Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммуноцитохимическое и патоморфологическое исследование морбилливирусной инфекции у байкальских тюленей (PHOCA SIBIRICA)

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Иммуноцитохимическое и патоморфологическое исследование морбилливирусной инфекции у байкальских тюленей (PHOCA SIBIRICA)"

На правах рукописи

Белых Ольга Ивановна

ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКОЕ И ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

МОРБИЛЛИВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У БАЙКАЛЬСКИХ ТЮЛЕНЕЙ (РНОСА Б1ВШ1СА)

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово, 1996

Работа выполнена в Лимнологическом институте СО РАН, г. Иркутск

Научный руководитель:

член-корр.РАН, доктор химических наук М.А. Грачев

Научный консультант:

кандидат медицинских наук О.А. Гольдберг

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук А. Н.Сергеев

кандидат биологических наук Е.И.Рябчикова

Ведущее учреждение:

Иркутский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии ВСНЦ СО РАМН

Защита состоится "Л / " 1996г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 074.20.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии "Вектор" по адресу: 633159, Новосибирская обл., п. Кольцове, ГНЦ "Вектор"

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ "Вектор".

Автореферат разослан и-осЦ- 1996г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Т.Н.Шубина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Осенью 1987 г. на Байкале произошла массовая гибель тюленей (Phoca sibirica Gmel., байкальская нерпа). Погибло около 6,5 тысяч животных из общего числа 70 тысяч; ранее эпизоотии у байкальских тюленей не были зарегистрированы. Клиническая картина болезни нерп и характер распространения заболевания указывали на то, что популяция байкальских тюленей подверглась воздействию инфекционного агента, вероятно, вируса чумы плотоядных (род Morbillivirus, сем-во Paramyxoviridae).

К началу 1988 г. с помощью метода олигонуклеотидного зондирования было установлено, что в органах погибших нерп присутствует вирусспецифическая РНК, имеющая как консервативные морбилливирусные последовательности, так и последовательности собственно вируса чумы плотоядных; сыворотки крови исследованных животных содержали антитела к морбилливирусам (Grachev et al., 1988).

Род Morbillivirus включает в себя 4 вида: вирус кори, вирусы чумы плотоядных, чумы крупного рогатого скота и чумы мелких жвачных животных. Ранее было показано, что морбилливирусы имеют тенденцию инфицировать более чем один вид, род и даже семейство животных (Taber, Pease, 1989). Так, вирус чумы плотоядных поражает 8 из 11 семейств отряда хищных (Carnivora), прежде всего, это волчьи, медвежьи, кошачьи, куньи (Hewicker et al., 1990). К началу настоящего исследования не было известно о восприимчивости к морбиллишфусам не только байкальских тюленей, но и других представителей отряда ластоногих (Pinnipedia).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось выявление морбилливирусных антигенов и морфологических изменений в тканях и органах байкальских тюленей (Phoca sibirica), погибших во время эпизоотии 1987/88 годов.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Локализовать морбилливирусные антигены в клетках, тканях и органах больных животных с помощью моноклональных антител против вируса кори и вируса чумы обыкновенных тюленей.

2. Локализовать бедки вируса чумы байкальских тюленей in situ, используя для этого моноклональные антитела против N-, Р- и F- белков вируса чумы обыкновенных тюленей.

3. Исследовать морфологические изменения внутренних органов байкальских тюленей при морбилливирусной инфекции.

Научная новизна работы. Впервые для изучения природной инфекции тюленей использованы иммуно- и электронномикроскопические методы.

Впервые у тюленей локализованы морбилливирусные антигены в цитоплазме и в ядрах макроглии, гепагоцитов, клеток эпителия извитых канальцев почек, бронхов и бронхиол, в лимфоцитах и ретикулярных клетках селезенки. Выявлена преимущественная локализация морбиляивирусных антигенов в лимфоидной ткани. В данной работе показано, что морбилливирусы поражают представителей отряда ластоногих (байкальская нерпа), вызывая целый ряд патологических изменений органов и тканей. Впервые проведена морфологическая и иммуноцитохимическая оценка патологии органов и тканей байкальских тюленей, которая позволила представить целостную картину морбюшивирусного заболевания. Показано, что патоморфологическую картину болезни нерп определяет поражение головного и спшшого мозга, легких, печени, селезенки, лимфатических узлов, тимуса. При этом патоморфологические изменения при морбилливирусной инфекции у байкальских нерп не являются высокоспецифическими. Установлено, что патологические изменения тканей и органов тюленей приморбилливирусной инфекции в основных чертах сходны с таковыми при чуме плотоядных. В тоже время у нерп выявлены отличия: отсутствие воспаления в мозжечке, мозговых оболочках и эпендиме, наличие у них воспалительных инфильтратов в печени, дистрофических и некр о биотических изменений в гепатоцитах.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в данной работе доказательства причины массовой гибели байкальских тюленей в 1987/88 годах показали возможность циркуляции морбилливирусов среди ластоногих, что имеет важное теоретическое и практическое значение. Полученные морфологические данные позволяют детализировать картину морбилливирусной инфекции у млекопитающих и значительно расширяют существующие сведения о морфологическом строениитканейи органов нерп.

Использованные в работе методы иммуноэлектронной микроскопии являются перспективными для быстрой диагностики вирусных инфекцнй в природных популяциях и могут быть полезны для мониторинга ластоногих. Эти методы позволили в относительно короткий срок показать наличие вируса в организме больных животныхи одновременно выявить его природу, а с помощью моноклональных антител против белков вируса кори и вируса чумы обыкновенных тюленей определить локализацию вирусных белков. В случае диагностики вирусных заболеваний животных, как показали проведенные исследования, предпочтительнее использовать технику постэмбидингового мечения, которая является менее трудоемкой и более информативной.

Работа выполнена в рамках комплексной программы "Функцио-

нитрование, охрана и рациональное использование байкальской нерпы", 1988-90 гг., шифр 01860102050.

Апробация работы. Результаты исследования были доложены и обсуждены на Первой Верещагинской байкальской международной конференции (Иркутск, 1989 г.), на IV совещании "Криогенные и аналитические методы в электронной микроскопии" (Пущино, 1989), на конференции "Актуальные проблемы биологии" (Иркутск, 1994), на заседании отдела молекулярной биологии Лимнологического института СО РАН (Иркутск, 1994).

Публикация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, 2 работы находятся в печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 168 страницах машинописного текста, включая 114 рисунков. Библиографический указатель содержит 166 литературных источников. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, изложения результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, приложения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для световой и электронной микроскопии был использован материал от 36 байкальских тюленей разного возраста и пола, весом от 12 до 67 кг. Из них 2нерпы были найдены мертвыми на побережье Байкала зимой 198788 гг., при наружном осмотре у них отмечены конъюнктивит, поражения кожи (№№304, 306); 4 тюленя погибли в аквариуме с клиническими признаками чумы плотоядных (нерпы №№308, 309, 310, 312) в октябре-декабре 1988 г. Другая часть материала была взята от внешне здоровых животных: отловленных с помощью сетей в октябре 1988 г. (№311) и в апреле 1989 г. (№321) и добытых во время промысловой охоты (28 нерп, номера выборочно с 404 по 486) весной-летом 1989 г.

Для приготовления гистологических препаратов образцы органов (головной мозг, легкие, печень, почки, селезенка, лимфатические узлы, тимус; в некоторых случаях забран язьж, пищевод, трахея, желудок, кишечник) фиксировали в 10% нейтральном формалине. После фиксации образцы обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, заключали в парафин и микротомировали. Полученные срезы окрашивали гематоксилином и эозином, азурП и эозином, основным фуксином по Павловскому.

В случае электронной микроскопии материал фиксировали в 4% параформена 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) или в 2,0%глутаральдегиде на 0,2 М какодилатном буфере (рН 7,4) 1 час при 4° С. Далее проводили

постфиксацию 1% р-м 0s04 на 0,1 М фосфатном или 0,2 М какодилатном буферах в течение 12 часов при той же температуре. После фиксации и дегидратации исследуемые образцы заливали в эпои-аралдит и получали ультратонкие срезы.

Материал для иммуноэлектронной микроскопии (ИЭМ) (головной мозг, легкие, печень, почки, селезенка) был забран от 6 нерп (№№308-312, 321). В качестве положительного контроля использовали образцы органов собаки, павшей от чумы плотоядных. Образцы органов нерп и собаки фиксировали в смеси двух фиксаторов: 4% параформ и 0,4% глутаральдегид иа 0,1 М фосфатном буфере.

После фиксации материал подвергали пре- и постэмбидингу с использованием моноклональных антител (МКАТ) и комплекса белок А-коллоидное золото.

Моноклоналъные антитела ВК-228 получены к белку N (нуклеокапсидаый) вируса кори (штамм Ленинград-16), МКАТ LEC-27 - к белку Н (гемагглютшшн, белок оболочки) вируса кори, выделенному от пациента с подострым склерозирующим панэнцефалитом. Оба МКАТ получены в институте вирусных препаратов (г. Москва) Ф.Г. Нагаевой. ВК-228 и LEC-27 реагировали в иммунофсрмаггном анализе с клетками Yero, инфицированными вирусом чумы плотоядных либо вирусом кори. МКАТ против N- (нуклеокапсидный), Р- (фосфобелок), и F- (белок слияния, оболочечный) белков вируса чумы обыкновенных тюленей были любезно предоставлены А. Остерхаузом из Ин-та здравоохранения и защиты окружающей среды (г. Билтховен, Нидерланды). Комплекс белок А-коллоидное золото был приготовлен предприятием "Биос" (г. Новосибирск) с размером частиц золота около 15 нм.

При преэмбщщинговом мечении вирусных антигенов (инкубирование с МКАТ и комплексом белок A-коллоидное золото до заливки в эпоксидные смолы) фиксированные образцы криоультрамикротомировали. В качестве криопротектора использовали 2,0 М р-р сахарозы па 0,2 М фосфатном буфере (pH 7,4), в котором исследуемый материал выдерживался в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем его прикрепляли гелем из метилцеллюлозы к держателям и переносили в криоультратом "Sandoz" с t - (10° -15°) С. Полутонкие срезы толщиной 15-20 мкм помещали в лунки плат для мшеротитрования, в которых содержался lOG-буфер (0,01 М трис-НС1,рН 8,0; 0,15 MNaCl; 0,05%твин-20; 0,1% овальбумин). Далее добавляли р-р МКАТ в концентрациях 0,135-1,35 мкг/мл ВК-228 и 0,16-1,6 мкг/мл LEC-27. Инкубировали при 4° С в течение 12 часов, после чего добавляли белок A-коллоидное золото (1/20 от объема) в концентрации 11,1 мкг/мл. После часовой инкубации при комнатной температуре полутонкие срезы

обезвоживали по стандартной методике и заливали в эпон-аралдит.

При проведений постэмбидинга (инкубирование с МКАТ и комплексом белок А-коллоидное золото после заливки в эпоксидные смолы и приготовления ультратонких срезов) образцы органов, фиксированные вышеописанным способом, заключали в эпон-аралдит и получали ультратонкие срезы. Сетки со срезами помещали на каплю р-ра, содержащую 1 OG-буфер и один из р-ров МКАТ: ВК-228 и LEC-27 в тех же концентрациях, как и при преэмбидинге; р-р МКАТ против N-, Р-, F-белков вируса чумы обыкновенных тюленей в концентрациях 0,125-1,25 мкг/мл. Далее инкубировали с комплексом белок А-коллоидное золото.

При пре- и постэмбидинге ставили контроль на неспецифическое связывание комплекса белок А-коллоидное золото (без обработки МКАТ).

Контрастирование ультратошшх срезов проводилось как при ИЭМ, так и при ЭМ с помощью урашглацетата и цитрата свинца, после чего препараты наблюдали в электронный микроскоп "Philips ЕМ-410" при ускоряющем напряжении 60 kV.

Статистическая обработка экспериментальных данных осуществлялась с помощью программы STATGRAF 1.2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Морбилливирусные антигены в клетках, тканяхи органах байкальских

тюленей

Локализация вирусных антигенов с помощью противокоревых моноклональных антител. Были использованы моноклональные антитела ВК-228 против N-белка вируса кори и LEC-27 против Н-белка вируса кори, выделенного от пациента с подострым склерозиругощим пагощефа литом. При электронной микроскопии ультратонких срезов головного мозга, легких, печени, почек, селезенки исследуемых животных, меченных противокоревыми моноклональными антителами и комплексом белок А-коллоидное золото, наблюдали морбилливирусные антигены в виде кластеров высококонтрастных частиц золота. Скопления частиц коллоидного золота были выявлены в клетках макроглии, в гепатоцитах, в эпителии бронхов, бронхиол, почечных канальцев, в лимфоцитах и ретикулярных клетках селезенки нерп №№308-312. У нерпы №321 морбилливирусные антигены не были обнаружены. В контрольных препаратах, где противокоревые моноклональные антитела и комплекс белок А-коллоидное золото были нанесены на угольную пленку, отмечали лишь отдельные частицы золота.

С помощью МКАТ ВК-228 против N-белка удалось выявить

морбилливирусные антигены в ядрах клеток исследуемых органов. Цитоплазматическая локализация морбилливирусных антигенов была проведена также с помощью МКАТ ВК-228 и LEC-27. Используя МКАТ ВК-228 были обнаружены крупные скопления частиц коллоидного золота (40-200 штук) в цитоплазме клеток печени, почек, селезенки нерп. В отдельных случаях в клетаах, меченных МКАТ ВК-228, в одном поле зрения отмечали по два-три скопления частиц коллоидного золота при рабочем увеличении х21500. Подобные групповые скопления золота были локализованы на ультратонких срезах печени собаки при таком же увеличении, используя МКАТ ВК-228 и технику преэмбидинга.

При исследовании ультратонких срезов печени, почек, селезенки нерп наблюдали вирусоподобные частицы, меченные МКАТ ВК-228, МКАТ LEC-27 и коллоидным золотом. Размер частиц составил 110-140 им. Меченные МКАТ ВК-228 и LEC-27 вирусоподобные частицы такого жеразмера были обнаружены в печени и почках собаки, погибшей от чумы плотоядных.

Сравнивая реакции МКАТ ВК-228 и МКАТ LEC-27 с вирусом чумы байкальских ттоленей (PDV-2), следует отметить более слабую реакцию последних антител. Скопления частиц коллоидного золота в цитоплазме клеток, меченных МКАТ LEC-27, отмечались значительно реже, чем таковые при мечении МКАТ ВК-228. Эти наблюдения согласуются с данными Ф.Г. Нашевой, которая показала, что МКАТ LEC-27 реагировали в иммуноферментном анализ ев наибольшей степени с вирусом кори и слабо с вирусом чумы плотоядных. В отличие от МКАТ LEC-27, МКАТ ВК-228 реагировали одинаково хорошо с клетками Vero, инфицированными как вирусомкори, таки с Vero, зараженными вакцинным штаммом вируса чумы плотоядных.

Локализация морбилливирусных антигенов в тканях и органах нерп с помощью моноклональных антител против белков вируса чумы обыкновенных тюленей. В апреле 1988 г., спустя полгода после начала эпизоотии у байкальских нерп, в Северном и Балтийском морях наблюдалась массовая гибель обыкновенных тюленей (Ph. vitulina) в результате морбилливирусной инфекции (Osterhaus, Vedder, 1988). В 19881991 гг. морбилливирусная инфекция была отмечена у морских свиней (Kennedy et al., 1988) и дельфинов (Domingo et al., 1990). Мы использовали моноклональные антитела против N- , Р- и F- белков вируса чумы обыкновенных тюленей (phocine distemper virus, PDV-1) для выявления подобных белков PDV-2 в печени, почках, селезенке нерп №№308, 309. При электронной микроскопии этих органов наблюдали ядерную и цитоплазматическую локализацию вирусных антигенов. В ядрах клеток исследуемых органов морбилливирусные антигены были выявлены с

помощью МКАТ против N-белка PDV-1.

Помимо внутриядерного отложения частиц коллоидного золота при мечении ультратонких срезов МКАТ против N-белка PDV-1 были отмечены скопления частиц золота в цитоплазме. В последнем случае такие скопления наблюдали значительно чаще. N-белковая метка была диффузно распределена по всей поверхности цитоплазмы, попавшей в плоскость среза.

Используя МКАТ против Р- и F- белков PDV-2, удалось выявить цитоплазматическую локализацию этих белков. Сравнивая характер распределения Р- и F- белковой метки в цитоплазме клеток, мы не смогли достоверно определить какое-либо предпочтительное отложение частиц коллоидного золота как в отношении Р-белка, так и в отношении F-белка. Лишь в нескольких случаях были отмечены скопления частиц золота, выявляющие Р-белок, непосредственно около ядра, а F-белок вблизи плазматической мембраны. Кроме того, было обнаружено, что F-белковая метка находится в составе вирусоподобных частиц.

Морбилливирусные антигены были локализованы во всех исследованных органах нерп, тем самым было показано, что вирус чумы байкальских тюленей имеет в организме больных животных широкий спектр распределения. Подобное явление характерно для морбилливирусов, они инфицируют широкий ряд тканей и органов (Taber, Pease, 1989). Как оказалось позднее, свойственно это н для морбилливирусов других ластоногих и китообразных (Bergman et al., 1990; Kennedy et al., 1991).

Нами показано, что локализация морбилливирусных белков с помощью противокоревых МКАТ и МКАТ против N-, Р- белков вируса чумы обыкновенных тюленей наиболее успешно проходила в лимфоцитах и ретикулярных клетках селезенки нерп. Изучая срезы печени, меченные противокоревыми МКАТ и МКАТ против PDV-1, можно было отметить достоверно меньшее число скоплений частиц коллоидного золота в гепатоцитах, чем в клетках селезенки. Результаты олигонуклеотидного зондирования также продемонстрировали, что зонды связываются в наибольшей степаш с РНК из селезенки и печени инфицированных нерп (Мамаев и др., 1992). У обыкновенных тюленей в печени лишь изредка была отмечена специфическая флюоресценция, а в почках морбилливирусные антигены не были найдены (Hofmeister et al., 1988). У байкальских тюленей, как показали данные ИЭМ, вирусные антигены в почках наблюдаются в эпителиальных клетках канальцев проксимального и дистального отделов нефрона. В легких морбилливирусные антигены были локализованы в бронхиальном и бронхиолярном эпителии и на базальной мембране слизистой бронхов. У нерп в почках и легких морбилливирусные антигены быливыявленыв меньшем количестве по сравнению спеченью, достоверного

различия в имммуномечении между почками и легкими не обнаружено. В головном мозгу нерп скопления частиц коллоидного золота наблюдали в клетках макроглии, иммуномечение здесь шло не столь интенсивно как в других исследуемых органах.

Таким образом, морбилливирусные антигены в организме больных нерп обнаружены в головном мозгу, легких, печени, ночках, селезенке; вирус чумы байкальских тюленей проявляет политропные свойства, размножаясь в лимфоидной (лимфоциты, ретикулярные клетки), эпителиальной (гепатоциты, эпителиальные клетки бронхов, бронхиол, почечных канальцев) и нервной (макроглия) тканях.

2. Морфологические проявления морбилливирусной инфекции у

байкальских тюленей

При микроскопическом исследовании головного и спинного мозга, легких, печени, почек, селезенки, лимфатических узлов, тимуса байкальских нерп выявлен целый ряд патоморфологических изменений. Патоморфологические изменения морбилливирусной природы с учетом результатов иммуноэлектронной микроскопии, олигонуклеотидного зондирования (Grachev et al., 1989) и серологического изучения сывороток крови исследуемых нами нерп (Grachev et al., 1989; Зоринидр., 1989; Титенко и др., 1992) выявлены у всех 6-ти нерп, погибших с клиническими признаками морбилливирусной инфекции №№304, 306, 308-310, 312 (табл.1), у отловленной с помощью сетей нерпы №311 (табл.1) и у 14 нерп, добытых во время промысловой охоты (табл. 2). В таблице 3 представлена патология органов нерп, не имеющих признаков морбилливирусной инфекции (отсутствие клинических симптомов болезни, специфических патоморфологических изменений, антител в крови).

Таким образом, из представленнных данных следует, что у 21 из 36 нерп была морбилливирусная инфекция. Очевидно, количество больных нерп является несколько завышенным для популяции в целом, т.к. во время промысловой охоты преимущественно отстреливаются ослабленные животные.

Головной мозг. При гист ологическом изучении головного мозга у 5 нерп (№№308, 312 погиблив аквариуме, №№446,451,480 отстреляны во время промысловой охоты; у всех перечисленных животных в крови присутствовали антитела к CDV, табл. 1, 2) был выявлен энцефалит с периваскулярной локализацией воспалительных инфильтратов. Последние наблюдали в белом веществе больших полушарий, между ядрами в продолговатом и среднем мозгу, близ стенок желудочков, в редких случаях на границе серого и белого веществ (№446). Энцефалит с периваскулярной

Таблица 1. Патология органов байкальских тюленей в периоде декабря 1987г. по ноябрь 1988г. В печении селезенке этих тюленей выявлена РНК морбилливирусов, в крови присутствовали антитела к морбилливирусам (Grachev et al., 1989).

№п/п 1 2 3 4 5 б 7

№ нерп 304 306 308 309 310 311 312

Особенности Найдена Найдена Погибла в Погибла в Погибла в Поймана Поймана

гибели мертвой мертвой аквариуме аквариуме аквариуме сетями сетями

животных на 6epeiy на берегу

Возраст, год 5 9 5 6 7 7 6

Вес, кг 54 36 35 43 70 67 43

Пол ? С 9 ? сг СГ СГ

Время забора материала Дек. 87 Дек. 87 О кг. 88 Окт. 88 Нояб. 88 Окт. 88 Нояб. 88

Клинические симптомы + + + + + - +

Энцефалит - - + - - - +

Бронхит + + + + + + -

Пневмония - + - + - - -

Гепатит - - - 4- - - +

Гиперплазия

фолликулов - - + + - - +

селезенки

Истощение

белой пульпы - - - - - - +

селезенки

Гиперплазия

фолликулов лимфатических + + + + + + +

узлов

Истощение В-

зоны лимфати- - - + - - +

ческих. узлов

Антитела к

вирусу чумы плотоядных в ВД НД + + + + +

крови

Мор биллив яру- мозг, мозг, мозг, мозг, мозг,

сные антигены легкие, легкие, легкие, легкие, легкие,

выявлены с нд НД печень, печень, печень, печень, печень,

помощью ИЭМ почки, почки, почки, почки, почки,

в органах: селезенка селезенка селезенка селезенка селезенка

вд - нет данных

инфильтрацией выявили у двух №№308, 312 из 5 нерп, имеющих морбилливирусные антигены в головном мозгу (табл. 1). Мелкоочаговые воспалительные инфильтраты располагались одиночно по ходу мелких и средних сосудов и состояли преимущественно из мононуклеарных клеток; плазматические клетки отмечались в меньшем количестве. К периферии состав инфильтрата постепенно менялся за счет пролифериругощих клеток микроглии. Помимо периваскулярной инфильтрации, гистологическая картина при остром энцефалите характеризовалась сосудистыми изменениями. Наблюдалось выраженное полнокровие и расширение сосудов, периваскулярные кровоизлияния, сладжирование эритроцитов, тромбоз мелкихи средних сосудов. Во всех случаях энцефалита отмечали отекмозга. Патогистологические изменения характерные для энцефалита с периваскулярной локализацией воспалительных инфильтратов были более выражены у нерп №№312, 446, 480, в меньшей степени у нерп №№308, 451.

Локализация инфильтратов вдоль сосудов и выраженные при этом явления периваскулярного отека указывают на гематогенное происхождение воспалительных процессов. Отмечаемые при световой и электронной микроскопии мозга нерп явления периваскулярного и перицеллюлярного отека свидетельствуют о повышенной проницаемости гематоэнцефалитического барьера, что, вероятно, способствует проникновению вируса в нервную ткань.

У 3 нерп (№№446,451,480) в белом веществе головного мозга набшодали немногочисленные очаги демиелинизащш, которые локализовались вокруг сосудов и характеризовались присутствием микроглии и мононуклеаров. При электронной микроскопии головного мозга у этих животных отмечались дегенеративные изменения олигодендроцитов.

Унерп№№308,312нарядусэнцефалитомбыл выявлен энцефаломиелит. У остальных животных с энцефалитом аутопсии спинного мозга отсутствовали, в тех же случаях, когда спинной мозг был взят для исследования у больных нерп (№№407, 471, 473), энцефаломиелит не был обнаружен. Патоморфологическая картина спинного мозга при энцефаломиелите характеризовалась наличием мелкоочаговых воспалительных инфильтратов вокруг сосудов и сосудистой патологией.

У 4-х нерп (№№435, 437, 453,486), отстрелянных во время промысловой охоты весной-летом 1989 г. (табл. 2), обнаружили энцефалит с локализацией воспалительных инфильтратов в су б эпендим ар ной зоне боковых желудочков. Инфильтраты были представлены клетками микроглии, клетки эпендимы не были вовлечены в воспалительный процесс. Выявлены как мелкоочаговые скопления микроглии, так и расположение клеток микроглии на всем протяжении эпендимы.

Таблица 2. Патология органов байкальских нояеней, добытых во время промысловой охоты в апреле-июне 1989г. В крови этих тюленей присутствуют ашттгелак морбилливирусам по дшзгым В Л. Зоринас соавт. (1989), A.M. Тигенко с соавг. (1992).

№п/п, ЛЪнерп, возраст (год), вес (кг), пол

Органы Патология 1 404 2 24 2 405 3 43 3 406 3 35 4 407 1 12 5 431 1 16 б 435 3 26 7 436 2 26 8 437 1 23 9 446 5 47 10 451 15 51 И 453 35 60 12 472 1 19 13 480 4 43 14 486 1 11

СГ СГ СГ ? СГ СГ СГ СГ СГ сГ СГ СГ СГ СГ

Мозг: - энцефалит - + - - - + - + + + + - + +

Легкие: - бронхот - пневмония - нематоды + + + - - + + + + + - + + + + + + + + ; - -

Печень: -гепагат + + + + + - - - + - + + - -

Селезенка: - гиперплазия лимфатических фолликулов + т + т - - - + ВД + ВД - ВД +

- исгощзшге белой пульпы + вд + вд - + нд - вд - вд +

Лимфатические - гиперплазия лимфатических фолликулов + + - + - + + + + + + + + +

узлы: - истощдше В-зоны + + + + + + +

Тимус: - акцвдентальная - -вд- - - - + + + __инволюция_ _

вд - нет данных

Поражение нейронов на всех уровнях мозга при энцефалите и энцефаломиелите были выражены не резко. Наблюдали умеренное набухание нейронов IV и V слоев коры больших полушарий, спинного и продолговатого мозга, в области ретикулярной формации. Отмечали незначительные дистрофические изменения нейронов.

Известно, что при чуме плотоядных энцефалит развшается, прежде всего, в результате непосредственного поражения нейронов, макро- и микроглии, мешшгиальных и эпендимальных клеток (Appel, 1969; 1981). По данным многих авторов энцефалит является патогномоничным признаком чумы плотоядных у собак (Gibson, 1965; Appel, 1969; Julb, Kennedy, 1970). В нашем случае энцефалит был выявлен у 9 из 21 больной нерпы. Несмотря на наличие морбилливирусных антигенов и антител к CDV у нерп (№№309, 310) не удалось выявить в мозгу этих животных морфологические изменения характерные для энцефалита. По нашим данным, энцефалит не является столь высоко специфичным признаком морбилливирусной инфекции у байкальских тюленей в отличие от такового у собак при чуме плотоядных. Кроме того, при энцефалите и энцефаломиелите у нерп мозговые оболочки, мозжечок, эпендима не были вовлечены в воспалительный процесс.

Печень. При микроскопическом изучении печеш! байкальских тюленей выявили воспалительную инфильтрацию стромы, дистрофические и некр обиотические изменения гепатоцитов. П одобные пагоги сл о л отческие изменения в печени характерны для гепатита. Воспаление печени - гепатит наблюдали у двух нерп, погибших в аквариуме с клинической картиной чумы плотоядных и имеющих морбилливирусные ан тигены в печени (№309 и №312; табл. 1) и у 8 отстрелянных нерп (№№404, 405, 406, 407, 431, 446, 453, 472; табл. 2), в целом, у 10 из 21 больной нерпы. Сыворотки крови всех жив отных с гепатитом содержали антитела к вирусу чумы плотоядных. Воспалительные инфильтраты были обнаружены преимущественно внутри долек. С помощью электронной микроскопии был показан клеточный состав инфильтратов: лимфоциты, сегментоядерные лейкоциты, макрофаги. Кровеносные сосуды при гепатите были расширены, полнокровны, содержали большое количество лейкоцитов. Отмечались как незначительные изменения гепатоцитов, такие как увеличение размеров ядрышка, деструкция митохондрий, рассеянная белковая дистрофия, так и необратимые дистрофические и некробиотические изменения печеночных клеток, особенно в очагах воспаления. Наблюдалась вакуольная дистрофия гепатоцитов (нерпы №№404, 406,443,472). В паренхиме печени обнаружили наряду с очаговыми воспалительными инфильтратами единичные лимфоциты, нейтрофилы, макрофаги. В печени больных нерп наблюдали единичные многоядерные клетки, был отмечен интенсивный фагоцитоз

эритроцитов клетками Купфера.

Поражение печени не отмечают при морбшшивирусной инфекции у других ластоногихи китообразных. У собак, павших от чумы плотоядных, наблюдали лишь застойную гиперемию печени (Черкасский, 1971), а в некоторых случаях жировую дистрофию гепатоцитов (Сгорин, Белоусова, Фомина, 1991).

Исходя из результатов световой, электронной и иммуноэлектрошюй микроскопии печени, можно говорить о том, что вирус, поразивший байкальских нерп, обладает определенной гепатотропностыо. Обнаружение в гепатоцитах вирусных антигенов свидетельствует о размножении вируса в этих клетках.

Лимфатические узлы, селезенка, тимус. Данные ЭМ и ИЭМ показали, что Р13У-2 размножается в лимфоидной ткани нерп, в лимфоцитах и ретикулярных клетках, вызывая их гибель. Поэтому в первую неделю после инфицирования в крови у нерп и собак, зараженных вирусом чумы байкальских тюленей, отмечали лимфопешпо (Титенкоидр., 1990; Остер хауз и др., 1992). Увеличение количества лимфоцитов в последующие дни и появление вируснейтрализутощих антител в крови свидетельствовало о развивающейся перестройке иммунокомпетентных органов. В морфологическом отпошении, по нашим данным, это проявилось в гиперплазии фолликулов селезенки и лимфатических узлов. В лимфатических узлах гиперплазия фолликулов была отмечена у 24 животных (№№304, 306, 308-312, 404,405, 407, 433, 435- 437, 446, 451,453, 472-474, 480, 484-486). Из них: нерпы №№304, 306, 308-310, 312 имели клинические симптомы болезни и морбилливирусную РНК в печени и селезенке; в тканях нерп №№308-312 локализованы морбилливирусные антигены; в кровинерп №№308-310, 31 1, 312, 404, 405, 407, 435-437, 446, 451, 453, 472, 480, 486 содержались антитела к вирусу чумы плотоядных (табл. 1, 2). В крови нерп №№433, 473, 474, 484, 485 антитела к СОУ не были выявлены (табл.3).

В селезенке гиперплазия лимфатических фолликулов обнаружена в 9 (нерпы №№308, 309, 312, 404, 406, 437, 451, 474, 486) из 27 исследованных образцов (табл. 1 -3). Таким образом, гиперплазия фолликулов наблюдалась в лимфатических узлах у 19, в селезенке у 8 больных байкальских тюленей. При этом в фолликулах развивается широкий центр размножения, состоящий из крупных светлых ретикулярных клеток и небольшого количества малых лимфоцитов имакрофагов. В шшфатических узлах ближе к периферии центров размножения отмечали интенсивное деление малых лимфоцитови образованиеплазмобластов, которые мигрируют в мякотные тяжи и дифференцируются там в плазматические клетки. В результате этих

К ТаблицаЗ. Патспогия органов байкальских тюленей, добытых во время промысловой охотыв апреле-июне 1989г.

В крови этих животных антитела к морбилливирусач не выявлены по данным В.Л. Зорина с соавт. (1989), А.М Титенко с соавт. (1992).

№п/п, №нерп, возраст (год), вес (кг), пол

Органы Патология 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

321 433 443 444 457 471 473 474 475 478 481 482 483 484 485

0,12 3 1 1 35 1 1 1 7 1 1 2 1 1 1

13 31 23 37 48 15 22 17 43 16 16 27 19 12 15

сг ? СГ СГ СГ ? ? ? ? ? ? СГ О* СГ СГ

Мозг: - энцефалит

Легкие:

- бронхит

- пневмония

- нематоды

Печень: - гепатит

- гиперплазия лимфатических

Селезенка: фолликулов

- истшрние белой пульпы

- гиперплазия Лимфата- лимфатических ческие фолликулов узлы: ■ истовдние

В-зоны

Тимус:

ВД

- акцвденгальная шшолюция

чд

ВД

нд НД

ВД

ВД

нд

ВД - ВД ВД

ВД - нд нд

ВД

вд- нет данных

процессов в лимфатических, узлах 10 больных животных (№№308, 309, 312, 404, 405, 407, 437, 453, 480, 486, табл. 1, 2) популяция лимфоцитов в фолликулах истощается и бывает представлена лишь в виде узкого ободка, расположенного на периферии фолликула. У этих же нерп отмечали истощение лимфоцитами пара кортикальной зоны, мякотных тяжей. Появляются участки опустошения и обнажается сеть ретикулиновых волокон стромы. Мозговые синусы чаще всего были расширены, содержали лимфу, макрофаги. В мякотных тяжах наблюдали значительное количество плазмобластов и плазматических клеток, встречались сегментоядерные нейтрофилы.

В селезенке байкальских нерп истощение популяции лимфоцитов было менее выражено, наиболее пострадавшими в этом отношении была белая пульпа и маргинальные зоны у 5 (№№312, 404, 406,437,486; табл. 1, 2) из 21 больной нерпы. В красной пульпе селезенки содержалось большое количество макрофагов, плазматических клеток, сегментоядерных лейкоцитов.

В лимфатических узлах и селезенке тюленей, погибших в результате болезни (№№304,306,308,309,310,312), нерпы №311 иу части отстрелянных животных (№№404, 405, 406, 407, 431, 435, 436, 437, 451) наблюдали многоядерные клетки, которые имели 3-8 ядер и были окружены небольшим количеством цитоплазмы.

В Т-зависимых зонах селезенки и лимфатических узлов также отмечали уменьшение количества лимфоцитов, что можно рассматривать как результат нитолитического действия вируса и/или как наличие клеточно-опосредованных воспалительных реакций в различных органах при данном заболевании. Наблюдаемая у молодых животных акцидентальная инволюция тимуса, вероятно, также явилась отображением вышеназванных процессов.

Акцидентальная инволюция была выявлена у 3 молодых нерп (№№472, 480, 486) с морфологическими признаками морбилливирусной инфекции и имеющими в крови антитела к CDV. У нерп №321 (1 мес.) и №484 (1 год) не было антител в крови и патологических изменений органов характерных дня морбилливирусной инфекции, однако вышеназванная реакция тимуса присутствовала. Кроме того, у нерпы №321 морбилливирусные антигены не были выявлены. По данным В.Н. Ивановской (1982) у детей подобные изменения в тимусе возникают быстро при различных стрессовых состояниях, инфекционных заболеваниях, при гемабластозах и злокачественных опухолях, что позволяет предполагать действие и других факторов, вызывающих отмеченную патологию тимуса у молодых нерп. Гиперплазия лимфатических фолликулов селезенки и лимфатических узлов

у нерп №№433, 473,474,484, 485, не имеющих признаков морбилливирусной инфекции (отсутствие клинических симптомов, патологических изменений органов, антителв крови), также может быть обусловлена вышеназванными причинами. У обыкновенных тюленей акцидентальную инволюцию тимуса связывают непосредственно с морбилливирусной инфекцией (Bergman et al., 1991). Акцидентальыая инволюция тимуса у байкальских тюленей представляла собой реактивные изменения органа, которые выразились в истощении популяции лимфоцитов коркового слоя. При этом происходит стирание границ между корковым и мозговым веществами, дольки состоят преимущественно из ретикулоэпителия с мальм содержанием лимфоцитов. В некоторых случаях происходила даже инверсия слоев (нерпы №№472,486).

Легкие. В бронхах у 5 нерп, умерших с симптомами болезни (№№304, 306, 308, 309, 310), у нерп №№311, 404, 407, 431, 436, 437, 446, 451, т.е. у 13 больных животных (табл. 1, 2) была отмечена картина катарального воспаления. При бронхите слизистая была набухшая и полнокровная, в просвете бронхов содержалась слизь, эритроциты. Эпителий слизистых низкий, местами наблюдалась его десквамация, клетки эпителия набухшие с явлениями вакуолязации. Бокаловидные клетки содержа™ значительное количеств о слизи, в слизистой - единичные инфильтр аты из мононуклеарных и плазматических клеток.

У 4 байкальских нерп (№306, 309, 404, 407; табл. 1, 2) обнаружили интерстициалъную пневмонию, в том числе и у нерпы №309, погибшей в аквариуме и имеющей морбилливирусные антигены в легких. При интерстициальной пневмонии межальвеолярные перегородки были расширены вследствие инфильтрации лимфоцитами, макрофагами, нейтрофилами, что приводило, как правило, к спадению легочной паренхимы. В альвеолах наблюдали слущешше клетки альвеолярного эпителия и эритроциты.

В легочной паренхиме большинства нерп были выявлены нематоды Par afilar oides krascheninnikovi, которые, как правило, не вызывали воспалительную реакцию. При инвазии бронхов, легочных артерий нематодами Otostrongylus circumlitus отмечалась воспалительная инфильтрация.

Поражения дыхательной системы являются наиболее часто описываемыми признаками морбилливирусной инфекции (Нисевич, 1967; Черкасский, 1971;Чижов, Данилов, Дукур, 1990;Сюрин, Белоусова, Фомина, 1991). При чуме плотоядных, обсуждая проблему пневмотропности CDV, рассматривают интерстициалъную пневмонию, когда воспалительный процесс распространяется по межуточной ткани легких, как проявление первичного вирусного поражения, а бронхопневмонию (очаговая

пневмония) как результат активации микробов, которые сапрофитизируют в верхних дыхательных путях (Appel, 1969; 1981). Интерстициальная пневмония была обнаружена у 40-50% больных обыкновенных тюленей (Kennedy et al. ,1988), дельфинов (Domingo et al., 1990), морских свиней (Kennedy et al. ,1988; 1991). У б ашсальскихнернгштерстциалышя пневмония была отмечена лишь у 19% животных, бронхопневмония у нерп не наблюдалась. У собак Е.Черкасский (1971) выявил бронхопневмонию у 235 животных из 296 исследованных (79%). Следовательно, сопоставляя литературные и наши данные клинического наблюдения, иммуноэлектронной, электроннойи световой микроскопии, можно говорить о том, что у байкальских тюленей изменения п дыхательной системе, в основном, были представлены ринитом, катаральным бронхитом, которые были вызваны непосредственно PDV-2, каки интерстициальная пневмония, сравнительно редко отмечаемая у нерп. Осложнения со стороны органов дыхания при морбилливирусной инфекции у нерп не наблюдались. Это представляется весьма интересным явлением, т.к. по данным авторов (Шройт, 1970; Norman, 1983) и нашим, морбилливирусы повреждают иммунокомпетшпиые клетки, вызывают истощение популяции лимфоцитов в лимфоидной TKaini; при кори и чуме плотоядных это не редко приводит к супрессии иммунологических реакций, что способствует возникновению вторичных инфекций, серьезно осложняющих течение болезни, а иногда и определяющих ее исход. Очевидно, что у байкальских тюленей истощение популяции лимфоцитов было не настолько значительным, чтобы привести к выраженной иммуносупрессии. В пользу этого говорит не только отсутствие осложнений у нерп со стороны дыхательной, нервной систем, но и тот факт, что смертность в популяции байкальских тюленей составила приблизительно 10%. У обыкновенных толеней в некоторых областях Северного моря смертность достигала 70-80% (Harwood, 1989).

В легких многоядерные клетки были обнаружены только в легочной паренхиме при пневмонии и в весьма малом числе, в эпителии бронхов и бронхиол таковые lie встречались. По мнению М. Appel (1981), многоядерные клетки сравнительно редко отмечаются в респираторном тракте собак при чуме плотоядных, но типичны дтя больных корыо. При изучении эпителия в других органах нерп, мпогоядерные клетки также не наблюдались.

Другие органы. Унерп №№312, 404, 480, 486 наблюдали глоссит; у нерп №№312,406, 485 - эзофагит; энтерит был выявлен у нерп №№404, 406; колит у нерпы №43 L. Из этих животных только нерпа №485 не имела антитела к вирусу чумы плотоядных. В почках и мочевомпузыре признаки воспаления не были обнаружены, в почках отмечались дистрофические изменения эпителия проксимального и дисталъного отделов нефрона.

Особое место в выявленной патоморфологиинерп занимало поражение сосудистого эндотелия. Отмечено набухание и округление эндотелиальных клеток, увеличение их размера. Этот процесс был наиболее выражен в почках байкальских тюленей и, вероятно, являлся причиной цитотоксического действия вируса.

Таким образом, систематизируя морфологические изменения в органах байкальских нерп и сравнивая их с таковыми при чуме плотоядных, кори, чуме обыкновенных тюленей и китообразных, можно сказать, что они соответствуют представлению о морбилливирусной инфекции как причине болезни и гибели нерп и в основных чертах сходны с патоморфологической картиной при чуме плотоядных. Вместе с тем, такие свойственные чуме плотоядных признаки как энцефалит, демиелшшзация, пневмошы, являясь довольно характерной патологией в случае болезни нерп, не могут быть расценены как высокоспецифичные для этих животных. В тоже время, вирус чумы байкальских тюленей отличается значительным своеобразием вызываемых им морфологических изменениях, прежде всего, в печени.

ВЫВОДЫ

1. В органах байкальских тюленей, погибших во время эпизоотии 198788 годов, выявлены морбилливирусные антигены с помощью моноклональных антител против вируса кори и против вируса чумы обыкновенных тюленей.

2. Морбилливирусные антигены локализованы в макроглии, гепатоцитах, в эпителиальных клетках почечных канальцев, бронхов и бронхиол, в лимфоцитах и ретикулярных клетках селезенки. Показана преимущественная локализация морбилливирусных антигенов в лимфоидной ткани.

3. С помощью моноклональных антител против вируса кори и вируса чумы обыкновенных тюленей определена ядерная и цитоплазматическая локализация И-белка вируса чумы байкальских тюленей, цитоплазматическая локализация Р-белка. Я- и Н-белки выявлены в цитоплазме клеток и в составе вирусоподобных частиц.

4. В органах больных байкальских тюленей выявлены морфологические изменения, которые соответствуют представлешоо о морбилливирусной инфекции как причине болезни и гибели животных. Вирус чумы байкальских тюленей вызывает поражение внутренних органов: головного и спинного мозга, легких, печени, селезенки, лимфатических узлов, тимуса.

5. Патоморфологические изменения при морбилливирусной инфекции у нерп не являются высокоспецифичными: энцефалит выявлен у 43% больных

животных; гепатит - 48%; бронхит - 60%; интерстициальная пневмония -19%; гиперплазия фолликулов лимфатических узлов - 90%; истощение В-зоны лимфатических узлов - 48%; гиперплазия фолликулов селезенки - 38%; истощение белой пульпы селезенки - 24%; акцидентальная инволюция тимуса - 14%.

6. Патоморфологическая картина болезни байкальских нерп по морфологическим критериям в основных чертах сходна с таковой при чуме плотоядных. Отличием у нерп являются:

- отсутствие воспаления в мозжечке, мозговых оболочках и эпендиме;

- наличие воспалительных инфильтратов в печени, дистрофических и некр о биотических изменений гепатоцитов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Likhoshwav Ye.V., Grachev М.А., KumarevV.P., Solodun Yu.V., Goldberg O.A., Belykh 0.1., Nagieva F.G., Nikulina V.G., Kolesnik B.S. Baikal seal virus //Nature.- 1989,- V.339.- P. 266.

2. Белых О.И., Лихошвай E.B., Солодун Ю.В., Гольдберг О.А., Колесник

B.C., Нагиева Ф.Г. Исследование тканей погибших нерп с помощью методов электронной и иммуноэлектропной микроскопии // Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы. Новосибирск: Наука, Сиб. отд-е, 1992.-

C.36-40.

3. Белых О.И., Солодун Ю.В., Гольдберг О.А., Лихошвай Е.В., Кумарев В.П. Иммуноэлекгр онномикроскопическая локализация морбилливирусных антигенов в тканях байкальских нерп // Перв. Верещагинская байкальская международная конф., Иркутск, 1989.- С. 77-78.

4. Belykh O.I., Likhoshway Ye.V., Solodun Yu.V., Goldberg O.A., Kumarev V.P., Nagieva F.G. Organs of Baikal seal affected by morbillivirus // Abstracts of the XII Int.Congr. for Electron Microscopy, Seattle, USA, 1990,- P. 468-470.

5. Белых О.И. Локализация вирусных антигенов в тканях байкальской нерпы с помощью антител против вируса чумы обыкновенных тюленей // Актуальные проблемы биологии/Тезисы докл. к юбилейной научн. конф., Иркутск, 1994,- С. 34.

6. Localization of Viral Antigens in Organs of Baikalian Seals by Means of Immuno-Electron Microscopy // Scanning, 1996, 1 е., в печати.

7. Light, Electron and Immuno-Electron microscopy of the organs of the seals of lake Baikal sampled During the Morbillivirus Infection of 1987-1988 // J. of Pathology, 1996, 24 е., в печати.