Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Образование активных форм кислорода под влиянием ионов уранила и их токсическое действие

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Образование активных форм кислорода под влиянием ионов уранила и их токсическое действие"

005059464

На правах рукописи

ГАРМАШ СВЕТЛАНА АНАТОЛЬЕВНА

ОБРАЗОВАНИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА ПОД ВЛИЯНИЕМ ИОНОВ УРАНИЛА И ИХ ТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ

Специальность 03.01.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

а іЗ

Пущино -2013

Работа выполнена в Лаборатории изотопных исследований Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук и в Учебном центре «Биофизика и биомедицина» Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пущинский государственный естественно-научный институт».

Научный руководитель: доктор биологических наук

Гудков Сергей Владимирович

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор

Акатов Владимир Семенович (зав. лабораторией тканевой инженерии ИТЭБ РАН, г. Пущино)

доктор биологических наук, профессор Воейков Владимир Леонидович (проф. кафедры биоорганической химии биологического факультета МГУ, г. Москва)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт общей физики им. А.М. Прохорова Российской академии наук

Защита диссертации состоится « » ИЮК.<2. 2013 г. в ^¿Гч. Зо мин. на заседании совета Д 002.093.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке ПНЦ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан « » оО^-^р? )Л& 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, /■

кандидат физико-математических наук Ланина Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В результате деятельности человека концентрация урана в природе достигает достаточно высоких значений и может варьировать в пределах от 0,01 мкг/л до 12,4 мг/л [Depleted Uranium: Sources, Exposure and Health Effects,

2001]. В почве и воде уран преимущественно встречается в виде свободных ионов уршшла (U022+) или в виде их комплексов [Duquene et al., 2010]. Давно известно, что ионы уранила представляют непосредственную опасность для экосистем [Sheppard et al., 2005], на организменном уровне могут быть причиной ряда патологий [Ни et al., 1990], проявляя существенные мутагенные и канцерогенные свойства [Miller et al.,

2002]. Подавляющее большинство известных работ сосредоточено на описании феноменологии повреждающего действия ионов уранила [Smith et al., 2009, Cheng et al., 2010, Trenfield et al., 2011, Orona & Tasat, 2012]. Причиной повреждающего действия ионов уранила на организм считают, с одной стороны, ярко выраженную радиоактивность изотопов урана [Бекман, 2009], с другой — их химическую токсичность, а именно - способность обратимо взаимодействовать с боковыми группами белков и аминокислот (например, с сульфгидрильпыми), что может приводить к инактивации ряда ферментов [Pible et al., 2010], а также способность к образованию комплексов, что негативно сказывается на обмене биологически значимых анионов и катионов [Baker, 2012]. Нужно отметить, что механизму химической токсичности ионов уранила традиционно отводится меньшее внимание, так как он наблюдается при остром воздействии и при достаточно высоких концентрациях [Cheng et al., 2010]. Образование активных форм кислорода и окислительных повреждений биополимеров за счет радиоактивности изотопов урана, а также ингибирование ряда ферментов антиоксидантной защиты и репарации, в большинстве случаев приводит к развитию окислительного стресса [George et al., 2011, Orona & Tasat, 2012]. В нашей лаборатории было высказано предположение о том, что существует дополнительный механизм инициации окислительного стресса ионами уранила, который связан преимущественно с физико-химической генерацией АФК под действием этих ионов [Смирнова и др., 2011]. В связи с вышеизложенным, исследование альтернативных процессов, лежащих в основе развития окислительного стресса, индуцированного ионами уранила, представляет собой актуальную научную проблему.

Цель и основные задачи исследования. Цель данной работы заключалась в исследовании образования активных форм кислорода под влиянием ионов уранила в водных растворах и их токсического действия в различных биологических системах. В соответствии с целью были поставлены основные задачи:

1. Исследовать влияние ионов уранила в микромолярных концентрациях на генерацию АФК в водных растворах под действием тепла или видимого света, выявить факторы, влияющие на этот процесс и оценить вклад естественной радиоактивности урана.

2. Изучить влияние ионов уранила в микромолярных концентрациях на образование окислительных повреждений ДНК и белков in vitro и in vivo.

3. Исследовать влияние ионов уранила на основные физиологические параметры митохондрий, оценить возможный вклад митохондрий в развитие индуцированного ионами уранила окислительного стресса.

4. Оценить радиомодифицирующий потенциал микромолярных концентраций ионов уранила на организменном уровне.

Научная новизна. Показано, что в присутствии ионов уранила в микромолярных концентрациях в водных растворах происходит существенное усиление образования АФК под действием тепла, видимого света и рентгеновского излучения. Выявлены ключевые факторы, влияющие на этот процесс. Установлено, что увеличение интенсивности генерации АФК в присутствии ионов уранила по большей части обусловлено их физико-химическими свойствами, а не природной радиоактивностью. С помощью метода индуцированной хемилюминесценции белка впервые показано образование долгоживущих радикальных форм белка под влиянием ионов уранила. Установлено, что при внутрибрюшинном введении ионов уранила в микромолярных концентрациях мышам наблюдается высокий уровень окислительных повреждений белков плазмы крови. Показано, что в присутствии ионов уранила в растворе с ДНК происходит интенсивное образование 8-оксогуанина - ключевого биомаркера окислительных повреждений ДНК. Установлено, что при внутрибрюшинном введении мышам ионов уранила в микромолярных концентрациях в костном мозге наблюдается увеличение уровня полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ), содержащих микроядра (МЯ). Показано, что ионы уранила в микромолярных концентрациях не влияют на функционирование митохондрий. Показано, что ионы уранила в существенной мере модифицируют повреждающее действие ионизирующей радиации при тотальном облучении мышей. Научно-практическая ценность. В работе показано, что ионы уранила в микромолярных концентрациях обладают значительными прооксидантными, генотоксическими и цитотоксическими свойствами. При этом наблюдаемые эффекты по большей части связаны с физико-химическими свойствами ионов уранила, а не с их радиоактивностью. Полученные результаты могут быть использованы при научном обосновании безопасных санитарно-гигиенических нормативов концентрации ионов уранила в среде и указывают на необходимость корректировки «Требований к защите от природного облучения в производственных условиях» (СП 2.6.1. 758-99).

Апуобаиия работы. Материалы диссертации были представлены на 14—16-й конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010-2012), на Съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2010), на IX Конференции, посвященной дню космонавтики (Москва, 2010), на III Всероссийском конгрессе «Симбиоз-Россия 2010» (Нижний Новгород, 2010), на Международной конференции «Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии» (Санкт-Петербург,

2011), на Международной конференции «Современные проблемы радиобиологии» (Гомель, 2011), на конференции «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино, 2011-2012), на VII Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, 2012), на I Всероссийской молодежной конференции «Актуальные проблемы биологии и химии» (Пущино, 2012). Материалы конференций опубликованы в виде тезисов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 работ, из них 7 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 1 рецензируемая статья в иностранном журнале и 11 тезисов докладов.

Финансовая поддержка. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (№ 10-04-01264-аи 10-04-00969-а).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 93 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (2 главы), методической части, изложения полученных результатов и их обсуждения (4 главы), выводов, списка цитируемой литературы ('i¿^источников). Работа иллюстрирована •j^рисунками и содержит ¿ таблиц.

Список принятых сокращений. АФК - активные формы кислорода, ККК -кумарин-3-карбоновая кислота, 7-ОН-ККК — 7-гидроксикумарин-З-карбоновая кислота, ОУ - обедненный уран, ПХЭ - полихроматофильные эритроциты, МЯ -микроядра, ФИД - фактор изменения дозы, ДЖРБ - долгоживущие радикалы белка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Определение продукты гидооксильных радикалов осуществляли с помощью их реакции с ККК, продукт гидроксилирования которой - 7-ОН-ККК — является удобным флуоресцентным маркером для определения образования этих радикалов [Черников и Брусков, 2002]. Флуоресценцию 7-ОН-ККК измеряли на спектрофлуориметре Сагу Eclipse (Австралия) с Х„ = 400 нм, = 450 нм [Гудков и др., 2012].

Определение концентрации перекиси водорода в водных растворах осуществляли с помощью высокочувствительного метода усиленной хемилюминесценции в системе люминол-4-йодофенол-пероксидаза [Bruskov et al., 2002]. Регистрацию величины хемилюминесценции проводили на жидкостном сцинтилляционном счетчике «Бета-1» (СССР), работающем в режиме счета одиночных фотонов [Bruskov et al., 2012].

Определение концентрации растворенного в воде кислорода проводили с помощью оксиметрического электрода ДКТП 02.4 на приборе «Эксперт-001» (Эконикс, Россия). Изменение концентрации кислорода в воде проводили путем барботирования кислородом или аргоном в течение 20 мин [Гудков и др., 2010]. Измерение индуцированной рентгеновским излучением люминесценции белковых растворов проводили на хемилюминометре «Биотоке 7АМ» (Россия). Измерение люминесценции всех образцов проводилось не менее чем в течение 30 с [Гудков и др., 2010а; Гудков и др., 20106].

Иммуноферментный anana. Для количественного определения 8-оксогуанина в ДНК использовали иммуноферментный анализ с применением моноклональных антител, специфичных к 8-оксогуанину [Bruskov et al., 2002].

Оиенка функциональных параметров митохондрий. Состояние дыхательной цепи митохондрий исследовали полярографически, используя кислородный электрод типа Кларк [Mironova et al., 2007]. Количество Са2+, необходимого для образования циклоспорин-А-чувствителыюй Са 2+-индуцируемой поры в митохондриях, оценивали с помощью Са2+-селективного электрода «Нико Аналит» (Россия) [Belosludtsev et al., 2010]. Скорость образования Н202 суспензией митохондрий печени измеряли с помощью флуоресцентного индикатора Amplex red = 563 нм, Хет, = 578) на спектрофлуориметре Сагу Eclipse (Австралия) [Белослудцев и др., 2012].

Определение окислительных модификаиий белков по уровню карбонильных производных под действием ионов уранила осуществляли с помощью 2,4-динитрофенилгидразина. Концентрацию карбонильных групп рассчитывали при длине волны 370 нм, используя коэффициент молярной экстинкции, равный 2,1 х 104 М'1 х см"1 [Дубинина и др., 1995].

Подготовка животных и облучение. Животных содержали на стандартном рационе и подвергали тотальному рентгеновскому облучению с мощностью дозы 1 Гр/мин, помещая в специальные клетки на рентгеновской терапевтической установке «Рут 15» (Мосрентген, Россия).

Микроядерный тест. Величину цитогенетических повреждений определяли по появлению ПХЭ, содержащих МЯ. Мышей умерщвляли методом цервикальной дислокации через 24 ч после облучения в дозе 1 Гр. Гистологические препараты готовили и окрашивали по стандартной методике с модифицированным растворением клеточного материала [Гудков и др., 2008, Карп и др., 2010]. Тест на выживаемость. Выживаемость самцов аутбредных мышей Kv.SHK в возрасте 10 недель массой 28-31 г фиксировали ежедневно в течение 30 суток после воздействия ионизирующего излучения. Контролем служили две группы мышей: инъекцированные изотоническим раствором и облученные в той же дозе или не подвергшиеся облучению [Gudkov et al., 2006].

Подсчет Форменных элементов крови. Образцы периферической крови брались из хвостовой вены мышей. Все экспериментальные процедуры описаны ранее [Gudkov etal., 2009].

Статистический анализ. Средние значения в экспериментальных группах сравнивали с контрольной группой, используя непараметрический {/-тест (критерий числа инверсий Манна-Уитни для малых выборок). В экспериментах на выживание различия между группами сравнивались по точному критерию Фишера. При р < 0,05 отличие считалось статистически значимым.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Образование активных форм кислорода в растворах, содержащих ионы уранила

Влияние различных концентраций ионов уранила на образование гидроксильных радикалов in vitro при воздействии тепла представлено на рис. 1. Данные получены с помощью высокоспецифичного флуоресцентного зонда для гидроксильных радикалов - кумарин-3-карбоновой кислоты. Показано, что в присутствии уранилнитрата в водных растворах наблюдается существенно более интенсивное образование гидроксильных радикалов. Так при воздействии уранилнитрата в концентрациях 1, 2, 5, 10, 50 мкМ и тепла количество образующихся гидроксильных радикалов увеличивается относительно контроля в 3, 7,10,13 и 28 раз.

Рис. 1. Влияние ионов уранила в различных концентрациях на образование 'ОН in vitro под действием тепла (80°С, 120 мин) в 20 мМ фосфатном буфере (ФСБ) pH 7,4 (л=3-5, 0,9 -значение медианы, I - 25%~75%, * -/><0,05, (/-тест)

Показано, что наличие в среде нитрата натрия в существенной мере не влияет на образование

гидроксильных радикалов. Зависимость интенсивности генерации гидроксильных радикалов (Y) от концентрации ионов уранила (X) аппроксимируется уравнением Y=15,8 + 51,3 lnX (R2 = 0,96), тогда как при превалировании радиационной компоненты полученные результате аппроксимировались бы уравнением прямой, чего не происходит на самом деле (R2 =0,63).

Показано, что при увеличении температуры в диапазоне от 40°С до 80°С скорость образования гидроксильных радикалов в присутствии ионов уранила значительно увеличивается по сравнению с контрольными образцами (ФСБ 20 мМ, pH 7,4) и образцами, содержащими нитрат натрия. Величину энергии активации процесса образования гидроксильных радикалов определяли как тангенс угла наклона прямой логарифмической зависимости к от обратной температуры на графике Аррениуса (рис. 2): -lg/t = -IgAo + EJ2,3RT, где Еа - энергия активации, R - газовая постоянная, Т — абсолютная температура. Энергия активации образования гидроксильных радикалов при нагревании в фосфатном буфере (20 мМ, pH 7,4), содержащем или не

О 10 20 30 40 50

[U022+],mkM

[N03"]/2,mkM

содержащем 20 мкМ МаМОз оказалась равной 25 ккал/моль, в фосфатном буфере (20 мМ, рН 7,4), содержащем 10 мкМ и02(ЬЮз)2 - 21 ккал/моль.

Рис. 2. График Аррениуса зависимости от обратной температуры для определения энергии активации

образования гидроксильных радикалов при нагревании (к -константа скорости генерации гидроксильных радикалов, с"1; Г-температура, К)

Известно, что удельная радиоактивность не зависит от температуры. Поэтому полученные данные

позволяют утверждать, что наблюдаемые эффекты существенного увеличения интенсивности генерации гидроксильных радикалов в присутствии ионов уранила по большей части обусловлены их физико-химическими свойствами, а не радиоактивностью [Гармаш и др., 2012а, ОагтаБЬ е! а1., 2013].

Таблица 1. Значения скорости (0 генерации гидроксильных радикалов в фосфатном буфере (20 мМ, рН 7,4) содержащем уранилнитрат (10 мкМ) и/или аскорбиновую кислоту (АК) (100 мкМ) при температуре 40°С (2 ч)

Воздействие [Oil мкМ V, моль/л/с

Контроль U02(N03)2 АК U02(N03)2+AK

Контроль 203 2,8 х Ю-14 8,8 х 10"13 — 2,8 х 10"9

Барботирование Аг 130 1,0 х 10"14 2,9 х 10"13 — 5,1 х Ю"10

Барботирование 02 450 1,2 х Ю-13 7,4 х 10"12 — 1,4 х 10'8

Влияние восстановителя на образование гидроксильных радикалов in vitro при воздействии тепла представлено в табл. 1. В качестве восстановителя использовали аскорбиновую кислоту. В присутствии 10 мкМ уранилнитрата образование гидроксильных радикалов под действием тепла происходит почти на порядок эффективнее по сравнению с контролем (ФСБ 20 мМ, рН 7,4). Показано, что наличие в среде аскорбиновой кислоты в существенной мере ингибирует процесс образования гидроксильных радикалов под действием тепла. При добавлении уранилнитрата совместно с аскорбиновой кислотой наблюдается на три порядка более интенсивное образование гидроксильных радикалов по сравнению с пробами, содержащими только уранилнитрат. Важным является также тот факт, что при уменьшении концентрации кислорода в среде интенсивность образования гидроксильных радикалов уменьшается во всех исследуемых группах. Таким

образом, образование гидроксильных радикалов в водных растворах под действием ионов уранила зависит от наличия доступного восстановителя и концентрации кислорода в среде.

С помощью высокоспецифичного флуоресцентного зонда для гидроксильных радикалов - кумарин-3-карбоновой кислоты, установлено, что в присутствии уранилнитрата в водных растворах при воздействии видимого света происходит существенное увеличение образования гидроксильных радикалов по сравнению с неосвещенным контролем (табл. 2).

Таблица 2. Влияние ионов уранила в различных концентрациях на образование 'ОН in vitro под действием видимого света (83,3 Вт/м2) в течение 2 ч в 20 мМ фосфатном буфере рН 7,4 (20°С) (л = 3, * -р < 0,05 (¿/-тест))

[U02+2], мкМ [*ОН], нМ (медиана (размах))

0 8,9(7,6-9,6)

10 13,1* (11,5-13,8)

50 26,0* (23,2-30,0)

100 44,9* (38,0-46,6)

При увеличении концентрации ионов уранила образование гидроксильных радикалов происходит более эффективно. При концентрации ионов уранила 100 мкМ образование гидроксильных радикалов относительно освещенного контроля увеличивается в 5 раз. С уменьшением энергетической освещенности образцов наблюдается уменьшение скоростей образования гидроксильных радикалов (данные не представлены).

С помощью высокоспецифичного флуоресцентного зонда для гидроксильных радикалов — кумарин-3-карбоновой кислоты, установлено, что в присутствии уранилнитрата в водных растворах при воздействии рентгеновского излучения в дозе 1 Гр происходит более интенсивное образование гидроксильных радикалов по сравнению с пробами, облученными в дозе 1 Гр, но не содержащими уранилнитрат. Установлена зависимость образования гидроксильных радикалов от концентрации уранилнитрата. При наличии в среде гапрата натрия данный феномен не наблюдается.

Методом усиленной хемилюминесценции показано, что при воздействии на растворы уранилнитрата теплом (40°С, 3 ч) наблюдается в 3-5 раз более интенсивное образование перекиси водорода по сравнению с непрогретыми образцами. Уранилнитрат в концентрациях 50 мкМ в 1 мМ фосфатном буфере рН 7,4 под действием тепла (40°С, 3 ч) приводит к образованию 12 нМ перекиси водорода. Эквимолярпые концентрации нитрата натрия приводили к незначительному уменьшению образования перекиси водорода по сравнению с контролем.

Методом усиленной хемилюминесценции показано, что уранилнитрат в концентрациях 5-100 мкМ значительно увеличивает продукцию перекиси водорода при освещении по сравнению с контролем (рис. 3). Эквимолярпые концентрации

нитрата натрия не приводили к существенному изменению образования перекиси водорода по сравнению с контролем. При концентрации ионов уранила 100 мкМ наблюдается практически в 5 раз более интенсивное фотоиндуцированное образование перекиси водорода. В отсутствие воздействия видимого света ионы уранила проявляют прооксидантные свойства в значительно меньшей степени (рис.

3).

100 80 60 ' 40 20 0

с + ио2'

Рис. 3.

Изменение

концентрации перекиси

водорода в фосфатном буфере (1мМ, рН 7,4) в зависимости от концентрации ионов уранила и нитрата (п = 4, 0,Ф,т -значение медианы, I - 25%-75%, * -/><0,05, £/-тест) (20°С). С1 - при воздействии видимого света (83,3 Вт/м2) в течение 2 ч. Сг - при экспозиции в темноте в течение 2 ч

20

40 60 [иОг2+], мкМ

80

100

[Ш3-]/2,мкМ

На рис. 4 представлено влияние ионов уранила, аскорбиновой кислоты и каталазы на концентрацию кислорода в водных растворах (фосфатный буфер, разведенная в десять раз термически инактивированная сыворотка, культуральная среда). Показано, что при добавлении уранилнитрата наблюдается тенденция к уменьшению концентрации молекулярного кислорода в исследуемом растворе.

и02(^03)2 аскорбиновая кислота 10 мкМ / (ЮО мкМ)

200

190

сч О

180

Рис. 4. Влияние ионов уранила (10 мкМ), аскорбиновой кислоты (100 мкМ) и каталазы (1 ед/мл) на концентрацию кислорода в водных растворах (40°С). Представлен репрезентативный опыт, измерения проводили в фосфатном буфере рН 7,4

При последующем

внесении аскорбиновой

кислоты наблюдается

интенсивное уменьшение концентрации молекулярного кислорода, достаточно

хорошо описываемое

функцией экспоненциального затухания. При внесении каталазы, фермента разлагающего перекись водорода до воды и молекулярного кислорода, наблюдается

60 80 100 120 140 160 180

Время, мин

увеличение концентрации молекулярного кислорода в растворе. При добавлении нитрата натрия или аскорбиновой кислоты к растворам, не содержащим ионы уранила, существенного изменения концентрации молекулярного кислорода не наблюдается (данные не представлены). Полученные результаты позволяют утверждать, что в результате взаимодействия ионов уранила и восстановителя происходит значительное потребление растворенного молекулярного кислорода и образование существенных количеств перекиси водорода.

Таким образом, показано, что в присутствии ионов уранила происходит образование АФК, причем при совместном воздействии либо с теплом, либо с видимым светом в существенной степени более интенсивно. Способность ионов уранила к образованию АФК зависит от: 1) интенсивности воздействия физического фактора (рис. 1-3, табл. 1, 2); 2) наличия в среде восстановителя (табл. 1); 3) наличия в среде растворенного молекулярного кислорода (табл. 1).

Процесс образования АФК в водных растворах, по всей видимости, происходит

следующим образом (1-5)

U022+ + hv (кТ)-> *U022+ (1)

*U022+ + RH-» U02+ + II* + Н+ (2)

2U02+ + 02 + 2Н+ -> 2U022+ + Н202 (3)

2UOj+ + 4Н+ Ш22+ + U4+ + 2Н20 (4)

U02+ (U4*) + Н202 -> U022+(U54) + 'ОН + "ОН (5)

Известно, что ион уранила поглощает ближнее ультрафиолетовое излучение и видимый свет в синей и частично зеленой областях. Фотоактивация ионов уранила приводит к переходу его в возбужденное состояние (*U022+) (1) [Мао&Вакас, 1997]. Предполагается, что под действием тепла могут происходить сходные процессы (1). Известно, что в возбужденном состоянии ионы уранила могут более эффективно реагировать с восстановителями, анионами и органическими субстратами (2) [George et al., 2011]. Одним из продуктов этой реакции является U02+, данное соединение в водных растворах преимущественно вступает в три реакции: реакция с молекулярным кислородом (3), реакция диспропорционирования (4) и реакция с перекисью водорода (5) [Бекман, 2009, George et al., 2011]. Вероятность протекания всех реакций в нашем случае зависит, по сути, от концентрации молекулярного кислорода, перекиси водорода и самого U02+. Поскольку концентрация молекулярного кислорода в исследуемых нами условиях примерно в 30 раз больше исходной концентрации ионов уранила и на несколько порядков больше концентрации U02+ и перекиси водорода, можно предполагать, что основной протекающей реакцией будет реакция (3). Данная реакция приводит к накоплению перекиси водорода, которая в дальнейшем расщепляется по реакции (5), чему должен способствовать U4+, который является одним из продуктов диспропорционирования U02+ (4). При этом происходит интенсивное образование гвдроксилыюго радикала [Boncella, 2008].

Образование повреждений белка и ДНК под действием ионов урапнла

С помощью метода индуцированной хемилюминесцснции белка показано образование долгоживущих радикальных форм белка при воздействии тепла (45°С, 2 ч) и влияние ионов уранила на этот процесс (рис. 5).

я я

S 600

К 400

о

Я

о

а

X

S 2

200 -

—•— Контроль -О- U022+ (1 мкМ) >22+ (10 мкМ) (100 мкМ)

2 3 Время, ч

Рис. 5. Влияние ионов уранила на образование долгоживущих радикалов БСА (1г/л) in vitro под действием тепла (45°С, 2 часа) (п=3-5, 0,в,Ш,П - значение медианы, I - 25%-75%, * -р <0,05, U--Kст)

Прогревание растворов БСА в присутствии ионов уранила в концентрации 1 мкМ не приводит к существенному изменению количества долгоживущих радикалов БСА по сравнению с контролем (прогретый БСА). Прогревание растворов БСА при добавлении ионов уранила в концентрациях 10-100 мкМ приводит к более интенсивному образованию долгоживущих радикальных форм белка по сравнению с контролем. Эквимолярные концентрации нитрата натрия не влияли существенным образом на этот процесс. Суть установленного феномена в достаточной мере описывают уравнения (1) и (2), приведенные выше. Вклад ионов уранила в регистрируемую люминесценцию не превышал 7%, что позволяет также говорить преимущественно о физико-химической природе образования долгоживущих радикальных продуктов БСА [Гармаш и др., 2012а].

Далее было исследовано влияние ионов уранила на образование окислительных модификаций белков при внутрибрюшинном введении уранилнитрата в различных концентрациях мышам Kv:SHK (рис. 6). Использованные концентрации ионов уранила 0,1-0,5 мкг/г эквивалентны эффективным концентрациям ионов уранила 210 мкМ в системах in vitro. С увеличением концентрации ионов уранила, вводимых мышам, содержание карбонильных производных в сыворотке их крови увеличивается. При максимальной исследуемой концентрации ионов уранила (0,50 мкг/г) содержание карбонильных производных увеличивается почти в два раза по сравнению с интакгными животными. При тотальном облучении животных в дозе 1 Гр содержание карбонильных производных увеличивается примерно в 1,8 раза. Воздействие ионов нитрата вплоть до концентраций 0,50 мкг/г существенно не влияло на поврежденность белков.

*f

£ 8

4 о

05 7

s

0

С й б

2S Ё Й I 5

1 Й4

я * J ;> 2

1 Гр HBI

0,00 0,10 0,25

2+

0,50

UO2 , мкг/г живого веса

Рис.6. Образование

карбонильных производных под действием ионов уранила в плазме крови самцов мышей. (п = 3-5, В - значение медианы, □ - 25%-75%, □ -размах, — - среднее, * -р <0,05, и-тест). 1Гр НВ1 -животных облучали тотально в дозе 1 Гр

Таким образом,

воздействие около 0,25 мкг/г ионов уранила на организм мыши эквивалентно ее

облучению в дозе около 1 Гр [Garmash et al., 2013].

Известно, что ключевым биомаркером повреждения ДИК под действием АФК является 8-оксогуанин. Методом иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител к 8-оксо1уанииу было количественно определено образование 8-оксогуанина в ДНК спермы лосося под действием различных концентраций уранилнитрата (рис. 7). С увеличением концентрации уранилнитрата уровень образования 8-оксогуанина в ДНК возрастает.

Рис. 7. Влияние различных концентраций ионов уранила на образование 8-оксогуанина в ДНК in vitro (40°С, 120 мин) (л = 4, • - значение медианы, I — 25%-75%). Фоновые значения и эффекты ниграт-ионов вычтены из полученных данных. Вставка: влияние ионов

уранила (100-500 мкМ) на образование 8-оксогуанина в ДНК in vitro под действием тепла (п = 4, • — значение медианы, I - 25%-75%)

Под действием нитрата натрия не наблюдается увеличения содержания 8-оксогуанина в ДНК. При тепловом воздействии (40°С) на раствор ДНК количество 8-оксогуанина увеличилось по сравнению с ДНК, находившейся при комнатной температуре (20°С) в 7 раз при концентрации уранилнитрата 500 мкМ. При совместном действии тепла и уранила образование 8-оксогуанина увеличивается.

[U022+ ], мкМ

100

Расчетные данные показывают, что радиационный вклад уранила в образование 8-ОГ в ДНК почти на два порядка меньше, чем представлено на рис. 7, что также говорит о физико-химической природе повреждения гуанина в ДНК [Гармаш и др., 2012а; Гармаш и др., 20126; Белослудцев и др., 2012].

Как показано выше, основной причиной образования повреждений биомакромолекул под действием окислов урана может быть их высокая химическая активность, приводящая к генерации активных форм кислорода и окислительным повреждениям ДНК. Кроме того, из литературы известно, что положительный заряд ионов уранила способствует их эффективному связыванию с отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК [Bruskov & Kiselev, 1968], что в ряде случаев может приводить к разрывам ДНК [Yazzie et al., 2003] и образованию гуанил-анион радикала, который долгое время мигрирует по остаткам гуанина в ДНК (DNA hole hopping) вплоть до окисления одного из остатков гуанина молекулярным кислородом [Conwell, 2005].

Цитотоксические и генотоксические свойства нонов ураннла

На рис. 8 приведены результаты влияния урашшштрата на жизнеспособность клеток культуры НЕр-2. Увеличение количества нежизнеспособных клеток наблюдается через 48 ч после обработки уранилнитратом в концентрации выше 10 мкМ. При меньших временах инкубации клеток с уранилнитратом наблюдалось меньшее количество нежизнеспособных клеток. Напротив, с увеличением концентрации ионов уранила процент погибших клеток существенно возрастал [Garmash et al., 2013].

£ Рис. 8. Цитотоксический

эффект ионов уранила (1-100 мкМ) на клетки человеческой карциномы гортани (НЕр-2) (л = 3, • - значение медианы, I -25%-75%, * -р < 0,05, САтесг). Вставка: цитотоксический

эффект ионов уранила (0,2-1,0 мМ) на клетки НЕр2 (п - 3, • -значение медианы, I - 25%-75%, *-р< 0,05, (/-тест)

Воздействие нитрат-ионов вплоть до концентраций 200 100 мкМ не влияло на жизнеспособность клеток [Белослудцев и др., 2012]. что использованная нами культура НЕр-2 является

[U022+], мкМ

Стоит отметить,

резистентной к воздействию различных повреждающих факторов химической и физической природы, вызывающих окислительный стресс, по сравнению с нетрансформированными клетками, особенно клетками костного мозга, тимуса,

эпителия ЖКТ и т.д. [Chen, 1988]. Для сравнения, воздействие на клетки НЕр-2 рентгеновским излучением в дозе 5 Гр через 48 ч после облучения приводит к появлению чуть более 3% нежизнеспособных клеток, что в принципе сопоставимо с реакцией клеток ЦНС, почек, печени, костно-мышечной системы и эквивалентно воздействию уранилнитрата в концентрации 100 мкМ в течение 48 ч [Гармаш и др., 2011, Garmash et al., 2013].

Известно, что система кроветворения является одной из наиболее чувствительных к различным повреждающим воздействиям. Метод микроядерного теста является одним из наиболее эффективных для количественной оценки цитогенетических повреждений, таких как ПХЭ с МЯ в костном мозге. Результаты влияния ионов

уранила на выход ПХЭ с МЯ в костном мозге мышей представлены на рис. 9.

Рис. 9. Образование ПХЭ с МЯ в костном мозге мышей, получивших ионы уранила (н = 3-5, Н - значение медианы,

□ -25%-75%, □ -размах,--

среднее, * - /><0,05, (/-тест). 1 Гр HBI - животных облучали тотально в дозе 1 Гр

На графике видно, что после воздействия на организм животных ионов уранила в количестве 0,10 мкг/г процент ПХЭ с МЯ увеличивается примерно в два раза: от 0,38 % в отсутствии воздействия до 0,66% при воздействии ионов уранила. При введении животным ионов уранила в концентрациях 0,25 и 0,50 мкг/г количество ПХЭ, содержащих МЯ, увеличивается в среднем в 5 и 9 раз. Зависимость образования ПХЭ с МЯ от концентрации уранила близка к линейной. При тотальном облучении животных в дозе 1 Гр процент ПХЭ с МЯ увеличивается примерно в 9 раз: от 0,38 % в отсутствии воздействия до 3,49% при воздействии рентгеновского излучения в дозе 1 Гр. Воздействие нитрат-ионов вплоть до концентраций 0,5 мкг/г существенно не влияло на содержание ПХЭ с МЯ в костном мозге мышей. После воздействия на организм животных нитрат-ионов в концентрации эквивалентной 0,50 мкг/г концентрации ионов уранила процент ПХЭ с МЯ увеличился примерно в 1,5 раза от 0,38 % при отсутствии воздействия до 0,59 % при воздействии нитрат-ионов.

Известно, что накопление ионов уранила в организме приводит к появлению различных патологий [Barillet et al., 2011], что, вероятно, связано с их высокой генотоксичностью и цитотоксичностыо. Одной из основных причин генотоксичности окислов урана может быть их высокая физико-химическая

4 •

; з 2

0,00 0,10 0,25

0,50

1 Гр HBI

UO2 , мкг/г живого веса

активность, в частности, приводящая к генерации АФК, окислительным повреждениям ДНК и белков.

Данные, полученные нами in vivo, согласуются с результатами, полученными in vitro и являются косвенным подтверждением того, что процессы, происходящие при воздействии ионов уранила и ионизирующей радиации сходны на качественном уровне. Данное сходство, вероятно, опосредовано генерацией АФК, что приводит к развитию окислительного стресса и реализуется, как в резистентных, так и в чувствительных к окислительному стрессу клетках.

Влияние уранилнитрата на функциональные параметры митохондрий печени крыс и мышей

Как показано выше, действие ионов уранила приводит к гибели клеток. Многочисленные исследования механизмов цитотоксического действия веществ различной природы показали, что в их основе зачастую лежит развитие окислительного стресса, сопровождающееся повреждением макромолекул [Miyake & Yamasaki, 2012]. Как известно, митохондрии являются основным поставщиком АФК в клетке [Korshunov et al., 1997]. В связи с этим исследована роль митохондрий в развитии окислительного стресса, индуцированного ионами уранила. Митохондрии выделяли из печени, так как данпый орган является одним из основных депозитариев ионов уранила в организме млекопитающих. Исследование проводили через 1, 5 и 11 суток после введения ионов уранила в концентрации 0,5 мкг/г. При сравнении двух групп мышей, получивших или не получивших ионы уранила не выявлено каких либо существенных различий в дыхании, Са2+-емкости митохондрий и скорости образования ими Н202. Однако, данный результат не доказывает отсутствие возможного влияния ионов уранила на функциональные параметры митохондрий при более высоких концентрациях. В связи с этим для установления пороговых концентраций ионов уранила, способных оказывать влияние на функциональные параметры митохондрий, проведено исследование этого процесса in vitro. В качестве объекта были выбраны крысы, так как печень крысы гораздо больше по размеру и дает возможность готовить большее количество проб из одной особи. Как видно из табл. 3, добавление ионов уранила в концентрации 1 мМ к суспензии митохондрий приводит к незначительному уменьшению скорости дыхания митохондрий в состоянии 3. При этом скорость дыхания митохондрий в состоянии 4 в присутствии ионов уранила оставалась на том же уровне.

Таблица 3. Влияние ионов уранила на дыхание митохондрий печени крыс (п = 3-4,

данные представлены как медиана (размах)). *-р< 0,05; ** - Дыхательный контроль (ДК) рассчитан как отношение У3/У4

U02(N03)2, мМ К дыхания (нмоль 02/мин/мг белка)

у2 Уз У* ^ДНФ ДК**

0,0 13,1(11,4-16,7) 64,0(52,1-70,3) 16,8(15,6-18,5) 84,4(84,3-84,6) 3,7

1,0 13,8(12,9-14,2) 55,7(54,3-57,6) 16,5(16,3-16,6) 72,1(71,9-72,7)* 3,4

2,5 10,5(9,7-11,3) 45,5(43,3-48,1)* 15,0(14,5-15,4)* 55,9(54,1-57,9)* 3,0

Следовательно, параметр дыхательного контроля (VJV4 - отношение скорости дыхания в присутствии АДФ к скорости дыхания, когда весь АДФ уже израсходован) также снижался. Кроме того, уранилнитрат в концентрации 1 мМ снижал скорость дыхания митохондрий, стимулированного разобщителем окислительного фосфорилирования 2,4-динитрофенолом (около 15%). При большей концентрации уранилнитрата (2,5 мМ) ингибирование дыхания было более выражено. Нитрат натрия в концентрации 5 мМ и меньше, а также уранилнитрат в концентрации 0,1 мМ не влияли на дыхание митохондрий печени крыс (данные не представлены).

Индукция митохондриальной циклоспорин-А-чувствительной белковой поры ионами кальция зачастую рассматривается как важный параметр при изучении роли митохондрий в развитии клеточной гибели. Открытие такой поры оценивалось по изменению Са2+-емкости митохондрий печени крыс. Показано, что при добавлении 1 мМ уранилнитрата Са2+-емкость митохондрий незначительно увеличивается: 90 мкМ/мг белка против 85 мкМ/мг в контроле.

Известно, что митохондрии являются основными поставщиками активных форм . кислорода в клетке [Lenaz, 2012]. В связи с этим, исследовано влияние уранилнитрата на скорость образования Н202 энергосопряженными митохондриями печени крыс. Показано, что скорость образования Н202 митохондриями в присутствии 0,1 мМ уранилнитрата достоверно ниже (228 (199-257) пмоль/мин/мг белка (медиана (размах))) по сравнению со скоростью образования Н202 в отсутствие ионов уранила (270 (259-286) пмоль/мин/мг белка (медиана (размах))).

Таким образом, уранилнитрат в микромолярных концентрациях (1-100 мкМ) практически не влияет на функциональные параметры митохондрий. По всей видимости, митохондрии не являются причиной развития окислительного стресса под действием ионов уранила [Белослудцев и др., 2012].

Радиомодифицирующис свойства ионов уранила

Поскольку ионы уранила приводят к генерации АФК и развитию окислительного стресса, было высказано предположение о том, что ионы уранила могут в существешюй степени модифицировать действие ионизирующей радиации in vivo. В связи с этим, в данной работе исследовано влияние ионов уранила на выживаемость мышей, подвергнутых радиационно-индуцированному окислительному стрессу посредством облучения в дозах 5,0-6,5 Гр (рис. 10). Животным сразу после облучения внутрибрюшинно вводили изотонический раствор (контроль) или уранилнитрат (0,75 мкг/г U02(N03)2 (U02+2 -0,50 мкг/г + -0,25 мкг/г МОз") или нитрат натрия (0,32 мкг/г NaN03 (Na+ ~7 мкг/г + 0,25 мкг/г N03^). Необходимо отметить, что при введении уранилнитрата интактным мышам в концентрации 0,75 мкг/г не наблюдалось заметных краткосрочных последствий, т.е. выживаемость в этой группе животных была равна 100 % до конца эксперимента (данные не представлены).

100 1

^ 80 О4" иЗ1 & 60

о се

§40

£

а 20

-е- 6 Гр

-о- б гр + ш^1 -я- б Гр + ио/2

Рис. 10. Влияние растворов Ш2(Ш3)2 и ЫаЫОз на выживаемость мышей при внутрибрюшинном введении этих соединений после воздействия рентгеновского излучения в дозе 6 Гр. (Функция Каплана-Мейера, каждая группа состояла из 20 животных)

30

В группе контрольных, облученных в дозе 6 Гр мышей, которым вводили изотонический раствор, 55%

О 5 10 15 20 25 Время после облучения, сут

животных оставались живы до конца эксперимента (рис. 10). В группе облученных в

дозе 6 Гр мышей, получивших нитрат натрия, средняя продолжительность жизни

составила 17 суток и 30% животных оставались живы в течение 30-ти суток после

облучения. В группе облученных в дозе 6 Гр мышей, получивших уранилнитрат,

средняя продолжительность жизни составила 8 суток и только 5% животных

оставались живы до конца эксперимента. Таким образом, показано, что ионы

уранила в существенной мере модифицируют воздействие ионизирующей радиации.

В связи с тем, что ионы уранила проявляют существенные радиомодифицирукяцие свойства, была предпринята попытка охарактеризовать их количественно. Для этого исследована способность ионов уранила модифицировать индуцированную различными дозами ионизирующего излучения гибель животных (рис. 11).

90

80

70-

л

Й 50

о 40'

1 30

и

2 20

и

10'

Контроль

Рис. 11. Влияние растворов Ш2(Ш3)2 и ЫаЖЬ на выживаемость мышей при внутрибрюшинном введении этих соединений после воздействия рентгеновского излучения.

График представлен в координатах доза - пробит. На каждую точку на графике приходится не менее 20 мышей

5 б 6,5 Установлено, что

Доза, Гр уранилнитрат увеличивал

вероятность летального исхода во всех исследуемых группах. Так при дозе 5 Гр вероятность смертельного исхода к 30 дшо при введении уранилнитрата увеличивалась на 25% по сравнению с

контролем (животные, облученные в дозе 5 Гр). При дозе 6 Гр вероятность смертельного исхода к 30 дню при введении уранилнитрата увеличивалась на 35%.

На основе полученных экспериментальных данных была вычислена полулетальная доза ионизирующего излучения для исследуемых животных. Для мышей, которым вводили изотонический раствор, Ь050/зо составила порядка 6 Гр.

После введения и02(№)3)2 и №7\т03 величина 1ЛЭ5а/зо снизилась до 5,3 и 5,9 Гр соответственно. Из полученных данных вычислен фактор изменения дозы (ФИД), который рассчитывается как соотношение доз ЬВ50/зо в присутствии или в отсутствие изучаемых соединений. ФИД для 1Ю2(М03)2 составил 0,88; для ЫаЖЬ - 0,98.

ФИД [Ш2+2] = 1 - ((1- ФИД[Ш2(Шз)2]) - (1- ФИДрМаЫОз]))

Исходя из полученных данных, ФИД для ионов уранила 1Ю2+2 составил 0,90.

Наиболее вероятным в случае самцов мышей КлгЭНК и доз облучения до 7 Гр представляется летальный исход, обусловленный радиационным поражением тканей, ответственных за образование и созревание клеток крови, а также повреждением иммунных клеток, находящихся в составе крови, лимфы и других тканей. В связи с этим исследовано влияние ионов уранила на количество форменных элементов крови у мышей, тотально облученных в дозе 6 Гр. Количество лейкоцитов в контрольной группе животных составило 9,3 х 109 кл/л. В группах облученных животных (изотонический раствор и нитрат натрия) количество лейкоцитов к 12-му дню снизилось на — 95% относительно количества лейкоцитов в периферической крови интактных мышей. В группе животных, получивших уранилнитрат, уровень лейкоцитов уменьшился к 12-му дшо до < 99%. Количество гранулоцитов и тромбоцитов в периферической крови облученных мышей изменялось сходным образом. Таким образом, уранилнитрат при введении его облученным в дозе 6 Гр животным негативным образом влияет на гемопоэз, что проявляется в существенном снижении количества форменных элементов крови, более выраженной лейкопении и тромбопении, что в итоге приводит к снижению выживаемости животных.

выводы

1. Ионы уранила в концентрациях 1-100 мкМ в солевых растворах значительно усиливают образование активных форм кислорода, индуцированных видимым светом или теплом, до значений 200 нМ. Вклад естественной радиоактивности урана в процесс образования АФК незначителен.

2. Ионы уранила в концентрации 10 мкМ в сочетании с природным восстановителем — аскорбиновой кислотой, способны обеспечивать в модельной физиологической среде (сыворотка крови, культуральная среда) генерацию активных форм кислорода вплоть до концентраций в десятки микромолей на литр.

3. Ионы уранила в микромолярных концентрациях (1-100 мкМ) индуцируют образование долгоживущих радикальных форм белка in vitro. Уранилнитрат при внутрибрюшинном введении мышам вызывает увеличение содержания карбонильных производных белков в сыворотке крови и количества полихроматофильных эритроцитов, содержащих микроядра, в костном мозге.

4. Показано, что внутрибрюшинное введение уранилнитрата самцам мышей в концентрации вплоть до 0,75 мкг/г и добавление ионов уранила к суспензии митохондрий in vitro до конечной концентрации 390 мкг/мл не влияют существенным образом на скорость дыхания, Са2+-емкость митохондрий и скорость образования ими Н2О2.

5. Уранилнитрат в концентрации 0,75 мкг/г проявляет радиомодифицирующие свойства, уменьшая выживаемость самцов мышей при внутрибрюшинном введении его непосредственно после действия ионизирующей радиации в летальных и сублетальных дозах. Фактор изменения дозы при таком введении в пересчете на ионы уранила равен 0,9.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах

1. Garmash S.A., Smirnova V.S., Кагр O.E., Usacheva A.M., Berezhnov A.V., Ivanov V.E., Chernikov A.V., Bruskov V.l., Gudkov S.V. Pro-oxidative, genotoxic and cytotoxic properties of uranyl ions. II J. Environ. Radioact. 2013 Jan 9. doi: 10.1016/j.jenvrad.2012.12.009 [PubMed & Scopus indexed].

2. Bruskov V.l., Karp O.E., Garmash S.A., Shtarkman I.N., Chernikov A.V., Gudkov S.V. Prolongation of oxidative stress by long-lived reactive protein species induced by X-ray radiation and their genotoxic action. // Free Radical Research. 2012. V. 46. P.1280-1290.

3. Белослудцев K.H., Гармаш C.A., Белослудцева H.B., Белова С.П., Бережнов A.B., Гудков C.B. Исследование механизмов цитотоксического действия уранилшнрата. //Биофизика. 2012. Т. 57, № 5. С. 789-795.

4. Гармаш С.А., Карп О.Э., Смирнова B.C., Гудков C.B. Прооксидантные свойства ионов уранила, индуцированные видимым светом // Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия биологическая. 2012. Ч.З. С.44-46.

5. Гармаш С.А. Образование активных форм кислорода при совместном действии низких концентраций ионов уранила и ряда физических факторов. И Фундаментальные исследования. 2012. №9 (4). С. 961-964.

6. Гудков C.B., Гармаш С.А., Штаркман И.Н., Черников A.B., Карп О.Э., Брусков В.И. Долгоживущие радикалы белка, индуцируемые рентгеновским облучением, являются источником активных форм кислорода в водной среде И ДАН. 2010. Т. 430, №1. С. 123-126.

7. Гудков C.B., Гармаш С.А., Карп О.Э., Смирнова B.C., Черников A.B., Брусков В.И. Долгоживущие радикалы аминокислот, индуцируемые рентгеновским излучением, являются источником образования перекиси водорода в водной среде. // Биофизика. 2010. Т. 55, вып. 4. С. 588-593.

8. Гудков C.B., Карп О.Э., Гармаш С.А., Иванов В.Е., Черников A.B., Манохин A.A., Асташев М.Е., Ягужинский Л.С., Брусков В.И. Образование активных форм кислорода в воде под воздействием видимого и инфракрасного излучения в полосах поглощения молекулярного кислорода. // Биофизика. 2012. Т. 57, вып. 1. С. 5-13.

Тезисы докладов

9. Смирнова B.C., Гармаш С.А., Гудков C.B., Брусков В.И. Генотоксическое и прооксидантное действие ионов уранила. «Экспериментальная и теоретическая биофизика' 10». Пущино. 19-20 октября 2010. С. 33.

10. Гармаш С.А., Гудков C.B. Цитотоксическое действие ионов уранила «Биология наука XXI века». Пущино. 18-22 апреля 2011. С.122.

11. Гармаш С.А., Бережнов A.B., Смирнова B.C., Гудков C.B., В.И. Брусков. Цитотоксические свойства ионов уранила. «Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии». Санкт-Петербург. 19-20 мая 2011 г. С.126.

12. Гармаш С.А., Бережнов A.B., Смирнова B.C., Гудков C.B. Ионы уранила влияют на выживаемость животных и клеток, а также вызывают окислительный стресс in vitro. «Радиация и Чернобыль: Наука и практика». Беларусь. Гомель. 13-14 октября 2011 г. С. 209-210.

13. Гармаш С.А., Смирнова B.C., Гудков C.B. Прооксидантные, гено- и цитотоксические свойства ионов уранила. «Экспериментальная и теоретическая биофизика'11». Пущино. 20-21 октября 2011. С. 4-5.

14. Гармаш С.А., Гудков C.B. Образование активных форм кислорода под действием ионов уранила in vitro. «Ломоносов». Москва. 11-15 апреля 2011. С. 35.

15. Гармаш С.А., Гудков C.B. Образование АФК при совместном действии ионизирующей радиации, тепла, света и ионов уранила. «Биология наука XXI века». Пущино. 16-21 апреля 2012 г. С. 305.

16. Гудков C.B., Карп О.Э., Гармаш С.А., Иванов В.Е., Черников A.B., Галочкина Е.А., Усачева A.M., Смирнова B.C., Брусков В.И. Образование активных форм кислорода под действием неионизирующих излучений. «Биологические механизмы старения». Украина. Харьков. 16-19 мая 2012 г. С. 21-22.

17. Гармаш С.А., Гудков C.B. Влияние ионов уранила в концентрациях, содержащихся в окружающей среде и механизм их действия на биологические системы. «Биология - наука XXI века». 24 мая 2012 г. Москва. С. 180-181.

18. Гармаш С.А. Сенсибилизация ионами уранила действия физических факторов окружающей среды. «Актуальные вопросы биологии и химии». Пущино. 30 гаоля-03 августа2012 г. С. 141.

19. Гармаш С.А. Исследование прооксидантных свойств ионов уранила и их способности усиливать действие физических факторов окружающей среды. «Экспериментальная и теоретическая биофизика'12». Пущино. 22-24 октября 2012. С. 100.

Подписано в печать:

26.04.2013

Заказ № 8430 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш„ 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гармаш, Светлана Анатольевна, Пущино

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОФИЗИКИ

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ПУЩИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЕСТЕСТВЕННО-НАУЧНЫЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

04201356930

ГАРМАШ СВЕТЛАНА АНАТОЛЬЕВНА

ОБРАЗОВАНИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА ПОД ВЛИЯНИЕМ ИОНОВ УРАНИЛА И ИХ ТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ

03. 01. 02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук Гудков С.В.

Пущино - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 5

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7

ГЛАВА 1. УРАН 7

1.1 УРАН. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ 7

1.2 ВАЖНЕЙШИЕ СВОЙСТВА СОЕДИНЕНИЙ УРАНА 8

1.3 ПРИМЕНЕНИЕ УРАНА И ЕГО СОЕДИНЕНИЙ 11

1.4 БИОЭКОЛОГИЯ И БИОБЕЗОПАСНОСТЬ СОЕДИНЕНИЙ УРАНА 14

1.5 ПОСЛЕДСТВИЯ ДЕЙСТВИЯ УРАНА И ЕГО СОЕДИНЕНИЙ НА 17 БИОСИСТЕМЫ

1.5.1 Общий механизм токсического действия урана и его соединений 17

1.5.2 Механизм проникновения соединений урана в организм человека 19

1.5.3 Уран и его соединения как причина патологий 19 ГЛАВА 2. ОБРАЗОВАНИЕ АФК И ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС 29

2.1 АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА 30

2.1.1 Перекись водорода (Н2О2) 30

2.1.2 Гидроксильный радикал (*ОН) 31

2.1.3 Синглетный кислород ('Ог) 31

2.1.4 Супероксиданион радикал (О2") 31

2.2 МАРКЕРЫ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА 32

2.2.1 Долгоживущие радикальные формы белка 32

2.2.2 Микроядерный тест 33

2.2.3 Карбонильные производные белков 36

2.2.4 8-оксогуанин в нуклеиновых кислотах 37 ЗАКЛЮЧЕНИЕ К ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ 39 ЧАСТЬ II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ 42

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 42

3.1. МАТЕРИАЛЫ 42

3.2. МЕТОДЫ 44

3.2.1 Подготовка и процедура облучения 44

3.2.1.1 Подготовка проб и облучение 44

3.2.1.2 Подготовка животных и облучение 44

3.2.2 Работа с животными 44

3.2.2.1 Уход за животными 44

3.2.2.2 Забой животных 44

3.2.3 Определение продукции перекиси водорода 45

3.2.4 Определение продукции гидроксильных радикалов 45

3.2.5 Определение концентрации растворенного кислорода в среде 46

3.2.6 Определение продукции долгоживущих радикалов белка 46

(ДЖРБ)

3.2.7 Определение окислительных модификаций белков по уровню 46

карбонильных производных

3.2.8 Определение 8-оксогуанина методом иммуноферментного 47 анализа (ИФА)

3.2.9 Определение цитотоксических повреждений в культуре клеток 48 НЕр2

3.2.10 Оценка генотоксического потенциала ионов уранила 49 микроядерным тестом

3.2.11 Работа с митохондриями 50

3.2.11.1 Выделение митохондрий печени 50

3.2.11.2 Оценка функциональных параметров митохондрий 5 *

2+ 51

3.2.11.3 Определение Са -емкости в митохондриях печени крысы

3.2.11.4 Образование Н2О2 митохондриями печени ^*

3.2.12 Тест на выживаемость 52

3.2.13 Подсчет общего количества клеток периферической крови 53

3.2.14 Исследование поведения животных 54

3.2.14.1 Тест «Открытое поле» 54

3.2.14.2 Тест «Черно-белая камера» 55

ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ 56

ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 4. ПРООКСИДАНТНЫЕ СВОЙСТВА ИОНОВ УРАНИЛА 56

4.1 ОБРАЗОВАНИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА ПОД 56 ДЕЙСТВИЕМ ИОНОВ УРАНИЛА

4.2 ОБРАЗОВАНИЕ ПОВРЕЖДЕНИЙ БЕЛКА И ДНК ПОД 66 ДЕЙСТВИЕМ ИОНОВ УРАНИЛА

ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ УРАНИЛНИТРАТА НА

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПАРАМЕТРЫ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ 76 МЫШЕЙ И КРЫС

ГЛАВА 6. РАДИОМОДИФИЦИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА ИОНОВ УРАНИЛА 79

ГЛАВА 7. ВЛИЯНИЕ ИОНОВ УРАНИЛА НА ЭТОЛОГИЧЕСКИЕ

ПОКАЗАТЕЛИ У ЖИВОТНЫХ 84

ВЫВОДЫ 89

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 90

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ 106

ВВЕДЕНИЕ

В ходе естественного вымывания горных пород богатых изотопами урана и в результате хозяйственной деятельности человека концентрация урана в природе может достигать достаточно высоких значений и варьировать в пределах от 0,01 мкг/л до 12,4 мг/л [Depleted Uranium: Sources, Exposure and Health Effects, 2001]. Существуют три основных природных изотопа урана: 238U (99,3%), 235U (0,7%) и 234U (0,005%). Обогащенный уран (изотопы 235 и 234) широко применяют как топливо для атомных электростанций, в бомбах в качестве критической массы. Уран 238 (обеденный, ОУ) в качестве замедлителя быстрых нейтронов в ядерных реакторах и при детонации бомб, в качестве сердечников для бронебойных снарядов, в современной танковой броне, например, танка М-1 «Абраме» [Бекман, 2009]. U-233 также является наиболее перспективным топливом для газофазных ядерных ракетных двигателей. В мирных целях ОУ используют в качестве балласта в судах, самолетах, в роторах маховиков и гироскопов, для придания цвета стеклу и керамике, при тонировании фотографий, в качестве красителя в живописи, в металлургии, при микроскопических исследованиях. В науке используют при радиоизотопном определении возраста пород и минералов.

В почве и воде уран преимущественно встречается в виде свободных ионов уранила (UO2 ) или в виде их комплексов [Duquene et al., 2010]. Уран обладает пирофорными свойствами, поэтому при авариях самолетов, в которых в качестве балластной массы используют ОУ или при попадании в цель бронебойных снарядов с ураниловыми сердечниками, уран сгорает на воздухе, в результате чего также образуются ионы уранила.

Обычно ОУ хранится в виде отвалов или терриконов открытым способом и, наряду с испытаниями ядерного оружия, представляет серьезную угрозу для экологии планеты в целом [Sheppard et al., 2005]. Давно известно, что ионы уранила на организменном уровне могут быть причиной ряда патологий [Ни et al., 1990], проявляя существенные мутагенные и канцерогенные свойства [Miller et al., 2002]. Подавляющее большинство известных работ сосредоточено на описании феноменологии повреждающего действия ионов уранила [Smith et al., 2009, Cheng et al., 2010, Trenfield et al., 2011, Orona & Tasat, 2012]. Причиной повреждающего действия ионов уранила на организм считают с одной стороны, ярко выраженную

радиоактивность изотопов урана [Бекман, 2009], с другой - их химическую токсичность, а именно способность обратимо взаимодействовать с боковыми группами белков и аминокислот (например, с сульфгидрильными), что может приводить к инактивации ряда ферментов [Pible et al., 2010], а так же способность к образованию комплексов, что негативно сказывается на обмене биологически значимых анионов и катионов [Baker, 2012]. Нужно отметить, что механизму химической токсичности ионов уранила традиционно отводится меньшее внимание, так как он наблюдается при остром воздействии и при достаточно высоких концентрациях [Cheng et al., 2010]. Образование активных форм кислорода и окислительных повреждений биополимеров за счет радиоактивности изотопов урана, а так же ингибирование ряда ферментов антиоксидантной защиты и репарации в большинстве случаев приводит к развитию окислительного стресса [George et al., 2011, Orona & Tasat, 2012]. В нашей лаборатории было высказано предположение о том, что существует дополнительный механизм инициации окислительного стресса ионами уранила, который связан преимущественно с физико-химической генерацией АФК под действием этих ионов [Смирнова и др., 2011]. В связи с вышеизложенным, исследование альтернативных процессов лежащих в основе развития окислительного стресса, индуцированного ионами уранила, представляет собой актуальную научную проблему.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. УРАН

1.1 УРАН. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Уран (U - uranium) - относится к семейству актиноидов химической таблицы Менделеева, к группе fd-элементов. Серебристо-белый глянцеватый металл, немного мягче стали, один из наиболее тяжелых из встречающихся в природе, с

л

относительной плотностью 19 г/см .Уран ковкий, гибкий, обладает небольшими парамагнитными свойствами, электроположительный, с малой электропроводностью. Основные физические свойства урана таковы: температура плавления - 1132,2°С, температура кипения - 3818°С, удельная теплоемкость - 6,65 кал/моль/°С (при 25°С), прочность на разрыв - 450 МПа [Кракий химический справочник, 1991]. Уран - активный металл, способен окисляться на воздухе. Аэрозоль из мелких частиц урана самовоспламеняется при температуре 150— 175°С в присутствии воздуха, образуя ряд оксидов. При температуре 1000°С уран соединяется с азотом, образуя желтый нитрид урана. Вода обладает способностью растворять этот металл. Уран так же растворяется в кислотах, образуя четырёхвалентные соли, но не взаимодействует со щелочами [Черноруков и Нипрук, 2010]. В слое литосферы толщиной 20 км количество урана оценивается в 1,3 *1014 т [Кац и Рабинович, 1954]. Кларк урана в земной коре составляет 0,0003% и превосходит содержание таких элементов как кадмий, серебро, сурьма, ртуть, висмут, золото, платина и равно содержанию мышьяка, молибдена и тантала [Бекман, 2009].

Семейство урана состоит из 26 изотопов, но только три из них встречаются в природе (234U, 235U, 238U). Все другие изотопы урана от 217U до 242U получают искусственно [Черноруков и Нипрук, 2010]. Все изотопы урана нестабильны и радиоактивны. Изотопы урана 235U и 238U являются родоначальниками двух радиоактивных рядов - ряда радия и ряда актиния. Изотопы свинца 206РЬ являются конечными элементами этих рядов. Природный уран состоит из а-радиоактивных изотопов: 238U (период полураспада 4,5><109 лет), 235U (7,13х108 лет) и 234U (2,48x105 лет) [Бекман, 2009]. Основной вклад в создание естественного радиационного фона вносит 238U, продукты его распада, а так же 234U [Иванов, 2002]. U не вносит особого вклада в создание естественного радиационного

фона, так как удельная активность U в 21 раз меньше активности изотопа с массовым числом 238.

Природный уран обогащают при создании топлива и материалов для ядерных электростанций, увеличивая содержание в нем изотопа U, который обеспечивает ядерное деление. После обогащения урана остается смесь, называемая обедненным ураном (ОУ). Обеднённый уран состоит в основном из изотопа урана 238, основная часть изотопов 235U и 234U извлекается на этапе обогащения. Доза внешнего облучения от обеднённого урана по оценкам разных исследователей составляет в среднем 60 % от того, что даёт природный уран. Однако в химическом отношении ОУ проявляет активность нисколько не меньшую, чем природный уран, несмотря на потерю радиоактивности [Бекман, 2009].

1.2 ВАЖНЕЙШИЕ СВОЙСТВА СОЕДИНЕНИЙ УРАНА

Металлический уран может быть в 3 кристаллических модификациях - a-, ß-, у-структуры. Радиус атома в металлическом состоянии 1,421 Ангстрем (Ä) [Виноградов, 1962]. Однако, уран практически не встречается в природе в виде металла, наиболее распространены различные соединения и минералы. Наиболее часто встречающимися урановыми рудами являются уранинит (еще его называют урановая смолка или настуран) - 65-75%, карнотит ~ 50 %, казолит ~ 40 %, самаркит -3-14 %. Уран в основном залегает в кислых породах и сопровождается молибденитом, галенитом, кварцем и др. В своих соединениях уран как в растворе, так и в твердых солях, проявляет четыре степени окисления от +3 до +6, три из которых (валентности 3, 4 и 6) установлены давно и хорошо изучены; более поздние исследования показали, что уран существует и в пятивалентном состоянии. U (III) существует в виде солей: хлоридов и бромидов [Черноруков и Нипрук, 2010]. Ионные радиусы урана зависят от валентности и составляют для U III - 1,03 Ä, IV - 0,97 Ä, V - 0,87 Ä, VI - 0,80 Ä [Кракий химический справочник, 1991].

Раствор U (III) может быть легко получен растворением солей (UC1 и UBr) или восстановлением U (IV). Растворы U (III) имеют интенсивно красный цвет. Трехвалентный уран очень неустойчив в растворе и подвергается окислению до U (IV) даже в отсутствие кислорода.

Растворы и (IV) окрашены в зеленый цвет и довольно устойчивы, особенно в сильнокислом холодном растворе.

Пятивалентный уран может быть получен растворением иС15 в воде, электролитическим восстановлением и (VI) при рН 2,5—3 или восстановлением шестивалентного урана. В растворе и (V) вступает в реакцию диспропорционирования с образованием и (IV) и и (VI):

2Ш2+ + 4НэО+ и4+ + Ш22+ + 6Н20

Наиболее устойчивой валентностью урана является +6. Шестивалентный уран существует только в виде иона уранила 1Ю2 , при рН < 2,5 [Кац и Рабинович, 1954]. Потенциалы окисления-восстановления шестивалентного урана сильно зависят от рН, который изменяет направления реакции, имеющей существенное значение в геохимии урана:

2 Ре 2+ +и6+ <-> 2Ре3+ + и4+ в кислой справа налево, в щелочной слева направо [Бекман, 2009]. Рентгенографические исследования большого количества кристаллических соединений урана (VI) показывают, что группа 1Ю22+ является линейным радикалом, в котором связь между кислородом и ураном носит частично ковалентный характер. В растворах 1Ю2 , как установили более поздние исследования, также имеет характер линейного радикала [Сиборг, 1959]. Ион шестивалентного уранила И02 является одним из самых крупных катионов и радиус его равен по разным оценкам 6,04-6,84 Ангстрем (0,68 нм). Мночисленные исследования в этой области свидетельствуют о неполной диссоциации солей уранила (ацетата, сульфата и др.) в водных растворах [Кац, 1955, Виноградов, 1962]. Неполностью диссоциирован уранилацетат, притом в еще большей степени, чем сульфат уранила. Весьма сложный характер имеет поведение иона уранила в водных растворах при рН > 2,5. На имеющий место гидролиз 1Ю2 указывает кислая реакция растворов ураниловых солей. Достаточно много работ посвящено изучению гидролиза иона уранила [Черноруков и Нипрук, 2010], но результаты, полученные в этих работах, весьма противоречивы. Несмотря на это, большинство исследователей едины во мнении о существовании следующих продуктов гидролиза: и022+: и2052+, и3082+, Ш2(ОН)+, и308 (ОН)+, и308(0Н)2, и3 08(ОН)3\

Показано, что при добавлении щелочи, когда отношение ОН"/ 1Ю22+ в растворе меняется от 0 до 1 (при концентрации урана от ОД до 1x10"5 моль/л), ион уранила переходит частично в и02(0Н)+. При дальнейшем добавлении щелочи, после соотношения ОН71Ю2 = 1, начинается процесс конденсации и количество полимерных однозарядных ионов типа и02(и0з)п0Н+ в растворе возрастает.

л,

Образование ионов типа и205 и и308 , по мнению Брусиловского, в этой области практически не встречается. Для соотношения 0Н"/и022+ от 1 до 1,4-1,6 наступает область метастабильных коллоидных растворов, где полимеры и02(и0з)п0Н+ неустойчивы и переходят в коллоидную форму гидроокиси уранила. Коллоиды постепенно разрушаются, осаждая и0з*пН20. Для соотношения ОН'/1Ю22+ от 1,4 -1,6 до 1,9 - 2 идет осаждение гидроокиси уранила, при дальнейшем добавлении щелочи гидроокиси переходят в уранаты и полиуранаты [цит. по Бекман, 2009]. В более поздних работах также изучался процесс гидролиза иона уранила, исследована зависимость гидролиза от температуры и ионной силы раствора. Исследователи склоняются к версии, что гидролиз 1Ю2 может быть объяснен образованием мономера 1ГО2ОН+ по реакции:

Ш22+ + Н20 -> и02 (ОН)+ + РГ

-У1

и димера 1Ю2хи03 , образующегося по реакции 21ГО22+ +Н20 -> Ш2хШ32+ +2Н+ Соединения иб+, растворимы в воде, особенно нитраты уранила, а также сульфаты и оксигалогениды (1Ю2С12 и 1Ю2 Б2). иС16 и летучи, но легко гидролизуются, образуя оксигалогениды. Главные нерастворимые соединения и6+ - оксиды, фосфаты, ванадаты и арсенаты, которые известны в качестве экзогенных урановых минералов.

Наиболее важными растворимыми солями урана, имеющими практическое значение, являются уранилнитрат, уранилсульфат, уранилхлорид, уранилацетат, а также соли урана (IV) — сульфат и хлорид.

В природных условиях наиболее важны карбонатные, сульфатные, нитратные, фторидные, фосфатные и гидроксильные комплексы. В акваионе уранила [1Ю2 (Н20)6]2+ аквагидроксокомплексы уранила образуются при ступенчатом замещении аквагрупп и имеют форму [Ш2(0Н)п(Н20)6"п] 2""(п - от 0 до 6) [Бекман, 2009].

Семейство карбонатных соединений образует комплексы среди которых в водных растворах устойчивы лишь [U02(C03)3]4' и [U02(C03)2 (Н20)2]2\ [U02(C03)3]4"

л

преобладает в растворе с избытком ионов С03 * и при разбавлении переходит в [U02(C03)2 (Н20)2] ". Далее происходит образование слаборастворимого карбоната уранила U02C03. Только в средах с высокими концентрациями фтора образуются фторидные комплексы. Карбонатным комплексам по строению подобны сульфатные комплексные соединения уранила, однако, по устойчивости эти соединения уступают не только карбонатным, но и фторидным. И еще одно условие должно быть соблюдено - они устойчивы только в кислой среде при рН 2—4. Нитрат уранила U02(N03)2 способен образовывать три соединения, содержащих либо шесть, либо три или две молекулы воды; все эти соединения (гидраты) хорошо растворимы в воде (0,54 г уранилнитрата на 1 г воды), а также в органических кислородсодержащих растворителях (спиртах, эфирах, кетонах и т. д.). Не растворяется уранилнитрат в сероуглероде и хлороформе [Черноруков и Нипрук, 2010].

Ион уранила образует важную группу комплексных соединений с органическими кислотами (уксусной, щавелевой, лимонной, группой гумусовых кислот и т. д.) [Бекман, 2009].

Ионы U6+ наиболее устойчивы в кислой среде и в отличие от U4+ имеют более высокое значение ионной плотности. В водных растворах U6+ гидролизуется с образованием U022+ и [1Ю2(Н20)б]+, [U02(H20)5]+, а в присутствии в растворе С032" в большинстве случаев образуется U02(C03)2 '.

Комплекс U02(0H)2 (гидроксил-уранильный) устойчив при рН 4,5-7, при рН > 4,5 начинается осаждение карбонатных комплексов, пр�