Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическая идентификация вируса, вызвавшего эпизоотопию в популяции байкальской нерпы (Phoca sibirica) в 1987-1988 гг.

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая идентификация вируса, вызвавшего эпизоотопию в популяции байкальской нерпы (Phoca sibirica) в 1987-1988 гг."

■ ' \ л

' \ •. На правах рукописи

•л

ото /вси/

ДЕНИКИНА

/

Н а тал ь я Николаевна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСА, ВЫЗВАВШЕГО ЭПИЗООТИЮ В ПОПУЛЯЦИИ БАЙКАЛЬСКОЙ НЕРПЫ (РНОСА ЗШШСА) В 1987-1988гг..

03.00.06-вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток 2000

Работа выполнена в Лимнологическом институте СО РАН, г. Иркутск.

Научный руководитель: Кандидат химических наук С.И.Беликов,

Лимнологический институт СО РАН, г.Иркутск Научный консультант: Член-корреспондент РАМН, доктор медицине^

наук, профессор В.И.Злобин, Институт эпидемиологии и микробиологии НЦМЭ ВСНЦ СО РАМН, г.Иркутск

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

P.A. Слонова

кандидат биологических наук В.А. Брыков

Ведущая организация: Омский научно-исследовательский институт

природно-очаговых инфекций (НИИПИ МЗ РФ)

Защита диссертации состоится 13 июня 2000 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К 003.97.01 по вирусологии в Биолого-почвенном институте ДВО РАН.

Адрес: 690022, г.Владивосток, пр. 100-летия Владивостока, 159. Факс: (4232)310-193.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ДВО РАН.

Автореферат разослан " 6 " мая 2000г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук М.В. Ходаковская

т >:-'>-1 -о у

Актуальность проблемы. Осенью 1987 г. на Байкале произошла спышка острого инфекционного заболевания у байкальских тюленей Phoca sibirica Gmelбайкальская нерпа), которая привела к гибели более >000 животных из общего числа 80-100 тысяч (Петров и др., 1992; 1ронин, Кабанов, 1992). Ранее эпизоотии у байкальских тюленей не 1егистрировались. Заболевание сопровождалось симптомами,

характерными для морбилливирусных инфекций (Бейм, 1988). В (екабре 1987 г. во время экспедиции на Малые Ушканьи острова было амечено, что из пяти собак, имевших тесный контакт с больными [ерпами, три умерли с типичными признаками чумы плотоядных. Иа юновании опроса местных жителей (метеорологов) B.C.Колесник, отрудник Иркутского противочумного института Сибири и Дальнего востока, высказал предположение, что эпизоотия в популяции байкальской нерпы вызвана вирусом чумы плотоядных.

Сыворотки крови больных нерп давали слабо положительный ответ ; реакции с антителами к вирусу кори (род Morbillivirus, семейство yaramyxoviridae). При радиоиммунометрии и при иммуноферментном нализе обнаруживались антитела к вирусу чумы плотоядных (CDV) у >0-80 % животных (Grachev et al, 1989).

Эти результаты, а также предварительные данные гатоморфологических исследований были обсуждены в ноябре 1988 г. на остоявшемся в Иркутске рабочем совещании и послужили основанием (ля того, чтобы считать CDV, или родственный ему вирус, наиболее ;ероятной причиной болезни нерпы. Обсуждались и возможные гсточники заболевания; так, одним из вероятных считали живые вакцины фотив CDV, используемые в пушном звероводстве в окресности озера ¡айкал.

К 1988 г. были описаны 4 вида рода Morbillivirus-, вирус кори MV), чумы крупного рогатого скота (RPV, риндерпест), чумы мелких квачных (PPRV) и чумы плотоядных (CDV). Данных о восприимчивости : морбилливирусам не только байкальских тюленей, но и других федставителей отряда ластоногих, не было. Поэтому гипотеза о юрбилливирусной инфекции, как причине массовой гибели байкальской 1ерпы, требовала серьёзного подтверждения, как и гипотеза о фичастности живых анти-CDV вакцин к заражению популяции. Кроме т>го, через шесть месяцев после массовой гибели байкальской нерпы, в треле 1988 г., эпизоотия охватила тюленей в Северном и Балтийском лорях. Наблюдался массовый падёж серых (Halichoerus gryphus) и обыкновенных {Phoca vitulina) тюленей. Европейскими учеными было

выдвинуто предположение о вирусе герпеса, как о причине эпизоотии (Osterhaus, 1988). Но уже предварительные серологические исследование убедительно показали, что животные поражены вирусом CDV илг близкородственным ему (Osterhaus, Vedder, 1988), а в 1989 г. антитела к вирусу чумы плотоядных или близкородственному ему вирусу был! обнаружены у тюленей на побережье Гренландии (Dietz, 1989) Естественно возник вопрос о возможной взаимосвязи этих эпизоотий у путях заражения столь отдалённых друг от друга популяций.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилась молекулярно-генетическая идентификация вируса, вызвавшего массовук гибель байкальской нерпы, определение его видовой принадлежности проверка гипотез о живых анти-CDV вакцинах, как о возможны* источниках инфекции и о связи эпизоотий байкальских и европейски* тюленей. Для этого необходимо было последовательно решить следующие задачи:

1. Подобрать структуры олигонуклеотидных зондов дл> определения присутствия вирусспецифических РНК в образцах ткане? павших и больных животных на основании сравнения опубликованные нуклеотидных последовательностей известных морбилливирусо! (Rozenblatt et al., 1985, Barrett et al., 1985, Bellini étal., 1986).

2. Показать наличие как вирионной, так и матричные морбилливирусных РНК в тканях павших и больных животных используя метод гибридизации.

"3. Определить по результатам гибридизации наиболее консервативные участки генома морбилливирусов, пригодные дш использования в полимеразной цепной реакции (ПЦР) в качеств« универсальных праймеров при массовой диагностике морбилливирусны? инфекций. Оптимизировать условия экспресс - диагностик! морбилливирусных инфекций методом ПЦР с использованием образцо] тканей, минуя этап культивирования вируса.

4. Амплифицировать фрагменты генома морбилливирус; байкальской нерпы и других штаммов вируса чумы плотоядных, в ключа: вакцинные штаммы. Клонировать и определить их нуклеотиднук последовательность.

5. Определить видовую принадлежность морбилливирус; байкальской нерпы и степень его родства с вакцинными штаммами CD\ и вирусом обыкновенных тюленей (PDV) на основе полученных в ход работы и имеющихся в литературе данных о нуклеотидны; последовательностях морбилливирусов.

Научная новизна и практическая значимость работы. В

[редставленной работе впервые молекулярно - биологическими методами ¡ыло показано, что вирус чумы плотоядных может не только поражать федставителей отряда ластоногих, в частности, байкальскую нерпу РЬоса з'ьЪтса), но и являться причиной массовой гибели этих животных, впервые для идентификации природной инфекции был использован 1етод полимеразной цепной реакции (ПЦР), отработаны методы обработки собранного материала и выделения РЖ, позволяющие в :ратчайшие сроки идентифицировать инфекционный агент. Впервые 1ыла разработана и предложена для использования в ПЦР-диагностике [риродных морбилливирусных инфекций система универсальных юрбилливирусных праймеров. Определены нуклеотидные юследовательности фрагмента гена белка нуклеокапсида длиной 200 [уклеотидов для изолята вируса байкальской нерпы и реизолированного акцинного штамма и участка кодирующей области гена фосфопротеина (линой 380 нуклеотидов для изолятов СБУ, полученных от хорька, обаки и байкальской нерпы, а так же для двух вакцинных штаммов и 'ПК, выделенной непосредственно из мозга павшей нерпы. Установлены шлогенетические связи вируса байкальской нерпы. Показано, что живые юммерческис вакцины, используемые в звероводстве, не были причиной пизоотии байкальской нерпы. Показано отсутствие близкой связи между трусом байкальской нерпы и РБУ.

Использованные в работе методы позволяют в относительно :ороткий срок показать наличие активно размножающегося вируса в »рганизме животного, а потому являются перспективными для быстрой (иагностики морбилливирусной инфекции в природных популяциях и югут быть полезны при мониторинговых исследованиях ластоногих.

Основные положепня, выносимые на защиту. . Эпизоотия в популяции байкальской нерпы в 1987-1988гг. вызвана

морбилливирусом. '.. Морбилливирус, вызвавший эпизоотию у байкальской нерпы, является

вирусом чумы плотоядных. I. Коммерческие живые вакцины против вируса чумы плотоядных

непричастны к заражению популяции байкальской нерпы, к Вирус, поразивший популяцию байкальской нерпы, не был причиной эпизоотии у обыкновенных и серых тюленей в Северной Европе.

Внедрение в практику. Материалы исследований используются в 'чебном процессе при подготовке студентов-биологов в Иркутском

Государственном Университете в циклах "Молекулярная вирусология" v "Частная вирусология".

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации быт представлены на Международном симпозиуме "Morbillivirus infections' (Hannover, 1994). По материалам диссертации опубликовано 6 статей.

Структура и объем работы. Предлагаемая диссертационная работе состоит из введения, обзора литературы (две главы), 3-х niai собственных исследований, заключения, выводов и спискг использованной литературы (26 отечественных и 127 зарубежны) источников). Объем работы составляет 107 страниц машинописногс текста, включающего 5 таблиц и 13 рисунков.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы. В работе проанализирована ( использованием метода гибридизации с 32Р-мечеными синтетическим] олигонуклеотидными зондами суммарная РЖ, выделенная и: патологического материала от 126 байкальских нерп и вакцинноп штамма CDV различными методами. Были выбраны и использованы 8' зондов на CDV и MV, синтезированных С.И.Беликовым. Выбраны i предложены для диагностики морбилливирусных инфекци] последовательности универсальных морбилливирусных праймеро* соответствующих позициям 401-416 и 802-817 гена Р: 3' TCACAGCGGTGAAGAG и 3 '-GGGTTGCACCACTTGT.

Методом ПЦР получены и заклонированы: фрагменты гена белк нуклеокапсида длиной 200 нуклеотидов коммерческого вакцинног штамма CDV и изолята вируса от байкальской нерпы; фрагменты ген фосфобелка длиной 380 нуклеотидов двух вакцинных штаммов CD\ изолятов CDV от хорька и собаки, изолята вируса байкальской нерпы вируса, выделенного из мозга байкальской нерпы. Определени последовательностей полученных фрагментов проводилось методо! секвенирования с секвеназой и Taq ДНК-полимеразой. Филогенетически анализ проводился с использованием программ из пакет филогенетических программ PHYLIP v. 3,5с (Felsenstein, 1993 DNADIST, FITCH.

Результаты исследований.

1. Результаты гибридизации РНК, выделенной из тканей нерпы PBi погибшей в аквариальной, пос.Листвянка, с клинической картино! характерной для вируса чумы плотоядных (рис. 1Л

1 2 3 4 5

зонды на Ы-ген Ш

5Р 7Р

V - к вириоиной РНК

« в в м

31^ V

—

9Л #1 м

V

6Ы м

9 ■ ® ® м

в *■*':' V

1(Ш* «« м

1Ш* . : V

12N* '■/; : : м

1314* ; V

14Гч'* у. м

1Р .: ® ''' V

2Р . ;; 9 4 м

ЗР £ , V

4Р - о « м

V

м

1С.1. Радиоавтография результатов гибридизации РНК из органов нерпы РВ6 с щивидуапьными 32Р-мечеными олигснуклеотидными зондами, жды* соответствуют вариабельной области Ы-гена. 1- отрицательный контроль, положительный контроль, 3- РНК из головного мозга, 4- РНК из печени, 5- РНК I селезенки.

Нерпа РВ6 была отловлена в декабре 1987г. и содержалась под наблюдением в аквариальной пос.Листвянка. После ее гибели были отобраны и всесторонне исследованы образцы тканей и органов. Эти же образцы позже использовались и для получения изолята вируса.

В качестве отрицательного контроля использовалась суммарная РНК из головного мозга молодой крысы-сосунка, любезнс предоставленного Азимовой Ш. (Ташкентский Институт биоорганической химии). В качестве положительного контроля - РНК. выделенная из реизолированного в культуре клеток вируса коммерческой вакцины против CDV (от Shering-Plough Corporation, USA), использованной в одном из местных пушных хозяйств.

32

В гибридизации использовались Р - меченые синтетические олигонуклеотидные зонды, комплементарные матричной и вирионноР РНК как в вариабельных, так и в консервативных участках N- и Р-геноЕ CDV. Основным результатом этого эксперимента стало доказательстве присутствия морбилливирусных РНК, как вирионной, так и матричной, е тканях погибшего животного (Рис. 1.), что свидетельствует не только с наличии вируса, но и об активном процессе его репликации. Все зонды ш Р-ген и почти все на консервативные области N-гена показали высоки? уровень связывания.

2. Сравнительная гибридизация РНК, выделенных из тканей собаки, павшей от CDV, новорожденного нерпенка. двух условие здоровых нерп разного возраста, и двух погибших на льду нерп (рис.2.).

В предыдущем эксперименте было показано, что байкальска5 нерпа инфицирована вирусом, близким или идентичным CDV. Поскольку до нашего исследования считалось, что ластоногие не входят в кру| хозяев этого вируса, необходимо было провести сравнительно« гибридизационное зондирование РНК нерп и РНК собаки, погибшей от вируса чумы плотоядных. Кроме того, необходимо былс проанализировать образцы тканей других нерп, как павших, так i клинически здоровых, чтобы исключить вероятность ошибки и показать что заболевание нерпы РВ6 не является единичным случаем.

Для того, чтобы предупредить трудности, обусловленные возможной неидентичностью структуры исследуемого вируса и CD\ (штамм Ondersteport), дальнейший гибридизационный анализ проводили используя смесь олигонуклеотидных зондов на РНК CDV. Кроме того это . значительно увеличило количество радиоактивной метки

зязывагощееся с РНК и, таким образом, усилило гибридизационный гвет.

В эксперименте использовались суммарные РНК, выделенные из рганов павшей от СОУ собаки, подобранных на льду павших нерп, эворожденного нерпенка и двух нерп без клинических признаков 1болевания (условно здоровых), добытых во время весеннего планового гстрела.

На рисунке 2 представлены результаты гибридизаций суммарных НК из органов перечисленных выше животных со смесью ^Р- меченых зндов (1-14М, 1-7Р). Видно, что все животные дали положительный гвет в гибридизации, т.е. нерпа РВ6 не являлась уникальным случаем (болевания. При этом больших различий в связывании зондов с РНК 1зных. животных нет. Несомненно, собака и байкальские тюлени эражены близкородственными или идентичными вирусами; можно >ворить только о разном распределении вирусного материала по органам энкретного животного. И далее вывод об отсутствии вируса в каком-либо ргане можно считать не совсем правомерным, поскольку отбор, ранение и транспортировка образцов проводились в нестандартных ;ловиях, что крайне важно для качества последующего выделения РНК, роме того, РНК-азная активность в каждом органе выражена по-разному, ледует отметить активное связывание вирусспецифических зондов с /ммарной РНК, выделенной из органов внешне совершенно здоровых :ивотных. Причем тот факт, что инфицированным оказался оворожденый детеныш - белек, не имевший контакта с другими :ивотными, кроме матери (Пастухов, 1993), свидетельствует об активной гртикальной передаче вируса внутри популяции.

Таким образом, основными результатами эксперимента можно читать следующие:

во-первых, байкальская нерпа поражена СОУ или очень близким му вирусом, т.к. праймеры связываются в равной мере как с РНК нерп, ак и с РНК павшей от СБУ собаки;

во-вторых, все нерпы, как погибшие, так и отстрелянные во время хоты и не проявлявшие никаких признаков заболевания, оказались нфицированными, следовательно, нерпа РВ6 не являлась единичным пучаяем заболевания;

в-третьих, новорожденный нерпенок, не имевший, кроме матери, икаких контактов с популяцией, также оказался инфицированным СБУ ли близким ему вирусом, что говорит о возможности вертикального ути заражения.

Исходя из этих выводов были поставлены следующие задачи: необходимо было определить процентное соотношение вирусоносителей и интактных животных в популяции байкальской нерпы и точнее оценить близость исследуемого вируса и CDV.

А В С D Е

0 ф ф Ф Ф

•S':' ' 0 0 || 'ф\ ф •* <?.

.'Ó' % Ф

:;$У Гу #

- ' #

Рис. 2. Радиоавтография результатов сравнительной гибридизации РНК со смесью зондов на матричную и вирионную РНК CDV. А - РНК из тканей собаки, павшей от CDV:

А1 - головной мозг, А2-миокард, A3-почка, А4-селезенка, А5 - легкое, А6 - печень, А7 - поджелудочная железа; В - РНК из тканей нерпы №7 (погибшая на льду нерпа):

В1-миокард, В2-трахея, ВЗ-легкое, В4 - почка, В5 - печень, В6 - головной мозг, В7 - мочевой пузырь, В8 - селезенка; С - РНК из тканей нерпы №3 (погибшая на льду нерпа):

С1 -селезенка, С2-легкое, СЗ-миокард, С4-печень, С5 - мочевой пузырь, С6 - головной мозг, С7 - спинной мозг; D - РНК из тканей нерпы РВ2 (условно здоровая нерпа):

D1 - селезенка, D2 - легкое, D3 - миокард, D4 - печень, D5 - спинной мозг, D6 - головной мозг; Е - (1-4) - РНК из тканей нерпы РВ1 (условно здоровая нерпа):

Е1 - селезенка, Е2 - легкое, ЕЗ - печень, Е4 - миокард; Е - (5-8) - РНК из тканей новорожденной нерпы

Е5 - селезенка, Е6 — легкое, Е7 - печень, Е8 - головной мозг.

1 2

3

4

5

6

7

8

3. Зондирование РНК от 120 условно здоровых нерп, полученных з 1988г. во время весенне-летнего планового отстрела.

Для оценки уровня пораженности СОУ популяции байкальской 1ерпы необходимо было провести гибридизационный анализ РНК, выделенных от максимально возможного количества случайно угобрапных животных. Для этой цели во время весенне-летнего тланового отстрела байкальской нерпы были отобраны пробы печени \ селезенки от 120 животных без видимых клинических признаков ¡аболевания (условно здоровых). По возможности были соблюдены все 1еобходимые условия забора и транспортировки образцов (отбор троводился сразу после смерти животного, образцы помещались и гранспортировались в жидком азоте), чтобы снизить вероятность потери 5НК в результате аутолитических изменений.

На рисунке 3 приведены типичные результаты эадиоавтографирования гибридизованных образцов РНК из печени. Поскольку гибридизация проводилась с помощью стандартного 96-1уночного аппарата для гибридизации, видно, где должны находится ;ветящиеся пробы. В каждую лунку нанесена проба РНК, выделенной из адного образца. Были проанализированы 240 образцов (от каждого кивотного по два).

$ Ф ф '-9Г;Щ •

© Ф $ Ф • ® # $ Ф * ® @ Ф Ф & ' ®

0 Щ7 Ф ©■ • •' •

. ф $ ф ® Ф • ' * '.

• Ф • ф

эис. 3. Типичный результат гибридизационного зондирования РНК из печени 96 нерп без видимых клинических признаков, добытых весной 1988г.

Результаты гибридизаций РНК из печени и селезенки практически идентичны. Видимо, заметное расхождение результатов гибридизаций РНК из различных органов в эксперименте, описанном выше, в значительной степени обусловлено нестандартными условиями хранения и транспортировки образцов. Так, ни одного случая присутствия вируса только в одном из органов (в печени или в селезенке), не наблюдалось, хотя незначительные изменения интенсивности свечения были.

Из 120 животных положительный ответ получен в 82 случаях. Остальные фотографии не прилагаются, так как дополнительной информации не несут.

Таким образом , полученные в результате этого эксперимента данные позволяют оценить уровень зараженности популяции байкальской нерпы, если считать выборку случайной и сохранность материала удовлетворительной, как близкий к 70%.

4. Выявление небольших отличий вируса байкальской нерпы от СРУ гибридизацией с 32Р-мечеными зондами на фрагмент М-гена с 484 по 1050 позицию.

Для выявления небольших отличий исследуемого вируса от СБУ были выбраны последовательности зондов, полностью перекрывающие М-ген с 484 по 1050 позицию. Сравнительное зондирование при постепенном повышении температур гибридизации позволяет достаточно точно определять степень связывания олигонуклеотида с иммобилизованной суммарной РНК. При мягкт условиях (достаточно низких температурах гибридизации) уровеш неспецифического связывания будет высоким. При повышенш температуры до расчетной температуры плавления комплекса суммарна? РНК-олигонуклеотидный зонд неспецифическое взаимодействш исчезает. То есть чем меньше сродство последовательности зонда к РНК чем больше замен в последовательности, тем меньше будет гибридизационный ответ при повышении температуры. Таким образом гибридизации при разных температурах вплоть до расчетной сс своеобразной "черепицей" зондов позволяют достаточно точн< определять наличие замен на конкретном участке последовательности.

В гибридизации использовали наиболее качественную и хорош< гибридизующуюся суммарную РНК, выделенную из головного мозг; новорожденного нерпенка-белька (см. Рис. 2, Е8). В качеств! отрицательного контроля использовалась суммарная РНК из мозга крысы Кроме того, для полноты проверки на фильтры наносилась плох<

гибридизовавшаяся в предыдущем эксперименте РНК из печени нерпы №3 (см. там же, С4). Гибридизации проводились при температурах: 25°С, 35°С, 40°С, 42°С, 44°С, 46°С, 48°С и 50°С для зондов с этой рассчетной температурой.

Результаты гибридизационного анализа продемонстрировали толную идентичность последовательности фрагмента М-гена (позиции 184-1050) исследуемого вируса и аналогичной последовательности СБУ вакцинный штамм Опс1ег5{ерооП). На рисунке 4 приведен пример результатов гибридизационного анализа при крайних значениях температур (25°С и 48°С). На рисунке видно, что при температуре гибридизации 25°С неспецифическое взаимодействие очень велико: толожительный ответ в реакции дают все образцы суммарной РНК, включая отрицательный контроль. Аналогичный результат был получен и три 35°С. Начиная с 40°С интенсивность свечения резко падает и при расчетных температурах гибридизации (48°С или 50°С) зонды хорошо :вязываются с РНК из мозга нерпенка, в значительно меньшей степени с 3НК из печени нерпы №3 и не связываются с отрицательным контролем. 7ри повышении температуры гибридизации до 52°С свечение пропадает совсем.

Таким образом, результаты этого эксперимента тродемонстрировали, что популяция байкальской нерпы поражена шенно СБУ, идентичным или очень близким вакцинному штамму 1пйег$1ерооП. Этот вывод потребовал дополнительной проверки ■ипотезы о причастности живых анти-СБУ вакцин к эпизоотии нерпы.

12 12 12 12'12 12 12

А ' :-У - ' У-У^*

В ! . Л'^'-С?" •#

с рр• с[Щ^ЩА-^Г

А }■:: Л 'Ш--^ Ул

эис. 4. Типичные результаты гибридизационного анализа при разных температурах. 1 - 25°С, 2 - 48°С, А - отрицательный контроль, В - РНК из печени 1ерпы №3, С - РНК из головного мозга нерпенка-бепька.

Таким образом, в результате представленных гибридизационных исследований можно сделать следующие выводы:

во-первых, байкальская нерпа поражена морбилливирусом, поскольку РНК, выделенная из органов нерп, гибридизуется с 32Р-мечеными олигонуклеотидами, комплементарными как вирионной, так и матричной РНК CDV и вируса кори;

во-вторых, это поражение не является единичным случаем, поскольку гибридизуется РНК, выделенная от павших, внешне здоровых и новорожденных животных, и уровень пораженное™ популяции близок к 70%;

в-третьих, морбилливирус байкальской нерпы является штаммом CDV, очень близким или идентичным вакцинному штамму Onderstepoort. поскольку нуклеотидные последовательности фрагмента гена М (позиции 484-1050) этих вирусов идентичны.

5. Определение и сравнительный анализ нуклеотидны> последовательностей фрагментов гена N (позиции 595-795) вакцинны? штаммов CDV и изолята вируса байкальской нерпы.

Для проверки предположения, что морбиливирус, вызвавший в 19871988гг. эпизоотию в популяции байкальской нерпы, имеет происхождение от живых вакцин, используемых в звероводстве, бьип определены нуклеотидные последовательности фрагментов гена N дд> изолята вируса байкальской нерпы (CDVP), полученного в Иркутскор. Противочумном институте под руководством Титенко А.М. i реизолированного там же штамма коммерческой живой вакцины протш CDV (от Shering-Plough Corporation, USA), применявшейся в окресностя: Байкала (CDVK).

В результате проделанной работы для восьми независим« амплифицированных фрагментов были получены последовательности представленные в виде элаймента с нуклеотидной последовательностью вакцинного штамма Onderstepoort на рисунке 5. Там же приведен аминокислотная последовательность фрагмента гена N.

На рисунке видно, что последовательности всех вирусов идентичш за исключением одной молчащей замены в позиции 735 (А - G Настораживает тот факт, что эта замена является общей и для вакцины, для изолята вируса от байкальской нерпы. Тем не менее, поскольк последовательность достаточно вариабельна, из полученных данны трудно сделать какие-либо выводы, кроме того, что вирус коммерческо живой вакцины неидентичен вакцинному штамму CDV Onderstepoor

Тримечательно, что, согласно справке Т.М.Шварца (Dr. Schwartz Т.М., >enior Director of Tecnical Services of Shering-PIough Animal Health Division), исследуемая вакцина получена на основе именно этого акцинного штамма CDV. Однако при адаптации вирусов к культуре леток могли появиться одинаковые замены в нуклеотидных юследовательностях, не приводящие к каким-либо изменениям в труктуре белка. Кроме того, поскольку процесс производства вакцины вляется коммерческой тайной, изначальный вакцинный штамм мог :одвергнуться некоторым усовершенствованиям, о которых д-р Шварц молчал по вполне понятным причинам.

595 YTQQRRVVGEFRMNKIWLDI DVO TATACCCAGCAAAGACGTGTGGTCGGAGAATTTAGAATGAACAAAATCTGGCTTGATATT

DVK ............................................................

DVP ............................................................

*21N-► *

655 VRNRIAEDLSLRRFMVALIL DVO GTTAGAAACAGGATTGCTGAGGACCTATCTTTGAGGCGATTCATGGTGGCGCTCATCTTG

DVK ............................................................

DVP ............................................................

715 DIKRSPGNKPRIAEMICDID DVO GACATCAAACGATCCCCAGGAAACAAGCCTAGAATTGCTGAAATGATTTGTGATATAGAT

DVK ....................G.......................................

DVP ....................G.......................................

775 N Y I V E A G 795 DVO AACTACATTGTGGAAGCTGGG

DVK .....................

DVP .....................

* - 24N*

ис. 5. Выравненные нуклеотидные и аминокислотные последовательности »рагмента гена N (позиции 595-795). CDVO - последовательность вакцинного гтамма Onderstepoort (Rozenblatt et al., 1985). CDVK - последовательность еизолированного вируса живой вакцины. CDVP - последовательность иркутского золята вируса от байкальской нерпы.

Заявление о коммерческой живой вакцине, как о причине эпизоотии, ызвавшей гибель более 6000 животных, является достаточно серьезным бвинением, требующим тщательной проверки. Кроме того, по-прежнему ерешенным остался вопрос о связи эпизоотии на Байкале и в Северной

Европе. Для решения этих проблем необходимо было установить точное таксономическое положение вируса от байкальской нерпы, что требовало определения и сравнения нуклеотидных последовательностей возможно большего количества вариантов CDV (включая вакцинные штаммы) на более протяженном участке.

6. Определение и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов гена Р (позиции 439-798) вируса от байкальской нерпы, вакцинных штаммов CDV и изолятов CDV от животных.

Для определения таксономического положения морбиливируса, вызвавшего в 1987-1988г.г. эпизоотию в популяции байкальской нерпы, а также для проверки предположения, что заболевание вызвано живыми вакцинами, используемыми в звероводстве, были определены нуклеотидные последовательности фрагментов гена Р для следующих изолятов и вирусов:

вакцинный штамм CDV Rockborrr,

реизолированный штамм коммерческой живой вакцины против CDV (от Shering-Plough Corporation, USA), применявшейся в окресностях Байкала;

изоляты диких штаммов CDV от хорька и собаки,полученные е

1992г.;

РЕК из головного мозга нерпы РВ6; изолят PDV2 от байкальской нерпы РВ6.

Для определения нуклеотидных последовательностей на кДНК и: вышеперечисленных образцов методом ПЦР с системой универсальны? морбилливирусных праймеров были получены фрагменты Р-гена длино? 417 н.п. и клонированы в векторе рТ7 Blue (Applied Biosystems) Полученные структуры, выравненные относительно последовательное™ вакцинного штамма Onderstepoort (CDV(O)), приведены на рисунке 6.

При анализе рисунка нельзя не заметить, что все три вакцинныз штамма практически идентичны. Вакцинный штамм Rockborn (CDV(R) имеет единственную замену в 14 позиции фрагмента. Также однозначн< можно сказать, что все остальные последовательности замети» отличаются от вакцинных. Этот факт указывает на непричастност коммерческой вакцины (CDV(K)) к заболеванию байкальской нерпы.

Обращает на себя внимание и тот факт, что нуклеотидна последовательность вируса байкальской нерпы, выделенног непосредственно из головного мозга нерпы РВ6 (клоны, полученные и

ПЦР-продукта с суммарной РНК из головного мозга) мРОУ2, отличается эт последовательности изолята РОУ2, полученного от того же животного. Это явление может свидетельствовать о процессе адаптации вируса к культуре клеток - замена в 26 позиции Т-С.

При сравнении последовательностей изолятов от хорька и собаки, выделенных одновременно в одном географическом районе, выяснилось, 4то они заметно отличаются друг от друга, что тоже может говорить о триспособлении конкретного штамма СБУ к конкретному хозяину.

439

ПЗУ (О) АСАСТСТССТССТАССТССАСССАСТСТСССТААТССАССАТТССАСАСАССАСААССАА :оу(ю .............с..............................................

499

HDV (О) GCCTTGATGATAGCACTGAGGATTCTGGCGAAGATTATTCCGAAGGAAATGCTTCATCTA :dv(r> ............................................................

DV (К) ............................................................

IPDV2 ............................................................

?uv2 .....................:......................................

)Од .............. . . :..........................G................

Garret ...........................................G................

559

DV (О) ACTGGGGATATTCTTTCGGCCTTAAACCGGACAGAGCAGCTGATGTGAGCATGCTGATGG

:DV(R> ............................................................

H3V(K) ............................................................

tPDV2 ............................А...............................

>DV2 ............................А...............................

>од ............................А...............................

terret ............................А...............................

619

:DV (О) AAGAGGAATTAAGTGCTCTACTCAGGACAAGCAGAAATGTAGGGATTCAGAAAAGGGATG HJV (R) ............................................................

:dv(k> ............................................................

IPDV2 ..........G........G......................................G.

>DV2 ..........G........G......................................G.

)og ..........G........G. . . .A...................................

'erret ..........G..C.....G................G.......................

Зис. 6. Нуклеотидные последовательности фрагмента гена Р, позиции 439-798 последовательности праймеров в элайнмент не входят). CDV(0) - штамм Dnderstepoort; CDV(R) - штамм Rockbourn; CDV(K) - реизолированная юммерческая живая вакцина; PDV2 - изолят, полученный от нерпы РВ6; MPDV2 -3НК из мозга нерпы РВ6; Dog и Ferret - немецкие изоляты от собаки и хорька.

:DV (к) .....

«PDV2 .....

PDV2 .....

Зод .....

rerret ... .С

G.....А

G.C...А

G.....А

G.....А

CDV (О) GGAAGACTCTGCAGTTCCCACATAATCCCGAAGGTAAGACAAGGGATCCGGAGTGTGGAT

CDV (R) ............................................................

CDV (K) ............................................................

MPDV2 ....A.................C..................G.A................

PDV2 ____A.................C..................G.A................

Dog .A....................C..................G................G.

Ferret......................C..................G..................

739 798

CDV (O) CCATTAAAAAGGGCACAGAAGAGAGGTCAGTCTCACATGGAATGGGGATAGTTGCTGGAT

CDV (R) ............................................................

CDV (K) ............................................................

MPDV2 ..................G...........С.............................

PDV2 ..................G...........С.............................

Dog ..................G...........С..............A..............

Ferret ..................G...........С.............................

Рис. 6. Продолжение.

Филогенетическое древо, построенное на основе полученных последовательностей (Рис. 7а), наглядно демонстрирует расхождение вакцинных штаммов СОУ с недавними изолятами. Также очевидно, что вирусы нерп и немецкие изоляты образуют отдельные кластеры, довольно сильно отличающиеся друг от друга.

При включении в анализ последовательности вируса европейских тюленей (РЭУ, банковский номер 010371), было получено филогенетическое дерево, приведенное на рисунке 7Ь. Видно, что вирус, поразивший популяции европейских тюленей практически одновременно с эпизоотией на Байкале, очень сильно отличается от всей группы СОУ. Судя по дистанции, он имеет самостоятельное происхождение и не принадлежит к виду СБУ.

PDV2 МОЗГ PDV2

PDV-2

>ис. 7(a,b). Филогенетические деревья, демонстрирующие генетические (заимоотношения между вирусами, построенные на основе последовательностей фрагмента гена Р (380 н.л.)

'DV2 - голландский изолят вируса байкальской нерпы от нерпы РВ6; Мозг PDV2 -шрусная РНК, выделенная непосредственно из мозга нерпы РВ6; Dog, Ferret -(емецкие изоляты CDV, выделенные от собаки и хорька в 1992г. Вакцины -юспедовательности вакцинных штаммов. PDV-вирус европейских тюленей.

выводы.

1. Доказано присутствие и активная репликация морбилливирусиы РНК в тканях байкальских тюленей с использованием мето,п гибридизации с набором радиоактивно меченых праймеро] комплементарных вирионной и матричной РНК вируса кори человека вируса чумы плотоядных.

2. Показано с использованием метода гибридизации, что уровег нораженности популяции байкальской нерпы морбилливирусо составлял 70%.

3. Установлено в результате гибридизации при разных температура и сравнительного анализа последовательностей фрагмента гена бель нуклеокапсида, что морбилливирус, поразивший популяцию байкальскс нерпы, является штаммом CDV.

4. Показано в результате сравнительного анализа получении последовательностей фрагмента гена фосфобелка длиной 380 пн изолятс вируса чумы плотоядных, выделенных от собаки и хорька, вируса с байкальских тюленей и двух коммерческих вакцинных штаммо применяемых в окресностях озера Байкал, что использованные окресностях озера Байкал живые вакцины против вируса чум плотоядных (штамм Rockborn и коммерческая живая вакцина от Sherini Plough Corporation) имеют низкую степень родства с вирусом ( байкальских тюленей. Следовательно, маловероятно, что они явили< источником заражения байкальских тюленей.

5. Показано в результате сравнительного анализа определеннь последовательностей фрагмента гена фосфобелка длиной 380 пн, ч' эпизоотии европейских и байкальских тюленей не имен этиологичческих связей.

6. Отработана и предложена к использованию систел универсальных морбилливирусных праймеров, позволяющая в короти сроки осуществлять дифференциальную диагностику морбилливируснь инфекций в популяциях различных животных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Grachev М.А., Kumarev V.P., Mamaev L.V., Zorin V.L., Baranova .V., Denikina N.N.. Belikov S.I., Petrov E.A., Kolesnik V.S., Kolesnik R.S., 'orofeev V.M., Beim A.M., Kudelin V.N., Nagieva F.G., Sidorov V.N. 'istemper virus in Baikal seals //Nature. - 1989. - V. 338. - P. 209.

2. Мамаев Jl.B., Беликов С.И., Баранова JI.B., Деникина Н.Н.. Зорин J1., Сидоров В.Н., Кумарев В.П. Обнаружение морбилливирусных РНК тканях павших нерп // Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы Наука. - 1992. - стр. 40-45.

3. Мамаев Л.В., Беликов С.И., Деникина Н.Н. Сходство орбилливируса байкальских тюленей с живой вакциной против чумы эрок // Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы / Наука. - 1992. стр. 62-66.

4. Mamaev L.V., Denikina N.N., Belikov S.I., Volchkov V.E., Visser K.G., Fleming M., Kai C., Harder Т., Liess В., Osterhaus A.D.M.E., Barrett . Characterisation of morbilivirus isolated from Lake Baikal seals (Phoca birica) // International symposium on Morbillivirus Infections, Hannover eterinary School, 12-13 June 1994.

5. Mamaev L.V., Denikina N.N., Belikov S.I., Volchkov V.E., Visser K.G., Fleming M., Kai C., Harder Т., Liess В., Osterhaus A.D.M.E., Barrett . Characterisation of morbilivirus isolated from Lake Baikal seals (Phoca birica) // Veterinary Microbiology. - 1995. - V. 44. - P. 251 - 259.

6. Mamaev L.V., Visser I.K.G., Belikov S.L, Denikina N.N., Harder Т., oatley L., Rima В., Edginton В., Osterhaus A.D.M.E., Barrett T. Canine istemper virus in Lake Baikal seals (Phoca sibirica) // The Veterinary Record. 1996.-V. 138.-P. 437-439.

7. Беликов С.И., Бутана T.B., Деникина H.H., Мамаев Л.В., Петров .А. Морбилливирус, вызвавший эпизоотию в 1987г., продолжает иркулировать в популяции байкальской нерпы // Сибирский сологический журнал. - 1999. - № 6. - стр. 663-666.