Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Образование этилового спирта лактозоусваивающими дрожжами и его роль в регуляции синтеза ферментов обмена лактозы

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Образование этилового спирта лактозоусваивающими дрожжами и его роль в регуляции синтеза ферментов обмена лактозы"

Национальна Академю наук Украши Гнсппуг мисробюлогн та в1русологн ¡м. Д.К.Заболотного

На правах рукопису

ГНАТУШ Свгглана Олекспвна

УТВОРЕННЯ ЕТИЛОВОГО СПИРТУ ЛАКТОЗОЗАСВОЮЮЧИМИ ДР1ЖДЖАМИ ТА ЙОГО РОЛЬ В РЕГУЛЯЩГ СИНТЕЗУ ФЕРМЕНИВ ОБМ1НУ ВУГЛЕВОД1В

03.00.07 - мжробюлопя

АВТОРЕФЕРАТ

дисертацц на здобуття вченого ступеня кандидата бюлопчних наук

Кшв-1996

-гз СД 2 2 ДО? «96

Дисертащею е рукопис.

Робота виконана на кафедр! ликробюлогп Льв1вського державного университету ¡м. I. Франка.

Науковий кер1вник: Офшдйш опоненти:

кандидат бюлопчних наук ГУДЗЬС.П.

доктор бюлопчних наук ЗАХАРОВА 1.Я. кандидат бюлопчних наук ФЕДОРОВИЧ Д.В.

Провщнаоргашзацш - Державнийушверситетхарчовихтехнолопй (м.Кшв)

Захист вщбудеться " " ПЩХ^Ш- 1996 року о "10" годиш на засщанш спещал1зовано1 Вчено1 ради Д 01.81.01 по присудженню наукового ступеня доктора бюлопчних наук в 1нституп мжробюлоги та в1русологп ¡м. Д.К.Заболотного НАН Украши (252143, Киш, 143, вул. Заболотного, 154, 1нститут мкробюлогй \ в1русологи НАН Украши, зал засщань). 3 дисертащею можна ознайомитися у б1блютещ 1нституту мжробюлоги та В1русологи ¡м.Д.К. Заболотного АН Украши.

Автореферат роз1сланий "..<?.... " г.?....... 1996 року.

Вчений секретар спещашовашп Ради, кавдидат бюлопчних наук Л. М. Пурш

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальшсть. Важлнвою проблемою на шляху практичного одержання достатшх кшькостен ферментов с функцюнування в мшробних титанах високоефектквних регуляторних систем, яы кошролюють 1х синтез 1 аьегившеть. Одним з мехашзмш, дп якого пщлягае бшышеть фермента, е катаболгша peпpeciя.

3 практично! 1 теоретично1 точок зору заслуговус на увагу р-галактозидаза др1ждаав, яказнаходить практнчне застосування в медпцнш 1 харчо вш промисловость Бюсннтез р-галактозидазиезручною моделлюдля внвченнявпливу р1зних фактор!в на регуляцпо шдуцибельних фермента.

За умов повшыюго поступання вуглевод1в в клшшу та його штучному сповмьненш спостершаеться суттеве щдвищення синтезу р-галакгозидази др1ждаав. Це евщчпть про важливу роль цих сполук чи промЬкннх продукпв 1х катабол1зму в регуляцй бюсшпезу р-талакгозидази.

Одним з промЬкннх продуктов катабагизму вyглeвoдiБ,' що нагромаджуються в культурах др!ждаав, е етанол. Про його вплиг, на регуляцпо бюсинтезу фермента у м1крооргатзм1в дат в ллерагур1 практично вщеупп. Лише удеяких представниюв метнлотрофнихдрхжююв етанол чи продукт його катабол1зму - глюксилат репресуе синтез фермента катабол1зму метанолу [Сиб1рннй, Титоренко, 1990].

Осюльки нагромадження етилового спирту мае мкце 1 при рост! лакгозозасвоюючих др1ждж1в, ми поставили перед собою завдання дослщити як впливае дя сполука на синтез р-галактозидази та окремих фермента ЦТК: цитратсинтази, ¡зодитратдепдрогенази, фумарази, ¡зоцитратаази та малатсиптази.

Мста1завдання дослщжень. Метою робота було дослижеши законом1рностсй утворення етилового спирту лактозозасвоюючими др1жджами в умовах аерацн та вивченпя його учасп в катаболгаий регуляцй окремих фермента ебмшу лакгози.

Для виконання роботи необидно було доелгдити:

- здатшеть р1зних вшив лакгозозасвоюючих др]ждаав утворювати етанол в процеа аеробного росту;

— природу пром1Жних продукта катабол1зму лактози, що нагромаджуються в культурах др!ждаав, 1 встановита 1х можливу участь в регуляцй биосинтезу

фермента обмшу лактози;

— законом1рносп бюсинтезу Р-пшактозидази та окремнх ферммгпв циклу трикарбонових кислот за вщсупгосп i наявносп етанолу в середовщщ;

-фу11К1ЦО}1уБа1пммехан1змуи'а1юль1Ю1катабол1т1Ю1репреси р-галакгозидази у мутмтв дрмдоцв Candida pseudotropicalis з порушсннмн р1зшшн етапами катабол1зму етанолу.

Наукова новизна. Дослщжено здатшсть велико'; групп лактозозасвоюючих дргждоав утворювати етанол при pocii палактоз} та шишх цукрах в аеробних умовах. Основними промЪкними продуктами катабошзму лактози, що виявлешв культур1 дрЪкдоав С. pseudotropicalis е етанол i оцтова кислота, а у дрцкдаав Cryptococcus curvatus - шюкоза.

Вперше встановлено, що етанол, под1бно до глюкози, репресуе синтез р-галакгозидази, цитратсиитази, ¡зоцитратшази у дрскдоав С. pseudotropicalis. Уцих др^ждаав, на вдашгу вд С. curvatus етанол виявляе сильницу репресуючу дно, nix глюкоза.

Мутанти дридаав С. pseudotropicalis' з блоком ¡шкогольдегщрогенази i ацетальдепддегщрогенази мають nopymeiry катаболппу penpeciio р-пшактозидази. У MyrairriB зблоковашщ синтезом ацетил-КоА-сиитетази етанол репресувавсинтез ферменту. Зроблепо висиовок, що катаболггом-корепресором в етанольнш катаболшцй penpeci'i синтезу р-галактозидази е ацетат.

Практично значения. OspeMi представники лактозозасвоюючих др1ждж'1в використовуються для одержання харчового i кормового бшка, npenapaTiB Р-галактозидази та етанолу при вирощувашп на молочнш сироватщ. Вщкритгя нами "етанольного ефекду" у лактозозасвоюючих дридаав в значнш Mipi розкривае причини зниження темшв нагромадження 6ioMacn i утворення р-галактозидази. Контролюючи i змшюючи pisenb етанолу в культурц очевидно можна сутгево пщвищити ефектившеть росту i бюсинтезу фермента.

Вперше описана роль етанолу в регуляци катабол1зму вуглевод1в, що дозволяе використовувати щ дат при вивченш регуляторних Mexaiii3MiB клтши у вщновщних номенклатурних курсах i спецкурсах.

Ha захист виносяться там положения:

— утворешгя етилового спирту р1зними видами дрЪкдаюв в умовах аерацп;

— особлисоcTi метабошзму лактози дрЪкджами С. pseudotropicalis i С. curvatus;

— 3aK0H0MipH0cTi бюсинтезу р-галакгозидази др1жджами С. pseudotropicalis i С. curvatus та участь промЬклих продукпв кaтaбoлiзмy лактози в його регуляци;

— функцюнувания мехашзму етанолыго! катаболпно!' репреей ß-галактозидази у мутанттв др1ждас1в С. pseudotropicalis з порушеними разними етапами катаболизму етанолу;

— вгшив етанолу на бюсинтез окремих фермента ЦТК у дршдоив С. pseudotropicalis.

Апробащя ро'боти. OciioBHi положения дисертадп доповщалися i обговорювалися на республжанськнх конференциях "Биотехнология получения кормового белка, экологически чистых препаратов, повышающих урожайность, премиксов, ферментов и витаминов кормового назначения" (Дшпропетровськ, 1990) та "Бютехнолопчш дослщження i перспективи ix розвитку" (JlbBiB, 1990), мЬкнародному Kourpeci "Биоконверсия органических отходов для получения биогумуса, биогаза, белковых веществ и охрана окружающей среды (Кш'в, 1991), щор1чних наукових конференцгях Льв1вського державного ушверситету та засщанш JlbBiBCbKoro вщдшення Укра'шського мжробюлопчного товариства (Льв1в, 1995).

Пуб.пкацм. Основн1 результата дослщжень представлен! в 10 друкованих

працях.

Об'ем i структура робота. Робота нидрукошиа ни 132 сторшках, вкночаючи шостративний MaTepian. Дисертащя складаеться 3i вступу, огляду ляератури, 6 роздшв' експерименталъних дослщжень, снсповмв, списку лтератури. Робота шюстрована 9 таблидями та 26 рисунками. Б1йлюграф1чний покажчик мютить 271 джерело, в тому чиой 215 шоземних anTopiB.

3MICT РОБОТИ

Огляд лггератури. Приводяться дан; про ochobhI принципи регуляци катабожзму вутецевих сполук у MiKpooprani3MiB, розглянуго ф1зкшопчш особливосп

метаболизму вуглевсдав у дрЬвдюв, биосинтез р-галактозидази у прокарют i еукарют та мехашзми його ре1уляцп.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

Матер!али i методи. В робоп використовувалися др1ждж! род i в Saccharomy-ces, Candida, Cryptococcus, Kluyveromyces, Endomyces, Saccharomycopsis, Zygosaccnaromyces, Schwaruiiornyces, одержат ¡з Всесоюзножолекци MÍKpoopraHÍ3MÍB.

Дрщдоы вирощували в середовиин Беркгольдера або на депротмтзовашй молочшй сироватид при температур! 30°С. Для аераци використовували кругову качалку (200 об./хв.).

Бюмасу визначали ваговим методом або турбщиметрично на фотоелектро-колориметр! КФК-2МП. Bmíct бшка в безклгпшних екстрактах визначали за методом Jloypi [Lowry et al., 1951]; редукуюч! цукри — за методом ШомодьНельсона [Захарова, Косенко, 1982]; глюкозу - ферментативним методом з використанням глюкозооксидази [Щербухин и др., 1970].

Етанол в культурах дрекдаав визначали ферментативним методом з використанням алкогольоксидази [Гончар и др., 1991]; оцтову кислоту в безклгтинних екстрактах та культуральнш рдапц - методом газорщинней хроматотрафй' [Немировський i in., 1989]. Для визначення ацетальдепду використовували метод описаний Paz [1965].

Акгибнють р-галакгозидази в клггинах држджв визначали за методом описании Мотгером [1982]. Пермеабшшдш кгатин проводили хлороформом i додецилсульфатом натрдо протягом 5 хв.

Лкшвшсть фермента ЦТК визначали: щгтратсннтазу за методом Srere [1969], ¡зодиграхдепдрогеназу за методом Kombeig [1955], фумаразу за методом Bergmeyer 11970], ¡зодитрат.'пазу за методом Reeves [1971], малатсинтазу за методом Dixon [1962].

АктиБШстьалкогольдегщрогенази визначали спектрофотометрично. Елегаро-форез бшюв проводили у вертикшьщйпластинцШААГтовщиною 1мм, виосячи в лунку 25 мкг бшка. Як елекгродний буфер використовували трш-шьщиювий, рН 8,30-8,35. Кондешращя роздшяючош remo - 7%; концентруючош - 3%.

Препарата алкогольоксидази булн люб'язно падаш проф. CnöipmiM A.A., а такожотримат нами з юптшг дрЬкдяав Hansenulapolymorpha за методом розробленим в лабораторн проф. Cn6ipnoro A.A. (м. Львш).

РЕЗУЛЬ ТА ТИ ДОСЛIДЖЕН Ь

Утворення етанолу та шших продукта катабол1зму лактози в культурах лактозозасвоюючих дрЬкдяав.

Дослщжували~здатшсть лактозозасвоюючих дртждайв, що належать до pi3HHX род1в, утворювати етанол в аеробних умовах при poeri в середовицц з глюкозою.

Встановлено (табл. 1),щозанаявноспглюкози(50 мМ) якджерелавуглецю переважна бшышеть доыоджених дридаав род1в Kluyveromyces та Candida утворюе битыне 1 г/г клгош етилового спирту i ix можна вщнести -до Кребтр1-позитивних.

Таким чином, ефект Kpeörpi, що був описаний у S. cerevisiae якпригшчення дихання глисагизом у вщповщь па внесения в середовище гпдвищених юлькостей глюкози [Urk, 1989], мае мгсце i у багатьох лактозозасвоюючих дрвкдаав.

Утворення етанолу дослщженими представниками Кребтр1-позитивних др1ждайв мае Micue i при використанш шших цукр1В (табл. 2).

Таблиця 2.

Утворення етанолу др^жджами С. pseudotropicalis та К. lactis при poeri на р'аних цукрах (час культивування 20 год., концетращя Щ'крш 2 %, аерахоя)

С. pseudotropicalis К. lactis

Вуглеводи бюмаса, г/л етанот. г/г клггин бюмаса, г/л еганол, г/г клшш

Арабшоза 0,7 ± 0,2 0,1 ± 0,2 0,5 ± 0,1 0,2 ± 0,1

Галактоза 1,6 ± 0,4 1,3 ± 0,3 1,2 ± 0,3 1,6 ± 0,2

Глюкоза 2,0 ± 0,3 2,5 + 0,4 . 1,6 ± 0,2 2,1 ± 0,4

Ксилоза 0,6 ± 0,5 0,3 + 0,5 0,6 ± 0,1 0,2 ± 0,1

Лактоза 2,5 ± 0,4 2,7 ± 0,4 1,3 ± 0,2 2,7 ± 0,2

Манноза 1,6 ± 0,4 2,1 ± 0,3 1,2 ± 0,1 0,9 ± 0,2

Рафшоза 1,3 ±0,3 0,1 ± 0,4 0,8 ± 0,2 0,1 ± 0,1

Сахароза 1,4 ±0,3 2,1 ± 0,2 1,0 ± 0,3 1,5 ± 0,2

Мальтоза 0,9 ± 0,4 1,2 ± 0,4 1,0 ± 0,2 0,6 ± 0,3

Таблиця 1.

Утворення этилового спирту ршшми видами дршдаов при роста в середовшщ з шюкозою (час культивовання 24, 48 год; конциггращя глюкози 2%)

Вид дргждяав Ефекг Кребтр1 Бюмаса, г/л Етанол, г/г кттин

24 год. 48 год. 24 год. 48 год.

Б. сегеушае ' + 2Д ± 0,5 2,9 + 0,6 2,2 + 0,4 0,8 + 0,3

С. и№ ВКМ У-769 + 2,4 + 0,4 3,2 ± 0,5 0,8 ± 0,3 1,3 + 0,5

С. р5еис1о1гор1са1в ВКМУ-209 + 3,3 ± 0,3 3,9 ± 0,4 1,9 + 0,5 0,2 + 0,4

С. ГагшИа - 2,3 + 0,4 2,9 + 0,3 0,3 + 0,6 0,1 + 0,3

С. 1уро1Шса + 2,5 + 0,6 2,9 + 0,4 0,9 + 0,5 1,2 + 0,4

С. сиптаИв ВКМ У-2230 - 2,3 ± 0,7 3,1 ± 0,4 0 0

С. ксЫтиш ВКМ У-1647 - 2,4 + 0,5 3,3 ± 0,6 0 0

С. 1аигепШ ВКМ У-720 - 1,6 + 0,4 2,0 ± 0,7 0,2 + 0,3 0,1 + 0,1

С. Ьута1ауегвв ВКМ У-1645 - 1,6 ± 0,5 2,7 ± 0,4 0 0

С. Пауш ВКМ У-222 - 1,5 ± 0,6 2,8 ± 0,5 0,4 + 0,4 0,3 + 0,2

С. 1С П1П5 - 1,3 ± 0,5 2,8 ± 0,7 0 0,2 + 0,2

К. 1асЦ$ ВКМ У-1527 + 4,4 ± 0,6 4,8 ± 0,6 1,9 ± 0,5 0,4 + 0,2

К. Ъulgaгicus ВКМ У-1494 + 4,3 ± 0,4 4,8 ± 0,3 1,9 ± 0,6 0,2 + 0,2

К. татапш ВКМ У-832 + 3,7 ± 0,7 4,4 ± 0,5 1,2 ± 0,7 0,4 ± 0,3

К. Шсгтогоктк ВКМ У-894 + 1,2 ± 0,4 1,8 ± 0,6 1,3 + 0,7 0,8 + 0,5

К. татапш ВКМ У-2012 + 3,3 + 0,5 3,8 ± 0,7 1,0 + 0,4 0,6 + 0,4

5. йЫОщега ВКМ У-1067 - 2,2 + 0,4 2,9 ± 0,6 0,4 + 0,3 0,2 ± 0,2

О. Ъиропв - 1,2 ± 0,5 2,4 ± 0,6 0 0

Б. тагпши ВКМ У-1072 + 1,7 ± 0,6 2,8 + 0,5 1,2 ± 0,5 0,2 + 0,2

г. Заротсш СВС-209 + 3,4 ± 0,5 4,2 ± 0,7 1,0 ± 0,4 0,3 + 0,2

г. татапш ВКМ У-832 + 4,9 + 0,6 5,5 ± 0,5 1,5 ± 0,5 0,3 + 0,3

Б. осгайепЫд ВКМ У-670 - 1,2 ± 0,5 2,4 ± 0,6 0,2 + 0,4 0,1 + 0,2

Осыльки лактоза забезпечуе picT i утворення етилового спирту лакгозо-засвоюючимидргжджами, миперев!рили1хздаттстьугБорюватпстанолнамолочнш сироватщ. Як видно з даних табл. 3, picT окремих вид!в др1ждаав супроводхуеться нагромадженням етанолу в середовшщ. Найбшьшукшыастъ спирту нагромаджували культури С. pseudotropicalis, С. kefir та К. lactis. ДрЪкдаа роду Ciyptococcus та oKpeMi представники роду Candida не утворювали етанолу.

Використовуючи метод газорщипно! хроматограф», дослщшш спектр жирних кислот у С. pseudotropicalis i С. curvatus. В клтгаах дргжджв С. pseudotropicalis на 16 год. росту в середовшщ, що Micmno лактозу, виявлено до 0,40 мкмоль/мг клгган ацетату. В процеи росту йльюсть oirrosoi кислота в клшшах зменшуеться. На48 год. в клшшах залишаетъся 0,08 мкмоль/мг ацетату. Частина оцтоБо! кислоти ввдшяеться в культуральну ршину. У др!ждаав С. curvatus оцгова кислота не виявлена Hi в логарифм1чнш, Hi в стацюнарнш фаз! росту.

Таблиця 3.

Нагромадження бюмаси, етанолу та р-галактозидазна _ aKTHBHicTb дргждода при pocri иа молоч1йй сироватщ (час росту 24 год., концентраци лакгози 4,5%, аеращя)

Др1ждж1 Бюмаса, г/л Етанол, г/г К1НТИН Актив1псть р-галакгози-дази, Е/мг клтш

Z. japonicus 2,1 ±0,2 0,7 ± 0,1 - 164,2 ± 0,8

Z. marxianus 4,7 ±0,3 0,4 ± 0,2 170,0 ± 0,7

С. utilis 6,2 ± 0,4 0,1 ± 0,1 0,6 ± 0,3

С. pseudotropicalis 7,8 ± 0,2 2,9 ± 0,3 700,8 ±0,8

С. curvatus 4,9 ± 0,6 0,1 ± 0,1 39,8 ± 0,5

С. lypolitica 4,5 ± 0,5 0.2 ± 0,2 0,4 ± ОД

К. lactis 5,9 + 0,4 3,2 + 0,4 197,4 ± 0,8

С. kefir 6,4 ± 0,6 2,9 ± 0,3 230,0 ± 0,7

К. bulgaricus 8,9 ± 0,5 1,7 + 0,5 214,5 ± 0,9

К. marxianus 6,8 ± 0,3 2,4 ± 0,4 186,4 ± 0,6

К. theimotolerans 2,5 ± 0,2 ' 1,2 ± 0,6 160,4 ± 0,4

С. tenuis 4,7 + 0,4 ОД ±0,1 8,7 ± 0,5

С. laurentii 3,2 ± 0,6 0,2 ± 0,2 • 114,1 ± 0,8

Оскшьки дрЬкдоа роду С1ур1ососси$ не утворюють етанолу на лакгозовлисному середовшщ, хоча виявляють за дих умов пор1вняно високу р-галактозидазну актившсть - 39,8 Е/гклшш, визначено вм1ст глюкози в к клшшах. Для нор1вняшш булп використашдр1ждоа С. рБешЗоиирюаНз, яю нагромаджують етанол в культуральному середовищь В безклгошних екстрактах др1жцж1в С. сиггаЦи на 24 год. росту виявлено 7,00 мкмоль глюкози на 1 мг клтш. В клшшах др1ждж1В С. рБеисЫгорюаИБ за цих умов глюкози не виявлено.

Отримаш результати показують, що у лактозозасвоюючих др^ждаов спо-стер!гаеться дв1 ч1тко виражеш особливоетт метабол1зму вушеводав. Перша особ-ливкть, що описана для Кребгрьпозитивних др1жшыв С. р5еис1о1гор1саК5, полягае в тому, що при висоий р-галакгозидазшй активносп кттин лакгоза швидко пдро;нзуеться до глюкози 1 галактози, 1 дал1 до етанолу та оцгово! кислота. Очевидно, швидке перетворення лактози в спирт слад розшядати як один з мехашзмгв захисту клтш вщ шпбуючого впливу глюкози, що утворюеться в результат! незбалансованого сиитезу р-галактозидази.

Друга особливклъ полягае в тому, що у Кребтрьнегативнихдргжджгв С. сиглЦщ утворення спирту в процес1 росту не спостершктьея. Однак, при високщ Р-галактозидазшй активносп в кттиш з'являеться глюкоза.

Таким чином, зниженпя активном! р-галактозидази у Кребтрьпозитивних 1 Креб'1р 1 -негати кних др1ждяав год час логарифлпчно! фази росту, очевидно, пов'язане з нагромздженням продукты катабодаму лактози: у перших - етилового спирту, у других - глюкози.

Законолнрносп утворення етанолу та р-галактозидази лактозозасвоюючими дршджами

Дослщжено нагромадження бюмаси, викрристання лактози, синтез р-галактозидази та етанолу др1жджами С. р8еи<Зо1:гор1са115та С. сигтаШБ в залежносп вщ часу культавування. Результати дослщш представлен! на рис. 1 А, Б.

Звертае на себе увагу той факт, що концентращя лактози (визначена як редукуючий цукор) в середовшщ росту дpiжджiБ С. рзеисМгорка^ знижуеться значио швидше, нЬк у С. сишЦш. На 18 год. припадае максимальна Р-

и

Рис. 1. PicT (1), використання цукру (2), утворення етанолу (3) та ß-галактозидазна актившсть (4) дрЬкджв С. pseudotropicalis (А) та С. curvatus (Б) при pocri в середовипц з лактозою.

галактозидазна акгившсгь клшга обидвох вщцв дpiжджiв незважаючи на те, що клшши дргждаав продовжугогь роста, актившсть ферменту починае piзкo знижуватися. Др1ждаа С. рзеисЫгоркаНх утворюють до 10 г/л етилового спирту, який використовуеться на другш фаз1 д1ауксичного росту. Др1ждаа С. сигуайи не утворюють етанолу.

Причину зменшення р-гадактозидазно! активносп штин не можна пояснити "розведенням" ферменту в процеа подальшого росту юнтин, осюльки протягом настуиних восьми годин бюмаса дрЪкдаов зрослалише на 50%, а ферментативна aктиБнicть юнтин зменшилася в 3-4 рази. Як показали подальнн дослщження, зростання вмнпу лактози в середовицц до 5% веде до нагромадження бшьшо! бюмасн др1жджами С. ркешЫгорюайз, однак при цьому характер залежной! актявносп р-галакгозидази В1'д часу суттево не змшгасться. Максимум фсрментативно! активности припадае на 32 год. росту незважаючи на ще високий р!вень лактози, актившсть р-пшактозидази починае знижуватися. Збшынення концентрацн лактози в середовицц у випадку вирощування др1ждаав С. ситоЦк супроводжуеться зменшеннямр-галактозидазно! активность При цьому максимум ферментативно! активной! припадае на 25 год. росту, а дал1 знижуеться, незважаючи на високий вмют лактози г. середовипц, як 1 у випадку С. рзеис^горюаЦз.

Яйцо до культур С. р5еш1о1горюа1в р1зного в1ку ( 12, 18 та 24 год.), що вщповщно Б1др1знялися за р1внем використання лакгози, швидюстю синтезу (3-галакгозидази 1 вмютом етанолу, додатково вносили лактозу , то це сутгево не вшшвало на синтез ферменту у век вар1антах. Яюцо ж клггани вщмивали ввд культуральнйрщшш 1 переносили в середовшце з лактозою, то, незалежно вщ в1ку культури, р-галактозидазна акгивтсть зростаяа.

Проведсш експерименти вказують нате, що пригшчення р-галактозидазно! активносп обумовлене нагромадженням в кттинах дргвдшв метаболтв, яы репресують синтез р-галактозидази.

Вплив продукта катаболвму лакгози, виявлених в культурах дрЬкдж1в, на синтез р-галактозидази

Для дослщження рол1 промшних продуктов катабол1зму лакгози в регуляцй синтезу р-галактозидази використовували кароткотривалу шкубацда ввдмитих клггин др!ждаав С. рхеибоиорюаЦх 1 С. сигуайк, хдо ввдр1знялись за здатшстю нагромаджувати промгжт продукта метаболизму, на середовищах, що м1стштм глюкозу чи етанол (рис. 2, 3).

5

и-

.2 500

Ы

К

В 400

2

о

в 300

1

ее. иЗ 200

в

Е X 100

1 — середовище без лакгози

2 — середовище з лактозою

3 — середовище з лактозою 1 глюкозою

4 — середовище з лактозою 1 етанолом

5 — середовище з лактозою 1 ацетатом (0,01%)

6 — середовище з лактозою 1 ацетатом (0,1%)

7 - середовище з лактозою 1 ацетатом (1Яз)

2 4 6 8 Час, год. Рис. 2. Вплив продуктов катабол!зму лакгози нарегуляцио р-галактозидазно1

активносп ктган С. рхеисЫгорка!^.

За вщсугаосп лакгози в шкубацшному середовицц р-галактозидазна актившсть клггин протягом 8 год. шкубаци залишалася без змш. За наявносп цьош вуглеводу в середовинц в концентраци 2% синтез р-галакгозидази в клтшах

дрвкдшв С. pseudotropicalis i С. curvatus зростав приблизно в 3 рази, що свщчить про здатшстъ дослщжуваних дрЬкдаав до нвдуцибелыюго синтезу ферменту. Коли до середовища додавали одночасно лактозу (2%) та глюкозу (1%), то ß-галактозидазна aKTHBHicrb кттин знижувалася удрЪкдж^в С. curvatus на 80%, а у С. pseudotropicalis-на 52%. Показано (рис. 2, 3), що у др!ждж1в С. curvatus i С. pseudotropicalis nofliöHHft до глюкози ефект виявляе етанол. При шкубацц кшин дршдаив С. curvatus в ссредовшш, що м1стило одночасно лактозу та етанол спостер1гаеться. зменшення активном! ферменту на 50%. Удр|адж1В С. pseudotropicalis за цих

умов aKTHBHicTb ферменту не перевищувала активност'1 ферменту при шкубаци в серсдовиий без лактози. Таким чином, синтез р-галактозидази у дрЪкдяав C.pseudotropicalis i С. curvatus виявився чутливим i до шюкози, i до етанолу. Однак ступшь пригшчення синтезу ферменту глюкозою та етанолом у цих дрЬкдаав не однаковий. Осюльки в культур! дрЬкяжш С. pseudotropicalis серед продукпв метабол13му лактози, xpiM етанолу була виявлена оцтова кислота, то в наступних експернментах перев1ряли дно ацетату на синтез ß-галакгозидази вщмитими юптинамц дршдяав. Клггини додавали nie ля неГнраЛ1зац11 шкубацшно'1 сумшп. Як видно з рис. 2, шкубащя клшш дрЪкдяав С. pseudotropicalis в'присупюст1 0,01% ouTOBo'i кислоти приводила до зниження активносп р-галактозидази на 25%. Подальше збтьшення концешраци ouroBo'i кислоти до 1% веде до шактивацй ферменту.

В культурi дргжддав С. curvatus на вщмшу вщ С. pseudotropicalis, виявлений один з продукпв катабол1зму лактози - глюкоза, яка репресуе утворення

5

100'

й-

Н

vt 80-

1

О

Й я 60-

-3 40

Ö

«с 20

4

1 — середовище без лактози

2 — середовише з лактозою

3 — середовище з лактозою i глюкозою

4 — середовище з лактозою i етанолом . \

8 Час, год.

Рис. 3. Вплив глюкози та етанолу на ß-галактозвдазну активность клшш дрЬкдаав С. curvatus.

6

ß-галакгозидази у цихдрЬкщив (рис. 3). Очевидно, саме цьому катаболггу належить основна роль в запуску катаболтго! penpecii у С. curvatus.

Дослщження учасп р1зних катаболтв лактози в регуляцй синтезу ß-галактозидази вказуе на вщмшшсть механым1в катаболйно! регуляци цього ферменту у pi3imx видгв др1ждж1в, однак не дае бщпобш на питания про безпосередню природу катаболгга - ефектора.

Мутанта дрикдяйв С. pseudotropicalis з пошкодженим катаболЬмом етилового спирту i регуляци синтезу ß-галактозидази в них

Для видтення мутанта др!жджш С. pseudotropicalis з порушеним кaтaбoлiзмoм етанолу застосовували методи позитивно! i негативно! селекцп. Як мутаген в обох випадках використовувади УФ-промет. Мутанта вщбирали за ознакою вщсугаосп росту на середовинц з етанолом як единим джерелом вуглецю або за ростом в присутносп 5 мМалшового спирту. Частота Биникненнямутацшскладала4,6х10-6 у випадку негативно! селекцц. Частота видтення резистегггнихдо ашловош спирту мутанта складала 2,0xl0s. Було видшено 80 мутанпв з порушеним катаб0Л13М0М етанолу.

Вивчення ростових потреб мутанта показало, що sei вони ростуть в середовщцахз вушеводами (глюкозою, лактозою, сахарозою), однакнагромдджують в 2-3 рази мешлу бюмасу nix вихадний штам. Переважна бшышеть MyraiiriB (74%) використовувала як джерело вутедю ацетат. Bei штами збер1гають здаттсть утворювати етиловий спирт i характеризуются високою ß-галактозидазною активтепо.

Дослщження дшишаг нагромадження етанолу дало змогу встановити, що у Bcix мутанта, яы не росли в середовищ1 з ацетатом та у частини urraMie, здатних використовувати цей субстрат, р1вень спирту б середовишд теля досяшення максимуму при иодальшому культивувант знижувався. Лише у 28 мутанта, що складали 35% ввд запшьно! кшькосп, piseHb етанолу залишався без змш протягом 72 год. Щоб встановити мюце геиетичного блоку були дослщжеш продукта катабсшзму етилового спирту, що нагромаджувалися в культур! при шкубацй вщмитих кл1тин в середовипн з етанолом. Визначали ревень етанолу, ацетату та

ацетальдегщу. Продукта катабол1зму анал1зувади в культуралыпй рщши nicjM 4 год. шкубаци клт-гн. Виявилося, що в культурах значно! юлькосп мутанта (група А) доданий до середовища етакол не перетворювався i в середовинй не виявлено продуктов йота кэтабол1зму. Очевидно, внаслщок мутацц у цих штам1в пошкоджена алкогольдеддрогеназа (мутацш adh). Другу велику групу (група Б) складали мутанта(31 штам), укультурахякихпришкубащ1виявленийацетальдегщ. Очевидно, вони не здатш перетворювати останнш, що може свщчяти про те, що у них мутащею пошкоджена ацетальдепддепдрогеназа (мутащя aid). Мутанти третьо! трупи, на вщмшу вщ urraMiB попередн1Х двох груп, не росли на ацетат! (група В). При шкубаци клтш в середовшщ з етанолом вони нагромаджували ацетат, тобто у них мутащя могла пошкодити ацетил-КоА-синтетазу (мутащя acs).

Дослщжено регуляцш синтезу р-галакгозидази у мутанта др1ждагав С. pseudotropicalis з блокованими ргзними етапами перетворення етанолу.

Як видно з наведених рисуныв, катаболпна penpecw, що викликаеться етанолом у дикого типу (рис. 2), спостер1пшася лише у мутанта з блоком ацетил-КоА-синтетази (рис. 4 В), в той час як у мутанта з блоком алкогольдегвдрогенази та ацетальдегщдепдрогенази етанольна катаболггна репрес1я була порушена (рис. 4 А, Б ). Оцтова кислота викликала однаковий ефект у век мутанта. Синтез р-галактозидази клтшами, що шкубувалися в середовишд, яке мютило одночасно лактозу i оцгову кислоту був повтетю репресований (рис. 4 А,Б,В).

Рис. 4. Вплив етанолу та ацетату на р-галактозидазну активность мутанта С. pseudotropicalis. А - мутант adh 4; Б - мутант aid 1; В - мутант ase 18.

Очевидно, саме оцгова кислота 1 е тим !нтермед!атом катабол13му етанолу, який виконуе функцш низькомолекулярного ефеетора катаболглю! репреси синтезу р-галактозидази у дршдаюв С. р5е^о1гор1саН5.

Алкогольлегцрогеназна акгившсть Кребтр1-пшитивних I Кребтр1-негативних дриклдов Ппснь етанолу в клтпп в першу чергу визначаеться акгивтстю алкотолъдепдрогенази, яка приймае участь в синтез! 1 катабол)ЗМ1 ща сполуки. Згщно з лпературиими даними (Сибирный, Титоренко, 1990) дискусшним залишаеться питания про участь алкоголвдепдрогенази у функцюнуванш етаноль-но1 катаболпно!' репреси фермен-пв обмшу метанолу у метилотрофних др^ждаов. Оскшьки у мутантов др!ждяав С. р5еийо(хор1са1в з бло^ованою алкогол-ьдегвдрогсназою, що приймае участь в окислеши етанолу, спосгер1галось порушення катаболяно1 репреси синтезу р-галактозидази, дослщжено алкогольдеддрогеназну актившсть 1 спектр алкогольдегщрогеназ у дикого типу 1 у мутантов дридаав з пошкодженими р1зними етапами катабол1зму етанолу. Цисаво було з'ясувати щ питания 1 для дрщдтав С. сшуаЦк, що за нашими даними не здаттутворювати етиловий спирт за умов аераци.

В екстракгах др1ждж1В С. рБеийоШэрюаЦз, вирощених в середовищах з лактозою та етанолом пр'отягом 24 год. культивування, алкогольдепдрогеназна актавшсть була приблизно в два-три рази вищою, и ¡ж у випадку використання глюкозиякджерелавуглецю. Варто вщмтгги, щоалкогольдеддрогеназнаактившсть др1ждж1в С. сютайи була значно нижчою, тжу С. pseudotгopicalis при використанш лакгози I глйкозп як джерел ¿углещо. Проте кятшам, що выросли на етанолг, властива значно вища ферментативна актившсть.

Дослщжуючи методом елекгрофорезу в ПЛАТ спектр алкогольдегщрогеназ лактозозасвоюючих др1ждж1в, ми встановшш, що у С. р8еийо!гор!саИ5 наявш шклъ молекулярних форм цього ферменту, а у С. ригуа1я15 - лише одна. Кшьисний склад молекулярних форм ферменту др1ждаов С. р$еиао1гор1саЦ5 помггао змшювався в залежносп вщ часу культивування та джерела вуглецю (глюкоза, лактоза, етанол). Дослщжуючи спектр алкогольдегщрогеназ в безкштинних екстракгах

мутантшк шталпв др1ждж1в С. рзеисЗойпрюаШ, не здатних катабол1зувати етанол, було показано, що у екстрактах 48-год. юнтин мупнтв труп Б 1 В з блокованою ацетил-КоА-сшггетазою I ацетальдепддепдрогеназою, гвдрбно як 1 у дикого типу, при росл на лактоз1 ч1псо бвдшяються три форми алкогольдегщрогенази (АДП, АДГШ, АДГУ1). У мутаттв групп А з пошкодженою алкогольдепдрогеназою фраюдя АДГ VI була вщсутня. Це щдтверджуе висновок про те, що у где! групи мутанта пошкоджена саме алкогольдеддрогеназа.

Г1ор1Вняшгя множинних форм алкогольдегирогеназ, акгившсть яких регулюеться джерелом вугаедю, вказуе на сутгеву '¿х вщмшшсть у Кребтр1-позитивних 1 Кребтрьнегативиих др1ждж1в. Очевидно, цеУ пов'язано з р13номатттстю функдШ ферменту, який вщцрае надзвичайно важливу роль в метабол1зм1 др1ждж1В.

Вплив етанолу на синтез деяких ферментов ЦТК

Доыцджено вплив етанолу на синтез цитратсинтази, НАДФ- та НАД-залежних ¡зоцитратдепдрогеназ, фумарази, 1зоцитратл1азитамалатсштазидрЬкдаав С. р5еийо1:горюаНх.

При вирощуванш др1ждаав в середов1тщ1злактозою активность цитратсинтази на 20 год. росту досягала 350 нмоль/мг бшка за 1 хв. За наявносп в серсдовипп етанолу, ревень активносп ферменту зростав бшьше як в 2 рази.

Яйцо ж клшши росли в середовицд, що мостило лактозу 1 етанол одно-часно, то активность цитратсинтази знижувались в 2,6 рази в поршнянт з кланами, що виросли на етанол! 1 була на 23% нюкча, чек в середовшщ з лактозою.

Дослщження цитратсинтазно! акгивносл вщмитнх клтш, яы шкубували

»

протягом 12 год. в середовищах з етанолом, лактозою, лактозою та етанолом виявило, що актившегь ферменту за наявносп в середовшш лактози 1 етанолу не перевишувала 45% активнос-п цитратсинтази при шкубацц клтш в середовиии з етанолом \ на 35% була меншою за актившеть ферме1ггу з клтш, що росли на лактоз1 (рис, 5).

Вшшву етилового спирту на актившеть ¡зодитратдепдрогенази (НАДФ- та НАД-залежно5) та фумарази нами виявлено не було (рис.5).

А В в Г

Рис. 5. Шдносна акгивтсть цитратсинтази (А), НАДФ-залежно!" ¡зоцитратдегщрогбнази (Б), НАД-залежно! 1зоцитратдегщрогенази (В) та фумарази (Г) при шкубацидр1жддав С. рэеи^иорюай в середовишд з лактозою (I) та лактозою 1 етанолом (II).

Встановлено, що при росл дрисджш С. рвеийоНорюаЦх в середовшцах з лактозою та лактозою 1 етанолом акгивтсть фермента глюксилатного шунта низька. Як видно з рис. 6 акгивтсть 1зоцитратл1ази за наявносп лакгози 1 спирту в середовиип становила 5% активности ферменту при рост! клпин в ссредовшщ з етанолом 1 була в 8 раз1В менша за активнють 1зоцитраттази кшгаи, що виросли в середовищ! з лактозою. Акгивтсть малатсинтази при росл др1ждаав С. р.чеисМгорюа^ середовинц, що мютить одночасно лактозу 1 етанол, лише незначно В1др1знялась за акгивтсть цього ферменту в клпинах дрыдоав, що росли на лактоз! (рис.6).

Рис. 6. Вцшосна актившсть ¡зоцнтрахшази (А) та малатсишази (Б) при росл др!ждж1в С. р5еис1оиорка115 в середовинн з лактозою (I) та лактозчю 1 етанолом (II).

Таким чином, nanii дослщження показують, що етанольна катаболтга penpecin розповсюджуеться на меншу ильюсть фермента, нж глюкозний ефекх i, очевидно, д1е лише на ключов1 фермента, яюшие ß-галактозидаза, дитратсинтаза та ¡зоцитратл1аза.

висновки

1. Дослщжено здатшсть 24 вщцв лакгозозаевоюючих др1ждаив утворювати етанол в аеробних умовах. За щею ознакою культури роздшяються на Крсбтрь позитивш (представники род1в Kluyveromyces, Candida) i Кребтрьнегативт (ДР1ЖДЖ1 роду Cryptococcus).

2. Вивчеш3aKOH0Mipn0cTi нагромадження етанолу, синтезу ß-галактозидази га використання лактози у С. pseudotropicalis та С. curvatus. Максимальна активн1сть ß-галактозидази у обидвох вид1в др1Ждаав припадае на середину логарифМ1Чно'1 фази росту. Швидюсть використання лактози др^жджами С. pseudotropicalis значно вища, нк у С. curvatus. На вщмшу вщ С. curvatus у С. pseudotropicalis виявлений д1ауксичний характер росту. Серед продукта катабользму лактози у С. pseudotropicalis в значних кшькостях виявлено етанол та онтову кислоту, а у С. curvatus - глюкозу.

3. Встановлено, що у дрЬкдоив С. pseudotropicalis i С. curvatus утворення ß-галактозидази пдаягас катаболгапй penpecii глюкозою. Вперше показало, що репрес!Я ферменту у цихдрЪкджв викликасться етанолом. Однак, ciyniiib пригтчення синтезу ß-галактозидази глюкозою та етанолом у них не однаковий.

4. Видиет мутанти дрЬкиов С. pseudotropicalis з пошкодженими алкогольдеддрогсназою, ацетальдепддедпрогеназою та ацетил-КоА-спнтстазога. Bei мутанти зберегли здатнють утворювати р-галактозидазу та ефективно транс-формувата лактозу в етанол. У мутанта з пошкодженою алкогольдепдрогеиазою та ацетальдепддепдрогеназою катаболтга репресш ß-галакгозидази етанолом була порушена, втой час, яку мутанта з бло кованою ацегил-КоА-синтетазою катаболгтна репрейя етанолом протгкала так як 1 у дикого типу. У век доелвджених мутанта дрйсдаав С. pseudotropicalis оцгова кислота в концентрацн 0,01% виянляла репресуючу дно на синтез ß-галактозидази аналопчпо до дикого типу.

5. Дослщжено алкогольдепдрогеназну актившсть та спектр алкогольдеддрогеназдр1ждж1вС. pseudotropicalis i C.curvatus в залежносп вщ BiKy культури i джерел вуглецевого живлення. Актившсть ферменту flpixjpKiB С. pseudotropicalis була на порядок вищою i представлена шктьма мшекуляршши формами, тод1 як у С. curvatus виявлена лише одна форма алкогольдепдрогенази.

6. Виявлено знижепня активности цитратсинтази та ¡зоцитрапиази, але не ¡зоцитратдегщрогенази (НАДФ- та НАД -залежних), фумарази та малатеинтази при росл дргждаав С. pseudotropicalis на лаклоз1 в присутносп етанолу.

СПИСОК РОБ1Т, ОПУБЛ1КОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦЙ

1. ГудзьС.П., ПрнаО.В., ГнатушС.О., ТретякО.1. Роль етанолу в регуляцй р-галактозидазно1 акгивносп Candida pseudotropicalis// Мжробюл. журнал. -1993. - 55, N 1 - С. 42-47.

2. Гудзь С.П., Првга О.В., Гнатуш С.О. Дели особливосп катабо.'изму вушеводав i регуляди р-гадакгозидазно! активносп улакдозозасвоюючихдр1жд-жгв // Мжробюл. журнал. - 1995. - 57, N 3. - С. 37-41.

3. Гудзь С.П., Гнатуш С.О., Закальський А.€. Впливумовкультивування на алкогольдепдрогеназну актившсть Candida pseudotropicalis// Мжробюл. журн. - 1995. - 57, N 5. - С. 40-43.

4. ГнатушС.О., Гудзь С.П., ТретякОЛ. Проетанольну катаболггнуpcnpeciio синтезу деяких ферменпв обмшу вушевод1в у др1ждаав//Акгуальт проблеми медидини, бюлоги, ветеринара i сшьського господарства. - Львгв. - 1995. -С. 70-72.

5. Гнатуш С.О., Гудзь С.П. Викорлетания молочно!енроватки i меласи для одержання етилового спирту !бикаодноюптишшх //Матергагщ Респубд. конференцц "Бютехнолопчш дослщження i персиективи ix розвитку". Лыив, 16-18 жовтня 1990. - С.79.

6. Гудзь С.П., Гнатуш С.А. Образование этилового спирта и дрожжевой биомассы на молочной сыворотке // Респ. конф. "Биотехнология получения кормовою белка". Днепропетровск. - 1990. - С.18-19.

7. Гудзь С.П., Гнатуш С.А. Особенности метаболизма лактозы сыворотки

дрожжами родов Cryptococcus и Candida // 1 МЬкнародний конгрес "Биоконверсия органических отходов". - Kiiia, 1991.- С.62-63.

8. Гудзь С.П., Прна О.В., Гнатуш С.О., Закальський A.C. Про катаболтгу penpeciio фермента обмшу вуглевод1в у др1ждж1в Candida pseudotropicalis // Всеукрашська конференщя з ф1зюлоги i öioxiMii. Тези доповшей. WlbBiß. -1994 р.- С. 50.

9. Гнатуш С.О., Закальський А.6. Актившсть алкогольдепдрогенази лактозозасвоюючих др1ждагв за р1зних умов культивування // Мгкробюл. журнал. - 1994^ - 56, N 1. - С. 47.

10. Гудзь С.П., Прна О.В., Гнатуш С.О., Третяк ОЛ.Про участь етанолу в регуляци ферменйв вуглеводного обмшу у др1ждж1в Candida pseudotropicalis// Мйсробюл. журнал. - 1994. - 56, N 1.-С. 49.

Гнатуш С.А.

Образование этилового спирта лактозоусваивающими дрожжами и его роль в регуляции синтеза ферментов обмена лактозы.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 - микробиология, Инстшутмикробнологин н вирусологии имД.К.Заболотиого HAH Украины, Киев, 1996.

РЕЗЮМЕ

Исследована способность лактозоусваивающих дрожжей синтезировать этанол в аэробных условиях при росте на лактозе и других сахарах. Основными промежуточными продуктами катаболизма лактозы, накапливающимися в культуре Кребтри-положительных дрожжей С. pseudotropicalis являются этанол и ацетат, а у Кребтри-отрицательпых С. curvatus — глюкоза. Установлено, что этанол, подобно глюкозе, репрессирует синтез ß-галактозндазы, цптратсинтазы, изоцитратлиазы у дрожжей С. pseudotropicalis. С помощью мутантов С. pseudotropicalis с поврежденными различными этапами катаболизма этанола показано, что ацетат выступает катаболитом-корепрессором в этанолыюй катаболитной репрессии синтеза ß-галактозидазы.

Ключош слова: лр1жлж1, мутанти, етанол, ацетат, катаболгтна репрссья, фсрмсптн обмшу лактози.

Gnatush S.A.

Ethanol production by lactose-assimilating yeast and its significance in the regulation of carbohydrate metabolism enzymes synthesis.

The Candidate Thesis for a Master's Degree, the Speciality 03.00.07. -Microbiology - Institute Microbiology and Virology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 1996.

SUMMARY

Capacity to ethanol formation under aerobic conditions of lactose-assimilating yeasts during the grow on lactose and other saccharides was investigated. Ethanol and acetic acid has been found among lactose catabolism products in CTabtry-positive yeast C. pseudotropicalis, glucose - in Crabtry - negative yeast C. curvatus. It was established that ethanol similar to glucose inhibits synthesis of p-galactosidase, isocytratsynthase and isocytratlyase in C. pseudotropicalis. C. pseudotropicalis mutants with impaired enzymes of certain steps of ctlianol catabolism were isolated. It was observed that only acetate is catabolite-corepressor of p-galactosidase synthesis.