Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль мембранных сигнальных систем в пролиферативном действии эстрадиола, эстрадиол-модифицированных и немодифицированных олигодезоксинуклеотидов

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль мембранных сигнальных систем в пролиферативном действии эстрадиола, эстрадиол-модифицированных и немодифицированных олигодезоксинуклеотидов"

На правах рукописи УДК 577.152.3; 577.171.6

ЛЕВАШОВА Зоя Борисовна

РОЛЬ МЕМБРАННЫХ СИГНАЛЬНЫХ СИСТЕМ В ПРОЛИФЕРАТИВНОМ ДЕЙСТВИИ ЭСТРАДИОЛА, ЭСТРАДИОЛ-МОДИФИЦИРОВАННЫХ И НЕМОДИФИЦИРОВАННЫХОЛИГОДЕЗОКСИНУКЛЕОТИДОВ клеточная биология - 03.00.25

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

I

Новосибирск -1998

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Научный руководитель: доктор биологических наук,

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация

| Морозова Т. М.|

с.н.с., кандидат биологических наук Меркулова Т. И.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск доктор биологических наук, Каракин Е. И.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск; кандидат биологических наук, Якубов Л. А.

Институт биоорганической химии СО РАН, г. Новосибирск

Государственный Научный Центр Вирусологии и Биотехнологии "Вектор", НИИ молекулярной биологии.

Защита состоится ' " С<"у!<" -f F1998 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.11.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, Новосибирск , просп. академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат разослан ". /V4.

Л < <'t—1998 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета __

доктор биологических наук У А.Д. Груздев

Актуальность проблемы. Выяснение молекулярных механизмов регуляции пролиферации клеток является одной из основных задач современной биологии, которая имеет не только теоретическое, но и практическое значение: исследования в этой области открывают возможности для создания средств подавления злокачественного роста, также как и средств стимуляции регенерации тканей. Пролифера-тивное действие ряда гормонов и других внеклеточных сигналов (включая факторы роста, цитокины, интерлейкины, антигены и т.д.) обеспечивается их взаимодействием со специфическими рецепторными белками, находящимися на поверхности плазматических мембран клеток-мишеней. Эти рецепторы имеют по крайней мере две функции - связывание агониста с высокой аффинностью и инициацию процесса проведения сигнала путем образования вторичных посредников внутри клеток: сАМР, Са2\ диацилглицерина и др. Активирующиеся вследствие этого различные протеинкиназы служат передаточным звеном между образованием вторичных посредников и активацией синтеза ДНК, распространяя таким образом сигнал от внешней мембраны до клеточного ядра. Наличие каталитических каскадов внутриклеточных посредников позволяет многократно усиливать внеклеточный сигнал, так что определенный клеточный ответ достигается при действии наномолярных (и менее) концентраций сигнальных веществ.

В свете вышесказанного большой интерес представляет изучение механизма пролиферативного действия стероидного гормона эстрадиола на клетки-мишени, имеющее как теоретическое, так и практическое значение в силу существования большого числа видов злокачественных новообразований, рост которых регулируется эстрадиолом. Открытие субпопуляции мембранных рецепторов эстрадиола (помимо "классических" цитозольных, выступающих в комплексе с гормоном как транскрипционный фактор) явилось новым этапом в понимании механизма его воздействия на клетки, однако данных о том, насколько "негеномные'эффекгы эстрадиола вовлечены в общий пролиферативный ответ клетки на гормон, довольно мало.

Механизм действия олигонуклеотидов (ОМ) на клетки также представляет большой интерес, во-первых, в связи с интенсивным развитием антисенсовой технологии (разрабатываемой с целью подавления роста опухолей и размножения вирусов путем избирательного ингибирования определенных генов), а во-вторых, в связи с открытием предполагаемых рецепторов для ОЫ на поверхности многих типов клеток. Известно также, что олигонуклеотиды присутствуют в крови и межкле-

точной жидкости организма в норме и при различных патологиях, в связи с чем ряд исследователей предполагает возможность существования у ОЫ неких сигнальных функций, подобных регуляторным функциям нуклеотидов, действующих через пу-ринэргические рецепторы.

Мы предположили также, что использование в "антисенс"-экспериментах олигонуклеотидов, ковалентно присоединенных к эстрадиолу, решило бы проблемы нуклеазной устойчивости ОМ, адресности его доставки в клетки, имеющие рецепторы к эстрадиолу, и, вследствие этого, привело бы к понижению эффективной концентрации ОИ и, значит, к понижению его токсичности на организм в целом. Привлекательность данного подхода послужила дополнительным стимулом для изучения механизмов действия обоих составляющих конъюгата гормон-олигонукпеотид, поскольку знание этих механизмов является необходимым для адекватного проведения подобного рода экспериментов.

Целью исследования было: 1) изучение связи между мембранными, "негеномными", эффектами эстрадиола и событиями, обеспечивающими пролиферативный ответ клетки; 2) изучение механизма влияния олигонуклеотидов на клетки. Конкретные задачи работы включали: 1) изучение влияния эстрадиола на метаболизм сигнальных фосфолипидов, на экспрессию протоонкогена с^оэ и на быструю, не зависимую от синтеза белка, активацию казеинкиназы II - одного из ключевых ферментов-регулятороз клеточной пролиферации; 2) определение роли С-киназной сигнальной системы в экспрессии протоонкогена с-йээ, в активации казеинкиназы II и стимулируемой эстрадиолом пролиферации; 3) изучение эффектов, оказываемых низкими концентрациями конъюгатов эстроген-олигонуклеотид и не-модифицированных олигонуклеотидов, на клетки; 4) определение роли С-киназной сигнальной системы в обеспечении эффектов ОМ на клетки.

Работа проводилась на эстрогенчувствительных тканях (почках молодых самок крыс и опухолях молочных желёз крыс линии Спрэг-Доули) и линиях клеток МСР-7 и 1929.

Научная новизна работы. В данной работе впервые показано, что уже через 1530 минут после введения животным эстрадиола происходит двух-трехкратное увеличение с ядрах клеток-мишеней активности казеинкиназы II, связанного с пролиферацией фермента. Одновременное введение аминазина, ингибитора протеинки-назы С, предотвращает стимулирующий эффект эстрадиола на активность казеинкиназы II.

Для подтверждения участия С-киназного сигнального каскада в пролифера-тивном действии эстрадиола на клетки-мишени были изучены изменения метаболизма сигнальных липидов в мембране клеток в ответ на введение гормона. Было обнаружено накопление меченой фосфатидовой кислоты, что свидетельствует об активации эстрадиолом мембранных фосфолипаз - сопряженных с С-белками ферментов, продуцирующих сигнальные соединения в клетке в. ответ на внеклеточный стимул. Кроме того, истощение клеток культуры по протеинкиназе С длительной предобработкой форболовым эфиром приводило к отмене пролифера-тивного действия эстрадиола, а также к отмене стимулируемой эстрадиолом экспрессии протоонкогена с^ог, продукт которого является компонентом известного фактора транскрипции АР-1.

Впервые показано также, что олигонуклеотиды в очень низкой концентрации, близкой к физиологической концентрации гормонов, сиквенснезависимым образом вызывают быстрый подъем общего уровня синтеза РНК и увеличение синтеза ДНК в обеих протестированных линиях клеток. Причем конъюгаты, гормонов с олиго-нуклеотидами стимулировали синтез ДНК в меньшей степени, нежели гормоны или ОЫ в отдельности.

Установлено, что стимулирующее действие олигонуклеотидов на клетки не обусловлено продуктами их деградации - мононуклеотидами, способными, как известно, взаимодействовать с пуринэргическими рецепторами, обнаруженными на поверхности многих типов клеток, и оказывать целый ряд эффектов, в том числе и митогенный.

Впервые показано, что низкие концентрации ОМ могут инициировать проли-феративные процессы в клетке, по-видимому, путем рецептор-опосредованной активации мембранных сигальных систем, поскольку в опытах по изучению влияния олигонуклеотидов на метаболизм сигнальных липидов имело место очень быстрое (через 30-40 секунд) увеличение мечения фосфатидовой кислоты, а также образование диацилглицерина, активатора РКС. Кроме того, истощение клеток по протеинкиназе С предобработкой форболовым эфиром приводило к отмене стимулирующего влияния олигонуклеотидов на синтез ДНК.

Теоретическая и практическая ценность работы. Полученные в работе данные развивают представление о механизме действия эстрадиола на клетки-мишени при стимуляции их пролиферации - не только через цитозольные рецепторы, способные в комплексе с гормоном выступать как транскрипционные факторы, но и через

активацию мембранных сигнальных систем систем, в частности, как нами показано - через активацию фосфолипаззависимого сигнального пути, сопровождающегося усилением метаболизма фосфатидовой кислоты и РКС-зависимыми процессами стимуляции экспрессии протоонкогена c-fos и активации казеинкиназы II.

Принципиально важными являются также данные о том, что олигонуклеоти-ды сиквенснезависимым образом способны стимулировать синтез РНК и ДНК в клетках, очевидно, также путем активации одной из фосфолипазэависимых мембранных сигнальных систем. Вследствие этого использование в антисенсовой технологии даже сравнительно низких концентраций олигонуклеотидов (на порядки меньших, чем используемые обычно в гемотерапии) не позволит избежать целого ряда побочных, "неантисенсовых", эффектов на клетки. С другой стороны, использование олигонуклеотидов, присоединенных к гормону, возможно, является перспективным, так как, будучи в составе конъюгата, как тот, так и другой, по-видимому, не способны в полной мере реализовать свое пролиферативное действие на клетки.

Публикации и апробация работы. Основные результаты диссертации опубликованы в 4 печатных работах. Результаты работы были представлены на V-ом Всесоюзном биохимическом съезде (1986, Киев), на франко-российском симпозиуме "Регуляция экспрессии генов" (1995, Новосибирск), на ll-ом биохимическом съезде РАН (1997, Пущино).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 97 страницах, содержит 26 рисунков и 6 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, материалов, методов, результатов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, содержащего 314 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Ранние эффекты эстрадиола в клетках эстрогенчувствительной линии MCF-7.

Обнаружение мест специфического связывания эстрадиола на плазматических мембранах клеток-мишеней в ранних работах нашей группы дало основания полагать, что следствием этого факта может быть быстрая активация систем вторичных посредников, что впоследствии также удалось продемонстрировать в экспериментах in vivo, в частности, для систем активации С- и А-киназ. Однако, при проведении экспериментов в условиях in vivo нельзя исключить опосредованного влияния эстрадиола на сигнальные системы клеток, а именно - через стимуляцию

2001

5100О

секреции ростовых факторов, которые, взаимодействуя со своими рецепторами на мембранах клеток ОМЖ, активируют протеинкиназные сигнальные каскады. Для получения прямых доказательств непосредственного участия эстрадиола в активации С-киназного сигнального каскада, приводящей к развертыванию пролифера-тивных событий в клетке, были выполнены эксперименты в условиях in vitro.

а На эстрогенчувствительной линии клеток

MCF-7 мы показали, что зстрадиол вызывает быстрое (-30 мин) и кратковременное увеличение общего уровня транскрипции в сравнении с нестимулированными клетками (рис.1), связанное, по-видимому, с увеличением экспрессии генов, ответственных за инициацию процессов, индуцируемых эстрадиолом.

В результате экспериментов по блот-гибридизации 32Р-меченого зонда c-fos (одного из генов раннего ответа, продукт которого является одним из компонентов транскрипционного фактора АР-1) с цитозольной РНК клеток MCF-7 обнаружено, что в этих клетках эстрадиол вызывает зависимое от времени увеличение содержания мРНК c-fos (рис.2). Сопоставление количеств анализируемой РНК в разных образцах проводили исходя из гибридизационного сигнала зонда 36В4, уровень мРНК которого не регулируется эстрадиолом и может быть использован в качестве контрольного. Можно видеть, что максимальное содержание мРНК c-fos примерно совпадает по времени с пиком увеличения общего уровня транскрипции в клетках.

я 0 30 60 90 120 150 время, мин

Рис. 1. Увеличение уровня транскрипции в клетках MCF-7 под действием 17-j} эстрадиола (10'sМ;30 мин. "run-on "реакции).

C-fos 36В4 ; ^ .

время 0' 10' 30' 60' 90' 150'

Рис.2 Влияние 17¡¡-эстрадиола (Iff8 М) на содержание мРНК гена c-fos в клетках MCF-7

Известно, что эстроген-рецепторный комплекс (Е1Ч) является транскрипционным фактором для гормончувствительных генов. Поскольку взаимодействие ЕЯ с соответствующими сайтами в промоторах чувствительных генов не требует синтеза белка, то быстрая стимуляция синтеза РНК вполне может быть объяснима с точки зрения классической теории. Однако, имеющиеся в литературе данные дают основания полагать, что митогенный эффект эстрадиола на клетки-мишени реализуется не только благодаря образованию эстроген-рецепторного комплекса, выступающего как транскрипционный фактор, но и в результате активации мембранных сигнальных путей, вследствие чего активируются клеточные протеинкиназные каскады.

Для проверки гипотезы о возможной роли протеинкиназы С в экспрессии протоонкогена с^оэ, индуцируемой эстрадиолом, мы провели истощение клеток по протеинкиназе С путем длительной предварительной обработки клеток форболо-вым эфиром ТРА. При этом происходило значительное снижение экспрессии гена Ыоз в клетках - как стимулированных эстрадиолом или эмбриональной сывороткой, так и а контрольных, не обработанных активаторами (рис.3).

Однако, если при стимуляции эстрадиолом предобработка ТРА приводит не только к снижению экспрессии гена с-Тоэ, но также к отмене пролиферативного действия эстрадиола на клетки, то стимулирующее влияние сыворотки сохраняется, видимо, вследствие присутствия в эмбриональной сыворотке большого числа ростовых факторов, использующих различные сигнальные пути (рис.4).

Кроме того, мы показали, что стимуляция эстрадиолом клеток, прединкуби-рованных с меченым ортофосфатом, вызывает накопление меченой фосфатидо-вой кислоты, в отличие от нестимулированных кпеток(рис.5). Усиление оборота фосфатидовой кислоты является ярким свидетельством в пользу того, что эстра-диол активирует фосфолипаззависимую сигнальную систему, что, в свою очередь,

-ТРА

+ТРА

12 3 4 5 6

Рис.3 Влияние предобработки форболовым эфиром (17.5 ч.) на содержание мРНК с-йю в клетках МСР-7. 1,4 - без активаторов; 2,5 - 17р-эстрадиол (10-8 М, 45мин.); 3,6 - эмбриональная сыворотка (10%, 45мин.).

Рис. 4 Влияние предобработки форболовьш эфиром (20нг/мл, 24ч) на пролиферацию клеток MCF-7, стимулируемую 17-ßэстрадиолом (Ш8М, 23ч) и эмбриональной сывороткой. (10%, 23ч.) (п=4)

инициирует митотические события в < рд

клетке (в частности, благодаря экспрессии протоонкогена с^ов).

Таким образом, в клетках МСЯ-7 эстрадиол усиливает метаболизм сигнальных фосфолипидов, вызывает , *

быстрое увеличение общей генной экспрессии и гена в частности. Даун-регуляция протеинкиназы С приводит к значительному снижению с Ег

Рис.5 Стимуляция эстрадиолом на-уровня мРНК с-Л«, а также к полной КОПления фосфатидовой кислоты в

отмене пролиферативного действия клетках МСГ-7.

эстрадиола на клетки. РА ■ фосфатидовая кислота (стрелкой указа-

но положение маркера РА), С - без активаторов, Ег -Пр-эстрадиол (1СГМ, 1ч)

2. Влияние эстрадиола на активность казеинкиназы II в органах-мишенях экспериментальных животных.

Одним из необходимых событий при запуске процессов клеточной пролиферации различными митогенными стимулами является активация казеинкиназы II.

Участие казеинкиназы II в индуцируемой эстрадиолом пролиферации клеток тканей - мишеней было исследовано в двух сериях экспериментов:

1) на эстрадиолзависимых опухолях молочных желез крыс линии Спрэг-Доули;

2) на почках 20-25-дневных самок крыс линии Вистар, также являющихся эстра-диолзависимыми.

Мы показали, что как в ОМЖ, так и в почках молодых животных содержится протеинкиназа, обладающая всеми свойствами, характерными для казеинкиназы II: предпочтительное использование кислых белков в качестве экзогенных субстратов фосфорилирования (казеин), способность активироваться физиологическими концентрациями полиаминов (2 мМ спермин) и ингибироваться низкими концентрациями гепарина (1-10 мкг/мл), использование как АТР, так и GTP в качестве донора фосфатов, элюирование с ДЭАЭ-целлкжозы и гепарин-сефарозы при определенных концентрациях NaCI (рис.6 и рис.7), а также определенный субъединичный со-став£оответствующий описанному в литературе (40-46 кДа и 25-27 кДа) (рис.8).

Однократное введение эстрадиола животным уже через 15-30 минут вызывало двух- трехкратное увеличение активности CKII - как в экстрактах ядер ткани почки, так и в ядерных экстрактах опухолевых клеток. Результаты двух типичных экспериментов приведены в табл.1.

Имеющиеся в литературе данные позволяют предположить, что регуляция СКИ осуществляется путем фосфорилирования-дефосфоришрования при участии С- киназной сигнальной системы. Как видно на рис.9, одновременная с эстрадиолом инъекция 21 -дневным крысам (2,5 мкг/г веса тела) аминазина, ингибитора

Рис.6 Хроматография казеинкиназы II цитозоля (А) и клеточных ядер (Б) на ДЭАЭ - целлюлозе.

° - без активаторов, »- в присутствии 2тМ спермина.

Рис. 7 Хроматография казеинкиназы II на гепарин-сефарозе (в присутствии 2мМ спермина в реакционной смеси)

«7» ШЦ.

25 V

17,8»

12,4 > «МК

Рис.8 Электрофореграмма препарата казеинкиназы II, очищенной на гепарин-сефарозе (20-24 фракции пикапа рис.7).

Влияние эстрадиола на активность казеинкиназы II в

экстрактах ядер клеток ОМЖ. Таблица 1

Условия опыта Перенос 32Р с GTP на казеин, нмоль/шшна 1мг белка

контроль эстрадиол (i 5мин) контроль эстрадиол(ЗОмин)

Без активаторов 2,0±0,1 6,8±0,1 3,9ifl,3 7,9±0,4

Спермин, 2,7 мМ 4,1±0,4 13,4±0,6 5,3±0.1 12,7+0,5

* • отличие от контроля достоверно (р>0,99: п=4)

Рис.9 Ингибирование аминазином стимулирующего действия 17-р- эстрадиола на активность казеинкиназы IIядерного экстракта почек крыс.

О- без активаторов; И - в присутствии 2,7мИ спермина; С •контрольные животные; А - аминазин (2,5мкг/г веса тела, 30мин); Е2 - 17/3-эстрадиол (5х10'9М,30мин); А+Ег- аминазин + 17'[}-эстрадиол. *- отличие от вариантов "А" и "А+Е2" достоверно (р>0.99, п=4)

протеинкиназы С, приводила к отмене стимулирующего действия эстрадиола на казеинкиназу II в ядерной фракции из почек.

Таким образом, при стимуляции пролиферации клеток-мишеней эстрадио-лом происходит быстрая активация казеинкиназы II, опосредованная, по-видимому, действием медиаторов, образующихся в одной из фосфолипаззависимых сигнальных систем, сопряженных с мембранными рецепторами эстрадиола. При этом активация СКП обеспечивает проведение сигнала от мембраны до ядерных компарт-ментов, где, фосфорилируя белки-субстраты, связанные с пролиферативными процессами, реализует митогенное действие эстрадиола.

16

12

3. Влияние олигонуклеотидов на клетки культур МСР-7 и 1-929.

3.1. Влияние олигонуклеотидов на пролиферативные процессы в клетках.

Поскольку становится все более очевидным, что действие олигонуклеотида не ограничивается его взаимодействием с комплементарными участками нуклеиновых кислот, а распространяется на многие клеточные мишени, то, определяя биологическую активность эстрогенов в составе конъюгатов (и, значит, сохранение их способности взаимодействовать с рецепторами клеток-мишеней), мы исследовали также вклад самих олигонуклеотидов в пролифе-

^ "(3.

Рис. 10 Влияние олигонуклеотидов ративное действие конъюгата на клетки, и их конъюгатов с эстрогенами на 6езотносительно к их антИсенсовым функ-синтез ДНК в заторможенных

циям. С этой целью были использованы

клетках МСР-7 (24часа инкубации).

С - контроль; Е1- 10е М эстрон; Е2 • 10*М ¡7-рэстрадиол;

• 108 М рСрАрврСр- эстрон; Е^рЫ, - 10е МрСрАрСрСр - эстрадиол; рЫ4- Ю* МрСрАрврС. • - отличие от контроля достоверно, р>0.99 (п=3)

фосфодиэфирные олигодезоксинуклеотиды со случайной последовательностью и, кроме того, не содержащие тимидин во избежание искажения результатов в экспериментах с включением [3Н] -тимидина. Как видно на рис.10, модифицированные эстрон и эстрадиол производят несколько меньший по сравнению с немодифицированными гормонами пролифе-ративный эффект на заторможенные клетки. Сам же олигонуклеотид вызывал сти-

муляцию синтеза ДНК в той же степени, что и эстрогены, причем использовался он в такой же концентрации-10"8М -близкой к физиологической концентрации эстра-диола. При совместном добавлении эстрадиола и немодифицированного олиго-нуклеотида имел место слабо выраженный аддитивный эффект, из чего можно заключить, что стимуляция деления клеток гормонами и олигонуклеотидами осуществляется благодаря различным механизмам.

Для того чтобы определить механизм этого влияния олигонуклеотида на клетки, была проведена серия экспериментов. Известно, в частности, что олиго-нуклеотиды, подвергаясь гидролизу нуклеазами, могут служить источником моно-нуклеотидов, которые, взаимодействуя с пуринэргическими рецепторами на поверхности многих типов клеток, способны оказывать на них митогенный эффект. Эксперименты по изучению скорости деградации незащищенных олигонуклеотидов в среде показали, что через 24 часа олигонуклеотид полностью деградирует, однако в течение первых 4-х часов большая часть радиоактивного материала представлена недеградированной формой ОМ.

И хотя, как видно на рис.11, нуклеозидмонофосфаты действительно способны стимулировать синтез ДНК, данный их эффект проявляется лишь в концентрации 10'5М, но не ниже. Влияние олигонуклеотида на синтез ДНК имело дозозави-симый характер, однако, в отличие от ЫМР, максимальный эффект достигался в интервале 0,2-1,0хЮ'7М (рис.12).

Рис. 11 Влияние нуклеозидмонофосфатов на синтез ДНК в клетках MCF-7. А - Одновременное внесение иононуклеотидов и [3Н] тимидина; Б - Внесение иононуклеотидов за 24 часа до добавления [3Н] тшпадинз; ♦ - CMP, A -GMP, ■ - AMP; (п=3).

<Ь 16

10-8 10 -7 10 -в 10 -6

концентрация, М

Рис. 12 Дозозависимый эффект олиго- и мононуклеотида на синтез ДНК в клетках MCF-7 (п=3). °-dGMP, • - d(pN)t-дезокси -pCpApGpC.

2 20

10

10 20 40 80

Время после внесения олигонуклеотида, мин.

Рис. 13 Зависимость уровня синтеза РНК в клетках MCF-7 от времени воздействия олигонуклеоти-дом d(pN)s (дезокси-рТТСССАТТ). (10" М, 25мин. "run-on"-реакции).

Стимуляция синтеза ДНК каким-либо пролиферативным агентом подразуме- • вает также стимуляцию синтеза РНК в клетках. Как видно на рис.13, ОЫ вызывал быструю стимуляцию синтеза РНК с максимумом через 20-40 минут после добавления ОМ к заторможенным клеткам, то есть задолго до его сколь-нибудь значимой деградации. Этот эффект не зависел от длины и последовательности олигонуклеотида. с1АМР и сГГМР в концентрации 10'5М оказывали такой же эффект на уровень синтеза РНК, что и с1(рГ^)8 в концентрации 10"7М.

Таким образом, стимуляция синтеза ДНК низкими концентрациями ОМ явно не обусловлена возможными продуктами его деградации - мононукпеотидами - хотя при более высоких концентрациях ОМ вклад ЫМР в пролиферативный процесс может быть весьма ощутимым.

Для ответа на вопрос, насколько распространено это явление и свойственно ли оно лишь клеткам МСЯ-7, нами была протестирована линия клеток мышиных фибробластов 1.929. На рис.14 показано, что и в этих клетках олиго-нукпеотиды разной длины и состава вызывали увеличение включения

[ Н]тимидина в кислотонерастворимую фракцию. Мононуклеотиды, взятые в этой же концентрации, на синтез ДНК не влияли, а динукпеотид рйрЭ имел слабый эффект.

з||11

•о -та ^

Рис. 14 Стимуляция синтеза ДНК различными моно- и олигонуклеотидами в клетках Ь929. (Ю^М, 2часа) СМР-дезоксицитозинмонофосфат; АМР-дезоксиаденозинмонофосфат; ОМР-дезоксигуанозинмонофосфат; <1(рв)2-дезокси рврв; с1(рЫ)6-дезоксирСрврТрГрТрС: с1(рИ)г дезокси рТрТрСрСрСрАрТрТ;с1(рЫ)¡0- дезокси (рА)в(рв)2. Достоверность отличия от контроля: » - р>0.95; *» - р>0.99 (п=4).

Рис. 15 Стимуляция роста клеток Ь929 олигонуклеотидом с!(ъИ) 16 А - зависимость от концентрации Л(рЪ!)16 (24 часа инкубации с (¡(рЫ)и) Б - зависимость от времени инкубации с ¿(рИ)и (2,5x10'* М).

определению флуоресценции комплекса ДНК с флуоресцентным красителем Н33258, зависело от времени воздействия и концентрации олигонуклеотида (рис.15), причем максимально эффективная концентрация ( 0.2-1 х10'7М) совпадала с таковой для клеток МСР-7 (рис.15А и рис.12).

Таким образом, в обеих линиях протестированных клеток олигонуклеотиды независимо от длины и состава вызывают стимуляцию синтеза ДНК. При этом максимально эффективная концентрация ОМ в обоих случаях составляет

10-8 ю-7 10-е о

концентрация, М

10 20 30 время, ч

Количество синтезированной ДНК, определенное независимым методом по

. 0.2-И .0x10"7М, что по крайней мере на два порядка ниже эффективной концентрации нукпеозидмонофосфатов. На клетках МСР-7 показано также, что олигонуклео-тиды вызывают быстрое увеличение синтеза РНК, необходимое, очевидно, для развертывания пролиферативных процессов в клетках. Поскольку имеет место аддитивный эффект в действии ОЫ и гормона, то, скорее всего, пролиферативное действие гормона и олигонуклеотида обеспечивается разными механизмами.

Причем, так как их конъюгаты гораздо менее эффективны в стимуляции синтеза ДНК, можно заключить, что модификация одного соединения путем ковалент-ного присоединения другого, по-видимому, мешает полной реализации как того, так и другого механизмов.

3.2. Влияние олигонуклеотидов на мембранные сигнальные системы.

Поскольку многие митогены и ростовые факторы реализуют свое действие через активацию фосфолилидзависимой протеинкиназы С, и, кроме того, целым рядом авторов описаны рецепторы для ОМ на поверхности многих типов клеток (и, в частности, клеток 1929), но не показана связь этих рецепторов с мембранными сигнальными системами, представляло интерес изучить, вовлечена ли система активации протеинкиназы С в стимулирующее действие олигонуклеотидов на клетки.

Истощение клеток по про-теинкиназе С предобработкой фор-боловым эфиром в течение 24 часов приводило к отмене стимулирующего эффекта олигонуклеотидов на синтез ДНК в клетках -1929 (рис.16), из чего следует, что стимуляция пролиферации олигонуклео-тидами - зависимый от РК С процесс.

Были проведены эксперименты с целью изучения метаболизма сигнальных липидов, связанных с активацией С-киназной сигнальной системы. Добавление олигонуклеотидов как к клеткам МСР-7, так и к 1929, вызывало быстрое увеличение

Рис. 16 Отмена стимулирующего действия с!(рЫ)16 (22ч) на клетки ¿929 в результате предобработки ТРА. ° - без предобработки А - с предобработкой ТРА, (20нг/мл, 24ч).

мечения фосфатидовой кислоты (рис.17), способной как служить источником диа-цилглицерина, активатора РКС, так и непосредственно выполнять медиаторные функции. Поскольку изменения в мечении фосфатидовой кислоты наступают уже через 30-40 секунд, можно предположить, что вызываемые добавлением оли-гонукпеотида изменения в метаболизме РА не связаны с его проникновением внутрь, а, по-видимому, являются результатом взаимодействия ОЫ с поверхностью клеток.

РА >

РА >

л

(Ж время

, 'Э

^у * V * * ^

О Ф *

! *

. + . + . + . + ом -+-.+.- + - +

30" 5'20" б'ЗО" 8'30" время 40" Г05" 2'30" 4'30'

Рис. 17 Кинетика [ Р] мечения фосфолипидов в клетках МСР-7 (А) и Ь929 (Б) в присутствии 10М 4(рТ)ю - (А), 10* м <1(рП)ц ■ (Б) и в отсутствие олигонуклеоти-

да. РА - фосфатидавая кислота.

10-« 10-1 10-6 концентрация й(рК)]

Кроме того, обработка олигонуклео-тидом в течение 2 часов клеток 1929, предмеченных [14С]-ацетатом, приводила к образованию диацилглицерина, активатора РКС. Принципиально важно; что максимально эффективная концентрация ОЫ при этом составляла 25 нМ, что близко к оптимальной концентрации ОЫ в опытах со стимуляцией пролиферации (рис. 18).

Таким образом, мы показали, что

Рис. 18 Влияние различных концент- олигонуклеотиды, добавленные к клеткам

раций олигонуклеотида на содержание [14С]00 в клетках 1.929.

культуры, реализуют свое действие через активацию протеинкиназы С, скорее всего, путем индукции быстрых изменений в липидном составе клеточных мембран с по-

1!

следующей активацией протеинкиназы С и развертыванием пролиферативных процессов в клетке.

Становится все более очевидным, что множество самых различных аго-нистов реализуют свое действие путем активации сравнительно небольшого числа мембранных систем проведения сигнала. Поэтому неудивительно, что система активации протеинкиназы С оказалась вовлечена в действие таких разных соединений как эстрогены и олигонуклеотиды. Имея, однако, разные рецепторы, эти соединения, скорее всего, отличаются также и по набору активируемых фосфолипаз, изоформ PK С и т.д. Поскольку в наших экспериментах конъюгат эстрадиол-олигонуклеотид обладал значительно меньшим пролиферативным действием на клетки по сравнению с немодифицированным гормоном или олигонуклеотидом, возможно, в силу снижения доли мембранных эффектов с каждого типа рецепторов из-за модификации лиганда, то, возможно, применение подобных соединений в антисенсовой технологии окажется перспективным.

ВЫВОДЫ.

1. В эстрогензависимой линии клеток MCF-7 эстрадиол индуцирует накопление меченой фосфатидовой кислоты, одного из медиаторных соединений клетки, вызывает быстрое и кратковременное увеличение общего уровня транскрипции, а также зависимое от времени увеличение содержания мРНК одного из генов раннего ответа - протоонкогена c-fos. Истощение клеток по протеинкиназе С приводит к снижению экспрессии гена c-fos и к отмене пролиферативного действия на клетки эстрадиола.

2. В эстрадиолзависимых опухолях молочных желез крыс и в почках молодых животных обнаружена и охарактеризована полиаминзависимая протеинкиназа (казеинкиназа II), активность которой быстро стимулируется эстрадиолом. Введение аминазина, ингибитора протеинкиназы С, приводит к отмене стимулирующего действия эстрадиола на казеинкиназу II.

3. Олигодезоксинуклеотиды (4-16-меры) способны стимулировать синтез ДНК в клетках MCF-7 и L929. Стимуляция синтеза ДНК олигонуклеотидом имеет дозозависимый характер, с оптимумом концентрации 0,2-1,0 х 10"7 М. Олигодезоксинуклеотиды независимо от длины и состава вызывают быструю стимуляцию синтеза РНК в клетках MCF-7 с максимумом через 20-40 мин после введения. Нуклео-

зидмонофосфаты, возможные продукты деградации олигонуклеотида, эффективны в стимуляции синтеза ДНК и РНК лишь в концентрации 10'5 М.

4. Истощение клеток по протеинкиназе С приводит к отмене стимулирующего эффекта олигонуклеотида на синтез ДНК. Добавление олигонуклеотидов к клеткам вызывает быстрое увеличение мечения фосфатидовой кислоты и образование диацилглицерина, активатора протеинкиназы С.

5. Эстрогены, ковалентно присоединенные к 3'-концу фосфодиэфирных оли-годезоксинуклеотидов, способны стимулировать синтез ДНК в клетках MCF-7, однако, в меньшей степени, чем немодифицированные гормоны или олигонуклеотиды.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Морозова Т.М., Митина Р.Л., Нагибнева И.Н., Ожогина З.Б. (Левашова), Сидоркина О.М. Биохимические механизмы стимулирующего действия эстрадиола на рост гормонзаеи-симых опухолей.//Тезисы докладов V Всесоюзного биохимического съезда, Киев, - М. :Наука, 1986, т.2, с.109

2. Левашова З.Б., Морозова Т.М. Влияние эстрадиола на активность лолиаминзави-симой протеинкиназы в тканях почки и гормонзависимых опухолях молочных желез.// Биохимия, 1988, т.53, No 2, с.214-218

3. Морозова Т.М., Левашова З.Б., Нагибнева И.Н., Pay В.А, Сидоркина О.М. Механизмы действия эстрадиола как фактора роста нормальных и трансформированных тканей-мишеней. // Цитология, 1989, т. 31, No 9, с. 1115

4. Морозова Т.М., Левашова З.Б., Нагибнева И.Н., Pay В.А, Сидоркина О.М. Участие трансмембранных систем посредников в действии стероидных гормонов на клетки-мишени. // Физиологический журнал им. И.М.Сеченова, 1990, т.76, No 9, с.1179-1186

5. Balakireva L.A, Levashova Z.B., Vlassov V.V. Diacylglycerol level, phosphatidate turnover and protein kinase С activity in membranes of oligodeoxynucleotide-treated L929 fibroblasts. // French-Russian Symposium on Regulation of Gene Expression, Novosibirsk, Russia, 1995, p.4

6. Balakireva L.A, Levashova Z.B., Chroboczek J., Vlassov V.V. Rapid sequence-independent cellular response to oligonucleotides. //FEBS Lett., 1997, v.400, No 1, p.267-270

7. Левашова З.Б., Балакирева Л.А Роль Саг*-фосфолипидзависимой протеинкиназы С в несиквенсслецифических эффектах олигонуклеотидов на клетки культуры. II Тезисы стендовых сообщений II биохимического съезда РАН, Пущино, 1997, 4.1, с.273

Подписано к печати 16.01.98

Формат бумаги 60x901/16. Печ. л.1. Уч.-изд. л. 0,7

Тираж 100 экз. Заказ 10

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, проспект академика М А Лаврентьева, 10