Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Образование и биохимическая характеристика покоящихся форм неспорулирующей бактерии MICROCOCCUS LUTEUS

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Образование и биохимическая характеристика покоящихся форм неспорулирующей бактерии MICROCOCCUS LUTEUS"



, . ^РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н. БАХА РАН

На правах рукописи УДК 579.22 - 861.1

МУКАМОЛОВА ГАЛИНА ВЛАДИМИРОВНА

ОБРАЗОВАНИЕ И БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОКОЯЩИХСЯ ФОРМ НЕСПОРУЛИРУЮЩЕЙ БАКТЕРИИ

Micrococcus luteus

03.00.04 - биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой creneini кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена в группе "Мембраны бактерий и анабиоз" Института биохимии имА.Н.Баха Российской Академии Наук.

Научный руководитель: доктор биологических наук А.С. Капрельянц

Официальные оппоненты: доктор биологических наук , профессор Н.П. Кораблева

доктор биологических наук, профессор Т.В.Коронелли

Ведущая организация: Институт микробиологии Российской Академии Наук

Защита состоится V 'И _1995 года в. /О часос

на заседании специализированного совета (К 002.96.01) по присуждению " ученой степени кандидата наук в Институте биохимии ИМ.А.Н. Баха РАН (117071, Москва, Ленинский пр. 33, корп.2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (117071, Москва, Ленинский пр. 33, корп.1).

Автореферат разослан исо^ 1995 года

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

М.И.Молчанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известно, что микроорганизмы способны гибко адаптироваться к все время изменяющимся условиям окружающей среда (в частности, недостатку питательных компонентов). При этом некоторые из них обладают генетически закрепленной специфической организацией метаболизма, позволяющей существовать при очень низких концентрациях питательных веществ (ток называемые олиготрофи). Клеим другой категории (копиотрофы) при истощении среды обитания способны включэтъ специальные программы переживания неблагоприятных условий. Часть из них образует специализированные структуры (споры к цисты), к<тгорые чрезпц-чанно устойчивы к различным стрессам. До сих пор остается не ясным вопрос об образовании покоящихся форм неспорулирующими бакгсрими. Хорошо исследованы процессы переживания вегетативными бактериями голодания, часто сопровождающиеся переходом клеток в некулыгшвируемое состояние. Однако не доказано, что такой переход обратим, и некультивиру-емые клетки действительно являются покоящимися. Этот вопрос весьма актуален, поскольку многие возбудители опасных заболеваний человека, животных и растений способны переходить в некультивируемое состояние при резком изменении остужающей среды и, следовательно, представлять источник инфекции в окружающей среде. Существенно, что такие клетки могут оказаться не чувствительными к различным антибактериальным веществам. Поэтому чрезвычайно важно исследование механизмов их превращения в активные делящиеся формы.

При проведении данного исследования были поставлены следующие задачи:

Получение клеток АПсгисосск Шеш, обладающих характеристиками покоящихся форм.

Доказательство, что такие клетки являются именно покоящимися формами и в связи с этим разработка специальной процедуры их восстановления -

оживления.

Исследование морфологических, биохимических и физиологических особенностей таких клеток.

Изучение качественного и количественного распределения жизнеспособны: (колониеобразуюхцих), покоящихся и мертвых клеток, а также возможны взаимоотношений между ними.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований установлено, что при длительном культивировании в условиях стационарной фазь клетки неспорулирующей бактерии Micrococcus luteussпереходят в особое состояние, сопровождающееся резко снйженными активностями эндогенной метаболизма и потерей способности образовывать колонии на плотных средах. Некулътивируемые клетки сохраняют интактность, основные клсточньк структуры (нуклеоид, цпм, клеточную стенку) и химические компоненты, хотя содержание белка, липидов и РНК значительно снижено. В таких клетках существенно снижены активности цитоплазматических и мембранных ферментов. Показано, что покоящиеся клетки могут превращаться в активные делящиеся после специальной процедуры их восстановления -оживления. Было обнаружено, что для нормального восстановления покоящихся клеток необходимо добавление в среду оживления некоего фактора (предположительно полипептида), синтезируемого жизнеспособными клетками микрококка в логарифмической фазе развития культуры.

В качестве возможных механизмов действия такого фактора предложено инактивирование некоторых антибактериальных веществ, накапливающихся в процессе оживления некультивируёмых клеток и приводящих к ограничению числа делений клеток, либо снижение чувствительности клеток к таким веществам. Установлено, что популяция голодающих клеток неоднородна и может включать различные группы клеток (колониеобразующие, покоящиеся и нежизнеспособные), причем соотношение этих групп, различное для каждой отдельно взятой культуры, определяет возможность восстановления покоящихся клеток в популяции.

Практическая ценность работы. Результаты данного исследования свидетельствуют, что неспорулирукнцие бактерии способны обратимо переходить в особое покоящееся состояние. Существенной характеристикой таких покоящихся форм является их некультивируемоегь (т.е. неспособность образовы-

вать колонии на плотных средах). Это свойство делает их "невидимыми" при

использовании обычных микробиологических приемов, что является весьма важным для медицинской микробиологии и охраны окружающей среды. Апробация работы. Результаты работы были изложены на 126 конференции Общества оСщей микробиологии (Университет Экзетера, Великобритания, 1993), на VI симпозиуме по биохимиии липидов (Санкт-Петербург, 1994). Дважды материалы исследований были представлены на общеинститутском конкурсе на лучшую работу.

Публикации. По материалам исследования опубликовано 5 работ, 1 работа принята к печати. ~

Структура диссертации. Текст диссертации состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация иллюстрирована 4 таблицами и 34 рисунками. МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали культуры Micrococcus luteus NGMB 13267 (ранее описываемые как штамм Флеминга 2665). Бактерии выращивали аэробно в

колбах Эрленмейера при 30®С. В качестве основной использовали минимальную лактатаую среду следующего состава; NH^Cl - 0,4%, KHjFO^ - 0,4%,

биотин - 0,001%, метионин - 0,002%, тиамин - 0,004%, инозин - 0,05%, 1 мг/л FeS04, 70 мг/л MgS04, 0,02 мг/л CuS04, 0,5 мг/л МпС12 и лакгат 0,5%

(Sigma, USA), рН7,4 (доведенный NaOH). В некоторых экспериментах в эту среду добавляли 0,05% дрожжевого экстракта. Иногда для выращивания использовали богатую среду - мясо-пептонный бульон. Культуру сохраняли и поддерживали t¿a агаровых косяках.

Для исследования поведения клеток в длительной стационарной фазе культуру, достигшую стационара, продолжали перемешивать на качалке 60-90

дней при ЗО^С. Затем культуру хранили при комнатной температуре в стерильных условиях без перемешивания.

Для определения числа колониеобразующих клеток использовали метод серийных разведений и высевов на твердую агаровую среду. Оценку количества жизнеспособных клеток проводили методом конечных разведений. Для - этого клетки из серийных декадных разведений (проведенных в стерильном супернатанте, полученном центрифугированием, фильтрованием и авпркла-

Ч

вированием голодавшей культуры) инокулировали в пробирки (в пятикратных повторносгях), содержащие по 2 мл а) лакгатной среды+0,05% дрожжевого экстракта и б) такой же среды,, разведенной в соотношении 1:1 суперна-тантом, полученным после центрифугирования и фильтрования через бактериальный фильтр с размерами пор 0,22 мкм свежей культуры M.Iuteus в поздней логарифмической фазе (оптическая плотность 2,0-2,5 при 650 нм в 1 см).

Пробирки инкубировали, перемешивая при в течение 3-10 суток. Учет результатов вели с использованием стандартных таблиц. Общее число клеток подсчитывали в камере Горяева.

Для оживления клетки отбирали из колбы и инокулировали в свежую лак-татную среду +0,05% дрожжевого экстракта, инкубировали на качалке при

ЗО^С в течение 48-120 часов. Иногда перед оживлением проводили предобработку культуры пенициллином (0,5 мкг/мл, в течение 12-20 часов).

Для определения антибактериальной активности в процессе оживления 2 7

4А10 -4А10 клеток M.Iuteus из ранней стационарной фазы инокулировали в пробирки (по 2 мл), содержащие либо голодавшие клетки (которые инкубировали в среде оживления соответствующие промежутки времени), либо пропущенную через 0,22 мкм бактериальный фильтр культуральную жидкость.

Пробирки инкубировали с перемешиванием при 30®С в течение 180 часов. Для получения мембранной и цитоплазматической фракций клетки'осаждали центифугированием и промывали переосаждением 50 мМ К^РО^ буфером рН 7,4. Осадок суспендировали в таком же буфере, содержащем 5мМ MgSO^ и инкубировали с лизоцимом :1 мг лизоцима на 1г клеток 30 минут

при

30°С с добавлением нескольких кристаллов ДНКазы. Мембраны осажда-

ли из. суспензии центрифугированием при 22000 g, 30 мин и дважды промывали переосаждением в магний-фосфатном буфере. Цитошгазматическую фракцию использовали для измерений сразу же после осаждения мембран.

Скорость поглощения кислорода клетками и мембранными фрагментами исследовали в полярографической ячейке Шольц-Островского.

Качественную и количественную оценку цитохромного состава проводили по дифференциальным спектрам, которые регистрировали на дифференциальном спектрофотометре Hitachi 557 при комнатной температуре. Содержание цитохромов подсчитывали, используя следующие коэффициенты инстин-

кции (cm~*mM~*): для цитохрома с- 1, для цитохрома Ь-20 и цитохрома а-13.

Активности малат, лаюгат и НАДН-дещдрогеназ в мембранных фракциях определяли спектрофотометрически по восстановлению 2,6-ДХФИФ при 600 нм на спектрофотометре Beckman.

Малат-, лактат-, этанол-зависимое образование НАДН и изоцитрат-зави-симое образование НАДФН определяли флюориметрически при комнатной температуре, используя флюоресцентный спектрофотометр Hitachi MPF-4 (возбуждение 350 нм, испускание > 450 нм). Для определения текучести мембраны клетки окрашивали дифенилгексатриеном (ДФГТ). Анизотропию флюоресцентной поляризации ДФГТ измеряли на флюориметрическом спектрофотометре Hitachi MPF-4 с использованием Perkin Elmer 063-056S поляризаторов. Флюоресцентную анизотропию г подсчитывали по следующей форму-лс: ^раг ^psP/^par^^eP' где !раг и !рег соответствУют флюоресценции при параллельном и перпендикулярном положениях (430 нм) поляризационных анализаторов при возбуждении 348 нм.

Количество ДНК в клетках исследовали по реакции с дифениламином (Burton, 1965). Для определения общего содержания РНК бактериальные клетки лизировали лизоцимом с последующим центрифугированием мембран и диализом супернатанта. РНК определяли в мембранной и цитоплазматиче-ской фракциях по оеакции с орцинолом (Ken, Seraidarian, 1945). Количество белка в мембранных и цитоплазматических фракциях определяли по методу Лоури (Lowry ttal, 1951). Экстракцию липидов проводили путем добавления

к суспензии клеток двойного объема смеси хлороформ/метанол (1:1) (Ansell, Hawthorne, 1954). Полученный после двукратного промывания водой осадок растворяли в смеси хлороформ: метанол 2:1 и наносили на пластинку с силикагелем. Двумерную тонкослойную хроматографию проводили сначала в системе хлороформ:метанол:аммиак 65:35:56, а затем - в системе хлороформ: метанол:вода 6525:4. Для проявления фосфолипидньи. пятен пластинку окрашивали мешибдагом голубым (Dittmer,Lester, 1964). Концентрацию общих липидов в экстрактах определяли при нагревании с I^SO^ (Грибанов, Сергеев, 1975). Концентрации фосфолипидов в экстрактах оценивали по реакции

с Victoria blue R, а содержание отдельных фосфолипидов после извлечения

\

геля соответствующих пятен на силикагельных пластинках и последующего нагревания в присутствии ^SO^. Микроскопию клеток проводили с использованием электронного микроскопа - JEM 100В.

Для изучения распределения клеток в культуре использовали проточный цитометр "Skatron Aigus 100" (Skatron, Ltd., Newmarket, Suffolk, UK). Для определения флюоресценции родамина 123 (Sigma, USA) использовали флюоресцентный блок со следующими характеристиками: возбуждение при 470495 нм, отрезающий фильтруй 510 нм, испускание при 550 нм. Сортировку клеток M.luteus проводили по интенсивности флюоресценции родамина 123, используя проточный цитометр Coulter Epics Elite (Coulter Electronics Ltd., Luton, UK). Источником возбуждения служил аргоновый лазер. При исследовании использовали следующие параметры: возбуждение при 488 нм, испускание при 525 нм (напряжение на фотоумножителе 570 В), малоугловое рассеивание при напряжении на фотоумножителе 400 В (все величины имели логарифмическое усиление). Для повышения точности сортировки использовали только микрокапли с единичными клетками. Скорость сортировки составляла 100 событий в секунду.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ I. Исследование поведения культуры MJuteus в длительной стационарной фазе. После того, как культура Micrococcus luteus достигала стационарной фазы в процессе дальнейшего культивирования общее число клеток, оцененное по

6

счету в камере Горяева после некоторых флюктуаций в начале голодания значительно не изменялось в течение последующих 90 дней (рис.1). Число

жизнеспособных клеток, образующих колонии на агаровых чашках, начинало резко снижаться после 10 дней инкубирования и через 90 дней уменьшалось более чем на 4 порядка. Важно, что количество колониеобразующих клеток практически не зависело от состава используемой среды, и было одинаковым на МПА, агаризсванной лактатной среде без и с добавлением дрожжевого экстракта.

0. 20 40 60 80 _ 100

время голодания, сутки

общее число клеток -Т- количество колониеобразующих клеток

Рис.1. Изменения концентрация колониеобразующих в общего числа клеток в

культуре М.Ьагж при голодании в. условиях длительного инкубирования в стационарной фазе.

Существенной для поведения популяции оказывалась среда выращивания М.Ыеиг. в отличие от выше приведенной минеральной лактатной среды, культивирование клеток на МПБ приводило к быстрому лизису культуры спустя 7 дней после достижения стационарной фазы (рис.2). Добавление к

минимальной лакгатной среде дрожжевого экстракта (0,1%) обнаруживал! нестабильность популяции в течение первых двух месяцев голодания, что вы ражалось в колебаниях оптической платности культуры, соправаждшащихс! лизисом клеток. В дальнейшем в качестве основной использовали минималь ную лакгатную среду.

э

о л §я

н 2

§ X

а о

6) чо

§ К о а

у и

20 40 60

время голодания, сутки

-•- мясо-петгтонный бульон

-О- лактатная среда

-в- лактатная среда+экстракт

Рис.2.Изменения оптической плотности культур МЛШеиа при голодании в условиях длительного инкубирования в стационарной фазе в различных средах.

Очевидно, что длительное инкубирование в стационарной фазе приводило к значительному истощению клеток, и это отражалось на их химическом составе. Действительно, на рисЗ показано, что уже в первые сутки инкубирования довольно резко снижалось содержание белка. При этом мембранные белки были более стабильными в сравнении с цитоплазматическими. Спустя б месяцев инкубирования общее содержание белка, составляло 43%, цитоплазматических белков-40%, а мсмбранных-50%. В противоположность, этому содер-

о

жание ДНК не изменялось на протяжении всего опыта. В начале голодания содержание ДНК было 2,9+ 0,4 фг на клетку, а спустя 6 месяцев оно составляло 2,8+0,5 фг . Количество же РНК значительно уменьшалось в процессе голодания: 15,1 фг на клетку в начале и 8,1 фг через 5 месяцев голодания.

Г I I П|

I I II Н1|

I I 11 I ГЦ

10 100 время голодания, сутки

-О- белок цитоплазмы -О- мембранный белок -О общий белок

1

Рис.3. Изменения содержания цитоплашатичеасого, мембранного и общего белка в клеписах МЛмсиз при голодании в условиях длительного инкубирования в стационарной фазе.

Существенно снижалось в первые 10-20 дней инкубирования и содержание липцдов, конечные концентрации общих липидов и фосфолипидов составляли примерно 50% ст начальных величин (рир.4). Соотношение белокишлид в мембране в начале голодания было 2,8:1, через 65 дней голодания-2,67:1, а спустя б месяцев-3,8:1. Более детальное исследование фосфолкпидного состава обнаружило его значительные изменения в процессе длительного инкубирования в стационарной фазе (рис.5). В клетках, голодавших 10-100

дней, основным фосфолипидным компонентом мембраны становился карди-олипин, тогда как фосфатидилглицерин исчезал практически полностью. В некоторых случаях наблюдалось накопление значительного количества фос-фатидной кислоты при длительном голодании. Следует заметить, что спустя 10 дней после начала голодания в лцпидных экстрактах появлялись лизо-формы фосфолипидов, которые составляли примерно 5-10% от общего количества фосфолипидов. В дальнейшем картина стабилизировалась, и существенных изменений в составе фосфолипидов не наблюдалось. В то же время исследование микровязкости мембраны с использованием зонда ДФГТ обнаружило тенденцию: длительное инкубирование в стационарной фазе приводило к значительному увеличению анизотропии флюоресцентной поляризации зонда этого параметра, т.е. снижению "текучести" мембраны, которая становилась более жесткой и упорядоченной.

Изучение дыхательной цепи голодавших клеток выявило, что уменьшение

16

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 время голодания, дни

Рис.4. Изменения содержания общих лашдов и фосфолипидов в клетках АМШеиз при голодают в условиях длительного культивирования в ешционвр-ной фазе.

дыхательной активности в первые 10 дней связано, очевидно, с потерей субстратов дыхания клетками, а не с ингибированием (деградацией) ферментов электронтранспортной цепи, т.к. мембранные оксидазы (активности которых измеряли в присутствии насыщающих концентраций субстратов) проявляли относительную стабильность в течение этого периода, хотя дальнейшее инкубирование приводило к значительному ингибированию дыхательной цепи. Параллельно с падением дыхательной активности постепенно уменьшалось и число клеток, активно накапливающих проникающий катион родамин 123, т.е. поддерживающих трансмембранную разность потенциалов. Послс 20 дней голодания всего 2-5% клеток проявляли чувствительную к воз-

„ 100

в е

о

о «

3 а

4

к с

ч о ■9<

о о

•е

10 100 время голодания, сутки

-О- кардиолипин -О- фосфэтидилглицерин -□- фосфатидилинозиг -Ш- фосфатидная кислота

Рис. 5.Изменения фосфолхпадного состава клеток М.Ыеиз при голодании в условиях длительного инкубирования в стационарной фазе.

1

действию разобщителя флюоресценцию родамина 123, а через 75 дней-такие клетки отсутствовали в популяции (рис.6). Довольно стабильными были мембранные дегиярогеназы, даже спустя 6 месяцев инкубирования малат- и НАДН-дегидрогеназы сохраняли около 30 и 25% от исходных активностей соответственно. При этом, содержание цитохромов а, Ь, и с составляло от исходных величин 22%, 71% и 64% соответственно. -

время голодания, сутки

-в- эндогенное дыхание 43- % клеток, накапливающих родамин Рис. 6. Изменения активности эндогенного дыхания клеток MJuieus и количества клеток, накапливающих родамин 123, при голодании в условиях длительного инкубирования .в стационарной фазе. Исходная дыхательная активность клеток составляла 150 натомов О/минмг веса cyxjuu Количество клеток, накаплиающих родамин 123, определяли с использованием* проточного цитометра. Напряжение на фотоумножителе составляло 650 В. 8 противоположность мембранным ферментам цитоплазматические дегидро-геназы были менее стабильными, за исключением НАДФ-зависимой изоцитрат-дегидрогеназы, которая и через 6 месяцев голодания сохраняла 26% от исходной активности (рис.7).

время голодания, сутки Рис 7. Изменения активностей некоторых цитоплазматичеасих дегидрогеназ в в клетках МАШею, голодавших в условиях длительного инкубирования в стационарной фазе.

-Электронная микроскопия показала, что в основном клетки, голодавшие в течение 9 месяцев, оставались морфологическими интактными. В отличие от нормальных растущих клеток они обладали значительно утолщенной клеточной стенкой и более плотной цитоплазмой. Очень редко в популяции встречались плазмолизированные и деградированные клетки, не было обнаружено делящихся клеток. Голодавшие клетки имели интактный нуклеоид, иногда более компактный, чем нормальные клетки.

Полученная таким образом популяция интактных клеток, которые с одной стороны, имели значительно сниженный эндогенный метаболизм и были не способны образовывать колонии на агаровых средах, с другой стороны, сохраняли основные жизненноважные структуры и набор химических компонентов, необходимых для нормального функционирования, можно было рассматривать как покоящиеся формы МАШеиз. Однако для окончательного вывода необходимо было доказать, что они могут переходить в активное делящееся состоние. С этой целью нами была разработана специальная процедура восстановления покоящихся клеток в жидкой среде - оживление.

2. Восстановление инкубированных в длительной стационарной фазе клеток а переход их в активное делящееся состояние. Популяция голодавших клеток чаще всего неоднородна и в ней встречается небольшое количество активных клеток, способных образовывать колонии на агаровых средах. Это вносит определенные трудности для исследования восстановления покоящихся клеток в жидкой среде. Поэтому мы разработали несколько подходов, позволяющих исключил» или хотя бы замедлить рост живых клеток в процессе восстановления. Один из них-предобрабопса культуры пенициллином, который действует исключительно на активные делящиеся клетки, вызывая их лизис с последующими отмывкой и инкубированием в специально подобранной среде. Предобработка пенициллином привадила к значительному снижению числа колониеобразующих клеток (на 2-3 порядка в среднем).

На рис.7 изображен типичный эксперимент восстановления клеток," голодавших в течение 3 месяцев. Интересно, что на первом этапе (20 часов инкубирования в среде оживления после предобработки пенициллином) начинало возрастать количество клеток, активно накапливающих родамин 123 (ори том, что число клеток, подсчитываемых в камере Горяева, и калоние-образующих было неизменным). Очевидно, восстановлению способности делиться предшествовало "метаболическое оживление* (восстановление трансмембранной разности потенциалов, дыхательной активности и энергетического метаболизма в целом). Спустя еще 12 часов довольно резко увеличивалось количество клеток, образующих колонии на агаровых чашках, очевидно, за счет восстановления покоящихся клеток, а не роста жизне-способных,поскольку: а) общее число клеток оставалось неизменным; б) увеличение числа колониеобразующих клеток на 5 порядков, происходило' за короткой промежуток времени (10-12 часов), а рост на такой 'среде при времени генерации 2 часа предполагает увеличение числа клеток всего на 2 порядка в течение 12 часов. На 48-50 часах инкубирования наблюдалось увеличение численности популяции (т.е. начинался рост). Следует отметить, что длительность процесса оживления зависела от возраста культуры и качества используемой среды.

-•- общее число клеток

-О- количество колониеобразующих клеток

-О % клеток, накапливающих родамин

Рис.7. Изменения общего числа клеток, концентрации колониеобразующих клеток и количества клеток, накапливающих родамин 123, при оживлении клеток МЛшеи^ голодавших в условиях длительного инкубирования в стационарной фазе (стрелкой указан период предобработки клеток пенициллином).

Восстановление покоящихся клетк в присутствия антибиотиков позволяет полностью'решить проблему критического роста, и оценив количество лизи-рованнных бактерии, можно определить долю клеток, потенциально способных к восстановлению. На рис.8 показано влияние пенициллина на нормальные хлетхи из позднелогарифмической культуры, а также на клетки, голодавшие в течение 3,5 и б месяцев. После 80 часов инкубирования в присутствии пенициллина 99,9% нормальных клеток лизировалось, тоща как в культурах голодавших клеток 30% клеток оставались интактнъгми. Следует отметить, что при инкубировании голодавших клеток в течение первых 22 часов падало

до нуля количество клеток, образовывавших колонии на агаровых средах. И лишь спустя еще несколько часов начинался лизис основной массы клеток. В данном эксперименте, количество клеток, способных к потенциальному восстановлению в присутствии пенициллина составляло 70%. Однако процент лизирующихся клеток при оживлении в присутствии пенициллина зависел от состава среды и от используемой культуры. В целом он колебался от 20 до 95%. -

140

Ж .120

и? о

ё

о и и о и 3* £

К §

0 20 40 60 80 • • время инкубирования, "часы ' " Рис.8. Изменение общего числа клеток.при инкубировании клеток МАйов в среде оживления в присутствии пенициллина (?. 1. жизнеспособные клетки из позднелогарифмической культуры; 2. клетки из культуры, голодавшей в течение 3,5 месяцев; 3. клетки из культуры, голодавшей в течение 6 месяцев.

3. Исследование популяционного состава голодающей культуры и межклеточных взаимодействий. Для количественной характеристики голодавшей популяции использовали метод конечных разведений, который предполагает засев очень низких концентраций клеток (вплоть до 1) и тем самым позволяет: исключить рост колониеобразующих форм, определять количество клеток, способных к восстановлению и проводить оживление в жидкой среде.

Однако в среде, обычно использовавшейся для восстановления голодавших культур, не наблюдалось видимого роста бактерий при инокулировании очень низких концентраций клеток. При этом различного рода добавки (в том числе малата, сукцината, пирувата, цАМФ, ГТФ), варьирование концентраций основных компонентов не приводили к увеличению количества жизнеспособных клеток в сравнении с колониеобразующими бактериями. Оказалось, что для восстановления покоящихся клеток при низких концентрациях лнокуяирования необходимо добавление супернатанта, полученного фильтрованием позянелогарифмической культуры МЫеих (КЖ). Отметим также, что важнейшим условием оживления покоящихся клеток являлось использование при титровании клеток в декадных разведениях супернатанта, полученного из голодавшей культуры. В таблице 1 показаны результаты исследования оживления нескольких бактериальных культур в высоких разведениях. Очевидно, что культуры различались не только по количеству колониеобразующих клеток (в целом оно колебалось от К)'* до 10^ клеток на мл), но и по числу бактерий, восстанавливающихся при оживлении (т.е. покоящихся клеток). Но в любом случае количество клеток, восстанавливающихся при оживлении в высоких разведениях, -превышало число колониеобразующих клеток в целом на 2-5 порядков. Следовательно, в голодающих культурах действительно присутствовали покоящиеся клетки, переходящие в активное состояние после оживления. Заметим, что не существовало четкой закономерности между "возрастом" культуры (временем хранения в условиях голодания) и количеством клеток, восстанавливающихся в процессе оживления. Для нормального восстановления покоящихся клеток было необходимо добавление некоторого фактора из кулыуральной жидкости позднелогарифмической культуры М.Ые-и$. Этот, фактор был термолабилен и не диализуем. Более того при предобработке кулыуральной жидкости трипсином, активность фактора терялась. Мы предположили, что данное активное вещество является палипептвдом. Оптимальная концентрация фактора возникала при оптической плотности культуры 2,0-2,5 (при 650 нм в 1см кювете).

Как отмечалось ранее, при инкубировании таких клеток в среде оживления без добавления отфильтрованного супернатанта логарифмической культуры (КЖ) не наблюдалось нормального (видимого) роста МЛШеш. Однако при ТАБЛИЦА 1. Соотношение между числом коло;шеобразующих клеток и количествам бактерий, восстанавливающихся при оживлении в высоких разведениях:

N культуры возраст (месяцы) общее число клеток жизнеспособность по чашкам по МКГ

1. 4,5 1А1010 1,3Л106 9,2Л109

2. 5 1,2А1010 1,7А105 1,2А1010

3. 6 1,2А*Ю10 3,6А104 9,2А109

4. 8 2,ПО10 5,ПО5 3,5А107

5. 2- 4,9А109 • 8,0А105 -2,4АЮ7

6. 10 6,4А109 1,2А106 б,8А108

более тщательном исследовании оказалось, что в таких условиях клетки пре терпевают ограниченное число делений (10-17 генераций). На рис.9 видно, .что в течение 72 часов инкубирования в среде оживления количество клеток

7

увеличивалось от 700 цгг/мл до 3"10 клеток/мл. В дальнейшем процесс деления останавливался, и на 120 часу инкубирования начиналась постепенная деградация культуры, количество клеток уменьшалось. Интересно, что на протяжении всего эксперимента клетки оставались некультивируемыми (т.е. не образовывали колонии на плотных средах). Важно, что такое деление

происходило только в присутствии питательных веществ и, видимо, не являлось редукционным делением, характерным для некоторых микроорганизмов в условиях голодания, хотя было ограничено по числу раз (10-17 генераций). Прекращение деления могло быть обусловлено либо какими-то эндогенными нарушениями клеток, либо накоплением в культуральной жидкости неких веществ, ингибирующих размножение.

? 108 С

£ 107

£ 106

1 ю5

I Н><

к

8 103

102

0 40 80 120 160 200 время инкубирования, часы Рис.9. Изменение общего числа клеток при оживлении голодавших клеток М.Шеиз в условиях низких концентраций инокулирования. Клетки из голодавшей в течение 9 месяцев культуры М.'.Шеиз (общее число клеток 7*10(9) кл/мл, количество колониеобразующих клеток 5*10(5) кл/мл) инокулировали в лактатну/о среду с добав,:епием 0,05% дрожзхевого экстракта (конечная концентрация клеток составляла 360 кл/мл).

Для проверки последнего предположения мы инокулировали в пробирки с инкубированными в среде оживления в течение различных промежутков времени голодавшими бактериями жизнеспособные клетки М.Ыеш из логарифмической культуры, регистрируя при этом лаг-периоды, предшествующие нормальному видимому росту. Результаты этих экспериментов свидетельствуют об ингибировании роста жизнеспособных бактерий, инокулированных в

пробирки с инкубированными в течение 50 и более часов голодавшими клетками (рис.10). Важно, что антибактериальная активность развивалась именно в процессе инкубирования голодавших клеток. Заметим, что на накопление и проявление антибактериальных веществ влияли изначальная концентрация оживляемых голодавших клеток и количество инокулируемых жизнеспособных бактерий. Антибактериальный фактор устойчив к автоклавированию и замораживанию, хотя терял активность, после диализа.

140 г

120 -

и) о г) 100 -

Т

X 80 -

О

Си <1> 60 -

С -

ь. сз в: 40 V

20 -

о 1-

0 20 40 60 80 100 120 140 160 время оживления, часы- -Рис.10. Зависимость лаг-периода, предшествующего видимому росту (оптическая плотность при 650 им в 1 см юовете>0,5) зкизкеспособных клеток М.Ьхгил, инокулированных в пробирки с инкубировавшимися в среде озкив-леник голодавшими клетками М.Ьаеиз (1) или суаернатантом, полученным фильтрованиях таких культур (2) от времени оживления голодавших клеток. Конечная концентрация инокулята жизнеспособных клеток составляла 700 кл/мл. Стрелками обозначены тачки, в которых никогда ие наблюдалось видимого роста клеток.

Каким же образом связаны оживление покоящихся клеток в высоких разведениях в присутствии супернаганта, полученного центрифугированием поздне-логарифмической культуры (КЖ), и накопление антибактериального фактора

(АФ). Для выяснения этого вопроса мы исследовали рост жизнеспособных клеток микрококка в смеси АФ и ОС На рис.11 ввдно, что разбавление инкубировавшихся в течение 96 часов в среде оживления голодавших клеток КЖ, в соотношении 4:1 приводит к нормальному росту жизнеспособных бактерий (при начальном инокулнровании 700 клеток на одну пробирку). Аналогичные результаты наблюдали и при использовании супернатанта, полученного из инкубировавшихся голодавших клеток. Заметим, что простое разбавление культуральной жидкости с АФ средой для оживления в соотношении 1:1 и 1:2,5 не приводило к его инактивации.

100

, § 80

CS

sr

g

g 60

о.

u

с

I

I 40

20

0 20 40 60 80 100 содержание КЖ, % Рис.11. Влитие культуральной жидкости, полученной фильтрованием позд-нелогарифмической культуры МЛШещ, на лаг-период, предшествовавший видимому росту жизнеспособных клеток, ияокулированных в пробирки с инкубировавшимися в среде оживления голодавшими клетками МЛиХет.

4. Разделение популяции голодавших клеток с использованием клеточного сортери. Согласно полученным данным при внешней морфологической однородности популяция голодавших клеток была неоднородной, в ней

присутствовали ксшонисобразующие (живые) клетки, клетки, способные к восстановлению в соответствующих условиях, а также бактерии, не превращавшиеся в активные "клетки ни при каких условиях (предположительно мертвые). Поэтому возникла необходимость провести разделение популяции, используя некоторые биохимические параметры.В качестве критерия для разделения популяции голодавшей культуры использовали интенсивность флюоресценции родамина 123. В популяции выделяли и исследовали две группы клеток: 1) бактерии с повышенной флюоресценцией родамина 123, полностью или частично чувствительной, к действию разобщителя (клетки из зон В и С); 2) бактерии с низкой флюоресценцией, которая не изменялась при добавлении СССР (зона А). После сортировки бактерии высевали на чашки с агаровыми средами для выяснения количества колониеобразующих клеток, а также в камере Горяева подсчитывали их общее число. Как и ожидалось большинство колониеобразующих клеток попадало в зоны В+ С. Однако после разделения популяции количество клеток, образующих колонии, значительно в (8-20 раз) увеличивалось и в зонах В+С, и в целом в

популяции (в пересчете на 10^ клеток) в сравнении с таковым до сортировки. Это могло быть связано с тем, что в голодавшей культуре мертвые клетки .выделяли какие-то днтибактериальные вещества, (возможно, они аналогичны антибактериальным веществам, проявлявшимся при оживлении в высоких разведениях). Возможно, что после отделения таких клеток и устранения антибактериальных факторов на чашках происходило восстановление так называемых поврежденных клеток.

Весьма важно было также выяснить, в какую область попадают клетки, восстанавливающиеся при оживлении. Для этого использовали процедуру восстановления, клеток в высоких разведениях. Как отмечалось ранее необходимым условием такого оживления являлось добавление в среду ожиа.ч;шм су-пернатанта, полученного цешрифугироваглем и фильтрованием позднелога-римической культуры микрококка. Данные экспериментов свидетельствуют, что восстановлению в таких условиях подвергались клетки исключительно из

зон В+С. Более того после сортировки эффективность такого восстановления

в пересчете на всю популяцию увеличивалась в целом в 50 раз (таблица 2). ТАБЛИЦА 2. Распределение жизнеспособности бактерий из популяции клеток М.1шеш, голодавших в течение 5 месяцев , до и после разделения с использование проточного цитометра и клеточного сортера.

до разделения после разделения

зона А зоны В+С зоны А+В+С

общее число

клеток 106 8Л105 2Ч05 106

количество ко-лониеобразующих клеток 740 42 6200 6240

жизнеспособность .

(по чашкам) 0,07% 0,005% 3,1% 0,62%

жизнеспособность (по МКР без КЖ)

0,065% 0,0044% 1,5% 0,3%

жизнеспособность (по МКР с КЖ)

3% 0,004% 19,3% 3,9%

выводы

1. При длительном инкубировании в стационарной фазе (от 3 до б) месяцев клетки неспорообразующсй грам-положигельной бактерии Micrococcus luteus переходили в некультивируемое состояние.

2. Некультивируемые клетки характеризовались:

а) морфологической интактноегью (компактно упакованным нуклеоидом, структурированной цитоплазмой и утолщенной клеточной стенкой;

б) резко сниженными активностями эндогенного метаболизма (нерегист-рируемой трансмембранной разностью потенциалов и практически нулевым эндогенным дыханием);

в) неспособностью образовывать колонии на плотных средах;

г) резко сниженным содержанием белка, РНК и лшгадов, но нормальным содержанием ДНК;

д) относительной стабильностью основных компонентов дыхательной цепи,

е) изменением соотношения белоклипид в мембране в пользу белка, увеличением микровязкости мембраны.

3. Некультивируемые клетки могли быть трансформированы в активные делящиеся клетки при оживлении в жидкой среде. Количество клеток, восстанавливающихся при оживлении в жидкой среде, варьировало в разных культурах и составляло в среднем 1-90%.

4. Для восстановления некуяьтивируемых клеток необходимо добавление некоторого фактора (предположительно полипептида) из культураяьной жидкости позднелогарифмической культуры M.luteus] в отсутствие фактора клетки делились только ограниченное число раз (10-17).

5. Отделение при помощи клеточного сортера клеток, не поддающихся оживлению, приводило к значительному увеличению количьства колоние-образующих и восстанавлиЕаюищхся в жидкой среде клеток.

6. Предполагается, что обратимо некультивируемые клетки Micrococcus ¡uieus являются покоящимися формами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Янопольская НД., Мукамолова Г.В., Капрельянц А.С. Липидный состав покоящихся клеток Micrococcus luteus. //Тез. VI симпозиума по биохимнии липютов, 3-6 октября 1994, Санкт-Петербург.

2. Мугэмолова Г.В., Кормер С.С., Янопольская Н.Д., Капрелянц А.С. Иесгаояание покоящихся клеток в культуре Micrococcus luteus, пребыва-»uteii в длительной стационарной фазе //Микробиология, 1995, Т.64, N3, с.346-351.

3. Knprety^nts A.S., Mukamolova G.V., Kell D.B. Estimation of dormant Micrococcus luteus cells by penicillin lysis and by resuscitation in cell-free spent medium in high dilution I I FEMS Microbiol. Lett., 1994, V.I 15, p.347-352.

4. Kell D.B., Davey H.M., Mukamolova O.V., Votyakova T.V., Kaprelyants A.S. Life, death, dormancy and social resuscitation in non-sporulating bacteria: reiatinship with energetic status of individual cells // Modern trends in BioThemioKinetics, 1994, V.3, p.252-254.

5. Mukamolova G.V., Kaprelyants A.S., Kell D.B. Secretion of antibacterial factor during resuscitation of dormanL cells in Micrococcus luteus cultures held in an extended stationary pba.se // Anton. Leeuw. int. G.B., 1995. V.67, p.289-29S.

6. Mukamolova G.V., Yanopolskaya N.D., Votyakova T.V., Pcpov V.I., Kaprelyants A.S., Kell D.B. Biochemical changes accompanying the long-term starvation of Micrococcus luteus cells in spent growth medium // Arch. Microbiol., 1995, in press.

Д