Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изоляция морбилливируса от байкальской нерпы и его биологические свойства

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изоляция морбилливируса от байкальской нерпы и его биологические свойства"

пг. на правах рукописи

РГГ) ОД ноя №ог

БОРИСОВА Татьяна Ивановна

ИЗОЛЯЦИЯ МОРБИЛЛИВИРУСА ОТ БАЙКАЛЬСКОЙ НЕРПЫ И ЕГО БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

03.00.06 - вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ТОМСК, 1995

Работа выполнена в Иркутском ордена Трудового Красного Знамен! научно-исследовательском противочумном институте Сибири и Дальней Востока Государственного комитета санитарно-зпидемиологическоп надзора Российской Федерации

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Титенко А.М.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Соляник Р.Г. кандидат биологических наук Уразова Л.Н.

Ведущее учреждение:

Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций

Защита состоится "_ " _1995 г. в_часов га

заседании специализированного совета К.098.11.01 по присужденик ученой степени кандидата биологических наук при Томском орденг Трудового Красного Знамени научно-исследовательского институте вакцин и сывороток (634050, Томск, пр. Ленина, 32).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Томского научно-исследовательского института вакцин и сывороток.

Автореферат разослан " " ^О^УиЛ^- 1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук Полещук Л.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В 1987 г. на озере Байкал зарегистрирована эпи-оотия среди тюленей РИоса .ч!Ыпса . в результате которой только в осен-[е-зимний период 1987-1988 гг. погибло свыше 7 тысяч животных. Мас-овая гибель тюленей привлекла внимание общественности, ученых и дминистративных органов. С целью расследования причин эпизоотии >ыла создана комплексная межведомственная комиссия (правительст-енная телеграмма № 14 663-54-10 от 16 декабря 1987 г.), которой было юручено организовать изучение причин массовой гибели тюленей. Не-колько институтов различных ведомств были привлечены дли отроет -:и версий возможной гибели нг^п от бактериальной и вирусной инфекций, токсинов и инвазий.

Было известно, что в 1979-1980 гг. у побережья Новой Англии около 00 тюленей погибло от заражения вирусом гриппа А(Н7Ш). Позднее тмечена гибель 60 животных от вируса гриппа А(Н4№). Наконец, в 984 г. у берегов Голландии 11 тюленей умерло от заражения герпесви-усом. Другие случаи массовой гибели водных млекопитающих живот-[ых в таких масштабах, как это произошло с нерпой озера Байкал, не ыли известны.

Важным с точки зрения санитарной охраны территории аспектом проблемы явилось апробация комплекса вирусологических методов для ;ервичной изоляции вируса в реальных условиях расследования массо-ого заболевания неясной этиологии. Необходимо было выяснить при-ины массовой гибели нерп, установить степень опасности этой эпи-оотии для популяции нерпы озера Байкал, человека, сельскохозяйственных, диких животных и окружающей среды.

Таким образом, актуальность работы определялась острой необхо-имостыо изучения причин массовой гибели нерп озера Байкал по масштабам не имевшей аналогов в мире среди водных млекопитающих, и цепки возможных последствий этой эпизоотии.

Цель исследования. Расследование причин массовой гибели нерпы [а озере Байкал с помощью вирусологических методов. Изучение мор-илливирусной инфекции у байкальских тюленей.

Основные задачи:

. Изоляция и идентификация вирусных агентов от нерп озера Байкал. . Отработка оптимальных методов изоляции вирусов от больных и

павших животных. . Биологическая характеристика изолированных агентов. . Серологическое обследование популяции байкальской нерпы на наличие антител к морбилливирусам.

Научная новизна. Впервые установлено, что массовая гибель вод-:ых млекопитающих вызвана морбилливирусом. Получены приоритет -[ые данные об изоляции морбилливирусов от тюленей, инфицировании в естественных условиях. На основе выделенного от тюленей мор-

билливируса впервые разработана и апробирована иммуноферментна* тест система для определения специфических антител. Показано, чтс значительная часть популяции имеет антитела к морбилливирусу (в 198S г. - 58.0%, 76.3% и 73.2% , были выявлены методом иммуноферментногс анализа в 1990 и 1993 гг., 61.4% и 76.1% животных имели антитела, выявляемые в реакции нейтрализации. Выделенный вирус способен инфицировать нерпу с индукцией антител.

Научно-практическая ценность. Расшифрована этиология инфекционного заболевания, вызвавшего массовую гибель байкальской нерпы От больных и погибших животных выделен возбудитель и определена его таксономическая принадлежность.

С использованием оригинальных штаммов морбилливируса впервые разработан метод клеточного иммуноферментного анализа для определения специфических антител. На основе полученных данных разработано методическое пособие "Мониторинг морбилливирусов у тюленей Байкала" (Утверждено на Ученом Совете Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока 02 февраля 1994 г.).

На защиту выносятся следующие положения:

1. Изоляция и идентификация морбилливирусов от нерп.

2. Биологические свойства выделенного вируса.

3. Определение специфических антител у тюленей Байкала, методом клеточного иммуноферментного анализа и в реакции нейтрализации.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены:

- Научных конференциях Иркутского научно-исследовательского про-

тивочумного института. Иркутск, 1989, 1990, 1991 гг.;

- Десятом Всесоюзном совещании "По изучению, охране и рациональ-

ному использованию морских млекопитающих". Светлогорск, Калининградской области, 1990 г.;

- Научно-практической конференции "Состояние здоровья населения

города Иркутска в связи с техногенным загрязнением окружающей среды". Иркутск, 1991 г.;

- Международном симпозиуме "Проблемы патологии и охраны здоро-

вья диких животных, экологическое взаимодействие болезней диких и сельскохозяйственных животных". Астрахань, 1992 г.;

- Научно-практической конференции "Проблемы природно-очаговых и

зоонозных инфекций в Сибири и на Дальнем Востоке". Чита, 1993 г.

- Международной конференции "Ninth International conference on Nega-

tive Strand Viruses". Estoril, Portugal, 1994. В окончательном варианте диссертация апробирована на заседании Ученого Совета Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока 7 апреля 1995г. и на заседании

{иссертационного Совета при Томском ордена Трудового Красного ;намени института вакцин и сывороток НПО "Вирион" (протокол № 3 >т 19.06.95 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано семь ста-•ей, семь тезисов и докладов и одно методическое пособие.

Объем и структура работы. Рукопись диссертации содержит: введение, >бзор литературы (главы 1-2), описание материала и методов (глава 3), пложение собственных экспериментальных результатов (главы 4-5), включение, выводы и список литературы. Общий объем рукописи 88 страниц, включая 8 таблиц, 10 рисунков. Список литературы мч^ржит 18 отечественных к 66 -»ярубе^сцых иошчников.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Обзор литературы состоит из двух глав. В первой главе описаны :овременная классификация и роль морбилливирусов в патологии мле-сопитающих и человека, во второй - роль морбилливирусов в инфекци->нной патологии морских тюленей, антитела к морбилливирусам в по-туляции тюленей, биологические и молекулярно-биологические свойства морбилливирусов тюленей, а также особенности среды обитания байкальской нерпы, представителя пресноводных ластоногих. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материал и методы. Объектом настоящего исследования была бай-сальская нерпа. Материалом для вирусологического исследования слу-кили внутренние органы больных и погибших нерп, которые были взяты в период эпизоотии на озере Байкал в декабре 1987 г., а также сыво-эотки клинически здоровых животных, собранных в разные годы. Экс-терименты по изоляции вирусных агентов проводили на морских свиных, белых мытах различного возраста, куриных эмбрионах, первично-грипсинизированных и перевиваемых культурах клеток. Для экспериментального заражения выделенным вирусом использовали байкальскую 1ерпу в возрасте 5 месяцев. В момент сбора материала для вирусологи-геского исследования отмечали основные симптомы заболевания и по-зедения животных. Сбор сывороток крови проводили в различные годы, з период распада льдов весной и осенью во время плановой добычи терп охотниками и научных командировок. Одновременно был определи возраст и пол животных.

В работе использовали методы изоляции вирусных агентов и метода тестирования специфических антител: реакцию непрямой иммуноф-пооресценции, твердофазный иммуноферментный метод и его модифи-<ации, реакцию нейтрализации. Очищенные антигены получали мето-юм ультрацентрифугирования.

Сбор материала для вирусологического и серологического исследования, экспериментальное заражение нерпы, патогистологические и татологоанатомические исследования выполнены совместно с сотрудниками Иркутского научно-исследовательского противочумного инсти-

тута, Иркутского Лимнологического института и института экологичес кой токсикологии г. Байкальска. РЕЗУЛЬТАТЫ ВИРУСОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛА ОТ НЕРП

Нами впервые предпринята попытка вирусологического изученш органов погибших и больных нерп. Стояла задача так спланировать проведение изоляции вирусных агентов, что бы не сделать неправильно* заключение об отсутствии вирусных инфекций в результате применение непермиссйвных систем. Погибшие животные были взяты из разны? мест береговой линии Байкала. У больной нерпы удалось проследит! клиническую картину болезни. Животное (самка 6 лет - РВ-6) было снято с льдины в районе Шаманки (Слюдянский район, южная оконечность Байкала), и доставлено в аквариальную института экологической токсикологии. Нерпа находилась в беспомощном состоянии, не оказывало сопротивления. Отмечалось обильное слезотечение из глаз и временами наступала "дрожь". В бассейне за ней было организовано круглосуточное наблюдение. Было проведено лечение антибиотиками внутрь (тетрациклин, ампициллин, пенициллин, стрептомицин). После лечения, состояние животного значительно улучшилось, однако вскоре наступило ухудшение и животное погибло. При патологоанатомическом вскрытии нерпы морфологических изменений не обнаружено. Паренхиматозные органы (печень, почки, миокард) с поверхности и на разрезе без признаков дистрофии или воспалительной инфильтрации. Селезенка внешне и на разрезе без особенностей. Обращало внимание резко выраженное полнокровие легких, набухший вид и неравномерное полнокровие слизистой оболочки мочевого пузыря, без признаков воспалительного поражения.

Для изоляции вирусных агентов на моделях экспериментальных животных использовали морских свинок, белых мышей и мышей-сосунков. 10% суспензию внутренних органов от нерп 2, 3, 4 и 6 вводили внутрибрюшинно морским свинкам 0.5 мл, взрослым белым мышам -0.2 мл, новорожденным сосункам интрацеребрально по 0.01 мл. Ни при проведении "слепых пассажей", ни при выдерживании оставшихся животных в течение 30 дней, клинических проявлений заболевания не отмечено.

Изоляцию вирусных агентов осуществляли также в 9-дневных куриных эмбрионах. В каждый эмбрион вводили по 0.2 мл суспензии одного из образца исследуемого материала. Вскрытие эмбрионов, взятие аллан-тоисной и амниотической жидкости проводили на 3 и 5 сутки после заражения. При вскрытии гибели эмбрионов не отмечали, однако, во всех случаях аллантоисная жидкость была мутной, коричневого цвета. Бактериальная контаминация была исключена. В последующих пассажах аллантоисную и амниотическую жидкость после промораживания осветляли центрифугированием при 2000 об/мин. Полученные на кури-

ных эмбрионах изоляты обозначены нами как На-2, На-3, На-4 и На-6. После проведения трех последовательных пассажей, из аллантоиснои жидкости получали препараты концентрированного и очищенного вируса для идентификации.

Проведено три "слепых" пассажа образцов исследуемого материала в культуре клеток ФЭК. Изменений инфицированного монослоя клеток по сравнению с контрольными клетками не отмечено. В перевиваемых культурах клеток Vero и Hela на первом пассаже исследуемого материала отмечены незначительные изменения клеток в виде округления. На втором пассаже в инфицированных культурах обнаружено оым гигантских сшштий Наиболее ьыражениып цшопашческий

эффект получен в 3 пассаже исследуемых образцов материала из мозга нерп 2, 3, 4 и 6. Начальные этапы цитопатического эффекта характеризовались образованием гигантских многоядерных клеток-синцитиев, затем внутриядерными и цитоплазматическими включениями. Позднее происходило постепенное округление клеток, разряжение монослоя и отслоение от субстрата. На 7-9 день погибало до 70-80% клеток. Последующие серийные пассажи неразведенной культуральной жидкости инфицированной исследуемым материалом от нерпы 6 в культуре клеток Vero вызывали эффект типа spindle - появление звездчатых клеток, в то время как при пассировании культуральной жидкости разведенной в 100 раз образовывались, главным образом, гигантские клетки с последующей деструкцией монослоя. Полученные инфекционные агенты обозначены нами как Н-2, Н-3, Н-4 и Н-6.

Таким образом, при первичной изоляции вируса на моделях морских свинок, взрослых белых мышей, мышей-сосунков и в культуре клеток ФЭК положительных данных не получено. В куриных эмбрионах при сохранении их жизнеспособности, отмечено помутнение аллантоиснои жидкости. Бактериальная контаминация исключена (три серийных пассажа на бульоне Хоггингера и питательной среде Сабуро), в связи с чем можно предположить, что изменения аллантоисной жидкости связаны с вирусной инфекцией. В культуре клеток Vero и Hela выявлен ЦПЭ до полной деструкции монослоя клеток на третьем пассажном уровне, что также указывало на присутствие вирусного агента в образцах суспензий мозга нерп 2, 3, 4 и 6. Примененный для первичной изоляции вирусных агентов комплексный подход показал свою эффективность. Необходимо было провести идентификацию выделенных инфекционных агентов.

Идентификация выделенных инфекционных агентов

Идентификацию инфекционных агентов проводили методами электронной микроскопии, непрямой иммунофлюоресценции и методом иммуноферментного анализа. Для электронной микроскопии и твердофазного иммуноферментного анализа использовали концентрированные очищенные ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы вирусы. Для непрямой иммунофлюоресценции монослой заражен-

ных клеток. В препаратах очищенного вируса с плавучей плотностью 1.18 г/см3 при электронной микроскопии выявлены сферические, гетерогенные по размерам частицы с диаметром около 100 нм. Результаты клинических наблюдений за нерпами и данные электронной микроскопии указывали, что вирусный агент, вызвавший заболеваемость и смертность тюленей может быть близок к вирусу чумы плотоядных.

В следующей серии экспериментов проведена идентификация выделенных вирусных агентов методом непрямой иммунофлюоресценции. Для этого зараженные изолятами Н-2, Н-3, Н-4 и Н-6 клетки использовали как слайд-антигены. Антителами - коммерческий препарат иммуноглобулинов человека против вируса кори, сыворотка от больной нерпы (нерпа-9) и сыворотка каспийского тюленя. Отрицательными контролями монослой незараженных клеток, слайд-антигены вируса Синд-бис и нормальная сыворотка кролика. Результаты изучения клеток, инфицированных выделенными от нерп вирусных агентов в непрямой иммунофлюоресценции представлены в таблице 1. Таблица 1. Идентификация методом непрямой иммунофлюоресценции

выделенных от нерп вирусных агентов.

№ п/п Антитела (сыворотка) Обратные титры антител

Изолят вируса

Н-2 Н-3 Н-4 Н-6

1 Сыворотка нерпы 64 64 128 128

2 Иммуноглобулины человека против кори 512 128 256 512

3 Сыворотка каспийского тюленя отрицат. отрицат. отрицат. отрицат.

Из приведенных данных следует, в сыворотке каспийского тюленя не содержится антител к выделенным от нерп вирусам, в то время как коммерческие противокоревые иммуноглобулины реагируют со всеми изолятами от нерп в высоких титрах. Учитывая то, что вирус кори несет морбилливирусоспецифические антигенные детерминанты, можно заключить, что выделенные от нерп вирусы относятся к роду Морбилли-вирус. Особый интерес представляют данные, полученные с применением сыворотки от нерпы 9. Клинические симптомы болезни этого животного соответствовали таковым у нерпы 6, что описаны ранее. Выявление к выделенным нами изолятами антител у больной нерпы подтверждает этиологию заболевания.

По результатам идентификации методом нМФА, выделенные в культуре клеток вирусы отнесены нами к роду Морбилливирус. ■ 8

Несомненный интерес представляли агенты полученные из того же ¡сходного материала и вызывающие помутнение аллантоиса при сохра-[ении жизнеспособности куриных эмбрионов. Нами получены частич-ю очищенные концентрированные препараты-антигены изолятов Н-2, 1-3, Н-4 и Н-6 из аллантоисной жидкости. Б таблице 2 приведены ре-ультаты идентификации вирусов из аллантоисной жидкости с набором ывороток и моноклональными антителами.

аблица 2. Идентификация методом твердофазного иммуноферментного анализа выделенных от нерп BHpvrwwx агспюи

№ п/п Антитела (сыворотка) Обратные титры антител

Изолят вируса

Н-2 н-з Н-4 Н-6

1 Сыворотка нерпы Н-9 1280 1280 10240 1280

2 Сыворотка нерпы Н-123 100 200 800 400

3 г-5бз отрицат. 200 3200 200

4 г-бп отрицат. 200 отрицат. 400

5 ВК-228 100 400 800 400

6 1.ЕК-27 отрицат. 100 5200 100

7 Иммуноглобулины человека против кори 2560 640 400 640

3 Сыворотка каспийского тюленя отрицат. отрицат. отрицат. отрицат.

Препаратами-антигенами сенсибилизировали 96-луночные планше-ы для иммуноферментного анализа. В реакции применяли сыворотку аспийского тюленя, как отрицательный контроль. Сыворотка Н-9 от ольной нерпы, как и в таблице 1. Сыворотка Н-123 получена от кли-ически здоровой байкальской нерпы в 1988 г. Сыворотки Z-563 и Z-11 получены от обыкновенного тюленя Северного моря (доктором ..Osterhaus, Netherlands), имели титр антител 1:3000 в реакции нейтра-изации против вируса чумы плотоядных. Моноклональные антитела iK-228 к шт. Ленинград-16 вируса кори и LEK-27 против вируса кори

от пациента страдающего подострым склеротизирующим панэнцефали-том (получены доктором Ф.Г. Нагаевой г. Москва). Приведенные в таблице 2 данные показывают, что все четыре вируса, выделенные из материала от нерп в аллантоисной жидкости, также относятся к роду Мор-билливирус.

Таким образом, при параллельной изоляции в различных по пер-миссивности системах - перевиваемых культурах клеток и куриных эмбрионах, из одного и того же исходного материала от больных и погибших нерп получены 4 штамма морбилливирусов, каждый в "культураль-ном" и "аллантоисном" варианте. Выделенные вирусы названы нами морбилливирусами байкальской нерпы и далее обозначаются как МБН-2, МБН-3, МБН-4 и МБН-6.

По результатам таблицы 2, в период массовой заболеваемости и гибели нерпы циркулирующие в популяции штаммы имеют существенное отличие по антигенной структуре. Для дальнейших экспериментов необходимо было выбрать один из четырех выделенных штаммов МБН. Мы остановились на штамме МБН-6, так как этот штамм выделен из мозга больного животного, которое наблюдали до его смерти. По антигенной структуре штамм МБН-6 похож на штамм МБН-3 и хорошо репродуцируется в культуре клеток, вызывая ЦПЭ.

Следующим этапом работы было получение концентрированных очищенных препаратов МБН-6 и изучение его иммунологической активности. Вирус МБН-6 из культуральной жидкости частично очищали и концентрировали методом дифференциального центрифугирования. Полученный концентрат вируса подвергали дальнейшей очистке ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы 15-60%. При фракционировании градиентов сахарозы с детекцией по оптической плотности выявляется два пика с плавучей плотностью 1.18 и 1.23 г/см3. Электронно-микроскопически во фракции с плавучей плотностью 1.18 г/см3 выявлены вирионы сферической формы и материал из этой фракции в 4-10 раз более активен в твердофазном иммуноферментном анализе с различными сыворотками к морбилливирусам, чем материал фракции 1.23 г/см3. Приведенные результаты дают основание заключить, что вирионы МБН имеют плавучую плотность в градиенте плотности сахарозы 1.18 г/см3.

Биологические свойства

На основе способности выделенных вирусов вызывать ЦПЭ в применяемых нами культурах клеток, был разработан метод количественной оценки инфекционности по ЦПЭ. Для титрования вируса МБН-6 применяли метод десятикратных разведений вируса, используя 96-лу-ночные планшеты. После адсорбции вируса, планшеты помещали в термостат при 37° С с 5% С02. Учет опыта проводили на 7-10 день после инокуляции с помощью микроскопа. В результате проведенных исследований был определен титр инфекционности вируса на уровне 7-8 пас-

:ажа вируса в культуре клеток Vero, который составил 107 ТЦПД^мл. Гитр вируса вычисляли по методу Рида и Менча. -----

Широкое применение метода бляшкообразования, послужило поводом 1ля проведения экспериментов по получению бляшек с вирусом МБН. На тервых этапах работы необходимо было воспроизвести метод бляшкообразования с данным вирусом, стандартизовать его и в последующих опытах применить для титрования инфекционной активности вируса в куль-гуральной жидкости. Применив метод бляшкообразования с агаровым токрытием, разработанным в нашей лаборатории, мы получили бляшки щаметром от 0.5 до 0.7 мм, которые выявлялись на 7-9 день. Клерки <раняли x¡íjiiooi¡>-n.i.MH^CTb под покрьиием не менее i4 суток. Ти ¡ р вируса з культуральнои жидкости составил 4.8* 104 БОЕ/мл. В опыт по экспериментальному инфицированию природного хозяина вируса МБН, было этобрано животное в возрасте 5 месяцев. Нерпы были отловлены в мае месяце 1990 г. в озере Байкал. После карантина в течение 2 недель и определения наличия антител, было отобрано две нерпы. Одно животное во время транспортирования погибло. Учитывая сложность добычи, транспортирования и содержания нерп, опыт был поставлен на одном животном. Нерпа была помещена в аквариальную института ВНИ экологической токсикологии г. Байкальска. Животное содержали в бассейне с проточной байкальской водой (6° С). В начале кормили живым кормом -гольянами, а затем мороженным минтаем. Перед заражением у животного взяли кровь для исследования в серологических реакциях. Нерпу инфицировали вирусом МБН-6, прошедшим 10 пассажей в культуре клеток Vero с гитром 107 ТЦПД50/мл. Цельную вируссодержащую жидкость вводили одномоментно комбинированно: внутримышечно - 5.0 мл, интраназально и в конъюнктиву глаза по 0.5 мл. Ежедневно наблюдали за клиническим состоянием животного - фиксировали изменения поведения, осматривали :лизистые, регистрировали ректально температуру тела, частоту дыхания (время пребывания под водой). В различные периоды после заражения эрали пробы крови, из которой получали сыворотку и исследовали в реакции нейтрализации и иммуноферментном анализе. Кровь брали на 10, 13, 16, 20, 24, 33 и 39 дни после инфицирования вирусом. Через четыре дня после заражения, у животного отмечен конъюнктивит, который наблюда-1И в течение двух месяцев. В эти же сроки наблюдали резкое учащение дыхания: более частое появление животного на поверхности воды и сокращение времени пребывания под водой в два раза по сравнению с показателями нормы. Через семь дней после инокуляции вируса, отмечено появ-тение жидких испражнений, которые наблюдали несколько раз в течение эксперимента. Потребление корма (рыбы) осталось регулярным. Колебания температуры тела не позволяют сделать заключение о существенных нарушениях терморегуляции. Через два месяца после заражения состояние животного нормализовалось. Результаты тестирования специфических антител к МБН в РН и ИФА приведены в таблице 3.

Таблица 3. Продукция антител к морбилливирусу байкальской нерпы у экспериментально инфицированного природного хозяина.

Время забора крови Обратные титры антител в ИФА Обратные титры антител в РН

До заражения отридат. отрицат.

После заражения:

10-й день 160 отрицат.

13-й день 160 отрицат.

16-й день 160 320

20-й день 640 640

24-й день 640 640

33-й день 640 640

39-й день 640 640

Из полученных данных следует, что антитела к МБН выявляются методом клеточного ИФА через 10 суток, а вируснейтрализующие -'16 после заражения. Титры антител, определяемые методами ИФА и РН, достигают максимума через 20 суток после заражения и сохраняются на высоком уровне в течение всего срока наблюдения (до 39 дней). Приведенные результаты показывают, что заражение МБН приводит к развитию инфекции и индукции у животного вируснейтрализующих антител в титрах 1:640. Наблюдаемая нами стертая картина клинических симптомов инфекции может быть связана с индивидуальной устойчивостью животного или с потерей вирулентных свойств вируса, поскольку для инокуляции использовали вирус, прошедший десять пассажей в культуре клеток.

Нами проведено экспериментальное заражение природного хозяина выделенным in vitro МБН (чистая культура), описано течение заболевания животного со стертыми симптомами, показана индукция вируснейтрализующих антител. Другие доступные экспериментальные животные, на которых можно было воспроизвести инфекцию МБН отсутствуют.

Таким образом, выделенные от нерп вирусы МБН-2, МБН-3, МБН-4 и МБН-6 по результатам идентификации отнесены к роду Morbillivirus семейства Paramyxoviridae. Эти вирусы были названы нами морбилливи-русами байкальской нерпы (МБН). При выполнении работы нами отработаны и определены условия прямой изоляции инфекционных агентов. Определена чувствительность лабораторных животных, клеточных культур и куриных эмбрионов. Проведена идентификация выделенных вирусных агентов. Показана антигенная гетерогенность выделенных штаммов МБН. Отработан метод концентрирования и очистки МБН дифференциальным и градиентным ультрацентрифугированием. Опре-

(елена плавучая плотность вирионов в градиенте плотности сахарозы 1.18 г/см3). Отработаны методы количественной оценки инфекпион-юсти. Показана возможность использования МБН для определения :пецифических антител методом непрямой иммунофлюоресценции, твер-юфазного иммуноферментного анализа и в реакции нейтрализации. Через ри месяца из исходного материала, хранившегося в азоте, проведена »еизоляция вирусов с аналогичными свойствами. СПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА К МОРБИЛЛИВИРУСУ

У НЕРП.

Задачей дальнейших исследований была разработка мстчоя зыяв-[ения специфических ашиг^л к МШ1 ъ реакции нейтрализации и методом клеточного иммуноферментного анализа. После разработки коли-[ественных методов определения инфекционности МБН по ЦПЭ и об-»азованию бляшек, стало возможным применить реакцию нейтрализа-ши. В результате предварительных экспериментов были подобраны ус-ювия реакции. Для повышения чувствительности метода в пробу брали ie более 100 ТЦПД50 МБН.

Как следует из полученных данных, значительное количество нецелованных сывороток (91 из 148) имеют нейтрализующие МБН анти--ела. Титры антител в положительных сыворотках составляют от 1:40 до : 1280. Реакция нейтрализации была применена нами в последующем тализе сыворотки крови экспериментально инфицированного природ-гого хозяина и при исследовании сывороток клинически здоровых нерп.

Метод клеточного иммуноферментного анализа по определению :пецифических к МБН антител. В серии предварительных экспериментов были подобраны условия заражения культуры клеток (множествен-юсть, время инкубации) выращенных непосредственно в 96-луночных шаншетах. В дальнейшем использовали стандартный вариант постановки >еакции. Совпадающие результаты получены с применением различных :ерий планшетов. Выявлены как отрицательные сыворотки, так и со-[ержащие вирусоспецифические антитела к МБН в титрах от 1:40 до : 1280.

Из исследованных 148 сывороток крови нерп 37 не имеют нейтра-[изующих антител и активны в иммуноферментной реакции. В то время 6 сывороток имеют вируснейтрализующие антитела, не выявляемые методом клеточного иммуноферментного анализа; 20 сывороток не со-(ержат антител, выявляемых обоими методами. Полученные данные называют на различающиеся биологические активности антител, выяв-[яемых двумя методами. Коэффициент корреляции полученных данных >авен г=+0.64.

Следующим этапом работы было определение специфических анти-ел к МБН у тюленей Байкала. Эти сведения необходимы для того, что-¡ы определить, насколько широко МБН циркулирует в популяции, оце-[ить долю иммунных животных, отработать подходы к мониторингу

морбилливирусной инфекции у байкальской нерпы. Исследовали сыво ротки крови, собранные весной и осенью 1989 г., весной 1990 и 1993 гг Все животные были без видимых клинических признаков инфекции Специфические антитела выявляли методом клеточного иммунофермент ного анализа и в реакции нейтрализации.

В 1989 г. было собрано 150 образцов сывороток. Для консервации : сыворотки добавили азид натрия, поэтому они были непригодны да изучения в РН. Сыворотки этого года изучали только методом клеточ ного иммуноферментного анализа. Специфические антитела к вирус; МБН содержат 58% обследованных животных. Анализ приведенных дан ных показывает, что значительная доля животных, через год после нача ла эпизоотии, имеет антитела к МБН в высоких титрах.

Среди щенков доля сероположительных составляет 90%. Количест во животных в группе от года до трех снижается до 48.8%, для животны: старше трех лет 38.4% и для группы возраст не определен, куда входя взрослые звери составляет 35.7%. Приведенные данные показывают, чт« среди самцов сероположительны 38.2%, в группе самок антитела к МБР содержат 41.5% особей. Приблизительно одинаковое количество самцо: и самок содержат антитела к МБН, тогда как доля сероположительны: животных в целом по выборке составляет 58%. В группу пол не известе! входят все щенки, чем можно объяснить высокую долю сероположи тельных животных 82.5%.

Таким образом, с увеличением возраста есть тенденция к уменьше нию доли сероположительных животных. Уровни титров антител бьип также выше в группе животных до одного года, а в более старших воз растных группах приблизительно одинакова.

В 1989 г. не менее 58.0% нерпы озера Байкал имеют антитела ] МБН. По аналогии с другими, более глубоко изученными морбилливи русами можно допустить, что в 1989 г. в популяции нерпы имеются вс< условия для продолжения эпизоотии.

В 1990 г. собраны образцы сывороток от 148 нерп и исследованы j реакции нейтрализации и методом клеточного иммуноферментноп анализа. Животных до одного года 19, одного-трех лет - 27, старше тре; лет - 59 и у 43 особей возраст не определен. Пол определен у 38 самцо] и 55 самок различного возраста. В целом по выборке вируснейтрализую щие антитела имеют 61.4% животных, а антитела, выявляемые иммуно ферментным методом - 76.3%. Доля сероположительных самцов состав ляет 81.5% и 60.5% по результатам ИФА и РН, а для самок 70.9% \ 65.4% соответственно.

По результатам анализа выборки 1990 г. наметилась тенденция увеличения доли сероположительных животных с возрастом. Схожая картина отмечена также по увеличению титров антител среди животны? старших возрастных групп.

В 1993 г. в реакции нейтрализации и методом клеточного иммуно-

Ферментного анализа обследовали 71 сыворотку клинически здоровой [ерпы различного возраста и пола. В выборке этого года 48 животных шегот возраст до одного года. Пол определен у 15 самцов и 13 самок.

При анализе методами ИФА и РН доля сероположительных живот -1Ых в целом по выборке составляет 73.2% и 76.1% соответственно. Ко-;ичество сероположительных животных среди самцов и самок, опреле-:яемое двумя методами, близки. Уровни титров антител также прибли-ительио одинаковы у животных различных возрастных групп. Отмече-1а тенденция увеличения сероположительных животных (в группе стап-ие 3 лет) с возрастом. Доля серополпжнтельпых жиншньтх сышс. чем в 989 г. и ила,* и к дгипплм 1990 г

Таким образом, на основе впервые выделенных от байкальской петы штаммов морбилливирусов нами разработаны методы тестирования пецифических антител в реакции нейтрализации и клеточном иммуно-зерментном анализе. Это первое применение гомологичной тест-систе-1Ы для определения специфических антител к морбилливирусам вод-[ых млекопитающих. Разработанные методы применены для тестирова-[ия антител в сыворотках крови 369 нерп, собранных в 1989, 1990 и 1993 г. Показано возрастание доли сероположительных животных в популя-(ии до 1990 г. Определено распределение специфических антител среди сивотных различного возраста и пола. Разработанный нами вариант леточного иммуноферментного метода с МБН проще и доступнее, чем радиционные варианты с очищенными антигенами или вариант мето-а, описанный для вируса кори. Для морбилливирусов водных млекопи-ающих такие методы разработаны и применены впервые.

При расследовании причин массовой заболеваемости и гибели нерп зера Байкал возникло целый ряд проблем, требующих решения. Преж-е всего, подобных случаев гибели водных млекопитающих от вирусныч нфекний не было известно ни среди тюленей Байкала, пи у морских (лекопитаюших животных. Поэтому, была велика опасность и соблазн тбросить возможную роль вирусных инфекций в этиологии эпизоотии, ем более, что теоретически нерпы, как водные млекопитающие, могли ыть инфицированы вирусами разных систематических групп, и для де-ального вирусологического исследования потребовалось бы очень про-олжительное время, применение самых различных, практически недо-гупных систем первичной изоляции вируса (свободных от патогенов ;ивотных, в том числе экзотических), и большой спектр, не выпускае-¡ых коммерческих диагностических тест-систем. В связи с изложенным а первых этапах следовало спланировать работу по изоляции вирусов аким образом, чтобы из-за применения непермиссивных систем пер-ичной изоляции не сделать неверного заключения о роли вирусов в гиологии эпизоотии. Кроме того, это был первый случай вирусологи-еского обследования байкальской нерпы.

Нами применены различные системы первичной изоляции (мыши-

сосунки, взрослые мыши, морские свинки, куриные эмбрионы, первичные и перевиваемые линии клеток) с учетом тропизма патогенных для животных вирусов различных систематических групп. В двух система) первичной изоляции вирусов - перевиваемых линиях клеток Vero и Hela а также в куриных эмбрионах, нам удалось выделить штаммы инфекционных агентов. Таким образом, примененный подход показал свою эффективность при расследовании причин массовой эпизоотии неясно* этиологии. Идентификация выделенных в различных системах вирусных агентов с широким кругом антител различной специфичности показало что от всех больных и погибших животных выделен^ вирусь из рода морбилливирус. Мы назвали выделенные вирусы морбилливи-русами байкальской нерпы. Это первая изоляция штаммов морбилливи-русов от водных млекопитающих. В связи с тем, что вид среди представителей рода морбилливирусов определяется, прежде всего, антигенное специфичностью и кругом хозяев, имеется основания полагать, что MEt может представлять собой отдельный вид морбилливирусов. Тем боле( интересно, что циркулирующий среди тюленей Байкала МБН выявлен i популяции, которая географически полностью изолирована от водньк млекопитающих Земного шара. Однако с учетом полученных в последние годы данных по гетерогенности циркулирующих среди млекопитающих морбилливирусов следует отметить, что для определения систематического положения МБН необходимо провести работу по сравнительному изучению гомологии геномов МБН и других представителей род; морбилливирусов. Не менее интересна другая возможность, касающаяся систематического положения МБН. А именно, что этот вирус является вариантом чумы плотоядных. В таком случае это первый из известны) изолятов вируса чумы плотоядных, выделенных не от собак, имеющий более широкий, чем принято считать, круг хозяев. В этом случае рол! МБН и возможность его циркуляции среди тюленей Байкала, диких \ домашних животных, в том числе среди содержащихся на фермах пушных зверей, приобретает особый как теоретический, так и практически? интерес. Нами также определена некоторая гетерогенность изолято! МБН, что может иметь существенное значение в развитии эпизоотий i последующем и должно привлечь усилия исследователей. Проведенная идентификация инфекционных агентов от нерп, анализ литературы, отсутствие данных о вспышках заболеваемости среди зоологов, паразитологов, охотников, местных жителей (группы риска), а также продолжающаяся программа по борьбе с корью позволила сделать вывод of отсутствии эпидемической значимости для человека эпизоотии байкальских тюленей. Однако исключить опасность МБН для людей, сталкивающихся с больными и павшими животными, для исследователей и охотников, нельзя.

Проведенное исследование показывает, что в 1987 г. на озере Байка; впервые среди водных млекопитающих выявлена массовая эпизоотш

тюленей, вызванная морбилливирусом. Разработан комплекс методов, позволяющий контролировать популяцию байкальской нерпы на предмет циркуляции морбилливирусов. Не мало важно также, что выполненная нами работа ставит целый ряд проблем, которые требуют дополнительных исследований и решения которых может иметь как фундаментальное, так и прикладное значение. Несомненно, единственным путем расследования причин эпизоотии является выполнение постулатов Коха. Изоляция вируса в чистой культуре и его идентификация -необходимый первый шаг на этом пути. Следует добавить, что при расследовании причин эпизоотии нркотортдми группами и^сп^коннтеле!? получены данные, указывающие на наличие морбилливирусных РНК и антигенов в клетках органов нерп. По-видимому, установить происхождение вируса, поразившего популяцию байкальской нерпы в 1987 г. будет невозможно, до настоящего времени не имеется оснований говорить о прекращении эпизоотии. Несмотря на то, что ранее было высказано поспешное заключение о прекращении эпизоотии в 1988 г., наши прогнозы, экспериментальные данные и наблюдения натуралистов, проводимые на озере Байкал указывают на обратное. Высокая доля популяции, не имеющая антител к МБН, также предполагает возможность продолжения эпизоотии. Конечно, масштабы заболеваемости и гибели значительно ниже, чем в 1987-1988 гг., так как существенно увеличилась иммунная прослойка. Возможно, в настоящее время имеющая место гибель нерпы от МБН учитывается как компонент так называемой ''естественной гибели". Только осуществление программы целенаправленного мониторинга популяции нерпы в отношении МБН позволит контролировать ситуацию, строить обоснованные прогнозы и не оказаться в следующий раз бессильными перед лицом якобы возникшей ниоткула эпизоотии. Необходимы также дополнительные исследования циркулирующих у наземных плотоядных Прибайкалья морбилливирусов и детальное изучение иммунного статуса нерпы.

ВЫВОДЫ

1. Впервые зарегистрирована эпизоотия тюленей Байкала, вызванная вирусным агентом, который идентифицирован как морбилливирус байкальской нерпы.

2. Отработаны условия изоляции морбилливируса в куриных эмбрионах и перевиваемых культурах клеток.

3. Изолировано четыре штамма морбилливируса из материала от больных и погибших нерп, изучены их основные биологические свойства.

4. Выделенные штаммы морбилливируса вызывают цитопатический эффект в культурах клеток Vero и Hela, размножаются в куриных эмбрионах, в эксперименте инфицируют природного хозяина - нерпу Байкала. Плавучая плотность вирионов морбилливируса в градиенте плотности сахарозы составляет 1.21 г/см3.

5. Серологический анализ 369 клинически здоровых нерп, проведенный после изоляции штаммов морбилливируса, в иммунофермент-ном анализе и реакции нейтрализации позволил установить возрастание количества сероположительных животных с 58.0% в 1989 г. до 76.3% и 61.4% в 1990 г. и 73.2% и 76.1% в 1993 г., что свидетельствует о продолжении эпизоотии в популяции байкальской нерпы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зорин B.JI., Котенко Ю.Г., Кумарев В.П., Титенко A.M., Борисова Т.И., Ишбаева Р.И. Иммунохимический анализ вирусной инфекции байкальской нерпы// I Верещагинская байкальская международная конференция.: Тез. докл. и стенд, сообщ. - Иркутск, 1989.- С. 82.

2. Титенко А.М., Борисова Т.И., Зорин B.JI., Кумарев В.П. Эпизоотия у байкальских тюленей: изоляция морбилливируса и его возможная роль в заболеваемости животных// Сб: Морские млекопитающие: Тез. докл. 10 Всесоюз. совещ. по изучению, охране и рациональному использованию морских млекопитающих.- Москва, 1990,- С. 297298.

3. Титенко А.М., Борисова Т.И., Зорин B.JL, Солодун Ю.В., Петров Е.А., Иванов М.К., Маликов Н.Г., Котенко Ю.Г., Кумарев В.П., Антитела к морбилливирусу байкальской нерпы у природного хозяина// Вопр.вирусол. - 1990. - 6.- С.502-503.

4. Титенко А.М., Борисова Т.И., Зорин B.JI., Чипанина В.М., Колесник B.C., Колесник P.C., Ишбаева Р.И., Капустин Ю.М., Грачев М.А., Голубинский Е.П., Бейм А.М., Куделин В.М., Кумарев В.П. Выделение морбилливируса от байкальской нерпы Phoca. sibirica и его предварительная характеристика// Вопр.вирусол.- 1991.- 2.- С.57-59.

5. Титенко А.М., Борисова Т.И., Бейм А.М., Новожилов С.С., Куделин В.М., Зорин B.JI., Колесник B.C. Экспериментальное заражение нерпы Phoca sibirica морбилливирусом// Вопр.вирусол.- 1991. - 6,- С. 511-512.

6. Титенко A.M., Борисова Т.И., Зорин B.JI., Чипанина В.М., Кумарев В.П. Изоляция морбилливируса от нерпы Phoca sibirica// Мн.: Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы - Новосибирск, Наука. Сиб. отд-ние. - 1992. - С. 47-52.

\

7. Титенко A.M., Зорин B.JI., Борисова Т.И., Солодуи 10.В., К,

- в В.П. Серологическое исследование сывороток байкальской"., рпы на присутствие антител к ее морбилливирусу// Ми.: Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы - Новосибирск, Наука. -Сиб. огд-ние. - 1992,- С. 53-60

8. Борисова Т.Н., Титенко А.М.Морбилливирусная инфекция у байкальских тюленей// Состояние здоровья населения города Иркутска в связи с техногенным загрязнением окружающей среды: Tes. докл. к науч. практ. конф.- Иркутск, 1991.- С. 26

9. Титенко А М , Борисова Т.К. Массовая гибель байксьи^киА нс|ж. вызванная морбцллнвцрусом// Проблемы патологии и охраны здоровья диких животных, экологическое взаимодействие болезней диких и сельскохозяйственных животных : Тез. докл. международ, симпоз,- Москва, 1992. - С. 52-54.

10. Борисова Т.И., Титенко A.M. Выявление специфических антител к морбилливирусу байкальской нерпы методом клеточного имму-ноферментного анализа// Проблемы природно-очаговых инфекций в Сибири и на Дальнем Востоке: Тез.докл,- Чита, 1993,- С. 1819.

11. Борисова Т.И., Лескова В.В., Новожилов С.С., Титенко A.M. Нейтрализующие морбилливирус антитела в популяции байкальских нерп//Вопр. вирусол. - 1993,- 1,- С.28-30.

12. Titenko A.M., BorisovaT.I. Morbillivirus infection in Lake Baikal Pho-ca sibirica population// Ninth International conference on negative strand viruses - Estoril, Portugal, 1994,- p. 155.