проти даного лектину; за допомогою антисироватки встановлено -тканино/видонеспецнфічність ВГЛ; вперше проаналізовано полі-пептндний склад розчинної, асоційованої з мембранами та цитоскелетноі форм Гіалуронат/гепаринзв’•язуючого лектину у різних органах та тканинах людини і щура, вивчено регіональний розподіл даних форм лектину у головному мозку людини 'га щура. Вперше проаналізовано можливість використання кількісного визначання різних форм ВГЛ у тканинах ‘як діагностичного тесту при деяких патологічних явищах (у перещеплюваних нейрогліальних ' пухлинах головного мозку

- з - ,

щурів, при гіпоксії плоду). Виявлено, ко при ГІПОКСІЇ плоду у плаценті людини зменшует -СЯ вміст розчинної форм:! лектину. Розроблено оригінальний метод аналізу лектиновоі активності, який може знайти застосування у лабораторній практиці.

Апьобаиія роботи. Матеріали дисертації' Суло представлено на VI Українському біохімічному з'їзді (Квїз, 1992), ХІТІ конгресі Міжнародного товариства лектннологіг-(Берлін, 1991), XXV конференці'і ',/Вропейськоі -асоціації нейробіологів (Кембридж, 1991). , .

. На захист виносяться наступні полог.с?іггя:

1. Особливості поліпептидного су іду та'регіональний розпо-

діл різних форм гіалуронат/гепарин'зв’язуючого^ лектину у тканинах та органах ,(насамперед у головному мозку) людини та щура. ■ '

2. Характеристика фізико-хімічних та вуглеводзв ’язуточия

властивостей даного лектину. ■

3. Аналіз вмісту різних форм лекіину у тканинах при деяких патологічних змінах (у нейрогліальких пухлинах гґ^овного мозку щура, у плаценті людини при гіпоксії плоду).

Структура та обсяг лиоертанійноі роботи. Дисертація Містить 6 розділів: 1 - вступ; 2 - огляд літератури; 3 -матеріали та методи дослідження; 4 - результати та 'і;:

обговорення; 5 - підсумковий розділ; 6 - висновки. Робота займає 125 сторінок машинописного тексту, проілюстрована і о таблицями та 21 малюнком. Список літератури містить 140 найменувань російською та англійською мовами.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Під час виділення та очистки ВГЛ використовувався мозок людини - аутопсійний матеріал жертв нещасних випадків через 8-12 год після загибелі. Під час дослідження тканино-та органоспецифічності лектину. використовувались- різні відділи мозку (мозочок, гіпокамп, та ін.), органи щурів лінії Вістар вагою 120 -.150 г, а також різні відділи мозку та органи людини (аутопсійний матеріал).

Взірці перевивав»"'X нейрогліальних пухлі: і головного мозку щупір були люб’язно надані ст.н.о. !ІДІ морфології людини, к.б.н. Халан^ким О.С. (Москве).' Кл,..ічний матеріал

І

для дослідження вмісту ВГЛ в плаценті людини люб'язно наданий к.м.н., доцентом Потаповим В.Н.(каф.акушерства та гінекології ДМІ, Дніпропетровськ).

10 г тканини гомогенізують у 50 ші буферу А:

. 25 ММ ТРИСОВИЙ буфер, pH-7,0 .

1 мМ ЕДТА '

ч Ш z-маркаптоетанолу 1 Ш FHSP, .

. що містить в собі 0,15 М КаСі та 0,1 М лактозу екстракт тканини | збагачений \-----1 |

білками, І si І----1 зо оооа 1 год

розчинними у -—і |—і—і

Фізіологічних І рі І ♦ іоо мл буферу А _

.к»«.:«'-і: • <—і—-J промивка

J зо 000g 40 ХВ.

І Р1 j ♦ 50 МЛ буферу А, 3 2 М НаСІ Та

екстракт тканини 1—|—1 0,1 М лактози

; > гачений Г"" ""І |

білками, І 821-----1 ЗО OOOg' 1 год

розчинними у *....-1 і—і—і

а N NaCl І Г2 І + 100 мл буферу А

1—і—* промивка .

*---1 30 OOOe 40 ХВ.

І Р2 І ■» 60 МЛ буферу АЗ 0,15 М NaCl,

1—1-----1 IX Тг Х-100

трІ ТОНОВИЙ

екстракт

ткани;;и

І

І S3|-------( зо 000g 1,5 ГОД

і РЗ І ♦ 100 мл буферу А 1—і—1 • промивка

30 000g 40 ХВ.

екстракт тканини | РЗ )+ 60. мл буфера А з 4М сечовини

збагачений 1—*—1 інкубація - ніч, +4°С

білками, |~—і {

розчинними у І 541--------------------------------1 30 0008 2 ГОД

4 М сечовини —І |—І 1 ,

ім| .

Мал. 1. Схема одержання екстрактів із головного мозку та інших тканин а органів людини та щурів, 8 - супернатант, . Р - осадок. , " ,

- ------- - 5 - ..... • •

Специфічну ангисировагку до ВГЛ отримали шляхом імунізації кролів городи "білиЯ велетень" очищеним препаратом ВГЛ. Контроль ' специфічності одержаної антисироватки провадився імуноблотінгом.

Визначання лектиновоі активності провадилося методом гемаглютинації та спеціально розробленим методом твердофазного ферментно-вуглеводного аналізу (ELCSA - Епгуа. Linked Carbohjrdrate-Sorbent Aasajj', ЯКИЙ базується На використанні кон’югованого з ферментом вуглеводе. Методом elcsa досліджувалась також вуглеводна специфічнїсть ВГЛ.

. Аналіз вмісту розчинної, асоційованої ■ а мембранами та цитоскелетної форм гір^уронат/гепаринзв'язуючого лектину у різних органах людини та цура Проводився за допомогою' імуно-ферментного аналізу. ПоліпептидниП склад цих- форм лектину визначався sa допомого» іму’облотінгу. Схема одержання екстрактів Із різних тканин людини та щурів зображена на мал. і. Білок у досліджуваних зразках визначався за методом Бредфорд. '

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Очистка виоокомолйкуляпного гіалуронат/гвпаоинзв’язу-ючого лвктиііу. На першому етапі очистки ВГЛ з екстракту мозку людини S4 (див.мал.1) застосовувалась афінна хромаг тографія на гепарин-агароз і (Fluka). Зв’язування ВГЛ з сорбентом проводилось у 0,05 М нитратному буфері, рН-3,5, який вміаіував 2 М NaCl, 4 м сечовини. Елюція пре одилась 0,2 М цитратним буфером, - 6,0, який вміщував б М сечовини. Профіль хроматографії на гепарин-агарозі зображено ка мал.2. Увесь білок, який зв'язався з сорбентом виходить у ХОДІ елюції ’ ВИГЛЯДІ одного ЧІТКОГО ІІКУі що може бути пояснено тим, то використовувалися досить жорстк і умови нанесення білкового екстракту на колонку. В таких умовах більшість відомих гепариизв’язуючих білків (фібронектин, фактори росту та ін.) не мають можливості зв'язуватись з в: леводом. Білки ж, що зв’язалися з сорбентом, можливо, мали близькі констант», асоціації, що викликал« необхідність застосував, і це одного етапу у процеоі ^тшотки ВГЛ. '

. - 8 - .

За допомогою методу еьсба визначено вуглеводну специфічність ВГЛ з головного мозку. Отримані дані наведені у табл. 1., Найбільшу здатність зв’язувати вуглеводи ВГЛ виявляє щодо гіалуронової кислоти, гепарину та ы-ацетил-о-галактозаміну, що може - бути пояснено участю у процесі зв'язування лектином вуглеводів їх и-ацетиламіногруп у другого атома вуглецю піранозного (гексозного)'кола.

Таблиця 1. Вуглеводна специфічність ВГЛ.

Концентрація, що викликає бох Вуглевод насичення вуглеводзв’язу очих . центрів ВГЛ

Араб іногалактан 1,17 ± 0,188 *

Гепарин 0,212 ± 0,033 X

Гіалуронова кислота 0,027 ± 0,017 X

Маноза 1,33 ± 0,024 М

ь-рамноза 0,205 ± 0,147 М

ь'-ацетил-о-галактозамін 0,013 ± 0,004 М .

Рафіноза '

' Хитозан

Целобіоза не викликає .

Лактоза SO X насичення

Галактоза

Метил-а -р-манопиранозид

р-Мелецитоза

Структура вуглеводзв’язуючого центру ВГЛ мас доситІ. велику стійкість до дії хаотропних агентів та детергентів! Взаємодія лектина з гепарином проходить навіть у розчинах« ию містять 3-4 М сечовини та 2-3 М NaCl (див. мал.б та 6).

Оброблення ВГЛ нейонними детергентами (Tween, Triton, і BridJ-35 та ін.) суттєво не впливало на структуру вуглевод-зв’язупчого центру ВГЛ. В той же час оброблення йонними детергентами (sds та цвітергентом 3-14) приводило практично до повно': втрати здатності "зв’язувати вуглеводи. Це може відбуватись через істотне порушення просторової структури лектину Понними дергентами, і, відповідно, порушення вуглеводзв’язу-'ючих центрів ВГЛ, котрі, певно, мають тривимірну структуру.

_ Процес зв'язування гепарину ВГЛ має позитивний кооперативний характер, що свідчить з наведеного графіку Скетчар-

да (мал.7). 3 поданного графіку (лінія 1) видно, що по мірі зростання кількості зв’язаного лектином гепарину, вуглеводзв *язуюча здатність ВГЛ посилюється. Це і^оже відбуватися за рахунок зростання константи асоціації комплексу ВГЛ-гепарин, або ж за рахунок існування в структурі лектину двох типів вуглеводзв’язуючих центрів: "відчинених", які завжди здатні зв’язувати вуглевод, та "прихованих", які переходять до активного стану внаслідок конформаційних змін у структурі ВГЛ, викликаних зв’язуванням молекул вуглеводу з "відчиненими" центрами. Після переходу вуглеводзв’язуючих нтрів ВГЛ до' активного стану кінетика процесу зв’язування вуглеводів ВГЛ має лінійний характер і можливе обчислення К0 комплексу лектин-гепарин, котра дорівнює бхіо-7 м/л (мал. 7, лінія’2). При цьому мається на увазі, що визначена таким чином к0 має* дещо умовний характер (для "активного"

мал, .а,і Вплив різних

концентрацій сечовини на реакцію взаємодії "ВГЛ - гепарин".

^ .

Majb.fi.-

Вплив різиих концентрацій сечовини та N»01 на реакцію взаємодії 'іЗГЛ - •

гепарин"

0 12 ’ _

М НаСІ ’ '

Беручи до уваги особливості вуглеводзв’язуючих вла-

конформаційного стану ВГЛ). 00492

- 12 - , з сірої речовини великих півкуль, мозку щура - теж у екстракті 82 з тканини довгастого мозку (вуеіепсерЬаіоп).

Таблиця 2. Вміот ВГЛ у мозку людини а]

іВіДДІЛИ * * S 1 ’ S 2 8 4

Substantia grisea Substantia alba Cerebellua Chiasaa opticum Mesencencephalon 21,14 * 7,50 24,81 * 0,60 26,28 * 9,68 30,70 * 0,63 J.93 ±1,10 46,22 * 10,97 29*23 * 6,06 21,72.* 4,64 44,66 * 11,80 48,94 * C,46 12,73 * 5,32 25,07 * 6,46 10,89 * 0,72 16,51 * 3,69 20,34 ± 4,87

І

і

і і

Таблиця Зі Вміст ВГЛ у мозку щура

‘________________________________________________________________>

ВІДДІЛИ SI S2 S4

8ubstantia grisea 24,32*6,46 36,09*4,81 6,176*2)44

Substantia aJba 26,06±6,68 36,67*7,98 6,63 *2,61

Cerebellum 26,08*5,25 26,97*6,93 6,70 *0,29

Hippocampus 19,72*2,84 21,28*0,05 6,89 *3,2?

Thalamus dorsalis 33,48*6,64 31,98*3,34 4,34 *0,26

Myelencephalon 32,99*4,38 37,52*10,6 6,97 *2,80

Pons 1 24,93*7,26 21,11*8,26 17,92*6,17

Bulbi olfactorii 18,69*6,39. 31,92*3,37 6,96 ±2,74

Поліпептидний склад лектину у різних гідцілах мозку які' с.:юдини, так і щура е однаковим Розчинна форма ВГЛ 8 різних відділів мозку людини складається з 3 поліпептидів з Мг ,

' 7і,2±о,4; б9,і±о,б; 60,2*0,6 кДа. Така ж форма лектину а мозку щура складається з 2 поліпептидів зі Мг 64,1*0,4 кДа та • вз,в*о,5 кДа. •

Мембрано-асоційована форма ВГЛ з різних ілдділів мозку людини складається з 2 поліпептидів (мі- 68,0*0,9 та 61,0*0,3 кДа). 'ііитоскелетна фоома - з 6 поліпептидів з Мг 1?0*1,3|

70,4*0,7і 60*0,4» 56*0,6; 61,3*0,4! 47*0,4кДа (ДИВ. Мал. 4, :

А1 - 2). ■ ' ‘ ;/ . '

- ІЗ -

Регіональний розподіл ВГД у різних органах

За допомогою отримано’! поліклонально'і моноопеш їічної аитисироватки проти ВГЛ з мозку людини було встановлено, що данин лектин не с тканино/видоспецифічним. Він виявляється практично у всіх досліджуваних органах та тканинах людини і щура. На відміну під картини розподілу ВГЛ у мозку де перевалак мембрано-асоціЯовама форма ВГЛ, у органгх як людини, так і щуре переважав розчинна форма .пекттоу (див.табл. 4 ТС. 5). Привертає уяягу досіпь великий 5МІСТ резчшшо'і Шормч лектішу у м’язових тканинах щура (м’язи -56,9, серце - 63,2 мг/г) при повній відсутності -там

цитоскелетноі форми ВГЛ. У людини найбільший вміст як розчинної, так і асоційовано "і з мембранами форм БГЛ виявляється у плаценті. Можливо, це пов’язане з учаотю ВГЛ у процесі активного транспорту через плаценту молекул, що містять у своєму складі вуглеводи.

Таблиця 4. Вміст ВГЛ у органах-щура

Органи ' ві 8 2 54

Серце 63,24 * 3,58 8,60 * 2,78 0

Легені 55,48 * 7,53 5,35 * 2,56 2,64 і 2,44

Печінка 30,84 * 2,05 8,08 * 4,14 3,65 * 1,07

Нирки 52,46 * 4.30 10.27 * 4,44 3,19 * 2,19

М ’ яам 56.94 ± 1.24 3,36 * 2,01 1 0

1 ■

Розчинна форма ВГЛ із різних' органів щура складається З 3 ідентичних ПОЛіПЄПТИДіВ 3 Мг 66,6*1,0; 60,0*0,7;

59,1*0,6 кДа. Але у складі ВГЛ із тканини печінки виявляється ще 2 поліпептиди з Мг 113,6*1,З'та 84,5*0,5 кДа, а із м'язів - з мг 12 1,3*0,7 та 119,2*0,6 кДа. .

У екстракті ві із різний органів людини специфічна антисироватка взаємодіє з такими поліпептидами: печінки - з 5 поліпептидами (Мг 98,2*0,5; 88,1*1,0! 65,3±0,9; 58,6*0,4;

57,о±о,5 кДа), легенів - з і поліпептидом з мг 62,5*1,7 кДа, серці -з Мг 64,7*1,3 кДа, нирках - з мг 66,4*1,2 кДа.

Для всіх досліджених органів щура, а такса серця, печінки та плаценти людини спостерігається так«

• - 14 - .

закономірність розподілу ВГЛ: вміст розчинної форми ВГЛ {Нльеглй,. ніж вміст асоційованої з мембранами форми, а останьої - більший, ніг цитоскелетної форми лектина.

Таблиця б. Вміст ВГЛ у органах людини.

Органи* * S1 ’ SZ S4

Серце Легені Печінка Нирки Плацента 43,09’ ± ¿2,80 18.24 ± 6,61 67,85 ± 17,14 29.25 ± 14,76 96,96 3,48 34,24 і 9,30 20,21 і 4,17 2Ь,05 і 8,48 52,09 і 14,16 60,66 ± 9.0«5 3,35 і 0,54 20,011 7,30 11,94± 0.35 5,82 1 1,45 5,40 Jt 0,86

Таблиця 6, Вміст ВГЛ у плаценті людини

. * ■ .

S1 S2 S4

Норма . Гіпоксия 96,9613,48 _ 68,3517,36 60,6619,06 73,8718,67 5,4010.86 4,0411,22

У зв'язку з можливою участю ВГЛ у системі транспорту глікокон'югатів являло інтерес ДОСЛІДИТИ вміст лектину у плаценті при порушенні живлення плоду. Було проаналізовано екстракти 01/4 одержані із тканини плаценти жінок, які мали Симптоми гіпоксії плоду. Отрш/ ні дані відображено у таблиці 6. із наведених даних можна побачити, вю при гипоксі'і спостерігається істотне, статистично достовірне зниження вмісту розчинної форми ВГЛ {68 , 35±7 ,36 МГ/Г ПРОТИ 9б,96іЗ,48 у нормі). У той же час для інших Ф рм лектину суттєвих змін

не ВИЯВЛЯЄТЬСЯ. МОЖЛИВО, це СВІДЧИТЬ |‘ Гфо ВІДМІННІ

функціональні ролі різних форм ВГЛ. Аналіз їх поліпептидного складу0 виявив, иіо розчинна форма ВГЛ ¡представлена 2 поліпептидами з Мг 144,5±з,8 та 70,8±0,в кДа, асоційована з мембранами - 1 поліпептидом з Иг 70,в±0,6 кДа, цитоскелетна-. з иг 68,5*2,5 кДа. Напевно, що власне високомолекулярний Я‘>дш»гвтижгид з Иг 144,2 кЛ - може бути активним компонентом і,.'>аисге«ііг»-.тїійяш0рту /глік'ііс"іі’игиітів у плаценті.

. Дослідження вмісту ВГЛ у пухлинах викликало інтерес у зв'язку з участю лектин-вуглеводних взаємодій у процесі онкогенезу (О.Яои£оп, 1992; А.Паг, 1987).

На вміст ,ВГЛ аналізовано гліоми головного мозку щурів Ю1/8 (гліобластома), ю-20-4 та 10-17-2 (анапластичні астроцитомі!) та невриноми 10-13-3 (анапластична не^ринома) і НГУК-1. Визначення вмісту лектішу у пухлинах здійснюплось (ФА. Привертає увагу істотне зменшення вмісту розчинної та мембрано-асоційованої форм ВГЛ у всіх пухлинах (від 18-33 мг/г у нормі до 1-25 мг/г у пухлинах для розчинної форм» та від 21-36 мг/г до 1-е мг/г для мембрано-асоційованої. форм ВГЛ). Більше то-о, у цілій низці пухлин зовсім не виявляється цитоскелетна (10-17-2, пасах-22, вік-25 Діб), або мембрано-асоційована (10-17-2, пасаж-17, вік-30 діб) 10-20-4 пасаж-49, вік-23 доби та' ін.) форми лектину, шо зовсім не властиво длл здорового мозку щурів (див.табл.3). Дані* дослідження будуть продовжені, і, якщо для пухлин людини виявляться аналогічні зміни у вмісті ВГЛ можливо застосування визначення вмісту ВГЛ у тканинах при аналізі біопсійного матеріалу хворих з пухлинами головного мозку.

ВИСНОВКИ.

• і., У екстракті мозку людини та щура, збагаченому цитоске- ■ летними білками, методом гемаглютинації виявлено високо-молекулярний гіалуронат/гепаринзв’язуючий лектин (ВГЛ).

2. Лектин виділено та очищено методами афінноі хроматографії на геппріш-агарозі та гель-фільтрації на ЗерЬасгуі Б-ЗОО. За допомогою гель-хроматографії встановлено мол-кулярну масу ВПГ, яка дорівнює 630 кДа. Лектин складається з 6 поліпептидів з Мг 1/0; 70,4; СО,Ч; 56; 51,3 та 47 кДа.

3. Розроблено метод твердофазного ферментно-вуглеводного

аналізу, за допомогою якого вивчено вуглеводзе'язуючі властивості ВГЛ. Найбільшу здатність зв’язуватитвуглеводи ВГЛ виявляє щодо гіалуроновоі кислоти, гепарину та ы-аце-тил-Б-галактозаміну. Процес зв’язування вуглеводів ВГЛ мас, можливо, позитивний кооперативний характер. . •

4. За допомогою отриманої моноспецифічно' антисироваткн проти лектину, виявлено три форми ВГЛ, що знаходяться у екстрактах тканин, збагачених розчинними, асоційованими з мембранами та цитоскелетними білками; встановлено ткани-но/видонеспецифічність лектину; проаналізовано його вміст у різних^органах та тканинах щура 'і людини.

5. За допомогою імуно-ферментного аналізу з використанням антисироватки, отриманої проти ВГЛ з мозку людини, показано, що у плаценті людини при клінічних ознаках гіпоксії плоду зменшується вміст розчинної форми ВГЛ.

6. Виявлено наявність ВГЛ у трансформованих клітинах, ¡іеаро-епітеліального походження, причому у перещеплюваних гліомах та невріномах щурів спостерігається зниження вмісту розчинної та мембрано-асоційованої форм ВГЛ, ііорівнлно з інтактними тканинами мозку.

1.Лепехин Е.А., Должвнко М.И., Березин В. А. Лектины мозга: характеристика, функции, рецепторы//Нейрохимия.- is90,

N 4, С.488-501. •

г.Дотенко М.Г., Лепьохш С.А., Потапов В.О., Берез ли В. О. Високомолекулярний лектиновий комплекс з мозку людини//

VI Украинский биохимический съезд.-1992.- Киев. с.11.

3.DoIehenko И.1., Lepekhin Е.А., Potapov V.A., Berezin V.A, A new Two-Site Method for Determination of Lectin

f Activity: Enzyme-Linked Carbohydrate-Binding Assay ' (ELCBA) // 13th International Lectin Meeting ( Aug. 1991 Berlin).- P.16. .

4. Lepekhin E,A, f Volzhenko M.T,, Potapov V.A.t Berezin V.A,

A Heparin-Binding Lectin Complex (LC 47-66) in Human and Rat Brain// 13th International Lectin Meeting (Aug. 1991, Berlin).- P.31. , ;

5.tepi bin Ш.А., Dolzhenko H.I., Potapov V.AJ, Berezin V.A.

The Proeence of a С., Loskeletal Heparin-Binding t sctin (11CL) in Human and Hat Brain// 14th Annual Meeting of the European N jrosc эпсе Association (Cambridge 8-12 September 1991).- P.26I5 / - ------—

ПРАЦІ, ОПУЕУІІКОВАНІ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

ОЧИСТКА ТА ХАРАКТЕРИСТИКА ГІАЛУРОРАТ /ТЕііАРІШЗВ’ЯЗУВЧОГО ЛЕКТИНУ З ГОЛОВНОГО МОЗКУ

03.00.04 - Біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття ннукового лтупеня кандидата біологічних наук

Підписано до друку/Л/^^Формат 60x84/16. Папер типоі^ґ'-фськнЯ Лрук плосьяий. Уол. печ. я. О. $2 Уч.-лзд.л.

Тираж і СО Заказ М ¿і і ' '

і-чпі''заииц і ■ и-. ПП4, 320625. ГСП, м. Дніпролетровськ-10,

гр,Гагарина, 72. Ротапринт АНУ, 320110, м. Дніпропетровськ, .

{г/;і. Казакова, 4а.