Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетические подходы к изучению РНК-содержащих вирусов на моделях морбилливируса байкальской нерпы и вируса клещевого энцефалита
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология
Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические подходы к изучению РНК-содержащих вирусов на моделях морбилливируса байкальской нерпы и вируса клещевого энцефалита"
Г г и ОД 2 5 ЦЕН ?У/)
На правах рукописи
БЕЛИКОВ Сергей Иванович
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ РНК-СО ДЕРЖАЩИХ ВИРУСОВ НА МОДЕЛЯХ МОРБИЛЛИВИРУСА БАЙКАЛЬСКОЙ НЕРПЫ И ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА
03.00.06 - вирусология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Владивосток - 2000
Диссертация выполнена в Лимнологическом институте СО РАН
Научные консультанты:
доктор медицинских наук, профессор Г.Н. Леонова
доктор медицинских наук, профессор, чл.-корр. РАМН В.И. Злобин
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, с.н.с. Е.П. Когут доктор биологических наук, с.н.с. Р.В. Гнутова доктор биологических наук, с.н.с. Ю.Ф. Картавцев
Ведущая организация:
Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук
Защита состоится" 14" декабря 2000 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета ДР. 003.97.40 в Биолого-почвенном институте ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, пр. 100-летия Владивостока, 159. Факс:(4232) 310-193.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библио-
теке ДВО РАН.
Автореферат разослан ноября 2000 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук
В.И. Малиновский
ръ'М-^О
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
В последние годы на территории России стремительно увеличивается аболеваемость населения, обусловленная РНК-содержащими вирусами. 'НК-содержащие вирусы обладают высокой скоростью изменчивости, что атрудняет использование для их диагностики и идентификации обычных [етодов иммуноанализа. Отсутствие знаний о штаммовых различиях виру-а не позволяет на научной основе разрабатывать необходимые вакцинные лекарственные препараты для борьбы с этими эпидемиологически опас-ыми инфекциями.
РНК-содержащий вирус был причиной вспышки острого инфекционно-о заболевания у байкальских тюленей в 1987-88 годах, которая привела к ибели более 6500 животных из общего числа 80-100 тысяч. Молекулярно-иологическое изучение новых морбилливирусов представляет особый интерес, поскольку это не только расширяет существующие знания относительно азнообразия циркулирующих в природе вирусов, но и раскрывает нското-ые возможные молекулярные механизмы неожиданной смены хозяина, об-аруженной практически одновременно в нескольких местах (Балтийском, Средиземном и Северном морях). Относительно низкий риск заражения ис-ледователя этим вирусом делает его хорошей моделью для отработки мето-ов исследования морбилливирусов, один из представителей которых, вирус ори, является патогенным для человека.
Вирус клещевого энцефалита, в отличие от морбилливируса байкальс-ой нерпы, известен давно. Вызываемый этим вирусом клещевой энцефалит вляется наиболее тяжелой и распространенной природно-очаговой инфек-;исй на территории России. Несмотря на 60-летний опыт изучения и борьбы с тим заболеванием, разработкой и практическим применением нескольких околений профилактических вакцин, заболеваемость КЭ в стране неуклон-:о растет. Особенно неблагоприятно ситуация складывается в азиатской час-и России. В то же время существует проблема эффективности препаратов для акцинации и экстренной профилактики, которая обусловлена высокой из-[еичнвостью вируса и отсутствием знаний о штаммовом составе вируса, цир-улирующего в настоящее время.
Учитывая высокую точность и информативность методов молекуляр-ой биологии для понимания генетической структуры региональных при-одных популяций вируса КЭ и для анализа фундаментальных вопросов го эволюции, мы посчитали актуальным изучить молекулярно-эпидемио-огические особенности КЭ на территории бывшего Советского Союза. 1рименение современных методов молекулярной вирусологии, таких как юлекулярная гибридизация нуклеиновых кислот с различными высоко-
специфичными зондами и определение структуры генома вируса важно также для решения практических задач, направленных на совершенствование прогноза эпидситуации, диагностики, профилактики и лечения различных инфекций.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы явилась разработка методических подходов для решения вопросов идентификации и молекулярно-эпидемиологической характеристики на примере двух РНК-содержащих вирусов: морбилливиру-са байкальской нерпы и вируса клещевого энцефалита.
Для этого необходимо было последовательно решить следующие задачи:
1. Подобрать структуры олигонуклеотидных зондов для определения наличия вирусоспецифических РНК в образцах тканей павших и больных животных на основании сравнения опубликованных нуклеотидных последовательностей известных морбилливирусов кори и СБУ.
2. Показать наличие как вирионной, так и матричных морбилливирус-ных РНК в тканях павших и больных животных, используя метод гибридизации.
3. Определить по результатам гибридизации наиболее консервативные участки генома морбилливирусов, пригодные для использования в качестве универсальных праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР) при массовой диагностике морбилливирусных инфекций. Оптимизировать условия экспресс-диагностики морбилливирусных инфекций методом ПЦР, с использованием образцов тканей, минуя этап культивирования вируса.
4. Определить нуклеотидные последовательности генов Р и Н изолята вируса байкальской нерпы и сравнить полученные последовательности с аналогичными структурами других морбилливирусов.
5. Определить таксономическое положение вируса байкальской нерпы среди других морбилливирусов.
6. Исследовать популяцию байкальской нерпы на наличие в ней морбилливирусов через 10 лет после вспышки 1987/88 гг.
7. Определить структуру фрагмента гена Е вируса КЭ и определить таксономическое положение и генетическую принадлежность вариантов вируса, циркулирующих на территории России.
8. Изучить на основе гибридизационного анализа гетерогенность и географическое распространение генетических вариантов вируса КЭ.
9. Адаптировать методы кластерного анализа для характеристики генетических различий штаммов вируса КЭ на базе данных гибридизационных тестов и выявить гетерогенность региональных вирусных популяций.
10. Оценить возможность корреляции вирулентности вируса КЭ и его спектра гибридизации с олигонуклеотидными зондами.
I Научная новизна работы
• Впервые методами молекулярной биологии, включающими гибриди-¡ацию с олигонуклеотидными зондами, амплификацию с использованием по-тимеразной цепной реакции выбранных участков генома вирусов, клонирование и последующее определение нуклеотидной последовательности Полуниных фрагментов был обнаружен новый, ранее неизвестный вирус, вызвав-лий эпизоотию байкальской нерпы.
• В результате анализа нуклеотидных последовательностей однозначно /становлено, что вспышка болезни на Байкале была вызвана вариантом вируса чумы плотоядных, который отличается от других, циркулирующих в лрироде штаммов СБУ.
• Показано существенное отличие вируса байкальской нерпы от мор-зилливирусов других морских млекопитающих, как ластоногих, так и китообразных.
• Продемонстрировано, что морбилливирус байкальской нерпы продолжает циркулировать в популяции, причем циркулирует как минимум два ва-эианта вируса различной вирулентности.
• Впервые на репрезентативном материале получены детальные сведения об основных генотипах вируса клещевого энцефалита, их генетическом разнообразии и географическом распространении в различных физико-географических регионах России.
• Впервые показано, что на территории России в основном циркулирует ?ирус клещевого энцефалита третьего генотипа, в то время как вирусы первого и второго генотипов встречаются мозаично.
• Так, вирус дальневосточного (первого) генотипа имеется во всех, кроне трех, исследуемых регионах от Сахалина до Калининграда. Вирус цент-эально-европейского (второго) генотипа циркулирует на западе России и его 1реал распространяется до Урала и Алтая.
• Впервые высказано предположение, что высокой вирулентностью об-надают не только штаммы вируса клещевого энцефалита дальневосточного 'енотипа, но и ряд штаммов вируса второго и третьего генотипов. Высокая зирулентность вариантов вируса связана, по-видимому, со структурой белка
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные в результате работы нуклеотидные последовательности двух енов вируса байкальских тюленей и ряда других изолятов СОУ значительно расширяют существующие представления о разнообразии вирусов чумы пло-гоядных, циркулирующих в природе. В распоряжении исследователей оказался юполнительный материал для изучения различий между вирусами на генети-неском уровне, для анализа вирусных белков и определения значения изменений в структуре генов и белков.
В ходе изучения вируса байкальской нерпы разработан и синтезирован ряд морбилливирусных праймеров для выявления и тонкого анализа любой морбилливирусной инфекции с помощью метода полимеразной цепной реакции. Отработанные методики позволяют быстро, без применения трудоёмкой стадии культивирования вируса подтвердить или опровергнуть наличие морбилливирусной инфекции, а в сочетании с методами секвенирования определить принадлежность выявленного вируса к тому или иному виду мор-билливируса и показать его отличие от других близких ему вирусов. Полученные результаты показывают, что данный подход оказался достаточно эффективным для этих целей. Разработанная методика с набором "универсальных морбилливирусных праймеров" может без изменений применяться при анализе вируса кори и других морбилливирусов.
Достоверное доказательство о превалировании на территории России вируса КЭ третьего генотипа не только расширяет наши представления о путях эволюции вируса, но и ставит вопросы о необходимости разработки новых коммерческих препаратов для диагностики, профилактики и лечения клещевого энцефалита.
Показанные выраженные отличия в частоте встречаемости основных генотипов вируса КЭ на различных территориях требуют от эпидемиологических служб разработать региональные схемы диагностики и профилактики КЭ.
Разработанный патогенетический подход к анализу вирусной популяции применим для оценки эпидситуации в регионах с целью профилактики и диагностики заболевания. Предложенный метод графического отображения спектра гибридизации вирусной РНК совместно с патогенетическим подходом целесообразно использовать при генотипировании вируса гепатита С с целью выявления путей его распространения.
Предположение о связи вирулентности вируса клещевого энцефалита со структурой гена белка ставит перед исследователями новые задачи изучения структуры функции и механизма действия белка, кодируемого этим геном.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Эпизоотия в популяции байкальской нерпы в 1987-1988гг. вызвана морбилливирусом, который наиболее близок к вирусу чумы плотоядных и является его новым вариантом.
2. Вирус, поразивший популяцию байкальской нерпы, не являлся причиной эпизоотии обыкновенных и серых тюленей в Северной Европе.
3. Переход морбилливирусов к морским и пресноводным млекопитающим произошёл независимо в нескольких эволюционных линиях.
4. Коммерческие живые вакцины против вируса чумы плотоядных непричастны к заражению популяции байкальской нерпы.
5. На территории России выявлен высокий уровень генетической гетерогенности циркулирующих штаммов вируса клещевого энцефалита.
6. На территории России доминируют штаммы вируса КЭ третьего ге-ютипа.
7. Штаммы вируса КЭ дальневосточного (первого) генотипа в основном ¡стречаются па Дальнем Востоке, но в тоже время имеются в большинстве )сследованных регионах от Калининграда до Сахалина.
8. Штаммы вируса КЭ центрально-европейского (второго) генотипа ¡стречаются в западных областях России, а ареал их распространения дости--ает Урала и Алтая.
9. Среди вариантов вируса КЭ второго и третьего генотипа могут встре-тться высоковирулентные штаммы.
Внедрение в практику
Полученные нуклеотидные последовательности генов М, N, Р и Н изу-шнных штаммов CDV, а также структуры фрагмента гена Е депонированы в международный компьютерный банк данных Genbank, а именно: AF2 59552, \F25955i, AF259550, AF259549, AF224667, AF224666, AF224665, \F224 664, AF224663, AF241774, AF241773, AF241772, AF236055, \F231807, AF231806, AF229364, AF229363, AF229362, AF181446, \F139491, AF13 94 90, AF139489, Х84998, Х84999, Х85000.
Получены следующие свидетельства на изобретения:
• Беликов С.И., Горбунов Ю.А., Попов С.Г. Способ удаления тритиль-шх защитных групп с производных нуклеозидов, нуклеотидов и олигонукле->тидов //Авторское свидетельство № 828671. - 1981. - 5 е.;
• Беликов С.И., Рыбак В.К. Способ получения 4-1Ч-бензоил-2-дезокси-щтидина Ii Авторское свидетельство № 1266164. - 1986а. - 3 е.;
• Беликов С.И., Рыбак В.К., Озолс A.M., Стопникова М.Н., Зиемелис СМ. 5'-0-Тритолилметильные производные 2'-дезоксинуклеозидов в качестве Iсходных веществ в синтезе олигонуклеотидов // Авторское свидетельство № 270153.- 19866.-7 е.;
• Абрамова JI.M., Беликов С.И., Белова Н.В., Чекавая Н.И. Способ поучения олиготимидилатного производного целлюлозы // Авторское свиде--ельство № 1438189.- 1988.-4 с;
• Кумарев В.П., Беликов С.И., Кобзев В.Ф., Кузнеделов К.Д., Баранова I.B., Средин Ю.Г. Способ синтеза олиго(поли)нуклеотидов и устройство для :го осуществления //Авторское свидетельство № 1773916. - 1992. - 11 с.
Апробация работы и публикации
Материалы диссертации были представлены на Международном симпо-иуме "Morbillivirus infections", Hannover, 1994; на второй Верещагинской ¡айкальской международной конференции, Иркутск, 1995; на юбилейной на-
учной конференции "Природно-очаговые болезни человека", Омск, 1996; на международной научной конференции "Вирусные, риккетсиозные и бактериальные инфекции, переносимые клещами", Иркутск, 1996; на научной конференции "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера", Новосибирск, 1998; на первой международной конференции "Biodiversity and dynamics of ecosystems in North Eurasia", Новосибирск, 2000.
По материалам диссертации имеется 18 публикаций, включая 1 монографию и 5 авторских свидетельств.
Структура и объем работы
Предлагаемая диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы и 5 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы (219 отечественных и зарубежных источников). Объем работы составляет 234 страницы машинописного текста, включающего 13 таблиц и 37 рисунков.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Идентификация неизвестного патогена, вызвавшего эпизоотию байкальской нерпы, методом гибридизации нуклеиновых кислот
Массовая гибель байкальской нерпы, отмечавшаяся в 1987-1988 годах, по результатам работы правительственной комиссии, не могла быть вызвана ни существенным загрязнением озера токсичными веществами, ни инфицированием тюленей известными бактериальными или вирусными патогенами. Нами было высказано предположение, что эпизоотия вызвана неизвестным вирусом, ранее не поражавшим нерпу и, по серологическим данным, являющимся морбилливирусом. Для доказательства предположения о том, что какой-то вирус данного семейства вызвал гибель более 6000 байкальских тюленей, была проведена работа по гибридизации суммарной РНК из тканей погибших и клинически здоровых животных со специфичными оли-гонуклеотидными зондами к различным участкам генома вируса кори и вируса чумы плотоядных. При сравнении этих геномов были выбраны как консервативные, так и вариабельные участки РНК, на которые были синтезированы зонды, причем зонды были комплементарны как вирусной PIIK, так и комплементарной ей мРНК. Морбилливирусы содержат минус-цепь РНК, поэтому в случае активного размножения вируса в тканях животных должна обнаруживаться не только РНК вируса, но и мРНК. Всего было синтезировано 54 зонда на различные участки генов Р, N и М. По результатам гибридизации с зондами на гены Р и N было показано, что РНК морбилливиру-
ов обнаруживается во всех органах умерших животных (печень, поджелу-(очная железа, почки, легкие, спинной и головной мозг и т.д.)- В последующем было показано, что вирусная РНК обнаруживается также у двух клини-■ески здоровых животных и даже у детеныша нерпы - белька и спектр гиб-шдизации с зондами не отличается у нерпы и погибшей от "чумки" (вируса ЖУ) собаки.
Для проведения массового скрининга на пораженность вирусом популя-1ии байкальских тюленей были отобраны 12 зондов, гибридизация с которыми была максимальна у всех животных. Суммарную РНК, выделенную из раз-1ичных органов 120 случайно отобранных животных, забитых во время пла-швого весеннего отстрела, гибридизовали со смесью этих зондов, причем на-шчие вирусной РНК было обнаружено в 82 случаях. Таким образом, показано, !то зараженность популяции составляет немногим менее 70 %. Аналогичные результаты были получены другими исследователями, проводившими анализ юраженности популяции нерпы иммунологическими методами (Зорин, авто-эеф. ... дисс. к.б.н.).
Для более четкого генотипирования неизвестного вируса байкальской 1ерпы и доказательства его близости к одному из известных морбилливиру-:ов, была проведена сравнительная гибридизация РНК от различных виру-:ов, от нескольких нерп и из штамма вируса байкальской нерпы, выделенного •олландскими учеными, с 33 зондами, перекрывающими фрагмент гена М с 184 по 1050 позицию. Структура олигонуклеотидов была выбрана таким образом, чтобы их температуры гибридизации были одинаковыми. По резуль-гатам гибридизации при различных температурах было показано, что вирус райкальской нерпы неотличим от вируса чумы плотоядных, а спектр гибри-шзации совпадает у вируса байкальской нерпы и у вакцинного штамма ЭпскгзК'рооп. Таким образом, было доказано, что гибель байкальской нерпы рыла обусловлена морбилливирусом, а именно, вирусом чумы плотоядных СЭУ), близким или идентичным вакцинному штамму.
2. Определение и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов IV, Р и Н морбилливируса байкальской нерпы
Для абсолютной уверенности в идентичности или отличии вируса бай-сальской нерпы от известных штаммов СБУ, включая вакцинные, были определены первичные структуры фрагмента гена Ы, полноразмерного гена Р и юлноразмерного гена Н. Выбор именно этих генов обусловлен тем, что они шеют разную степень консервативности, а для идентификации сравнительно 1алеких видов более подходят консервативные гены, такие как ген 14, для иден-гификации близкородственных видов более подходят вариабельные гены, гакие как ген Н. Ген Р занимает промежуточное положение между этими вариантами.
Анализ структуры 200-членного фрагмента гена N показал полную идентичность структуры вируса байкальской нерпы и вакцинного вируса CDVK (Shering-Plough Corp.,USA), а одна молчащая замена обнаружена в структуре гена вакцинного штамма Onderstepoort. Таким образом, ген N не подходит для наших целей и необходим анализ менее консервативного гена. С этой целью мы определили структуру гена Р, длиной 1569 нуклеотидных пар, и показали, что вирус байкальской нерпы достоверно отличается от вакцинных штаммов вируса Onderstepoort и Rockborn. Эти данные проиллюстрированы на рис. 1, где приведено филогенетическое древо, построенное на анализе сравнения гена Р.
55 81
100
100
100
SEAL88 • Ferr90/G
- Dog90/G > CDV
100
Ondst.vac
RB.vac
PDV
DMV
RPV - MV
Рис. 1. Филогенетическое древо, построенное на основе сравнения структур фрагмент гена Р вируса байкальской нерпы (Seal88), хорька (Ferr90/G), собаки (Dog90/G), вакцинных штаммов Onderstepoort и Flockborn COndst.vac, RB.vac^, вируса, поразившего европейских тюленей во время эпизоотиии 1988-1989 годов (PDV, strain Ulster/88), вируса дельфинов (DMV), вируса чумы крупного рогатого скота (RPV) и вируса кори (MV, strain Edmonston).
На рис. 1 видно, что вакцинные штаммы достоверно отличаются от вируса байкальской нерпы, и, следовательно, не могли быть причиной эпизоотии у байкальских тюленей. Видно также, что вирус, поразивший европейских тюленей во время аналогичной эпизоотии в Европе в 1988-1989 годах, находится далеко от вируса байкальской нерпы и не является его ближайшим
родственником. Вирусы дельфинов, чумы крупного рогатого скота и кори являются еще более далекими представителями морбилливирусов.
Для определения точного таксономического положения вируса байкальской нерпы среди вирусов СБУ нами была определена структура гена Н длиной 1949 п.н. Также как при анализе гена Р, в анализ были взяты образцы РНК хорька и собаки и два образца РНК вируса байкальской нерпы. Один образец из изолята вируса нерпы, выделенного голландскими учеными, а другой образец РНК был выделен из мозга той нерпы, от которой был выделен изолят вируса. На рис. 2. показано филогенетическое древо, полученное в результате анализа гена Н различных штаммов вируса СБУ.
L02 иЬвШиЁшшЧИ*
190 »to IM
loor Black panther 57 Black leopard Raccoon — Javelina d |— Chinese leopard '— American dog - German dog-90 -Banish dog German dog-404 1 German dog-2544 —Ferret (Germany)
i Raccoon dog
Dog (Hamamatsu)
— ito [ Dog (Yanaka)
Dog (Ueno)
I— Chinese dog (Liud) IOOJ
— Greenlandic dog iJorPDV-2 (RNA)
LpDV-2 (Strain) |—Snyder Hill loorConvac
USA
Germany
Yapan
- Onderstepoort
Vaccine
■PDV
Рис. 2. Филогенетическое древо, полученное в результате анализа структуры гена Н, показывающее таксономическое положение морбилливируса байкальской нерпы среди других вирусов СйУ.
В качестве аутгруппы взят штамм морбилливируса от европейских тюленей (РОУ). Так же как при анализе гена Р, видно, что структуры вакцинных штаммов достоверно отличаются от других структур штаммов вируса СБУ, выделенных от животных. Вирус байкальской нерпы находится в одном кластере с вариантами вируса от китайской и гренландской собак и достоверно отличается от вирусов СБУ, выделенных в других районах мира. Видно, что вирусы СОУ, выделенные от диких и домашних животных, имеют региональные особенности и образуют отдельные кластеры. Так, выделяются американские, европейские и японские кластеры вируса СЭУ. Но вирус байкальской нерпы находится в одном кластере с вирусами из географически удаленных территорий (Гренландия и Китай), что указывает, возможно, на занос вируса с помощью человека, путем привоза больных собак.
Известно, что организмы, попав в новые экологические условия, начинают быстро мутировать в процессе приспособления к новой среде обитания. В связи с этим мы исследовали наличие вируса байкальской нерпы и его гетерогенность в популяции тюленей в течение 10-летнего периода после эпизоотии. С этой целью мы анализировали фрагмент гена Р, полученный путем амплификации вирусной РНК из мозга животных на "универсальных морбилливирусных" праймерах. С помощью этих праймеров, имеющих структуру АТСТТТАТСАТСАСАССССТС и АТТСССТЮСАССАСТТСТС, амплифицируется фрагмент длиной 429 п.н., достаточный для идентификации вируса. В анализ брали либо клинически здоровых животных (во время плановых забоев 1992 и 1995 годов) либо умерших животных (1996 и 1997 гг). В 1992 году было проанализировано 45 животных, в 1995 году - 35 животных. В отличие от 1988 года, когда была обнаружена зараженность нерпы на уровне 79 %, в 1992 году вирус был обнаружен только у 6 % животных, однако зараженность вновь резко возросла в 1995 году и составила 40%. Несмотря на такую высокую зараженность нерпы в 1995 году не наблюдалось достоверного превышения смертности животных по сравнению с остальными годами. Филогенетический анализ проанализированных структур фрагмента гена Р приведен на рис. 3.
Анализ структуры фрагмента показал, что в трех проанализированных в 1992 г образцах, имеются ноль, одна и две замены на 429 п.н., что указывает на высокую, но не экстремальную изменчивость вируса. Однако в 1995 году у трех изолятов вируса, из четырех проанализированных образцов, были обнаружены по 7-8 замен в исследуемой области. Наличие такого количества замен в относительно небольшом фрагменте генома указывает на то, что вирус буквально за три года претерпел существенные изменения, и можно предположить, что появился новый вариант вируса. На появление нового варианта указывает тот факт, что, как видно на рис. 3, варианты вируса переместились
в другой кластер. На появление нового, существенно отличающегося от предыдущего варианта вируса, указывает также факт более высокой зараженности нерпы, чем в предыдущие годы. Но данный вариант вируса, вероятно, является менее патогенным для байкальской нерпы. Вариант вируса, поразившего нерпу в 1987 году, продолжает циркулировать в популяции, и обнаружен в органах умерших в 1996 и 1997 годах нерп.
99
■ S.vac lOndstvac 981-RB.vac-Ф-
. SnyHill ■»•
79
- DcgB/UK
-Великобритания
83
61
41
43
85
74
iCleo92/US
53 I-Gfox92/US
r- Lion94/A 64 | Cfam94/A 73
Bleo91/US Racn92/US
-США
97
Otmeg94/A - Pan94-2/A
96
УПрал^З/А
34 iPan94-1/A SEAL63-95 •
>-
Африка
58
С Ferr89/G -Dog90/G
}
- Германия
80
81
I--
j SEA
80
72
SEAL78-95 • SEAL2S-95 •
Sllon/UK -ф- - Великобритания Dog95/Ch -Ф- -Китай
-SEALj1-92 •
5S,SEALj13-92 • SEALJ14-92 • SEAL2-97 • SEAL-96 • SEAL3-97 •
48
52
I J
1SEAI 1-£
0.01
42 26
531 351
SB88 •
SEAL88 •
SEAL27-95 •
■ SB88
К
Рис. 3. Филогенетический анализ, выполненный на основе анализа структур фрагмента гена Р вирусов СОУ и вариантов вируса байкальской нерпы(в), выделенных в различные годы после эпизоотии 1987-1988 г. Значком (•$■) обозначены исследованные в работе изоляты СО\/.
3. Молекулярно-генетическое изучение вируса клещевого энцефалита, циркулирующего на территории России
До последнего времени считалось, что дальневосточный и центрально-европейский варианты вируса клещевого энцефалита являются доминирующими на Евро-Азиатском континенте. Но недавно на территории России были обнаружены еще несколько вариантов вируса, в том числе восточносибирский и урало-сибирский варианты (Злобин, 1996). Однако эти данные нельзя считать абсолютно убедительными, так как они получены на основе различных методологических подходов и критериев оценки генетических различий вариантов. Наиболее достоверно гетерогенность родственных вариантов вируса можно оценить лишь при определении структуры их НК. Так, наиболее достоверная классификация флавивиру-сов, куда входит вирус КЭ, была проведена на основе анализа структур гена NS5. Однако классификация по этому гену не совсем удобна, так как белок NS5 является неструктурным белком и его гетерогенность не влияет на антигенные характеристики вируса. Для этих целей более удобен гли-копротеин оболочки вируса, белок Е, так как к нему образуются антитела, и поэтому классификацию, полученную на основании анализа структур гена этого белка, можно будет сравнить с полученной ранее классификацией по антигенным свойствам вируса.
С этой целью мы выбрали фрагмент гена Е, состоящий из 160 пар оснований, и определили первичную структуру этого фрагмента гена у 29 штаммов вируса из различных районов России. Первичная структура РНК была определена методом RT-PCR с использованием для обратной транскрипции прайме-ра GAGCTTCTCCACATGGCCAT, комплементарного участку 2647-2666 гена NS1 и праймеров GGATCAGAGTGATCGAGGGTG И CAACACTCCAGTCTGGTCTCC на ПОЗИЦИИ 1248-1268 и 1758-1738 генаЕ.
Генетическая гетерогенность вируса КЭ представлена на филогенетическом древе (рис. 4), из которого следует, что штаммы вируса КЭ разделяется на три кластера.
В первый кластер входят штаммы вируса, выделенные в основном на Дальнем Востоке, во второй кластер входят штаммы вируса, в большинстве своем выделенные в Центральной Европе, в третий кластер входят штаммы вируса, выделенные из различных регионов России от Сахалина до Калининграда. Видна также группа штаммов комплекса клещевого энцефалита, к которому относится проанализированный нами штамм Vergina и два штамма с неясной позицией (886-84 и 178-79). Таким образом установлено, что на территории России доминируют варианты вируса третьего генотипа, а также встречаются варианты вируса первого и второго генотипов.
— НУГУШ-2 ТАЛАКЛН-4 ЛАГОВКА-5
- ПРЕГОЛЯ-1 ТЕНИСТ
новгород-г
—БУЗУУЧУК ТОМАРИ-1 БОТСАД-1 БАЙКАЛ-4
СТОЛБЫ-1 СТОЛБЬМ 1— СССТРОРЕЦК-2 . СЕМЕКС к'АТУНЬ-3
—"311-81
ВОЛОГДА-! ЛЕСОПАРК-!! А1а>*
УмПсЬепко г* УмНеЬспко
-ЕЛЬЦОВКА-2
884-81-1
БсНаг I* ЦиЬ. !• ,272-75
• 1»о 40- Р.п-
-Бтаг* Уп"
Нург-К23" - ТВЕ *ПТ 973
Кст !•
АЛЕБАОТРОВО-1 АЬ1СГЧГ0С"
га-Ьоир1п{ Ш*
-ЯрмИЬ 5Ь«р*
ТвгкиЪ" ВЕР1 1П1А Стк («С .
1
башкирия амурская обл. приморский край калининградская обл. омская обл. новгородская обл. киргизия ©.сахалин
новосибирская обл. иркутская обл.
гтотигт з красноярский край ' " красноярский край
ленинградская о ял. волынская обл. алтайский край бурятия
вологодская обл. новосибирская обл.
новосиби рск ая обл. иркутская обл.
ирютская обл.
ГЕНОТИП 2
-Цв
1С
0.1.1* -01Ыш< 5-и. 0»Ыя1-5-10* р! ОЫт.З-й-
Л Ьо»Ыш«А-1-
I-Сг1п<а'
I- ЧЕХЦИР-1
г-!-- ПРИМОРЬЕ-!
I-205 •
г- ^фп-НО* К1М-2* . КН9$-10-КНМ-5-4—$о1)1п' 1| N 132-
ПРИМОРЬЕ ! I- N24-- 178-79
ЭСТОНИЯ ПЕРМСКАЯ ОБЛ.
греция
хабаровский край приморский край
ГЕНОТИП 1
- К|»аяиг ГогеЛ ¿иг иг *
приморский край иркутская обл.
Рис. 4. Филогенетическое древо на основе анализа структур фрагмента гена Е штаммов вируса КЭ, выделенных на территории России. Показаны районы, в которых выделен штамм вируса. Структуры, отмеченные *, взяты из СепВапк.
Такое распределение вариантов вируса КЭ, циркулирующих на территории России, подтверждается также анализом вычисленной на основе наших и литературных данных аминокислотной последовательности анализируемого
фрагмента белка Е (Рис. 5).
Генотип I
190 243
Sofjin* SGVDLAQTVILELDKT S EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
O-I-l* SGVDLAQTVILELDKT s EHL PT AWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
Oshima-5-lO* SGVDLAQTVILELDKT s EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
Oshima 3-6* SGVDLAQTVILELDKT s EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
Crimea* SGVDLAQTVILELDKT s EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
Sofjin-HO* SGVDLAQTVILELDKT s EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
KH98-2* SGVDLAQTVILELDKT s EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
KH98-10* SGVDLAQTVILELDKT s EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
T-blood* SGVDLAQTVILELDKT s EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
N132* SGVDLAQTVILELDKT s EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
PRIMORSKIJ-3 SGVDLAQTVILELDKT s EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
RK 1424* SGVDLAQTVILELDKT s EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
Oshima 5-11* SSVDLAQTVILELDKT s EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
Oshima A-l* SGVDLAQTVILELDKT s EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHDGAQ N WNNAERLV
KH98-5* SGVDLAQTVILELDRT s EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
HEHCIR-1 SGVDLAQTVILELDKT s EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
PRIMORSKIJ-4 SGVDLAQTVILELDKT s EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
205 SGVDLAQTVILELDKT s EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
178-79 SGVDLAQTVILELDKT s EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWRHEGVQ N WNNAERLV
Генотип II
Neudoerfl* SGVDLAQTVILELDKT V EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
Als 1* SGVDLAQTVILELDKT V EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
Schar I* SGVDLAQTVILELDKT V EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
272 SGVDLAQTVILELDKT V EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
N 256* SGVDLAQTVILELDKT V EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
Iso 40* SGVDLAQTVILELDKT V EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
Pan* SGVDLAQTVILELDKT V EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
Hypr* SGVDLAQTVILELDKT V EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
К 23* SGVDLAQTVILELDKT V EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
TBE 4387* SGVDLAQTVILELDKT V EHL PTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
ALEBASTROVO SGVDLAQTVILELDKT V EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
973_3 SGVDLAQTVILELDKT V EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
Absettarov* SGVDLAQTVILELDKT V EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
263* SGVDLAQTVILELDKT V EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
ZZ 9* SGVDLAQTVILELDKT V EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNDAGRLV
Stara Ves* SGVDLAQTVILELDKT V EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNADRLV
Ljub I* SGVDLAQTVILELDKT V EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ T' WNNAERLV
Генотип III
SESTRORETSK 886-84-1
Aina*
Vasilchenkol*
Vasilchenko2*
LESOPARK-11
367-81
352-81
BAIKAL-4
TALAKAN-4
LAZOVKA-5
PREGOLA-1
TENIS-6
NOVGOROD
TOMARI-3
BOTSAD-1
BAIKAL-3
STOLBY-1
STOLBY-4
SEMEKS
KATUN-3
VOLOGDA-2
ELTSOVKA-2
BUZUUCHUK
NUGDSH-2
SGVDLAQTVILELDKT L EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV a) SGVDLAQTVILELDKT L EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ N WNNAERLV
SGVDLAQTVILELDKT SGVDLAQTVILELDKT SGVDLAQTVILELDKT SGVDLAQTVILELDKT SGVDLAQTVILELDKT SGLDLAQTVILELDKT
L EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ Q WNNAERLV b) L EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ Q WNNAERLV L EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ Q WNNAERLV L EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ Q WNNAERLV L EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ Q WNNAERLV L EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ Q RNNAERLV
SGVDLAQTVILELDKT L SGVDLAQTVILELDKT L SGVDLAQTVILELDKT L SGVDLAQTVILELDKT L SGVDLAQTVILELDKT L SGVDLAQTVILELDKT L SGVDLAQTVILELDKT L SGVDLAQTVILELDKT L SGVDLAQTVILELDKT L SGVDLAQTVILELDKT L SGVDLAQTVILELDKT L SGVDLAQTVILELDKT L SGVDLAQTVILELDKT L SGVDLAQTVILELDKT L SGVDLAQTVVLELDKT L SGVDLAQTVILELDTT L SGVDLAQTVILELDKT L
EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ H WNNAERLV С) EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ H WNNAERLV EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ H WNNAERLV EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ H WNNAERLV EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ H WNNAERLV EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ H WNNAERLV EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ H WNNAERLV EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ H WNNAERLV EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ H WNNAERLV EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ H WNNAERLV EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ H WNNAERLV EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ H WNNAERLV EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ H WNNAERLV EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ H WNNAERLV EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ H WNNAERLV EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ H WNNAERLV EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ H WNNAERLV
Комплекс клещевого энцефалита
Turkish* VERGINA-9 Greek goat* Louping ill* Spanish sheep* K.forest dis.*
SGVDLAQTVVLELDKT A EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAL G WNNAERLV SGVDLAQTVILELDKT A EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAL G WNNAERLV SGVDLAQTVILELDKT A EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAL G WNNAERLV SGVDLAQTIILELDKT A EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHDGNP H WNNAERLV SGVDLAQTVILELDKT A EHLPTAWQVHRDWFNDLALPWKHEGAQ R WNNAERLV SGVDPAQTVVLELDKT A EHLPKAWQVHRDWFEDLSLPWRHEGAQ E WNNADRLV
Рис. 5. Сравнение аминокислотных структур фрагмента белка Е вариантов вируса КЭ, выделенных на территории России. Структуры, отмеченные *, взяты из вепБапк.
На рис.5 видно, что аминокислота в позиции 206 коррелирует с генотипом вируса, причем штаммы вируса первого генотипа имеют в этой позиции серин, второго генотипа - валин, третьего генотипа - лейцин, а вирусы комплекса клещевого энцефалита - аланин. Аналогичные данные получены австрийскими учеными в 1999 году, однако в их анализе было рассмотрено только 2 штамма вируса КЭ третьего генотипа. Еще одним вариабельным участком является аминокислота в позиции 235, причем штаммы вируса пер-
вого и второго генотипов содержат в этом месте аспарагин, а штаммы вируса третьего генотипа разбиваются на три группы: меньшая группа из двух штаммов так же содержит аспарагин, группа из пяти штаммов содержит глу-тамин, большая группа из 17 штаммов содержит гистидин. Возможно, что отличия в этой позиции были причиной выявления ранее на территории России нескольких серотипов вируса КЭ, в частности урало-сибирского и восточносибирского вариантов.
4. Определение гетерогенности популяции вируса на территории России методом гибридизации нуклеиновых кислот
Высокая трудоемкость определения первичной структуры генов не позволяет провести массовый скрининг популяции вируса. Для таких анализов более подходит метод гибридизации. Но его широкое использование сдерживалось отсутствием методов математической обработки большого массива данных гибридизации. Кроме того, данные по гибридизации вирусной РНК с различными зондами указывают на генетическую гетерогенность популяции, но не учитывают возможную вирулентность вируса. Комплексный анализ этих важных характеристик вируса может быть перспективным направлением в оценке эпидемиологической ситуации в регионах и разработке рациональной схемы профилактики заболеваемости.
С целью сравнения данных гибридизации вирусной РНК с олигонук-леотидными зондами и данных по вирулентности штаммов вируса мы применили методы филогенетического анализа. Структуры зондов, метод и данные по гибридизации различных штаммов вируса описаны в многочисленных работах последних лет Злобина, Шаманина, Леоновой. В анализе нами использованы опубликованные и не опубликованные данные, предоставленные Джиоевым, по гибридизации РНК штаммов вируса КЭ с 10 зондами, комплементарными РНК штамма КЭ Софъин и двумя зондами, дифференцирующими штаммы вируса второго и третьего генотипа. При отработке методики анализа мы первоначально рассматривали гибридизационные данные штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных в Приморском крае от больных с различными формами заболевания (Леонова, 1996). С этой целью положительную гибридизацию вирусной РНК с олигонуклеотидом обозначали 1, а отсутствие гибридизации обозначали 0. Спектр гибридизации каждого штамма вируса, таким образом, записывали в виде последовательности единиц и нулей длиной 10 знаков и полученную матрицу обрабатывали с помощью пакета программ TREECON как RFLP/AFLP/RAPD данные. Матрицу дистанций рассчитывали простым подсчетом (simple matching), а топологию деревьев рассчитывали методом neighbor-joining. На рис. 6 показано топологическое древо, отражающее генетическую гетерогенность штаммов КЭ и ее связь с вирулентностью вируса.
•345
2909 288 651 315
I Лазовка-2 ' Шейнин
— 178
478 243 212
336
{|
¿582 Ч 208
• Бабаева
472
Бабич
Астафьева
185
■О
С 183 "533 Чугурин
-253
Синолицып
Берчипский
Пищелкин
_I Приморье-3
I Мордовец . Дгаф 1 Сенц(
I Лазовка-3 — "«ЛЕСОПАРК-11
270
332
Приморье-4
1211
Негушкнн
10И0В [ОВ
Приморье-1 2701 -
155" "кребач арунов
ОфЬИН
Рис. 6. Топологическое древо, отражающее генетическую гетерогенность штаммов вируса КЭ, вызвавших различную тяжесть течения заболевания, и штаммов вируса, выделенных из клещей (подчеркнуты). Штаммы, выделенные от больных с очаговой формой инфекции, обозначены жирным шрифтом, от больных с лихорадочной формой - курсивом.
Видны две достоверно различающиеся группы штаммов: группа штаммов первого генотипа, в которую входит прототипный штамм Софъин, и группа штаммов вируса третьего генотипа с прототипным штаммом Jleco-парк-11. Имеется также группа штаммов, принадлежность которых к какому-либо генотипу этим методом не определяется. Такое распределение штаммов на группы коррелирует с вирулентностью вируса, что также видно на рисунке. Большинство штаммов, вызвавших тяжелые формы заболевания и смерть больных, сосредоточено в первой группе, а штаммы, вызвавшие инаппарантную форму инфекции, находятся во второй группе. Исключение составляет высоковирулентный штамм Шейнин, оказавшийся во второй группе штаммов. Штаммы вируса, вызвавшие лихорадочную форму заболевания, находятся в промежуточной группе и приграничных районах первой и второй групп. В анализ взяты также 9 штаммов вируса, выделенные от клещей (на рис.6 подчеркнуты), вирулентность которых не известна. Штамм 178 находится во второй группе и, вероятно, является слабовирулентным. Штамм 533 находится в первой группе, а его спектр гибридизации совпадает со штаммом 183, вызвавшим лихорадочную форму заболевания, на основании этого штамм 533 также можно считать слабовирулентным. Аналогично, штаммы 185 и 208 находятся в промежуточной группе штаммов и также как другие штаммы этой группы являются слабовирулентными.
Таким образом, предложенный метод позволяет не только отобразить гибридизационные события в удобной графической форме и разделить анализируемые штаммы на генотипы, но и позволяет предсказать ожидаемую вирулентность анализируемого штамма вируса.
Используя такой подход нами проанализирована гетерогенность популяции вируса КЭ в различных регионах России: Приморский край, Прибайкалье-Забайкалье, Средняя Сибирь, Западная Сибирь, Алтае-Саянская горная страна, Урал-Приуралье, Северо-запад-Центр России, Запад Рос-сии-Средняя Азия-Крым. В качестве примера на рис. 7 и рис. 8 приведены топологические деревья, отражающие гетерогенность региональных популяций вируса КЭ в Приморье и Прибайкалье-Забайкалье, и предполагаемую вирулентность вариантов вируса. Остальные топограммы не приводятся из экономии места. На рис. 7 и 8 анализируемые штаммы выделены курсивом, штаммы, вызвавшие очаговую форму, выделены жирным шрифтом, штаммы, вызвавшие лихорадочную форму - подчеркиванием, а штаммы вызвавшие инаппарантную форму - обычным шрифтом. На рис. 7 показаны результаты анализа 21 штамма вируса КЭ, выделенных из клещей в Приморском крае.
. Лазовка-11 I Лазовка-5 1 Талакан-4 I Талакан-2
I При.норье-4 ' Том ар и-Я!
I омари-
I Лазовка-3 Т ЛЕСОПАРК-1 ■ 332
■ Лазовка-1
270
£
183 331
Приморье-2
253
Синолицын
651 315 288
"211
336
345
4]
2-13 ~> 11 478
178
139
582
а
овка-2
еннин
Талакан-5
132
Томари-3 Талакан-1 Хехцир-1
Цегушкин
довец
гашонов
ендов
ия-1
Шчари-82
кребач шорье-1 йарунов Софьин
Рис. 7. Топологическое древо, показывающее генетическое разнообразие штаммов вируса КЭ, выделенных на территории Амуро-Сахалинской горной страны.
Девять штаммов (43 %) попали в группу Софьин-подобных высоковирулентных штаммов первого генотипа, 9 штаммов объединены в группу с вирусами третьего генотипа, вызывающими бессимптомное течение заболевания (прототипный штамм Лесопарк-11), и три штамма {139, Талакан-5 и Лазовка-2) находятся в промежуточной группе, куда вошли как высоковирулентный штамм Шейнин, так и менее вирулентные штаммы. Не обнаружено штаммов, гибридизующихся с зондами 11 и 12, определяющими второй (центрально-европейский) генотип вируса. Таким образом, на территории Приморского края циркулируют в почти равных количествах вирусы двух генотипов - высоковирулентные вирусы первого генотипа и маловирулентные вирусы третьего генотипа. Такое распределение вирусов объясняет наблюдаемую заболеваемость клещевым энцефалитом в Приморском крае (Леонова, 1997).
На рис. 8 показано распределение штаммов вируса КЭ, выделенных из клещей в Прибайкалье-Забайкалье.
Из 40 проанализированных штаммов только два штамма (Байкал-3 и Байкал-6), эквивалентных по гибридизации высоковирулентному штамму Софьин и штамм Горный-5, находящийся в субкластере со штаммом Чугу-рин, можно отнести к высоковирулентным штаммам, остальные штаммы, вероятно, являются штаммами генотипа III. Последнее предположение о принадлежности маловирулентных штаммов к вирусу третьего (или второго) генотипа, строго говоря, не доказано и, возможно, не всегда верно. Наиболее вероятно, тем не менее, что штаммы, находящиеся в одном кластере со штаммом Лесопарк-11, являются штаммами третьего (или второго) генотипа, а штаммами с неясной классификацией являются изоляты, занимающие промежуточное положение между двумя кластерами. Это штаммы Байкал-1, Горный-3, Горный-7, Горный-8 и Горный-9, для точной классификации которых, возможно, нужен другой, более широкий набор зондов для гибридизации.
Вновь, как и на предыдущей топограмме (рис. 7), среди штаммов третьего генотипа выделяется группа штаммов (Баргузин-1, Баргузин-5), близких высоковирулентному штамму Шейнин. Штамм 48-76 гибридизуется с зондами 11 и 12 и поэтому является штаммом генотипа II. Таким образом, штаммы центрально-европейского генотипа могут проникать от западных регионов страны вплоть до Иркутской области. Количество потенциальных высоковирулентных штаммов в Прибайкалье-Забайкалье в 4-5 раз ниже, чем в Приморье, и этот факт подтверждается существено более легким течением заболевания в Иркутской области (Саламатова, 1999).
Баргузин-14
Тюг4
Баргузин-4
48-76 ,\'сис!
%аикал-7 Чайкал-5 ., баргузин-и ргузин-3 ргузин-2
>-90
— Ьаргузин-5
■ Байкал-! и-З
Берчииский
Рис. 8. Топологическое древо, показывающее генетическое разнообразие штаммов вируса КЭ, выделенных на территории Прибайкалья-Забайкалья.
Распределение штаммов вируса КЭ, выделенных от клещей в районе Средней Сибири, несколько отличается от распределения в Прибайкалье-Забайкалье. Во-первых, кластер штаммов, обладающих высокой вирулентностью, разделился на две ветви, в одну из котрых, вместе со штаммом Софьин, попали три штамма Красный Яр-3, Красный Яр-8 и Красный Яр-9 (15 %). Во вторую группу вместе с высоковирулентными штаммами Пищелкин и Чугурин включен штамм Красный Яр-11. По всей видимости, этот штамм можно также считать высоковирулентным. К высоковирулентным штаммам можно также отнести штамм 178-79, у которого спект гибридизации совпадает со штаммом Шейнин. Остальные штаммы однозначно попадают в группу маловирулентных штаммов, аналогичных штамму Лесопарк-11. Штаммы вируса генотипа II не обнаружены.
В районе Западной Сибири два штамма Лесопарк-5 и Тенис-9 гибридизу-ются с зондами так же, как прототипный штамм Софьин, поэтому их однозначно можно отнести к высоковирулентным штаммам. Остальные 17 штаммов находятся в кластере маловирулентных штаммов. В отличие от предыдущих регионов, в Западной Сибири не обнаружено штаммов, относящихся к промежуточной группе, в том числе нет штаммов, аналогичных штамму Шейнин. Но обнаружен один штамм вируса центрально-европейского генотипа, (генотипа И) - штамм Лесопарк-2.
Необычное распределение штаммов обнаружено в районе Алтае-Саянс-кой горной страны (классификация Злобина В.И., 1996). В связи с тем, что генетический состав популяции вируса КЭ на Алтае существенно отличается от состава популяции в Красноярском крае, целесообразно рассмотреть их особенности раздельно.
Из 11 штаммов вируса КЭ, выделенных из клещей Красноярского края, только 1 штамм (Енисей-2) гибридизуется так же, как штамм Софьин, остальные штаммы, по-видимому, являются штаммами генотипа III. В Красноярском крае отсутствуют штаммы генотипа II и штаммы промежуточной группы. В противоположность этому, в Алтайском крае из 8 проанализированных штаммов пять (62 %) являются штаммами генотипа II, причем четыре из них (Змеиногорск-1, Змеиногорск-З, Змеино-горск-5 и Змеиногорск-9) находятся в одной группе с высоковирулентным штаммом Шейнин. Таким образом, распределение генотипов вируса в Красноярском крае аналогично распределению в других районах Сибири, а генетическое разнообразие вируса КЭ на Алтае уникально. Впервые выявлено аномально высокое содержание на Алтае штаммов вируса центрально-европейского генотипа. Отсутствие в анализируемой популяции вирусов, близких высоковирулентным штаммам первого генотипа, и, в то же время, наличие тяжелых (очаговых) форм заболевания, которые составляли от 3.9 % в 1998 г. до 11.4 % в 1992 г. (Назарен-ко, 2000), косвенно указывает на то, что варианты вируса, близкород-
ственные штамму Шейнин, могут быть ответственными за наличие тяжелых форм заболевания на Алтае.
Другое распределение штаммов отмечено в регионе Урал-Приуралье. Из 18 штаммов, выделенных на Урале, только 2 штамма Добрянка-2 и 4072 относятся к высоковирулентным штаммам. Остальные штаммы находятся в одном кластере с маловирулентными штаммами. Но среди этой группы имеется субкластер, включающий высоковирулентный штамм Шейнин и 5 других штаммов, в том числе 4 штамма вируса второго генотипа. В Приуралье не обнаружено вариантов вируса первого генотипа, найдено 2 штамма вируса (14 %) второго генотипа. Этот факт указывает на то, что относительное количество штаммов вируса КЭ второго генотипа не уменьшается равномерно с Запада на Восток, а имеет максимумы в горных районах Урала и Алтая
Типичная картина генетической изменчивости вируса КЭ обнаружена в регионе Северо-запад-Центр. Выделяются две основные группы штаммов, в одну из которых входят высоковирулентные штаммы, в другую -маловирулентные. Имеется также промежуточная группа штаммов. Не найдено ни штаммов второго генотипа, ни штаммов, близких штамму Шейнин, а количество штаммов первого генотипа составляет 19 %.
В регионе Запад России - Средняя Азия - Крым присутствуют штаммы вируса (Ак-Сул, Преголя-8 н ДМ), близкородственные высоковирулентному штамму Софъин первого генотипа. Самое удивительное, что из 28 проанализированных штаммов только три штамма {Крът-4, Преголя и 256) или только 10 %, являются штаммами второго генотипа. Таким образом, полностью опровергается бытующее мнение о постепенном уменьшении количества центрально-европейских штаммов с Запада на Восток, так как максимальное количество штаммов центрально-европейского (западного) генотипа обнаружено на Алтае (62 %), в то время как в истинно западных районах России обнаружено два штамма второго генотипа из одиннадцати проанализированных штаммов. Таким образом, не существует плавного клинального уменьшения количества штаммов по мере удаления от их основного места обитания.
На всей территории России превалируют варианты вируса КЭ третьего генотипа. Основное количество штаммов вируса второго генотипа обнаружено до Урала, но единичные штаммы найдены в Прибайкалье-Забайкалье. Исключение составляет Алтай, где количество штаммов генотипа II достигает 62 %. Штаммы вируса первого генотипа не найдены в Крыму, Приуралье и на Алтае, в других районах они встречаются в количестве 5-20 %, а в Приморье их количество достигает 43 %.
Также не обнаружено тесной связи между вторым генотипом вируса КЭ и видом клеща-переносчика, как это предполагал Вотяков. Только в
трех случаях штаммы вируса второго генотипа выделены от клещей I. ricinus, а в 16 случаях выделены от клещей I. persulcatus.
Возможно, что мозаичное распределение различных генетических вариантов обусловлено доминирующим типом прокормителей клещей. Ранее Чу-нихиным и др. было показано, что существуют "виды-амплифайеры" и "виды-супрессоры" процесса циркуляции вируса в очаге (Чунихин, 1981). Так, они отнесли к видам "ускорителям" зеленоядных полевок, а к "замедлителям" некоторых семеноядных грызунов. Леоновой Г.Н. показано, что в условиях Южно-Сихотэ-Алиньского региона полевая мышь способствует циркуляции штаммов вируса с низкой патогенной активностью, восточно-азиатская мышь поддерживает только вирусы высокой патогенной активности, а красно-серая полевка является хорошим донором для обеих групп штаммов. Известно также, что такой широко распространенный вид грызунов, как красная полевка, в европейских очагах ведет себя как "замедлитель", а в азиатских очагах как "ускоритель".
Мы сравнили генетическую гетерогенность популяции вируса КЭ в Прибайкалье-Забайкалье в зависимости от объекта, из которого выделен вирус. На рис. 9 показано рапределение штаммов вируса, выделенных от мелких животных.
При сранении с рис. 8 , на котором показано распределение штаммов вируса, выделенных из клещей в том же районе, видно, что популяция вируса, циркулирующая в теплокровных животных, существенно обеднена маловирулентными вирусами третьего генотипа. Относительное количество штаммов вируса КЭ первого генотипа выросло почти в 4 раза, с 8 до 31 %, что указывает на то, что часть вариантов вируса второго и третьего генотипов, циркулирующих в клещах, элиминируется из популяции при переходе вируса к теплокровным животным. Причем в основном происходит элиминирование вариантов вируса третьего генотипа, так как количество штаммов вируса генотипа II выросло до 27 % .
В кластер с высоковирулентными штаммами вируса генотипа I вошли 9 штаммов. Из них от красной полевки выделено 5 штаммов, что составляет 55 % от общего количества вирулентных штаммов, от красно-серой полевки выделено два штамма (22 %) и один штамм выделен от лесной мыши. Один штамм вируса выделен из коровьего молока. Все вирусы КЭ, выделенные от других многочисленных животных вошли в другую группу, содержащую маловирулентные вирусы. Штаммы вирусов, выделенные от красной полевки, в 83 % случаев оказались штаммами генотипа I, а из шести штаммов вируса КЭ, выделенных от красно-серой полевки, только два штамма (33 %) оказались в одной группе с высоковирулентными штаммами, а четыре штамма в группе с маловирулентными штаммами. Из приведенных данных ясно видно, что в Восточной Сибири красная полевка обогащает популяцию вируса высоковирулентными вирусами первого генотипа.
с
с
Марунов
Софьин
763-87
713-»/ шкреоач
, /3 .
| ¿85-81
Агафонов Сенцов некий
740-87 "ПР7Т 7&Ц-87 749-87 '
■С!
Чй™
533
I Мордовец • Пищелкин
Красная полевка Красная полевка
Красная полевка Красно-серая полевка Красно-серая полевка Коровье молоко Лесная мышь Красная полевка
ин
•253
ч
И8. Ба
' Синолнцын
абаева 210-79 552
■336
Кровь больного
I ¿¿о
* I I Бабич Ч Астафьева
1135.
Негушкнн
т
Г*
478 243 212 651 315 288
-Шеи
еинин
•345
178
372-81
<5
118-71 215-81 898-84
¿и-и> 134-71'
886-84 711-84"
■ 740-84"
ГУР76
215-79
—352-81
■270
Суслик
Полевка стадная Красная полевка Полевка стадная Суслик
--Утка серая
Красно-серая полевка Красно-серая полевка Красно-серая полевка — 332
■ЛЕСОПАРК
348-81
¥
4-82
4=5
Даурский хомячок — Восточная полевка Полевка экономка 429-82 Рябчик 351-81
_____ Домовая мышь
560-86 ~ Полевка стадная
765-87 Лесная мышь 367-81 -
ц
. Азиатская лесная мыть Утка серая
Рис. 9. Гетерогенность штаммов вируса КЭ, выделенных от теплокровных животных в Прибайкалье-Забайкалье.
Таким образом, ни знание о присутствии вируса КЭ в клещах, ни количественный состав животных в очаге при данном уровне знаний не могут дать возможности предсказать уровень угрозы здоровью населения, и требуется разработка новых подходов, способных быстро оценить эпидемиологическую ситуацию на конкретной территории и прогноз течения заболевания. Предложенный нами метод анализа дает такую возможность.
На рис. 10 представлена схема, иллюстрирующая генетическое разнообразие 265 штаммов КЭ, выделенных в России. Подобное представление результатов гибридизации показывает не только генетическую гетерогенность вируса КЭ в России и распределение штаммов по генотипам, но и предсказывает возможную вирулентность штаммов. Несомненно, что для большей точности анализа, особенно для штаммов, отнесенных в промежуточную группу, необходимо проводить гибридизацию с большим количеством зондов, в том числе на варианты вируса второго и третьего генотипов. Тем не менее видно, что штаммы вируса разделились на две неравные группы, меньшая из них включает штаммы вируса КЭ, близкие или идентичные штамму Софьии, т.е. штаммы первого генотипа, а основная группа штаммов включает варианты третьего и второго генотипов (всего обнаружено 34 штамма вируса КЭ второго генотипа).
На рис. 10 видно, что обе группы являются очень гетерогенными, имеется множество штаммов, присутствующих в единственном экземпляре, и в то же время имеются группы различного размера, вплоть до 38 штаммов, у которых гибридизационный спектр штаммов совпадает. Достоверность такого распределения штаммов КЭ на группы подтверждается тем, что позиции штаммов, генотип которых определен независимым способом, соответствуют позиции на топологическом древе. Действительно, в группу со штаммами, близкими штамму Софъин, не попало ни одного штамма второго генотипа, которые легко дифференцируются от штаммов третьего генотипа гибридизацией со специфичными зондами 11 и 12. Аналогично, штаммы Алебастрово, Абсеттаров и 272 являются штаммами второго генотипа как по результатам гибридизации, так и по структуре гена Е. Также показано, что штамм Хехцир-1, как по результатам гибридизации, так и на основании определения первичной структуры фрагмента гена Е, является штаммом вируса КЭ первого генотипа. Таким образом, топологическое древо, показанное на рис. 10, достаточно достоверно и отражает действительное генетическое разнообразие штаммов КЭ.
'ис. 10. Схема, иллюстрирующая генетическое разнообразие 265 штаммов вируса КЭ, выделенных на территории России.
Часть общего топологического древа, содержащая группу штаммов первого генотипа, включая высоковирулентный штамм Софьин, показана отдельно на рис. 11.
и
Рис. 11. Фрагмент общей схемы гетерогенности вируса КЭ, включающий высоковирулентные штаммы первого генотипа.
Видно, что эта группа гетерогенна, и кроме 19 штаммов, которые, также <ак штамм Софьин, гибридизуются со всеми зондами, имеются штаммы, которые гибридизуются с частью зондов. В эту группу вошли все штаммы, выз-завшие очаговую форму заболевания и штаммы, вызвавшие лихорадочную }>орму: Берчинский, А стафъева, Бабич, 185,208 и 533. Имеются также два штампа (253 и 582), вызвавшие инаппарантную форму, однако следует заметить, îto эти штаммы не находятся в основном кластере, а попадают в промежуточную группу между основными кластерами.
Вторая группа, которая также четко выделяется на рис. 10 названа груп-га "Шейнин" по наименованию высоковирулентного штамма, входящего в эту группу. Увеличенный фрагмент рис. 10, включающий группу "Шейнин", приведен на рис. 12.
Видно, что эта группа достоверно отличается от большой группы штампов, включающей прототипный штамм третьего генотипа ЛЕСОПАРК {Лесопарк-! 1), образуя отдельный кластер. В свою очередь, этот кластер разделяется на два субкластера, в одном из которых находится высоковирулентный итамм вируса КЭ Шейнин. Другой особенностью этого кластера является вы-:окое содержание (50 %) в нем вирусов второго генотипа. Интересно отменить также, что штаммы вируса 886-84 и 178-79, таксономическое положение <оторых нам не удалось установить при анализе первичных структур фрагмента гена Е, также оказались в группе штаммов, близких штамму Шейнин. Это факт еще раз указывает, что в этой группе штаммов вируса КЭ собраны it обычные варианты вируса и требуется ее детальное изучение в первую очередь. Весьма вероятно, что вирусы, находящиеся в этом кластере, также как и итамм "Шейнин", являются высоковирулентными. Исходя из этой гипотезы, «ожно предположить, что тяжелые случаи заболевания клещевым энцефалитом на территории России могут быть обусловлены не только штаммами ге-готипа I, но и определенными вариантами вирусов генотипов II и III. Как уже упоминалось ранее, на Алтае и в Приуралье не обнаружено вариантов вируса гервого генотипа, однако регистрируются тяжелые случаи заболевания кле-девым энцефалитом. Таким образом, тяжелые случаи заболевания клещевым шцефалитом могут вызываться некоторыми вариантами вируса КЭ второго г третьего генотипов, возможно, близких штамму "Шейнин".
Обшее число вариантов вируса КЭ, отнесенных нами к высоковирулент--1ым штаммам, согласуется с данными по тяжести заболевания энцефалитом в различных регионах. Это дает нам возможность поиска корреляции данных ■ибридизации с конкретным зондом и вирулентностью вируса. Не смотря на го, что используемым нами набором зондов анализируется не весь геном, и в шализ не попадают гены некоторых больших белков, таких как NS3 и NS5, тоиск такой корреляции является перспективным. При анализе полученных раннее Леоновой и др. данных по гибридизации штаммов вируса с известной шрулентностью, выделенных в Приморском крае видно отсутствие корреля-
ции между вирулентностью и степенью гибридизации с зондами 2 (ргеМ), 4 (М), 5 (Е) и 6 (NS1) (данные в реферате не приведены). Отсутствие гибридизации с зондами 3 (ргеМ) и 10 (NS4b) коррелирует с низкой вирулентностью штаммов вируса, однако среди высоковирулентных штаммов также имеется ряд вариантов (6/11 для зонда 3 и 4/11 для зонда 10), РНК которых не гибри-дизуется с этими зондами.
215-81 (N) 48-76 (N) 134-71 (N1 118-71 (N)
_ 898-84 (N)
272-75 (N)
---Д-^Л!
___.886-84
I--I 711-84
___ 740-84
I I Залесная
1—I I Новгород-2 (N) I Иж-9 (N)
I—— Coifyp
Нетва-1 (N)
_ Вологда-2
Днвья-2 Баргузин-4 — Столбы-3
I Красный Яр-2 1 Иж-5
I Калуга-! (N) Стара Русса Талакан-5
1Луковка-3 Баргузнн-1 Алебястрово-2 (N)
Змеиное орск-3 (N1
__Шейнин
- - 178-79
К.-Т»ш-1 (N) Лаювка-2
- -|-Себеж
' \1М'сиа|иин\)
__Н.ИальниымМ
Адебапрови I (М I— Крым-З 256 (N)
Змемногорь'к-Ч (N) Змеиногорск(V)
Конкуль-З
Усень-4
Лаювка-3
327-89
317-89
Кордон-2
- О-К'алуш-2
llviym-2
369-89
Тенис-Ю
Лесопарк-II
Лесопарк-6
ЛЕСОПАРК
_ _ _ _ _Sofjin
Рис. 12. Фрагмент общей схемы гетерогенности вируса КЭ, включающий кластер группы "Шейнин" вирусов КЭ второго и третьего генотипов.
Гибридизация с зондами 1,7,8 (гены С и NS1 ) не всегда коррелирует с высо-сой патогенностью вируса, так с зондом 1 (С) не гибридизуется высоковирулент-1ый штамм Шейнин, но гибридизуются авирулентные штаммы 183, 253 и т.д. Наиболее четкая корреляция наблюдается между вирулентностью и гибридиза-шей с зондом 9, комплементарным участку гена NS2b. Отсутствие гибридизации ; этим зондом однозначно указывает на низкую вирулентность штамма. Интересно отметить, что даже штаммы, вызвавшие течение заболевания средней тя-кести, такие как Берчинский, Синолицин и другие, гибридизуются с этим зондом. 1о-видимому, структура гена NS2b в этом районе важна для проявления виру-1ентности, а менее тяжелое течение заболевания иод действием последних штампов может объясняться реакцией макроорганизма на инфекцию, либо измененной в других участках генома вируса, которые также могут уменьшать вирулентность вируса. Вероятно, оба эти явления существуют в реальности, так штамм Черчинский, вызвавший лихорадочную форму заболевания, также как высокови-)улентный штамм Чугурнн, имеет мутации в месте гибридизации с зондами на ены NS1 и NS4b, более того, штамм Чугурин имеет дополнительную мутацию в районе ргМ. То есть в данном случае большее влияние оказала реакция макроор-~анизма на ход течения заболевания. Штамм Синолицин имеет дополнительную мутацию в другом участке гена NS 1, которая могла повлиять на уменьшение вирулентности вируса КЭ. Аналогичные данные получены при анализе штаммов руппы "Шейнин". Следует отметить, что ранее в литературе уже отмечалось, 1то изменния в структре гена NS2b влияют на вирулентность вируса, однако эта работа не получила дальнейшего развития (Ni&Barret, 1996). Очевидно, что не-рбходимы дополнительные эксперименты по определению структуры белка NS2b, :го функции и связи с вирулентностью вируса.
5. Синтез олигонуклеотидов
Проведение работ по молекулярно-биологической идентификации вирусов невозможно без большого количества олигонуклеотидов, которые дол-киы быть доступны в любое время при относительно низкой цене. В после-шие 15 лет, синтез олигонуклеотидов осуществляется на автоматических син-гезаторах двумя основными методами, фосфорамидным (phosphoramidite) и Тфосфонатным (H-phosphonate, hydrogen phosphonate), предложенными norm одновременно (Caruthers, 1980,1987; Froehler, 1986).
Наиболее часто употребляется фосфорамидный метод, при котором вредя, требуемое для добавления одного звена, составляет около 4 минут. При :интезе олигонуклеотидов Н-фосфонатным методом время реакции меньше шагодаря отсутствию стадии блокирования непрореагировавших групп и :тадии окисления межнуклеотндного фосфора. Конденсация мономера с нук-[еозидом, закрепленным на твердом носителе, происходит под действием из->ытка хлорангидридов жирных кислот, таких как триметилуксусная (пивале-1ая) или адамантанкарбоновая.
Оба метода имеют свои недостатки. При амидофосфитном методе используемый мономер не стабилен и довольно быстро разлагается при хранении с расщеплением амидной связи. Эта проблема достаточно просто решается в технологически развитых странах, когда используют свежеполучен-ные мономеры промышленного производства. В нашей стране это не реально, поэтому предпочтительнее Н-фосфонатный метод синтеза, так как используемые мономеры стабильны при комнатной температуре в течение нескольких лет. Однако при синтезе олигонуклеотидов этим методом по схеме, предложенной ранее (РгоеЫег, 1986), не стабильным оказывается сам процесс синтеза.
Как мы выяснили, нестабильность процесса синтеза связана с механизмом активации мономерного звена под действием хлорангидрида и побочными процессами, протекающими одновременно. Под действием хлорангидрида из Н-фосфоната быстро получается смешанный ангидрид фосфоновой и алифатической кислот, который затем "медленно" реагирует с гидроксиль-ной группой нуклеозида с образованием фосфидиэфирной связи. Одновременно возможно частичное блокирование гидроксильной группы наращиваемой цепи, что препятствует образованию фосфидиэфирной связи, и, параллельно, происходит образование смешанного ангидрида между межнук-леотидым атомом фосфора и хлорангидридом алифатической кислоты, служащим конденсирующим агентом. Выход олигонуклеотида, таким образом, уменьшается благодаря частичному блокированию растущей цепи избытком конденсирующего агента и распаду олигонуклеотидной цепи, содержащей по межнуклеотидному атому фосфора остаток пивалевой кислоты в виде смешанного ангидрида. Замена пивалевой кислоты на стерически затрудненную адамантанкарбоновую кислоту не принесла ожидаемых результатов (Тапака, 1987).
Нами было отмечено, что при применении конденсирующего агента в количестве, эквивалентном количеству Н-фосфоната, не происходит блокирования З'-гидроксильной группы наращиваемой олигонуклеотидной цепи, что повышает выход целевого олигонуклеотида. Более того, если смешение мономера и конденсирующего агента производить непосредственно в колонке с носителем, то реакция конденсации становится стабильной и воспроизводимой и протекает с существенно большей скоростью.
Учитывая это, нами сконструирован и изготовлен автоматический синтезатор олигонуклеотидов, обеспечивающий смешение мономера и конденсирующего агента непосредственно на колонке с носителем растущей цепи олигонуклеотида. Метод синтеза и устройство для его осуществления, защищены авторским свидетельством (Кумарев, Беликов и др.,1992).
Синтезатор состоит из 8 электромагнитных клапанов, управляемых компьютером и 8 реакционных сосудов с реагентами, находящимися под давле-
шем гелия (1.2 атмосферы). Для обеспечения постоянной подачи на носи-ель свежих порций смеси мономера с конденсирующим агентом программа интеза составлена таким образом, чтобы одновременно подавать на колонку »авные количества и концентрации мономера и конденсирующего агента. 1ричем, количество этой смеси лишь немного превышает объем колонки, а 1ремя подачи смеси составляет 0.1 секунды. После подачи смеси следует паза в течение одной секунды, в это время происходит реакция конденсации. Саждый цикл конденсации проводится со свежей порцией смеси мономер-:онденсирующий агент. Объем реакционной смеси составляет 13-15 мкл.
Для повышения выхода реакции конденсации цикл подача смеси/ожидание повторяется многократно, обычно 25-30 раз. Таким образом, в про-рамму синтеза, на каждой стадии добавления одного мономерного звена, ходят следующие стадии:
удаление триметилтритильной защитной группы - 4 сек, промывка колонки ацетонитрилом - 2 сек, 25-30 циклов [подача смеси/ожидание] (25-30 сек) и промывка колонки от избытка мономеров - 2 сек.
Цикл добавления одного звена в сумме составляет не более 40 сек, что ;елает этот метод синтеза и синтезатор самыми быстрыми, из имеющихся настоящее время устройств и методов синтеза олигонуклеотидов.
По окончанию синтеза олигонуклеотида, который занимает около 15 шнут для синтеза обычных праймеров и зондов, аналог олигонуклеотида, [меющий межнуклеотидный трехвалентный атом фосфора окисляют сме-ью четыреххлористого углерода, триэтиламина и воды в пиридине в тече-ие 5-7 минут. По завершению окисления, олигонуклеотид, связанный с осителем, и имеющий временные защитные группы по гетероцикличес-им основаниям удаляется с носителя концентрированным раствором ам-[иака. При этом удаляются защитные группы с гетероциклических осно-аний. Целевой олигонуклеотид далее подвергается очистке различными пособами, наиболее быстрым и надежным методом очистки является элек-рофорез в акриламидном геле. Решающее преимущество этого способа чистки заключается в том, что целевой олигонуклеотид не содержит сле-ов силикатов, которые могут присутствовать в образцах, подвергнутых чистке на кремниевых сорбентах. Этот фактор особенно важен для оли-онуклеотидов, служащих праймерами в ПЦР, в которой даже следы сили-атов ингибируют реакцию полимеризации.
Таким образом, предложенный нами способ и устройство для автома-ического синтеза олигонуклеотидов позволяют в кратчайшие сроки син-езировать широкий спектр зондов и праймеров для идентификации орга-измов и является основой для проведения любых молекулярно-биологи-еских работ.
выводы
1. Впервые определена нуклеотидная последовательность генов 14, Р и Н вируса байкальской нерпы, что позволило провести сравнительный анализ с аналогичными структурами других морбилливирусов.
2. Эпизоотия, вызвавшая массовую гибель байкальской нерпы в 1988 году, обусловлена морбилливирусом, родственным вирусу чумы плотоядных (СБУ).
3. Показано, что морбилливирус, вызвавший эпизоотию байкальской нерпы, наиболее близок морбилливирусу собак и является его новым вариантом.
4. Установлено, что варианты вакцинных штаммов вируса не были пред-ковыми формами вируса байкальской нерпы.
5. Доказано, что морбилливирус, вызвавший эпизоотию 1989 года у обыкновенных и серых тюленей в Северной Европе, не является ближайшим родственником вируса, вызвавшего массовую гибель байкальской нерпы, а вирус байкальской нерпы, не был причиной этой эпизоотии.
6. Показана в динамике на иротяжениии 12 лет циркуляция морбилли-вируса байкальской нерпы и формирование, по крайней мере, двух вариантов морбилливируса различной вирулентности.
7. Определена первичная структура фрагмента гена белка оболочки 29 штаммов вируса КЭ, установлены их таксономическое положение и принадлежность к трем различным генетическим вариантам.
8. На территории России отмечен высокий уровень генетической гетерогенности циркулирующих штаммов вируса клещевого энцефалита с абсолютным доминированием штаммов третьего генотипа.
9. Установлено, что штаммы вируса КЭ первого генотипа доминируют на Дальнем Востоке, но, в тоже время, в разной степени встречаются во всех исследованных регионах от Сахалина до Калининграда, причем их количество мозаично варьирует по территориям.
10. Показано, что штаммы вируса КЭ второго (центрально-европейского) генотипа встречаются от западных областей России до Урала с преобладанием их на Алтае.
11. Впервые показано, что среди вариантов вируса КЭ второго и третьего генотипов могут встречаться высоковирулентные штаммы, аналогичные штамму Шейнин, выделенному в Приморском крае от больного, умершего от КЭ.
Список основных работ, опубликованных по теме диссертации
1. Беликов С.И., Горбунов Ю.А., Попов С.Г. Способ удаления тритиль-ых защитных групп с производных нуклеозидов, нуклеотидов и олигонукле-тидов // Авторское свидетельство № 828671. - 1981. - 5 с.
2. Беликов С.И., Рыбак В.К. Способ получения 4-Ы-бензоил-2-дезокси итидина // Авторское свидетельство № 1266164. - 1986. - 3 с.
3. Беликов С.И., Рыбак В.К., Озолс А. М., Стопникова М.Н., Зиемелис :.М. 5'-0-тритолилметильные производные 2'-дезокси нуклеозидов в каче-гве исходных веществ в синтезе олигонуклеотидов. // Авторское свидетель-гво № 1270153.- 1986.-3 с.
4. Абрамова JI.M., Беликов С.И., Белова Н.В., Чекавая Н.И. Способ поучения олиготимидилатного производного целлюлозы // Авторское свиде-ельство№ 1438189. - 1988.-4 с.
5. Grachev М.А., Kumarev V.P., Mamaev L.V., Zorin V.L., Baranova L.V., )enikina N.N., Belikov S.I., Petrov E.A., Kolesnik V.S., Kolesnik R.S., Dorofeev r.M., Beim A.M., Kudelin V.N., Nagieva F.G. Sidorov V.N. Distemper virus in aikal seals // Nature. - 1989. - V. 338. - P. 209.
6. Кумарев В.П., Беликов С.И., Кобзев В.Ф., Кузнеделов К.Д., Баранова [.В., Средин Ю.Г. Способ синтеза олиго(поли)нуклеотидов и устройство для го осуществления//Авторское свидетельство № 1773916,- 1992.- 11 с.
7. Мамаев Л.В., Беликов С.И., Баранова Л.В., Деникина Н.Н., Зорин В.Л., Сидоров В.П., Кумарев В.П. Обнаружение морбилливирусных РНК в тканях авших нерп / Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы // Наука. -992.-С. 40-42.
8. Мамаев Л.В., Беликов С.И., Деникина Н.Н. Сходство морбилливиру-1 байкальских тюленей с живой вакциной против чумы норок/ Вспышка чумы лотоядных у байкальской нерпы // Наука. - 1992. - С. 62-66.
9. Mamaev L.V., Denikina N.N., Belikov S.I., Volchkov V.E., Visser I.K.G., leming M., Kai C., Harder Т., Liess В., Osterhaus A.D.M.E., Barrett T. haracterisation of morbillivirus isolated from Baikal seals (Phoca sibirica) // iternational symposium on Morbillivirus Infections, Hannover veterinary School, 2-13 June 1994.
10. Mamaev L.V., DenikinaN.N., Belikov S.I., Volchkov V.E., Visser I.K.G., leming M., Kai C., Harder Т., Liess В., Osterhaus A.D.M.E., Barrett T. haracterisation of morbillivirus isolated from Baikal seals (Phoca sibirica) // eterinary Microbiology. - 1995. - V. 44. - P. 251-259.
11. Mamaev L.V., Visser I.K.G., Belikov S.I., Denikina N.N., Harder Т., roatley L., Rima В., Edginton В., Osterhaus A.D.M.E., Barrett T. Canine distemper irus in Lake Baikal seals (Phoca sibirica) // The Veterinary Record. -1996. - V. 38. - P. 437-439.
12. Haas L.,Martens W., Greiser-Wilke I., Mamaev L., Butina Т., Belikov S.I., Maack D., Barrett T. Analysis of the haemagglutinin gene of current wild-type canine distemper virus isolates from Germany // Virus Reseach. - 1997. - V. 48. -P. 165-171.
13. Огарков О.Б., Камалтынов P.M., Беликов С.И., Щербаков Д.Ю. Анализ филогенетических взаимоотношений байкальских эндемичных амфмпод (Crustacea, Amphipoda) на основании сравнения нуклеотидных последовательностей участка митохондриального гена Ш субъединицы цитохромоксидазы // Молекулярная биология. - 1997. -Т. 31. - С.32-37.
14. Злобин В.И., Мамаев JI.B., БутинаТ.И., Беликов С.И., Демина Т.В., Горин 0.3., Джиоев Ю.П., Козлова И.В., Верхозина М.М., Адельшин Р.В., Крамарская Н.В. Генотипирование вируса клещевого энцефалита на основе гомологии фрагмента гена, кодирующего белок оболочки Е // Научная конференция "проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера. - Новосибирск, 1998. - С.40-41.
15. Беликов С.И.. БутинаТ.В.,ДеникинаН.Н.,Мамев Л.В.. Петров У.Ф. Морбилливирус, вызвавший эпизоотию в 1987 г., продолжает циркулировать в популяции байкальской нерпы // Сибирский экологический журнал. - 1999. -Т. 6.-С. 663-666.
16. Belikov S.I., Digas S.E., Khasnatinov М.А. Genetic diversity of tick-borne pathogens in the Baikal region // First International symposium "Biodiversity of the fauna of North Eurasia". - Novosibirsk, 21-26 Aug. 2000. - V.3. - P. 223- 225.
17. Dzhioev Y.P., Zlobin V.I., Adelshin R. V., Belikov S.I. The degree of genetic diversity of tick-borne encephalitis virus population in the Asian part of Russia // First International symposium of "Biodiversity of the fauna of North Eurasia". -Novosibirsk, 21-26 Aug. 2000. - V.3. - P. 241-243.
18. Zlobin V.I., Demina T.V., Dzioev Y.P., Verkhozina M.M., Kozlova I.V., Gorin O.Z., Voronko I.V., Adelsin R.V., Butina T.V., Belikov S.I. Determination of genetic variability of a tick-borne encephalitis virus on the teritory of Russia // First International symposium "Biodiversity of the fauna of North Eurasia". -Novosibirsk, 21-26 Aug. 2000. - V.3. - P. 304-306.
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Беликов, Сергей Иванович
ВВЕДЕНИЕ . В
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
ГЛАВА 1. Таксономия вирусов.
ГЛАВА 2. Род Morbillivirus: организация генома, структурные белки, транскрипция и репликация
ГЛАВА 3. Род Flavivirus: организация генома, структурные белки и репликация флавивирусной РНК.
ГЛАВА 4. Методы молекулярной биологии, используемые для анализа нуклеотидной последовательности вирусного РНКгенома.
4.1. Получение кДНК на основе вирусной РНК.
4.2. Методы определения нуклеотидных последовательностей ДНК.
4.3. Методы построения филогенетических схем
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
5.1. Материалы.
5.2. Методы.
ГЛАВА 6. Идентификация неизвестного патогена, вызвавшего эпизоотию байкальской нерпы, методом гибридизации нуклеиновых кислот.
6.1. Выбор ол иго нуклеотидных зондов для обнаружения РНК вируса чумы плотоядных.
6.2. Гибридизация РНК из тканей нерпы, имеющей клиническую картину заболевания, характерную для вируса чумы плотоядных.
6.3. Сравнительная гибридизация РНК, выделенных от погибших животных и животных без клинических проявлений инфекции.
6.4. Оптимизация условий гибридизации, выбор эффективных зондов.
6.5. Оценка уровня зараженности популяции нерпы.
6.6. Выявление уровня гомологии между вакцинным штаммом
СБУ и вирусом байкальской нерпы.
ГЛАВА 7. Определение и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей морбилливирусов.
7.1. Определение и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов гена N изолята вируса от байкальской нерпы и вакцинных штаммов СЭУ.
7.2. Определение и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов гена Р вируса от байкальской нерпы, вакцинных штаммов СБУ и изолятов СБУ от животных.
7 3. Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей генов и белков Р, С и V.
7.4. Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей гена Н белка гемагглютинина.
7.5. Изучение структуры фрагмента гена Р изолятов вируса байкальской нерпы в течение 10-летнего периода от начала эпизоотии.
ГЛАВА 8. Молекулярно-генетическое изучение вируса КЭ, циркулирующего на территории России.
8.1. Определение структуры фрагмента гена Е.
8.2. Филогенетический анализ.
8.3. Анализ аминокислотной структуры фрагмента белка Е
ГЛАВА 9. Определение гетерогенности популяции вируса на территории России методом гибридизации.
9.1. Усовершенствование подходов к количественному анализу данных гибридизационных тестов.
9.2. Генетическая гетерогенность штаммов вируса, вызвавших заболевание различной тяжести у больных людей.
9.3. Сравнительный анализ гетерогенности региональных вирусных популяций.
9.4. Различия в генетических вариантах вируса КЭ, выделенного от клещей и животных в Прибайкалье-Забайкалье.
9.5. Поиск корреляции между вирулентностью штамма и данными его гибридизации с различными зондами.
ГЛАВА 10. Синтез олигонуклеотидов.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетические подходы к изучению РНК-содержащих вирусов на моделях морбилливируса байкальской нерпы и вируса клещевого энцефалита"
Актуальность проблемы. В последние годы на территории России, и на территории Иркутской области в частности, стремительно увеличивается заболеваемость населения, обусловленная РНК содержащими вирусами (вирус гепатита С, вирус иммунодефицита человека и вирус клещевого энцефалита). Эти РНК-содержащие вирусы обладают высокой скоростью изменчивости, что затрудняет использование для их диагностики и идентификации обычных методов иммуноанализа. Отсутствие знаний о штаммовых различиях вируса не позволяет на научной основе разрабатывать необходимые вакцинные и лекарственные препараты для борьбы с этими эпидемиологически опасными инфекциями.
РНК содержащий вирус явился также причиной вспышка в 1987-1988 годах на Байкале острого инфекционного заболевания у байкальских тюленей (Phoca sibirica Gmel., байкальская нерпа), которая привела к гибели более 6500 животных из общего числа 80-100 тысяч (Петров, 1992; Пронин, 1992). Несмотря на то, что вирус, вызвавший эпизоотию, не патогенен для человека, сам факт появления у него мутаций, которые привели к смене хозяина, является чрезвычайно опасным. Не исключено, что при попадании в новые экологические условия, вирус будет мутировать с существенно большей скоростью и, таким образом, существует возможность еще одной смены хозяина и появление вируса, патогенного для человека.
Ранее эпизоотии у байкальских тюленей не регистрировались. Клиническая картина болезни, патологические изменения органов и тканей животных и характер распространения заболевания указывали на то, что популяция байкальских тюленей подверглась воздействию инфекционного агента, вероятно, вируса чумы плотоядных (CDV - род Morbillivirus, семейство Paramyxovirus). Массовое заболевание байкальской нерпы стало первым зарегистрированным случаем морбилливирусной инфекции среди водных млекопитающих. До 1987 г. были описаны 4 вируса рода Morbillivirus: вирус кори (MV), патогенный для человека, вирус чумы крупного рогатого скота (RPV, риндерпест), вирус чумы мелких жвачных животных (PPRV) и вирус чумы плотоядных (CDV), поражающий в основном домашних собак и пушных зверей. Считалось, что каждый представитель рода морбилливирусов имеет свой круг хозяев (Barrett, 1991). Так, вирус чумы плотоядных может поражать представителей 5 из 7 семейств отряда хищных. Данных о восприимчивости к морбилливирусам не только байкальских тюленей, но и других представителей отряда ластоногих, не было.
Через полгода в 1988 г. вспышке аналогичной болезни подверглись популяции других ластоногих (Pinnipedia), а именно серых {Halichoerus gryphus) и обыкновенных (Phoca vitulina) тюленей в Балтийском и Северном морях (Osterhaus, 1988а). Позднее морбилливирусные инфекции были зарегистрированы в Средиземном море среди популяций морских свиней и дельфинов - представителей отряда китообразных {Cetáceo). За прошедшее десятилетие вирус чумы плотоядных продолжал менять своих хозяев и инфицировал не только морских млекопитающих, но и большое число других наземных животных, включая кошачьих и гиеновых, у которых ранее данная инфекция также не наблюдалась (Appel, 1994; Harder, 1995; Harder, 1996).
Молекулярно-биологическое изучение новых морбилливирусов, в том числе вируса байкальской нерпы и других вариантов вируса чумы плотоядных, представляет особый интерес, поскольку это не только расширяет существующие знания относительно разнообразия циркулирующих в природе вирусов, но и раскрывает некоторые возможные молекулярные механизмы неожиданной смены хозяина, обнаруженной практически одновременно в нескольких местах. Относительно низкий риск заражения исследователя этим вирусом делает его хорошей моделью для отработки методов исследования морбилливирусов, один из представителей которых, вирус кори, является патогенным для человека.
Вирус клещевого энцефалита, в отличие от морбилливируса' байкальской нерпы, известен давно. Вызываемый этим вирусом клещевой энцефалит является наиболее тяжелой и распространенной, природно-очаговой инфекцией на территории России. Несмотря на 60-летний опыт изучения и борьбы с этим заболеванием, разработкой и практическим применением нескольких поколений профилактических вакцин, заболеваемость КЭ в стране неуклонно растет. Особенно неблагоприятно ситуация складывается в азиатской части России. Например, заболеваемость клещевым энцефалитом в Иркутской области постоянно увеличивается, и выросла в 5 раз за последние 5 лет (Саламатова, 1999). В то же время существует проблема эффективности препаратов для вакцинации и экстренной профилактики, которая обусловлена высокой изменчивостью вируса и отсутствием знаний о штаммовом составе вируса, циркулирующего в настоящее время. До последнего времени считалось, что существуют два варианта вируса клещевого энцефалита, дальневосточный и центрально-европейский. Известно, что дальневосточный вариант КЭ протекает чрезвычайно тяжело и обусловливает летальность порою до 30 % (Леонова, 1997). Центрально-европейский вариант вируса отличается сравнительно доброкачественным течением. Недавно на территории России обнаружен третий вариант вируса КЭ, который по тяжести заболевания занимает промежуточное положение между дальневосточными и центрально-европейскими вариантами вируса. Несмотря на то, что в литературе опубликован ряд работ о существовании нескольких антигенных вариантов вируса КЭ, эти данные нельзя считать абсолютно убедительными, так как они получены на основе различных методологических подходов и критериев оценки различий.
Учитывая высокую точность и информативность методов молекулярной биологии для понимания генетической структуры региональных природных популяций вируса КЭ и для анализа фундаментальных вопросов его эволюции в прошлом и в настоящее время, мы посчитали актуальным изучить молекулярно-эпидемиологические особенности вируса КЭ на территории бывшего Советского Союза. Применение современных методов молекулярной вирусологии, таких как молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот с различными высокоспецифичными зондами и определение структуры генома вируса важно также для решения практических задач, направленных на совершенствование прогноза эпидситуации, диагностики, профилактики и лечения различных инфекций.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы явилась разработка методических подходов для решения вопросов идентификации и молекулярно-эпидемиологической характеристики на примере двух РНК содержащих вирусов морбилливируса байкальской нерпы и вируса клещевого энцефалита.
Для этого необходимо было последовательно решить следующие задачи:
1. Подобрать структуры олигонуклеотидных зондов для определения наличия вирусоспецифических РНК в образцах тканей павших и больных животных на основании сравнения опубликованных нуклеотидных последовательностей известных морбилливирусов кори и СЭУ;
2. Показать наличие как вирионной, так и матричных морбилливирусных РНК в тканях павших и больных животных, используя метод гибридизации;
3. Определить по результатам гибридизации наиболее консервативные участки генома морбилливирусов, пригодные для использования в качестве универсальных праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР) при массовой диагностике морбилливирусных инфекций и оптимизировать условия экспресс - диагностики морбилливирусных инфекций методом
ПЦР, с использованием образцов тканей, минуя этап культивирования вируса;
4. Определить нуклеотидные последовательности генов Р и Н изолята вируса байкальской нерпы и сравнить полученные последовательности с аналогичными структурами других морбилливирусов;
5. Определить таксономическое положение вируса байкальской нерпы среди других морбилливирусов;
6. Исследовать популяцию байкальской нерпы на наличие в ней морбилливирусов через 10 лет после вспышки 1987/88 гг.
7. Определить структуру фрагмента гена Е вируса КЭ и определить таксономическое положение и генетическую принадлежность вариантов вируса, циркулирующих на территории России;
8. Изучить на основе гибридизационного анализа гетерогенность и географическое распространение генетических вариантов вируса КЭ;
9. Адаптировать методы кластерного анализа для характеристики генетических различий штаммов вируса КЭ на базе данных гибридизационных тестов и выявить геновариантные кластеры в региональных вирусных популяциях;
10. Оценить возможность корреляции вирулентности вируса КЭ и его спектра гибридизации с олигонуклеотидными зондами.
Научная новизна работы.
Впервые методами молекулярной биологии, включающими гибридизацию с олигонуклеотидными зондами, амплификацию, с использованием полимеразной цепной реакции, выбранных участков генома вирусов, клонирование и последующее определение нуклеотидной последовательности полученных фрагментов, был обнаружен новый, ранее не известный вирус, вызвавший эпизоотию байкальской нерпы.
В результате анализа нуклеотидных последовательностей, однозначно установлено, что вспышка болезни на Байкале была вызвана вариантом вируса чумы плотоядных, который отличается от других, циркулирующих в природе штаммов СЭУ.
Показано существенное отличие вируса байкальской нерпы от морбилливирусов других морских млекопитающих, как ластоногих, так и китообразных.
Продемонстрировано, что морбилливирус байкальской нерпы продолжает циркулировать в популяции, причем циркулирует два варианта вируса различной вирулентности.
Впервые на репрезентативном материале получены детальные сведения об основных генотипах вируса клещевого энцефалита, их генетическому разнообразию и географическому распространению в различных физико-географических регионах России.
Впервые показано, что на территории России в основном циркулирует вирус клещевого энцефалита третьего генотипа, в тоже время, вирусы первого и второго генотипов встречаются мозаично.
Так вирус дальневосточного (первого) генотипа имеется во всех, кроме трех, исследуемых регионах от Сахалина до Калининграда. Вирус центрально-европейского (второго) генотипа циркулирует на западе России и его ареал распространяется до Урала и Алтая.
Впервые на основании филогенетического анализа высказано предположение, что высокой вирулентностью обладают штаммы вируса клещевого. энцефалита не только дальневосточного генотипа, но и ряд штаммов вируса второго и третьего генотипов. Высокая вирулентность вариантов вируса связана, по-видимому, со структурой белка N826.
Предложены модификации метода синтеза олигонуклеотидов, разработана схема синтеза и изготовлен автоматический синтезатор, обеспечивающий быстрый и экономный синтез олигонуклетидов.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Полученные в результате работы нуклеотидные последовательности двух генов вируса байкальских тюленей и ряда других изолятов СБУ значительно расширяют существующие представления о разнообразии вирусов чумы плотоядных, циркулирующих в природе. В распоряжении исследователей оказался дополнительный материал для изучения различий между вирусами на генетическом уровне, для анализа вирусных белков и определения значения изменений в структуре генов и белков.
В ходе изучения вируса байкальской нерпы разработан и синтезирован ряд морбилливирусных праймеров для выявления и тонкого анализа любой морбилливирусной инфекции с помощью метода полимеразной цепной реакции. Отработанные методики позволяют быстро, без применения трудоёмкой стадии культивирования вируса, подтвердить или опровергнуть наличие морбилливирусной инфекции, а в сочетании с методами секвенирования определить принадлежность выявленного вируса к тому или иному виду морбилливируса и показать его отличие от других близких ему вирусов. Полученные результаты показывают, что данный подход оказался достаточно эффективным для этих целей. Разработанная методика с набором «универсальных морбилливирусных праймеров» может без изменений применяться при анализе вируса кори и других морбилливирусов.
Достоверное доказательство о превалировании на территории России вируса КЭ третьего генотипа не только расширяет наши представления о путях эволюции вируса, но и ставит вопросы о необходимости разработки новых коммерческих препаратов для диагностики, профилактики и лечения клещевого энцефалита.
Показанные выраженные отличия в частоте встречаемости основных генотипов вируса КЭ на различных территориях требуют от эпидемиологических служб необходимость разработки региональных схем диагностики и профилактики КЭ.
Разработанный патогенетический подход к анализу вирусной популяции применим для оценки эпидситуации в регионах с целью профилактики и диагностики заболевания. Предложенный метод графического отображения спектра гибридизации вирусной РНК совместно с патогенетическим подходом целесообразно использовать при изучении других РНК-содержащих вирусов.
Предположение о связи вирулентности вируса клещевого энцефалита со структурой гена белка №2Ь ставит перед исследователями новую задачу изучения структуры и функции белка, кодируемого этим геном, и механизма его действия.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Эпизоотия в популяции байкальской нерпы в 1987-1988гг. вызвана морбилливирусом, который наиболее близок к вирусу чумы плотоядных и является его новым вариантом.
2. Вирус, поразивший популяцию байкальской нерпы, не являлся причиной эпизоотии обыкновенных и серых тюленей в Северной Европе.
3. Переход морбилливирусов к морским и пресноводным позвоночным произошёл независимо в нескольких эволюционных линиях.
4. Коммерческие живые вакцины против вируса чумы плотоядных непричастны к заражению популяции байкальской нерпы.
5. На территории России выявлен высокий уровень генетической гетерогенности циркулирующих штаммов вируса клещевого энцефалита.
6. На всей эндемичной территории России доминируют штаммы вируса КЭ третьего генотипа.
7. Штаммы вируса КЭ дальневосточного (первого) генотипа в основном встречаются на Дальнем Востоке, но в тоже время имеются в большинстве исследованных регионах от Калининграда до Сахалина.
8. Штаммы вируса КЭ центрально-европейского (второго) генотипа встречаются в западных областях России, а ареал их распространения достигает Урала и Алтая.
9. Среди вариантов вируса КЭ второго и третьего генотипа могут встречаться высоковирулентные штаммы.
Внедрение в практику. Полученные нуклеотидные последовательности генов М, N, Р и Н изученных штаммов CDV, а также структуры фрагмента гена Е депонированы в международный компьютерный банк данных Genbank, а именно: AF259552, AF259551, AF259550, AF259549, AF224667, AF224666, AF224665, AF224664, AF224663, AF241774, AF241773, AF241772, AF236055, AF231807, AF231806, AF229364, AF229363, AF229362, AFI81446, AFI39491, AF139490, AF139489, Х84998, Х84999, Х85000. Получены следующие свидетельства на изобретения:
Беликов С.И., Горбунов Ю.А., Попов С.Г. Способ удаления тритильных защитных групп с производных нуклеозидов, нуклеотидов и олигонуклеотидов.// A.C. № 828671.- 1981. - 5с;
Беликов С.И., Рыбак В.К. Способ получения 4-1\[-бензоил-2-дезоксицитидина.// A.C. № 1266164. -1986а.- Зс;
Беликов С.И., Рыбак В.К., Озолс A.M., Стопникова М.Н., Зиемелис K.M. 5'-0-Тритолилметильные производные 2'-дезоксинуклеозидов в качестве исходных веществ в синтезе олигонуклеотидов. // A.C. № 1270153.-19866.-7с;
Абрамова JT.M., Беликов С.И., Белова Н.В., Чекавая Н.И. Способ получения олиготимидилатного производного целлюлозы. // Авторское свидетельство № 1438189, 1988, 4с;
Кумарев В.П., Беликов С.И., Кобзев В.Ф., Кузнеделов К.Д., Баранова Л.В., Средин Ю.Г. Способ синтеза олиго(поли)нуклеотидов и устройство для его осуществления.//Авторское свидетельство № 1773916, 1992, 11 с.
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на Международном симпозиуме "Morbillivirus infections", Hannover, 1994; на второй Верещагинской байкальской международной конференции, Иркутск, 1995; на юбилейной научной конференции "Природно-очаговые болезни человека", Омск, 1996; на международной научной конференции "Вирусные, риккетсиозные и бактериальные инфекции, переносимые клещами", Иркутск, 1996; на научной конференции "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера", Новосибирск, 1998; на первой международной конференции "Biodiversity and dynamics of ecosystems in North Eurasia", Новосибирск, 2000.
По материалам диссертации имеется 18 публикаций, включая монографию 4 статьи в центральной печати, 4 статьи в зарубежной печати и 5 авторских свидетельств.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (4 главы), 6-ти глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы (219 отечественных и зарубежных источников) и приложения. Объем работы составляет 234 страницы машинописного текста, включающего 13 таблиц и 37 рисунков.
Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Беликов, Сергей Иванович
выводы
1. Впервые определена нуклеотидная последовательность генов >1, Р и Н вируса байкальской нерпы, что позволило провести сравнительный анализ с аналогичными структурами других морбилливирусов.
2. Эпизоотия, вызвавшая массовую гибель байкальской нерпы в 1988 году, обусловлена морбилливирусом, родственным вирусу чумы плотоядных (СЭУ).
3. Показано, что морбилливирус, вызвавший эпизоотию байкальской нерпы наиболее близок морбилливирусу собак и является его новым вариантом.
4. Установлено, что варианты вакцинных штаммов вируса не были предковыми формами вируса байкальской нерпы.
5. Доказано, что морбилливирус, вызвавший эпизоотию 1989 года у обыкновенных и серых тюленей в Северной Европе, не является ближайшим родственником вируса, вызвавшего массовую гибель байкальской нерпы, а вирус байкальской нерпы, не был причиной этой эпизоотии.
6. Показана в динамике на протяжении 12 лет циркуляция морбилливируса байкальской нерпы и формирование, по крайней мере, двух вариантов морбилливируса различной вирулентности.
7. Определена первичная структура фрагмента гена белка оболочки 29 штаммов вируса КЭ, установлены их таксономическое положение и принадлежность к трем различным генетическим вариантам.
8. На территории России отмечен высокий уровень генетической гетерогенности циркулирующих штаммов вируса клещевого энцефалита с абсолютным доминированием штаммов третьего генотипа.
9. Установлено, что штаммы вируса КЭ первого генотипа доминируют на Дальнем Востоке, но, в тоже время, в разной степени встречаются во всех исследованных регионах от Сахалина до Калининграда, причем их количество мозаично варьирует по территориям.
10. Показано, что штаммы вируса КЭ второго (центрально-европейского) генотипа встречаются от западных областей России до Урала с приобладанием их на Алтае.
11. Впервые показано, что среди вариантов вируса КЭ второго и третьего генотипов могут встречаться высоковирулентные штаммы, аналогичные штамму Шейнин, выделенному в Приморском крае от больного, умершего от КЭ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Методы молекулярной биологии, такие как гибридизация со специфическими зондами, амплификация с помощью ПЦР, определение первичной структуры генома и филогенетический анализ структур и гибридизационных событий являются перспективными методами исследования вирусов. Особенно полезны они при анализе РНК содержащих вирусов, отличающихся высокой скорость мутационной изменчивости, что затрудняет применение для их исследования серологических методов.
На примере вируса, вызвавшего эпизоотию байкальской нерпы, было убедительно показана не только полезность этих методов исследования, но и их уникальная скорость и точность. На этом примере показано, что смена вирусом хозяина возможна в настоящее время, при жизни исследователей, а не в течение столетий, как считалось ранее. Показано, что метод гибридизации нуклеиновых кислот со специфичными зондами является чрезвычайно быстрым и надежным методом для идентификации вируса, по крайней мере, до рода, и что этот метод нельзя выбрасывать из арсенала методов исследования в связи с его относительной древностью. Методы определения структуры нуклеиновых кислот и их филогенетический анализ являются наиболее точными для выявления тонких отличий у близкородственных вирусов. Так, методом иммуноанализа не различаются два варианта вируса, циркулирующие в настоящее время в популяции байкальской нерпы, в тоже время данные филогенетического анализа убедительно доказывают это.
В отличие от вируса нерпы, при анализе вируса клещевого энцефалита основной задачей являлась оценка генетического разнообразия большого количества штаммов вируса, выделенных со всех территорий России. В этом случае наиболее оптимальным является применение гибридизационных методов для анализа популяций. Так методом секвенирования и филогенетического анализа было оценено 29 штаммов вируса, а методом гибридизации оценено 265 штаммов вируса КЭ. Убедительно показано, что на территории России преобладают штаммы вируса КЭ генотипа III, а штаммы вируса генотипа I (дальневосточный) и генотипа II (центрально-европейский) встречаются значительно реже. Количество вариантов вируса этих двух генотипов значительно варьирует в различных регионах, причем районы с высоким содержанием этих генотипов вируса расположены мозаично и относительная концентрация этих вариантов вируса не уменьшается линейно по мере удаления от их основного очага. Варианты вируса КЭ первого генотипа обнаружены во всех исследованных регионах, в том числе в западных областях России. Штаммы вируса КЭ второго генотипа в основном изолированы в западной части России, но максимальное их количество выявлено на Урале и, особенно, на Алтае. Только один штамм вируса второго генотипа обнаружен восточнее этих районов, в Иркутской области.
В тоже время генотипический состав вирусов, выделенных от клещей и от мелких животных, в одной и той же области существенно различается. Так, в Иркутской области штаммы вируса, выделенные от животных, оказались существенно обогащены вариантами вируса первого и, особенно, второго генотипов. Этот факт указывает на то, что часть вариантов вируса, циркулирующего в клещах, не способна размножаться в теплокровных животных. Впрочем, этот факт следует тщательно перепроверить, так как штаммы вируса от клещей и штаммы вируса от животных собирались в разное время и в различных экологических районах, а известно, что и численность и типовой состав вируса меняются во времени и зависят от экологических условий в конкретной местности.
Впервые отмечено также, что среди вариантов вируса КЭ второго и третьего генотипов выделяется группа штаммов, спектр гибридизации которой, близок спектру высоковирулентного штамма Шейнин, выделенного в Приморском крае от умершего больного клещевым энцефалитом.
Показано также, что вирулентность вируса в большой степени совпадает с гибридизацией зондов к генам белков С, NS1 и NS2b, причем наибольшее совпадение отмечено при гибридизации с зондом на участок гена NS2b.
Методы молекулярной биологии, использованные в настоящей работе, дали не только новую информацию о РНК- содержащих вирусах, выбранных в качестве модели, но и позволили наметить новые направления исследований. Так, факт обнаружения нового варианта морбилливируса в популяции байкальской нерпы, который существует одновременно с вариантом вируса, вызвавшего эпизоотию, и который возник на протяжении нескольких лет, указывает на экстремально высокую скорость эволюции вируса. В связи с этим имеется уникальная возможность оценить пути и механизм эволюции нового вируса. Для этого необходимо продолжить ежегодное изучение структуры РНК вируса, до начала стабилизации и окончания «взрывного» характера эволюции вируса. Важно также исследовать варианты вируса у диких и домашних животных, тесно связанных с Байкалом, так как высокая скорость эволюции вируса может быстро привести к появлению новых вариантов, способных поражать другие виды животных и, возможно, человека.
В изучении вируса клещевого энцефалита также очерчены новые направления исследований.
Очевидно, что при разработке вакцинных препаратов и диагностических наборов необходимо учитывать доминирование на территории России вируса третьего генотипа. При оценке эпидситуации и прогнозе заболеваемости клещевым энцефалитом необходимо учитывать особенности региональной популяции вируса и содержание основных генотипов вируса.
Для повышения точности генотипирования необходимо осуществить дизайн новых зондов на основе структур трех основных генотипов вируса. Необходимо также существенно упростить методику генотипирования для
190 того, чтобы ее можно было применить в медицинских диагностических лабораториях. Определение генотипа вируса, в течение нескольких дней после укуса клещом, может помочь в предсказании тяжести течения заболевания и в назначении адекватного лечения.
Необходимо провести более четкую связь между спектром гибридизации вирусной РНК и патогенностью вируса. В первую очередь эту работу важно провести на группе изолятов, близких штамму Шейнин. Вопрос о существовании высоковирулентных штаммов вируса среди доминирующих на территории России вариантов второго и третьего генотипа принципиально важен.
Чрезвычайно важно также точное подтверждение связи вирулентности вируса со структурой и функцией конкретных белков, в частности со структурой белка N821». Ичитывая, что этот белок маленький и длина гена, кодирующего этот белок, лежит в оптимальных пределах, удобных для секвенирования, такую связь между вирулентностью и структурой белка N821? можно провести в сжатые сроки.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Беликов, Сергей Иванович, Иркутск
1. Абрамова Л.М., Беликов С.И., Белова Н.В., Чекавая Н.И. Способ получения олиготимидилатного производного целлюлозы. // A.C. № 1438189. 1988.-5с.
2. Баранова Л.В., Бейм A.M., Беликов С.И. и др. Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы (1987/88 г.). // Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние. 1992. - 71 с.
3. Бейм A.M., Колесник B.C., Куделин В.М. и др. О клинической симптоматике эпизоотии в популяции байкальской нерпы // Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы. Новосибирск, Наука, Сиб-е отд. - е -1992. - С.26-30.
4. Беликов С.И., Горбунов Ю.А., Попов С.Г. Способ удаления тритильных защитных групп с производных нуклеозидов, нуклеотидов и олигонуклеотидов.// A.C. № 828671.- 1981. 6с.
5. Беликов С.И., Рыбак В.К. Способ получения 4-.М-бензоил-2-дезоксицитидина.// A.C. № 1266164. -1986а.- 5с.
6. Беликов С.И., Рыбак В.К., Озолс A.M., Стопникова М.Н., Зиемелис K.M. 5'-0-Тритолилметильные производные 2'-дезоксинуклеозидов в качестве исходных веществ в синтезе олигонуклеотидов. // A.C. № 1270153.-19866.-7с.
7. Беляков В.Д., Голубев Д.Б., Каминский Г.Д., Тец В.В. Саморегуляция паразитарных систем. М., «Медицина», 1987.
8. Букринская А.Г., Зайдес В.М. Молекулярная биология парамиксовирусов. М.: Медицина. - 1978. - С. 183.
9. Верета Л.А. Принципы прогнозирования заболеваемости клещевым энцефалитом. М., -1975.
10. Верета Л.А., Островская О.В., Николаева С.П., Пуховская И.М. Выявление естественной неоднородности природных популяций вируса клещевого энцефалита и группировка штаммов. // Вопр. вирусол. 1983,- Т. 6.-С. 706- 710.
11. Вотяков В.И., Протас И.И., Жданов В.М. Западный клещевой энцефалит. Минск, 1978. - 256с.
12. Гайдамович С.Я. Арбовирусы: классификация и таксономия // Арбовирусы,- М., 1986. С. 5-15.
13. Демина Т.В. Характеристика генетической вариабельности штаммов вируса клещевого энцефалита на основе анализа гомологии участков вирусного генома //Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Владивосток., 1999. -22 с.
14. Дживанян Т.И., Батикова М., Грешикова М., Чунихин С.П. Отличия в штаммах вируса клещевого энцефалита в свете чувствительности их гемагглютининов к действию детергентов. // Вопр. вирусол. 1981. - Т. 2. -С. 237-239.
15. Джиоев Ю.П. Молекулярно-эпидемиологический и филогенетический анализ генетической гетерогенности популяций вирусу клещевого энцефалита на азиатской территории России. Автореф. дис. . канд. биол. наук. Иркутск., 1999.-22 с.
16. Добрикова Е. Ю., Плетнев А.Г., Шаманин В.А. Детекция вируса клещевого энцефалита в крови человека и в индивидуальных клещах методом гибридизации нуклеиновых кислот. // Вопр. вирусол. 1986. - Т. 31. - С. 739-742.
17. Живоляпина P.P. Этиологическая структура очагов КЭ в Иркутской области. Автореф. дис. . канд. мед. наук. Иркутск, 1971. 41с.
18. Злобин В.И. Молекулярная эпидемиология новый подход к анализу вариабельности вируса клещевого энцефалита. // Ж. Микробиол. Эпидемиол. Иммунобиол. - 1991. - Т. 7. - С. 80 - 82.
19. Злобин В.И. Молекулярно-биологическое определение и генотипическая дифференциация вируса клещевого энцефалита: Автореф. дис. . докт. мед. наук . М., 1992. - 67с.
20. Злобин В.И., Горин О.З. Клещевой энцефалит (Этиология, эпидемиология и профилактика в Сибири) Иркутск: Наука, 1996. - 177 с.
21. Злобин В.И., Дрокин Д.А., Мансуров П.Г., Калмин О.Б., Якименко В.В Типирование штаммов вируса клещевого энцефалита по растворимому антигену. // Вопр. вирусол. 1991,- Т. 36. - С. 24-27.
22. Карпов С. П. Томский очаг КЭ и вопросы его оздоровления. //Клещевой энцефалит. Минск, 1965. - С. 212-221.
23. Краминская H.H., Живоляпина P.P., Мейерова P.A. Своеобразный штамм вируса КЭ, выделенный от больного с проградиентным течением заболевания. // Актуал. пробл. вирусных заболеваний. М., 1965. - С. 190 -191
24. Кумарев В.П., Беликов С.И., Кобзев В.Ф., Кузнеделов К.Д., Баранова JI.B., Средин Ю.Г. Способ синтеза олиго(поли)нуклеотидов и устройство для его осуществления. // АС № 1773916. 1992. - 11с.
25. Левкович E.H., Погодина В.В., Засухина Г.Д., Карпович Л.Г. Вирусы комплекса клещевого энцефалита. Л.: Медицина, 1967. - 245 с.
26. Леонова Г.Н. Клещевой энцефалит в Приморском крае: вирусологические и эколого-эпидемические аспекты. Владивосток: Дальнаука, 1997,- 187 с.
27. Леонова Г.Н., Беликов С.И., Джиоев Ю.П., Борисевич В.Г. Филогенетический анализ популяции клещевого энцефалита. -2000. 7с. -в печати.
28. Леонова Г.Н., Кожемяко В.Б., Исаева М.П., Майстровская О.С. Молекулярная характеристика популяции вируса клещевого энцефалита Южно-Сихотэ-Алиньского очагового региона. // Вопр. вирусол. 1996. -Т.41. -С. 154-158.
29. Львов Д.К., Клименко С.М., Гайдамович С.Я. Арбовирусы и арбовирусные инфекции. М., 1989
30. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование М: Мир, 1984.-432 с.
31. Морозова О.В., Бахвалова В.Н., Добрикова Е.Ю., Максимова Т.Г. Клеточные белки взаимодействуют с РНК вируса клещевого энцефалита // Журн. инфекц. паталогии. 1996. - т.З, N4. - С. 44-46.
32. Наумов З.Л. Клещевой энцефалит и болезнь Лайма: эпизоотологические параллели и мониторинг. // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 1999. - Т.2. - С. 20 - 26.
33. Павловский E.H. Паразитологические факторы существования природного очага КЭ. // Совещ. по паразитологическим проблемам .- М.ю 1939.-С.13.
34. Павловский E.H. Природная очаговость и понятие о ланшафтной эпидемиологии трансмиссивных болезней человека. // Мед. паразитол. и паразитарные болезни. 1944. - № 6. - С. 29-38.
35. Петров Е.А., Елагин O.K., Егорова Л.И. и др. Состояние популяции байкальской нерпы // Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы. -Новосибирск.: Наука, Сиб. отд-ние, 1992. С. 20-26.
36. Пищенко Н.М., Кветкова Е.А., Шаманин В.А., Плетнев А.Г., Ильюшенко Л.П. Использование метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот для диагностики клещевого энцефалита. // Тр. инст. им Пастера.- 1989. Т.65.- С. 169-175.
37. Плетнев А.Г., Ямщиков В.Ф., Блинов В.М. Нуклеотидная последовательность генома и полная аминокислотнаяпоследовательность полипротеина вируса клещевого энцефалита. // Биоорг. химия, 1989.-Т. 15, N 11. - С. 1504-1521.
38. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Корешкова Г.В. Свойства штаммов серотипа Айна/1448 вируса КЭ. // Вопр. вирусол. 1981а. - Т. 6. - С. 741-746
39. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Левина Л.С., Жезмер В.Ю., Мейерова P.A. Иммунологические и некоторые этиологические аспекты изучения серотипа Айна/1448 вируса КЭ. // Вопр. вирусол.- 1981. Т. 6. С. 735-741.
40. Погодина В.В., М.П. Чумаков: вклад в изучение проблемы хронического клещевого энцефалита// Журн. инфекц. патологии. 1996,-т.З. - N4. - С. 52-56.
41. Погодина В.В., Трухина А.Г., Шаманин В.А., Бочкова Н.Г., Фролова Т.В. Дезоксиолигонуклеотидные пробы, различающие антигенные и патогенные варианты вируса клещевого энцефалита. // Вопр. вирусол.- 1992. -Т.37 С.53-56.
42. Погодина В.В., Фролова М.П., Ермак Б.А. Хронический клещевой энцефалит: Этиология, иммунология, патогенез. Новосибирск:Наука., 1986. -233 с.
43. Пронин Н.М., Кабанов Д.Е. Оценка масштабов гибели байкальских тюленей в 1987 / 1988 гг. // Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы. Новосибирск: Наука, Сиб. отд-ние, 1992. - С. 12-20
44. Пуховская Н, М., Верета JI.A., Шаманин В.А., Плетнев А.Г. Диагностические возможности метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот для обнаружения вируса клещевого энцефалита. // Вопр. вирусол. 1991. - Т. 36. - С. 250-253.
45. Пуховская Н.М., Верета JI.A., Островская О.В., Шаманин В.А., Плетнев А.Г. Обнаружение вируса клещевого энцефалита в клещах гибридизацией нуклеиновых кислот.// Мед. паразит. -1989.- Т.З.- С. 11-14.
46. Рубин С.Г., Чумаков М.П., Семашко И.В. Антигенные типы и подтипы штаммов вируса КЭ из различных регионов (вопросы классификации, географического распространения) // Вирусы и вирусные инфекции человека: Тез. конф. М, -1981. - С. 63-64.
47. Саламатова Г.А., Горин О.З., Малов И.В., Борисов В.А., Злобин В.И., Антонова A.M. Некоторые аспекты эпидемиологии, клиники и лечения клещевого энцефалита. // Ж. инфект. патол. 1999 - №4. — С. 4-10.
48. Сиссонс Г.П., Олдстоун М.Б., Иоклик В.К. и др. Вирусология в 3-х т. Под ред. Б. Филдса, Д. Найпа М.: Мир. - 1989.
49. Цилинский Я.Я. Генетика вирусов // Общая и частная вирусология. / Под ред. В.М.Жданова, С.Я.Гайдамович. М., Медицина. - 1982. - т.Г, гл.7.-С. 213-259.
50. Цилинский Я.Я. Популяционная структура и эволюция вирусов. // М.,1988
51. Чумаков М.П., Рубин С.Г., Линев М.Б. Три антигенных типа вируса клещевого энцефалита, их зависимость от основных видов клещей-переносчиков и географическое распространение // Вопр. медиц. вирусологии. М., 1975. С. 371-372
52. Чунихин С.П., Леонова Т.Н. Экология и географическое распространение арбовирусов. М.: Медицина. - 1985. - 126 с.
53. Шаманин В.А., Плетнев А.Г., Злобин В.И. Применение молекулярной гибридизации с синтетическими дезоксиолигонуклеотидами для дифференциации штаммов вируса клещевого энцефалита. // Вопр. вирусол. — 1990,- Т. 35.- С.474-478.
54. Шаманин В.А., Плетнев А.Г., Рубин С.Г., Злобин В.И. Дифференциация вирусов комплекса клещевого энцефалита с помощью РЖ-ДНК гибридизации. //Вопр. вирусол. 1991. - Т.36. - С. 27-31.
55. Шоуп Р. Эпидемиология: механизм возникновения, распространения и передачи вирусных инфекции. // Вирусология. Под ред. Филдса Б., Найпа Д. М.; Мир .- 1989. - т.1. - гл.1Х. - С. 264-276.
56. Baron M., Barrett T. The sequence of the N and L genes of rinderpest virus, and the 5' and 3" extra-genic sequences: the completion of the genome sequence of the virus // Vet. Microbiol. 1995. - V. 44. - P. 175-186.
57. Baron M., Subbarao S.M. and Barrett T. Cloning and sequence analysis of the phosphoprotein (P) gene of rinderpest virus. // J. Gen. Virol. 1993.
58. Barret A.D.T., Monath T.P., Cropp C.B., Adkins J.A., Ledger T.N., Gould E.A., Schlesinger J.J., Kurney R.M., Trent D.W. Attenuation of wild-type yellowfever virus by passage in HeLa cells. // J. Gen. Virol. 1990. - V.71. - P. 27572764.
59. Barrett T, Subbarao S.M., Belsham G.J., Mahy B.W.J. The molecular biology of morbilliviruses. In Kingsbury D. (e<±), The Paramyxoviruses, Plenum Press, New York. 1991.-P. 83-102.
60. Barrett T. and Underwood B. Comparison of messenger RNAs induced in cells infected with each member of the morbillivirus group. // Virology. 1985. -V.145. - P.195-199.
61. Barrett T., Mahy B.W.J. Genome organisation and genetics relationships among the morbilliviruses. // Rev. sci. tech. off. Int. Epiz. 1986. - V. 5, N. 2. -P. 395-405.
62. Barrett T., Romero C.H., Baron M.D. et al. The molecular biology of rinderpest and pest des petits ruminants. // Ann. Med. Vet.- 1993b. V.137. - P. 77-85.
63. Barrett T., Shimpton S.B., Russel S.E.H. Nucleotide sequence of the entire protein coding region of canine distemper virus polymerase associated (P) protein mRNA. // Virus Research. 1985. - V.3. - P. 367- 372.
64. Barrett T., Visser I.K.G., Mamaev L.V., Goatley L., Van Blessem M.-F., Osterhaus A.D.M.E. Dolphin and porpoise morbilliviruses are genetically distinct from phocine distemper virus. // Virology. 1993b. - V. 193. - P. 1010-1012.
65. Bartholomeusz A., and Thompson P. Flaviviridae polymerase and RNA replication.//J.Viral Hepatitis. 2000.- V. 6. - P. 261-270.
66. Bartholomeusz AI, Wright PJ. Synthesis of dengue virus RNA in vitro: initiation and the involvement of the proteins NS3 and NS5. // Arch. Virol. 1993. - 128. - P. 111-121.
67. Bellini W.J., Englund G., Rozenblatt S. et al. Measles virus P gene codes for two proteines. // J. Virol. 1985. -V. 53. - P. 908-919.
68. Blackwell JL, Brinton MA. BHK cell proteins that bind to the 3' stem-loop structure of the West Nile virus genome RNA. // J. Virol. 1995. -V. 69. - P. 5650-5658.
69. Bohn W., Ciampor F., Rutter R., Mannweiler K. Localization of nucleocapsid associated polypeptides in measles virus infected cells by immunogold labeling after resin embedding // Arch. Virol. 1990. - V. 114. - P. 53-64.
70. Bond C. W., Virology, Lectures at Montana State University (Internet), 2000
71. Borisov V., Malov I., Uschuk N. et al. Tick-born infections in Eastern Siberia: epidemiology and clinical features. // VIII Int. Conference on Lyme borreliosis and other emerging tick-borne diseases. Munich, Germany, June 20-24, 1999. - P. 297.
72. Boshell J., Goverdhan M.K., Rajagopalan P.K. Preliminary studies on the susceptibility of wild rodents and shrews to KFD virus. // Indian J Med Res. -1968,-V.56.-P. 614-627.
73. Brandt W.E. From the World Health Organization. Current approaches to the development of dengue vaccines and related aspects of the molecular biology of flaviviruses. // J. Infect. Dis. 1988. - V. 157. - P. 1105-1111.
74. Buchhold C.J., Spehner D., Drillien R., Neubert W.J. and Homann H.E. The conserved N-terminal region of Sendai virus nucleocapsid protein NP is required for nucleocapsid assembly. // J. Virol. 1993. - V. 67. - P. 5803-5812.
75. Cao J.X., Ni H., Wills M.R., Campbell G.A., Sil B.K, Ryman K.D., Kitchen I., Barrett A.D.T. Passage of Japanese encephalitis virus in HeLa cells results in attenuation of virulence in mice. // J. Gen. Virol. 1975. - V.76. -P. 2757-2764.
76. Caruthers M.H., Barone A.D., Beaucage S.L., Dodds D.R., Fisher E.F., McBride I.J., Matteucci M. Chemical synthesis of deoxyoligonucleotides by the phosphoramidite method. //Methods Enzymol. -1987. V.154. - P. 287-313.
77. Caruthers M.H., Beaucage S.L., Efcavitch J.W, Fisher E.F., Matteucci M.D., Stabinsky Y. New chemical methods for synthesizing polynucleotides.// Nucl. Acids Symp. Ser. 1980. -V 7. -P. 215-23.
78. Cattaneo R., Kaelin K., Baczko K., Billeter M.A. Measle virus editing provides an additional cystein-rich protein. // Cell. 1989. - V. 56. - P. 759-764.
79. Cattaneo R., Rebmann G., Baczko K. et al. Altered ratios of measles virus transcripts in diseased human brains. // Virology. 1987a. - V. 160 — P. 523-526.
80. Cattaneo R., Rebmann G., Schmidt A. Altered transcription of a defective measles virus genome derived from a diseased human brain. // EMBO J. 1987b. -V.6. - P. 681-688.
81. Chamberlain R.W., Wamwayi H., Hockley E., Subbarao S.M., Goatley L., Knowles N.J. and Barrett T. Evidence for different lineages of rinderpest virus reflecting their geographic isolation. // J. Gen. Virol. 1993. - V. 72. - P. 443-447.
82. Chen CJ, Kuo MD, Chien LJ, Hsu SL, Wang YM, Lin JH. RNA-protein interactions: involvement of NS3, NS5 and the 3' noncoding regions of Japanese encephalitis virus genomic RNA. // J. Virol. 1997. - V. 71. - P. 3466-3473.
83. Chirgwin J.M., Przybyla A.E., MacDonald R.J. et al. Isolation of biologikally active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. // Biochemistry. 1979. - V.18. - P. 5294.
84. Chomczynski P. and Sachi N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.// Anal. Biochem. 1987. -Vol. 162.-P. 156-159.
85. Chu PW, Westaway EG. Molecular and ultrastructural analysis of heavy membrane fractions associated with the replication of Kunjin virus RNA. //Arch Virol.-1992.-V. 125.-P. 177-191.
86. Chu PW, Westaway EG. Replication strategy of Kunjin virus: evidence for recycling role of replicative form RNA as template in semiconservative and asymmetric replication. // Virology. 1985. -V. 140. - P. 68-79.
87. Chungue E., Cassar O., Drouet M.T. et al. Molecular epidemiology of dengue-1 and dengue-4 viruses. // J. Gen. Virol. 1995. - Vol. 76. - P. 1877-1884.
88. Clarke D.H. Father studies on antigenic relationships among the viruses of the group B tick-borne complex. // Bulletin of the World Health Organization. -1964,-V. 31.-P. 45-56.
89. Coelen RJ, Mackenzie JS. Genetic variation of Murray Valley encephalitis virus.//J. Gen. Virol. 1988.-V. 69.-P. 1903 - 1912.
90. Collett M.S., Larson R., Gold C., Strick D., Anderson D.K., Purchio A.F. Molecular cloning and nucleotide sequence of the pestivirus bovine viral diarrhea virus. // Virology. 1988. -V. 165. - P. 191-199.
91. Curran J., Boeck R. and Kolakofsky D. The Sendai virus P gene expresses both an essential protein and an inhibitor of RNA synthesis by shuffling modules via mRNA editing. // EMBO J. 1991. - V. 10. - P. 3079-3085.
92. Curran J., Marq J.-B. and Kolakofsky D. An N-terminal domain of the Sendai paramyxovirus P protein acts as a chaperone for the NP protein during the nascent chain assembly step. // J. Virol. 1995. - V. 69. - P. 849-855.
93. Curran J., Marq J.-B. and Kolakofsky D. The Sendai virus non-structural proteins specifically inhibit viral mRNA synthesis. // Virol. 1992. - V. 189. - P. 647-656.
94. Curran J., Pelet T. and Kolakofsky D. An acidic activation-like domain of the P protein is required for RNA synthesis and encapsidation. // Virology. -1994,- V. 202.-P. 875-884.
95. Curran M.D. and Rima B.K. The genes encoding the phospho- and matrix proteins of phocine distemper virus. // J. Gen. Virol. 1992. - V. 73. - P. 15871591
96. Deshpande K.L., Portner A. Monoclonal antibodies to the P protein of Sendai virus define its structure and role in transcription. // Virology. 1985. - V. 140.-P. 125-134.
97. Deubel V, Digoutte JP, Monath TP, Girard M. Genetic heterogeneity of yellow fever virus strains from Africa and the Americas. // J. Gen. Virol. 1986. -V. 67. - P. 209 -213.
98. Dunster L.M., Gibson C.A., Stephenson J.R., Minor P.D., Barrett A.D.T. Attenuation of virulence of flaviviruses following passage on HeLa cells. // J. Gen. Virol. 1990. - V.71 - P. 601-607.
99. Ecker M., Allison S.L., Meixner T., Heinz F.X. Sequence analysis and genetic classification of tick-borne encephalitis viruses from Europe and Asia. // J.Gen.Virol. 1999. - V.80. - P.179-185.
100. Eckert K.A., Kunkel T.A. High fidelity DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase. // Nucl. Acids Res. 1990. - V. 37. - P. 165-167.
101. Falker W.A., Diwan A.R., Halstead SB. Human antibody to dengue soluble complement-fixing (SCF) antigens. // J. Immunol. 1973 -V. -111. -P. 1804-9.
102. Felsenstein J. Evolutionary trees from DNA sequences: a maximum likelihood approach. // J. Mol. Evol. 1981. - V. 17. - P. 368-376.
103. Francki R.I.B., Fauquet C.M., Knudson D.L., Brown F. (eds) Classification and nomenclature of viruses. Fifth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. // Arch. Virol. 1991. - Supple 2.
104. Froehler B.C., Ng P.G., Matteucci M.D. Synthesis of DNA via deoxynucleoside H-phosphonate intermediates. // Nucl. Acids Res. 1986. - V. 14(13). - P.5399-5407.
105. Gargadennec L. and Lalanne A. La peste des pestits ruminants. // Bulletin des services Zootechniques et des Epizootics de L'Afrique Occidentale Française. 1942,-V. 5.-P. 16-21.
106. Godovikova T.S., Orlova T.N., Zarytova V.F., Shamanin V.A., Vorobjova N.V., Serdjukova N.A., Romashchenko A.G. Direct non-radioactive detection of virus RNA by a novel RNA-PCR test. // Nucl. Acids Symp. Ser.- 1991. V.24. -P. 284.
107. Gong YH, Trowbridge R, Macnaughton TB, Westaway EG, Shannon AD, Gowans EJ. Characterization of RNA synthesis during a one-step growth curve and of the replication mechanism of bovine viral diarrhea virus. // J. Gen. Virol. — 1996. V.77. - P. 2729-2736.
108. Grun JB, Brinton MA. Separation of functional West Nile virus replication complexes from intracellular membrane fragments. // J. Gen. Virol. 1988. - V. 69.-P. 3121-3127.
109. Hambleton P, Stephenson JR, Baskerville A, Wiblin CN.Pathogenesis and immune response of vaccinated and unvaccinated rhesus monkeys to tick-borne encephalitis virus. // Infect Immun. 1983. - V. 40(3). - P. 995-1003.
110. Hanahan D. Techniques for transformation of E.coli. // DNA cloning, V. 1 / Ed. D.M. Glover. Oxford, Washington DC: IRL. Press, 1985. - P.109-136.
111. Harder T.C., Kenter M., Appel M.J.G. et al. Phylogenetic evidence for canine distemper virus in Serengeti's lions //Vaccine. 1995. - V. 13. - P. 521-523.
112. Harder T.C., Liess B., Osterhaus A.D.M.E. and Barrett T. Characterization of morbi Hi viruses isolated from lake Baikal seals (Phoca sibirica). II Vet. MicrobiolSpecial Issue: Morbilliviruses. 1995. - V. 44. - P. 251-259.
113. Hardy F.M. The growth of Asibi strain yellow fewer virus in tissue cultures. II/ Modification of virus and cells. // Journal of infectious Diseases. 1963. -V.113.-P. 9-14.
114. Heinz F.X., Kunz C. Homogeneity of the structural glycoprotein from European isolates of tick-borne encephalitis virus: comparison with other flaviviruses. // J. Gen. Virol. 1981. - V.57. - P. 263-274.
115. Heinz F.X., Roehrig J.T. Flaviviruses. // Immunochemistry of viruses, II. The basis for serodiagnosis and vaccines. (Eds. M.H.V. van Regenmortel and A.R.Neurath). 1990. - P. 289-305.
116. Heinz FX, Tuma W, Kunz C. Antigenic and immunogenic properties of defined physical forms of tick-borne encephalitis virus structural proteins. // Infect. Immun. 1981. - V. 33. - P. 250- 257.
117. Henchal EA, McCown JM, Seguin MC, Gentry MK, Brandt WE. Rapid identification of dengue virus isolates by using monoclonal antibodies in anindirect immunofluorescence assay. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1983. V. 32. - P. 164-169.
118. Holzmann H.,.Vorobyova M.S, Ladyyzhenskaya I.P., Ferenczi E., Kundi M., Kunz C., Heinz F.X. Molecular epidemiology of tick-borne encephalitis virus: cross-protection between European and Far Eastern subtypes. //Vaccine. 1992. -V. 10,- P. 345-349.
119. Hori H, Morita K, Igarashi A. Oligonucleotide fingerprint analysis on Japanese encephalitis virus strains isolated in Japan and Thailand. //Acta Virol. -1986.-V.30.-P.353 -359.
120. Jenner E. (cited by Kirk H.) Canine distemper, its complications, sequelae and treatment. // 1st Ed., Baillere, Tindall and Cox, London. 1809. - P. 1922.
121. Junean M.L. Famille des Paramyxoviridae // Can J. Med. Technol. 1991. -V. 53.-P. 169-173.
122. Kamata H., Tsukiyama K., Sugiyama M., Kamata Y., Yoshikawa Y., and Yamanouchi K. Nucleotide sequence of cDNA to the rinderpest virus mRNA encoding the nucleocapsid protein. // Virus Genes. 1991. - V. 5. - P. 5-15.
123. Kerschner JH, Vorndam AV, Monath TP, Trent DW. Genetic and epidemiological studies of dengue type 2 viruses by hybridization using synthetic deoxyoligonucleotides as probes. // J. Gen. Virol. -1986. -V.67. -P. 2645-61.
124. Khorana H.G. Total synthesis of transfer RNA genes. // Symp. Soc. Dev. Biol. -1974. V.30. - P. 193-4.
125. Kim D.W, Gwack Y., Han J.H., Choe J. Towards defining a minimal functional domain for NTPase and RNA helicase activities of the hepatitis C virus NS3 protein. // Virus Res. 1997b. - V. 49. - P. 17-25.
126. Kim D.W, Kim J., Gwack Y., Han J.H., Choe J. Mutational analysis of the hepatitis C virus RNA helicase. // J. Virol. 1997a. -V. 71. - P. 9400-9409.
127. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. // J. Mol. Evol. 1980.-V. 16.-P. 111-120.
128. Kimura-Kuroda J, Yasui K.Topographical analysis of antigenic determinants on envelope glycoprotein V3 (E) of Japanese encephalitis virus, using monoclonal antibodies. // J. Virol. 1983. - V. 45. - P. 124-132.
129. Kitano T, Suzuki K, Yamaguchi T. Morphological, chemical, and biological characterization of Japanese encephalitis virus virion and its hemagglutinin. // J. Virol. 1974. - V. 14(3).-P. 631-639.
130. Koonin E.V. Computer-assisted identification of a putative methyltransferase domain in NS5 protein of flaviviruses and lambda 2 protein of reoviruses. // J. Gen. Virol. 1993. -V. 74. - P. 733-740.
131. Kuno G., Chang G-J.J., Tsuchiya K.R., Karabatsos N., Cropp C.B. Phylogeny of genus Flavivirus. II J. Virol. 1998 - V.72- P.73-83.
132. Mackenzie J.M., Khromykh A.A., Jones M.K., Westaway E.G. Subcellular localization and some biochemical properties of the flavivirus Kunjin nonstructural proteins NS2A and NS4A. // Virology. 1998. -V. 245. - P. 203-215.
133. Mamaev L.V., Visser I.K.G., Belikov S.I., Denikina N.N., Harder Т., Goatley L., Rima В., Edginton В., Osterhaus A.D.M.E., Barrett T. Canine distemper virus in Lake Baikal seals (Phoca sibirica). // Veterinary Record. 1996. -V. 138.-P. 437-439.
134. Mandl C.W., Heinz F.X., Kunz C.H. Sequence of the structural proteins of tick-borne encephalitis virus (western subtype) and comparative analysis with other flaviviruses. // Virol. -1988. -V.166. P.197-205.
135. Maxam A.M., Gilbert W.A. A new method for sequencing DNA. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1977. - V. 174. - P. 560-564.
136. Mayer V. Study of the virulence of tick-borne encephalitis virus. //Acta Virol. 1965. - V.9. - P. 397-408.
137. Mayo M.A., Pringle C.R. Virus Taxonomy 1997. // J.Gen. Virol. -1998. -V.79. - P. 649-657.
138. McMinn P.C. The molecular basis of virulence of the encephalitogenic flaviviruses. // J. Gen. Virol. -1997. -V. 78. P. 2711-2722.
139. McMinn P.C., Marshall I.D., Dangarno L. Neirovirulence and neuroinvasivenes of Murray Valey encephalitis vims mutants selected by passage in a monkey kidney cell line. // J. Gen. Virol. 1995. - V. 76 - P. 865-872.
140. McNeill W.H. Plagues and peoples: a natural history of infectious disease // Garden City, New York: Anchor Press, Doubleday. 1976. - P. 76.
141. Meincoth J., Wahl G. Hybridisation of nucleic acid immobilized on solid support // Anal.Biochem. -1984. V.138. - P.267-284
142. Monath T.P. Yelow fever and dengue viruses the interaction of virus, vector and host in the re-emergence of epidemic disease. // Semin. Virol. - 1994. -V.5. - P. 133-145.
143. Murphy F.A., Fauquet C.M., Bishop D.H.L., Ghabrial S.A., Jarvis A.W., Martelli G.P., Mayo M.A., Summers M.D. (Ed) // Virus taxonomy: classification and nomenclature of virus. 1995. - P. 415-421. Spring-Verlag, New York, N.Y.
144. Murphy G., Kavanagh T. Speeding-up the sequencing of double-stranded DNA. // Nucl. Acids Res. 1988.-V. 16.-P. 5198.
145. Murrey V. Improved double-stranded DNA sequencing using the linear polymerase chain reaction. // Nucl. Acids Res. 1989. - V. 17. - P. 8889.
146. Muylaert I.R., Chambers TJ., Galler R., Rice C.M. Mutagenesis of the N-linked glycosiiation sites of the fellow fever virus NS1 protein: effects on virus replication and mouse neurovirulence. // Virology. 1996. -V. 222 -P. 159-168.
147. Ni H., Barrett A.D.T. Molecular differences between wild-type encephalitis virus strains of high and low mouse neuroinvasiveness. // J. Gen. Virol. 1996. — V.77.-P. 1449-1455.
148. Norrby E., Utter G., Orvell C., Appel M.J.G. Protection against canine distemper virus in dogs after immunization with isolated fusion protein. // J. Virol., 1986. - V. 58.-P. 536-541.
149. Osterhaus A.D.M.E. Seal death. //Nature. 1988a. - V. 334. - P. 301-302.
150. Peeples M.E. Paramyxovirus M proteins: Pulling it all together and taking it on the road. In: Kingsbury D.W. (Eds.) // The paramyxoviruses. Plenum press: New York. - 1991. - P. 427-456.
151. Pletnev A.G., Bray M., Huggins J., Lai C.-J. Construction and characterization of chimeric tick-borne encephalitis/dengue type 4 viruses. // Proc. Natl. Acad. Sci., USA. -1992. V. 89. - P. 10532-10536.
152. Pletnev A.G., Bray M., Lai C.J. Chimeric tick-borne encephalitis and dengue type 4: effects of mutations on neurovirulence in mice. // J. Virol. 1993. - V. 67. -P. 4956-4963.
153. Pogodina VV, Frolova TV, Frolova MP, Sobolev SG, Shamanin VA, Pletnev AG Molecular hybridization with cloned fragments of tick-borne encephalitis (TBE) virus cDNA in acute and chronic TBE infection. // Acta Virol. -1991. -V.35 (1). -P.71-80.
154. Rice C.M., Lenches E.M., Eddy S.R., Shin S.J., Sheets R.L., Strauss J.H. Nucleotide sequence of yellow fever virus: implications for flavivirus gene expression. // Science. 1985. - V. 229. - P. 726-733.
155. Rice C.M., Strauss E.G., Strauss J.H. In Togaviridae and Flaviviridae (Schleisinger S., Schleisinger M.J., eds.) 1986a - Plenum Press, New York, P. 279-326.
156. Rice C.M, Aebersold R, Teplow DB, Pata J, Bell JR, Vorndam AV, Trent DW, Brandriss MW, Schlesinger JJ, Strauss JH. Partial N-terminal amino acid sequences of three nonstructural proteins of two flaviviruses. // Virology. 1986b. -V. 151.-P. 1-9.
157. Richardson C.D., Scheid A., Choppin P.W. Specific inhibition of paramyxovirus replication by oligopeptides with amino acid sequences similar to those at the N-termini of the F1 or HA2 viral polypeptides. // Virilogy. 1980. -V. 105. - P. 205-222.
158. Rima B.K. The proteins of morbilliviruses. // J. Gen. Virol. 1983 - V. 64. -P. 1205-1219.
159. Rozenblatt S., Eizenberg O., Ben-Levy R., Bellini W.J. Sequence homology within the morbilliviruses. // J. Virol. 1985. - V.54. - P. 684-690.
160. Saitou, N., Nei, M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. // Mol. Biol. Evol. 1987. -V. 4. -P. 406-425.
161. Sanger F., Niclen S., Coulson A.R. DNA Sequence with chain-terminating inhibitors. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1978. - V. 304. - P. 5463 - 5467.
162. Schildkraut C.L., Marmur J., Doty P. The formation of hybrid DNA molecules and their use in studies of DNA homologies. // J. Mol. Biol. 1996. -V.3.-P.597-617.
163. Schlesinger J.J., Brandriss M.W., Cropp C.B., Monath T.P. Protection against yellow fever in monkeys by immunization with yellow fever virus nonstructural protein NS1. // J. Virol. 1986. - V. 60/ - P. 1153-1155.
164. Seal J.J. Crossing the species barrier viruses and the origins of AIDS in perspective. // Royal Soc. Med. - 1989. - V. 82. - P. 285-300.
165. Shamanin VA, Pletnev AG, Rubin SG, Zlobin VI Differentiation of strains of tick-borne encephalitis virus by means of RNA-DNA hybridization. // J. Gen. Virol. 1990.-V.71.-P. 1505- 1515.
166. Shiu S.Y.W., Ayres M.D., Gould E.A. Genomic sequence of the structural proteins of Louping ill virus: comparative analysis with tick-borne encephalitis virus.//Virology. 1991.-Vol. 180. - P.411-415.
167. Stettler M., Zurbriggen A. Nucleotide and deduced amino acid sequences of the nucleocapsid protein of the virulent A75/17-CDV strain of canine distemper virus // Vet. Microbiology. 1995. - V. 44. - P. 211-217.
168. Suzich J.A., Tamura J.K., Palmer-Hill F. et al. Hepatitis C NS3 protein polynucleotide-stimulated triphosphatase and comparison with the related pestivirus and flavivirus enzymes. // J. Virol. 1993. - V. 67. - P. 6152-6158.
169. Tai C., Chi W., Chen D., Hwang L. The helicase activity associated with hepatitis C virus nonstructural protein 3 (NS3). // J. Virol. 1996. -V. 70. - P. 8477-8484.
170. Takegami T, Hotta S. In vitro synthesis of Japanese encephalitis virus (JEV) RNA: membrane and nuclear fractions of JEV-infected cells possess high levels of virus-specific RNA polymerase activity. // Virus Res. 1989. - V. 13. - P. 337350.
171. Takegami T, Miyamoto H, Nakamura H, Yasui K. Biological activities of the structural proteins of Japanese encephalitis virus. // Acta Virol. 1982. -V.26 -P.312-320.
172. Tan B.H., Fu J., Sugrue R.J., Yap E.H., Chan Y.C., Tan Y.H. Recombinant dengue type 1 virus NS5 protein expressed in Escherichia coli exhibits RNA-dependent RNA polymerase activity. // Virology. 1996. -V. 216. - P. 317-325.
173. Tanaka T., Tamatsukuri S., Ikehara M. Solid phase synthesis of oligoribonucleotides using the 0-nitrobenzyl group for 2'-hydroxyl protection and H-phosphonate chemistry. //Nucl. Acids Res. 1987. - V.15 . - P.7235 - 7248.
174. Taylor M.J., Godfrey E., Baczko K., ter Meulen V., Wild T.F. and Rima B.K. Identification of different lineages of measles virus // J. Gen. Virol. 1991. -V. 72.-P. 83 - 88.
175. Thomas S.M., Lamb R.A. and Paterson R.G. Two mRNAs that differ by nontemplated nucleotides encode the amino coterminal proteins P and V of the paramixovirus SV5 // Cell. 1988. -V. 54. - P. 891-902.
176. Trent DW, Grant JA, Vorndam AV. Monath TP. Genetic heterogeneity among Saint Louis encephalitis virus isolates of different geographic origin.// Virology. 1981.-V. 114.-P. 319-332.
177. Van de Peer Y., De Wachter Y. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. // Comput. Applic. Biosci. 1994. - V. 10. - P. 569 - 570.
178. Vandevelde M. and Zurbriggen A. The neurobiology of canine distemper virus infection. // Vet. Microbiol. 1995. - V. 44. - P. 271-280.
179. Wallner G., Mandl C.W., Kunz C., Heinz F.X. The flavivirus 3'-noncoding region: extensive size heterogeneity is independent of evolutionary relationships among strains of tick-borne encephalitis virus. // Virology. 1995. - V. 213. - P. 169-178.
180. Wallner G., Mandl C.W., Ecker M., Holzmann H., Stiasny K., Kunz C., Heinz F.X. Characterization and complete genome sequences of high- and low-virulence variants of tick-borne encephalitis viruses. // J. Gen. Virol. -1996. V. 77.-P. 1035-1042.
181. Wardrop E.A., Briedis D.I. Characterization of V Protein in Measles virus-infected cells. // Virology. 1991. -V. 65. - P. 3421-3428.
182. Warrener P., Tamura J.K., Collett M.S. RNA stimulated NTPase activity associated with yellow fever virus NS3 protein expressed in bacteria. // J. Virol. -1993.- V. 67-P. 989-996.
183. Westway E.G., Brinton M.A., Gaidamovich S.Y., Horzinek M.G., Igarashi A., Kaariainen L., Lvov D.K. Portfield J.S., Russell P.K., Trent D.W.// Intervirology. 1985. - V.24. - P. - 183 - 192.
184. Wild T.F., Malvoisin E., Buckland R. Measles virus: both the haemagglutinin and fusion glycoproteins are required for fusion. // J. Gen. Virol. -1991,-V. 72.-P. 439-442.
185. Wild T.F., Naniche D., Rabourdin-Combe C., Gerlier d., Malvoisin E., Lecouturier V., Buckland R. Mode of entry of morbilliviruses. // Vet. Microbiol. -1995,-V. 44.-P. 267-270.
186. Wilkinson L. Rinderpest and mainstream infectious disease concepts in the eighteenth century // Medical History. 1984. - V. 28. - P. 129-150.
187. Yamashita T., Kaneko S., Shirota Y. et al. RNA-dependent RNA polymerase activity of the soluble recombinant hepatitis C virus NS5B protein truncated at the C-terminal region. // J. Biol.Chem. 1998. - V. 273. - P. 1547915486.
188. Yu M., Hansson E., Shiell B., Michalski W., Eaton B.T., Wang L.F. Sequence analysis of the Hendra virus nucleoprotein gene: comparison with other members of the subfamily Paramyxovirinae. // J. Gen. Virol. 19986. - V. 79. - P. 1775 - 1780.
189. Yuan Z-H. Kumar U., Thomas H.C., Wen Y-M., Monjatdino J. Expression, purification and partial characterization of HCV RNA polymerase. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. -V232. - P. 231-235.
190. Zlobin VI, Drokin DA, Shamanin VA Synthetic deoxyoligonucleotide probes for identification of flaviviruses. // Nucl. Acids Symp. Ser.- 1991. -V.24. -P. 280.
191. Zlobin VI, Shamanin VA, Drokin DA, Pletnev AG Use of synthetic oligonucleotide probes for investigation of tick-borne encephalitis virus genetic variability. //Nucl. Acids Symp. Ser. 1991. -24. -P.220.
-
Беликов, Сергей Иванович
-
доктора биологических наук
-
Иркутск, 2000
-
ВАК 03.00.06
- ХАРАКТЕР ПРОТИВОВИРУСНОГО ИММУНИТЕТА К СОВРЕМЕННЫМ ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫМ ШТАММАМ <br/>ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА<br/>У ЛИЦ, ПРИВИТЫХ ПРОТИВ ЭТОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ
- Изоляция морбилливируса от байкальской нерпы и его биологические свойства
- Обнаружение природного резервуара вируса чумы плотоядных в брюхоногих моллюсках
- Изучение морбилливируса байкальской нерпы методами молекулярной биологии
- Иммуноцитохимическое и патоморфологическое исследование морбилливирусной инфекции у байкальских тюленей (PHOCA SIBIRICA)
