Диссертации » Биологические науки » Биофизика

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Образование 8-оксогуанина и продуктов его окисления в ДНК in vitro под действием тепла, ионов уранила и γ-излучения
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Образование 8-оксогуанина и продуктов его окисления в ДНК in vitro под действием тепла, ионов уранила и γ-излучения"

На правахрукописи

Смирнова Виолетта Сергеевна

ОБРАЗОВАНИЕ 8-ОКСОГУАНИНА И ПРОДУКТОВ ЕГО ОКИСЛЕНИЯ В ДНК IN VITRO ПОД ДЕЙСТВИЕМ ТЕПЛА, ИОНОВ УРАНИЛА И у-ИЗЛУЧЕНИЯ

03.00.02. - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущнно-2005

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Научный руководитель: доктор химических наук

Брусков Вадим Иванович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Озолинь Ольга Николаевна

кандидат биологических наук Безлепкин Владимир Георгиевич

Ведущая организация: Институт физико-химической биологии им. А. Н, Белозерского МГУ им. М. В.Ломоносова, г. Москва.

Защита диссертации состоится « 2005 г. в

на заседании Диссертационного совета Д002.093.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московская область, ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Пущинского научного центра РАН

Автореферат разослан

2005 г.

Учёный секретарь

кандидат физико-математических наук

Ланина Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Активные формы кислорода (АФК) образуются в процессе нормального аэробного клеточного метаболизма и в результате внешних воздействий факторов окружающей среды на организм, таких как ионизирующее и УФ-излучения, ксенобиотики и др. АФК чрезвычайно реакционноспособны и могут легко вступать в окислительно-восстановительные реакции с липидами, белками, углеводами и нуклеиновыми кислотами. Это вызывает нарушения метаболизма и структурной организации клетки [Синицкая, Хавинсон, 2002]. Наиболее чувствительной мишенью при действии АФК на ДНК является гуанин, а продуктом его окислительного повреждения - 8-оксогуанин (8-OG) [Beckman, Ames, 1997]. 8-OG в настоящее время считается одним из основных биомаркеров окислительного повреждения ДНК [Griffiths et al., 2002]. Установлена связь между образованием 8-OG и такими процессами как мутагенез [Cheng et al., 1992; Moria, Grollman, 1993], канцерогенез [Olinski et al., 2002], старение [Beckman and Ames, 1998] и патогенезом болезней пожилого возраста [Зенков и др., 2001].

Тепло, постоянно действующий физический фактор среды, индуцирует повреждения ДНК нескольких типов, таких как депуринизация ДНК [Lindahl, Nyberg, 1972], дезаминирование цитозина с образованием урацила [Frederico et al., 1990], разрывы сахаро-фосфатного остова, продукцию 8-оксогуанина в ДНК [Bruskov et al., 2002]. Большую опасность для окружающей среды и здоровья человека (заболевания «неясной этиологии», лейкемия и др.) представляет использование снарядов с обедненным ураном (ОУ) в ходе военных конфликтов. При взрывах таких снарядов происходит сгорание урана с образованием различных окислов. Среди них наибольшее биологическое действие, по-видимому, оказывают образующиеся ионы уранила [Miller et al., 2002; Yazzie et al., 2003]. Поскольку ОУ на 60% менее радиоактивен, чем природный уран, то он не может вызывать существенные генотоксические эффекты, связанные с радиационным воздействием. Поэтому причины такого действия ОУ на организм человека до сих пор являются неизвестными. Исследование молекулярных механизмов, приводящих к генерации АФК, образованию 8-оксогуанина и других повреждений оснований в ДНК под действием таких факторов среды, как тепло, у-излучение и ионы уранила, представляет собой актуальную фундаментальную проблему, связанную с необходимым пониманием процессов мутагенеза, канцерогенеза и старения, индуцированных действием этих факторов окружающей среды.

Цель и основные задачи исследования. Цель работы заключалась в изучении процесса теплового повреждения ДНК in vitro с образованием 8-оксогуанина, продуктов его дальнейшего окисления и исследовании модифицирующего влияния ионов уранила на образование 8-оксогуанина в ДНК под действием тепла и у-излучения.

В соответствии с целью были поставлены основные задачи:

1) исследовать процесс окисления гуанина в ДНК in vitro с образованием 8-OG и возможность его дальнейшего окисления при физиологической температуре 37°С;

2) выделить и идентифицировать продукты дальнейшего окисления 8-OG;

3) исследовать возможность влияния ионов уранила на генерацию активных форм кислорода под действием тепла, возможность усиления продукции 8-OG и других повреждений оснований в ДНК in vitro под действием тепла и у-излучения.

Научная новизна. Впервые, методом иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител, специфичных к 8-OG, показано, что содержание 8-оксогуанйна в ДНК in vitro меняется при физиологической температуре 37°С. Этот процесс носит сложный осциллирующий характер, обусловленный как образованием 8-OG, так и его дальнейшим окислением под действием тепла. Путем воздействия повышенных температур (80°С и 60°С) на 8-оксо-2-дезоксигуанозин (8-oxodG) установлено, что при тепловом воздействии происходит дальнейшее окисление 8-oxodG с образованием ряда неустойчивых продуктов, что затрудняет их выделение и идентификацию. УФ-спектр поглощения одного из выделенных продуктов соответствует УФ-спектру поглощения спироиминодигидантоина. При воздействии на ДНК физиологической температурой 37°С, высвобождении окисленных гуаниловых оснований с помощью фермента 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы и разделении этих продуктов методами жидкостной колоночной хроматографии, впервые показано, что происходит дополнительное окисление 8-OG и образуется целый ряд продуктов, УФ-спектры поглощения некоторых из них соответствуют УФ-спектрам поглощения имидазолона, спироиминодигидантоина и дииминоимидазола. Установлено, что процессы образования 8-OG и его дальнейшего окисления сопровождаются генерацией АФК (перекиси водорода и гидроксильного радикала), индуцированных тепловым воздействием при 37°С.

Установлены зависимости образования 8-оксогуанина в нативной и денатурированной ДНК в присутствии ионов уранила от длительности прогревания растворов при 37°С. Содержание 8-OG в этих случаях изменяется сложным квазиколебательным образом. Установлено, что при воздействии на раствор нативной ДНК ионами уранила и температурой 37°С,

процессы окисления 8-оксогуанина преобладают над его образованием. Выявлено, что при прогревании ДНК в присутствии уранилацетата происходит существенное увеличение образования урацила. Получена зависимость образования перекиси водорода, при тепловом воздействии на фосфатный буфер, от концентрации уранилацетата. С использованием флуоресцентного зонда для гидроксильных радикалов кумарин-3-карбоновой кислоты показано существенное увеличение образования ОН-радикалов при тепловом воздействии на фосфатный буфер в присутствии уранилацетата.

Научно-практическая ценность. Впервые показано, что тепловое воздействие может приводить к образованию не только 8-оксогуанина в ДНК, но и продуктов его дальнейшего окисления. В работе впервые экспериментально показана нестабильность ДНК в растворе in vitro при физиологической температуре 37°С, обусловленная окислением гуанина с образованием 8-оксогуанина и продуктов его дальнейшего окисления, за счет генерации АФК. Этот факт показывает необходимость существования мощной антиоксидантной защиты и репарации ДНК in vivo, в том числе от повреждений, обусловленных действием тепла при этой температуре. Полученная информация расширяет существующие представления о тепловых повреждениях ДНК, физико-химических механизмах образования АФК, процессах спонтанного и индуцированного мутагенеза. Полученные результаты показывают, что высокая генотоксичность окислов урана, обусловлена в первую очередь их химическими свойствами. Результаты работы свидетельствуют о том, что причины генотоксического действия ионов уранила, вероятно, связаны с окислительно-восстановительными свойствами

окислов урана образующихся при использовании бронебойных снарядов с обедненным ураном во время военных конфликтов.

Апробаиия работы. Материалы диссертации были представлены на XIII зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2001), конференциях молодых ученых "Биология - наука 21-го века" (Пущино, 2001, 2002, 2004), III Съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), II конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино, 2002), V Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения" (Харьков, 2002).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 3 статьи.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (3 главы), методической части, изложения полученных результатов и их обсуждения (3 главы), заключения, выводов, списка цитируемой литературы (274 источника). Работа иллюстрирована 23 рисунками и содержит 2 таблицы.

Список сокращений. АФК - активные формы кислорода; 8-OG - 8-оксогуанин; 8-oxodG - 8-оксо-2'-дезоксигуанозин; ОУ - обедненный уран; ФБ - фосфатный

буфер; G - радиационно-химический выход; ОН* - гидроксильный радикал; Н2О2 - перекись водорода; Fpg - 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза; Iz - имидазолон; Sp — спироиминодигидантоин; Diz—дииминоимидазол; Gh — гуанидиногидантоин.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Иммуноферментный_анализ. Использовали оригинальный метод

иммуноферментного анализа для определения 8-OG в ДНК с помощью моноклональных антител, специфичных к 8-оксогуанину, разработанный в лаборатории изотопных исследований ИТЭБ РАН. Моноклональные антитела к 8-OG получены [Брусков и др., 1996] при совместной работе лабораторий изотопных исследований ИТЭБ РАН (рук. Брусков В.И.), молекулярной радиобиологии ИТЭБ РАН (рук. Газиев А.И.) и лаборатории культур клеток и клеточной инженерии ИБК РАН (рук. Моренков О.С.). Высокополимерную ДНК из спермы лосося (ICN, США) (в 1мМ ФБ, рН 6,8) прогревали при 37°С, 60°С и 80°С (±0,1 °С) в течение различных промежутков времени. Далее анализ проводили, как описано в работе [Bruskov et al., 2002]. Количественная оценка содержания 8-OG проводилась с использованием калибровочной кривой, для построения которой ДНК облучали на установке l37Cs ГУПОС (Латвия) при мощности дозы 1,88 Гр/мин в дозах 1, 2, 5, 10, 20 и 30 Гр отдельно для каждого эксперимента.

Определение тепловой продукции перекиси водорода в бидистиллированной воде и фосфатном буфере.

Использовали оригинальный метод усиленной хемилюминесценции в системе люминол-р-йодофенол-пероксидаза хрена, с чувствительностью до 0,1 нМ в образце [Брусков и др., 2001]. Количественное определение хемилюминесценции проводили с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика "Бета-1" (СССР) для измерения р-излучения, работающего в режиме счета одиночных фотонов (без схемы совпадений). Опытные образцы (1мМ ФБ рН 6,8 и воду)

прогревали при 37°С и 40°С в течение различных временных интервалов. К образцам добавляли по 1 мл "счетного раствора", содержащего: 1сМ Трис-НС1 буфер рН 8,5, 50 мкМ p-йодфенол, 50 мкМ люминола, 10 нМ пероксидазы хрена. Удаление продуктов окисления гуанина 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазой. ДНК (1мМ ФБ, рН 6,8) прогревали 24 ч при 80°С и концентрировали в вакуумном роторном испарителе RVO-64 (Чехословакия). К раствору ДНК добавляли буферный раствор, содержащий 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазу (0,2 мкг/мкг ДНК). Реакцию ДНК с ферментом проводили при ~20°С в течение 1,5 ч и останавливали охлаждением. Жидкостная колоночная хроматография.

Раствор ДНК наносили на колонку (75 х 1,1 см) гидрофобного Sephadex LH-20 ("Pharmacia", Швеция) или геля Toyopearl HW-40 ("ToyoSoda", Япония). Колонку элюировали бидистиллированной водой (далее - "вода"). Продукты хроматографического разделения регистрировали по УФ-поглощению при Х=230 нм с помощью прибора Liquochrom-2010 (Венгрия). Собранные коллектором фракции, соответствующие отдельным продуктам, концентрировали и измеряли их УФ-спектры поглощения на спектрофотометре Uvikon 923 В ("Kontron Instruments", Италия).

Определение тепловой продукции ОН-радикалов в фосфатном буфере при действии уранилаиетата и ацетата Na.

Осуществляли с помощью реакции с кумарин-3-карбоновой кислотой (ККК) ("Aldrich", США), продукт гидроксилирования которой - 7-гидроксикумарин-З-карбоновая кислота (7-ОН-ККК) - является удобным флуоресцентным зондом для определения образования этих радикалов [Черников и Брусков, 2002]. В 0,5 мМ раствор ККК в воде вносили 0,1 М ФБ до конечной концентрации 1 мМ, далее добавляли до 5, 10 мкМ уранилацетата и ацетат Na (в 1мМ ФБ, рН 6,8). Опытные образцы (и контроль) прогревали 2 ч при 80°С. Флуоресценцию 7-ОН-ККК, измеряли на спектрофлуориметре SFM 25A ("Kontron", Италия) при 400 нм, Перед флуориметрией в калибровочные со

своим контролем) пробы добавляли 0,5 М Трис-HCl буфер, pH 8,1 до конечной концентрации 20 мМ. Количество *ОИ в пробах рассчитывали, полагая Gqh пРи радиолизе воды равным 2,8 мкмоль • Дж"1 [von Sonntag, 1987], т.е. 0,27 мкМ'ОН •

Определение образования ураиила в ДНК при действии тепла и ионов уранила ДНК нагревали при 80°С в течение 24 ч. Раствор концентрировали и очищали ДНК от продуктов тепловой депуринизации и депиримидинизации на колонке с сефадексом LH-20. Для выделения урацила. ДНК концентрировали и инкубировали с 1 ед. урацил-ДНК-гликозилы ("BioLabs", США) [Lindahl et al., 1997] в течение 14 ч при 37°С. Проводили разделение и анализ полученных продуктов на той же колонке и регистрировали их по УФ-поглощению при Х=260 нм. Фракцию урацила концентрировали и определяли его концентрацию спектрофотометрически, используя справочное значение коэффициента молярного пеглощения урацила Бгбо" 8200 (М"1 • см'1) [Досон и др., 1991]. Депуринизаиия ДНК при действии тепла и ионов уранила.

Образцы ДНК с добавлением 5 мкМ уранилацетата или ацетата Na, прогревали при 80° С в течение 15 ч, концентрировали и продукты разделяли на колонке сефадекс LH-20, элюируя водой. Пробы, соответствующие гуанину и аденину, концентрировали и определяли содержание оснований спектрофотометрически,

используя справочные значения коэффициентов молярного поглощения (G) £246=10700 М-1 • см*1, (А) е26|=13350 М"1 • см-1 [Досон и др., 1991].

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Зависимость содержания 8-оксогуанина в ДНК от времени прогревания

Зависимость содержания 8-оксогуанина в нативной (а) и денатурированной (б) ДНК от времени нагревания при 37°С представлена на рис.1. С увеличением времени прогревания образцов ДНК при постоянной температуре (37°С) содержание 8-оксогуанина в них меняется сложным, многофазным образом и максимальные изменения достигают почти двукратных величин. В денатурированной нагреванием ДНК подобные процессы многократного уменьшения, а затем увеличения содержания 8-оксогуанина в ДНК при нагревании при 37°С несколько более усилены. При этом крайние значения величин изменяются также приблизительно в два раза от 2,3 до 1,1 х 10-8 моль 8-

OG/мкг ДНК. Уменьшение количества 8-OG в ДНК не может быть вызвано депуринизацией модифицированного основания, так как известно, что данная модификация приводит не к уменьшению, а к повышению устойчивости гликозидной связи

[Черников и др., 1996].

Рис1.

Зависимость содержания 8-оксогуанина в нативной (а) и денатурированной (б) ДНК от времени нагревания при 37°С. По оси абцисс - время нагревания, ч; по оси ординат-концентрация 8-оксогуанина х]0"® моль/мкг ДНК. Приведены средние значения и величины стандартных

отклонений для 7 независимых экспериментов.

Уменьшение содержания 8-OG в ДНК в определенные промежутки времени можно объяснить его дополнительным окислением, поскольку 8-оксогуанин для многих клеточных окислителей является «горячей точкой» (hot spot) - наиболее эффективной мишенью для дальнейшего окисления [Doddridge et al., 1998].

2 4 1 А

-А

Л 4 3 К, 1 Б _

X *

020 »0,3 | 010 | 0 0$ о ООО ^^^^ 12«асоп

оде Ч С06 | 00« 1 002 ° 000 300 220 240 260 280 300 330 МО 360 ЗвО 400 ^^^^ члса

в006 1с<в 1 004 I 002 о »0 220 240 2«0 210 300 320 ч 4$чксав \

200 220 240 260 длина волки нм тао аоо 320

Исходя из этого, можно полагать, что под действием тепла происходит генерация АФК, за счет которой в ДНК происходят два процесса, образование 8-OG из гуанина и дальнейшее окисление 8-оксогуанина с образованием новых продуктов

Рис 2.

Хроматографическое разделение на колонке Sephadex LH-20 раствора 8-оксо-2 -дезоксигуанозина, прогретого при 60°С А • 12 часов, Б - 24 часа, 5-45 часов

/, 2,3,4- номера фракций Ордината - поглощение при Я, = 245 нм Выход фракций слева направо

Разделение на колонке Sephadex LH-20 образцов 8-oxodG, прогретых при 60°С в течение

12, 24 и 45 ч представлено на рис. 2. Во фракциях У и 2 выходят продукты, не имеющие характерных УФ-спектров

поглощения, что затрудняет их идентификацию. 8-oxodG

выходит во фракции 4. Продукт, вышедший в третьей фракции, концентрировали и измеряли его УФ-спектры поглощения. Эти УФ-спектры поглощения представлены на рис. 3.

РисЗ.

УФ-спектры поглощения продуктов дополнительного окисления

8-оксо-2 -дезоксигуанозина, соответствующих фракции 3 хроматографического разделения, представленного на рис 2

Продукт, полученный после 12 часов прогревания, имеет характерный УФ-спектр с двумя выраженными максимумами в области 275 и 369 нм. При

дальнейшем прогревании в течение 24 часов, УФ-спектр поглощения этого продукта меняется — содержит один максимум около 250 нм. К 45 часам прогревания максимум УФ-спектра смещается в сторону около 233 нм и соответствует УФ-спектру поглощения спироииминодигидантоина, что свидетельствует о том, что во всех трех случаях имело место образование продуктов, обусловленных дальнейшим окислением предыдущего продукта под действием тепла.

Определена продукция перекиси водорода - наиболее устойчивой разновидности АФК - в воде и 1 мМ фосфатном буфере, рН 6,8, при нагревании при 37°С в течение различных промежутков времени (рис.4). Общий характер наблюдаемых изменений по положению максимумов и минимумов концентраций образующейся Н2О2 оказывается подобным. Поскольку динамика образования перекиси водорода - одной из форм АФК в растворах - под действием тепла

носит квазиколебательный характер при относительно коротких временах

воздействия [Брусков и др., 2001; Брусков и др., 2002] и, как показано в нашей работе, в течение длительных промежутков времени, то это

обстоятельство может быть одной из причин сложного многофазного характера образования 8-оксогуанина в ДНК и его дальнейшего окисления с течением времени при нагревании.

Ряс 4.

Квазиколебагельный характер изменения концентраций Н2О2 в воде (а) и 1 мМ ФБ, рН 6,8 (б) в зависимости от времени нагревания при 37°С. По оси абсцисс - время нагревания, ч; По оси ординат концентрация Н2О2, нМ.

Таким образом,

образование 8-OG при нагревании образцов ДНК указывает на то, что в этих условиях происходит тепловая генерация АФК, а ДНК выступает в роли их химического биосенсора. Сложный осциллирующий характер этого процесса, позволил предположить, что наряду с образованием 8-OG происходит и его дальнейшее окисление под действием тепла, с образованием новых неидентифицированных продуктов. Это предположение удалось подтвердить с помощью дифференциальной УФ-спектроскопии прогретого при высоких

температурах (60°С) 8-оксо-2-дезоксигуанозина и разделением продуктов, образующихся при этом, методами жидкостной колоночной хроматографии.

2. Дополнительное окисление 8-оксогуанина и образование продуктов его окисления в ДНК in vitro

На рис. 5 представлено хроматографическое разделение на колонках Sephadex LH-20 (рис.5Б) и Toyopearl HW-40 (рис.5В) прогретых образцов ДНК,

обработанных ферментом Fpg при одинаковых условиях нагревания ДНК и проведения реакции с ферментом.

Рис 5. Хроматографическое разделение раствора ДНК прогретого 24 ч при 80°С. (А) - контрольная ДНК, колонка Toyopearl HW-40, Х=254 нм;

(Б) - ДНК после реакции с Fpg, колонка Sephadex LH-20, 1=230 нм;

(В) - ДНК после реакции с Fpg, колонка Toyopearl HW-40, Х,=230 нм.

Выход фракций справа налево.

Т - тимин; С - цитозин; G - гуанин; А - аденин.

1, 2, 3,4,5, 6, 7,8,9,10, 11 12, 13, 14 - номера фракций.

При разделении

контрольных прогретых образцов ДНК наблюдаются пики поглощения в УФ-спектре, обусловленные депуринизацией и депиримидинизацией, соответствующие всем четырем природным основаниям - Т, С, G и А (рис. 5А). При разделении опытных образцов на колонке Sephadex LH-20, вначале выходит высокополимерная ДНК и ее низкомолекулярные фрагменты. В шестой, седьмой, восьмой и девятой фракциях выходят, соответственно, цитозин, тимин, гуанин, аденин. Продукты дальнейшего окисления 8-OG находятся во фракциях 4 и 5. УФ-спектры поглощения этих продуктов представлены на рис. 6 и соответствуют весьма характерным УФ-спектрам имидазолона (a) [Raoul et al., 1996] и спироиминодигидантоина (г) [Suzuki and Oshima, 2002]. При разделении аналогичных опытных образцов на геле Toyopearl HW-40 (рис.55) также наблюдаются продукты, соответствующие пуриновым (фракции 11 и 14) и пиримидиновым (фракции 3 и 4) основаниям, в том числе урацилу (фракция 7), образовавшемуся в результате дезаминирования цитозина под действием тепла. Продукт, УФ-спектр поглощения которого соответствует имидазолону (Iz, 'kmlr!252 нм) [Suzuki et al., 2002] (рис.66), выходит во фракции непосредственно перед гуанином. В девятой фракции выходит соединение, УФ-спектр

поглощения которого представлен на рис.бв и соответствует УФ-спекгру дииминоимидазола (Diz, ^„,(„=255 нм) [Suzuki et al., 2002]. Наблюдается также ряд неидентифицированных продуктов. Полученные данные свидетельствуют о том, что в зависимости от длительности прогревания раствора ДНК происходит как образование 8-OG, так и его дальнейшее окисление. Среди продуктов дальнейшего окисления 8-оксогуанина удалось выделить продукты, УФ-спектры поглощения которых соответствуют УФ-спектрам имидазолона, спироиминодигидантоина (Sp, Хта=232 нм) [Luo et al., 2000] и дииминоимидазола. Возможно, образуются также и такие потенциально мутагенные повреждения, как оксазолон, гуанидиногидантоин, иминоаллантоин и другие.

Рис б.

УФ-спектры поглощения продуктов дополнительного окисления 8-OG,

соответстующих хроматографическому разделению растворов ДНК после реакции с Fpg, представленных на рис. 5.

(о) - имидазолон, колонка Sephadex LH-20;

(б) - имидазолон, колонка Toyopearl HW-40;

(в) - дииминоимидазол, колонка Toyopearl HW-40;

(г)

спироиминодигидантоин, колонка Sephadex LH-20.

По оси абсцисс - длина волны, нм;

По оси ординат - оптическая плотность, отн. ед.

Следует отметить, что ряд продуктов окисления гуанина, такие как имидазолон, оксазолон, дигидрогуанидиногидантоин - нестабильны даже при физиологические условиях [Kino, Sugiyama, 2001; Luo et al., 2001], так время полужизни дигидрогуанидинодигандоина в воде составляет 5 ч при 37°С и 8 ч при 0°С [Jovanovic, Simic, 1996]. Это обстоятельство затрудняет их выделение и идентификацию. Образование продуктов окисления 8-оксогуанина зависит от длительности теплового воздействия. Известно, что продукты дальнейшего окисления 8-оксогуанина способны к ошибочному спариванию с А и G, что в свою очередь приводит к таким мутагенным последствиям, как образование G—+T И G-»C трансверсий [Henderson et al., 2002].

3. Действие на ДНК ионов уронила, у-ЮЛученил и тепла

На рис.7 представлены зависимости образования 8-00 в растворах ДНК от концентрации ионов уранила в растворе после воздействия у-излучения в дозе 5 Гр для двуспиральной и денатурированной ДНК. Эти зависимости имеют немонотонный характер. Уровень 8-00 растет с увеличением концентрации ионов уранила до 5 мкМ, затем наблюдается некоторый спад при 10 мкМ и дальнейшее увеличение образования 8-00 с ростом концентрации уранилацетата.

Рис 7.

Зависимость образования 8-00 в растворах ДНК (1мМ фосфатный буфер, рН 6,8) от концентрации уранилацетата после воздействия у-излучения в дозе 5 Гр. Представлены средние значения и их стандартные отклонения для 3-х независимых экспериментов.

На рис.8 представлены зависимости образования 8-00 от дозы для

нативной (рис.8А) и денатурированной ДНК

(рис.8Б) с добавлением 5 мкМ уранилацетата. Эти

зависимости имеют

немонотонный характер, в отличие от воздействия одного у-излучения, когда

наблюдается линейный рост содержания 8-00 при увеличении дозы облучения.

Рис 8.

Зависимость образования 8-00 в растворах нативной (А) и денатурированной (Б) ДНК (1мМ ФБ, рН 6,8), содержащих 5 мкМ уранилацетата, от дозы у-облучения. Приведены средние значения и стандартные отклонения для 3-х независимых экспериментов.

Следует отметить, что изменение содержания 8-00 в зависимости от дозы облучения в нативной и денатурированной ДНК имеют «противофазный» характер: минимумы на дозовой зависимости для нативной ДНК соответствуют максимумам для

денатурированной и наоборот, что, ввдимо, связано с разной миграцией "дырки" по гуанинам, обусловленной образованием гуанин-катион радикала.

Особенно сильные изменения наблюдались при дозе 10 Гр, когда в нативной ДНК происходило увеличение содержания 8-OG на 21 нмоль/мкг ДНК, а для денатурированной - уменьшение на такую же величину, по сравнению с величинами, наблюдаемыми в образцах ДНК, облученных без уранила. Такой характер дозовой зависимости можно объяснить тем, что, наряду с продукцией 8-OG, происходит его дальнейшее окисление под действием ионов уранила с

Рис 9.

Зависимость образования 8-СС в растворах нативной и

денатурированной ДНК (1 мМ ФБ, рН 6,8), содержащих 5 мкМ уранилацетата, от длительности нагревания при 370С. По оси абсцисс - время нагревания, ч, по оси ординат - количество 8-OG, нмоль/мкг ДНК.

Приведены средние значения и стандартные отклонения для 9 независимых экспериментов

В присутствии 5 мкМ ионов уранила при прогревании при 37°С содержание 8-OG в ДНК в зависимости от времени меняется сложным квазиколебательным образом (рис.9). Этот результат не связан с разбросом величин, т.к. взяты усредненные данные по 9

независимым экспериментам. При этом изменения содержания 8-OG в нативной и денатурированной ДНК до 9 часов нагрева происходят в противоположных направлениях, а

квазиколебательный характер этих изменений затухает со временем.

Рис 10.

Зависимость образования 8-СЮ в нативной ДНК (1мМ ФБ, рН 6,8) при добавлении 5 мкМ уранилацетата и у-облучении в дозе 4 Гр, от времени прогревания при 37°С. Приведены средние значения и стандартные отклонения для 9 независимых экспериментов

Аналогичные процессы происходят и в отсутствие ионов уранила, как это было показано выше (рис.1), однако ионы уранила заметно усиливают этот процесс. При воздействии на раствор нативной ДНК у-излучения в дозе 4 Гр, ионов

образованием ряда новых продуктов.

уранила и физиологической температуры 37°С в течение 30 ч (рис.10) видно, что при 9 ч нагрева и 25-30 ч нагревания преобладают процессы дополнительного окисления 8-OG. В целом, при сочетанием воздействии этих трех факторов на ДНК, процессы окисления 8-OG преобладают над его образованием.

Исследовано влияние 5 мкМ уранилацетата на дезаминирование цитозина под действием тепла при прогревании ДНК при 80°С в течение 24 ч в 1мМ фосфатном буфере, рН 6,8. Полученные результаты представлены в таблице 1. В присутствии 5 мкМ уранилацетата происходит существенное увеличение образования урацила (приблизительно в 2,5 раза). Этот эффект увеличения теплового дезаминирования цитозина обусловлен ионом уранила, т.к. в присутствии 5 мкМ ацетата натрия, позволяющем вычленить влияние иона ацетата, происходит уменьшение величины дезаминирования примерно в 1,4 раза (табл. 1.). В то же время уранилацетат в концентрации 5 мкМ не влияет заметным образом на процесс тепловой депуринизации ДНК в аналогичных условиях. Константы скорости высвобождения гуанина и аденина в присутствии 5 мкМ уранилацетата и натрия ацетата были равны таковым для гуанина в контрольных образцах ДНК в пределах точности эксперимента и незначительно ниже для аденина (табл. 1).

Таблица 1. Влияние ионов уранила на дезаминирование цитозина в ДНК и ее

депуринизацию под действием тепла при 80°С.

ч Процесс Дезаминирование Депуринизация (А * 107, с'1)

цитозина

Образец (А х 107, с"1) Гуанин Аденин

ДНК (контроль) 2,2 ±0,2; 4,9 ±0,4; 3,7 ±0,3;

(п = 3) (п = 7) (п = 7)

ДНК + 5мкМ 5,3 ±0,6; 4,5 ±0,9; 3,1 ±0,2;

уранилацетата (п-3)* (п = 2) (п = 2)

ДНК + 5мкМ № 1,5 ±0,1; 5,0 ±0,4; 2,9 ± 0,2;

ацетата (п-3) (п = 2) (п = 2)

Нагревание раствора ДНК в 1мМ фосфатном буфере, рН 6,8, проводили в течение 24 ч при определении дезаминирования цитозина и 15 ч при депуринизации. Приведены средние значения констант скоростей (к) этих процессов и их стандартные ошибки п - число независимых экспериментов * - достоверно отличается от контроля, Р < 0,05.

Повышение концентрации уранилацетата до 50 мкМ не оказывало влияния на величину константы скорости освобождения гуанина и аденина по сравнению с контролем.

На рис. 11 представлена зависимость образования перекиси водорода в 1 мМ ФБ, рН 6,8, в условиях прогревания при 40°С в течение 3 ч, от концентрации уранидацетата, полученная методом усиленной хемилюминесценции в системе «люминол - р-йодфенол - пероксидаза». С повышением концентрации уранилацетата наблюдается и повышение продукции перекиси водорода, зависимость носит практически линейный характер. Добавление 20 мкМ уранилацетата увеличивает продукцию Н2О2 на 12,4 наномоль, тогда как добавление ацетата № в той же концентрации уменьшает ее образование на 1,1 наномоль, по сравнению с буфером без уранилацетата (рис. 11). С помощью высокоспецифичного флуоресцентного зонда для гидроксильных радикалов -кумарин-3-карбоновой кислоты, установлено (рис.12), что при прогревании при 80°С в течение двух часов раствора 1 мМ фосфатного буфера, рН 6,8, в присутствии 5 и 10 мкМ уранилацетата происходит существенное увеличение (на

0,23 и 0,8 наномоль, соответственно) образования гидроксильных радикалов по сравнению с контролем.

Рис 11.

Зависимость образования перекиси водорода в 1 мМ ФБ, рН 6,8, под действием нагревания при 40°С в течение 3 часов, от концентрации уранилацетата или ацетата N8.

По оси абсцисс - концентрация, мкМ;

По оси ординат - концентрация Н2О2, наномоль.

Приведены средние значения и стандартные отклонения для 3-х независимых экспериментов.

В присутствии аналогичных концентраций №-ацетата, как и в случае перекиси водорода, происходит некоторое уменьшение (на 0,02 и 0,18 наномоль, соответственно) образования 7-ОН-кумарин-З-карбоновой кислоты,

ии гидроксильных радикалов в присутствии ацетат-анионов.

Рис 12.

Образование гидроксильных

радикалов в 1 мМ ФБ, рН 6,8, прогретого при 40°С в течение 2 ч в зависимости от концентрации уранилацетата или ацетата N8.

По оси абсцисс: / -концентрация уранилацетата; 2 - ацетата N8, мкМ; По оси ординат: концентрация 7-ОН-кумарин-З-карбоновой кислоты, нМ.

Поскольку под действием ионов уранила, а также тепла и ионизирующего излучения, происходит генерация АФК, приводящая сначала к окислению гуанина в 8-оксогуанин, а затем и к его дальнейшему окислению, то эти два процесса обуславливают осциллирующий характер образования 8-оксогуанина

при окислении гуанина в ДНК, который ранее был отмечен для этого процесса в реакции Фентона [White et al., 2003].

Полученные нами результаты согласуются с литературными данными, где было показано, что в присутствии перекиси водорода и аскорбата обедненный уран генерирует гидроксильные радикалы, причем более эффективно, чем ионы железа в реакции Фентона [Miller et al., 2002]. При этом уранилнитрат из ОУ в этих условиях вызывает окислительные повреждения оснований ДНК, такие как образование тиминовых гликолей и 8-оксогуанина [Miller et al., 2002]. Полученные нами данные о различиях в образовании 8-оксогуанина и его дальнейшем окислении в двуспиральной и денатурированной ДНК под влиянием ионов уранила свидетельствуют, по-видимому, о том, что миграция дырки по гуанинам различна в этих двух случаях. Нами показано (рис.9), что при тепловом воздействии физиологической температурой 37°С в присутствии ионов уранила как в нативной, так и в денатурированной ДНК происходит изменение содержания 8-OG, которое носит сложный квазиколебательный характер. Аналогичный процесс происходит при 37°С и в отсутствие ионов уранила (рис.1). Он обусловлен тем, что, с одной стороны, происходит образование 8-OG, а с другой - его распад в результате дальнейшего окисления 8-OG. Причем ионы уранила существенно усиливают последний процесс. Возможным объяснением генотоксичного действия ионов уранила на ДНК может служить показанная нами способность ионов уранила вызывать генерацию АФК, таких как перекись водорода и гидроксильные радикалы. Поскольку тепло, ионизирующее излучение и ионы уранила индуцируют образование АФК, их совместное действие может приводить к синергическому усилению окислительных повреждений оснований в ДНК. Полученные в данной работе результаты по образованию перекиси водорода и гидроксильных радикалов в присутствии ионов уранила подтверждают рассмотренный ранее механизм генерации АФК в водных растворах под действием тепла [Брусков и др., 2002; Брусков и др., 2003]. Действительно, поскольку ион уранила является одним из наиболее эффективных акцепторов гидратированного электрона [Пикаев, 1986], он усиливает продукцию гидроксильных радикалов при образовании из гидроксильных ионов электрон-радикальной пары. Соответственно, увеличивается рекомбинация гидроксильных радикалов, сопровождающаяся образованием перекиси водорода.

Таким образом, наши результаты показывают возможность дополнительной генерации АФК под действием ионов уранила и усиление повреждающего воздействия на ДНК тепла и у-излучения. Ионы уранила, совместно с тепловым воздействием и приводят к таким мутагенным повреждениям

оснований ДНК, как образование 8-оксогуанина, продуктов его дальнейшего окисления и существенному увеличению теплового дезаминирования цитозина с образованием урацила. Полученные данные указывают на высокую химическую генотоксичность окислов урана при их взаимодействии с ДНК, в особенности с ее денатурированной формой. Это может свидетельствовать о том, что ДНК наиболее подвержена повреждающему действию ионов уранила в процессе репликации, когда двойная спираль находится частично в расплетенном состоянии. Известно, что при одинаковой концентрации ионов уранила, обладающих разной удельной активностью, неопластическая трансформация клеток увеличивается с ростом радиоактивности [Miller et al., 2002]. Эти данные позволяют предположить, что радиационный фактор также играет определенную роль в проявлении биологических эффектов обедненного урана. Возможно,

действие ионов уранила, опосредованное образованием АФК, является причиной повреждения ДНК при попадании ионов уранила в организм человека. Следствием всех этих процессов, по-видимому, может быть возникновение заболеваний "неясной этиологии", а также лейкемии у человека за счет загрязнения окружающей среды окислами урана при использовании бронебойных снарядов с обедненным ураном.

ВЫВОДЫ

1) Методом иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител, специфичных к 8-оксогуанину, показано, что при физиологической температуре 37°С происходит изменение содержание 8-оксогуанина в ДНК. Этот процесс носит сложный, квазиколебательный характер, а максимальные изменения содержания 8-оксогуанина достигают двукратных величин. Эти изменения обусловлены как дополнительным образованием 8-оксогуанина, так и его дальнейшим окислением активными формами кислорода, генерируемых при действии тепла.

2) Установлено, что при тепловом воздействии при 60°С происходит дальнейшее окисление 8-оксо-2'-дезоксигуанозина с образованием ряда неустойчивых продуктов. Свойства этих продуктов изменяются в зависимости от длительности прогревания. УФ-спектр поглощения одного из выделенных продуктов соответствует УФ-спектру спироиминодигидантоина.

3) После прогревания и выщепления из ДНК окисленных производных 8-оксогуанина ферментом 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазой и разделения их методами жидкостной колоночной хроматографии выделен ряд продуктов. УФ-спектры поглощения отдельных продуктов соответствуют УФ-спектрам имидазолона, спироиминогидантоина и дииминоимидазола. Показано, что образование промежуточных продуктов окисления зависит от времени и условий прогревания.

4) Ионы уранила при действии тепла вызывают дополнительное образование перекиси водорода и гидроксильных радикалов в фосфатном буфере, рН 6,8, и в воде. Опосредованная ионами уранила дополнительная генерация АФК приводит к усилению повреждений оснований ДНК с продукцией 8-оксогуанина, продуктов его дальнейшего окисления и увеличению теплового дезаминирования цитозина с образованием урацила. Ионы уранила усиливают повреждающее действие у-излучения на ДНК in vitro.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Брусков В.И., Малахова Л.В., Масалимов Ж.К., Черников А.В., Богатова B.C. Индуцируемое теплом образование активных форм кислорода и тепловые повреждения ДНК. // Ш-съезд биохимического общества. Санкт-Петербург. 2002 г. 26 июня-1 июля, тезисы докладов. С. 479.

2. Брусков В.И., Масалимов Ж.К., Богатова B.C., Черников А.В. Образование активных форм кислорода под действием тепла, повреждение

ДНК и старение. V-Международный симпозиум "Биологические механизмы старения". Харьков. 2002. 30 мая - 1 июня, тезисы докладов. С. 42.

3. Брусков В.И., Газиев А.И., Малахова Л.В., Масалимов Ж.К., Богатова

B.C. Использование методов иммуноферментного анализа для определения 8-оксогуанина - продукта повреждения ДНК активными формами кислорода. // Конференция «Научные исследования в наукоградах Московской области» - "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям". Пущине 2001 г. 24-26 октября, тезисы докладов. С. 44.

4. Богатова B.C., Масалимов Ж.К., Черников А.В., Брусков В.И. Тепловые повреждения ДНК активными формами кислорода с образованием 8-оксогуанина и его окисленной формы. // XIII зимняя международная молодежная научная школа. Москва. 2001 г. 7-9 февраля, тезисы докладов.

C. 63.

5. Богатова B.C., Масалимов Ж.К., Черников А.В., Брусков В.И. Повреждения ДНК активными формами кислорода с образованием 8-оксогуанина и его окисленной формы. // 5-ая Пущинская конференция молодых ученых «Биология - наука 21 века». Пущине 2001 г. 16-20 апреля, тезисы докладов. С. 112.

6. Богатова B.C., Масалимов Ж.К., Черников А.В., Гудков СВ., Брусков В.И. Генотоксическое действие ионов уранила с образованием в ДНК 8-оксогуанина и его окисленных форм при действии гамма-излучения и тепла. // 6-ая пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология -наука 21 века». Пущине 2002 г. 20-24 мая, тезисы докладов. С. 56.

7. Богатова B.C., Масалимов Ж.К., Черников А.В., Брусков В.И. Генотоксическое действие ионов уранила с образованием в ДНК 8-оксогуанина и его окисленных форм, // Горизонты биофизики. Пущино. 2003 г. Сборник работ. С. 194-198.

8. Смирнова B.C., Гудков СВ., Черников А.В., Брусков В.И. Образование 8-оксогуанина и его окисленных продуктов в ДНК под действием тепла при 37°С. // 8-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука 21 века». Пущино. 2004 г. 17-21 мая, тезисы докладов. С 69.

9. ' Смирнова B.C., Гудков СВ., Черников А.В., Брусков В.И. Образование 8-оксогуанина и его окисленных продуктов в ДНК in vitro под действием температуры 37°С. // Биофизика. 2005. Т. 50. Вып. 2. С. 243-252.

10. Смирнова B.C., Гудков СВ., Штаркман И.Н., Черников А.В., Брусков В.И. Генотоксическое действие ионов уранила на ДНК in vitro, обусловленное генерацией активных форм кислорода. // Биофизика. 2005, Т. 50. Вып. 3.

Научное издание

Автореферат В.С.Смирновой

Налоговая льгота - общероссийский классификатор продукции ОК - 005 - 93, том 2,953000 - книги, брошюры

Подписано в печать 24 02 05 г Заказ 10127Р Тираж 100 экз Усл печл 1,0

Отпечатано с оригинала-макета в Объединенном научно-техническом издательстве ПНЦ РАН

142290, гПущиноМосковской обл,пр Науки,3 ОНТИ

( . /1637

22 к:.? ?V> * i V

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Смирнова, Виолетта Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Активные формы кислорода, их роль и антиоксидантная защита клетки.

1.1. Активные формы кислорода.

1.1.1. Супероксид-анион радикал.

1.1.2. Перекись водорода.

1.1.3. Гидроксильный радикал.

1.1.4. Оксид азота и пероксинитрит.

1.2. Биологическая роль АФК.

1.3. Повреждающая роль АФК.

1.4. Антиоксидантная защита клетки.

Глава 2. Образование 8-оксогуанина и его биологическая роль.

2.1. Влияние различных экзогенных факторов на образование 8-оксогуанина в ДНК in vivo.

2.2. Роль 8-оксогуанина в патогенезе и развитии различных заболеваний.

2.3. Репарация 8-оксогуанина в ДНК.

Глава 3. Влияние некоторых повреждающих факторов на ДНК.

3.1. Ионизирующее излучение.

3.2. Температурное воздействие.

3.3. Ионы металов и обедненный уран.

3.3.1. Обедненный уран.

ЧАСТЬ И. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Глава 4. Материалы и методы исследования.

4.1. Материалы.

4.2. Методы.

4.2.1. Определение концентрации ДНК.

4.2.2. Облучение ДНК.

4.2.3. Очистка моноклональных антител из асцитной жидкости.

4.2.4. Образование 8-OG в ДНК под действием у-излучения.

4.2.5. Иммуноферментный анализ.

4.2.6. Определение тепловой продукции перекиси водорода в бидистиллированной воде и фосфатном буфере.

4.2.7. Удаление продуктов окисления 8-оксогуанина ферментом 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазой.

4.2.8. Жидкостная колоночная хроматография.

4.2.9. Определение тепловой продукции перекиси водорода в фосфатном буфере при действии уранилацетата и ацетата Na.

4.2.10. Определение тепловой продукции ОН - радикалов в фосфатном буфере при действии уранил ацетата и ацетата Na.

4.2.11. Определение образования урацила в ДНК при действии тепла и ионов уранила.

4.2.12. Депуринизация ДНК при действии тепла и ионов уранила.

ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 5. Образование 8-оксогуанина в ДНК под действием физиологической температуры 37°С.

5.1. Тепловое повреждение ДНК с образованием 8-оксогуанина при температуре 37°С.

5.2. Окисление 8-оксо-2'-дезоксигуанозина под действием тепла.

5.3. Образование перекиси водорода при 37°С.

Глава 6. Дополнительное окисление 8-оксогуанина и образование продуктов его окисления в ДНК.

6.1. Выделение и идентификация продуктов дальнейшего окисления 8-оксогуанина при нагревании раствора ДНК после прогревания раствора ДНК при 80°С.

Глава 7. Действие на ДНК ионов уранила, у-излучения и тепла.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Образование 8-оксогуанина и продуктов его окисления в ДНК in vitro под действием тепла, ионов уранила и γ-излучения"

Одним из наиболее значимых повреждающих факторов среды действующих на биологические макромолекулы - нуклеиновые кислоты, белки и липиды, - являются активные формы кислорода (АФК). Такие формы кислорода индуцируются разнообразными причинами: ионизирующей радиацией, множеством химических мутагенов и канцерогенов, а также естественным и, особенно, нарушенным аэробным клеточным метаболизмом. Высокая реакционная способность АФК делает их чрезвычайно токсичными для биологических систем на всех уровнях - от молекулярно-клеточного до организменного. Одной из наиболее чувствительных и биологически важных мишеней при повреждении ДНК активными формами кислорода является гуанин, а продуктом повреждения 8-оксогуанин [Kasai et al., 1984]. Поскольку 8-оксогуанин (8-OG) является наибольшим по величине выхода продуктом, образуемым при действии АФК на нуклеиновые кислоты, то 8-OG в настоящее время считается одним из основных биомаркеров окислительного повреждения ДНК [Griffiths et al., 2002]. В отличие от других производных оснований, образованных под действием АФК, блокирующих репликационный процесс, 8-оксогуанин обладает неоднозначными субстратно-кодовыми свойствами при биосинтезе нуклеиновых кислот, что приводит к точковым мутациям трансверсионного типа G:C-»A:T. О важности удаления 8-оксогуанина из организма говорит существование нескольких типов репарации этого повреждения у высших и у низших организмов. Действительно, в настоящее время установлена связь между образованием 8-OG и такими процессами как мутагенез [Брусков и др., 1992; Moria and Grollman, 1993], канцерогенез [Olinski et al., 2002], старение [Beckman and Ames, 1998] и патогенез болезней пожилого возраста [Зенков и др., 2001]. Поэтому исследование механизмов образования 8-оксогуанина в ДНК, при различных воздействиях, и его поведение в биологических процессах представляет актуальную фундаментальную проблему. Среди различных воздействий ведущих к генерации АФК и повреждению ДНК, ее спонтанной нестабильности, мутагенезу, старению и различным патологиям, роль тепла является наименее изученной. Из известных в настоящее время повреждений ДНК индуцируемых теплом (депуринизация, дезаминирование цитозина, однотяжевые разрывы сахаро-фосфатного остова), образование 8-оксогуанина установлено лишь недавно. Для понимания роли тепла необходимо вычленить и оценить ее относительную роль, как постоянно действующего физического фактора среды в повреждениях ДНК среди других воздействий. Необходимо также выяснить роль различных видов окислительных модификаций оснований ДНК в молекулярных механизмах индуцированного мутагенеза. Большую опасность для окружающей среды и здоровья человека (заболевания «неясной этиологии», лейкемия и др.) представляет использование снарядов с обедненным ураном (ОУ) в ходе военных конфликтов. При взрывах таких снарядов происходит сгорание урана с образованием различных окислов. Среди них наибольшее биологическое действие, по-видимому, оказывают образующиеся ионы уранила [Miller et al., 2002; Yazzie et al., 2003]. Поскольку ОУ на 60% менее радиоактивен, чем природный уран, то он не может вызывать существенные генотоксические эффекты, связанные с радиационным воздействием. Поэтому причины такого действия ОУ на организм человека до сих пор являются неизвестными. Исследование молекулярных механизмов, приводящих к генерации АФК, образованию 8-оксогуанина и других повреждений оснований в ДНК под действием таких факторов среды, как тепло, у-излучение и ионы уранила, представляет собой актуальную фундаментальную проблему, связанную с необходимым пониманием процессов мутагенеза, канцерогенеза и старения, индуцированных действием этих факторов окружающей среды.

Целями диссертационной работы являлись: изучить процесс теплового повреждения ДНК in vitro с образованием 8-оксогуанина, продуктов его дальнейшего окисления; исследовать модифицирующее влияние ионов уранила на образование 8-оксогуанина в ДНК под действием тепла и у-излучения.

В соответствии с выбранными целями были поставлены основные задачи:

1) исследовать процесс окисления гуанина в ДНК in vitro с образованием 8-OG и возможность его дальнейшего окисления при физиологической температуре 37°С;

2) выделить и идентифицировать продукты дальнейшего окисления 8-OG;

3) исследовать возможность влияния ионов уранила на генерацию активных форм кислорода под действием тепла, возможность усиления продукции 8-OG и других повреждений оснований в ДНК in vitro под действием тепла и у-излучения.

ЧАСТЬ I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Смирнова, Виолетта Сергеевна

ВЫВОДЫ:

1) Методом иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител, специфичных к 8-оксогуанину, показано, что при физиологической температуре 37°С происходит изменение содержания 8-оксогуанина в ДНК in vitro с образованием 8-оксогуанина. Этот процесс носит сложный, квазиколебательный характер, а максимальные изменения содержания 8-оксогуанина достигают двукратных величин. Эти изменения обусловлены как дополнительным образованием 8-оксогуанина, так и его дальнейшим окислением активными формами кислорода, генерируемых при действии тепла.

2) Установлено, что при тепловом воздействии при 60°С происходит дальнейшее окисление "8-оксо-2'-дезоксигуанозина с образованием ряда неустойчивых продуктов. Свойства этих продуктов изменяются в зависимости от длительности прогревания. УФ-спектр поглощения одного из выделенных продуктов соответствует УФ-спектру спироиминодигидантоина.

3) После прогревания и выщепления из ДНК окисленных производных 8-оксогуанина ферментом 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазой и разделения их методами жидкостной колоночной хроматографии выделен ряд продуктов. УФ-спектры поглощения отдельных продуктов соответствуют УФ-спектрам имидазолона, спироиминогидантоина и дииминоимидазола. Показано, что образование промежуточных продуктов зависит от времени и условий прогревания.

4) Ионы уранила при действии тепла вызывают дополнительное образование перекиси водорода и гидроксильных радикалов в фосфатном буфере, рН 6,8, и в воде. Опосредованная ионами уранила дополнительная генерация АФК приводит к усилению повреждений оснований ДНК с продукцией 8-оксогуанина, продуктов его дальнейшего окисления и увеличению теплового дезаминирования цитозина с образованием урацила. Ионы уранила усиливают повреждающее действие у-излучения на ДНК in vitro.

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

8-OG - 8-оксогуанин;

АФК - активные формы кислорода; мкАт - моноклональные антитела;

ПОЛ - перекисное окисление липидов;

СОД - супероксиддисмутаза;

ФБ- фосфатный буфер,

ОН~ - гидроксильный ион;

ОН* - гидроксильный радикал;

Н2О2- перекись водорода, ещ - гидратированный электрон.

02*~ - супероксид-анион радикал 1Ог - синглетный кислород

ABTS - 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenz-thiazoline-6-sulfonic acid)

Fpg - формамидопиримидин-ДНК-гликозилаза, MutM

G - радиационно-химический выход

ИФА - иммуноферментный анализ; 8-oxodG - 8-оксо-2'-дезоксигуанозин; г-2-амино-5-[(2-дезокси-Р-В-э/7«/и/'о-пентофуранозил)амино]-4Я-имидазол-4-он (имидазолон);

Or- 2,2-диамино-4-[(2-дезокси-р-В-эр«тро-пентофуранозил)амино]-5(2Я)-оксазалон (оксазолон);

Sp - спироиминодигидантоин; z- 2,5-диимино-4-[(2-дезокси-(В-В-эрыт/?о-пентофуранозил)амино]-2Я,5//-имидазол (дииминоимидазол); Gh- гуанидиногидантоин; 1а - иминоаллантоин.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе представлены результаты исследования процесса теплового повреждения ДНК in vitro, при физиологической температуре 37°С, с образованием 8-оксогуанина и продуктов его дополнительного окисления, исследовано модифицирующее влияние ионов уранила на образование 8-оксогуанина в нативной и денатурированной ДНК in vitro под действием тепла и у-излучения.

В 5 главе работы, методом иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител специфичных к 8-оксогуанину, показано изменение содержания 8-OG в растворе нативной и денатурированной ДНК (1мМ ФБ, рН 6,8) in vitro под действием физиологической температуры 37°С со временем. Этот процесс в обоих случаях носит сложный, осциллирующий характер и максимальные изменения, достигают двукратных величин. С помощью дифференциальной спектроскопии, показано изменение УФ-спектра поглощения 8-оксодезоксигуанозина после его прогревания при высоких температурах. Проведено хроматографическое разделение 8-oxodG, прогретого в течение различных временных интервалах и получен ряд продуктов. УФ-спектр поглощения одного из них меняется в зависимости от длительности прогревания, что свидетельствует об образовании новых неустойчивых продуктов обусловленных окислением 8-оксодезоксигуанозина под действием тепла. УФ-спектр поглощения этого продукта, полученный после наиболее длительного прогевания 8-oxodG (45 часов), соответствует УФ-спектру поглощения спироиминодигидантоина. Методом усиленной хемилюминесценции, в системе люминол-р-йодофенол-пероксидаза хрена, определена продукция перекиси водорода в воде и 1 мМ ФБ, рН 6,8, при тепловом воздействии физиологической температуры 37°С в течении различных длительных промежутков времени. Показан квазиколебательный характер изменения концентрации Н2О2 на приблизительно постоянном стационарном уровне. Полученные данные свидетельствуют о том, что образование 8-OG в ДНК при 37°С, опосредованно возникновением АФК под действием тепла.

В 6 главе работы, методами жидкостной колоночной хроматографии и проведении реакции с ферментом 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазой, впервые показано образование продуктов дополнительного окисления 8-оксогуанина в ДНК in vitro под действием тепла. УФ-спектры поглощения этих продуктов соответствуют УФ-спектрам имидазолона, спироиминодигидантоина и дииминоимидазолу.

В главе 7 проведено исследование образования 8-оксогуанина в ДНК in vitro при совместном действии тепла, у-излучения и ионов уранила. Приведены зависимости образования 8-OG в нативной и денатурированной ДНК от концентрации уранилацетата

90 после воздействия у-излучения и от дозы у-излучения с добавлением уранилацетата. Эти зависимости имеют немонотонный характер. Представлены зависимости образования 8-OG в нативной и денатурированной ДНК после у-облучения, от длительности прогревания при 37°С. Содержание 8-оксогуанина при этом меняется сложным квазиколебательным образом, а добавление ионов уранила заметно усиливает этот процесс. Методом усиленной хемилюминесценции, в системе люминол-р-йодофенол-пероксидаза хрена, показано, что уранилацетат увеличивает продукцию перекиси водорода при нагревании 1мМ ФБ, рН 6,8, тогда как ацетат Na ее уменьшает. С помощью кумарин-3-карбоновой кислоты установлено, что в присутствии уранилацетата в растворе 1мМ ФБ, рН 6,8 и его прогревании (80°С, 2 часа), происходит увеличение образования гидроксильных радикалов по сравнению с контролем в 2 раза. Эти данные свидетельствуют об образовании АФК под действием ионов уранила в условиях прогревания растворов. В свете полученных данных, осцилирующий характер образования 8-оксогуанина в ДНК под действием ионов уранила, у-облучения и теплового воздействия объясняется как образованием 8-OG, так и его дальнейшим окислением, что обусловленно генерацией АФК ионами уранила и теплом. В целом, при сочетанном воздействии этих трех факторов на ДНК, процессы окисления 8-OG преобладают над его образованием. Показано влияние ионов уранила на другой тип теплового повреждения ДНК, такой как дезаминирование цитозина, с образованием урацила. Константа скорости этого процесса составляет величину 5,6 х10"7с"\ В присутствии 5 мкМ уранилацетата происходит увеличение скорости образования урацила в 2,5 раза. В тоже время уранилацетат не влияет заметным образом на процесс тепловой депуринизации ДНК.

Таким образом, нам впервые удалось показать образование не только 8-оксогуанина в ДНК in vitro под действием тепла при 37°С, но и продуктов его дальнейшего окисления. Также показано образование продуктов дальнейшего окисления 8-оксо-2'-дезоксигуанозина под действием тепла. Показана возможность дополнительного образования АФК под действием тепла и ионов уранила что приводит к таким мутагенным повреждениям оснований ДНК, как образование 8-OG, продуктам его дальнейшего окисления, а также существенному увеличению теплового дезаминирования цитозина с образованием урацила. Ионы уранила усиливают повреждающее действие у-излучения на ДНК in vitro.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Смирнова, Виолетта Сергеевна, Пущино

1. Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.И. Человек и противоокислительные вещества. Ленинград: Наука. 1985 с.

2. Барабой В.А. Механизмы стресса и перекисное окисление липидов. // Успехи соврем. Биологии. 1991. Т. 111(6). С. 923-931.

3. Барабой В.А., Петрина Л.Г. Металлотионеины: структура и механизмы действия. // Укр. BioxiM. Журнал. 2003. Т. 75(4). С. 28-36.

4. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов. // М.: Медицина. 1989.278 с.

5. Болдырев А.А. Карнозин. Биологическое значение и возможности применения вмедицине. // М: МГУ. 1998. С. 119-121.

6. Брусков В.И. // Молекул. Биология. 1968. Т. 2. 681-687.

7. Брусков В.И., Газиев А.И., Малахова Л.В., Манцыгин Ю.А., Моренков О.С.

8. Брусков В.И., Петров А.И. Кинетика образования 8-окси-2 -дезоксигуанозин-5'-монофосфата под влиянием тепла: определение констант скоростей энергии активации. // Мол. Биол. 1992. Т. 26. С.1362-1369.

9. Брусков В.И., Черников А.В., Гудков С.В., Масалимов Ж.К. Активация восстановительных свойств анионов морской воды под действием тепла. // Биофизика. 2003. Т. 48. Вып. 6. С. 1022-11029.

10. Доклад ЮНЕП по обедненному урану. // Бюллетень МАГАТЭ. 2001. Т. 43. С. 4851.

11. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир. 1991.540 с.

12. Дубинин Н.П., Сидоров Б.Н., Соколов Н.Н. Генетический эффект свободныхрадикалов. // Докл. АН СССР. 1959. №1. С. 172-175.

13. Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Мутагены. Скрининг и фармакологическаяпрофилактика воздействий. М.: Медицина. 1998. 328 с.

14. Жанатаев А.К., Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Перспективы определения 8гидрокси-2-дезоксигуанозина в качестве биомаркера окислительного стресса вэксперименте и клинике. // Вестник РАМН. 2002. Т. 2. С. 45-49.

15. Жижина Г.П., Блюхтерова Н.В. Изменение уровня эндогенного окисления ДНК спомощью ионов металлов и ксенобиотиков. // Биохимия. 1997. Т. 62(1). С. 103-110.

16. Журавлев А.И. Развитие идей Б.Н. Тарусова о роли цепных процессов вбиологии. // Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии.1. М.: Наука, 1982. С. 3-37.

17. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньшикова Е.Б. Окислительный стресс: биохимический и патофизиологический аспекты. М.: МАИК «Наука/Интерпериодика». 2001. 343 с.

18. Зенков Н.К., Меныцикова Е.Б. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах. // Успехи соврем. Биологии. 1993. Т. 113(3). С. 286-296.

19. Зотин А.И., Зотина Р.С. Феноменологическая теория развития роста и старения организма. М.: Наука. 1993. 364 с.

20. Ищенко А.А., Булычев Н.В., Максакова Г.А., Джонсон Ф., НевинскиЙ Г.А.

21. Кудряшов Ю.Б. Радиационная биофизика (ионизирующие излучения). М.: ФИЗМАТЛИТ. 2004.448 с.

22. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Биологическая роль глутатиона. // Успехи соврем, биол. 1990. Т. 110(1). С. 20-33.

23. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. Новосибирск. Наука. 1989. 123 с.

24. Новосёлов В.И., Амелина С.Е., Кравченко И.Н., Новосёлов С.В., Янин В.А., Садовников В.Б., Фесенко Е.Е. Роль пероксиредоксина в антиоксидантной системе органов дыхания. //Докл. РАН. 2000. Т. 375(6). С. 831-833.

25. Новоселов В.И., Барышникова JI.M., Янин В.А., Амелина С.Е. Влияние пероксиредоксина VI на заживление резаной раны у крыс. // Доклады Академии Наук. 2003. Т. 393(3). С. 412-414.

26. Обухова Л.К., Эмануэль Н.М. Молекулярные механизмы замедления старения антиоксидантами. // Итоги науки и техники. Общие проблемы биологии. М.: ВИНИТИ. 1984. Т. 4 С. 44-80.

27. Обухова Л.К., Эмануэль Н.М. Роль свободнорадикальных реакций окисления в молекулярных механизмах старения живых организмов. // Успехи химии. 1983. Т. 52(3). С. 353-372.

28. Шарий Н.И., Подоплелов И.И., Ковалева В.М. Влияние длительной гипотермии на жизнеспособность культур клеток. Искусственное увеличение видовой продолжительности жизни. М. 1978. С. 20.

29. Шевченко В.А., Абрамов В.И., Фетисов А.Н., Нилова И.Н. Мутагенное действие урана. // 4 Съезд по радиационным исследованиям. Тезисы. Москва, 2024 ноября 2001 г. T.I. С.116.

30. Эмануэль Н.М. Антиоксиданты и пролонгирование жизни. // Биология старения. Л.: Наука. 1982. С. 569-585.

31. Эмануэль Н.М. Ингибиторы радикальных процессов (антиоксиданты) и возможность продления жизни. Киев: Ин-т геронтологии. 1979. С. 118-127. Ярмоненко С.П., Вайнсон А.А. Радиобиология человека и животных. М.: Высшая школа. 2004. 550 с.

32. Ames B.N., Shigenaga M.K., Hagen T.M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. Vol. 90. P. 7915-7922.

33. Ames B.N., Shigenaga M.K., Hagen T.M. Oxidants, antioxidants and degenerative diseasesof aging. Proc. Natl.Acad. Sci. 1993. Vol. 90. P. 7915-7922. Archer S. Measurement of nitric oxide in biological models. // FASEB J. 1993. Vol. 7. P. 349-360.

34. Aruoma O., Halliwell B. DNA-damage and free radicals. // Chem. Brit. 1991. Vol. 27. P. 149-152.

35. Aruoma О., Halliwell В., Dizdaroglu M. Iron-dependent modification of bases in DNA by superoxide radical generating system hypoxantine/xantine oxidase. // J. Biol. Chem. 1989. Vol. 264. P. 13024-13028.

36. Bagchi D., Hassoun E.A., Bagchi M. Oxidative stress induced by chronic administration of sodium dichromate Cr(VI). to rats. // Сотр. Biochem. Physiol. C. Pharmacol. Toxicol. Endocrinol. 1995. Vol. 110. P. 281-287.

37. Bast A., Haenen G.R.M.M., Doelman C.J.A. Oxidants and antioxidants: State of the art. // Amer.J.Med. 1991. Vol. 91. Suppl.3C. P. 2S-13S.

38. Baverstock K.F., Will S. Evidence for the dominance of direcr excitation of DNA in the formation of strand breaks in cells following irradiation. // Int. J. Radiat. Biol. 1989. Vol. 55. P.563-568.

39. Becker D., Seville M.D. The chemical consequences of radiation damage to DNA. // Adv. Radiat. Biol. 1993. Vol. 17. P. 121-180.

40. Beckman K.B., Ames B.N. The free radical theory of aging matures. // Physiol. Rev.1998. Vol. 78. P. 547-581.

41. Beckman K.B., Ames B.N. Endogenous oxidative damage of mtDNA. // Mutat. Res.1999. Vol. 424. P. 51-58.

42. Bleise A., Danesi P.R., Burkart W. Properties, use and health effects of depleted uranium (DU): a general overview. // J. Environment. Radioact. 2003. Vol. 64. P. 93112.

43. Burdon R.H. Released active oxygen species as intercellular signals: their role in regulation of normal and tumour cell proliferation. // Biol. Chem. 1992. Vol. 373. P. 739-740.

44. Burdon R.H., Gill V., Evans C.R. Active oxygen species and heat shock protein induction. // Stress Proteins. Induction and Function. Berlin: Springer-Verlag. 1990. P. 19-25.

45. Carmichael P., Hewer A., Osborne M. Detection of bulky DNA lesions in the liver of patients with Wilson's desiase and primary haemochromatosis // Mut. Res. 1995. Vol. 326. P. 235-243.

46. Chemeris N.K., Gapeyev A.B., Sirota N.P., Gudkova O.Y., Kornienko N.V., Tankanag A.V., Konovalov I.V., Buzoverya M.E., Suvorov V.G., Logunov V.A.

47. DNA damage in frog erythrocytes after in vitro exposure to a high peak-power pulsed electromagnetic field. // Mutat. Res. 2004. Vol. 558. P. 27-34.

48. Chen S-K., Tsai M-H., Lin C-H., Hwang J.J., Chan W.P. Determination of 8-oxoguanine in individual cell nucleus of gamma-irradiated mammalian cells. // Rad. Res. Vol. 155. P. 832-836.

49. Cheng K.C., Cahill D.S., Kasai H., Nishimura S., Loeb L.A. 8-Hydroxyguanine, anabundant form of oxidative DNA damage, causes G—>T and A—>C substitutions. // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267(1). P. 166-172.

50. Chung M.N., Kasai H., Jones D.S., Inone H., Ishikawa H., Ohtsuka E., Nishimura

51. S. An endonuclease activity of E. coli that specifically removes 8-hydroxyguanine residues from DNA. // Mutat. Res. 1991. Vol. 254. P. 1-12.

52. Chung M.N., Kasai H., Nishimura S., Yu P. Protection of DNA damahe by dietary restriction. // Free Rad. Biology and Medicine. 1992. Vol. 12. P. 523-525.

53. Chung M.N., Kim H.S., H.,Ohtsuka., Kasai H., Yamomoto F., Nishimura S. Anendonuclease activity in human polymorphonuclear neutrophils that removes 8-hydroxyguanine residues from DNA. // Biochim. Biophys. Res. Commun. 1991. Vol. 178. P. 1472-1478.

54. Crawford D., Zbinden I., Amstad P., Cerutti P. Oxidant stress induces the proto-oncogenes c-fos and c-myc in mouse epidermal cells. // Oncogen. 1988. Vol. 206. P. 667-673.

55. Cullis P.M., Symons M.C.R. Effects of direct radiation on deoxyribonucleic acid. // Radiat. Phys. Chem. 1986. Vol. 27. P. 93-100.

56. Cutler R. Human longevity and aging: possible role of reactive oxygen species. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1991. Vol. 621. P. 1-28.

57. Datta R., Hallahan D.E., Kharbanda S.M. Involvement of reactive oxygen intermediates in the induction of c-jun gene^anscription by ionizing radiation. // Biochemistry. 1992. Vol. 31. P. 8300-8306.

58. De Witt D.L. Prostaglandine endoperoxides synthase: regulation of enzyme expression. // Biochem. et biophys. acta. 1991. Vol. 1083. P. 121-134.

59. Debono D.P., Yang W.D. Exposure to low concentrations of hydrogen peroxide causes delayed endothelial cell death and inhibits proliferation of surviving cells. // Atherosclerosis. 1995. Vol. 114. P.235-245.

60. Dillard C.J., Tappel A. // Methods Enzymol. 1984. Vol. 105. P. 337-341. Diamascio P., Briviba K., Sasaki S.T. The reaction of peroxynitrite with tert-butyl hydroperoxide ptoduces singlet molecular oxygen. // Biol. Chem. 1997. Vol. 378. P. 1071-1074.

61. Dimascio P., Devasagayam T.P., Raiser S., Sies H. Carotenoids, tocopherols, and thiols as biological singlet molecular oxygen quenchers. // Biochem. Soc.Trans. 1990. Vol. 18. P. 1054-1056.

62. Duarte V., Gasparutto D., Jaquinod M., Cadet J. In vitro DNA synthesis opposite oxazolone and repair of this DNA damage using modified oligonucleotides. // Nucleic Acids Res. 2000. Vol. 28(7). P. 1555-1563.

63. Durakovic A. Undiagnosed illnesses and radioactive warfare. // Croatian Med. J. 2003. Vol. 44(5). P. 520-532.

64. Dynlacht J.R., Hen thorn J., ONan C., Dunn S.T., Story M.D. Flow cytometric analysis of nuclear matrix proteins: method and potential applications. // Cytometry. 1996. Vol. 24. P. 348-359.

65. Flanagan S.W., Moseley P.L., Buettner G.R. Increased flux of free radicals in cells subjected to hyperthermia: detection by electron paramagnetic resonance spin trapping. // FEBS Lett. 1998. Vol. 431(2). P. 285-286.

66. Frank J., Kelleher D.K., Pompella A., Thews O., Biesalski H.K., Vaupel P.

67. Enhancement of oxidative cell injury and antitumor effects of localized 44 degrees С hyperthermia upon combination with respiratory hyperoxia and xanthine oxidase. // Cancer Res. 1998. Vol. 58(13). P. 2693-2698.

68. Emerit I., Micheson A. Chromosome instability in human and murine autoimmune disease: anticlastogenic effect of superoxide dismutase. // Acta Physiol. Scand. 1980. Vol. 492. P. 59-65.

69. Fidelius R.K. The generation of oxygen radicals: A positive signal for lymphocyte activation. // Cell. Immunol. 1988. Vol. 113. P. 175-182.

70. Floyd R. The role of 8-hydroxyguanine in carcinogenesis. // Carcinogenesis. 1990. Vol. 11. P. 1447-1450.

71. Forsinski M., Bialkowski K., Skiba M. Evaluation of 8-oxodeoxyguanosine typical oxidative DNA damage, in lympocytes of ozone-treated arteriosclerotic patients. // Mutat. Res. 1999. Vol. 438. P. 23-27.

72. Fraga C.G., Motchnik P.A., Shigenaga M.K., Helbock H.J., Jacob R.A., Ames B.N.

73. Ascorbic acid protects against endogenous oxidative DNA damage in human sperm. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. Vol. 88. P. 11003-11006.

74. Fraga C.G., Shigenaga M.K., Park J.V., Degan P., Ames B.N. Oxidative damage to DNA during aging: 8-Hydroxy-2 -deoxyguanosine in rat organ DNA and urine. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. Vol. 87. P. 4533-4537.

75. Fuciarelli A.F., Wegher B.J., Blakely W.F., Dizdaroglou M. Yields of radiation induced base production in DNA: effect of DNA conformation and gassing condition. // Int. J. Radiat. Res. 1990. Vol. 3. P. 397-415.

76. Gajewski E., Rao G., Nackrdien Z., Dizdaroglu M. Modification of DNA bases in mammalian chromatine by radiation generated free radicals. II Biochemistry. 1990. V. 29. P. 7876-7882.

77. Galeotti Т., Massotti L., Borello S., Casali E. Oxy-radical metabolism and control of tumour growth. //Xenobiotica. 1991. Vol. 21. P. 1041-1052.

78. Garner M.H., Spector A. Selective oxidation of cysteine and methionine in normal and senile cataractous lenses. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. Vol. 77. P. 1274-1277. Giese B^//Ann. Rev. Biochem. 2002. Vol. 71. P. 51-70.

79. Gutteridge J.M. Iron promoters of the Fenton reaction and lipid peroxidation can be released from haemoglobin by peroxides. // FEBS Lett. 1986. Vol. 201. P. 291-295.

80. Halliwell В., Gutteridge J. Free radicals in biology and medicine. Oxford: Clarendon Press, 1986. 346 p.

81. Halliwell В., Gutteridge J.M.C. Free radicals as usefull species. // Free Radicals in Biology and Medicine. 1989. P. 366-415.

82. Hansson M., Asea A., Ersson U. Induction of apoptosis in NK cells by monocyte-derived reactive oxygen metabolites. // J. Immunol. 1995. Vol. 156. P.42-47. Harman D. Free radical in aging. // Mol. and Cell. Biochem. 1988. Vol. 84(2). P. 155161.

83. Henderson P.T., Delaney J.C., Gu F., Tannenbaum S.R., Essigmann J.M. Oxidation of 7,8-dihydro-8-oxoguanine affords lesions that are potent sources of replication errors in vivo. II Biochemistry. 2002. Vol. 41. P. 914-921.

84. Hoffman M.E., Mello-Filho A.C., Meneghini R. Correlation between cytotoxic effect of hydrogen peroxide and the yield of DNA strand breaks in cells of different species. // Biochim. et Biophys. Acta. 1984. Vol. 781. P. 234-238.

85. Hogg N., Darley-Usmar V.M., Wilson M.T., Moncada S. Production of hydroxyl radicals from the simultaneous generation of superoxide and nitric oxide. // Biochem. J. 1992. Vol. 281. P. 419-424.

86. Holistein M., Sidransky D., Vogelstein В., Harris C.C. p53 vutations in human cancers. Science, 1991. Vol. 253. P. 49-53.

87. Hollingsworth M.J. Temperature and length of life in Drosophila // Exp. Gerontol., 1969. Vol. 4 P. 49-55.

88. Horan P., Dietz L., Durakovic A. The quantitative analysis of depleted uranium isotopes in British, Canadian, and U. S. Gulf War veterans. // Mil. Med. 2002. Vol. 167. P. 620-627.

89. Huang L.E., Zhang H., Bae S.W., Liu A.Y. Thiol reducing reagents inhibit the heatshock response. Involvement of a redox mechanism in the heat shock signal transductionpathway. //J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269(48). P. 30718-30725.

90. Hunt J.V., Dean R.T., Wolff S.P. Hydroxil radical production and autooxidativeglycosylation. // Biochem. J. 1988. Vol. 256. P. 205-212.

91. Johnson H.A., Pavelec M. Thermal injury due to normal body temperature. // Am. J. Patol. 1972. Vol. 66. P. 557-564.

92. Jovanovic S.V., Simic M.G. One-electron redox potentials of purines and pyrimidines. // J. Phys. Chem. 1986. Vol. 90. P. 974-978.

93. Kalinich J., Ramakrishnan N., Villa V., McClain D. Depleted uranium-uranyl chloride induces apoptosis in mouse J774 macrophages. // Toxicology. 2002. Vol. 179. P.105-114.

94. Kasai H. // Mutat. Res. 1997. Vol. 387. P. 147-163.

95. Kasai H., Crain P.E., Kuchino Y., Nishimura S., Ootsuyama A., Tanooka H.

96. Katschinski D.M., Boos K., Schindler S.G., Fandrey J. Pivotal role of reactive oxygen species as intracellular mediators of hyperthermia-induced apoptosis. // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275(28). P. 21094-21098.

97. Kawanishi S., Inoue S., Yamamoto K. Active oxygen species in DNA damage induced by carcinogenic metal compounds. // Environ. Health Perspect. 1994. Vol. 102. Suppl.3. P. 17-20.

98. Kelly J., Orner G., Hendricks Y., Williams D. Dietary hydrogen peroxide enhances hepatocarcinogenesis in trout: correlation with 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine levels in liver DNA. // Carcinogenesis. 1992. Vol. 13. P. 1639-1642.

99. Kino K., Saito I. Product analysis of GC-specific photooxidation of DNA via electron transfer: 2-aminoimidazolone as a major guanine oxidation product. // J. Am. Chem. Soc. 1998. Vol. 120. P. 7373-7374.

100. Kohda K., Kasai H., Ogawa T. Deoxyribonucleic Acid (DNA) damage induced by bleomycin-Fe(II) in vitro: formation of 8-hydroxyguanine residues in DNA. // Chem. Pharm. Bull. 1989. Vol. 37. P. 1028-1030.

101. Konings A.W. Membranes as targets for hyperthermic cell killing. // Recent Results Cancer Res. 1988. Vol. 109. P. 9-21.

102. Madison D.V. Pass the nitric oxide. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. Vol. 90. P. 4329-4331.

103. Maki H., Sekiguchi M. MutT protein specifically hydrolyses a potent mutagenicsubstrate for DNA synthesis. //Nature. 1992. Vol. 35. P. 273-275.

104. Malins D., Haimanot R. Major alterations in the nucleotide structure of DNA in cancerof the female breast. // Cancer. Res. 1991. Vol. 51. P. 5430-5432.

105. Manevich Ye. Held K.D., Biaglow J.E. Coumarin-3-carboxylic acid as a detector forhydroxyl radicals generated chemically and by gamma radiation. // Rad. Res. 1997. Vol.148. P. 580-591.

106. Mao Y., Liu K.J., Jiang J.J., Shi X. Generation of reactive oxygen species by Co(II) from H2O2 in the presence of chelators in relation to DNA damage and 2 -deoxyguanosine hydroxylation. //J. Toxicol. Environ. Health. 1996. Vol. 47. P.61-75.

107. McCord J.M., Russel W.J. Superoxide inactivates creatine phosphokinase during reperfusion of ischmic heart. // Oxy-Radicals in Molecular Biology and Pathology. N.Y.: Liss. 1988. P. 27-35.

108. McDiarmid M.A., Keogh J.P., Hooper F.J., McPhaul K., Squibb K., Kane R. Health effects of depleted uranium on exposed Gulf War veterans. // Environ. Res. 2000. Vol. 82. P. 168-180.

109. Miller A.C., Brooks K., Stewart M., Anderson В., Shi L., McClain D., Page N.

110. Genomic instability in human osteoblast cells after exposure to depleted uranium: delayed lethality and micronuclei formation. // J. Environ. Radioact. 2003. Vol. 64. P. 247-259.

111. Miller A.C., Stewart M., Brooks K., Shi L., Page N. Depleted uranium-catalyzed oxidative DNA damage: absence of significant aipha particle decay. // J. Inorg. Biochem. 2002. Vol. 91. P. 246-252.

112. Miller A.C., Xu J., Stewart M., Brooks K., Hodge S., Shi L., Page N., McClain D.

113. Suppression of depleted uranium-induced neoplastic transformation of human cells by the phenyl fatty acid, phenyl acetate: chemoprevention by targeting the p21RAS protein pethway. // Radiat. Res. 2001. Vol. 155. P. 163-170.

114. Miller D.M., Buettner G.R., Aust S.D. Transition metals as catalysts ofautooxidation" reactions. // Free Rad. Biol. Med. 1990. Vol. 8. P. 95-108.

115. Mills C.D. Molecular basis of "suppressor" macrophages. Arginine metabolism via thenitric oxide synthetase pathway. // J. Immunol. 1991. Vol. 146. P. 2719-2723.

116. Mitchel R.E., Birnboim H.C. Triggering of DNA strand breaks by 45 degrees Сhyperthermia and its influence on the repair of gamma-radiation damage in human whiteblood cells. // Cancer Res. 1985. Vol. 45(5). P. 2040-2045.

117. Moncada S., Palmer R.M.J., Higgs E.A. Nitric oxide: physiology, pathophysiologyand pharmacology. // Pharmacol. Revs. 1991. Vol. 43. P. 109-142.

118. Moriya M., Grollman A.P. Mutations in the mutY gene of Escherichia coli enhance thefrequency of targeted G:C—>T:A transversions induced by a single 8-oxoguanine residuein single-stranded DNA. // Mol. Genet. 1993. Vol. 239(1-2). P. 72-76.

119. Moriya M., Ou C., Bodepudi V., Johnson F., Takeshita M., Grollman A.P. // Mutat.

120. Res. 1991. V. 254. P. 281-288.

121. Mould R.F. Depleted uranium and radiation-induced lung cancer and leukaemia. // The British J. Radiol. 2001. Vol. 74. P. 677-683.

122. Mullarkey C.J., Edelstein D., Brownlee M. Free radical generation by early glycation products: a mechanism for accelerated atherogenesis in diabetes. // Biochem. And Biophys. Res.Commun. 1990. Vol. 173. P. 932-939.

123. Murrell G., Bromley F.N. Modulation of fibroblast proliferation by oxygen free radicals. // Biochem. J. 1990. Vol. 265. P. 659-665.

124. Nathan C.F., Hibbs J.B. Role of nitric oxide synthesis in macrophage antimicrobal activity. // Current Opinion Immunol. 1991. Vol. 3. P. 65-70.

125. Ogawa A., Griffin R.J., Song C.W. Effect of a combination of mild-temperature hyperthemia and nicotinamide on the radiation response of experimental. // Rad. Res. 2000. Vol. 153. P. 327-331.

126. Ogura H., Takeuchi Т., Morimoto K. A comparison of the 8-hydroxy-deoxyguanosine, chromosome and micronucleus techniques for the assessment of thegenotoxicity of mercury compoud in human blood lymphocytes. // Mutat. Res. 1996. Vol. 340. P. 175-182.

127. Okajima K., Griffin R.J., Iwata K., Shakil A., Song C.W. Tumor oxygenation aftermild-temperature hyperthermia in combination with carbogen breathing: dependence onheat and tumor type. // Rad. Res. 1998. Vol. 149. P. 294-299.

128. Oliver C., Marman E., Goldstein S. // Biol. Chem. 1987. Vol. 262. P. 5488-5491.

129. Palmer R.M.J., Ferrige A.G., Moncada S. Nitric oxide release accounts for thebiological activity of endothelium-derived relaxing factor. // Nature. 1987. Vol. 327. P.524.526.

130. Radi R-, Becman J., Bush K., Freeman B. Peroxynitrite-induced membrane lipid peroxidation: The cytotoxic potentional of superoxide and nitric oxide. // Arch. Biochem. Biophys. 1991. Vol. 288. P. 481-487.

131. Ravanat J.-L., Cadet J. Reaction of singlet oxygen with 2 -deoxyguanosine and DNA. Isolation and characterization of the main oxidation products. // Chem. Res. Toxicol. 1995. Vol. 8. P. 379-388.

132. Reid G.G., Edwards J.G., Marshall G.E. Hydrogen peroxide induces microvilli on human retinal pigment epithelial cells in culture. // Cell Biol. Int. 1995. Vol. 19. P. 91101.

133. Reid T.M., Feig D.I., Loeb L.A. Mutagenesis by metal-induced oxygen radicals. // Environ. Health Perspect. 1994. Vol. 102. Suppl.3. P. 57-61.

134. Repine J.E., Johansen K.S., Berger E.M. Hydroxyl radical scavengers produce similar decreases in the chemiluminescence responses and bactericidal activities of neutrophils. // Infect, and Immun. 1984. Vol. 43. P. 435-437.

135. Roots R, Okada S. Estimation of life times and diffysion distances of radicals involved in X-ray-induced DNA strand breaks or killing of mammalian cells. // Radiat. Res. 1975. Vol. 64. P. 306-320.

136. Roti J.L., Wright W.D., VanderWaal R. The nuclear matrix: a target for heat shock effects and a determinant for stress response. // Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 1997. Vol. 7. P. 343-360.

137. Rubanyi C.M. Vascular effects of oxygen-derived free radicals. // Free Radical Biol, and Med. 1988. Vol. 4. P. 107-121.

138. Rubin R., Farber J.L. Mechanism of the cultured hepatocytes by hydrogen peroxide. // Arch. Biochem. and Biophys. 1984. Vol. 228. P. 450-459.

139. Sagone A.L., Greewald J., Kraut E.H. Glucose: a role as a free radical scavenger inbiological system. //J. Lab. and Clin. Med. 1983. Vol. 101. P. 97-104.

140. Sakumi K., Furuichi M., Tsuzuki Т., Kakuma Т., Kawabata S., Maki H., Sekiguchi

141. M. Cloning and expression of cDNA for a human enzyme that hydrolyzes 8-oxo-dGTP, a mutagenic substrate for DNA synthesis. // J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268. P. 2352423530.

142. Salbu В., Janssens K., Lind O.C., Proost K., Danesi P.R. // J. Environment. Radioact. 2003. Vol. 64. P. 167-173.

143. Schreck R., Rieber P., Baeuerle P.A. Reactive oxygen intermediates as apparently widely used messengers in the activation of the NF-k-B transcription factor and HIV-1. // EMBO J. 1991. Vol. 10. P. 2247-2258.

144. Schubert J., Wilmer J.W. Does hydrogen peroxide exist "free" in biological systems? // Free Radical Biol. And Med. 1991. Vol. 11. P. 545-555.

145. Shaw A.A., Cadet J. Direct effects of y-radiation on 2'-deoxycytidine in frozen aqueous solution. // Int. J. Radiat. Res. 1996. Vol. 70. P. 1 -6.

146. Shaw A.A., Voituriez L., Cadet J. Identification of the products resulting from the effects of y-radiation on thymidine. // J. Chem. Soc. Perkin Trans. II. 1988. P. 13031307.

147. Shigenaga M., Hagen Т., Ames B. Oxidative damage and mitohondrial decay in aging. //Proc. Natl. Acad. Sci. 1994. Vol. 91. P. 10771-10778.

148. Shimoda R., Nagashima M., Sakamoto M. Increased formation of oxidative DNA damage. 8-hydroxydeoxyguanosine, in human livers with chronic hepatitis. // Cancer Res. 1994. Vol. 54. P. 3171-3172.

149. Shingu M., Yoshioka K., Nobunaga M., Yoshida K. Human vascular smooth muscle cells and endothelial cells lack catalase activity and are susceptible to hydrogen peroxide. //Inflammation. 1985. Vol. 12. P. 215-222.

150. Smiley P.L., Stremler K.E., Prescott S.M. Oxidatively fragmentedphosphatidylcholines activate human neutrophils through the receptor for plateletactivating factor. // J. Biol. Chem. 1991. Vol. 266. P. 11104-11110.

151. Sneddon J.M., Vane J.R. Endothelium-derived relaxing factor reduces plateletadhesion to bovine endothelial cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. Vol. 85. P.2800-2804.

152. Snyder S.H. Nitric oxide 1st in a new class of neurotransmitters. // Science. 1992. Vol. 257. P. 494-496.

153. Spitz D.R., Dewey W.C., Li G.C. Hydrogen peroxide or heat shock induces resistance to hydrogen peroxide in Chinese hamster fibroblasts. // J. Cell. Physiol. 1987. Vol. 131. P. 364-373.

154. Stamler J.S., Jaraki O., Osborne J. Nitric oxide circulares in mammalian plasma primarily as an S-nitroso adduct of serum albumin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. Vol. 89. P. 7674-7677.

155. Standeven A.M., Wetterhahn K. Is there a role for reactive oxygen species in the mechanism of chromium (VI) carcinogenesis? // Chem. Res. Toxicol. 1991. Vol. 4. P. 616-625.

156. Stronger S., Payne D. Oxygen toxicity. // Ann. Pharmacotherapy. 1992. Vol. 26. P. 1554-1581.

157. Suzuki Y.J., Ford G.D. Inhibition of Ca2+-ATPase of vascular smooth muscle sarcoplasmic reticulum by reactive oxygen intermediates. // Amer. J. Physiol. 1991. Vol. 261. P. H568-H574.

158. Suzuki Т., Masuda M., Friesen M.D., Fenet В., Ohshima H. Novel productsgenerated from 2'-deoxyguanosine by hypochlorous acid or a myeloperoxidase-H202-Crsystem: identification of diimino-imidazole and amino-imidazolone nucleosides. //

159. Nucleic Acids Research. 2002. Vol. 30(11). P. 2555-2564.

160. Suzuki Т., Ohshima H. Nicotine-modulated formation of spiroiminodihydantoinnucleoside via 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in 2'-deoxyguanosinehypochlorous acid reaction. // FEBS Letters. 2002. Vol. 516. P. 67-70.

161. Tajiri Т., Maki H., Sekiguchi M. Functional cooperation of Mut T, Mut Y, Mut Mproteins in preventing mutations caused by spontaneous oxidation of guaninenucleotidein E. coli. И Mutat. Res. 1995. Vol. 336. P. 257-267.

162. S. 8-Oxoguanine (8-Hydroxyguanine) DNA Glycosylase and Its Substrate Specificity. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. Vol. 88. P. 4690-4694.

163. Topinka J., Binkova В., Sram K. The influence of tocotherol and pyritinol on oxidative DNA damage and lipid peroxidation in human limphocytes. // Mutat. Res. 1989. Vol. 225. P. 131-136.

164. Varga S.I., Novak Z., Pataki L. The influence of antioxidants on the oxidative stress ofred blood cells. // Clin. Chim. Acta. 1992. Vol. 205. P. 241-244.

165. Verheij M., Bose R., Lin X.H., Yao В., Jarvis W.D., Grant S., Birrer M.J., Szabo

166. E., Zon L.I., Kolesnick R.N. Requirement for ceramide-initiated S APK/JNK signallingin stress-induced apoptosis. //Nature. 1996. Vol. 380. P. 75-79.

167. Verma A., Hirsch D.J., Glatt C.E. Carbon monoxide: A putative neural messenger. //

168. Science. 1993. Vol. 259. P. 381-384.

169. Vialas C., Pratviel G., Meyer A., Rayner В., Meunier B. Obtention of two anomers of imidazolone during the type I photosensitized oxidation of 2'-deoxyguanosine. // J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1.1999. P. 1201-1205.

170. Von Sonntag C. The chemical basis of radiation biology. London. Taylor & Francis. 1987. P. 94-100.

171. Ward J.F., Blakely W.F., Moberly J.B. A comparison of the enzymatic repair kinetics of ionizing radiation and of hydrogen peroxide induced DNA strand breaks in V79 cells. // Radiat. Res. 1983. Vol. 94. P. 629-630.

172. Weiss S.J. Tissue destruction by neutrophils. //New Engl. J. Med. 1989. Vol. 320. P. 365-376.

173. Wendel A. Enzymes acting against reactive oxygen. // Enzymes: Tools and Targets. 1988. P. 161-167.

174. Wiseman H., Kaur H., Halliwell B. DNA damage and cancer: measurement and mechanism. // Cancer Lett. 1995. Vol. 355. P. 209-234.

175. Yamanaka K., Okada S. Induction of lung-specific DNA damage by metabolically methylated arsenics via the production of free radicals. // Environ. Health Perspect. 1994. Vol. 102. Suppl.3. P. 37-40.

176. Yang K.D., Shaio M.-F. Hydroxil radical as an signal involved in phorbol ester-induced monocyte differentiation of HL60 cells. // Biochem. And Biophys. Res. Commun. 1994. Vol. 200. P. 1650-1657.

177. Yanofsky С., Сох E.C., Horn V. The unusual mutagenic specifity of an E. coli mutator gene. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1966. Vol. 55. P. 274-281.

178. Yazzie M., Gamble S.L., Civitello E.R., Stearns D.M. Uranyl acetate causes DNA single strand breaks in vitro in the presence of ascorbate (vitamin C). // Chem. Res. Toxicol. 2003. Vol. 16. P. 524-530.

Информация о работе
  • Смирнова, Виолетта Сергеевна
  • кандидата биологических наук
  • Пущино, 2005
  • ВАК 03.00.02
Диссертация
Образование 8-оксогуанина и продуктов его окисления в ДНК in vitro под действием тепла, ионов уранила и γ-излучения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно
Автореферат
Образование 8-оксогуанина и продуктов его окисления в ДНК in vitro под действием тепла, ионов уранила и γ-излучения - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации
Похожие работы