Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Образование 8-оксигуаниловых нуклеотидов под действием φ-радиации и влияние 80окси-GTP на синтез олигонуклеотидов в РНК-полимеразной реакции

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Образование 8-оксигуаниловых нуклеотидов под действием φ-радиации и влияние 80окси-GTP на синтез олигонуклеотидов в РНК-полимеразной реакции"

РГ8 ОД

- НОЯ 1995

На правах рукописи УДК 577.214.3 577. 346

Усачева Анна Максимовна

ОБРАЗОВАНИЕ 8-0КСИГУАНИЛ0ВЫХ НУКЛЕОТИЛОВ ПОЛ ДЕЙСТВИЕМ г-РАЛИАЦИИ И ВЛИЯНИЕ 8-ОКСИ-етР НА СИНТЕЗ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ В РНК-ПОЛИНЕРАЗНОЙ

РЕАКЦИИ.

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино-1995

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Научный руководитель:

доктор химических наук В.И. Брусков

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А.И.Газиев; кандидат физико-математических наук А. В. Карнаухов

Ведущая организация: Институт биофизики клетки РАН.

Защита состоится «<¿3 „ МгЛ^у^ 1Эд5 Г0Да в ~ часов на

заседании диссертационного совета Д 200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292 г.Пущино Московской области. Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

6 диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Автореферат разослан 19Э5 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук /

У

■1

Нелипович П. А.

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы

Активные формы кислорода, такиа как гидроксил и супероксид радикалы, перекись водорода и синглетный кислород образуются в процессе аэробного метаболизма в клетке и под воздействием у-радиации, ультрафиолетового излучения, различных токсинов, красителей, ряда лекарств ( Ames, 1983), вызывая нарушения в структуре нуклеиновых кислот, белков, липидов.

Одним из наиболее существенных биологически значимых генотокси-ческих повреждений в ДНК. под действием некоторых активных форм кислорода является 8-оксидезоксигуанозин. Этот тип повреждения играет важную биологическую роль в мутагенезе, канцерогенезе и старении (Breimer, 1990) .

Содержание 8-оксигуанозина в крови или выделяемого организмом с мочой служит маркером физиологического неблагополучия организма <Floyd, 1986). О важности для организма удаления этого повреждения говорит существование специальных систем репарации. Эти системы включают в себя продукты генов-мутаторов: mutM - S-oxo-G-гликозила-зу ( Tchou, 1991), mut Y ( фермент репарации неправильной пары A-8-oxo-G ) и mut Т - белок (8-oxo-dGTP-a3a), снижающий пул 8-охо-dGTP, как мутагенного субстрата в ДНК-полимеразной реакции ( Grollman & Moriya, 1993). С возрастом происходит накопление 8-oxodG в клетках и замедление удаления поврежденных оснований из организма , что связано, видимо, со снижением скорости метаболических процессов (Fraga et al., 1990). При образовании 8-oxodG могут возникать А=>С, G=tT трансверсии ( Wood, 1990, Moriya, 1991) . Наиболее частые мутационные замены при раке легких и печени это трансверсии GC=>TA { Holistein et al., 1991). Активация протоонко-генов при трансверсиях G=>T обнаружена в раке легких у курильщиков ( Reynolds et al., 1991). Таким образом, исследование биологической роли 8-оксигуанозина необходимо для более глубокого понимания процессов мутагенеза, канцерогенеза и старения.

Основная часть научных работ ведется по исследованию возникновения этого повреждения в ДНК. Образование 8-oxo-G в РНК и следствия кодифицирования по восьмому атому GTP, играющим важную роль во многих внутриклеточных реакциях, сравнительно мало изучено.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы было изучение воздействия у-излучения на гуаниловые нуклеозиды и нуклеотиды, мочевую кислоту и выяснение

влияния 8-замещенных аналогов GTP на синтез опигонуклеотидов в РНК -полимеразной реакции , а также выяснение возможности синтеза polyOxoG полинуклеотидфосфорилаз ой.

Экспериментальные задачи исследования состояли в следующем:

1) Исследование субстратных свойств 8-oxo-GTP u 8-Br-GTP в реакции синтеза опигонуклеотидов РНК-полимеразой E.coli на промоторе AI ДНК фага Т7 ДД 111 при ограниченном наборе субстратов и изучение кинетики ингибирования.

2) Исследование методом дифференциальной УФ спектроскопии образования 8-оксипроизводных гуаниловых нуклеозидов и нуклеотидов под действием ионизирующего излучения.

3) Исследование методом УФ-спектроскопии воздействия у-радиации на мочевую кислоту.

4) Синтез полинуклеотияов полинуклеотидфосфорилазой с включением 8-oxoG с перспективой использования подобной матрицы в системе синтеза белка.

Научная новизна работы

В результате настоящей работы исследовано образование 8-оксигуа ниловых производных при j-облучении растворов нуклеозидов и нуклео тидов ( Guo, dGuo, GMP, dGMP, GDP u GTP). При облучении нуклеозидов в HgO и в DgO обнаружено, что механизмы формирования 8-окси-гуанина под действием у-облучения и тепла отличаются друг от друга. При 37° уровень повреждений клеточного нуклеотидного фонда dGTP, индуцированных природным радиационным фоном, составляет приблизительно О, 2% от теплового, а при температуре 4°С « 20 '/.. Аналогичные оценки, сделанные для ДНК, показывают, что радиационное воздействие на нуклеотидный клеточный фонд dGTP больше чем на ДНК. •При воздействии у-радиации на мочевую кислоту и гуанозин наблюдается медленное пострадиационное разрушение хромофорных групп. Мочевая кислота « в 3 раза менее устойчива к действию радиации по сравнению с гуанозином.

Обнаружено, что S-BrGTP является ингибитором, a 8-oxoGTP проявляет неоднозначные субстратно-кодовые свойства в системе синтеаа опигонуклеотидов РНК-полимеразой Bscherihia coli на промоторе AI ДНК фага Т7 ADill при ограниченном наборе субстратов. Рассчитаны количественные характеристики связывания этих аналогов нуклеотидов в центрах фермента, геометрия которых приспособлена для включения АТР и UTP. 8-oxo-GTP u 8-Br-GTP конкурируют с АТР (отношение равновесных констант диссоциации 2,1 и 2,4 при значении константы для АТР 0,3 мМ), но в отличие от АТР не включаются в

состав продукта. 8-охо-С1Р конкурирует также и с ОТР ( Отношение равновесных коне™1нт диссоциации 21,8 при значении константы для итр 0,03 нМ). в-Вг-СТР с центром связывания итр не взаимодействует.

8-охо-ЕТР в отличие от 8-Вг-йТР и вТР способен замещать итр при синтезе тетра- и пентануклеотида. Замена БТР на 8-охо-СТР и в-Вг-СТР при синтезе на слабом Р-промоторе не приводит к инициации синтеза , что говорит о неспособности данных аналогов быть инициа-торнымя нуклеотидами.

В системе синтеза с полинуклеотидфосфорилазой синтезирован полинуклеотид ро1уАохов с соотношением нуклеотидов А:охоС 2:1 и 3:1 и длиной цепи 30-100 звеньев и полинуклеотид ро1уохов с длиной цепи 30-70 нуклеотидов.

Научно-практическая ценность работы.

Апробирован методический подход оценки радиационного и теплового повреждения нуклеотидов методом дифференциальной УФ спектроскопии.

Биологическая роль, обусловленная проявлением неоднозначных субстратно-кодовых свойств в-охо-в , является существенной для понимания некоторых путей спонтанного, радиационного и химического мутагенеза и канцерогенеза.

Использование модельных систем позволяет приблизиться к пониманию узнавания РНК-полимеразой нуклеотидов. Сравнение 8-ВгСТР и 8-охо-СТР дало возможность проверить гипотезу об образовании РНК-полимеразой водородных связей с атомами С8 и N3 пуринов и Сб и 02 пкримидинов в парах А=и и сгс, Встраивание в-охов вместо и говорит о возможности образования водородных связей узнающим центром РНК-полимеразы с 8-0 атомом 8- охобТР (в син-конформации), расположенном на месте 02 атома итр, что может свидетельствовать в пользу этой гипотезы.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, их обсуждения и выводов. Материал изложен на

/0-? стр. машинописного текста, содержит 17 рисунков и 6 таблиц. Список цитированной литературы включает ¿9£> наименований.

Апробация работы Материалы, изложенные в диссертации, были представлены на внутриинститутской конференции Института биологической физики в 1991 и Института Теоретической и экспериментальной биофизики РАН в 1993 году.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В опытах использовали нуклеозиды и нуклеозид моно- ди- и трифосфаты фирм "Реанал" (Венгрия) и "Serva" (ФРГ). В случае необходимости нуклеотиды дополнительно очищали на колонке ДЕАЕ-сефадекса А-25 в линейном градиенте LiCl.

Синтез олигонуклеотидов: ДНК. делеционного мутанта была выделена Курявык В. В. по методу Ричардсона (Richardson, 1966). РНК полимераза гро В 1006 была любезно предоставлена О.Селюченко . В работе по синтезу тетра- и пентануклеотидов использована РНК-полимераза производства Олайне. Условия синтеза описаны ранее ( В. В Курявый, Брусков, 1987). Продукты синтеза разделяли методом электрофореза в ЗОХ полиакриламидном геле. После авторадиографии нужные участки геля вырезали и просчитывали по черенковскому излучению на жидкостном сцинтиляционном счетчике .

Дифференциальные спектры измеряли в области 285-310 нм на приборе "Specord М40" ( "Карл Цейсс", Йена ) на шкале оптической плотности О, ID.

Растворы облучали на "Гамма-установке биологического эксперимента" с активностью 137 ТБК 60Со. Дозы облучения составляли 10, 40, 100, 150, 200, 270 Грэй. Пострадиационный эффект оценивался при дозе 270 Грей. Все измерения проводили непосредственно после облучения, за исключением временной зависимости для оценки пострадиационного эффекта. Концентрации солей металлов при исследовании влияния ионов металлов на образование 8-оксигуанозина были 10 мкМ.

В работе по синтезу полинуклеотидов использовали фермент из Micrococcus lyaodeikticus ( Boehringer) и из E.coli ( термостабильный фермент, любезно предоставленный Седельниковой Э.А. ) Синтез полинуклеотидов полинуклеотидфосфорилазой проводили как описано в работе Folayan, 1984. В процессе работы методика была модифицирована. Время синтеза уменьшено до 24 часов. Температура синтеза 55°С.

Для уменьшения инактивации фермента был добавлен дитиотраитол до - 4

концентрации 10 М. По окончании синтеза проводили депротеинизацию фенолом , отбирали водную фазу и троекратно осаждали смесью 4M ацетат аммония и изопропанол (или этиловый спирт) (1:3) до удаления следов фенола. Определение длины цепи проводили в денатурирующем полиакриламидном геле и колоночной хроматографией на молекулярном сите SW-40 Toyopearl.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Кинетика ингибирования 8-oxyGTP u 8-BrGTP синтеза дийуклеотида рррАри РНК-поликеразой Escherichia Coli на промоторе А1 ДНК фага_ Т7 ADlll при ограниченом наборе субстратов.

В отличие от природных субстратов конформационное равновесие син-анти у 8-oxy-GTP u 8-Br-GTP сдвинуто в сторону син-конформера ( Kapuler, Reich, 1971). Это делает возможным образование хугсти-новской пары типа A-G ( син) при синтезе РНК ( рис.1). Ранее было показано, что 8-оху-АТР образует пару такого типа с dGMP матрицы при синтезе ди- и тринуклеотида на промоторе А1 ДНК фага Т7 7D111 ( Курявый, Брусков, 1987). Сравнение 8-оху u 8-Br-GTP позволяет также проверить гипотезу об образовании РНК-полимеразой водородных связей с инвариантными атомами С8 и N3 пуринов и С6 и 02 пириниди-нов в комплементарных парах A-U u C-G.

1.1. Влияние 8-oxo-GTP на синтез динуклеотида рррАри В присутствии аналогов скорость синтеза динуклеотида уменьшалась, при том 8-oxoGTP оказывал более сильный ингибирующий эффект. Зависимость синтеза динуклеотида от времени на временном промежутке 0-30минут была линейна при всех комбинациях нуклеозидтрифосфа-тов: ATP + OTP, ATP + UTP + 8-oxo-GTP, ATP +UTP48-Br-GTP. Графики двойных обратных величин представляют собой семейства прямых, пересекающихся на оси абсцисс( рис.2 ).

Выведенное нами уравнение из графиков зависимости скорости синтеза от концентрации ATP u UTP : v^g- v(AB)m xab

(а+ao)x(b+bo)

соответствует кинетической модели двусубстратной реакции с неупоря доченным присоединением. Величина констант а и Ь для фермента из

Рис. 1. Схемы образования

комплексов 8-замешенны ми аналогами GTP с нук-леотидами матрицы при синтезе динуклеотида pppApU; а, б, в-комплекс в центре взаимодействия с ATP. a-Wobble-пара T-8-oxoG (анти); б -wobble-napa T-8-BrG С анти); и-комплементар-ная пара Т-А; г-образование пары А - 8oxoG (син), аналогичной комплементарной паре А-и в центре для включения UTP.

г

мутантного штамма гро ВЮОб составляет 300 и 30 мкМ соответственно Графики двойных обратных величин при фиксированной концентрации 8-охо-СТР представляют собой семейства прямых, пересекающихся на оси абсцисс (рис.2).

С учетом влияния 8-оксигуанозина уравнение примет вид-.

(а+а0') <Ь+ЬоП , где ас значения величин а ц Ь в присутствии ингибитора. С уче-

скорости синтеза

кажущиеся

константы,

том того, что

*o'-o[<H-iol>/i01]

=V ii+i02)/l02]'

- абсциссы точек пересечения прямых с осью X на рисунке зависимости значений кажущихся констант от концентрации ингибитора, тогда V,

(AB)

abxiolxi02

AB

(ai 01 +a0i +aoi Q1)x(bi 02+b(Ji+b0i Q2>

¿Лдд / muh/MKM

,muh/mkM

1Чд ж . i

tan

ms г

so /

/15

so 3

</o i

1_

-Чаи тип 5

a g,Mffi

ю //о.млг"1 izjji то zoo lib,**'*

b'a, мкМ

Рис. 2. Кинетика синтеза динуклеотида рррАри в отсутствии (а, б) и в присутствии 8-oxo-GTP, ММ:0,35( в, Г) , 0, 7( д, е) 1, ОБ (ж, з ). а, в, д, ж-зависимости обратных величин начальной скорости синтеза(l/v,„) от об

АО

ратной концентрации АТР(1/а) при концентрациях UTE (мкМ):5 ( 1), 10( 2), 20(3), 40{ 4); величина отрезков,отсекаемых на оси ординат прямыми на графиках б е,е, з соответственно при различных концентрациях АТРС5); 6,г,е,э- зависимости обратных величин скорости cHHTesal/v^g

от обратной концентрации OTP (1/Jb) при концетрации АТР, мкМ 100(1), 200(2), 400(31,800(4); величина отрезков, отсекаемых от оси ординат прямыми на графиках а, в, д, ж при различных концентрациях UTP (5) ;и-зависи-мость величины а'на графиках а, в, д, ж от концентрации 8-охо-GTP(i),к-зависииость величины отрезков, отсекаемых прямыми 5 на оси ординат а-з и обозначающих величину, обратную максимальной скорости синтеза 1/V^^j^oT концентрации Э-охо-

GTP(i), зависимость Ъ' на графиках б, г, е, з от концентрации 8-oxo-GTP(i).

Соответствующая этому уравнению кинетическая модель представлена на рис. 3 б, вывод следующего уравнения для которой здесь опущен:

fOkAB*ab*IK*KI

АВ

Параметры а

А

К- О. 3,

(ахК +Акх+А.к;гк; (ЬК1+1КВ+КВК1) , Ь , ¿„,, -¡„о соответствуют константам диссоциации

О О и!

К„=0.03, ,К=0. 63, К=0. 65, а величина =0,58 мкМ/мин.

В X I (АН/со

Графики двойных обратных величин, отражающие синтез динуклеоти-да в присутствии трех концентраций 8-ВгСТР имеют аналогичный вид, за исключением того, что кажущаяся константа характеризующая

равновесную константу диссоциации ОТР из ОТР-свяэывающего центра,, в присутствии Вгв не изменяется, что говорит об отсутствии взаимодействия ВгвТР с центром связывания итр а константа диссоциации для АТР-связываюшего центра для 8-ВгСТР 1К=0,71( Кинетичес-

кая модель соответствующая уравнению, описывающему синтез динукле-отида в присутствии в-ВгвТР показана на рис.3 а.

Рис. 3. Кинетические модели синтеза динук-леотида в присутствии 8-BrGTP(а) и 8-охо-GTP(б). А-первый субстрате АТР); В-второй субстрат (OTP) ;Х-8-BrGTP <а)8-oxoGTP(b)открытый промоторный комплекс РНК-полимеразы с ДНК.; AF,FB,AFB,IF,IFB,FI,AFI- комплексы с

соответствующими субстратами и ингибиторами; KA,Kgr ^К,К^.-равновес-

ные константы диссоциации субстратов и ингибиторов из соответствующих комплексов; к^-константа скорости диссоциации из фермент-матричного комплекса динуклеотида pppApU (АВ).

Таким образом, оба изученных аналога имеют общее свойство.- они непродуктивно конкурируют с АТР. Специальные опыты, в которых АТР был полностью заменен на 8-oxoGTP или З-BrGTP показали, что аналоги не включаются в продукт.

1. 2. Синтез тетрануклеотида AUCN и пентануклеотида CAUCN с инициаторным динуклеотидом СрА.

Линуклеотид СрА осуществляет избирательную инициацию синтеза с промотора А1 ( Oen et al., 1979). 8-Br-GTP и 8-oxo-GTP проявляют субстратные свойства GTP и эффективно влючаются в конец тетра- и пентануклеотида ( Рис. 4). Это приводит к терминации дальнейшего синтеза. Без СрА наблюдается лишь небольшое включение следующего

нуклеотида AMP, тогда как в контрольных экспериментах происходит синтез цепи РНК.

№ Рис.4. Радиоавтограф геля с

продуктами синтеза олигонук-леотидов на AI промоторе (1-5) и Д промоторв (6-8) ДНК фага Т7 AD 111. Во всех пробах, кроме 5, мечешшй субстрат a P-UTP, в 5-а Р-СТР.. T-8-Br-GTP включается вместо GTP в конец тетрануклео-тида, II, Щ-то же для 8-охо-I « ш *> pppGpUpUpGpG- GTP, в III по сравнению с pppApüpCpN - » Щ * pppGpUpUpG Ii обнаруживается дополни-

pppApoxoGpC - • pppGpUpU тельный олигонуклеотидный

« „ „ • » т ^ продукт. Концентрации субст-

pppApUpCÄ A ~90PPPGPV ратов в пробах, мкМ: АТР-рррАри ф * • 300(1-5);UTP-20(1-8),СТР-10

(1-5),GTP-500(2,б), 8-BrGTP А а — ^ -210 (3), 8-oxoGTP-360(4,5) и

, 32 flMMMAAa 8-нулевое время

ЩЦр^ВВН^^^В^Р синтеза. Соотношение фермент " " : ДНК 20:1(1-5) И 50:1 В ос-

12345678 тальных пробах.

При использовании в реакционой смеси двух субстратов GTP u OTP происходит инициация синтеза со слабого Д-промотора с синтезируемой последовательностью pppGpüpUpGpG ( Prosen, Cesh, 1986) . В Этом случае замена GTP на 8-oxo-GTP ( рис 4(7))и 8-Br-GTP не приводит к инициации синтеза соответствующих олигонуклеотидов как при замене АТР на 8-Br-ATP и 8-охо-АТР на AI промоторе (Курявый,Брусков,1987) Сравнение результатов синтеза на AI промоторе при замене GTP на

8-замещенные аналоги GTP при использовании двух различных меченных 32 32

субстратов а- P-UTP и а- Р-СТР показывает, что в случае исполь-

32

зования аналога 8-oxo-GTP и метки а Р-СТР между продуктами синтеза, соответствующими тринуклеотиду pppApUpC и тетрануклеотиду pppApUpCpoxoG,обнаруживается дополнительный олигонуклеотидный продукт ( рис 4(5)). он может соответствовать тринуклеотиду pppApoxoGpC либо тетрануклеотиду ppApoxoGpCpoxoG с измененной по

отношению к свидетелям электрофоретической подвижностью, так как в 32

случае a P-UTP этот продукт не регистрируется. Для подтверждения замещения UTP на 8-oxoGTP был проведен анализ продуктов синтеза при использовании инициаторного динуклеотида СрА при полном замещении OTP на 8-замещенные аналоги GTP (рис 5). 8-oxo-GTP, в отличие от 8-Br-GTP способен замещать UTP и приводит к синтезу тетра - CpAoxoGpC и пентануклеотида CpApoxoGpCoxoG.

32

Был проведен щелочной гидролиз меченого при использовании а- Р

-СТР тетрануклеотида и дальнейший анализ полученных продуктов ионо обменной хроматографией на колонке в присутствии свидетеля 5'-8-oxo-GMP. При этом максимумы оптической плотности Э-oxo-GMP и

РНК Рис. 5. Радиоавтограф геля с про

дуктами синтеза олигонуклеот-идов на промоторе Al,инициированном динуклеотидом СрА.Замещение GTP на 8-oxo-GTP (6) и 8-BrGTP (7) . Замещение UTP на 8-oxoGTP (1) , 8-BrGTP (2) u GTP CpApNpCpN«» flBbk CpApUpCpN (-ЗД • Все пробы содержали 5 мкМ

CpApNpC V ШСрАрИрС tt Р~СТР и 50 "KM СрА; контроль

СрАрС « ™ (4). Концентрации других субст-

ратов: UTP-80 мкМ ; GTP-1,2 mM (3,7); 8-oxo-GTP- l.OmM <l,í>); 8-BrGTP- 0.92 mM (2,6) . 4-нуле-Ä - вое время синтеза при полном

аААДв^М^ наборе субстратов. '7 - синтез

32 протяженной цепи РНК. Соотноше-

[а Р] ние фермент:ДНК равно 20:1.

1 2 3 4 S678 радиоактивности совпадают. Известно, что щелочной гидролиз приводит к разрыву межнуклеотидных связей и переносу фосфата в (2')3'~ -положение предшествующего нуклеотида ( Kapuler, Reich, 1971), полученный результат свидетельствует о включении 8-oxo-GMP в середину нуклеотида вместо UMP и получение при синтезе тетрануклеотида CpApoxoGpC.

2. 1 Образование 8-оксигуанина при повреждении гуаниловых

нуклеотидов под действием ^-излучения.

Дифференциальное изменение оптической плотности при окислении гуаниловых нуклеотидов под действием r-излучения с образованием 8-оксигуанина имеет линейную зависимость от дозы (рис.6). Максимум изменения оптической плотности находится в области от' 293 до 300 нм, сдвигаясь в длинноволновую часть спектра с увеличением доли модифицированных оснований. Известно, что при э~радиолизе растбо-ров гуанозина и ДНК образуются продукты повреждения гуанина, такие как 8-оксигуанилы ( Dizdaroglu, 1985, Kasai et al., 1990 ), 2,4-диамино-5-формамидопиримидин ( Fappy-Gua) ( Fuciarelli at al., 1990, Boiteux'et al., 1992). В условиях аэрации основным продуктом являются 8-оксигуанилы. Fappy-Gua не вносит вклада в дифференциаль ный спектр, так как его максимум-около 270 нм ( Hems, 1958).

С помощью коэффициента экстинкции 8-оксигуанина ( Ka3ai, Nishimura, 1984, Брусков, Петров, 1992) вычислены величины

io"6 м

Рис.6. Образование 8-окси производных при г-облучении гуаниловых нуклеози-дов и нуклеотидов в зави-Tso Гр синости ох дозы.

По абсциссе- величина дозы (Гр), по ординате -концентрация^) 8-оксипроизводных

продуктов. Концентрация ис-

- 5

ходных растворов 5x10 М - з

в фосфатном буфере 10 М, Т^оГррН 6,8. 1 -dGuo; 2-Guo;

3- dGMP ; 4 - GMP ; 5- GDP ; 6- GTP Указаны средние значения и стандартные отклонения для 3-8 независимых экспериментов

100 150 гр

Нуклеозиды, Концентрации 8-оксигуанилов ( мкН) нуклеотиды при облучении дозами, Гр

40 100 150

10~8М/Гр

Guo 2, 0 ± 0. 3(8) 3,0 ± 0,3(7) 4, В 0,7(6) 3, 3 0, 3

dGuo 2, 0 ± 0, 5(5) 3, 6 ± 0,4(7) 4, 7 0,7(5) 3, 3 0,3

dGMP 1, 1 ± 0, 1(3) 2, 2 0,3(3) 2, 8 0,3(3) 2, 0 0,2

GMP 2, 3 ± 0, 3(4) 4,5 0,7(5) 5, 6 ± 0,6(6) 4, 0 0,4

GDP 0, 11 0, 1( 3) 1,8 ± 0,2(4) 3, 1 + 0,3(4) 2, 0 0,2

GTP 2, 7 ± 0, 7(5) 4,8 Hr 0,7(5) 5, 9 ± 0,9(5) 4, 2 0,4

Таблица 1 Влияние у-излучения на радиационно-хикический выход 8-оксигуаниловых производных по данным дифференциальной УФ-спектроскопии при разных дозах облучения. Примечание.

Представлены средние значения и их стандартные ошибки , в скобках указано число независимых экспериментов. Б - радиационно химический выход (молекула/100 эВ).

образования 8-оксигуанилов на единицу дозы облучения и значения радиационно-химического выхода (О для исследованных нуклеозидов и нуклеотидов. Полученные результаты суммированы в табл. 1.

Радиационно-химический выход 8-оксипроизводных нуклеозидов и нуклеотидов составляет от О, 2 до 0,4 молекул/loo эВ. На радиационно-хинический выход образования 8-оксипроизводных при у-облучении растворов гуаниловых нуклеозидов и нуклеотидов практически не влияет их исходная концентрация в растворе, что отмечалось ранее (Trumbore, 1989).

Это свидетельствует о косвенном действии радиации и формировании повреждений кислородными радикалами при облучении в растворе. Этот вывод подтверждают также наши результаты г~облучения замороженных в жидком азоте образцов Guo и dGuo. Даже при больших дозах облучения - 150 Гр мы не наблюдали образования 8-оксигуанина, о чем свидетельствует отсутствие максимума поглощения в дифференциальном УФ-спектре.

Ранее было показано, что образование 8-оксигуанина, индуцируемое теплом, значительно усиливается в тяжелой воде (Е>20' по сравнению с Н^О ( Брусков, Петров, 1992). В отличие от теплового воздействия, при у-облучении гуаниловых нуклеозидов в тяжелой воде радиа-ционно-химический выход 8-оксипроизводных оказался меньше, чем в легкой воде (табл. 2). Этот факт означает, что молекулярные механизмы окисления при тепловом повреждении гуанина и у-облучении, по-видимому, различны. Детальные химические процессы, ведущие к образованию 8-оксигуанина, все еще остаются невыясненными. При тепловом воздействии превращение гуанина в 8-оксигуанин осуществляется, вероятно, преимущественно посредством синглетного кислорода ( Брусков, Петров, 1992).

Таким образом, необходимо учитывать, что пути образования 8-оксигуанина могут различаться под влиянием разных воздействий. Присутствие в клетке антиоксидантов и ферментативных систем защиты от действия кислородных радикалов ( Ames et al., 1993) может по-разному влиять на процессы окисления гуанина, индуцированные теплом и у-облучением in vivo.

Образование 8-оксигуанина под действием з—излучения было исследовано ранее для гуанина (Trumbore et al.,1989) dGuo , dGMP ( Dizdaroglu, 1985) и ДНК ( Kasai et al., 1990, Fuciarelli et al., 1990). Показано, что в присутствии кислорода - это преобладающий продукт модификации гуанина. С помощью ЯМР и масс-спектрометрии установлено, что 8-оксигуанин является основным продуктом при рентгеновском облучении динуклеотида d(GpC) < Paul et al., 1987) и тетрануклеотида d(TpApCpG) (Paul et al., 1988) в водном растворе. Полученные нами значения радиационно-химических выходов

нуклеозидов соответствуют значениям G-0.3-0.4, полученным ранее (Trumbore et al., 1989, Dizdaroglu, 1985).

Следует отметить, что радиационно-химический выход образования 8-оксигуанина при облучении ДНК in vitro близок значениям, представленным ранее ( Kasai et al., 1990) , или превышает значения, полученные для нуклеозидов ( Fuciarelli et al., 1990). При этом значение выхода мало зависит от конформации ДНК (нативная или денатурированная форма), хотя сильно зависит от присутствия кислорода в растворе ( Fuciarelli et al., 1990).

Количество 8-оксигуанина в ДНК после облучения клеток in vivo на три порядка ниже, чем после облучения ДНК in vitro ( Kasai et al., 1986), что обусловлено репарацией этих повреждений и наличием в клетках систем защиты генетического материала от воздействия кислородных радикалов. Уровень повреждения нуклеотидного фонда гуанилов в клетках может быть ниже, чем величина этого изменения in vitro, за счет присутствия в них антиоксидантов и систем ферментативной защиты от кислородных радикалов.

Полученные в данной работе численные значения выхода 8-оксигуанина в зависимости от дозы у-облучения нуклеозидов и нуклеотидов (табл. 1) позволяют оценить и сопоставить величины теплового повреждения с величиной, обусловленной ПРФ. Среднее значение облучения ПРФ оценивается величиной 2,4 мЗв/год ( Алексахин, Гуськова, 1994), а фоновое облучение от всех источников излучения -5 мЗв/год ( Баженов и др. , 1990), т.е. мощность поглощенной дозы, обусловлен ной ПРФ, составляет величину 7,6*10 11Гр с а от всех источников фонового облучения - 1,6*10 10Гр с Полученные Нами значения

радиационно - химического выхода 8-оксигуаниловых нуклеотидов на

-8 -1

единицу дозы облучения составляют от 2 до 4,2*- 10 М Гр , т.е.

средняя скорость образования 8-оксигуаниловых производных под дей-

-18 -1

ствием всех источников ПРФ равна я 5*10 М с Повреждение клеточного нуклеотидного фонда dGTP под действием ПРФ при 37°С составляет « 0,2У. от тепловой величины, а при t°4°C (k=5, 7*10 12с 1) ~ 20%. Аналогичные оценки, сделанные для ДНК, показывают, что радиационное воздействие на нуклеотидный клеточный фонд dGTP больше, чем на ДНК. Поэтому можно ожидать, что мутагенное действие кислородных радикалов и радиационно-генетическое действие ионизирующего излучения будет осуществляться в значительной степени через воздействие на клеточный нуклеотидный фонд dGTP.

2.2.Влияние ионов тяжелых металлов на образование 8-оксигуанозииа при ц- облучении.

Влияние различных ионов тяжелых металлов на выход 8-оксигуанозина показан в таблице 2.

Продукция активных форм кислорода различными системами ( ионизирующая радиация, гипоксантин/ксантин оксидазная система, перекись водорода) увеличивается в присутствии ионов металлов, усиливая повреждения ДНК ( Агиота, 1989).

По нашим даным наибольший эффект на образование 8-оксигуанозина оказывают ионы неди и железа что согласуется с литературными данными авторов исследующих влияние этих ионов при воздействии других

о ,

систем на ДНК ( Агиота, 1989, Вл.г<1агод1и, 1991) . Со ионы и

ионы марганца снижают выход 8-оксигуанозина ( табл.2).

2п2+ ' 2 + 1 Си 1 РЬ2 + м- 2 + N1 Со2+ 1 1 1

0.92 + 0.2 1 2.1 ± 0.8 1 0.99 ± 0.4 1.09 ± 0 5 0.68 ± 0 1 13 1

Мд 2 + 1 Мп 1 сг2°42" Са2+ Ге 1 1 1

1.0 4 0.3 1 0.53 ± 0.25 1 0.79 ± 0.18 0.86 ± 0 4 1 2.5 ± 0 1 6 1

Таблица 2. Влияние ионов тяжелых металлов на выход 8-оксигуанозина при воздействии у-радиации на раствор гуанозина. Значения даны по отношению к контролю (принят за 1).

2.3.Пострадиационый эффект облучения нуклеозидов и мочевой кислоты.

Необходимость измерений сразу после облучения гуаниловых нуклеозидов обусловлена постепенным исчезновением максимума на 293 нм со временем. Ранее подобный эффект был занечен при воздействии у-радиации на аденин I ТгшпЬоге et а1, 1989). Мочевая кислота, на к продукт метаболизма нуклеозидов, была взята для сравнения, поскольку известно что при воздействии УФ-облучения устойчивость к облучению зависит от количества карбонильных групп. Еще Шугар в 19в0г показал, что устойчивость пуринов к ультрафиолетовому облучению падает в таком порядке: аденин , гипоксантин, ксантин, мочевая кислота. Для пириминовых оснований также характерен параллелизм между чувствительностью к фотолизу и числом карбонильных групп в кольце.

Были изучены изменения спектров мочевой кислоты и и в и дифференциального спектра сЗС после воздействия у-радиации. Изменения спектра мочевой кислоты и дифференциального спектра ав показаны на рис. 7. Рассчитанный нами радиационный выход разрушения

мочевой кислоты составил 1, 5 молекулы на ЮОэВ.

Для оценки вклада долгоживущих продуктов радиолиза воды было изучено влияние облученных растворителей (воды, буфера) на изменение ' спектров изучаемых веществ в течение 48 часов. Сравнительная оценка показала, что растворение веществ в облученном растворителе не вызывало сдвигов максимумов или появления новых, но вызывало уменьшение максимумов в спектре за счет частичного разрушения вещества. При растворении в облученной воде уменьшение максимума за 48 часов составляло 5'6У. для dG и 16-20% для мочевой кислоты, тогда как хранение облученных растворов тех же веществ приводит к 45% и 98'/. падению максимума соответственно. Растворение в облученном фосфатном буфере в коцентрации 10 М вызывало падение максимума на 1-2% для dG и на 8-10% для мочевой кислоты.

Трис-буфер оказывает больший ингибирующий эффект по сравнению с фосфатным на образование 8-оксигуанозина под действием кислородных

_ о

радикалов ( Floyd, 1990) при концентрации 4,8x10 М. При облучении раствора мочевой кислоты влияние двух типов буфера представлено на рис. 7 (В). Трис-буфер имеет более резко выраженную концентра-ционую зависимость по сравнению с фосфатным.

1-1-1-Г

210 240 270 300 330

Длина волны, нм

0 12 3 4 5

- lg С

290300310

Длина волны, нм

Рис.7. А - Спектр мочевой кислоты: а - исходный, b - сразу после облучения раствора мочевой кислоты (50 мкМ) дозой 270 Грэй с временным интервалом снятия спектра 20 минут; с-через 24 часа после облучения; _d - через 24 часа после растворения в облученном Tris-буфере ( 10 М) дозой 270 Грей; В - зависимость концентрации разрушенной кислоты от концентрации фосфатного (а) и Tris - буфера ( Ь) при дозе 100 Грэй; С - дифференциальный спектр дезоксигуано-зина после облучения дозой 270 Грэй, снятый с интервалом 18 минут.

Таким образом мочевая кислота в 3 раза менее устойчива к действию ионизирующей радиации по сравнению с дезоксигуанозином и может служить индикатором присутствия активных форм кислорода в воде.

3. Синтез полинуклеотидов полинуклеотидфосфорилазой

с включением 8-okchG.

Известно, что полимеризация GDP полинуклеотидфосфорилазой требует более высокой температуры и присутствия ионов Mn ( Thang et al. 1965). в обычных условиях ( 37°) полис цепь не синтезируется. Синтез полинуклеотидов с включенными аналогами проведен Икехара с соавторами. Длина цепи увеличивается при проведении синтеза в 0.1 н растворе NaCl, более концентрированнный раствор подавляет синтез (0,4 М). Синтез полив имеет очень низкий выход, добавление других нуклеотидов увеличивает процент выхода продукта, при этом синтезируется гетерогенный полинуклеотид ( Ikehara et al., 1989).Нами выбыла синтезирована полинуклеотидная цепь poliAoxoG с соотношением включившихся нуклеотидов A:oxoG 2:1 и 3:1 , выход продукта составил 10% , и полинуклеотид poliOxoG с выходом 6%. Длина поли нуклеотидных цепей определенная колоночной хроматографией и электрофорезом в полиакриламидном геле составила около 30-100 нуклеотидных звеньев. В перспективе данные полинуклеотиды можно использовать как матрицу в системе синтеза белка. Представляет интерес исследование свойств синтезированных полинуклеотидов, кроме того известно, что некоторые гибридные дуплексы полинуклеотидных цепей с модифицированными основаниями могут вызывать индукцию синтеза интерферона (Folayan, 1981).

Выводы:

1. В системе синтеза олигонуклеотидов РНК-полимеразой Escherichia coli на промоторе AI ДНК фага T7iDlll при ограниченном наборе субстратов 8-oxo-GTP конкурирует с АТР и UTP, сотношение равновесных констант диссоциации 2, 1 и 21, 6 при значении константы для АТР 0,3 мМ и для UTP 0,03 мМ. Обнаружено, что 8-oxoGTP проявляет неоднозначные субстратно-кодовые свойства: 8-oxoGTP способен замещать итр и GTP при синтезе тетра- и пентануклеотида на промоторе AI, но не включается в продукт вместо АТР. При синтезе на Д-промоторе замена GTP на 8-oxo-GTP не приводит к инициации синтеза, что говорит о неспособности 8-oxoGTP быть инициаторным нуклеотидом.

2. 8-BrGTP в системе синтеза олигонуклеотидов РНК-полимеразой Escherichia, coli на промоторе AI ДНК фага T7ADlll при ограниченном наборе субстратов взаимодействует с центром связывания АТР с

отношением равновесных констант диссоциации 2. 4, не включаясь в продукт. 8-BrGTP не взаимодействует с центром связывания UTP. При синтезе на промоторе AI 8-BrGTP включается вместо GTP, приводя к терминации синтеза, но неспособен быть инициаторным нуклеотидом вместо GTP на слабом Д-промоторе.

3. Методом дифференциальной УФ спектроскопии исследовано образование 8-оксигуаниловых производных при г-облучении растворов нуклео-зидов и нуклеотидов ( Guo, dGuo, GMP, dGMP, GDP u GTP). Радиацион-но - химический выход составляет от О.2 до 0.4 молекул на 100 эВ.

4. При облучении нуклеозидов в Н20 и в D^O обнаружено, что кехакиз мы формирования 8-оксигуанина под действием у-облучения и тепла отличаются друг от друга. Произведена сравнительная оценка уровня теплового и радиационного повреждения нуклеотидов. При 37° уровень повреждений клеточного нуклеотидного фонда dGTP, индуцированных природным радиационным фоном, составляет приблизительно О, 27. от теплового, а при температуре 4°С (к=5, 7*10 2 с ) « 20%. Полученные результаты позволяют предположить, что радиационно-генетическое действие ионизирующей радиации осуществляется частично через клеточный нуклеотидный фонд dGTP.

5. При воздействии ^-радиации на мочевую кислоту и гуанозин наблюдается медленное пострадиационное разрушение хромофорных групп. Мочевая кислота ö в 3 раза менее устойчива к действию радиации по сравнению с гуанозином.

6. С помощью полинуклеотидфосфорилазы синтезирован полииуклеотид polyAoxoG с соотношением нуклеотидов A:oxoG 2:1 и 3:1 и длиной цепи 30-100 звеньев и полинуклеотид polyoxoG с длиной цепи 30-70 нуклеотидов.

Полученные результаты были опубликованы в центральной печати :

1. Брусков В. И., Курявый В. В., Усачева A.M. - ДАН , 1989, T.307.N 16 с. 243-246.

2. Курявый В. В., Усачева A.M., Брусков В. И.- Молекуляр. биология 1989, Т. 23, ВЫП. 3, с. 7822-829.

3.Усачева A.M., Черников A.B., Брусков В. И.- Молекуляр. биология 1995, т. 29, ВЫП. 2, с. 446-451.

4. Черников А. В, Усачева A.M., Брусков В. И. - Биохимия , в печати.

5. Usacheva A., Bruskov V., 25-th Annual Meeting of the Europ.Soc. for Rad,Biol., June 10-14, 1993, Abstracts.