Изучение морбилливируса байкальской нерпы методами молекулярной биологии

Бутина, Татьяна Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение морбилливируса байкальской нерпы методами молекулярной биологии
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение морбилливируса байкальской нерпы методами молекулярной биологии"

На правах рукописи

БУТИНА Татьяна Владимировна

ИЗУЧЕНИЕ МОРБИЛЛИВИРУСА БАЙКАЛЬСКОЙ НЕРПЫ МЕТОДАМИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

03.00.06 - Вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Владивосток, 2000 г.

Работа выполнена в Лимнологическом институте СО РАН, г. Иркутск

Научный руководитель: Кандидат химических наук

С.И. Беликов

Научный консультант: Член-корреспондент РАМН, доктор

медицинских наук, профессор В.И. Злобин

Официальные Доктор медицинских наук, профессор

оппоненты: Г.Н. Леонова

Кандидат биологических наук В.Б. Кожемяко

Ведущая организация: Омский научно-исследовательский

институт природноочаговых инфекций МЗ РФ

Защита состоится "13" июня 2000 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета К 003.97.01 по вирусологии в Биолого-почвенном институте ДВО РАН.

Адрес: 690022, г. Владивосток, пр. 100-летия Владивостока, 159. Факс:(4232)310-193

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ДВО РАН

Автореферат разослан " & " _2000 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук ^^CixQ М.В. Ходаковская

ПЧЧьЗ^ "

n^'i-SiO

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Осенью 1987 г. на Байкале произошла ассовая гибель тюленей (Phoca sibirica, байкальская нерпа). В езультате погибло около 6,5 тысяч животных из общего числа 70 ысяч. Ранее эпизоотии у байкальских тюленей не были регистрированы. Клиническая картина болезни, патологические зменения органов тканей животных и характер распространения 1болевания указывали на то, что популяция байкальских тюленей одверглась воздействию инфекционного агента, вероятно, вируса умы плотоядных (CDV - род Morbillivirus, семейство Paramyxovirus). [озднее эта гипотеза была подтверждена гибридизационным эндированием РНК из органов больных животных синтетическими лигонуклеотидами, синтезироваными на основе опубликованных груктур известных морбилливирусов.

Массовое заболевание байкальской нерпы стало первым ^регистрированным случаем морбилливирусной инфекции среди юрских млекопитающих. В 1988 г. вспышке подобной болезни одверглись популяции других ластоногих (Pinnipedic), а именно ерых (Halichoerus gryphus) и обыкновенных {Phoca vitulina) тюленей в алтайском и Северном морях. Позднее морбилливирусные инфекции ыли зарегистрированы в Средиземном море среди популяций морских виней и дельфинов - представителей отряда китообразных (Cetacea).

За последнее время вирус чумы плотоядных инфицировал не олько морских млекопитающих, но и большое число наземных сивотных в Европе, Соединенных Штатах Америки, Африке и в [понии. О восприимчивости к вирусу чумы плотоядных многих из тих видов животных ранее не было известно.

Молекулярно-биологическое изучение новых

юрбилливирусов, в том числе вируса байкальской нерпы и других ариантов вируса чумы плотоядных, представляет особый интерес, оскольку это не только расширяет существующие знания тносительно разнообразия циркулирующих в природе вирусов, но и ,аёт возможность раскрыть некоторые молекулярные механизмы еожиданной смены хозяина, обнаруженной практически дновременно в нескольких местах.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось юлекулярно-филогенетическое исследование вируса байкальской

нерпы на основе сравнения полных нуклеотидных последовательносте? двух генов этого вируса (белков фосфопротеина Р и гемагглютинина Н и ряда других морбилливирусов.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить нуклеотидные последовательности генов Р и Н изоляте вируса байкальской нерпы.

2. Сравнить полученные последовательности с аналогичнымг структурами других морбилливирусов, а также всех известны? изолятов СБУ.

3. С помощью молекулярно-филогенетического анализа определит! систематическое положение байкальского вируса относительж других морбиливирусов.

4. Оценить отличия вируса байкальской нерпы от других циркулирующих в природе штаммов вируса чумы плотоядных.

5. Исследовать популяцию байкальской нерпы на наличие в не{ морбилливирусов после вспышки 1987/88 гг.

6. Оценить полиморфизм вирусов, циркулирующих в популяцш байкальской нерпы.

Научная новизна работы. Впервые для изучения вирусноп заболевания в природной популяции животных были использовань методы молекулярной биологии, включая амплификацию < использованием полимеразной цепной реакции выбранных участко) генома вирусов, клонирование и последующее определени< нуклеотидной последовательности полученных фрагментов.

В результате анализа нуклеотидных последовательносга однозначно установлено, что вспышка болезни на Байкале был; вызвана вариантом вируса чумы плотоядных, отличным от других циркулирующих в природе штаммов СПУ.

Показано существенное отличие вируса байкальской нерпы о-морбилливирусов других морских млекопитающих, как ластоногих, та! и китообразных. Продемонстрировано независимое происхождени морбилливирусов морских и пресноводных животных.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в результате работы нуклеотидны последовательности двух генов вируса байкальских тюленей и ряд других изолятов СБУ значительно расширяют существующи представления о разнообразии вирусов чумы плотоядны?

иркулирующих в природе. В распоряжении исследователей оказался ополнительный материал для изучения различий между вирусами на енетическом уровне, для анализа вирусных белков и определения начения изменений в структуре генов и белков.

В ходе изучения вируса байкальской нерпы разработан и интезирован ряд морбилливирусных праймеров для выявления и онкого анализа любой морбилливирусной инфекции с помощью [етода полимеразной цепной реакции. Отработанные методики озволяют быстро, без применения трудоёмкой стадии ультивирования вируса подтвердить или опровергнуть наличие юрбилливирусной инфекции, а в сочетании с методами еквенирования определить принадлежность выявленного вируса к ому или иному виду морбилливируса и показать его отличие от ругих, близких ему вирусов. Результаты показывают, что данный юдход оказался достаточно эффективным для этих целей.

На защиту выносятся следующие положения: Переход морбилливирусов к морским и пресноводным позвоночным произошёл независимо в нескольких эволюционных линиях.

Исследованный в работе вирус байкальской нерпы наиболее близок к вирусу чумы плотоядных и является отдельным вариантом последнего.

Вирус байкальской нерпы высоко изменчив и в популяции байкальской нерпы одновременно циркулируют несколько вариантов этого вируса.

Внедрение в практику. Полученные нуклеотидные юследовательности гена Р и Н изученных штаммов СБУ [спонированы в международный компьютерный банк данных СепЬапк.

Материалы исследований используются в учебном процессе 1ри подготовке студентов-биологов в Иркутском Государственном Университете в циклах «Молекулярная вирусология» и «Частная ¡ирусология».

Апробация работы. Результаты исследований представлялись т Второй Верещагинской байкальской международной конференции, троходившей в 1995 г. в городе Иркутске.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано дв( статьи в реферируемых журналах. Одна статья находится в печати.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 15( страницах машинописного текста, включая 10 рисунков и 6 таблиц Библиографический указатель содержит 136 литературных источников в том числе 15 отечественных и 121 зарубежных. Диссертация состой' из введения, обзора литературы, описания материала и методо1 исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения заключения, выводов, списка литературы и приложения.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы состоит из трёх разделов. В первом раздел< описаны современная классификация и молекулярная биологии морбилливирусов, во втором - роль морбилливирусов в патологш морских и пресноводных млекопитающих; в третьем - особенное« эволюции вирусов и современные подходы к изучению молекулярно{ биологии, и филогении РНК-содержащих вирусов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основным объектом исследования в работе стал виру( байкальской нерпы. Для анализа использовали как выращенный н: культуре клеток изолят этого вируса (полученный в Голландии и: материала погибшей в 1988 г. нерпы), так и образцы тканей головногс мозга байкальских тюленей, собранные от больных, а также о' клинически здоровых животных. РНК из зараженных клеток и и: образцов тканей выделяли методом с использованием «кислого) изотиоцианата гуанидина. После этого следовало проведение реакций обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ПЦР). Синте: кДНК-копий фрагментов генома вирусов проводили, используя ] качестве затравки смесь гексонуклеотидов (Яапс1от-праймеры) шп структурные праймеры, полученные на основе известны: нуклеотидных последовательностей разных морбилливирусов Амплифицированные с помощью ПЦР фрагменты кДНК очищал! электрофорезом в легкоплавкой агарозе и клонировали в А-Т вектор! рТ7В1ие или рСЕМ. Выбранные клоны секвенировали по метод;

Сенгера с использованием ДНК-полимераз, а также по методу Максама-Гилберта, основанному на химической деградации ДНК.

Для сравнительного' анализа в работе также исследовано несколько изолятов вируса чумы плотоядных: штаммы Dog90/G и Ferret89/G из Германии от собаки и хорька, изолят Snyder Hill из Великобритании, а также вакцинный штамм Rockborn. Кроме того, был исследован патологический материал от морского льва, погибшего в Лондонском зоопарке с симптомами острого респираторного заболевания, и аналогичный материал от собаки, привезённый из Китая в 1995 г.

В качестве анализируемых фрагментов вирусов были выбраны полные или частичные последовательности двух генов белков фосфопротеина Р и гемагглютинина Н. В структуре гена Р также находятся две открытые рамки считывания для неструктурных белков С и V. Полную нуклеотидную последовательность гена Р определяли с помощью клонирования и секвенирования трёх перекрывающихся фрагментов кДНК гена, полученных на основе вирусной РНК. Фрагменты амплифицировали с помощью следующих пар праймеров: фрагмент 1. - 480 и 2546, фрагмент 2.-331 и 397, фрагмент 3. - 2545 и 334 (рис. 1.).

В случае анализа образцов мозга байкальской нерпы, собранных от клинически здоровых и погибших животных определяли нуклеотидную последовательность фрагмента гена Р размером 388 п.н., полученного с помощью «универсальных» морбилливирусных праймеров 2545 и 2546 - фрагмент 4. (см. рис. 1.)

Для анализа полной нуклеотидной последовательности гена Н вируса байкальской нерпы и некоторых штаммов вируса чумы плотоядных амплифицировали с помощью праймеров Н01 и Н02 и затем клонировали полноразмерную ДНК-копию гена (рис. 2).

Для обработки полученных нуклеотидных последовательностей генов Р и Н применялись программы из пакета филогенетических программ PHYLIP v. 3;5с.

Сочетание методов обратной транскрипции, полимеразной цепной реакции и секвенирования может быть рекомендовано для изучения любых РНК-геномных вирусов. Так, подобный подход был успешно использован нами для изучения различных вариантов другого РНК-содержащего вируса: вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) из семейства флавивирусов. Для этого выбрали небольшой фрагмент

480-» <—2546

2545-» 331—> <-334 <-397 Р М

Рис. 1. Схематическое изображение гена Р морбилливирусов и расположения амплифицированных фрагментов кДНК гена вируса байкальской нерпы и изолятов вируса чумы плотоядных (продольные линии), полученных с помощью метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции. Фрагменты использовали для определения нуклеотидной последовательности гена. Стрелками показано расположение и ориентация праймеров для ПЦР.

Н01-> <-Н02

Н__.____Ь

Клонированный фрагмент

Рис. 2. Стратегия получения фрагмента, к ДНК гена Н вируса байкальской нерпы и других штаммов СЭ\/. Расположение и направление праймеров обозначено стрелками. Продольная ограниченная линия обозначает полученный кДНК клон.

генома, кодирующий А-антигенный домен поверхностного белка Е ВКЭ. Данный участок гена кодирует участок неконсервативных аминокислот и окружён консервативными областями, что очень важно для выбора праймеров. Синтезированные праймеры позволяют амплифицировать фрагмент гена Е размером 160 п.н. Проанализировав 35 штаммов ВКЭ, удалось идентифицировать несколько генотипов этого вируса и показать распространение различных генотипов на территории России.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей

гена Р вируса байкальской нерпы.

В результате клонирования и секвенирования 3-х тсрекрывающихся фрагментов получена полная кодирующая область -еиа Р и, соответственно, двух других генов белков С и V, открытые замки считывания которых находятся в пределах рамки считывания ена Р, следующих изолятов: изолята вируса байкальской нерпы 'SEAL88), полученного в Голландии осенью 1988 г., вакцинного птамма Rockborn (RB.vac), и двух изолятов из Германии от больной ;обаки (Dog90/G), и от хорька (Ferr89/G), полученных во время зспышки чумы плотоядных на звероферме в 1989 и 1990 гг. :оответственно. Размер нуклеотидной последовательности генов Р, С и V исследованных вирусов составил 1569, 522 и 897 п.н. соответственно.

На основе полученных нуклеотидных последовательностей выведены аминокислотные последовательности белков Р, С и V исследованных вирусов. Их размер составил 507, 174 и 299 аминокислот соответственно.

Полученные структуры генов и белков Р, С и V сравнили с аналогичными структурами распространённого в настоящее время, вакцинного штамма CDV Onderstepoort (Ondst.vac), выделенного в 1930 г. в Африке, и с аналогичными генами и белками других морбилливирусов (вируса кори MV, вируса чумы крупного рогатого скота RPV, вируса европейских тюленей PDV и вируса дельфинов DMV). Структуры всех перечисленных вирусов получены из банка данных GenBank. Процент гомологии проанализированных вирусов приведён в табл. 1.

По данным сравнения гена Р процент гомологии между вирусом байкальских тюленей и вирусами MY, PDV, RPV, DMV (55-77%) намного ниже, чем между вирусом SEAL88 и всеми изолятами CDV (95-98%).

На основе полученных структур гена Р вирусов с помощью программы NEIGHBOR было получено древо, демонстрирующее филогенетические отношения вируса байкальской нерпы SEAL88, различных штаммов вируса чумы плотоядных и других морбилливирусов. Для оценки достоверности полученных данных применяли метод бутстреп-анализа (рис. 3.).

Таблица 1.

Процент гомологии между различными штаммами С0\/ и между разными морбилливирусами по данным сравнения

первичных последовательностей генов и белков РЛ//С.

Нуклеотидная последовательность гена Р/У/С

Аминокислотная последовательность белка Р/У/С Ог^.Уас ЯВ.Уас 0(^90/0 Регге189/0 8ПАЬ88' МУ 1ЮУ ЯРУ ОМУ

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

I. 100/100/100 96/95/96 96/95/95 95/94/96 - 54/57/54 76/79/83 54/56/54 56/58/56

2. 100/100/99 96/95/95 96/95/95 95/94/95 54/57/54 76/79/83 54/56/54 56/58/56

3. 93/92/93 93/92/92 98/97/97 97/96/98 54/57/53 76/79/83 54/56/54 56/58/55

4. 94/92/91 94/92/91 97/95/94 98/97/98 55/57/53 77/80/83 55/56/53 56/58/55

5. 94/92/94 94/92/93 97/96/96 98/97/94 55/57/54 77/80/84 55/57/54 56/58/56

6. 42/36/44 42/36/44 42/36/45 43/36/44 43/37/45 55/56/51 68/69/69 59/60/51

7. 76/71/74 76/71/73 76/71/76 76/71/75 76/71/76 42/34/41 57/57/53 57/58/55

8. 42/35/40 42/35/40 43/37/41 43/37/41 43/38/40 59/59/55 45/38/39 61/62/58

9. 46/39/36 46/39/36 47/40/34 47/40/35 47/41/34 46/41/36 46/38/34 48/44/43

55 81

100

SEAL88 • L Ferr90/G ^ Dog90/G ^ V CDV Ondst.vac RB.vac

PDV

DMV

RPV

ic. 3. Филогенетические отношения вируса байкальской нерпы и других представителей рода Morbillivirus, полученные на основе анализа нуклеотидной последовательности гена Р программой NEIGHBOR из пакета программ PHYLIP. В узлах указаны значения бутстреп-анализа. Значком (•) обозначен изолят вируса байкальской нерпы, а значком (-❖-) — исследованные в работе изоляты вируса чумы плотоядных.

Из представленной схемы можно видеть, что вирус байкальско! нерпы SEAL88 очень сильно отличается от морбилливируса други; тюленей - вируса обыкновенных тюленей PDV. Это даёт основани« считать, что вспышка заболевания на Байкале абсолютно не связана < аналогичной вспышкой болезни тюленей в Северном море, xotj произошли они практически в одно время. Ещё сильнее вирус SEAL8! отличается от морбилливируса других морских животных - вирус; дельфинов из Средиземного моря (DMV), и вирусов MY, и RPV. Kai видно, вирус байкальской нерпы входит в группу вирусов чумь плотоядных и наиболее близок к изолятам CDV Ferr89/G и Dog90/G.

Представленные результаты филогенетического анализа ряд; морбилливирусов практически не отличаются от предварительны: данных, полученных на основе фрагмента гена Р. Таким образом можно считать, что изученный нами изолят вируса байкальской нерга действительно является штаммом вируса чумы плотоядных.

Относительная консервативность гена Р позволила определит связь вируса байкальской нерпы с известными морбилливирусами, ] показать различное происхождение вирусов морских и пресноводны: животных. Более же детальные сходства и отличия вируса байкальског тюленя от циркулирующих в природе штаммов вируса чум! плотоядных получили с помощью анализа одного из самы вариабельных генов морбилливирусов- гена поверхностного белк гемагглютинина Н.

Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей

гена и белка гемагглютинина H вируса байкальской нерпы

Для исследования последовательности нуклеотидов гена H бы амплифицирован участок генома, содержащий открытую рамк считывания белка Н, следующих изолятов: голландского изолята вирус байкальской нерпы 1988 г. (SEAL88), германских изолятов CDV с собаки (Dog90/G) и хорька (Ferr89/G), и вирулентного штамма CD Snyder Hill (SnyHill), выделенного около 30 лет назад. Размс исследованного фрагмента составил 1942 п.н. Кроме того, определи структура фрагмента гена H (1900 п.н.), полученного из суммарно РНК, выделенной из образца мозга байкальской нерпы (SB88) - той ж от которой голландскими учеными был получен изолят вирус байкальской нерпы. Сравнение вируса, полученного непосредствен! из ткани животного и вируса, прошедшего ряд пассажей в культу]

пето к даёт возможность проследить изменения вируса в процессе цаптации его к изменяющимся условиям.

Для всех исследованных изолятов идентифицирована большая гкрытая рамка считывания размером 1821 п.н., кодирующая 607 минокислот. Проанализированные структуры гена и белка Н разных ггаммов вируса чумы плотоядных сравнили с аналогичными оследовательностями других известных изолятов CDV: вакцинных ггаммов Onderstepoort (Ondst.vac) и Convac; двух германских изолятов т собак 1995 г. (Dog95-l/G, Dog95-l/G); изолятов от норки VIink86/DK) и собаки (Dog91/DK) из Дании; изолята от гренландской обаки (Dog88/GR); американских изолятов от пантеры (Bleo92/US), еопарда (Cleo92/US), енота (Racn89/US), ошейникового пекаря Favl89/US), и собаки (Dog89/US); и четырёх японских изолятов Гапи86/Т, Ueno92/J, Hamam93/J, Yanak94/J) (табл. 2.). Все эти труктуры получены из банка данных Genbank. Размер белка Н всех еречисленных изолятов также составил 607 аминокислот, за включением вакцинного штамма Onderstepoort, белок которого на 3 минокислоты короче.

По данным сравнения гена Н, вирус байкальских тюленей среди сех CDV-вирусов наиболее сильно отличается от вакцинных штаммов [ изолята Shyder Hill (92-93%). Наибольшее сходство отмечено между (золятом вируса SEAL88 и вирусом, выделенным из мозга животного, >т которого получен этот изолят (SB88) - около 100%, а также между »EAL88 и двумя изолятами CDV от собак из Германии и Гренландии 96%). Гомология вируса байкальских тюленей с самым близким к CDV юрбилливирусом европейских тюленей PDV составила 70%.

При сравнении аминокислотных последовательностей белков Н шных штаммов вируса чумы плотоядных и морбилливирусов морских кивотных (DMV и PDV) удалось обнаружить несколько 1минокислотных замен, характерных исключительно для лорбилливирусов, изолированных от тюленей (байкальских и ¡вропейских). Поскольку белок гемагглютинин играет ключевую роль в тервичном взаимодействии вируса с хозяином, выявленные отличия в 1минокислотых последовательностях могут отвечать за специфическое взаимодействие вирусов. Таким образом, это раскрывает некоторые молекулярные основы адаптивности морбилливирусов к этим водным млекопитающим (рис. 4).

Таблица 2.

Процент гомологии между различными штаммами СОУ и разными морбилливирусами на основе гена и белка Н.

Нуклеотидная последовательность гена Н

о РЗ > ' ТЭ с о о (3 > с о и 5 о С\ од о р О о^ 00 Ь и и. ОО 00 Ы 0о СО ОО Ш СО X >\ с со ы е чо ОО ■ё % Оод95-1ЛЗ О ---- гч V) % о Р ей СЭ ОО ОО ад о Р о р Dog89/US со § С\ 8 и сл 5 о\ 00 5 •—1 со 3 ОО с о « со Оч О о и чо со 3 § Н (Ч с^ о с о р т а» И 1 1 > а а, > Р

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23

1. 99 93 93 92 92 97 93 92 92 92 93 92 92 92 92 92 91 91 91 91 70 51

2. 95 93 93 93 93 98 94 93 93 93 93 92 93 93 93 93 92 92 92 92 70 50

л 3. 90 91 97 96 96 93 97 99 .99 96 99 97 97 97 97 97 96 96 96 96 70 50

ё ? 4. 89 90 98 95 96 93 97 97 97 96 97 96 96 97 96 97 96 96 95 96 69 50

5. 90 90 99 97 100 92 95 95 95 98 96 95 95 95 95 95 94 94 94 94 70 50

О 6. 90 91 98 96 99 92 96 95 95 98 96 95 95 96 95 95 94 95 94 95 70 50

иа С? 7. 90 91 91 90 90 91 93 92 92 93 93 92 92 92 92 92 92 92 91 92 70 51

Ё 8. 90 90 99 97 98 97 90 99 97 96 97 97 97 97 97 97 96 96 96 96 70 50

§ 9. 90 91 100 98 99 98 91 97 100 95 99 97 96 97 96 97 96 96 96 96 70 50

Е- и 10. 90 91 100 98 99 98 91 99 100 98 99 97 96 97 96 97 96 96 96 96 70 50

с 11. 89 90 98 96 99 98 90 97 98 95 96 95 95 96 95 95 95 94 95 95 70 50

Й % 12. 90 91 99 98 99 98 91 99 100 100 98 97 97 96 97 97 96 96 96 96 70 50

13. 90 90 97 95 96 95 89 96 97 97 95 99 97 98 97 98 95 95 95 95 69 50

о 14. 88 89 95 93 94 93 87 94 95 95 93 97 95 98 97 97 95 95 95 95 70 50

о X 15. 89 90 98 98 97 96 90 97 98 98 96 95 95 93 98 98 96 96 96 96 70 50

16 90 90 97 95 96 95 89 96 97 97 95 98 97 95 95 97 95 95 95 95 69 50

17. 90 91 98 96 97 96 90 97 98 98 96 97 97 95 96 97 96 95 95 95 69 50

18. 88 89 97 96 96 95 89 96 97 97 95 98 94 92 95 94 95 98 99 99 70 50

19. 90 90 97 96 96 97 90 96 97 97 95 97 94 92 95 94 95 98 98 100 70 50

20. 88 89 97 96 96 95 89 96 97 97 95 97 94 92 95 94 95 98 98 98 69 50

21. 89 90 96 97 95 96 90 95 96 96 94 96 93 91 96 93 94 97 99 ■97 69 50

22. 63 62 64 63 64 65 63 64 64 64 64 64 65 62 63 63 62 63 64 62 63 49

1 л 1 Л 1 Л Л Л 1 Л 1 л 1 1 А-У 1 Л 1 Л 1 лп Л1 41 ю ¿1 лп 41

dst.vac nvac g90/G rr89/G AL88 88

yHill

g95-l/G

nk86/DK

g88/GR

g95-2/G

ig89/US

eo91/US

lv189/US

icn89/US

,eo92/US

inu86/J

!По92/J

Lmam93/J

mak94/J

NP P STVKVNFTNYCE SIGIRKAIAS AAN .K.......................

571

RPDFLRIECFVWDDNLWCHQFYRFEADI ..........................N.

. .Kl . -Kl . .Kl . .Kl . .K. . .Kl . .Kl . .Kl . .Kl . .Kl . .Kl . .Kl . .Kl . .Kl . .Kl . .Kl . .Kl . .Kl . .K. ■ DQ.

........DT. . . K. S . ..........D . . .

........DT. . . . . S . ..........ND . . .

........DT.g . . .S. • L. . . ......g____

........DT.§ . . .S. .L. . . ..........@D____

....Y..N.

........DTV. . . .S. ...........D....

........DT. . . . . S. ...........D... .

........DT. . . . . S . .L. .. . . . ...........D... .

........DTV. ... s. ...........D... .

........DT. . ... s. ...........D... . ........S

. .......DT. . ...s. ...........D... . ........S

........DT. . ...s. ...........D . . . . ......T.S

........DT . ... s. ...........D.. . , ......T. S

........DT. . .. .s. ...........D.. ..

----Q.

IDYAQ.

.DTV.VK.S......

. . ITjjjFKE.TR.V. . .NH.AAEEL.VTKFK

...1... E.IY...

273

ldst.vac NDMPLLQTTNYMVLPKNSKAKVCTIAVG

3nvac ...............E............

эдЭО/G .N.............E,...........

=rr89/G................E............

EAL88 .....F.S.-..П..Е............

B88 .....F......Q. .E............

nyHill ...............E............

og95-l/G .N.............E............

ink86/DK......P........E............

og8 8 / GR .....F.........E............

og95-2/G .N.............E............

og89/US .G.............E............

leo91/US ...............E............

àvl89/US ...............E............

acn89/US ...............E............

leo92/US .N.............E............

anu86/J ...............ET...........

feno92/J ...............ET...........

[amam93/J ...............ET...........

:anak94/J ...............ET...........

>DV G. ...F.....B£5lSN..NT.I......

>MV SRE.V..M..F..IDEDEGLNF.LLS..

.....D.

----@H.

.P.SRQ.

415

........N.

......QL.A

.HYCMINSTV

LPSYGRLTLPLDASVDLQLNISFTYGPV

.E.x. .3.1.

..p.l.

..PGX. ....1. ..P.l. ..P.l. ..P.l. ..P.l. .AP.I. ..P.l. ..P.l. ..P.l. ..P.l.

•L..P.l.

.........S. .¡¡¡.T. .SI.V.VAQ. .1

I.A.AYIA.EIKEDSG.E.D.TSN. . .L

эис. 4. Фрагменты выравненных аминокислотных последовательностей белка гемагглютинина H проанализированных штаммов вируса чумы плотоядных и морбилливирусов морских животных, содержащие замены, характерные только для вирусов тюленей (отмечены чёрным цветом). А - два фрагмента белка, в структуре которых находятся адаптивные аминокислотные замены (в позициях 158 и 571), ведущие к изменению гидрофобности и заряда данных участков белка вирусов тюленей; Б- замены в позициях 273, 415, не изменяющие гидрофобность белка Н.

Для филогенетического анализа изолятов CDV от байкальской нерпы и других животных на основе структуры гена H использовали программу NEIGHBOR из пакета программ PHYLIP (рис. 5). Структуры гена H морбилливирусов MY, RPV и DMV были исключены из анализа, поскольку полученные па основе самого вариабельного гена дистанции между CDV-изолятами и этими морбилливирусами были настолько большими, что это затрудняло рассмотрение филогенетических отношений внутри группы вируса чумы плотоядных.

Из топологии полученного древа (см. рис. 5.) четко видно, что вирус байкальских тюленей (SEAL88 и SB 8 8), как и другие вирусы от диких и домашних животных, существенно отличается от вакцинных штаммов Convac и Onderstepoort, а также от вирулентного штамма Snyder Hill, полученного около 30 лет назад. Наиболее близким родственником вируса байкальских животных оказался вирус чумы плотоядных от гренландской собаки. Остальные же изоляты CDV из Америки, Европы и Японии заметно отличаются от вируса байкальской нерпы, образуя отдельные кластеры. Ещё более существенно изолят байкальского вируса отличается от вируса других тюленей - PDV.

Интересно заметить, что японские, американские и европейские изоляты CDV как от домашних, так и от диких животных' образовали три отдельные ветви. Таким образом, можно сказать, что штаммы CDV могут отличаться по их географическому происхождению.

Изолят вируса байкальской нерпы образует отдельный кластер с гренландским изолятом CDV от собаки, что противоречит идее о различии штаммов по географическому распространению. Вопрос о том, почему настолько удалённые друг от друга животные оказались инфицированными очень близкими вариантами вируса чумы плотоядных остаётся открытым.

Интересное распределение можно также наблюдать среди всех европейских изолятов. Несмотря на то, что европейские изоляты CDV от хорька и норки, и изоляты CDV от собак имеют близкое географическое происхождение, они разделены на две отдельные ветви. Одна ветвь включает штаммы вируса чумы плотоядных, которые поражают собак (представителей семейства плотоядных), а другая -животных из семейства куньих.

10С

_ BIIeo91/US . Racn90/US Javel89/US _ Dog89/US _ Chleo92/US

Dog90/G -Ф-_ Dog91/DK Dog95-2/G 100L Dog95-1/G ,_Ferr89/G

100

Ueno92/J

100

4- США

V Европа

Mink86/DK gg Tanu86/J L_ Hanam93/J

V-Япония

1001 Yanaka94/J

_Dog88/GR

_Seal88 •

100L SB88 •

_SnyHill -Ф-

_Ondst.vac

99l— Convac _ PDV

Гренландия Сибирь

}

эис. 5. Филогенетическое древо, полученное в результате анализа структуры гена И, демонстрирующее взаимосвязь вируса байкальской нерпы (•) с морбилливирусом европейских тюленей (PDV) и с известными штаммами вируса чумы плотоядных из различных географических ареалов. Значком (-0-) обозначены исследованные в работе изопяты CDV. Данная схема получена программой NEIGHBOR из пакета программ PHYLIP.

Таким образом, к настоящему времени можно идентифицировать несколько разновидностей СБУ, которые циркулируют в различных географических ареалах. Кроме того, существуют генотипы СОУ, отличающиеся своей специфичностью, т. е. различной патогенностью для отдельных видов животных.

Изучение структуры фрагмента гена Р вирусов байкальской

нерпы в течение 10-летнего периода от начала эпизоотии

С целью исследования разнообразия вирусов, циркулирующих в популяции байкальской нерпы, а также мониторинга состояния этих животных после вспышки заболевания чумой плотоядных в 1987/1988гг., в 1992 и 1995 гг. проводился ГЩР-анализ образцов тканей мозга животных, отобранных во время весенних плановых отстрелов нерпы, а также животных, найденных погибшими на побережье Байкала, на наличие вирусной РНК. Дня этого использовалась разработанная ранее система так называемых «универсальных» праймеров, полученных на основе консервативных последовательностей гена Р известных морбилливирусов. Небольшой размер амплифицируемого с помощью этих праймеров фрагмента (388 п.н., не включая праймеры) позволяет достаточно быстро и точно методом секвенирования установить отличия или сходства новых морбилливирусов с уже известными.

Из 45 образцов тканей мозга байкальской нерпы, полученных весной 1992 г., положительными оказались 3 образца, а из 35 образцов 1995 г. - 14. Все 3 образца 1992 г. и четыре положительных образца из набора 1995 г. использовали в дальнейшем для изучения структуры полученного фрагмента гена Р (см. рис. 1.). Кроме того, в анализ вошли образцы суммарной РНК от павших в более поздний период животных. В частности, у двух тюленей, погибших в декабре 1996 г., и у двух нерп, выброшенных на берег Байкала летом 1997 г., была обнаружена морбилливирусная РНК. Наличие в тканях погибших животных как вирусной РНК, так и матричной РНК говорило о присутствии вируса в активной форме.

После ПЦР-анализа исследовалась структура фрагмента гена Р из положительных образцов тканей, содержащих вирусную РНК. Полученные фрагменты секвенировали без предварительного клонирования, используя внутреннею пару праймеров: 329 и 330. В результате проанализировано 12 фрагментов гена Р вирусов от

байкальской нерпы, выделенных в различное время, в том числе изолята SEAL88 вируса байкальской нерпы, полученного во время вспышки болезни в 1988 г. и этого же вируса, но полученного непосредственно из ткани мозга погибшего животного (SB88).

Кроме этих образцов от байкальской нерпы, в работе с помощью аналогичного сочетания методов исследована частичная структура гена Р вирусов CDV от других животных: морского льва из Лондонского зоопарка (Slion/UK) и китайской собаки (Dog95/Ch), а также вирулентного штамма Snyder Hill (SnyHill).

Полученные последовательности обработали с помощью филогенетических программ. Кроме изученных структур в компьютерном анализе использовали структуры фрагмента гена Р, полученные из банка данных GenBank, всех известных к настоящему времени вариантов вируса CDV: вакцинных штаммов Onderstepoort (Ondst.vac), Rockborn (RB.vac) и коммерческой живой вакцины от Shering-Plough Corporation, применяемой на зверофермах в окрестностях Байкала (S.vac); американских изолятов от пантеры (Bleo91/US), леопарда (Cleo92/US), енота (Racn92/US), и серой лисицы (Gfox92/US); африканских изолятов от собаки (Cfam94/A), большеухой лисицы (Otmeg94/A) и четырёх львов (Lion94A и Рап94-1/А, Рап94-2/А, Рап94-3/А); и изолята Belfast от собаки из Великобритании (DogB/UK).

. На рис. 6. приведено древо, полученное с помощью программы NEIGHBOR из пакета программ PHYLIP. Поскольку размер фрагмента, на основе которого производился анализ, небольшой, и в анализе используется большое количество близких, видов (соответственно небольшое число замен), достоверность всех полученных деревьев оказалась невысокой.

Из полученных данных, видно, во-первых, что вирусы от байкальских тюленей кластеризуются с европейскими изолятами C.DV (Ferr89/G, Dog90/G, Slion/UK) и изолятом от китайской собаки (Dog95/Ch). Во-вторых, существует две группы вирусов байкальских животных. Первая группа - самая многочисленная - кластеризуется совместно с изолятом от китайской собаки. В неё также входит изолят вируса байкальской нерпы, полученный в 1988 г. Вторая группа вирусов образует отдельный кластер с европейскими штаммами CDV. По данным филогенетического анализа на основе гена Н вирус байкальских тюленей 1988 г. достаточно сильно отличается от европейских вариантов вируса чумы плотояднх, в том числе от изолятов

S.vac [Ondst.vac 98 I-RB.vac -Ф-

■ SnyHill ^

■ DogB/UK 83

- Великобритания

jciet

Bleo91/US Racn92/US

;cieo92/US

53 I-Gfox92/US

■ Lion94/A

■ -США

jsE/

56 34

SEAL63-95 Ferr89/G + • Dog90/G -Ф-SEAL78-95 <

1 Pan

■ Otmeg94/A — Pan94-2/A Pan94-3/A

\ - Африка

Pan94-1/A

Германия

SEAL26-95 <

-Slion/UK -Ф-

Dog95/Ch -Ф--SEALj1-92 •

- Великобритания Китай

0.01

ЬВ|' l!

(- OD

^HSEAL-S 35'-SB

SEALj 14-92 ■ SEAL2-97 '

96 • SEAL3-97 • SB88 •

SEAL88 • -SEAL27-95 <

Рис. 6. Филогенетический анализ вирусов от байкальской нерпы (•) и других известных CDV, выполненный на основе частичной структуры гена Р (388 п.н.) с помощью программы NEIGHBOR из пакета программ PHYLIP. Вирусы байкальской нерпы (SEAL) обозначены с указанием номера животного и времени изоляции (год). Значком (-Ф-) обозначены исследованные в работе изоляты CDV.

Регг89ЛЗ и Бс^90/0. Таким образом, в популяции байкальской нерпы циркулирует как минимум две разновидности вируса чумы плотоядных.

При сопоставлении результатов анализа нуклеотидных последовательностей и времени выделения вирусов от байкальских животных, линейного изменения вируса по годам не обнаружено [байкальские вирусы 1988, 1992, 1995, 1996 и 1997 гг. находятся в одной группе вирусов, а вирусы 1995 г. - в другой). Одним из возможных объяснений этого является факт, что вирусы первой группы получали от больных животных, а в 1995 г. - от клинически здоровых. Возможно, вирусы от больных животных являются представителями более патогенного варианта вируса чумы плотоядных. Необходимо отметить, что у животных, у которых отбирали образцы тканей во время планового отстрела (то есть у клинически здоровых нерп), встречаются вирусы, аналогичные вирусам, полученным от больных животных.

Структура фрагмента гена Р, на основе которого производился анализ вирусов байкальской нерпы оказалась очень удобной для быстрой идентификации морбилливирусной инфекции. Анализ полной нуклеотидной последовательности гена Р нескольких штаммов СОУ и других морбилливирусов показал, что выбранный для идентификации морбилливирусной инфекции участок гена является одним из вариабельных во всей структуре гена фосфопротеина. Поэтому для быстрого анализа новых морбилливирусов достаточно исследовать нуклеотидную последовательность только этого фрагмента.

ВЫВОДЫ

1. Определена полная нуклеотидная последовательность гена Р морбилливируса, вызвавшего эпизоотию байкальской нерпы в 1987/88 гг. Сравнение её с последовательностями гена Р других морбилливирусов позволило точно установить систематическое положение байкальского вируса.

2. Морбилливирусы, идентичные или близкие вирусу байкальской нерпы 1988 г., продолжают циркулировать в популяции названных животных. Сравнение последовательностей гена Р выделенных штаммов вируса байкальской нерпы позволило установить, что в популяции циркулирует несколько вариантов этого вируса.

3. Для более точного филогенетического анализа вируса байкальских животных определена полная нукпеогидная последовательность одного из наиболее вариабельных генов морбилливирусов - гена H белка гемагглютинина, играющего ключевую роль в определении специфичности взаимодействия вирус - хозяин.

4. Сравнение последовательности гена H байкальского вируса с аналогичной последовательностью морбилливируса европейских тюленей позволило доказать их происхождение от родственных, но различных предков. Вместе с тем, удалось выявить ряд конвергентных мутаций, по-видимому, необходимых при адаптации морбилливирусов к этим водным млекопитающим.

5. Развёрнутый филогенетический анализ на основе полных последовательностей гена H позволил количественно оценить отличие вируса байкальских тюленей от других морбилливирусов, показать его близкую связь с вирусом чумы плотоядных и определить, что вирус байкальских тюленей является отдельным вариантом вируса чумы плотоядных.

6. Сконструирован ряд праймеров, требующихся для ПЦР-диагностики и ПЦР-анализа морбилливирусов с любой степенью специфичности. Показано, что ген H наиболее пригоден для тонкого анализа генетических различий отдельных штаммов вируса чумы плотоядных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Haas L-,Martens W., Greiser-Wilke I., Mamaev L., Butina T., Maack D., Barrett T. Analysis of the haemagglutinin gene of current wild-type canine distemper virus isolates from Germany // Virus Reseach. — 1997.-V. 48.-P. 165-171.

2. Беликов С.И., Бутина T.B., Деникина H.H., JI.B. Мамаев, E.A. Петров. Морбилливирус, вызвавший эпизоотию в 1987 г., продолжает циркулировать в популяции байкальской нерпы // Сиб. Экол. Журнал. - 1999. - № 6. - С. 663-666.

3. Злобин В.И., Дёмина Т.В., Мамаев J1.B., Бутина Т.В., Беликов С.И. и др. Анализ генетической вариабельности штаммов вируса клещевого энцефалита по первичной структуре фрагмента гена белка оболочки Е // Вопр. Вирусол. — (в печати)

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бутина, Татьяна Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика морбилливирусов.

1.2. Роль морбилливирусов в патологии морских и пресноводных млекопитающих.

1.3. Эволюция вирусов и современные подходы к изучению молекулярной филогении вирусов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей генов и белков Р, С и V.

3.2. Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей гена Н белка гемагглютинина.

3.3. Изучение структуры фрагмента гена Р изолятов вируса байкальской нерпы в течение 10-летнего периода от начала эпизоотии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение морбилливируса байкальской нерпы методами молекулярной биологии"

Актуальность проблемы. Осенью 1987 г. на Байкале произошла массовая гибель тюленей (Phoca sibirica, байкальская нерпа). В результате погибло около 6,5 тысяч животных из общего числа 70 тысяч. Ранее эпизоотии у байкальских тюленей не были зарегистрированы. Клиническая картина болезни, патологические изменения органов тканей животных нерп и характер распространения заболевания указывали на то, что популяция байкальских тюленей подверглась воздействию инфекционного агента, вероятно, вируса чумы плотоядных (CDV - род Morbillivirus, семейство Paramyxovirus) Позднее эта гипотеза была подтверждена гибридизационным зондированием РНК из органов больных животных синтетическими олигонуклеотидами, синтезироваными на основе опубликованных структур известных морбилливирусов.

Массовое заболевание байкальской нерпы стало первым зарегистрированным случаем морбилливирусной инфекции среди водных млекопитающих. В 1988 г. вспышке подобной болезни подверглись популяции других ластоногих (Pinnipediaг), а именно серых (Halichoerus gryphus) и обыкновенных (Phoca vitulinä) тюленей в Балтийском и Северном морях (Osterhaus et al., 1988а). Позднее морбилливирусные инфекции были зарегистрированы в Средиземном море среди популяций морских свиней и дельфинов - представителей отряда китообразных (Cetáceo).

За последнее время вирус чумы плотоядных инфицировал не только морских млекопитающих, но и большое число других наземных животных в Европе, Соединенных Штатах Америки, Африке и Японии. О восприимчивости к вирусу чумы плотоядных многих из этих видов животных ранее не было известно. Так, были описаны случаи заболевания крупных кошачьих и гиеновых, как в природе, так и в неволе (Appel et al., 1994; Harder et al., 1995; Harder et al., 1996).

Молекулярно-биологическое изучение новых морбилливирусов, в том числе вируса байкальской нерпы и других вариантов вируса чумы плотоядных, представляет особый интерес, поскольку это не только расширяет существующие знания относительно разнообразия циркулирующих в природе вирусов, но и раскрывает некоторые возможные молекулярные механизмы неожиданной смены хозяина, обнаруженной практически одновременно параллельно в нескольких местах.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось молекулярно-филогенетическое исследование вируса байкальской нерпы на основе сравнения полных нуклеотидных последовательностей двух генов этого вируса (белков фосфопротеина Р и гемагглютинина Н) и ряда других морбилливирусов.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить нуклеотидные последовательности генов Р и Н изолята вируса байкальской нерпы.

2. Сравнить полученные последовательности с аналогичными структурами других морбилливирусов , а также всех известных изолятов СОУ.

3. С помощью молекулярно-филогенетического анализа определить систематическое положение байкальского вируса относительно других морбиливирусов.

4. Оценить отличия вируса байкальской нерпы от других, циркулирующих в природе штаммов вируса чумы плотоядных.

5. Исследовать популяцию байкальской нерпы на наличие в ней морбилливирусов после вспышки 1987/88 гг.

6. Оценить полиморфизм вирусов, циркулирующих в популяции байкальской нерпы.

Научная новизна работы. Впервые для изучения вирусного заболевания в природной популяции животных были использованы методы молекулярной биологии, включая амплификацию с использованием полимеразной цепной реакции выбранных участков генома вирусов, клонирование и последующее определение нуклеотидной последовательности полученных фрагментов.

В результате анализа нуклеотидных последовательностей однозначно установлено, что вспышка болезни на Байкале была вызвана вариантом вируса чумы плотоядных, отличным от других, циркулирующих в природе штаммов СОУ.

Показано существенное отличие вируса байкальской нерпы от морбилливирусов других морских млекопитающих, как ластоногих, так и китообразных. Продемонстрировано независимое происхождение морбилливирусов морских и пресноводных животных.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Полученные в результате работы нуклеотидные последовательности двух генов вируса байкальских тюленей и ряда других изолятов СОУ значительно расширяют существующие представления о разнообразии вирусов чумы плотоядных, циркулирующих в природе. В распоряжении исследователей оказался дополнительный материал для изучения различий между вирусами на генетическом уровне, для анализа вирусных белков и определения значения изменений в структуре генов и белков.

В ходе изучения вируса байкальской нерпы разработан и синтезирован ряд морбилливирусных праймеров для выявления и тонкого анализа любой морбилливирусной инфекции с помощью метода полимеразной цепной реакции. Отработанные методики позволяют быстро, без применения трудоёмкой стадии культивирования вируса подтвердить или опровергнуть наличие морбилливирусной инфекции, а в сочетании с методами секвенирования определить принадлежность выявленного вируса к тому или иному виду морбилливируса и показать его отличие от других близких ему вирусов. Результаты показывают, что данный подход оказался достаточно эффективным для этих целей.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Переход морбилливирусов к морским и пресноводным позвоночным произошёл независимо в нескольких эволюционных линиях.

2. Исследованный в работе вирус байкальской нерпы наиболее близок к вирусу чумы плотоядных и является отдельным вариантом последнего.

3. Вирус байкальской нерпы высоко изменчив и в популяции байкальской нерпы одновременно циркулируют несколько вариантов этого вируса.

Внедрение в практику. Полученные нуклеотидные последовательности гена Р и Н изученных штаммов СБУ депонированы в международный компьютерный банк данных ОепЬапк.

Материалы исследований используются в учебном процессе при подготовке студентов-биологов в Иркутском Государственном Университете в циклах «Молекулярная вирусология» и «Частная вирусология».

Апробация работы. Результаты исследований представлялись на Второй Верещагинской байкальской международной конференции, проходившей в 1995 г. в городе Иркутске.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано две статьи в реферируемых журналах. Одна статья находится в печати.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Бутина, Татьяна Владимировна

выводы

3. Для более точного филогенетического анализа вируса байкальских животных определена полная нуклеотидная последовательность одного из наиболее вариабельных генов морбилливирусов - гена Н белка гемагглютинина, играющего ключевую роль в определении специфичности взаимодействия вирус - хозяин.

4. Сравнение последовательности гена Н байкальского вируса с аналогичной последовательностью морбилливируса европейских тюленей позволило доказать их происхождение от родственных, но различных предков. Вместе с тем, удалось выявить ряд конвергентных мутаций, по-видимому, необходимых при адаптации морбилливирусов к водным млекопитающим.

5. Развёрнутый филогенетический анализ на основе полных последовательностей гена Н позволил количественно оценить отличие вируса байкальских тюленей от других морбилливирусов, показать его близкую связь с вирусом чумы плотоядных и определить, что вирус байкальских тюленей является отдельным вариантом вируса чумы плотоядных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Поскольку массовое заболевание байкальской нерпы стало первым зарегистрированным случаем морбилливирусной инфекции среди водных млекопитающих, это событие стало предметом всеобщего внимания. Установление факта инфицирования вирусом чумы плотоядных байкальской нерпы открыло новую сторону этого вируса. До сих пор вирус чумы плотоядных оставался самым малоизученным среди всех морбилливирусов. О восприимчивости к вирусу чумы плотоядных этого вида животных ранее не было известно, так же, как и не было известно о способности CDV инфицировать многие виды наземных животных (крупных кошачьих, гиеновых и др.).

Изучение нового варианта вируса чумы плотоядных - вируса байкальской нерпы, представляло огромный интерес, поскольку это давало возможность оценить отличие на генетическом уровне этого вируса от циркулирующих в природе штаммов CDV и определить насколько он отличается от других вариантов вируса CDY, инфицирующих различные виды наземных животных.

Сразу после идентификации вируса, вызвавшего эпизоотии у тюленей, Силом (Seal et al., 1989) было высказано предположение (без экспериментальной проверки), что причиной инфекции стали живые вакцины, которые используются в последнее время для иммунизации домашних собак, а также норок и др. животных на зверохозяйствах. Проверить же вирулентность живой вакцины для байкальских тюленей не представлялось возможным, поскольку все животные имели тесный контакт с морбилливирусом байкальской нерпы в замкнутой экосистеме озера Байкал, что подтверждает высокая частота нахождения антител к CDV в крови нерп (Grachev et al.,. 1989).

Приведенные нами данные показали, что изолят (SEAL88) вируса байкальской нерпы, полученный в 1988 г. из материала погибшего животного, резко отличается от вакцинных штаммов Onderstepoort, Rockbourn, и Convac, которые широко используются в последнее время на пушных зверофермах и для вакцинации домашних животных. Проводимый нами ПЦР-анализ образцов мозга байкальских тюленей в течение 10 летнего периода выявил только присутствие вирусов, близких или идентичных изоляту вируса байкальской нерпы, выделенному голландскими учеными в 1988 г.

Таким образом, гипотеза Сила опровергается. На основании изучения изолята 1988 г., выделенного во время вспышки эпизоотии на Байкале, а также вирусов, полученных в более поздний период, можно утверждать, что байкальская нерпа не была заражена вакцинным штаммом CDV.

Полученные нами результаты полностью подтверждают данные предварительных исследований вируса байкальской нерпы, проведенных на основе серологических испытаний сывороток животных, а также анализа частичной структуры гена белка фосфопротеина Р. Теперь с полной уверенностью можно сказать, что вирус байкальских тюленей является штаммом вируса чумы плотоядных, отличным от других вариантов этого вируса. Как стало известно, CDV поражает разные виды отряда хищных Carnivora - Aïluridae, Canidae, Hyaenidae, Mustelidae, Procyonidae, Ursidae, Viverridae, и теперь ещё Felidae (Visser et al., 1993c; Appel et al., 1994; Appel et al., 1995). Этим он сильно отличается от другого морбилливируса - вируса кори (MV), который поражает исключительно приматов. Поскольку MV является типичным представителем всего рода Morbillivirus, по аналогии с ним считалось, что все морбилливирусы имеют ограниченный круг хозяев. Как теперь видно, CDV таковым не является. Кроме того, в процессе эволюции он стал патогенным и для водных млекопитающих. И передаваться он может не только от наземных животных к морским, но и от морских к

112 наземным. Примером тому послужил случай заболевания норок на одной из ферм в Дании, инфицированных, как оказалось, вирусом европейских тюленей РЭУ (ВНхепкгопе-МоНег et а1, 1990).

Анализ всех известных вариантов вируса чумы плотоядных показал, что все они прежде всего отличаются по географическому распространению. Правда остаётся не объяснимым факт о сильном сходстве вируса байкальской нерпы с изолятом СБУ от собаки из Гренландии. Показано также, что в некоторых случаях различные штаммы вируса чумы плотоядных могут отличаться и по способности инфицировать различные виды животных.

Выявленные отличия вакцинных штаммов СБУ от циркулирующих в природе вирусов чумы плотоядных несомненно приводят к существенным отличиям в иммунном ответе на генетически отдалённые варианты вируса. Подтверждением этого служат зарегистрированные недавно во Франции, Германии, Скандинавии и других европейских странах (ВНхепкгопе-МоНег а1., 1993; Нааэ е( а1., 1997), а также в Японии (Г\уа1Бикл ег а1., 1997) случаи вспышки «чумки» у собак, многие из которых были предварительно иммунизированы. Таким образом, в последнее время появилась угроза того, что используемые СБУ-вакцины становятся неэффективными для защиты от всех, циркулирующих в природе, вариантов этого вируса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бутина, Татьяна Владимировна, Владивосток

1. Баранова Л.В., Бейм A.M., Беликов С.И. и др. Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы (1987/88 г.). Новосибирск: Наука. Сиб отд-ние. -1992.-71 с.

2. Борисова Т.И., Лескова В.В., Новожилов С.С., Титенко A.M. Нейтрализующие морбилливирус антитела в популяции байкальских нерп Phoca sibirica // Вопросы вирусологии. 1993. - № 1. - С. 28-30.

3. Борисова Т.И. Изоляция морбилливируса от байкальской нерпы и его биологические свойства: Автореф. дис. канд. биол. наук Томск, 1995. -19 с.

4. Букринская А.Г., Зайдес В.М. Молекулярная биология парамиксовирусов. -М.: Медицина. 1978. - С. 183.

5. Мазин A.B., Кузнеделов К.Д., Краев A.C., Холодилов Н.Г., Блинов А.Г. и др. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Новосибирск: Наука, 1990.-С. 248.

6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование М: Мир, 1984.-432 с.

7. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. (Практическое пособие). М: Наука, 1981.-288 с.

8. Пастухов В.Д. Нерпа байкала: биологические основы рационального использования и охраны ресурсов. Новосибирск: ВО «Наука». Сиб. изд-ая фирма. - 1993. - 272 с.

9. Сиссонс Г.П., Олдстоун М.Б., Иоклик В.К. и др. Вирусология в 3-х т. Под ред Б. Филдса, Д. Найпа М.: Мир. - 1989.

10. Титенко A.M., Борисова Т.Н., Бейм A.M., Новожилов С.С., Куделин В.Н., Зорин В.Л., Кумарев В.П., Колесник B.C. Экспериментальное инфицирование нерпы Phoca sibirica морбилливирусом // Вопросы вирусологии. 19916.- №6. - С. 511-512.

11. Appel M.J.G., Reggiardo C., Summers B.A., Pearce-Kelling S., Mare C.J., Noon T.H., Reed R.E., Shively J.N. and Orvell C. Canine distemper virus infection and encephalitis in javelinas (collared peccaries) // Arch. Virol. 1991. -V. 119.-P. 147-152.

12. Baron M., Subbarao S.M. and Barrett T. Cloning and sequence analysis of the phosphoprotein (P) gene of rinderpest virus // J. Gen. Virol. 1993.

13. Baron M. and Barrett T. The sequence of the N and L genes of rinderpest virus, and the 5" and 3" extra-genic sequences: the completion of the genome sequence of the virus // Vet. Microbiol. 1995. - V. 44. - P.175-186.

14. Barrett T., Shimpton S.B., Russel S.E.H. Nucleotide sequence of the entire protein coding region of canine distemper virus polimerase associated (P) ptotein mRNA // Virus Research. 1985. - V. 3 - P. 367-372.

15. Barrett T., Mahy B.W.J. Genome organisation and genetics relationships among the morbilliviruses // Rev. sci. tech. Off. int. Epiz. 1986. -V. 5, N. 2. - P. 395405.

16. Barrett T, Subbarao S.M., Belsham G.J., Mahy B.W.J. The molecular biology of morbilliviruses. In Kingsbury D. (ed.), The Paramyxoviruses. Plenum Press, New York. - 1991.-P. 83-102.

17. Barrett T.,Growther J., Osterhaus A.D.M.E. et.al. Molecular biological and serological studies on the recent seal virus epizootics in Europe and Siberia // Sci.TotelEnviron.-1992.-V. 115.-P. 117-132.

18. Barrett T, Romero C.H., Baron M.D., Yamanouchi K., Diallo A., Bostock C.J. and Black D. The molecular biology of rinderpest and peste des petits ruminants // Ann. Med. Vet. 1993a. - V. 137. - P. 77-85.

19. Barrett T., Visser I.K.G., Mamaev L.V., Goatley L., Van Blessem M.-F., Osterhaus A.D.M.E. Dolphin and porpoise morbilliviruses are genetically distinct from phocine distemper virus // Virology. 1993b. - V. 193. - P. 1010-1012.

20. Beckford A.P., Kaschufa R.O.C., Stephan C. Factors associated with fatal cases of measles: a retrospective autopsy study // S. Afr. Med. J. 1985. - V. 68. - P. 858-863.

21. Bellini W.J., Englund G., Rozenblatt S. et al Measles virus P gene codes for two proteines // J. Virol. 1985. - V. 53. - P. 908-919.

22. Belykh O., Goldberg O., Likhoshway Y.V., Grachev M.A. Light, electron and immuno-electron microscopy of organs from seals of Lake Baikal sampled during the morbillivirus infection of 1987 1988. // Europ. J. of Vet. Path. -1987. -V. 3,N. 3. - P. 133-145.

23. Bengtson J.L., Boveng P., Franzen U., Have P., Heide-Jorgensen M.-P. and Harkonen T.J. Antibodies to canine distemper virus in antarctic seals // Marine Mammals Sci. 1991. - V. 7. - P. 85-87.

24. Black F.L. Epidemiology of paramyxoviruses. In Kingsbury D. (Ed.), The paramyxoviruses New York, Plenum Press. - 1991. - P. 509-536.

25. Blixenkrone-Moller M., Svansson V., Orvell C. & Have P. Phocid distemper virus -a threat to terrestrial mammals? // Vet. Rec. 1990. - V. 127. - P. 263-264.

26. Blixenkrone-Moller M., Svansson V., Have P., Orvell C., Appel M., Pedersen I.R., Dietz H.H. and Henriksen P. Studies on manifestations of Canine distemper virus infection in an urban dog population // Vet. Microbiol. 1993. - V. 37. -P. 163-173.

27. Blixenkrone-Moller M., Bolt G., Gottschalk E. And Kentner M. Comparative analysis of the gene encoding the nucleocapsid protein of the dolphin morbilliviruses // J. Gen. Virol. 1994. - V. 75. - P. 2829-2834.

28. Bohn W., Ciampor F., Rutter R., Mannweiler K. Localization of nucleocapsid associated polypeptides in measles virusinfected cells by immunogold labelling after resin embedding // Arch. Virol. 1990. - V. 114. - P. 53-64.

29. Bortolotto A., Casini L., Stanzani L.A. Dolphin mortality alone the Southern Italian coast // Aquatic Mammals 1992. - V.5. - P. 35-37.

30. Buchhold C.J., Spehner D., Drillien R., Neubert W.J. and Homann H.E. The conserved N-terminal region of Sendai virus nucleocapsid protein NP is required for nucleocapsid assembly // J. Virol. 1993. - V. 67. - P. 5803-5812.

31. Cattaneo R., Rebmann G., Baczko K., Meulen V.Ter and Billeter M.A. Altered ratios of measles virus transcripts in diseased human brains // Virology. -1987.-V. 160.-P. 523-526.

32. Cattaneo R., Rebmann G., Schmidt A., Altered transcription of a defective measles virus genome derived from a diseased human brain // EMBO J. 1987a. -V. 6.-P. 681-688.

33. Cattaneo R., Rebmann G., Baczko K., Meulen V.Ter and Billeter M.A. Altered ratios of measles virus transcripts in diseased human brains // Virology. -1987b.-V. 160.-P. 523-526.

34. Cattaneo R., Kaelin K., Baczko K., Billeter M.A. Measle virus editting provides an additional cystein-rich protein // Cell. 1989. - V. 56. - P. 759-764.

35. Chamberlain R.W., Wamwayi H., Hockley E., Subbarao S.M., Goatley L., Knowles N.J. and Barrett T. Evidence for different lineages of rinderpest virus reflecting their geographic isolation // J. Gen. Virol. 1993. - V. 72. - P. 443-447.

36. Chomczynski P. and Sachi N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. -1987.-Vol. 162.-P. 156-159.

37. Curren M.D., CTLoanD., Rima B.K., Kennedy S. Nucleotide sequence analysis of phocine distemper virus // Veterinary Record. 1990. - V. 127. - P.430-431.

38. Curran J., Boeck R. and Kolakofsky D. The Sendai virus P gene expresses both an essential protein and an inhibitor of RNA synthesis by shuffling modules via mRNA editing // EMBO J. 1991. - V. 10. - P. 3079-3085.

39. Curran M.D. and Rima,B.K. The genes encoding the phospho- and matrix proteins of phocine distemper virus // J. Gen. Virol. 1992. - V. 73, Pt 6. - P. 15871591

40. Curran J., Marq J.-B. and Kolakofsky D. The Sendai virus non-structural proteins specifically inhibit viral mRNA synthesis // Virol. 1992. - V. 189. - P. 647656.

41. Curran J., Pelet T. and Kolakofsky D. An acidic activation-like domain of the P protein is required for RNA synthesis and encapsidation // Virology. 1994. -V. 202.-P. 875-884.

42. Curran J., Marq J.-B. and Kolakofsky D. An N-terminal domain of the Sendai paramyxovirus P protein acts as a chaperone for the NP protein during the nascent chain assembly step // J. Virol. 1995. - V. 69. - P. 849-855.

43. Deshpande K.L., Portner A. Monoclonal antibodies to the P protein of Sendai virus define its structure and role in transcription // Virology. 1985. - V. 140. - P. 125-134.

44. Dietz R., Ansen C.T., Have P., Heide-Jorgensen M.P. Clue to seal epizootic? // Nature. 1989. - V. 338. - P. 627.

45. Domingo M., Ferrer L., Pumarola M., Marco A., Plana J., Kennedy S., McAliskey M., Rima B.K. Morbillivirus in dolphins // Nature. 1990. - V. 348. - P. 21.

46. Domingo M., Vilafranca M., Visa J., Prats N., Trudgett A., Visser I. Evidence for chronic morbillivirus infection in the Mediterranean striped dolphin {Stenella coeruleoalba) II Vet. Microbiology. 1995. - V. 44. - P. 229-239.

47. Duignan P.J., Saliki J.T., St. Aubin D.J., House J.A. and Geraci J.R. Neutralizing antibodies to phocine distemper virus in Atlantic Walruses (Odobenusrosmarus rosmarus) from Arctic Canada // J. Wildl. Dis. 1994. - V. 30. -P. 90-94.

48. Duignan P.J., House C., Geraci J.R., Duffy N., Rima B.K., Walsh M.T., Early G., Aubin D.J., Sadove S., Koopman H., Rhinehart H. . Morbillivirus infection in cetaceans of the western Atlantic // Vet, Microbiology. 1995b. - V. 44. - P. 241-249.

49. Eckert K.A., Kunkel T.A. High fidelity DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polimerase // Nucleic Acids Res. 1990. - V. 37. - P. 165-167.

50. Felsenstein J. Evolutionary trees from DNA sequences: a maximum likelihood approach // J. Mol. Evol. 1981. - V. 17. - P. 368-376.

51. Felsenstein J. PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.5c. Department of Genetics. University of Washington. Seattle. 1993.

52. Francki R.I.B., Fauquet C.M., Knudson D.L., Brown F. (eds) Classification and nomenclature of viruses. Fifth report of the International Commitee on Taxonomy of Viruses // Arch. Virol. 1991. - Supple 2.

53. Gargadennec L. and Lalanne A. La peste des petits ruminants. Bulletin des services Zootechniques et des Epizootics de L'Afrique Occidentale Française. 1942. -V. 5.-P. 16-21.

54. Goodhart C.B. Seal deaths // New Scientist. 1988a. - 29 Sep. - P. 101

55. Goodhart C.B. Did virus transfer from harp seal to common seal? // Nature. -1988b. V. 336, 3 Nov. - P. 101.

56. Haig D.A. Canine distemper-immunization with avianised virus Onderstepoort // J. Vet. Res. 1956. - V. 27. - P. 19-53.

57. Haas L., Martens W., Ggeiser-Wilke I., Mamaev L., Butina T.V.,Maak D., Barrett T. Analysis of the haemagglutinin gene of current wild-type canine distemper virus isilates from Germany // Virus Reseach. 1997. - V. 48. -P. 165-171.

58. Hanahan D. Techniques for transformation of E.coli. In: DNA cloning / Ed. D.M. Glover. Oxford, Washington DC: IRL. Press. - 1985. - V. 1 - P. 109-136.

59. Hartley W.J. A post-vaccional inclusion body encephalitis in dogs // Vet. Pathol. -1974.-V. 11.-P. 301-312.

60. Harder T.C., Moennig V., Greiser-Wilke I., Barrett T., Liess B. Analysis of antigenic differences between sixteen phocine distemper virus isolates and other morbilliviruses // Arch. Virol. 1991. - V. 118. - P. 261-268.

61. Harder T.C., Kenter M., Appel M.J.G., Roelke-Parker M.E., Barrett T. and Osterhaus A.D.M.E. Phylogenetic evidence of canine distemper virus in Serengetfs lions // Vaccine. 1995. - V. 13. - P. 521-523.

62. Harder T.C. and Osterhaus A.D.M.E. Canine distemper virus a morbillivirus in search of new hosts? // Trends Microbiol. - 1997. - V. 5. - P. 120-124.

63. Harwood J. Lessons from the seal epidemic // New Scien. 1989. - V. 121. - P. 3841.

64. Jenner E. (cited by Kirk H.) Canine distemper, its complications, sequalae and treatment. 1st Ed., Baillere, Tindall and Cox, London. 1809. - P. 1922.

65. Junean M.L. Famille des Paramyxoviridae // Can J. Med. Technol. 1991. -V. 53.-P. 169-173.

66. Kamata H., Tsukiyama K., Sugiyama M., Kamata Y., Yoshikawa Y., and Yamanouchi K. Nucleotide sequence of cDNA to the rinderpest virus mRNA encoding the nucleocapsid protein // Virus Genes. 1991. - V. 5. - P. 5-15.

67. Kennedy S., Smyth J.A., Cush P.F., McCullough S.J., Allan G.M., McQuaid S. Viral distemper now found in porpoise // Nature, London. 1988. - V. 336. -P. 21

68. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences // J. Mol. Evol. 1980. -V. 16.-P. 111-120.

69. Mamaev L.V., Visser I.K.G., Belikov S.I., Denikina N.N., Harder T., Goatley L., Rima B., Edginton B., Osterhaus A.D.M.E., Barrett T. Canine distemper virus in Lake Baikal seals (Phoca sibirica) // Veterinary Record. 1996. - V. 138. -P. 437-439.

70. Maxam A.M., Gilbert W.A. A new method for sequencing DNA // Proc. Nat. Acad. Sci. US., 1977. V. 174. - P. 560-564.

71. Mcllhatton M.A., Curran M.D. and Rima B.K. Nucleotide sequence analysis of the large (L) genes of phocine and canine distemper virus (corrected sequence) // J. Gen. Virol. In press.

72. McNeill W.H. Plagues and peoples: a naturai history of infectious disease Garden City, New York: Anchor Press, Doubleday. - 1976. - P. 76.

73. Norrby E., Utter G., Orvell C., Appel M.J.G. Protection against canine distemper virus in dogs after immunization with isolated fusion protein // J. Virol., 1986 -V. 58.-P. 536-541.

74. Orvell C., Norrby E. Immunological relationships between homologous structural polypeptides of measles and canine distemper virus // J. Gen. Virol. 1980. -V. 50.-P. 231-232.

75. Orvell C., Blixenkrone-MollerM., Svansson V., Have P. Immunological relationships between phocid and canine distemper virus studied with monoclonal antibodies // J. Gen. Virol. 1990. - V. 71. - P. 2085-2092.

76. Osterhaus A.D.M.E., Yang H., Spijkers H.E.M., Groen J., Teppema J.S., van Steenis G. The isolation and partial characterization of a highly pathogenic herpesvirus from the Harbor seal // Arch. Virol. 1985. -V. 86 - P. 239-251.

77. Osterhaus A.D.M.E. Seal death // Nature. 1988a. - V. 334. - P. 301-302.

78. Osterhaus A.D.M.E. Identification of virus causing resent seal deaths // Nature -1988b.-V. 335.-P. 20.

79. Osterhaus A.D.M.E., Groen J., Vries P.D., Uytdehaag F.G.C.M., UytdeHaag F.G.C.M., Klingeborn B., Zarnke R. Distemper virus in seals // Nature -1988c. V. 335. - P. 403-404.

80. Osterhaus A.D.M.E., Groen J., Uytdehaag F.G.C.M. Distemper virus in Baikal seals // Nature. 1989a. -V. 338. - P. 209-210.

81. Osterhaus A.D.M.E., Groen J., Uytdehaag F.G.C.M, Visser I.K.G. et.al. Morbillivirus infections in European seals before 1988.11 Veterinary Record. -1989b. V. 125, No 326. - P. 56.

82. Osterhaus A.D.M.E., Broeders H.W.J., Groen J. et.al. Different morbilliviruses in European and Siberien seals // Veterinary Record. 1989c. - V. 125. - P. 647648.

83. Osterhaus A.D.M.E., Groen J., Spiykers H.E.M. et al. Mass mortality in seals caused newly discovered virus-like morbillivirus // J. Vet. Microbiol. 1990. -V. 23.-P. 343-350.

84. Osterhaus A.D.M.E., Visser I.K.G., De Swart R.L. et al. Morbillivirus threat to Mediterranean monk seals? // Vet. Rec. 1992. - V. 130. - P. 141-142.

85. Osterhaus A.D.M.E., de Swart R.L., Vos H. W., Ross P.S., Kenter M.J.H., Barrett T. Morbillivirus infections of aquatic mammals: newly identified members of the genus // Vet. Microbiology. 1995. - V. 44. - P. 219-227.

86. PCR technology Principles and applications for DNA amplification. Erlich H.A. (ed). - New York: Stokton Press. - 1988. - P. 289.

87. Peeples M.E. Paramyxovirus M proteins: Pulling it all together and taking it on the road. In: Kingsbury D.W. (Eds.) The paramyxoviruses. Plenum press: New York.-1991.-P. 427-456.

88. Richardson C.D., Scheid A., Choppin P.W. Specific inhibition of paramyxovirus replication by oligoprptides with amino acid sequences similar to those at the N-termini of the F1 or HA2 viral polypeptides // Virilogy. 1980. - V. 105. -P. 205-222.

89. Rima B.K. The proteins of morbilliviruses // J. Gen. Virol. 1983 - V. 64. -P. 1205-1219.

90. Rockborn G. Canine distemper virus in tissue culture // Arch. Ges. Virusforsch -1958.-V. 8.-P. 485-492.

91. Rockborn G. An attenuated strain of canine distemper virus in tissue culture // Nature (London). 1959. - V. 184. - P. 822.

92. Ross P.S., Visser I.K.G., Broeders H.W.J., van de Bildt M.W.G., Bowen W.D. and Osterhaus A.D.M.E. Antibodies to phocine distemper virus in Canadian seals // Vet. Rec. 1992. -V. 130. -P.514-516.

93. Rozenblatt S., Eizenberg O., Ben-levy R., et al Sequence homology within the morbilliviruses // J. Virol. 1985. - V. 53, 2. - P. 684-690.

94. Rima B.K. The proteins of morbilliviruses // J. gen. Virol. 1983. - V. 64. -P. 1205-1219.

95. Sambrook J., Fritch E.F., Maniatis T. Molecular cloning a laboratory manual NY: Gold Spring Harbor Lab. Press. - 1989. - P. 500.

96. Sanger F., Niclen S., Coulson A.R. DNA Sequence with chain-therminating ingibitors // Ibid., 1978. V. 304. - P. 5463-5467.

97. Seal J.J. Seal deaths // Royal Soc. Med. 1989. - V. 82. - P. 519-524.

98. Shesberadaran H., Norrby E., McCullough K.C. et al. The antigenic relationship between measles, canine distemper and rinderpest virus studied with monoclonal antibodies // J. Gen Virol. 1986. - V. 67. - P. 1381-1392.

99. Stettler M., Zurbriggen A. Nucleotide and deduced amino acid sequences of the nucleocapsid protein of the virulent A75/17-CDV strain of canine distemper virus // Vet. Microbiology. 1995. - V. 44. - P. 211-217.

100. Svansson V., Blixenkrone-Moller M., Skirnisson K., Have P., Heje N.-I., Nielsen J., Lund E. Infection studies with canine distemper virus in harbour seals // Arch Virol.-1993.-V. 131.-P. 349-359.

101. Taylor M.J., Godfrey E., Baczko K., ter Meulen V., Wild T.F. and Rima B.K. Identification of different lineages of measles virus // J. Gen. Virol. 1991. -V. 72.-P. 83-88.

102. Tamin A., Rota P.A., Wang Z., Heath J.L., Anderson L.J. and Bellini W.J. Antigenic analysis of current wild type and vaccine strains of measles virus // J. Infect. Dis. 1994. - V. 170. - P. 795-801.

103. Thomas S.M., Lamb R.A. and Paterson R.G. Two mRNAs that differ by nontemplated nucleotides encode the amino coterminal proteins P and V of the paramixovirus SV5 // Cell. 1988. - V. 54. - P. 891-902.

104. Van Blessem M.F., Visser I.K.G., van de Bildt M.W.G. Teppema J.S., Raga J.A., Osterhaus A.D.M.E. Morbillivirus infection in Mediterranean striped dolphins (Stennella coeruleoalba) II Vet. Rec. 1991. - V. 129. - P. 471-472.

105. Van Blessem M.F., Visser I.K.G., De Swart R.L., Orvell C., Stanzani L., Androukaki E., Siakavara K., Osterhaus A.D.M.E. Dolphin morbillivirus infection in different parts of the Mediterranean Sea // Arch Virol. 1993. -V. 129.-P. 235-242

106. Vandevelde M. and Zurbriggen A. The neurobiology of canine distemper virus infection // Vet. Microbiol. 1995. - V. 44. - P. 271-280.

107. Visser I.K.G., Kumarev V.P., Orvell C., de Vries P., Broeders H.W.J., van de Bildt M.W.G., Groen J., Teppema J.S., Burger M.C., UytdeHaag F.G.C.M.,

108. Osterhaus A.D.M.E. Comparison of two morbilliviruses isolated from seals during outbreaks of distemper in North West Europe and Siberia // Arch. Virol.-1990.-V. 111.-P. 149-164.

109. Visser I.K.G., Van Blessem M.-F., Barrett T., Osterhaus A.D.M.E. Morbillivurus infections in aquatic mammals // Vet. Res. 1993c. - V. 24. - P. 169-178.

110. Wardrop E.A., Briedis D.I. Characterization of V Protein in Measlse virus-infected cells // Virology. 1991, July. - P. 3421-3428.

111. Wild T.F., Malvoisin E., Buckland R. Measles virus: Both the gaemagglutinine and fusion glycoproteins are required for fusion // J. Gen. Virol. 1991. - V. 72. -P. 439-442.

112. Wild T.F., Naniche D., Rabourdin-Combe C., Gerlier d., Malvoisin E., Lecouturier V., Buckland R. Mode of entry of morbilliviruses // Vet. Microbiol. 1995. -V. 44. - P. 267-270.

113. Wilkinson L. Rinderpest and mainstream infectious disease concepts in the eighteenth century // Medical History. 1984. - V. 28. - P. 129-150.129

114. Yu M., Hansson E., Shiell B., Michalski W., Eaton B.T., Wang L.F. Sequence analysis of the Hendra virus nucleoprotein gene: comparison with other members of the subfamily Paramyxovirinae // J Gen Virol. 19986, Jul. -V. 79, Pt 7. - P. 1775-1780.

Информация о работе

Бутина, Татьяна Владимировна
кандидата биологических наук
Владивосток, 2000
ВАК 03.00.06

Диссертация

Изучение морбилливируса байкальской нерпы методами молекулярной биологии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно