Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Обнаружение природного резервуара вируса чумы плотоядных в брюхоногих моллюсках

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Обнаружение природного резервуара вируса чумы плотоядных в брюхоногих моллюсках"

На правах рукописи

Кондратов Илья Геннадьевич

ОБНАРУЖЕНИЕ ПРИРОДНОГО РЕЗЕРВУАРА ВИРУСА ЧУМЫ ПЛОТОЯДНЫХ В БРЮХОНОГИХ МОЛЛЮСКАХ

03 00 16- экоюгия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ИРКУТСК 2007

иилв177 1

003161771

Работа выполнена в лаборатории аналитической биоорганической химии Лимнологического институте Сибирского отделения Российской академии наук, г Иркутск.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Деникина Наталья Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Саловарова Валентина Петровна;

кандидат биологических наук, доцент Таничев Андрей Игоревич

Ведущая организация:

ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (г. Владивосток)

. Ъ£.

Защита состоится « /4^» ноября 2007 г в 5 часов на заседании диссертационного совета Д 212.074 07 при Иркутском государственном университете по адресу 666003, г. Иркутск, ул Сухэ-Батора, 5, Байкальский музей им Профессора ММ Кожова(ауд 219) Факс(3952)241855, e-mail dekanat@bio isu ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Иркутского государственного университета

Автореферат разослан oj^ октября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е С Купчинская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Вирус чумы плотоядных (Canine Distemper Kiraï.CDV), представитель рода Morbillivirus семейства Paramyxoviridae, явился причиной эпизоотии байкальских тюленей Phoca sibirica, приведшей к гибели 10-15 тысяч животных в течение осени 1987 - весны 1988 гг (Grachev et al, 1989, Lichoshway et al, 1989) Практически одновременно, в 1988 г, в морях Северной Европы началась массовая гибель тюленей Phoca vitulina, но причиной этой эпизоотии послужил морбилливирус, близкородственный CDV, впоследствии описанный как самостоятельный вид Phocme distemper virus (PDV) (Osterhaus, Vedder , 1988, Mahy et al. 1988) Морбилливирусные инфекции у ластоногих были впервые зарегистрированы именно во время этих эпизоотий До 1988 г род Morbillivirus объединял четыре вида вирусов measle virus (MV), ringerpest virus (RPV), peste-des-pestits-rummants virus (PPRV) и canine distemper virus (CDV) Считалось, что морбилливирусы инфицируют строго ограниченный круг млекопитающих (видоспецифичны), в который представители ластоногих не входили

После затухания морбилливирусных эпизоотий у ластоногих 1987-1988 г. ситуации на Байкале и в морях Северной Европы развивались совершенно по-разному Так, процент серопозитивных к PDV взрослых шотландских тюленей снизился с 72% в 1988г до 0% в 2000 г (Thompson et al, 2002). Вирус не регистрировался до повторной эпизоотии в 2002 г, которая началась, как и первая, на о Анхольт и оказалась не менее разрушительной (Jensen et al, 2002, Muller et al, 2004) Варианты PDV 2002 г незначительно отличались от варианта 1988 г и имели мутации в исследуемом фрагменте гена Р (370 н п ), либо молчащие, либо приводящие к замене одной аминокислоты в штамме PDV-1 /DK/2002 (Muller et al, 2004)

В Байкале зараженность тюленей в течение всего периода составляла около 40%, причем инфицированные животные были нормальной упитанности без видимых признаков каких-либо нарушений, кроме того, зараженность тюленей не зависела от пола, возраста и места отлова (Беликов и др, 1999) Антитела к CDV были обнаружены у 85% животных (Ohashi et al, 2001) Выявлена значительная гетерогенность анализируемого фрагмента гена Р в популяции байкальской нерпы как в различные года, так и среди образцов головного мозга тюленей, добытых в течение одного года (Бутина и др, 2003). Такие существенные отличия в этих эпизоотических процессах указывают на существование различных механизмов циркуляции вируса в двух экосистемах Поскольку вероятность постоянного инфицирования байкальских тюленей от других животных чрезвычайно низка, появилось предположение о существовании природного резервуара морбилливирусов в экосистеме оз Байкал

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось доказательство существования природного резервуара CDV в пойкилотермных

з

животных (брюхоногих моллюсках) Для этого необходимо было решить следующие задачи

1 Показать методом ОТ-ПЦР возможность присутствия РНК вируса чумы плотоядных в организмах пойкилотермных животных

2 Доказать, что вирус чумы плотоядных в организме брюхоногого моллюска сохраняет свою инфекционность для теплокровных животных Провести заражение чувствительных животных (хорьков) и получить изоляты вирусов на культуре клеток

3 Определить нуклеотидные последовательности фрагментов геномов вируса чумы плотоядных от байкальской нерпы, брюхоногих моллюсков и полученных изолятов вируса чумы плотоядных Определить степень родства вируса чумы плотоядных от байкальской нерпы и брюхоногих моллюсков

4 Продемонстрировать возможность репликации вируса чумы плотоядных в организме пойкилотермного животного (брюхоногого моллюска)

5 Показать, что вирус чумы плотоядных способен передаваться в популяции брюхоногих моллюсков по поколениям

Научная новизна работы В представленной работе впервые показано, что вирус чумы плотоядных, представитель рода Morbillivirus, ранее считавшийся облигатным вирусом теплокровных, способен накапливаться в организмах пойкилотермных животных (брюхоногих моллюсков Limnaea auricularia и Maakia herderiana) без потери инфекционности для теплокровных Использованы как молекулярно-биологические (ПЦР с последующим определением нуклеотидной последовательности, масспектрометрия), так и вирусологические методы (заражение чувствительных животных, изоляция на культуре клеток MDCK - перевиваемой эпителиальной клеточной культуре почки собаки)

Впервые продемонстрирована способность вируса чумы плотоядных реплицироваться в организмах пойкилотермных животных (брюхоногих моллюсков) методом раздельной гибридизации вирусоспецифических кДНК на биотинмеченых праймерах, комплементарных матричной и вирионной РНК, иммобилизованных на стрептавидиновых планшетах

Впервые в результате длительного культивирования брюхоногих моллюсков L auricularia в условиях, исключающих дополнительную контаминацию в искусственной водной экосистеме (аквариуме) продемонстрирована способность вируса чумы плотоядных передаваться в популяции моллюсков по поколениям

Впервые получены изоляты вируса чумы плотоядных от брюхоногих моллюсков L auricularia и М herderiana на культуре клеток MDCK, проведена их молекулярно-биологическая, иммунологическая и пептидная характеризация

Определены нуклеотидные последовательности участка кодирующей области гена фосфопротеина длиной 380 нуклеотидов для вариантов CDV от байкальской нерпы, L auricularia и М herdenana Показано, что варианты вируса чумы плотоядных от брюхоногих моллюсков и байкальской нерпы на исследуемом участке генома обнаруживают высокую степень родства Практическая значимость работы. Разработанный в работе подход к изучению циркуляции морбилливирусов является абсолютно новым и может бьпь использован при исследовании экологии других одноцепочечных РНК-содержащих вирусов, в первую очередь - вируса гриппа Полученные данные могут быть использованы в учебных курсах университетов Основные защищаемые положения:

1 Вирус чумы плотоядных способен накапливаться в ор!анизмах брюхоногих моллюсков без потери инфекционности для теплокровных

2 Вирус чумы плотоядных способен реплицироваться в организмах брюхоногих моллюсков

3 Вирус чумы плотоядных способен передаваться в популяции брюхоногих моллюсков L auricularia по поколениям

4 Варианты вируса чумы плотоядных от брюхоногих моллюсков и байкальской нерпы на исследуемом участке генома обнаруживают высокую степень родства

Апробация работы и публикации Материалы диссертации были представлены на 6 конференциях Зг International Symposium "Ancient Lakes Speciation, Development in Time and Space, Natural History" (Иркутск, Россия, 2002), 2nd International Conference "Marine Mammals of Holarctic" (Байкал, Россия, 2002), Всероссийская научно-практическая конференция "Развитие физико-химической биологии и биотехнологии на современном этапе" (Иркутск, Россия, 2003), Четвертая Верещагинская Байкальская конференция (Иркутск, Россия, 2005), 20lh Annual Conference of the European Cetacean Society (Gdynia, Poland, 2006), IX съезд гидробиологического общества РАН (Тольятти Россия, 2006) По материалам диссертации опубликовано 3 статьи Личный вклад соискателя. Молекулярно-биологические данные получены лично автором Заражение чувствительных к CDV животных проведено сотрудниками Института молекулярной биологии ГНЦ ВБ «Вектор» под руководством к б н Шестопалова А М Изоляты CDV на культуре MDCK получены на базе ГУ НЦМЭ ВСНЦ СО РАМН, Иркутск, под руководством к б н Черногор Л И Пептидная характеризация изолятов проведена автором на базе Института аналитического приборостроения РАН, г Санкт-Петербург, под руководством к б н Подольской Е П

Структура и объем диссертации. Рукопись диссертационной работы состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (128 наименования, из

них 15 отечественных и I 13 зарубежных). Работа изложена па 120 страницах машинописного текста, включая 13 рисунков и 2 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

В первой главе содержится обзор литературных данных по систематике и молекулярной биологии морбилливирусов. Приведены характеристики морбилливирусных эпизоотии у водных млекопитающих 1987-2002гг. Продемонстрирована роль беспозвоночных животных в циркуляции вирусов теплокровных.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В работе были использованы: ггой кил отер мные гидробионты оз. Байкал из коллекций сотрудников Лимнологического института, хранившиеся под спиртом; живые брюхоногие моллюски семейств Ьутгшехйае и ВтсаШсЬе, собранные в прибрежной зоне оз. Байкал в районе м. Березовый, пос. Большие Коты и о. Ольхон; живые брюхоногие моллюски I. аипси!апа, собранные в Иркутском водохранилище и в р. Ангара в черте г. Иркутска: живые двустворчатые моллюски, амфиподы и черви; головной мозг рыб, выловленных в оз. Байкал в разные сезоны (рис. I); образцы органон и тканей хорьков,

Выделение из образцов суммарной РНК и реакцию обратной транскрипции проводили с использованием наборов «Рибосорб», «Рибозоль» и «Реверта» (Ам пли сено, Москва). Гибридизовали кДНК на биотинилированных универсальных морбилливирусных праймерах (Barrett et al., 1993), иммобилизованных на стрептавидиновых планшетах Nunclori. 1ТЦР амнликонов

б

проводили с использованием тех же праймеров, нуклеотидные последовательности определяли как после клонирования, так и прямым сиквенированием либо с использованием [а-33Р] dATP, либо на автоматических секвенаторах ABI 373А (Applied Biosystems) и SEQ 8800 (Beckman Coulter) Сравнительный анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили методом neighbor-joining

Иммуноферментный анализ образцов органов и тканей хорьков, заражённых гомогенатом L auriculana проводили с использованием тест-системы иммуноферментной для диагностики чумы плотоядных (БиоКом ЛТД, г Новосибирск)

Культивирование L auncularia проводили в аквариумах с отстоянной водопроводной водой при 15-20°С, в качестве белковой подкормки использовали вареную рыбу Взрослых особей после периода размножения и откладки икры отбирали для последующего выделения мРНК и определения присутствия вирусоспецифических РНК Кладки икры после смены воды, а затем выклюнувшуюся из кладок молодь L auriculana первого поколения продолжали культивировать в тех же условиях в течение года до наступления полового созревания. Начало полового размножения стимулировали белковыми подкормками и повышением температуры воды до 24"С Полученные кладки и молодь второго поколения также анализировали на присутствие вируса CDV

Изоляты CDV от гастропод L auriculana и М herdenana (пулы по 10 штук) получали на перевиваемой эпителиальной клеточной культуре Madin-Darby Canine Kidney (MDCK), 78 пассажа (ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор», п Кольцово) В качестве контроля использовали вакцинный штамм Rockbom Культуру просматривали раз в неделю с помощью светового микроскопа Leica DM 6000В (Leica, Germany) Наличие вируса определяли с помощью первичных флюоресцирующих антител к вирусу CDV (VMRD, Inc) после получения цитопатического эффекта (на 21 день) на флюоресцентном микроскопе Olympus ВХ60 (Olympys America, Inc, NY) Пептидный анализ трипсинолизатов суммарного белка полученных изолятов, гастропод L auncularia и чистой культуры MDCK в качестве контроля проводили на масс-спектрометре МХ53-03

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Анализ байкальских пойкилотермных гидробионтов на присутствие CDV.

Для обнаружения возможных природных резервуаров вируса чумы плотоядных в экосистеме оз Байкал был проведен анализ зараженности пойкилотермных гидробионтов вирусом CDV, как объектов питания байкальской нерпы (рыбы), так и являющихся основанием пищевых цепей (моллюски, амфиподы, черви), собранных в разное время года в разных районах (рис 1)

В качестве наиболее информативного и чувствительного метода был выбран ОТ-П11Р анализ с последующей визуализацией результатов в Г1ААГ-электрофорезе (окраска серебром), позволяющем визу визировать 0.! иг ДНК с шириной полосы ! см.

На рис. 2 приведена в качестве примера одна из полученных электрофореграмм. В результате проведенного анализа вирусоспецифические РНК были обнаружены в организмах различных пойкилотермных гидробионтов оз. Байкал и р. Ангара: в головном мозге ряда рыб. принадлежащих различным экологическим нишам, отличающихся по спектрам питания; в амфиподах, брюхоногих моллюсках и червях. Зараженность гидробионтов. относящихся к разным таксонам, различалась в зависимости от места и времени сбора образцов, сезонной и территориальной корреляции зараженности организмов обнаружено не было.

Рис. 2. Пример результатов ОТ-ПЦР аналич;! гпдробиинтов оз Байкал (июль 2001, м Березовый} 2-10 — р] е5ы 12-16 гасгроиеды; 17-20 -- амфиподы: 1,11.21,22 -маркер молекулярного веса Стрелка - 389 п.п,-фрагмент гена

фосфомролепна ипруса чумы плотоядных

В дальнейших экспериментах были использованы брюхоногие моллюски семейств Ьутгше^ае и Ва1саНк!ае (рис. 3), как наиболее доступные и удобные для длительного культивирования.

А

Рис. 3. Фотографии брюхоногих моллюсков, использованных в работе: Л) Цртаеа ампси1апст, Ц) шаак 'Ш НвгДеггшга

В

£

Заражение чувствительных к CDV животных - хорьков (Mustela putofitts) гомогенатом гастропод L, auricularia.

Для доказательства биологической активности вируса, накапливающегося в моллюсках, было проведено заражение чувствительных к вирусу животных-хорьков (Mustela putoritis). С этой целью гомогенизировали 10 прудовиков L. auricularia, собранных в р. Ангара в черте г. Иркутска, в фосфатно-солевом буфере так/ чтобы суммарный объем гомогената составил 10 мл, смесь центрифугировали и ввели по 1 мл супернатанта впутрибрюшинно трем хорькам. Параллельно для контроля 2 хорька были заражены вирулентным штаммом CDV Snider-Hill в дозе К)3LDso.

Заболевание с типично иервиыми проявлениями, отказом от пищи, вялостью, парезом, раскоординацией движений и т,д, проявилось у животных, зараженных штаммом Snider-Hill на 7-9 сутки, а у зараженных гомогенатом улиток - на 14-16 сутки. Вирусный антиген был обнаружен в различных органах больных животных (Рис.4).

Рис. 4. Данные иммуноферментаого ¡«гагата оргаихт хорьков, зараженных вирулентным штаммом CDV Snider-Hill и гомогенатом моллюсков/,, auricularia'.

1 - положительный контроль (Snider-Hill); 2 - отрицательный контроль (гомогенат моллюсков, р. Нижний Коен, * Новосибирская обл.); 3,4 - сежзйика и лёгкое хорька,

заражённого Snider-Hill; 5 - гомогенат моллюсков L. auricularia, 6, 7, 8 - мозг, селезенка и легкое хорька №1, заражённого гомогенатом моллюсков L auricularia', 9, 10, 11 -ю мозг, селезёнка и лёгкое хорька №2, заражённого гомогенатом

моллюсков L. auricularia

т

Наличие вирусной РНК в этих органах, было, в свою очередь, подтверждено методом RT-PCR (рис.5) с последующим частичным сиквенированием ампликонов. Полученные последовательности участка гена фосфопротеина (150 н.п.) не отличались от варианта CDV. вызвавшего эпизоотию в 1988 г. и отличались от вакцинных штаммов и Snider-Hill.

Рис, 5. Элект рофореграм м а продуктов амплификации фрагмента гена фосфопротеина (389 п.н.) вируса CDV от зараженных хорьков: 1,2 - мозг и селезёнка хорька №1, заражённого гомогенатом L. auriftdaria', 4,5- мозг и селезёнка хорька JMs 2, заражённого гомогенатом L. auricularia', 7,8 - мозг и селезёнка хорька, зараженного Snider-Hill; 3,6 - маркер молекулярного веса.

2 Ь

3 ?

ш

4 Ft

1 2 3 4 5 6 7 8

~ —' —- -----■ »V1

• V

ч» Щ т т

Таким образом, в организмах гастроШД действительно может присутствовать аиру с чумы плотоядных. При этом вирус сохраняет вирулентность для теплокровных организмах.

Изоляция CDV на культуре клеток MDCK от г ¡1 строп од L. auricularia и М. herderiana.

Изоляцию CDV проводили на перевиваемой эпителиальной клеточной культуре tvTDCK. Для изоляции вируса CDV было взято 50 особей L, auricularia и 40 особей М. herderiana (пулы по 10 шт.) В качестве контроля использовали вакцинный штамм Rockborn

Цшоштический эффект наблюдали на 20-21 день (рис. 6. A-D). Наличие вируса определяли с помощью первичных флюоресцирующих антител (direct FA conjugate, polyclonal antiserum conjugate to fluorescein isothiocyatiatc) к вирусу CDV (VMRO, Inc.) (рис. 6. E-H).

Put. б. Микрофотографии культуры клеток MDCK..

Цитопатичсский эффект, 21 день:

A) иеинфшдированиая;

B) инфицированная, штамм Rockborn;

C) инфицированная, гомогенат L. auricularia

D) инфицированная, гомогенат М. herdriana

Обработанная первичными

флюоресцирующими антителами к вирусу CDV:

E) неиифицированная;

F) инфицированная, штамм

Rockborn;

G) инфицированная, гомогенат JL auricuiaria

H) инфицированная, гомогенат М. herdriana

Флюоресцентный микроскоп

Olympus ВХ60 (Olympys America, Inc.., NY), увеличение: xl 000.

Таким образом, нами показано что вирус, присутствующий в брюхоногих моллюсках, сохраняет свою инфекционность для культур клеток теплокровных животных

Молекулярно-генетическая характеризация вариантов CDV от различных гидробионтов оз. Байкал.

Проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена фосфопротеина CDV и соответствующих предсказанных аминокислотных последовательностей из природных образцов байкальской нерпы (Phoca sibirica), брюхоногих моллюсков L auncularia, изолятов от байкальской нерпы и брюхоногих моллюсков L auricularia и М herdriana

Исследованный фрагмент, кроме фосфопротеина, со сдвигом рамки считывания кодирует часть неструктурного белка С и содержит сайт редактирования для неструктурного белка V Все эти белки входят в репликативный комплекс вируса Многофункциональность фрагмента обуславливает его достаточно жесткую консервативность, что позволяет использовать его как генетический маркер видовой принадлежности морбилливирусов

Все полученные последовательности по сравнению с изолятом 1988 г совпадают на 97-100% на участке гена фосфопротеина длиной 360 н п Данные по соответствующим предсказанным аминокислотным последовательностям фрагмента гена фосфопротеина (с 119 по 237 позицию по штамму

\№ ак cdv\ -* H Ш "i 1-ГО 00 t r-r- л r- o o\ v> C\ ** oe 0\ Os 9\ o M V) M N f~» Я M 3 n N VI m N ve f» N t-я

Onder E T G L D A L R R N D N R P G E R s V

Seal-88 E A S L D A L R R N E N G P G G R s A

Seall-92 E A S L D A S R R N D N G P G G R s V

Stall3-92 E A s L D A L R R N E N G P G G R s I

Stal 14-92 E A s L D A L R R N E N G P G G R s I

Scal26-95 E A s L D A L К R N D N G P G G R s A

Seal27-9S E A s L D A L R R N E N G P G G G s A

Seal63-95 E A s L D A L R R S D N G P G G R p A

Seal78-95 E A s L D A L К R N D N G P G G R s A

Stal1-96 E A s L D A L R R N E N G P G G R s T

Sea 12-97 E A s L D A L R R N E N G P G G R s T

StaU-97 E A s L D A L R R N E N G P G G R s T

Seall-00 E A s L D A L R T N E S G L G G R s T

Stal3-00 E A s L G V L R R N E N G L D G R s T

StalS-OO E A s L D A L R R N E N G L G G R s A

Limnaea E A s L D A L R R N D N R L G G R s A

Llmnea-i E A s L D A L R R N E N G P G G R s A

Maakia-i V A s R D A L R R N E N G P G G R s A

Таблица 1 Аминокислотные замены во фрагменте фосфопротеина.

*Красным цветом обозначены замены, приводящие к изменению пространственной структуры белка, синим - не приводящие

Наиболее близким к вакцинному штамму оказался вариант вируса из моллюска L auricularia (5 аминокислотных замен), наиболее отличными -вариант от нерпы Seal 3-00 (10 аминокислотных замен) и изолят от холодноводного моллюска М herderiana (8 аминокислотных замен)

Интересные данные получены при анализе предсказанных последовательностей фрагмента неструктурного белка С, влияющего на транскрипцию и репликацию вируса (Bankamp et al, 2005) Изолят вируса от холодноводного брюхоногого моллюска М herderiana оказался дефектным по неструктурному белку С В результате мутации А-Т в позиции 371 (нумерация по последовательности гена фосфопротеина), приводящей к образованию стоп-кодона, оказались делегированы 58 аминокислотных остатков На три аминокислоты оказался короче белок С в варианте от нерпы Seal 3-00 (рис 7)

Onder KRLRESKMLWSWYbQAbSVIEDSBJEEKEAIMX*bRILAKIIPKmLHbTaDIbSAIjmTI^XMatop

Seal-88 KI^RESKMLTVSWYbQAIiSVXEDSREEKEAUlIAIiRZIiAKZIFKEMLHIiTGDXbSAZiNQTEQX^l^top

Seal 1-92 KBIjRESKHLWSWYLQAb^VXEDSH£EK£AlMXXLRXLAKIIPK£MLHLTGDXLSAIiNQTEQIjMstop

Seal 13-92 KRbRgSKMLTVSWyLQAJjSVIEDSREEKEAIMIATiRTTiAKIIPKEMLHIiTgDXIiSAXJTQTEQbMstop

Seal 14-92 KBbRESKMLTVSWYLQALSVIEDSIUSEKEAIidlAIiRIIAKIIPKEMLHLTQDIbSAIiNQTEQIJ^top

Seal 26-95 RU^RESKl^WSWmQXbSVIEDSREEKEMMIMJirLXKIIPRBMLHLTaDILSXI^TEQI^t^

Seal 27-95 KBbBESKMLTVSWZbQALSVlEDSBEEKEAIMIAIiRlZAKlIFKEMLHLTSDXbSAIitlLTEQUlstop

Seal 63-95 KBbFESro^TASW^QALSVTEDSBEEKEAIMIALIUILAKIIPREMLHI/raDIbSAIjNQTEQIMatap

Seal 78-95 KJ^BESKMLTVSW^QALSVIEDSREEKEAIiilAIjRIIAKIIPREMLHIjTGDIIiSAIjNQTEQLMatop

Seal 1-96 KI^RESKMLTVSWyiQAIiSVTEDSREEKEAIMXATtPTTiAKJIPKEMLHIjT(3DXLSALNQTEQI^i3top

Seal 2-97 KFIiPZSKMLTVSWYIiPALSVIEDSFEEKEAIMIAIjRIIAKIIPK]Q^HLTGDILSAIjNQTEQIi4stop

Seal 3-97 KRLRESKMLTVSWXLQALSVZEDSREEKZAIMIPLRXIiAKXIPKEblLHIACIDIIiSAIiNQTEQUistop

Seal 1-00 ITCIjRXSKMLTVSWXbQALSVTEDSBEEKEAIMIAIiRILAXUIPlCEMLHI^GDIbSAIilTQTEQIAistop

Seal 3-00 KBIiKZSKMLTVSWXbQAbSVZEDSBEEKEIkZMZAZiRIUkKZIPKEMLHZAGDIliSAZitTQAXs top

seal 5-00 KBbBSSIQlLWSWZbQALSVIEDSBEEKEAIllZAIiSlZiAKIIPKlbiLllI/reDILSXIiMQTEQIllstop

Lymnea KBZJSSK^TVSW^QAIiSVIEDSBEEKEAUCCAliRIIiAKIIFKEMLHIiTeDIbSAIilTQTXQZ^lstop

Lymna=a_i KaiJ(ESiaiLTVSTra,QAlSVIEDSREEKEMiiLAIjaiiAKIIPra^^

Маак1а_1 KBLBJESstop

Рис. 7. Выровненные аминокислотные последовательности фрагмента белка С

Пептидная характеризация вариантов СБУ от моллюсков и изолированных на культуре клеток МОСК.

Наиболее перспективным объектом для пептидного анализа в вирусе чумы плотоядных является белок нуклеокапсида (И), поскольку он наиболее обилен и содержит крайне консервативные участки Трипсинолизаты суммарного белка, выделенного из моллюска Ь аипси1апа, зараженных клеток и культуральной жидкости, проанализированные масс-спектрометрией, показали наличие пептида с массой подходящей пептиду М\у (8МЕА1АК) = 749 39, который в свою очередь принадлежит белку нуклеокапсида N (позиции 489495) Пептид с такой массой был обнаружен в организме моллюска Ь аипси1апа (рис 8, С), трипсинолизатах суммарного белка клеток МОСК., зараженных как гомогенатом моллюсков Ь аипси1апа, так и зараженных в качестве положительного контроля штаммом СБУ ЯоскЬош (рис 8, А, В) В

качестве отрицательного контроля нами исследовались не зараженные клетки МЭСК и их ростовая среда. Как видно на рисунке 8 О пептида с такой массой не Обнаружено.

1

Ь; ' ; I : : -У N ■ 3!! 1 ■

11 щ&Л, мм § || № [1 ь« : ¡11 |Н;У 111

г! 11 Ши, С< 1 'Л ■' Ш И и!( И п ■'

[ 'Г1<> : ' .. !

Ряс. 8. Масс-спектры трппсииолизатоп суммарного белка, выделенного из:

A) культуральной жидкости клеток МОСК. зараженных вирулентным штаммом СОУ КоскЬогп;

B) культуральмой жидкости клеток УЮСК, зараженных гомогенатом Ь. аипси!аг1а\

C) моллюска акпси1ипа\

О) культуральной жидкости незаряженных клеток МОСК.

Доказательство возможности репликации вируса чумы плотоядных в организмах пой кил от ерм ныл животных (гастроном).

Поскольку геном CDV представ л нет собой линейную молекулу одноцепочечной РНК негативной полярности, доказательством репликации является одновременное присутствие в организме обоих видов РНК — вириоиной и матричной. Общепринятым методом для решения задач такого рода является гибридизация со специфическими олигонуклеотидными зондами, несущими либо флюоресцентную, либо радиоактивную метку. Основным препятствием для определения природных резервуаров с помощью этого метода является его недостаточно высокая чувствительность, поскольку при нормальных условиях концентрация вируса в организме слишком мала. Мы использовали адаптированный метод гибридизации, повысив его чувствительность с помощью последующей амплификация фрагмента гена белка фосфо протеина.

Суммарную ГНК из гастропод L. auricular i а ревертировали со статистической затравкой, полученную к ДНК гибридязовали с в ирусо специфическим и (комплементарными к + и — цепи РНК) биотин-мсченными олигонуклеотидными зондами, раздельно сорбированными на полистирольных планшетах, покрытых стре птавидино м. Обогащенные в результате гибридизации пробы вирусоспецифических к ДНК использовали в качестве матрицы в ПЦР с универсальными морбилливирусными праймерами. Использованный подход позволил раздельно детектировать присутствие обеих форм вирусоспецифических РНК. Результаты проведенного эксперимента представлены в виде электрофореграммы ам пли конов фрагмента гена фосфонрОтеит в ПААГ с серебряным окрашиванием (рис. 9). Очевидно, что вирус CDV способен реплицироваться в организмах гастропод.

1 2 3 4 5

Рис. 9. Амшшкояы фрагмента Р-гена с суммарной1 тшятжя кДНК после гибридизации:

A) L. Qurkularia. 1- гибридизация с CDV-L драймером (наличие мРНК); 2- гибридизация с CDV-R праймером (наличие вирионной РНК); 3-положигельный контроль; 4- отрицательный контроль, 5- маркер молекулярного веса.

-Y—' ж ■ *

'¿ЁшШйШШШш

По-видимому, скорость репликации (и, как следствие, соотношение вирусоспецифических РНК) в пойкилтермном организме может значительно варьировать в результате воздействия множества факторов. Так, уровень

репликации вируса должен зависеть от конкретных условий существования гастропод, таких как температура, возрастная стадия, спектр питания и т д

Передача CDV по поколениям в популяции моллюсков в искусственной системе.

Для выяснения, насколько долго может существовать вирус в популяции брюхоногих моллюсков без перехода к теплокровным животным, мы провели длительный эксперимент по культивированию зараженных моллюсков в лабораторных условиях в аквариуме с байкальской водой

Брюхоногих моллюсков L auricularia собирали на мелководье (до 50 см) р Ангара в черте г Иркутска в июне 2003 г и культивировали в аквариумах при 15°С, в качестве белковой подкормки использовали вареную рыбу Взрослых особей после периода размножения и откладки икры отбирали для последующего выделения мРНК и определения присутствия вирусоспецифических РНК Canine Distemper Virus Кладки икры после смены воды, а затем выклюнувшуюся из кладок молодь первого поколения L auricularia продолжали культивировать в тех же условиях в течение года до наступления полового созревания улиток Полученные кладки L auricularia имели продолговатую форму и размеры 20-30 мм длина, 3,5-4,5 мм ширина и 2,5-3,5 мм высота Полученные кладки и молодь улиток второго поколения с высотой раковины около 2 мм также анализировали на наличие вирусной РНК методом ОТ-ПЦР Электрофореграмма результатов проведенного ОТ-ПЦР-анализа речных моллюсков, кладок и молоди второго поколения L auricularia приведена на рис 10 Из рисунка видно, что РНК вируса CDV присутствует как в родительских особях, так и в потомстве 1 и 2 поколений

1 2 3 4 5 6 7 8

РнсМ Э1 ¡с к тро форе грамма результатов проведенного ПЦР-анализа речных моллюсков (6), кладок (2-4) и молоди второю поколения (7). Дорожки 1. В маркер молекулярного веса. Дорожка 5 - отрицательный контроль

Условия эксперимента полностью исключают возможность случайной контаминации. Поступление вируса из окружающей среды было невозможно, поскольку все подкормки подвергались тепловой обработке, а морбилливирусы достаточно лабильны (СЬеглезси ел а1, 1978). После получения кладок взрослых особей отсаживали с одновременной сменой воды в выводковом аквариуме, предотвращая контакт с исходным источником вируса. Таким образом, полученные данные позволяют утверждать, что СОУ способен передаваться в популяции моллюсков по поколениям без включения в процесс циркуляции теплокровных животных.

выводы.

1 Продемонстрирована возможность присутствия и активной репликации вируса чумы плотоядных в организмах брюхоногих моллюсков семейств Lymnaeidae методом гибридизации с вирусоспецифическими биотинмеченными праймерами с последующей ОТ-ПЦР

2 Показана возможность вертикальной передачи вируса чумы плотоадных в популяции брюхоногих моллюсков L auriculana посредством длительного культивирования нескольких поколений моллюсков в условиях, исключающих дополнительную и перекрестную контаминацию Контроль присутствия вируса в кладках моллюсков, материнских и дочерних организмах осуществлялся методом ОТ-ПЦР с последующим определением нуклеотидной последовательности полученного фрагмента

3 Продемонстрирована патогенность вариантов вируса чумы плотоядных из брюхоногих моллюсков Lymnaea auriculana для чувствительных к исследуемому вирусу животных (хорьков) путем внутрибрюшинного заражения хорьков гомогенатом моллюсков Вирусный антиген обнаружен в органах зараженных животных методом иммуноферментного анализа, присутствие вирусоспецифических РНК подтверждено методом ОТ-ПЦР с последующим определением нуклеотидной последовательности полученного фрагмента

4 Получены изоляты вируса чумы плотоядных от брюхоногих моллюсков L auriculana и М herderiana на перевиваемой эпителиальной клеточной культуре Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) Характеризация изолятов проведена методами иммунофлюоресценции, масс-спектрометрии трипсинолизатов суммарного белка и ОТ-ПЦР с последующим определением нуклеотидной последовательности полученного фрагмента

5 Проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов гена фосфопротеина вариантов вируса чумы плотоядных от байкальской нерпы, брюхоногих моллюсков и изолятов вируса чумы плотоядных от брюхоногих моллюсков L auriculana и М herderiana, продемонстрировавший близкую степень родства вариантов исследуемого вируса от теплокровных и пойкилотермных животных

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1 Кондратов ИГ. Деникина Н.Н, Беликов СИ, Дурыманова АА, Устинова Е Н, Шестопалов А М Моллюски как естественный резервуар морбилливирусов // ДАН - 2003 - №389(3), С 421-423

2 Бутина Т В, Деникина Н Н, Кондратов И Г.. Беликов С И., Дурыманова А А, Блинов В М, Шестопалов А М Молекулярно-генетаческое сравнение морбилливирусов, вызвавших эпизоотии байкальских (РНОСА SIBIRICA) и каспийских (РНОСА CASPICA) тюленей // Мол Генетика, Микробиология и Вирусология -2003 -№4 - С 27-32

3 Петрова Н М , Кондратов И Г . Дзюба Е В , Деникина Н Н, Беликов С И Изучение механизмов циркуляции вируса чумы плотоядных в экосистеме оз Байкал// Бюллетень ВСНЦ СО РАМН -2003 - № 7 - С 135-136.

4 Kondratov I G , Denikina N N, Behkov S I Invertebrates as a Possible Natural Reservoir for Morbillivirus That Caused Epizooty in Baikal Seal Population // Ancient Lakes. Speciation, Development m Time and Space, Natural History, 3 rd International Symposium, Irkutsk, Russia, 2002 - P 83

5 Behkov S I, Butina T V , Denikina N N , Kondratov IG , Shestopalov A.M Molecular-genetic comparison of morbilhviruses caused epizootic diseases in baikal and Caspian seals and determination of possible infection natural reservoirs // Marine Mammals of Holarctic, 2nd International Conference, Baikal, Russia, 2002 -P 29.

6. Петрова HM , Кондратов ИГ , Дзюба E В , Деникина НН, Беликов С И Изучение механизмов циркуляции вируса чумы плотоядных в экосистеме оз Байкал // Развитие физико-химической биологии и биотехнологии на современном этапе, Всероссийская научно-практическая конференция, Иркутск, Россия, 2003 -С 135

7 Деникина Н Н, Кондратов И Г. Черногор Л И, Бутина Т В , Дзюба Е В , Ситникова Т Я, Вейнберг И В , Беликов С.И Циркуляция вируса чумы плотоядных в экосистеме озера Байкал // Четвертая Верещагинская Байкальская конференция, Иркутск, Россия, 2005 - С 67-68

8 Кондратов И Г, Деникина Н Н, Беликов С И Репликация вируса чумы плотоядных в организме брюхоногих моллюсков Limnea auriculana И Четвертая Верещагинская Байкальская конференция, Иркутск, Россия, 2005 -С 100-101

9 Denikina N N., Kondratov I G, Chernogor LI, Butina T V , Lopatovskaya К V, Dzuba E V, Sitnikova T Ya, Vemberg IV, Belikov SI Circulation of canine distemper virus in lake Baikal ecosystem // 20th Annual Conference of the European Cetacean Society, Gdynia, Poland, 2006 -P 164

10. Деникина H H, Кондратов ИГ, Черногор Л И, Бутина Т В , Дзюба Е В , Ситникова Т Л, Вейнберг И В , Целиков С И. Циркуляция вируса чумы плотоядных в экосистеме озера Байкал II IX съезд гидробиологического общества РАН, Тольятти, Россия, 2006 - С 132

Подписано в печать 09 10 07 Формат 210x147 1/16 Бумага писчая белая Печать RIZO Уел печ л 1 б Отпечатано в типографии «Академкопия», Ш1 Овсянников А А Тираж 100 экз Заказ № 41

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кондратов, Илья Геннадьевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1.Сравнительная характеристика морбилливирусных эпизоотий у тюленей Байкала и северных морей.

1.1.1. Морбилливирус в популяции байкальской нерпы (Phoca sibirica).

1.1.2.Морбилливирус европейских тюленей и его отличие от вируса байкальской нерпы.

1.1.3 .Сравнительная характеристика байкальской нерпы {Phoca sibirica) и обыкновенных тюленей {Phoca vitulina).

1.2. Морбилливирусные эпизоотии водных млекопитающих с 1988 по 2002 годы.

1.3.Молекулярно-биологическая характеристика рода мофштъщ>усоъ{МогЫ11тгш).

1.4. Роль беспозвоночных в экологии вирусов теплокровных животных.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Молекулярно-биологические подходы к мониторингу.

3.2. Анализ байкальских пойкилотермных гидробионтов на присутствие морбилливирусной РНК.

3.3. Заражение чувствительных к CDV животных -хорьков (Mustela putorius) гомогенатом гастропод

L. auricularia.

3.4. Изоляция CDV на культуре клеток MDCK от гастропод/,. auricularia и М. herderiana.

3.5. Молекулярно-генетическая характеристика вариантов

CDV от различных гидробионтов оз. Байкал.

3.6. Пептидная характеризация вариантов CDV от моллюсков (нативных и изолированных на культуре клеток MDCK).

3.7. Доказательство возможности репликации вируса чумы плотоядных в организмах пойкилотермных животных (гастропод).

3.8. Передача CDV по поколениям в популяции моллюсков в искусственной системе.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Обнаружение природного резервуара вируса чумы плотоядных в брюхоногих моллюсках"

Актуальность проблемы. Вирус чумы плотоядных {Canine Distemper Virus, CDV), представитель рода Morbillivirus семейства Paramyxoviridae, явился причиной эпизоотии байкальских тюленей Phoca sibirica, приведшей к гибели 10-15 тысяч животных в течение осени 1987 - весны 1988 гг. (Grachev et al, 1989, Lichoshway et al, 1989.). Практически одновременно, в 1988 г., в морях Северной Европы началась массовая гибель тюленей Phoca vitulina, погибло 23 тысячи животных, что составило около 57% популяции. Причиной этой эпизоотии послужил морбилливирус, близкородственный CDV, впоследствии описанный как самостоятельный вид Phocine distemper virus (PDV) (Osterhaus, Vedder, 1988, Mahy et al. 1988.). Морбилливирусные инфекции у ластоногих ранее не наблюдались и были впервые зарегистрированы именно во время этих эпизоотий. До 1988 г. род Morbillivirus объединял четыре вида вирусов: measles virus (MV), ringerpest virus (RPV), peste-des-pestits-ruminants virus (PPRV) и canine distemper virus (CDV). T.e считалось, что морбилливирусы являются видоспецифичными, так как они инфицируют строго определенный круг млекопитающих Представители ластоногих не входили в перечень млекопитающих, которых может поражать морбилливирус.

Эпидемические процессы в Северной Европе и на Байкале, несмотря на совпадение сроков начала эпизоотий, стали развиваться различными путями. Так, процент серопозитивных к PDV взрослых шотландских тюленей изменился с 72% в 1988 г. до 0% в 2000 г. (Thompson et al, 2002). Морбилливирус у североморских тюленей не регистрировался до повторной эпизоотии в 2002 г., которая началась, как и первая, на о. Анхольт и оказалась не менее разрушительной (Muller et al., 2004). После эпизоотий 1987-1988 гг. повторная мощная эпизоотия среди тюленей Северного моря произошла в 2002 году, при которой погибло 30 тысяч животных (47% численности) (Harkonen et al, 2006). Варианты PDV 2002 г. незначительно отличались от варианта 1988 г. и имели всего 2 либо 3 мутации в исследуемом фрагменте гена Р (370 н.п.), либо молчащие, либо приводящие к замене одной аминокислоты в штамме PDV-1/DK/2002. Между собой варианты 2002 года отличались одной нуклеотидной заменой (Muller et al., 2004).

В Байкале зараженность тюленей в течение всего периода составляла около 40%, причем инфицированные животные были нормальной упитанности без видимых признаков каких-либо нарушений, кроме того, зараженность тюленей не зависела от пола, возраста и места отлова (Беликов и др., 1999). Антитела к CDV были обнаружены у 100 % животных в 1993 г. (Mamaev et al., 1995) и у 85% животных в 1999 г. (Ohashi et al, 2001). Выявлена значительная гетерогенность анализируемого фрагмента гена Р в популяции байкальской нерпы как в различные годы, так и среди образцов головного мозга тюленей, добытых в течение одного года (Butina et al, 2003). Таким образом, в экосистеме озера Байкал морбилливирус продолжает циркулировать в популяции нерпы, но повторных эпизоотий до сих пор не наблюдалось. По данным на 2003 год, носителями вируса являются ~ 45% поголовья тюленей.

Такие существенные отличия в этих эпизоотических процессах указывают на существование различных механизмов циркуляции вируса в двух экосистемах. Одним из объяснений таких различий в эпизоотических процессах может быть различная экологическая обстановка, в частности постоянный контакт байкальской нерпы с новыми вариантами вируса. Таким контактом можно объяснить не только высокий титр антител у байкальской нерпы в течение стольких лет после первой эпизоотии, но и гетерогенность вариантов вируса, зарегистрированных в течение года. Так как нерпа является единственным млекопитающим оз. Байкал и фактически не контактирует с наземными животными, то альтернативными источниками инфекции могут служить только пойкилотермные гидробионты. В этом случае в различных видах гидробионтов могут существовать отличающиеся варианты вируса, которые с пищей будут попадать в организм тюленей в малых дозах, приводя к образованию антител, но не вызывая гибели животных. Доказательству правомочности этого предположения посвящена данная работа.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось доказательство существования природного резервуара CDV в пойкилотермных животных (брюхоногих моллюсках). Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Показать методом ОТ-ПЦР присутствие РНК вируса чумы плотоядных в организмах пойкилотермных животных.

2. Продемонстрировать, что вирус чумы плотоядных в организме пойкилотермного животного (брюхоногого моллюска) сохраняет свою инфекционность для теплокровных животных, провести заражение чувствительных животных и получить изоляты вирусов на культуре клеток.

3. Определить нуклеотидные последовательности фрагментов геномов вируса чумы плотоядных от байкальской нерпы, брюхоногих моллюсков и полученных изолятов вируса чумы плотоядных. Определить степень родства вируса чумы плотоядных от байкальской нерпы и брюхоногих моллюсков.

4. Продемонстрировать возможность репликации вируса чумы плотоядных в организме пойкилотермного животного.

5. Показать, что вирус чумы плотоядных способен передаваться в популяции брюхоногих моллюсков по поколениям.

Научная новизна и практическая значимость работы. В представленной работе впервые показано, что вирус чумы плотоядных, представитель рода Morbillivirus, ранее считавшийся облигатным вирусом теплокровных, способен накапливаться в организмах пойкилотермных животных (брюхоногих моллюсков Lymnaea auricularia и Maakia herderiana) без потери инфекционности для теплокровных. Использованы как молекулярно-биологические (ПЦР с последующим определением нуклеотидной последовательности), так и вирусологические методы (заражение чувствительных животных, изоляция на культуре клеток MDCK).

Впервые продемонстрирована способность вируса чумы плотоядных реплицироваться в организмах пойкилотермных животных.

Впервые в результате длительного культивирования брюхоногих моллюсков L. auricularia в искусственной водной экосистеме (аквариуме) в условиях, исключающих дополнительную контаминацию, продемонстрирована способность вируса чумы плотоядных передаваться в популяции моллюсков по поколениям.

Впервые получены изоляты вируса чумы плотоядных от брюхоногих моллюсков L. auricularia и М. herderiana на культуре клеток MDCK, проведена их молекулярно-биологическая, иммунологическая и пептидная характеризация.

Определены нуклеотидные последовательности участка кодирующей области гена фосфопротеина длиной 380 нуклеотидов для вариантов CDV от байкальской нерпы, и моллюсков - L. auricularia и М. herderiana. Показано, что варианты вируса чумы плотоядных от брюхоногих моллюсков и байкальской нерпы на исследуемом участке генома обнаруживают высокую степень родства.

Разработанный в работе подход к изучению циркуляции морбилливирусов является абсолютно новым и может быть использован при исследовании экологии других одноцепочечных РНК-содержащих вирусов, в первую очередь - вирусов гриппа. Полученные данные могут быть использованы в учебных курсах университетов.

Основные защищаемые положения:

1. Вирус чумы плотоядных способен накапливаться в организмах пойкилотермных животных без потери инфекционности для теплокровных.

2. Вирус чумы плотоядных способен реплицироваться в организмах пойкилотермных животных (брюхоногих моллюсков).

3. Вирус чумы плотоядных способен передаваться в популяции пойкилотермных животных (брюхоногих моллюсков L. auricularia) по поколениям.

4. Варианты вируса чумы плотоядных от брюхоногих моллюсков и байкальской нерпы на исследуемом участке генома обнаруживают высокую степень родства.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на 6 конференциях: 3rd International Symposium "Ancient Lakes: Speciation, Development in Time and Space, Natural History" (Иркутск, Россия, 2002); 2nd International Co nference "Marine Mammals of Holarctic" (Байкал, Россия, 2002); Всероссийская научно-практическая конференция "Развитие физико-химической биологии и биотехнологии на современном этапе" (Иркутск, Россия, 2003); Четвертая Верещагинская Байкальская конференция (Иркутск, Россия, 2005); 20th Annual Conference of the European Cetacean Society (Gdynia, Poland, 2006); IX съезд гидробиологического общества РАН (Тольятти, Россия, 2006). По материалам диссертации опубликовано 3 статьи.

Личный вклад соискателя. Молекулярно-биологические данные получены лично автором. Заражение чувствительных к CDV животных проведено сотрудниками Института молекулярной биологии ГНЦ ВБ «Вектор» под руководством к.б.н. Шестопалова A.M. Изоляты CDV на культуре MDCK получены на базе ГУ НЦМЭ ВСНЦ СО РАМН, Иркутск, под руководством к.б.н. Черногор Л.И. Пептидная характеризация изолятов проведена на базе Института аналитического приборостроения РАН, г. Санкт-Петербург, под руководством к.б.н. Подольской Е.П.

Структура и объём диссертации. Рукопись диссертационной работы содержит 3 главы и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (128 наименования, из них 15 отечественных и 113 зарубежных). Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, включая 13 рисунков и 2 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Кондратов, Илья Геннадьевич

ВЫВОДЫ

1. Продемонстрирована возможность присутствия и активной репликации вируса чумы плотоядных в организмах брюхоногих моллюсков семейств Lymnaeidae методом гибридизации с вирусоспецифическими биотинмеченными праймерами с последующей ОТ-ПЦР.

2. Показана возможность вертикальной передачи вируса чумы плотоядных в популяции брюхоногих моллюсков L. auricularia посредством длительного культивирования нескольких поколений моллюсков в условиях, исключающих дополнительную и перекрестную контаминацию. Контроль присутствия вируса в кладках моллюсков, материнских и дочерних организмах осуществлялся методом ОТ-ПЦР с последующим определением нуклеотидной последовательности полученного фрагмента.

3. Продемонстрирована патогенность вариантов вируса чумы плотоядных из брюхоногих моллюсков Lymnaea auricularia для чувствительных к исследуемому вирусу животных (хорьков) путем внутрибрюшинного заражения хорьков гомогенатом моллюсков. Вирусный антиген обнаружен в органах зараженных животных методом иммуноферментного анализа, присутствие вирусоспецифических РНК подтверждено методом ОТ-ПЦР с последующим определением нуклеотидной последовательности полученного фрагмента.

4. Получены изоляты вируса чумы плотоядных от брюхоногих моллюсков L. auricularia и М. herderiana на перевиваемой эпителиальной клеточной культуре Madin-Darby Canine Kidney (MDCK). Характеризация изолятов проведена методами иммунофлюоресценции, масс-спектрометрии трипсинолизатов суммарного белка и ОТ-ПЦР с последующим определением нуклеотидной последовательности полученного фрагмента.

5. Проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов гена фосфопротеина вариантов вируса чумы плотоядных от байкальской нерпы, брюхоногих моллюсков и изолятов вируса чумы плотоядных от брюхоногих моллюсков L. auricularia и М. herderiana, продемонстрировавший близкую степень родства вариантов исследуемого вируса от теплокровных и пойкилотермных животных.

ОТ АВТОРА

Автор выражает особую благодарность своему руководителю Деникиной Н.Н. за всестороннюю поддержку и "свободу эксперимента". Беликову С.И. за неоценимые советы по разработке и модификации уже существующих молекулярно-биологических методов. Академику М.А Грачеву за всестороннюю поддержку.

Автор глубоко благодарен всем тем, с кем пришлось сталкиваться на разных этапах работы: Шестопалову М.А. предоставившего возможность заражения животных на базе ГНЦ ВБ "Вектор" (г. Новосибирск); Подольской Е.П. (НИИ Цитологии, г. Санкт-Петербург) за совместную масс-спектрометрическую часть работы; Черногор Л.И. (ГУ НЦМЭ ВСНЦ СО РАМН, г. Иркутск) за полученные изоляты на клеточной культуре; Петрову Е.А. за предоставленный патологический материал от байкальских нерп; Дзюбе Е.В., Ситниковой Т.Я. и Тимошкину О.А за предоставленный коллекционный материал и помощь в определении гидробионтов, а так же Хаснатинову М.А., Кулаковой Н.В., Белых О.И., Огаркову О.Б., Ханаеву И.В., Бутиной Т.В., Петровой Н.М., Перетолчиной (Самсоновой) Т.Е., Аделыпину Р.В., Лопатовской К.В.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные выше данные позволяют нам выдвинуть гипотезу о возможности широкомасштабной циркуляции CDV в экосистеме оз. Байкал без участия теплокровных животных.

Действительно, в Байкале существует как минимум один резервуар морбилливирусов, в котором CDV способен реплицироваться и поддерживаться в течение многих лет - популяции брюхоногих моллюсков. В моллюсках происходит не только накопление вирусных частиц, поступающих с водой и пищей, но и синтез вирусных мРНК и вирусных белков, что указывает на активное размножение вируса.

Мы не исследовали факторы, оказывающие влияние на скорость репликации вируса в организме моллюсков, эффективность утилизации вируса в экосистеме и пути передачи вируса теплокровным животным. Вероятно, имеются нескольких механизмов передачи вирусов от одного вида животных другому. Так, вирус может передаваться внутри экосистемы через воду, по существующим пищевым цепям или паразитами, меняющими хозяев в процессе онтогенеза.

Эта гипотеза полностью объясняет существующую эпидемиологическую ситуацию на Байкале и разительные отличия от картины эпизоотий PDV в Северной Европе. Острая фаза эпизоотии закончилась в обоих случаях вымиранием сверхчувствительной к вирусу части популяции тюленей. Оставшиеся животные были иммунны к морбилливирусам. Следующие поколения тюленей на ранних стадиях развития были защищены материнскими антителами, получаемыми с молоком. Впоследствии у байкальских тюленей, которые постоянно живут в условно замкнутой экосистеме оз. Байкал, формировался собственный иммунитет в результате постоянного поступления в организм микроколичеств вируса вместе с пищей (рыбой, моллюсками, амфиподами) или паразитами. У европейских тюленей такого постоянного поступления вируса, очевидно, не было, что привело к постоянному падению количества животных, имеющих антитела к вирусу, и к повторной эпизоотии. Полагают, что в Северной Европе обе эпизоотии начались на острове Анхольт (Harkonen et al., 2006). Если проводить аналогию с байкальской эпизоотией, то вероятно, что существовал какой-то источник и резервуар вируса в районе о. Анхольт. Возможно, что таким источником вируса могли быть пресноводные пойкилотермные гидробионты, обитающие в водоемах о. Анхольт и достаточно редко попадающие в массовом количестве в прибрежные морские воды. В таком случае иммунитет к PDV у следующих поколений тюленей не вырабатывается, поскольку они не имеют постоянного контакта с вирусом. Иммунная прослойка популяции постепенно исчезает и при следующем массовом проникновении вируса в море возникает новая разрушительная эпизоотия.

Наша гипотеза циркуляции вируса объясняет и большую гетерогенность вируса CDV в генетически однородной популяции байкальской нерпы. При переходе вируса из популяции тюленей к различным пойкилотермным животным при каждой смене хозяина «квазивиды вируса» проходят отбор, своего рода эволюционное «бутылочное горло». Многократно переходя от моллюсков к рыбам, амфиподам или тюленям, вирус может изменяться с большей скоростью, чем при переходе от тюленя к тюленю. При таком активном эволюционном процессе достаточно велика вероятность появления нового особопатогенного варианта вируса, заметно отличающегося от ныне циркулирующих. В этом случае возможно начало следующей эпизоотии.

Мы не знаем, могут ли другие варианты CDV или других морбилливирусов размножаться в гидробионтах, но считаем, что предложенная нами модель циркуляции CDV в экосистеме оз. Байкал может быть справедлива и для других представителей рода Morbillivirus и других экосистем. Например, интересно проверить ее при анализе эпизоотий RPV в Африке. Возможно, что ряд других вирусов, резервуары которых не известны, могут иметь сходные механизмы циркуляции. Так, интересно применить эту гипотезу к поиску природных резервуаров и анализу циркуляции вируса гриппа. По-видимому, среди пойкилотермных животных имеет смысл искать природные резервуары вирусов SARS и Hendra. В любом случае, представленные результаты свидетельствуют, что при анализе циркуляции опасных вирусных инфекций нельзя игнорировать пойкилотермных животных, которые могут является природными резервуарами вирусов теплокровных.

100

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кондратов, Илья Геннадьевич, Иркутск

1. Беликов С.И., Бутина Т.В., Деникина Н.Н., Мамаев JI.B., Петров Е.А. Морбилливирус, вызвавший эпизоотию в 1987 г., продолжает циркулировать в популяции байкальской нерпы // Сиб. экол. журн.; 1999; (6):663-666. (966)

2. Борисова Т.И., Лескова В.В., Новожилов С.С., Титенко A.M. Нейтрализующие морбилливирус антитела в популяции байкальских нерп Phoca sibirica II Вопросы вирусологии. 1993. - № 1. - С. 28-30.

3. Борисова Т.И. Изоляция морбилливируса от байкальской нерпы и его биологические свойства // Автореферат кандидатской диссертации Томск. -1995.

4. Букринская А.Г., Зайдес В.М. Молекулярная биология парамиксовирусов // М.: Медицина. 1978. - С. 183.

5. Дурыманова А.А., Золотых С.И., Туманов Ю.В., Шестопалов A.M., Хураськин Л.С., Кузнецов В.Н. Мониторинг морбилливирусиой инфекции у каспийских тюленей // Ветеринария 2006. - С. 30-32

6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование. М: Мир, 1984. - 432 с.

7. Остерман J1.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. (Практическое пособие). М: Наука, 1981.-288 с.

8. Пастухов В.Д. Нерпа Байкала. Новосибирск: ВО "Наука", 1993.- 272 с. Сиссонс Г.П., Олдстоун М.Б., Иоклик В.К. и др. Вирусология в 3-х т. Под ред Б. Филдса, Д. Найпа.- М.: Мир, 1989 - 496 с.

9. Титенко A.M., Борисова Т.И., Бейм A.M., Новожилов С.С., Куделин

10. B.Н., Зорин B.JL, Кумарев В.П., Колесник B.C. Экспериментальное инфицирование нерпы Phoca sibirica морбилливирусом // Вопросы вирусологии. -19916. -№ 6. С. 511-512.

11. Baron M., Subbarao S.M. and Barrett T. Cloning and sequence analysis of the phosphoprotein (P) gene of rinderpest virus // J. Gen. Virol. 1993 - P. 299304.

12. Barrett Т., Shimpton S.B., Russel S.E.H. Nucleotide sequence of the entire protein coding region of canine distemper virus polimerase associated (P) ptotein mRNA // Virus Research. 1985. - V. 3 - P. 367-372.

13. Barrett Т., Mahy B.W.J. Genome organisation and genetics relationships among the morbilliviruses // Rev. sci. tech. Off. int. Epiz. 1986. - V. 5, N. 2. - P. 395-405.

14. Barrett T, Subbarao S.M., Belsham G.J., Mahy B.W.J. The molecular biology of morbilliviruses. In Kingsbury D. (ed.), The Paramyxoviruses, Plenum Press, New York.-1991.-P. 83-102.

15. Barrett T.,Growther J., Osterhaus A.D.M.E. et.al. Molecular biological and serological studies on the recent seal virus epizootics in Europe and Siberia // Sci.Totel Environ. -1992.- V. 115. P. 117-132.

16. Barrett T, Romero C.H., Baron M.D., Yamanouchi K., Diallo A., Bostock C.J. and Black D. The molecular biology of rinderpest and peste des petits ruminants // Ann. Med. Vet. 1993a. - V. 137. - P. 77-85.

17. Barrett Т., Visser I.K.G., Mamaev L.V., Goatley L., Van Blessem M.-F., Osterhaus A.D.M.E. Dolphin and porpoise morbilliviruses are genetically distinct from phocine distemper virus // Virology. 1993b. - V. 193. - P. 1010-1012.

18. Bellini W.J., Englund G., Rozenblatt S. et al. Measles virus P gene codes for two proteines // J. Virol. 1985. - V. 53. - P. 908-919.

19. Belykh O., Goldberg O., Likhoshway Y.V., Grachev M.A. Light, electron and immuno-electron microscopy of organs from seals of Lake Baikal sampled during the morbillivirus infection of 1987 1988. // Europ. J. of Vet. Path. - 1987. - V. 3, N.3.-P. 133-145.

20. Bengtson J.L., Boveng P., Franzen U., Have P., Heide-Jorgensen M.-P. and Harkonen T.J. Antibodies to canine distemper virus in antarctic seals // Marine Mammals Sci. 1991. - V. 7. - P. 85-87.

21. Black F.L. Epidemiology of paramyxoviruses. In Kingsbury D. (Ed.), The paramyxoviruses // New York, Plenum Press. 1991. - P. 509-536.

22. Blixenkrone-Moller M., Bolt G., Gottschalk E. And Kentner M. Comparative analysis of the gene encoding the nucleocapsid protein of the dolphin morbilliviruses // J. Gen. Virol. 1994. - V. 75. - P. 2829-2834.

23. Bohn W., Ciampor F., Rutter R., Mannweiler K. Localization of nucleocapsid associated polypeptides in measles virusinfected cells by immunogold labelling after resin embedding // Arch. Virol. 1990. - V. 114. - P. 53-64.

24. Bortolotto A., Casini L., Stanzani L.A. Dolphin mortality alone the Southern Italian coast // Aquatic Mammals, 1992

25. Buchhold C.J., Spehner D., Drillien R., Neubert W.J. and Homann H.E. The conserved N-terminal region of Sendai virus nucleocapsid protein NP is required for nucleocapsid assembly // J. Virol. 1993. - V. 67. - P. 5803-5812.

26. Cattaneo R., Rebmann G., Schmidt A., Altered transcription of a defective measles virus genome derived from a diseased human brain // EMBO J. 1987a. -V.6.-P. 681-688.

27. Cattaneo R., Rebmann G., Baczko K., Meulen V.Ter and Billeter M.A. Altered ratios of measles virus transcripts in diseased human brains // Virology. -1987b.-V. 160.-P. 523-526.

28. Cattaneo R., Kaelin K., Baczko K., Billeter M.A. Measle virus editting provides an additional cystein-rich protein // Cell. 1989. - V. 56. - P. 759-764.

29. Chomczynski P. and Sachi N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chioroform extraction // Anal. Biochem., 1987. -Vol. 162.-P. 156-159.

30. Costantini V., Loisy F., Joens L., Le Guyader F.S., Saif L.J. Human and animal enteric caliciviruses in oysters from different coastal regions of the United States// Appl Environ Microbiol. 2006 Mar;72(3): 1800-9,

31. Curren M.D., CTLoanD., Rima B.K., Kennedy S. Nucleotide sequence analysis of phocine distemper virus // Veterinary Record. 1990. - V. 127. - P.430-431.

32. Curran J., Boeck R. and Kolakofsky D. The Sendai virus P gene expresses both an essential protein and an inhibitor of RNA synthesis by shuffling modules via mRNA editing // EMBO J. -1991. V. 10. - P. 3079-3085.

33. Curran M.D. and Rima,В .К. The genes encoding the phospho- and matrix proteins of phocine distemper virus // J. Gen. Virol. 1992. - V. 73 (Pt 6). - P. 1587-1591

34. Curran J., Marq J.-B. and Kolakofsky D. The Sendai virus non-structural proteins specifically inhibit viral mRNA synthesis // Virol. 1992. - V. 189. - P. 647-656.

35. Curran J., Pelet T. and Kolakofsky D. An acidic activation-like domain of the P protein is required for RNA synthesis and encapsidation // Virology. 1994. - V. 202.-P. 875-884.

36. Curran J., Marq J.-B. and Kolakofsky D. An N-terminal domain of the Sendai paramyxovirus P protein acts as a chaperone for the NP protein during the nascent chain assembly step // J. Virol. 1995. - V. 69. - P. 849-855.

37. Deshpande K.L., Portner A. Monoclonal antibodies to the P protein of Sendai virus define its structure and role in transcription // Virology. 1985. - V. 140. - P. 125-134.

38. De Swart RL, Ross PS, Vedder LJ, Timmerman HH,Heisterkamp SH, Van Louveren H, Vos JG, Reijnders PJH, Osterhaus ADME. Impairment of immunefunction in harbor seals (Phoca vitulina) feeding on fish from polluted waters. Ambio 1994;23:155-9.

39. Dienstag J.L., Gust I.D., Lucas C.R., Wong D.C., Purcell R.H. Mussel-associated viral hepatitis, type A: serological confirmation// Lancet. 1976 Mar 13;l(7959):561-3.

40. Dietz R., Ansen C.T., Have P., Heide-Jorgensen M.P. Clue to seal epizootic? // Nature. 1989. - V. 338. - P. 627.

41. Domingo M., Ferrer L., Pumarola M., Marco A., Plana J., Kennedy S., McAliskey M., Rima B.K. Morbillivirus in dolphins // Nature. 1990. - V. 348. -P. 21.

42. Domingo M., Vilafranca M., Visa J., Prats N., Trudgett A., Visser I. Evidence for chronic morbillivirus infection in the Mediterranean striped dolphin (Stenella coeruleoalba) // Vet. Microbiology. 1995. - V. 44. - P. 229-239.

43. Duignan P.J., Saliki J.T., St. Aubin D.J., House J.A. and Geraci J.R. Neutralizing antibodies to phocine distemper virus in Atlantic Walruses (Odobenus rosmarus rosmarus) from Arctic Canada // J. Wildl. Dis. 1994. - V. 30. - P. 9094.

44. Duignan P.J., House C., Geraci J.R., Duffy N., Rima B.K., Walsh M.T., Early G., Aubin D.J., Sadove S., Koopman H., Rhinehart H. . Morbillivirus infection in cetaceans of the western Atlantic // Vet, Microbiology. 1995b. - V. 44. - P. 241249.

45. Eckert K.A., Kunkel T.A. High fidelity DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polimerase // Nucleic Acids Res. 1990.

46. Enriquez R., Frosner G.G., Hochstein-Mintzel V., Riedemann S., Reinhardt G.J. Accumulation and persistence of hepatitis A virus in mussels// Med Virol. 1992 Jul;37(3):174-9.Links

47. Forsyth MA, Kennedy S, Wilson S, Eybatov T, Barrett T. Canine distemper virus in a Caspian seal (Phoca caspica). Vet Rec 1998;143:662-4.

48. Francki R.I.B., Fauquet C.M., Knudson D.L., Brown F. (eds) Classification and nomenclature of viruses. Fifth report of the International Commitee on Taxonomy of Viruses // Arch. Virol. 1991. - Supple 2.

49. Franco E, Toti L, Gabrieli R, Croci L, De Medici D, Pana A. Depuration of Mytilus galloprovincialis experimentally contaminated with hepatitis A virus// Int J Food Microbiol. 1990 Dec;l l(3-4):321-7.Links

50. Gargadennec L. and Lalanne A. La peste des petits ruminants. Bulletin des services Zootechniques et des Epizootics de L'Afrique Occidentale Francaise. -1942. -V. 5. P. 16-21.

51. Goodhart C.B. Seal deaths // New Scientist. 1988a. - 29 Sep. - P. 101

52. Goodhart C.B. Did virus transfer from harp seal to common seal? // Nature. -1988b.-V. 336,3 Nov.-P. 101.

53. Haig D.A. Canine distemper-immunization with avianised virus Onderstepoort //J. Vet. Res. 1956. - V. 27. - P. 19-53.

54. Hall AJ, Duck CD, Law RJ, Allchin CR, Wilson S, Eybatov T. Environmental Pollution 1999;106:203-12.

55. Harder T.C., Moennig V., Greiser-Wilke I., Barrett Т., Liess B. Analysis of antigenic differences between sixteen phocine distemper virus isolates and other morbilliviruses // Arch. Virol. 1991. - V. 118. - P. 261-268.

56. Harder T.C., Renter M., Appel M.J.G., Roelke-Parker M.E., Barrett T. and Osterhaus A.D.M.E. Phylogenetic evidence of canine distemper virus in Serengeti's lions // Vaccine. 1995. - V. 13. - P. 521-523.

57. Harwood J. Lessons from the seal epidemic // New Scien. 1989. - V. 121. -P. 38-41.

58. Jenner E. (cited by Kirk H.) Canine distemper, its complications, sequalae and treatment. 1st Ed., Baillere, Tindall and Cox, London. 1922. - P. 1809.

59. Junean M.L. Famille des Paramyxoviridae // Can J. Med. Technol. 1991. — V. 53.-P. 169-173.

60. Jensen ., van de Bildt M., Dietz H.H., Andersen Т.Н., Hammer A.S., Kuiken Т., Osterhaus A. Another phocine distemper outbreak in Europe // Science 2002 -P.-209- 297.

61. Kamata H., Tsukiyama K., Sugiyama M., Kamata Y., Yoshikawa Y., and Yamanouchi K. Nucleotide sequence of cDNA to the rinderpest virus mRNA encoding the nucleocapsid protein // Virus Genes. 1991. - V. 5. - P. 5-15.

62. Kennedy S., Smyth J.A., Cush P.F., McCullough S.J., Allan G.M., McQuaid S. Viral distemper now found in porpoise // Nature, London. 1988. - V. 336. - P. 21

63. Kennedy S., Kuiken Т., Jepson P., Diaville R. Mass Die-Off of Caspian Seals Caused by Canine Distemper Virus // Emrging Infections Diseases-2000-V6-P.637-639

64. Kingsley D.H., Richards G.P., Persistence of hepatitis A virus in oysters// J Food Prot. 2003 Feb;66(2):331-4.

65. Mahy B.W.J., Barrett Т., Evans S. et al. Characterization of seal morbillivirus //Nature. 1988. - V.336. - P. 115.

66. Mamaev L.V., Visser I.K.G., Belikov S.I., Denikina N.N., Harder Т., Goatley L., Rima В., Edginton В., Osterhaus A.D.M.E., Barrett T. Canine distemper virus in Lake Baikal seals (Phoca sibirica) // Veterinary Record. 1996. - V. 138. - P. 437-439.

67. Mcllhatton M.A., Curran M.D. and Rima B.K. Nucleotide sequence analysis of the large (L) genes of phocine and canine distemper virus (corrected sequence) // J. Gen. Virol. In press

68. McNeill W.H. In: Plagues and peoples: a naturai history of infectious disease // Garden City, New York: Anchor Press, Doubleday. 1976 - P. 66-69.

69. Muller G., Wohlsein P., Beineke A., Haas L., Greiser-Wilke I., Siebert U., Fonfara S., Harder Т., Stede M., Gruber D.A., Baumgartner W. Phocine distemper in german seals, 2002 // Emerging Infection Deseases, 2004-V.10-P.723-725

70. Ng T.L., Chan P.P., Phua Т.Н., Loh J.P., Yip R., Wong C., Liaw C.W., Tan B.H., Chiew K.T., Chua В., Lim S., Ooi P.L., Chew S.K., Goh K.T. Oyster-associated outbreaks of Norovirus gastroenteritis in Singapore // J Infect. 2005 Dec;51(5):413-8.

71. Norrby E., Utter G., Orvell C., Appel M.J.G. Protection against canine distemper virus in dogs after immunization with isolated fusion protein // J. Virol., 1986-V. 58. P. 536-541.

72. Osterhaus, A.D.M.E., Yang, H., Spijkers H.E.M., Groen, J., Teppema, J.S.,

73. Steenis, G. The isolation and partial characterization of a highly pathogenic herpesvirus from the harbor seal (Phoca vitulina). II Arch. Virol. 1985. - V. 86 -P. 239-251.

74. Osterhaus A.D.M.E. Seal death // Nature. 1988a. - V. 334. - P. 301-302.

75. Osterhaus A.D.M.E. Identification of virus causing resent seal deaths // Nature- 1988b.-V. 335.-P. 20.

76. Osterhaus A.D.M.E., Groen J., Vries P.D., Uytdehaag F.G.C.M., UytdeHaag F.G.C.M., Klingeborn В., Zarnke R. Distemper virus in seals // Nature 1988c. -V.335.-P. 403-404.

77. Osterhaus A.D.M.E., Groen J., Uytdehaag F.G.C.M, Visser I.K.G. Morbillivirus infections in European seals before 1988. // Veterinary Record. -1989b.-V. 125,No326.-P. 56.

78. Osterhaus A.D.M.E., Broeders H.W.J., Groen J. et.al. Different morbilliviruses in European and Siberien seals // Veterinary Record. 1989c. - V. 125. - P. 647-648.

79. Osterhaus A.D.M.E., Groen J., Spiykers H.E.M. et al. Mass mortality in seals caused newly discovered virus-like morbillivirus // J. Vet. Microbiol. 1990. - V. 23.-P. 343-350.

80. Osterhaus A.D.M.E., Visser I.K.G., De Swart R.L. et al. Morbillivirus threat to Mediterranean monk seals? //Vet. Rec. 1992. - V. 130. - P. 141-142.

81. Osterhaus A.D.M.E., de Swart R.L., Vos H. W., Ross P.S., Kenter M.J.H., Barrett T. Morbillivirus infections of aquatic mammals: newly identified members of the genus // Vet. Microbiology. 1995. - V. 44. - P. 219-227.

82. Peeples M.E. Paramyxovirus M proteins: Pulling it all together and taking it on the road. In: Kingsbury D.W. (Eds.) The paramyxoviruses, Plenum press: New York.-1991.-P. 427-456.

83. Rice D.W. and Scheffer V.B. A list of the marinr mammals of the world. US Fish, and Wildlife Service. Spec. Scient. Report Fischeries N 579, W.D.C., 1968

84. Richardson C.D., Scheid A., Choppin P.W. Specific inhibition of paramyxovirus replication by oligoprptides with amino acid sequences similar to those at the N-termini of the F1 or HA2 viral polypeptides // Virilogy. 1980. - V. 105.-P. 205-222.

85. Rima B.K. The proteins of morbilliviruses // J. Gen. Virol. 1983 - V. 64. -P. 1205-1219.

86. Robert T. Dillon J.R. The ecology of freshwater mollusks// Cambridge university press. 2000 - P. 522.

87. Rockborn G. Canine distemper virus in tissue culture // Arch. Ges. Virusforsch 1958. - V. 8. - P. 485-492.

88. Ross P.S., Visser I.K.G., Broeders H.W.J., van de Bildt M.W.G., Bowen W.D. and Osterhaus A.D.M.E. Antibodies to phocine distemper virus in Canadian seals // Vet. Rec. 1992. - V. 130. - P.514-516.

89. Rozenblatt S., Eizenberg O., Ben-levy R., et al Sequence homology within the morbilliviruses // J. Virol. -1985. V. 53,2. - P. 684-690.

90. Rima B.K. The proteins of morbilliviruses // J. gen. Virol. 1983. - V. 64. -P. 1205-1219.

91. Saito K, Sato N, Takahashi A, Tsutsumi R, Sato S. Study on pollutant pathway of norovirus contamination in oysters// Kansenshogaku Zasshi. 2006 Jul;80(4)-P.399-404.

92. Sambrook J., Fritch E.F., Maniatis T. Molecular cloning a laboratory manual // NY: Gold Spring Harbor Lab. Press, 1989.

93. Shesberadaran H., Norrby E., McCullough K.C. et al. The antigenic relationship between measles, canine distemper and rinderpest virus studied with monoclonal antibodies // J. Gen Virol. 1986. - V. 67. - P. 1381-1392.

94. Stettler M., Zurbriggen A. Nucleotide and deduced amino acid sequences of the nucleocapsid protein of the virulent A75/17-CDV strain of canine distemper virus // Vet. Microbiology. 1995. - V. 44. - P. 211-217.

95. Svansson V., Blixenkrone-Moller M., Skirnisson K., Have P., Heje N.-I., Nielsen J., Lund E. Infection studies with canine distemper virus in harbour seals // Arch Virol. 1993.-V. 131.-P. 349-359.

96. Thompson, P.M., Thompson, H. & Hall, A.J. (2002). Prevalence of morbillivirus antibodies in Scottish harbour seals. Veterinary Record, 151, 609610.

97. Van Blessem M.F., Visser I.K.G., van de Bildt M.W.G. Teppema J.S., Raga J.A., Osterhaus A.D.M.E. Morbillivirus infection in Mediterranean striped dolphins (Stennella coeruleoalba) // Vet. Rec. -1991. V. 129. - P. 471-472.

98. Van Blessem M.F., Visser I.K.G., De Swart R.L., Orvell C., Stanzani L., Androukaki E., Siakavara K., Osterhaus A.D.M.E. Dolphin morbillivirus infection in different parts of the Mediterranean Sea // Arch Virol. 1993. - V. 129. - P. 235-242

99. Vandevelde M. and Zurbriggen A. The neurobiology of canine distemper virus infection // Vet. Microbiol. 1995. - V. 44. - P. 271-280.

100. Visser I.K.G., Van Blessem M.-F., Barrett Т., Osterhaus A.D.M.E. Morbillivurus infections in aquatic mammals //Vet. Res. 1993c. - V. 24. - P. 169-178.

101. Wardrop E.A., Briedis D.I. Characterization of V Protein in Measlse virus-infected cells // Virology. 1991, July. - P. 3421-3428.

102. Wild T.F., Malvoisin E., Buckland R. Measles virus: Both the gaemagglutinine and fusion glycoproteins are required for fusion // J. Gen. Virol. -1991.-V. 72.-P. 439-442.

103. Wild T.F., Naniche D., Rabourdin-Combe C., Gerlier d., Malvoisin E., Lecouturier V., Buckland R. Mode of entry of morbilliviruses // Vet. Microbiol. -1995.-V. 44.-P. 267-270.

104. Wilkinson L. Rinderpest and mainstream infectious disease concepts in the eighteenth century // Medical History. 1984. - V. 28. - P. 129-150.

105. Yu M., Hansson E., Shiell В., Michalski W., Eaton B.T., Wang L.F. Sequence analysis of the Hendra virus nucleoprotein gene: comparison with other members of the subfamily Paramyxovirinae // J Gen Virol. 19986, Jul. - V. 79, Pt 7. - P. 1775-80.