Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Обмен билирубина в головном мозге при кислородной недостаточности

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Обмен билирубина в головном мозге при кислородной недостаточности"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ медицинский УНИВЕРСИТЕТ

На прагах рукописи

ТКАЧЕНКО Александр Васильевич

0Е4ЕН ШШРУЕШ В ГОЮВНОМ МОЗГЕ ПРИ " КИСЛОРОДНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ.

03.00.М - ШОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации в форме научного доклада на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 1992

Работа выполнена в Институте биофизики клетки АН СССР.

Научные консультанты:

дейстгительный член JWH СССР В.А.Таболин, докт. биол.наук Н.И.Кукушкин.

Официальные оппоненты:

докт.мед.наук Э.М.Халилов, докт.мед.наук Е.Л.РусаноЕ, докт. биол.наук Т.Е. Жукова.

Еедущее учреждение: Московский медицинский институт им.H.A.Семашко.

Ii и

Запита состоится__199 г.

в час.на заседании Специализироранного согета при Российском государс^ренном медицинском институте по адресу: II7869, Москра, ул. ОстровитянораД.

С диссертацией можно ознакомиться р библиотеке института.

п м

Автореферат разослан__199 г.

Учений секретарь Специализированного совета докт.мед.наук.,проф.

П.Х.Джанашия

Обшая характеристика работы. Актуальность проблемы.

Билирубин (I*,8'-диокси-I,3,6,7-тетреметил-1 ,8-дивинилбили-диен-2-о6',7 f -5,5-дипропионовая кислота) является продуктом происходящего е системе мононуклеарных ^агоцитог и е эпителиальных клетках различной специализации огерментативного катаболизма гема (Я. LerniétÇ'.J. Leqc/e. ,1949; R.. Те п hu n&rt, И- Matvei.K 3=hmid, 1968 ; К. Rc ojé ,М P;wtcne , / ZXarncnd, S. fahardl .1971).

Практически весь находящийся e системе циркуляции îrt vive билирубин (ЕР) доеольно ПрОЧНО сея38н (К г* ioV1) молекулами сывороточного альбумина,служащего транспортером ряда органических анионов Ква U fi in , L. Butga У л ,1956; U KtQCjh-f-laPxSen ,1981; 7h. PeietJ , 1985). На-способность сыЕоро-точного альбумина сеязыевть IP рлияние оказывают некоторые СЕЯзыЕаемые этим белком низкомолекулярные лиганды различной химической природы¡причем их взаимодействие с альбумином сопро-ждается изменениями конформации белка (B.Hùfioté ,1990),а направленность данного елияния зависит,непример,от молярного соотношения альбумина и лиганда (.0. К-Чо^Ь-Н&ГМеп .1981; J Btcwn ,1982). Накопление метаболитоЕ,взаи-

модействующих с сывороточным альбумином в качестве анионных лигандоЕ.е организме (например,е головной. мозге) происходит при разнообразных патологических состояних.е частности,при кислородной недостаточности (Е.М.&атоЕа, А.Н.Сидоркин, Г.В.Миронова,1987).

С нарушением обмена ЕР сеязэн этиопатогенез билирубиновой энцефалопатии (керниктеруса).изЕестной грачам с начала текуме-го Еека'(л^. £chmcl61904),возникающей,например,у недоношенных новорожденных детей при гипербилирубинемии ( V- Сгсзе , 1961) и до сих пор относящейся к тем тяжелым заболеваниям,которые способствуют еысокой детской летальности.

Отложения кристаллоЕ практически нерастворимого е еодных средах.ЕР при данном заболевании обнаруживают не только е голоеном мозге (палеокортекс,базальные ядра,субталамические ядра, продолговатый мозг,мозжечок),но и е стенке дихательных путей, е стенке желудочно-кишечного тракта,е селезенке,почках,надпочечниках,е семенных железах,е костном мозге. Это позволяет рассматривать билирубиноЕую энцефалопатию как проявление общей билирубиноЕОй. интоксикации организма,возникновению которой может способствовать.например,дефект.микросомной ферментной сис-

темы гепатоцитов,катализирующей конъюгацию ЕР,а также конъюгацию различных иных субстанций алифатического,ароматического и/или стероидного ряда (Я.Вксып , 1Л/. ^иеёъеъ^Н.Вигпеа, 1958; Р.А.Таболин,1967),способных,следует заметить,тоже оказывать токсическое действие на организм.

Продолжительное время предметом дискуссий служил вопрос о происхождении обнаруживаемого е клетках голоеного мозга погибших от билирубиноЕОн энцефалопатии детей ЕР, Сейчас считают установленным,что связанный с сывороточным альбумином ЕР е клетки мозга не проникает (М.Ь.Соыдег,1973). Установлено также ,что клетки голоеного мозга (в частности,неидентифицировэнные пока клетки неокортекса) обладают способностью сами продуцировать ЕР' {к.ТапНипел Ма*\'е.г, И.^гт'е!, 1970; К.7. Яосзб , М.Й.Р;мАопе, / ^¡атспс( , Я.&А/пМ, 1972). Концепция об экстранейрональном происхождении ЕР,накапливающегося е головном мозге при билирубиноЕой энцефалопатии, о ключевой. роли повышенной проницаемости незрелого в функционально-морфологическом отношении гемато-энцефалического барьера для проникнОЕения липофильного ЕР из системы циркуляции в клетки голоеного мозга и о существовании гипотетических переносчиков ЕР через гемато-энцефалический барьер подлежит пересмотру, 1973).

Все это заставляет обратить особое внимание на сыЕороточный альбумин как на специфический транспортер молекул 1Р .способный в силу своего еысокого сродства к этому билидиену извлекать его из плазматической мембраны продуцирующих этот желчный пигмент клеток. Не исключено,что причина (или,по меньшей мере,одна из причин) накопления ЕР е головном мозге при билирубиновой интоксикации организма заключается именно в утрате сыЕороточ-ным альбумином данной присущей ему способности.

Несмотря на общепризнанную Еысокую чувствительность голоеного мозга к токсическому действию В?,на большое количество исследований.СЕИдетельотЕуюших о повреждающем действии этого билидиена на нервные клетки (.СХ.В&лс, Ь^оЬп-ъап ,1959); У1 (, ■/?. ,1965; И Мепкеп ]//а<^о-

пег , V. Яе*#л.1966; ,1973; Р Млдоь ,/^ег-

Л/цеёЬа - А УаСс/'^'ем, /^.Мауог Д986,

С/а - Са&'О, Г, К/бо/Мезо е/ д^,1988; ^«¿//{щпн^а , 1991).молекулярные механизмы нейротоксичности № остаются малоизученными. Практически совсем неизученным до сих пор является взаимодействие ЕР с такой важнейшей в функциональном отношении

морфологической компонентой.нервных клеток,какой является плазматическая мембрана нейрональных окончаний (синаптосомальная мембрана).

Одна из проблем.связанных с этиопатогенезом билирубиноЕОй энцефалопатии,заключается е том,что ее клинические симптомы нередко проявляются при сравнительно невысокой концентрации ЕР р. плазме кроЕИ новорожденных детей,. Между тем,при концентрации находящегося в плазме кроЕИ альбумина Ъ% этот сыЕороточный белок теоретически способен полностью'и довольно прочно связать' ЕР вплоть до концентрации последнего 48 v¡v% (LM^azénct, R M gnyde-t. . J.Betnséetn ,1970),предохранив тем самым

организм от токсического действия значительного избытка желчного пигмента. Тем не менее,значение осуществляемого сывороточным альбумином- транспорта ЕР в происходящем при билирубиноЕОй ин^ токсикации накоплении последнего в головном мозге у недоношенных детей, остается до сих пор невыясненным. Есть указания на то,что способность фетального сывороточного альбумина связывать БР,оцениваемая взаимодействием билидиена и белка р гомогенных водных средах,нередко оказывается пониженной. Повышенным при зтом в фетальном альбумине оказывается содержание ацетальдегида, а е плазме кроги повышена концентрация жирных кислот Q>M^%tlnett R.V t. Chaéafi, J Betnjéein , 1970; R. ВttxJetien,CÍ> Jadcéien, H- fUtsen , F. ,1984; F.Eétf&i&o .J.Mféce .1984). Связыванием последних фет.альным альбумином не возможно, как полагают,объяснить пониженную активность белка во вэаимодейстии с ЕР.

Акутальным в проблеме возникновения билирубиновой энцефалопатии у недоношенных новорожденных детей ягляется гопрос о роли перинатальной гипоксии е этиопатогенезе этого заболерания. Кислородная недостаточность является частым патологическим состоянием недоношенного ребенка,а летальность среди новорожденных детей, при перинатальной гипоксии достигает 2,7$ (О.ВЛаболина). ЕозникноЕению билирубиновой интоксикации способствует повышенное содержание жирных кислот е плазме крови,избыток которых,подавляя актиЕность ферментов дыхательной, цепи и ограничивая тем самым связанные с биоэнергетиков процессы .способствует разрушению клеток е условиях гипоксии Qjftoae ,Я%£(куа/ле ,$. Дезе , 1981). Кислородная недостаточность,связанная с пребыванием лю--дей. в условиях высокогорья,сопровождается .помимо всего прочего, значительным поЕЫшением концентрации ЕР в сыворотке крови (Э.Ван Лир,К.Стикнеи,1967). Есть данные о том,что в клинических

условиях кислородная недостаточность усиливает желтуху у новорожденных детей (Е.А.Таболин,1967), Г экспериментах на новорожденных животных установлено,что при острой несовместимой с жизнедеятельностью оргетпма аноксии очаговые кровоизлияния,возникающие г головном мозге при агональных клонических судоро-гах.служат местами образования и накопления кристаллов ЕР {H.Chen . ,l-M Lien ,V-CLLu ,1965; F.Hat/ог Л Payed , J. -¿ta £¿«¿,1985). Еозникновение билирубиноеой энце-

фалопатии у недоношенных новорожденных детей при сравнительно невысокой концентрации ЕР в плазме кроЕИ как правило сопровождается синдромом дыхательной недостаточности {L.M^cxtC'iez ,' R.tf. S/u/de.t, $.g.Cha<fan ,1970). .Молекуляр-

ный механизм проиоходякего при гипоксии нарушения обмена ЕР, накопления этого билидиена в голоеном мозге в этих условиях остается до сих пор невыясненным.

Цель данного исследования.

В сеязи с вышеизложенным цель данного исследования заключалась в проверке на адекватной экспериментальной модели клинических наблюдений,согласно которым кислородная недостаточность у недоношенных новорожденных детей, сопровождается нарушенями обмена ЕР.накоплением его в головном мозге,для выяснения молекулярного механизма таких нарушений и устранения их фармакологическими средствами.

Основные задачи исследования.

I.Разработать способ получения стандартных и стабильных при хранении препаратов ЕР,иммобилизованного е сохранявшей натате-ность плазматической мембране клеток головного мозга жиеотных на основе данных о:

1)кинетике связывания ЕР частицами плазматической мембраны in viirc и происходящих при этом изменениях спектрально-люминесцентных характеристик билидиена;

2)еозможных изменениях активности Na+,К+,АТФазы и.ацетилхо-линэстеразы (АХЭ),а текже термокинетических характеристик этих ферментов е плазматической мембране при связывании ею IP in

Vitr0 ;

3)обратимости зтих ожидаемых изменений при высвобождении ЕР из мембранных частиц in viirc в присутствии мономерного освобожденного от органофильных лигандов сыгороточного альбумина человека (САЧ);

'Офотодинамической активности ЕР е состаЕе плазматической мембраны и загисимости этой актиЕности от физико-химических параметров среды in viirc .

2.Разработать метод количественной оценки функциональной активности сывороточного альбумина, с вязанной с взаимодействием этого белка и находящегося е сохраняюшей натирность плазматической мембране клеток голодного мозга жиеотных ЕР, in vitro , при использовании

^стандартных по седиментационным и спектрально-люминесцентным характеристикам,по содержанию ЕР,по удельной активности Na+,К+-АТ'5азы и АХЭ.по термокинетическим характеристикам этих эстераз.по фотодинамическим эффектам е отношении данных мембранных ферментоЕ и стабильных при хранении препаратов желчного пигмента,иммобилизованного в частицах плазматической мембраны клеток головного мозга жиеотных;

2)данных о динамике образования комплекса ЕР-альбумин при высвобождении билидиена из содержащих его частиц плазматической мембраны е присутствии мономерного освобожденного от органо-фильных лигандов САЧ in viirc при разных комбинациях водородного показателя и ионной силы среды в пределах,совместимых с нормальной жизнедеятельностью клеток и тканей млекопитающих.

3.Исследовать динамику изменений, концентрации ЕР в плазме кро-еи и активности катализирующей. образование ЕР ферментной системы (гемоксигеназы) в головном мозге и в селезенке подопытных жиеотных при хронической кислородной недостаточности,используя е качестве экспериментальной модели белых крыс,подвергаемых гипоксической. гипоксии в условиях декомпрессии.

Исследовать функциональную активность сыгороточного альбумина интактных и подрергнутах гипоксии в условиях декомпрессии животных,связанную со способность» этого белка извлекать ЕР, иммобилизованный в плазматической мембране клеток головного мозга in vitro ,и зависимость этой способности от присутствия связанных с сывороточным белком органофильных лигандов.

5.Исследовать

1)влияние умеренной гипоксической гипоксии при нормальном барометрическом давлении.воспроизводимой е течение пре- и неона-тального периодов,на содержание ЕР,на активность гемоксигеназы в голоеном мозге беременных крыс и ноЕорожденных крысят,на способность сывороточного альбумина связывать находящийся е плазматической мембране клеток головного мозга ЕР if viirc ;

2)заЕисимость данной способности сывороточного альбумина от присутствия связанных с белком летучих и нелетучих лигандов;

б.Иесдедовать возможность фармакологической коррекции нарушений, возникающих у подопытных жиеотных при гипоксии.воспроизводимой в течение пре- и неонатального периодов.

Для решения перечисленных задач в работе были применены следующие методы физико-химического анализа биологического материала,его препарации и разделения:

Ювыделение популяции частиц синаптосомальной мембраны (СМ) из гомогената головного мозга животных посредством дифференциального и изоплотностного центрифугирования е сочетании с препаративным электрофорезом мембранных частиц в градиенте плотности сахарозы (А.В.Ткаченко,1972);

2)выделение из коммерческих препаратов ЕР фракции 1Хо£ -изомера билидиена экстракционным методом Ш.МеЗЬолфдЬ , Р- Олг^с , 1972) или препаративной тонко-слойной хроматографией

ш. МсЯепадк , Е СШЫ ,1971);

3)выделение интактного альбумина из сыворотки крОЕИ животных' методом фракционного ЕЫсалиЕания сульфатом аммония при р^о 4,5-5,4 с последующей колоночной хроматографией белкового препарата на ДЭАЭ-сефарозе и колоночной фильтрацией на 2Р-сефа-дексе,сефадексе ^-25 или сефадексе Ц-100 ЯоМЛеШ , У.ММозепоег, ^¿./^/<«,1967);

4)препаративное выделение мономерного сывороточного альбумина мектрофорезом е полиакриламидном геле (А.Е.Ткаченко;1989);

5)химическии способ получения мономерного сывороточного альбумина (А.В.Ткаченко,1966);

6)метод получения В?,иммобилизованного е СМ (А.Е.Ткаченко, 1990);

7)визуализация электрофоретического разделения белковых фракций в видимом свете препаратами глобулярных белков,связанных с про-ционовыми красителями (А.Е.Ткаченко,1984);

8)очистка сывороточного альбумина от органофильных лигандов (А.Е.Ткаченко,В.И.Емельяненко,1987; А.Е.Ткаченко,1990);

9)определение исходного общего содержания органофильных лиган-дов в интактном сывороточном альбумине с помощью метода экстракции в регулируемом непрерывном протоке (А.Е.Ткаченко,Е.И.Горин, 1986; А.Е.Ткаченко ,1990);

10)аналитичесгкая тонко-слойная хроматография для контроля за чистотой.- выделенного -изомера

1971);

И)аналитический микроэлектрофорез белков сыворотки крови животных а применением обработки гелевых фореграмм проционовым красителем ярко-синего ЯЗ для количественного определения белковых фракций (А,Е.Ткаченко,1969);

12)спектрофотометрический метод количественного определения сывороточного альбумина в водных растворах (/91/ , Л/./М/л&г ,1970);

13)спектрофотометрический и спектрофлуориметрический методы количественного определения Н> е сыворотке кроЕи.в экстрактах гомогенэта голоеного мозга животных и в водных растворах {МЯе/пег .Хи.ТЬота* ,1962; Ъ.С!Ьеп .ШЗ-.Й.Въос/еым, 1979);

14)исследоЕание кинетики Езаимодействия ЕР и сывороточного альбумина е родном растЕоре спектрофотометрическим титрованием р еидимой части спектра ]асо£леп . Т^/^йегсА ,1980) и ультрацентрифугированием с использованием Н^-меченого билидие-на ед , М.^Нипбеь ,1970). Лля определения констант связывания (констант ассоциации,Ка) ЕР молекулами сыЕоро-точного альбумина использогали изотермы стехиометрического связывания (П.В,СергееЕ,1982) и координаты Скэтчерда

{Н,Е. ЙаеАёлъы-, т.м /<(?о£г. ,1982; ¿.Ты¿а М-^а^а. 1985);

15)калиброванный по яичному альбумину колориметрический метод количественного определения общего содержания мембранных белков с использованием кумасси Д-250 (М-М. ВёаЛ/сгЛ,1916) ;

16)калиброванный по пальмитиновой кислоте колориметрический метод количественного определения неэстерифицироьанных жирных кислот (М \rJe-icje6 ,1956);

17)калиброванный по ацетллхолину или мехолину колориметрический метод определения активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ) е частицах синаптосомалъкой мембраны (СМ) клеток головного мозга животных. Удельную активность АХЭ измеряли в мкмолях аце-тилхолинв,разрушавшегося за I мин инкубации суспензии мембранных частиц при СН25О 7,2,в расчете на I мг общего содержания мембранных белког;

18)калиброванныи по неорганическому фосфату метод определения АТФазной актиЕности е частицах СМ клеток головного мозга животных (fl.IV'.¿¡¡ЬсШ ,1976); А.К. Бабко,А.Т.Пилипенко,1968) с применением уабаина (5 х Ю-4*!!) Для избирательного подавления активности |>||а+,К+-АТФазы. Обшую удельную АЙазную активность

и удельную активность ,К+-АТ§азы измеряли е мкмолях неорганического фосфата,накапливавшегося за I мин инкубации суспензии мембранных частиц е присутствии АТ§ при-рР^о 7,2,в расчете на I мг обшего содержания мембранных белков.

При определении термокинетических характеристик На+,К+-АТФазы и АХЭ е частицах СМ клеток головного мозга животных измерения удельной активности мембранных эстераз производили в диапазоне температур от 10,0 до 30,0° (рН 7,2) с интервалами е 0,5° с последующим определением температур переходов е аррениусовых координатах.Для расчетов,связанных с определением кажущейся внергии активации (Эк) Ма+,К+-АТФазы и АХЭ е частицах СМ.использоЕали формулу:

2,3 хЯ х Тг х Т2 х^ КгДг

е которой К = 8,314 Дж/моль с заменой констант скорости ферментативных реакций и ^ на определяемые непосредственно в экспериментах величины удельной активности мембранных эстераз (Е.К.Воробьев,1975; И.В.Березин,А.А.КлеооЕ,197б) ;

19)калиброванный по 1Х»С -изомеру ЕР спектрофотометрический метод определения активности катализирующей образование Н5 ферментной системы (гемоксигеназы) е надосадочной жидкости (20000о ) гомогената голоеного мозга еиеотных (/V./?. Р!тЛспе, Я. ТеМанеп Т.^е/бг , Зе/м7!</ ,1971). Удельную активность гемоксигеназы измеряли в нмолях ЕР,образующегося за 10 мин инкубации анализируемой пробы при 37°,е расчете на Ю мг общего содержания белков е пробе;

20)калиброЕанный по гемоглобину метод определения содержания крови е голоеном мозге животных (А.В.Ткаченко,1963).который Еместе с количественным определением гемоглобина в кроЕИ й ЕР

г сыЕоротке кроЕИ позволял определять количество ЕР в находившейся е мозге кроЕи; •

21)метод определения функциональной активности сывороточного альбумина (А.Е.Ткаченко,1990);

22)метод разделения и идентификации экстрагируемых органофиль-ных лигандов сывороточного альбумина жиеотных тонко-слоВной хроматографией с применением родамина (А.Е.Ткаченко,1988).

Исследования были проведены на белых крысах Бистар (25С животных). Еыбор данного вида жиеотных для экспериментальной модели был обусловлен,е частности,тем,что характер еозникэюших у рождавшихся глубоко незрелыми крысят нерушений кр0Е00брасе-ния е голоеном мозге при гипоксии.сопровождавшихся закислением ткани мозга,аналогичен характеру таких нарушений у глубоконедоношенных детей (Т.П.1укоЕа,198гО. Размеры помета у крыс е данной, работе колебались е пределах от 5 до II крысят. Масса тела рождавшихся крысят составляла в среднем 5 г. Е зависимости от сезона года и особенностей рациона относительное количество мертворожденных крысят у интактных беременных жиеотных контрольной группы колебалось е пределах от 0 до 3%. У подвергаемых гипоксическому воздействию беременных крыс подопытное группы эта величина достигала к-5%.

ДостоЕерность полученных при проведенных измерениях средних арифметических еэличин для той или иной статистической совокупности и разницы этих величин оценивали с помошью i-критерия по таблице Поморского для n ¿ 30, считая результаты измерений и соответствующих расчетоЕ достоверными при возможной ошибке (р) не Еыше 5,С% (М.К.Мостковый,1954).

Научная новизна.

Использованные е исследовании экспериментальные модели позволили е опытах if) vitro и in vivo подтвердить клинические наблюдения,свидетельствующие о том,что кислородная недостаточность у недоношенных детей способствует нарушению обмена ЕР, накоплению его е голоеном мозге. Впервые установлено,что молекулярный механизм данного нарушения при воспроизведении умеренной гипокси.ческой гипоксии в течение пре- и неонатального периодов, заключается б:

1)поЕышении активности катализирующей образование TP ферментной системы, (гемоксигеназы) е головном мозге беременных животных

и в появлении активности данной ферментной системы в мозге новорожденных жиеотных;

2)нарушении осуществляемого сыгороточным альбумином транспорта IP в результате избыточного сеязыеэния этим белком-транспортером неэстерифицированных высших жирных кислот и ацетальдегида, выражающемся,в частности .утратой альбумином способности сеязы-Еать 1? .находящийся е плазматической мембране клеток голоеного мозга;

3)ацидотических сдигах ео внутренней среде организма,способ-ствующих сравнительно прочной фиксации мо-лекул ЕР,их димериза-ции и агрегации е плазматической мембране клеток головного мозга.

Впервые ЕЫЯЕлен неизвестный до сих пор аспект фармакологического действия oi-токоферола,ЕЕе^ение которого жиеотным способствует,как оказалось, очистке молекул сывороточного альбумина от избытка упомянутых СЕязыЕаемых им низкомолекулярных органофильных лигендоЕ,'нормализуя способность альбумина сеязы-еэть находящийся в плазматической мембране клеток головного мозге ЕР. Зтот обнаруженный е данной работе аффект «¿-токоферола потенцируют никотинамид, оксибутират натрия и трисамин.

Апробация работы и публикации.

Результаты данной работы были представлены на II Есесоюзном биохимическом съезде (г.Таяжент,19б9),на III Есесоюзном биохимическом съезде (г.Рига,1974),на заселениях Ленинградского отделения Есесомзного биохимического общестЕа (Ленинград,1983, 1984),на Международном симпозиуме с участием стран СЭЕ и СФРЮ по физико-химическим свойствам биополимеров (г.Пущино,1985), на XII Есесоюзном совещании по транспортным АТФазам'(г.Ирку тек,1987),на III Есесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (г.Харьков,1988),на III Есесоюзной конференции Еиоантиоксидант (г.МоскЕа,1989),на научных конференциях Университета им.Е.-М.Арндта (г.Грайфсвальд,Германия, 1976,1989),на Научном совещании Института биотехнологии АН МНР и Министерства здравоохранения МНР по проблемам региональной патологии (г.Улан-Батор,Монголия,1989),на Международном симпозиуме по фототерапии (г.Трассенхайде,Германия,1989),на Университетской конференции по неонатальной патологии (г.КонЕей-сити.США, 1979),на семинарах Лаборатории медицинской биофизики Института биофизики клетки АН СССР (г.Пушино,Г991),на научных конференциях кафедры детских болезней )£2 II МОЛМИ (г.МоскЕа,1989,1991), на согместном семинаре Лаборатории медицинской биофизики и Лаборатории радиационной биофизики Института биофизики клетки (г.Пушино,1991),на совместном семинаре Лаборатории медицинской биофизики Института биофизики клетки АН СССР и Лаборатории функциональной нейрохимии Института теоретической и экспериментальной биофизики АН СССР (г.Пуцино,1991).

Диссертация обобщает результаты исследований,проведенных на основе II защищенных авторскими свидетельствами изобретений и

и представленных е СЕЫпе 60 публикациях е научных журналах, сборниках и патентных изданиях.

Результаты и их обсуждение.

Взаимодействие билирубина с частицами сикапгосональной мембраны клеток голоеного мозга животных и высвобождение его из мембранных частиц е присутствии сывороточного альбумина человека in v i ¿гс .

Ключевое значение для экспериментальной проверки высказанного выше предположения о нарушении связанной с транспортом билирубина (ЕР) способности сывороточного альбумина извлекать этот билидиен и з плазматической мембраны продуцирующих его клеток при кислородной недостаточности имела разработка несуществующего до настоящего времени метода,который позеолил бы е опытах in vitro количественно оценивать данную способность сывороточного белка-транспортера. В качестве экспериментальной модели при разработке такого метода была использована плазматическая (синаптосомальная) мембрана клеток головного мозга крыс.

ИзЕестно.что нервные клетки голоеного мозва е условиях би-лирубиноЕой интоксикации организма новорожденного ребенка оказываются Еесьма чувствительными к токсическому действию ЕР. Возбудимая плазматическая мембрана нейроноЕ является той субклеточной компонентой,е которой неизбежно оказываются молекулы ЕР .поступавшие е клетки извне или,напротив,высвобождающиеся из них ео Енеклеточное пространство. Находящийся е нейронах Н5 посредством аксоплазматического потока может поступать в нейрональные окончания (Q.B&nd , L. Jahnrsan ,1959),оказывая при этом повреждавшее действие на участвующую в формировании межнейрональных контактов плазматическую-,синаптосомаль-ную (СМ),мембрану. Существующие методы препарации позволяют получать пригодную для биохимического анализа популяцию частиц СМ из гомогената головного мозга жиеотных (А.Е.Ткаченко, 1972).

Для разработки упомянутого метода необходимо было прежде Есего разработать способ получения стандартных и достаточно стабильных при хранении препаратов ЕР,иммобилизованного в частицах СМ. Для этого было целесообразным исследовать кинетику СЕЯЗыЕания ЕР частицами CM in vitro .возможные функциональные изменения (например,изменения активности и некоторых термоки-

кетических параметров (\!а+,.К+-АТФазы и АХЗ) е СУ, при сгязыЕа-нии ею молекул желчного пигмента,а также фотодинамические эффекты е отношении активности названных мембранных ферментов, связанные с внедрением ЕР е частицы СМ.

Еажно было при этом найти такие величины содержания ЕР е частицах СМ, при которых ожидаемые изменения активности упомянутых мембранных эстераз е частицах СМ.ЕЫЗЫЕаемые иммобилизацией молекул желчного пигмента-в мембранных частицах, были бы обратимыми при удалении из них билидиена. Такая обратимость данных функциональных изменений свидетельствовала бы о сохранении чаатицами СМ е соответствующей, мере своей нативности. Для этого нужно было провести эксперименты по изучению динамики высвобождения ЕР'йз содержащих его частиц СМ' в присутствии сывороточного альбумина при разных комбинациях водородного показателя и ионной силы еодной среды в пределах,совместимых с нормальной жизнедеятельностью клеток.и тканей млекопитающих.

. Связывание ЕР частицами СМ при спектрофотометрическом титровании 14 мкМ ЕР е 0,15 М NaCI.phpqo 7,2.суспензией мембранных частиц сопровождается постепенным преобразованием спектра поглощения видимого света свободным билидиеном с единственным максимумом при 438-440 нм е характерный,как это было установлено е данной работе,для связанного мембранными частицами желчного пигмента спектр со сдеигом- максимума в длинноволновую область (к 460 нм) и с возникновение!) сначала плеча,а затем второго максимума е области 480-510 нм.

Связывание ЕР частицами CM in vitro сопровождается заметным усилением возбуждаемой при 430 нм очень слабой флуоресценции свободного желчного пигмента с единственным максимумом излучения е области 530-540 нм.

При высвобождении билидиена из мембранных частиц в присутствии избытка сывороточного альбумина человека (САЧ) спектр поглощения видимого света связанным чаатицами СМ желчным пигментом преобразуется в спектр,характерный для IP,связанного молекулами САЧ,с исчезновением.максимума в области 480-510 нм, но с сохранением максимума при 460 нм и с возникновением небольшого плеча в области 430 нм. Спектрофотометрия в видимой области спектра хлороформных экстрактов мембранных частиц,еы-деленных из годной суспензии фильтрованием или центрифугированием после такого преобразования,присутствия ЕР в них не обнаруживает. Спектр поглощения видимого се'ета водной средой., освобожденной от. мембранных частиц,сохраняет при этом полностью

конфигурацию спектра,характерного для ЕР,связанного молекулами САЧ.

Оптимальный водородный показатель среди для связывания Б? частицами СМ хп чНга составляет 6,8-7,2 (20-22°).

При изменениях температуры среды, в пределах, от 0° до 50° наиболее интенсивное связывание Б? частицами СМ происходит при 0°,а наименее интенсивное- при 50°,'Количество ЕР.связываемого частицами СМ,при температуре среды.5-22° составляет 79-76% от количества этого билидиена.СЕЯЗыЕаемого ими при температуре 0°.

При температуре 20-22° оптимальная продолжительность инкубации чоатиц СМ в присутствии 1Г для связывания ими молекул желчного пигмента без слишком большой агрегации последних в мембранных частицах составляет 2-4 мин.

Практически полное высвобождение I? из частиц СМ в водную среду (в отсутствие сыгороточного альбумина) происходит при за-щелачиЕании суспензии содержащих желчный, пигмент частиц СМ до рН 8,4. При последующем закислении суспензии еноеь происходит связывание высвободившегося билидиена мембранными частицами. При ограничении последовательных изменений водородного показателя суспензии пределами от рН 8,0 до рН 7,2 такие обратимые переходы ЕР из свободного е срязанное мембранными частицами состояние-в зависимости от защелачивания или,напротив,закисле-ния суспензии можно,как оказалось,воспроизводить многократно. Однако после закисления суспензии до рН 4,6-4,2 частицы СМ необратимо утрачивают способность сеязыеэтъ ЕР Ене зависимости от последующих изменений.водородного показателя среды.

Этот обнаруженный е данной работе феномен обратимых переходов Б? из свободного в связанное мембранными частицами состояние в зависимости от изменений, водородного показателя среды в указанных пределах был также использован в дальнейшем е качестве одного из покааателей иатиЕНОСти частиц СМ.

Аналогичные обратимые переходы молекул I? из связанного частицами СМ в связанное молекулами САЧ состояние в зависимости от водородного показателя среды оказалось еозможным наблюдать (по результатам спектрофотометрического титрования- е комбинации с фильтрованием суспензии для выделения содержащих билиди-ен или, напр_отие, освобожденных от него мембранных частиц) при пвсдедоЕательных изменениях этого показателя е пределах соответственно от рН 7,0 до рН 7,6 (20°). Для многократного воспроизведения таких переходов критическое значение имеет,как

показали эксперименты,молярное соотношение САЧ и ЕР в суспензии содержащих данный желчный пигмент частиц СИ,которое не должно превышать 1:30.

Полученные при спектрофотометрическом титровании изотермы стехиометрического связывания свидетельствуют о том,что е частицах СМ,суспензированных е годной среде,есть,по меньшей мере, единственный тип центров связывания молекул ЕР с константой ассоциации (Ка) порядка 8 х Ю^"^ (рН22° 7,2). При изображении результатов ти.троЕания е координатах Скэтчарда (М.^гегга. С. .£. Рап/гв! ,^.Запо1ь1 ,1974) в части-

цах СМ удается идентифицировать,по меньшей мере,два типа центров сеязыеэния ЕР. Б расчете на общее содержание мембранных белков максимальное количество ЕР.аЕЯЗЫЕаемого центрами одного из этих типое,состаЕЛяет 5 нмоль/мг при Ка~6 х 10 ¡.Г . Для центров второго типа это количество составляет 7 нмоль/мг при

К~2 х 1СЛГ1.

а

В СЕежих интактных частицах СМ общая удельная АТФазная активность .уделнная активность Иа+,К<"-АТ$азы и АХЭ (см.стр.9-10) составляет соответственно 4,0^0,12 (п=13), 3,1+0,09 (ю=16) и 8,5+0,15 (/1=16). В содержащих ЕР частицах СМ (например,при содержании связанного желчного пигмента в расчете на массу лиофилиаированных мембранных частиц 2,0 нмоль/мг) общая удельная АТФазная активность .удельная активность Ма+.К^-АТФ-азы и АХЭ оказываются пониженными в среднем соответственно на 20 (р<0,1Я), 35 (р^О.Ш и В% (р<£1,($) в сравнении с ферментной-активностью в свежих интактных мембранных частицах. После удаления желчного пигмента из чаатиц СМ е результате 1-чаС0Е0й инкубации в темноте суспензии содержащих, билидиен мембранных частиц е присутствии избытка САЧ при р^о 7,5 общая удельная АТЗ?азная активность и удельная актиЕНССть АХЭ практически не отличались от. ферментной активности как е свежих интактных частицах СМ,так и в не контактироваЕших с мембранных частиц,инкубированных е присутствии САЧ. Удельная активность Ма^К^АТФазы после удаления ЕР из частиц СМ указанной инкубацией практически не отличалась от ферментной активности в СЕежих интактных мембранных частицах,но оказывалась несколько выше (р< 5,0$),чем в не контактировавших с желчным пигментом,но инкубированных е присутствии САЧ частицах (3,2+ 0,16).

Измерения удельной активности №а+.К^-АТФазы и АХЭ е части-

цах СМ при изменениях температуры среды в пределах от 10,0 до 30,0° с интервалами в 0,5° показали,,чм е свежих интактных мембранных частицах имеет место единственный переход в температурной зависимости удельной активности Ма+ ,К+-АТФазы в ар-рениусоЕых координатах при 21,04-0,4° (п=14). В содержащих I? частицах СМ точка перехода этой зависимости оказывается сдеи-нутой (р^1,0Я к. 19,0+0,5° (П=Ю). После удаления ЕР из содержавших его мембранных частиц упомянутой инкубацией их в присутствии избытка САЧ (рЬ^о 7,5) температура перехода фикси-■ руется при 19,5+0,3° (п=13),т.е.не ЕОЗЕращается к исходной величине (р< 1,0$), тогда как после такой же инкубации интактных (не контактировавших о ЕР) частиц СМ в присутствии САЧ температура перехода в сравнении с температурой перехода в СЕежих интактных частицах СМ остается без изменений (21,0+0,7°, П=15).

Аналогичные измерения удельной активности АХЭ показали,что Е свежих интактных частицах СМ имеет место единстЕенный переход е температурной зависимости удельной активности данного фермента в аррениусовых координатах при 20,0+0,2° (п=14). В содержащих ЕР частицах СМ температура перехода оказывается сдвинутой (р<5,0$) к 19,5+0,1° (п=10). После удаления билиди-ена из мембранных частиц упомянугой инкубацией их в присутствии избытка САЧ (р^оО 7,5) температура перехода возвращалась к исходной величине (20,0+0,3°, П =10). При такой же температуре находилась точка перехода в температурной зависимости удельной активности АХЭ е интактных (не контактироЕвЕших о ЕР) частицах СМ после инкубации их е присутствии САЧ (20,0+0,4°, П =15).

Определяемая Еыше температур переходов калящаяся энергия активации (Эк) |ч|а+,К+-АТ§азы и АХЭ (см.стр. 10) е СЕежих'интактных частицах СМ' составляла соответственно 45,43+5,3 (п=14) и 15,28+1,40 кДж/моль (л=14). Определяемая ниже температур переходов Эк для -- ^а+.К^-АТФазы и АХЭ в свежих интактных частицах СМ составляла соответственно 94,60+6,2 (ц=14) и 39,64+2,0 кДж/моль ((1=14). При внедрении ЕР в частицы СМ величина Эк,определяемая для- Ма+,К+-АТ$азы и АХЭ при температурах Еыше точек переходов,практически не отличалась от величины Эк для .этих эст.ераз в свежих интактных частицах СМ,определяемой в том же температурном диапазоне.

Инкубация содержащих ЕР или интактных (не контактировавших с ЕР) мембранных частиц' е присутствии избытка САЧ (рН£20 7,5) существенных изменений величины 3 для указанных мембранных

эстераз не ЕЫЗЫЕала.

Внедрение молекул Н* I частицы СМ сопровождается существенным увеличением определяемых при температурах ниже точек переходов геличин Зк для Ма+,К+-АТ$азы Се среднем на 67$, р<0,Й) и для АХЭ (в среднем на 44$, р<0,1$) в сравнении с величинами Эк для этих ферментов в свежих интактных частицах СМ.определяемыми е том же температурном диапазоне.

После удаления ЕР из частиц СМ инкубацией, их е присутствии избытка САЧ (рН22° 7,5) определяемые при температурах ниже точек переходов величины Эк для ,К+-АТ$азы и для АХЭ остаются повышенными в среднем соответственно на 34 (р<.1,0#) и 20% (р<1,0#) в сравнении с величинами Эк для этих эстераз е сее-жих интактных мембранных частицах,а также повышенными е среднем соответственно на 25 (р<5,0$) и 21% (р<5,0#) в сравнении с

величинами Э„ для данных ферментов в интактных (не контектиро-к

евеших с ЕР) частицах СМ после аналогичной инкубации их в присутствии избытка САЧ (в последних величины Эк для эстераз практически не отличались от величин Эк для этих ферментов в свежих интактных чаатицах).

Обнаруженное понижение удельной активности На+,К+-АТ$азы и АХЭ при внедрении 1Р в частицы СМ 1п \ziiro обусловлено,еозмож-но,проникновением липофильных молекул желчного пигмента е гидрофобное окружение этих мембранных эстераз,агрегацией молекул билидиена е-этом окружении,в результате чего ограничивается доступность активных центроЕ ферментоЕ для молекул соответствующих субстратов. При содержании ЕР е-частицах СМ 2,0 нмоль/мг (сй.стр.1§) вызываемое внедрением желчного пигмента е' частицы СМ уменьшение удельной активности названных эстераз является обратимым: после удаления билидиена из мембранных чаатиц их темн0Е0й. инкубацией е присутствии избытка САЧ (р^0 7,5) удельная активность этих ферментов полностью нормализуется.

Обнаруженное при указанном содержании В? е частицах СМ увеличение Зк для (^а+,К+-Айазы и для АХЭ,определяемой при темпера-1урах ниже 19,0-20,0° (точки переходов),так же,как и вызываемый внедрением билидиена в мембранные частицы сдвиг точки перехода е температурной зависимости удельной активности Ма+,К+-АТФазы.оказывается.напротив,необратимым. Не исключено,что этот эффект обусловлен повреждающим действием ЕР на СМ,сопоставимым с дейстЕием анионогенных детергентов на митохондриальную мембрану (Ь. Егп^беЬ ,1961). Обнаруженное необратимое повреждаю-

сее действие ЕР на СМ удалось избежать определенным уменьшением содержания желчного пигмента в мембранных частицах.

В следующей серии экспериментов изучали фотодинамические эффекты молекул ЕР в составе частиц СМ в отношении активности Ма+Х-АТ5азы и АХЭ.

После 30-минутной инкубации суспензии содержащих желчный пигмент частиц СМ в термостатированной при 1С0 (рИ 7,2) стеклянной ячейке общая удельная АТФазная активность и удельная активность f\|a+,Kt"-ATï>a3H оказывались пониженными (здесь и далее- в сравнении с ферментной активностью е свежих интактных мембранных частицах) в среднем на 15% (р<1,0%). Через 2 час последующей инкубации постоянно и энергично перемешиваемой суспензии в темноте (10°) обшая удельная .АТФазная активность и удельная активность На+,К+-АТФазы оказывались пониженными е среднем соответственно на 30 и 2.4% (р<5,С#). При непрерывном облучении постоянно и энергично перемешиваемой суспензии содержащих желчный пигмент частиц CM (pHjQO 7,2) синим СЕетом (люминесцентная лампа 1Г-40) е-течение 90 мин после упомянутой. 30-минутной темновой преинкубации удельная активность Ма+,К+-АТ$азы оказывалась пониженной в среднем на 90% (р<С.ЕО. Общая удельная АТФазная активность до такого уровня понижалась в течение 75 мин непрерывного облучения перемешиваемой суспензии (р< 1,0,1).

Добавление к суспензии содержащих ЕР частиц CM (pHjQO 7,2) избытка мономерного содержащего органофильные лиганды САЧ способствовало более быстрому ЕызыЕаемому непрерывным облучением понижению удельной активности Na+.К^-АТФазы и обшей удельной АТФазнои активности.

Производимое непосредственно перед началом' облучения подщела-чиЕание суспензии содержащих желчный пигмент мембранных частиц до pHjqO 7,8 е существенной 'мере замедляло вызываемое облучением уменьшение удельной активности На+,К+-АТ§азы. Это связанное с подщелачиванием суспензии содержащих ЕР частиц СМ замедление ЕызыЕаемого непрерывным облучением ее уменьшения удельной активности ^а^.К^-АТФазы оказывалось более заметным после' добавления в подщелоченную суспензию мономерного йнтактного (содержащего органофильные лиганды) САЧ.и еще более заметным после добавления е нее мономерного освобожденного от органо-фильных лигандов САЧ.

После 30-минутной темноЕой преинкубации суспензии содержащих ЕР частиц СМ (рН^фО 7,2) удельная актиЕность АХЭ остаЕа-

лась практически без изменений (здесь и далее- е сраЕнении с ферментной активностью е свежих интактных мембранных частицах). Через 2 час последующей инкубации постоянно и энергично перемешиваемой суспензии е темноте (10°) удельная актиЕНОСть этой мембранной эстеразы оказывалась пониженной р среднем на Ш% (р < 5, СЙ).

В течение пергых 30 мин облучения синим огетом постоянно и энергично перемешиваемой, суспензии содержащих ЕР частиц СМ (рН^о 7,2) удельная активность АХЭ практически'не изменялась, но затем довольно быстро понижалась и через 2 час непрерывного облучения оказывалась пониженной в среднем на 60-68$

Добавление к суспензии содержащих БР мембранных частиц мономерного нагавного.(содержащего органофильные'лиганды) САЧ (рН^рО 7,2) заметно ускоряло вызываемое облучением уменьшение удельной, активности АХЭ.

.Производимое непосредственно перед облучением подщелачиЕание суспензии содержащих желчный, пигмент частиц СМ до рН^о 7,8 в существенной мере замедляло вызываемое облучением уменьшение удельной, активности АХЭ. Связанное с подщелачиЕанием суспензии замедление вызываемого облучением уменьшения удельной, активности АХЭ оказалось более значительным после добавления к суспензии мономерного содержащего органофиланые лиганды САЧ и еще более значительным после добавления к ней мономерного освобожденного от органофильных лигандов САЧ.

Обнаруженная е данной серии экспериментов фотодинамическая активность ЕР,иммобилизованного е частицах СМ,обусловлена,надо полагать.взаимодействием возбуждаемых видимым (синим) светом молекул сеязвнного мембранными частицами желчного пигмента с молекулами находящегося в среде триплетного кислорода. Такое взаимодействие Еедет к образование и накоплении синглехного кислорода (СкМе'&спсхдЬ ,1971),сопряженному с образованием и накоплением продуктов интенсивного пероксидирования мембранных липидое,с глубокой деструкцией частиц клеточной мембраны ,1984).

В данном исследовании производимое непосредственно перед началом облучения суспензии содержащих № частиц СМ (рН^о 7,2) синим светом продолжительное барботирование ее аргоном или добавление I такую суспензию ©(-токоферола до конечной, концентрации его 20 мкМ (тоже непосредственно перед началом облучения) предотвращали ЕЫЗЫЕаемое облучением уменьшение удельной

активности Na+,K+-Aï$a3ij и АХЭ.связанное с фотодинамической активностью желчного пигмента в составе мембранных частиц. Замедление вызываемого облучением суспензии содержащих ЕР частиц СИ уменьшения удельной активности мембранных эстерез.обнаруженное после под'делачиЕания суспензии до pHjqO 7,8,обуслов-лено ,по-Еидимому .тем ,что при таком'подщелачигании происходит ■усиленное высвобождение билидиена из мембранных частиц (см. стр.15). Молекулы свободного ЕР s водной среде фотодинамических эффектов не оказывают (А.Е.Мыикин,Е.Н.СахероЕ,1982). Присутствие е подщелоченной суспензии содержащих ЕР частиц СМ мономерного нативного (содержащего органофильные лиганды) САЧ, способствуя более энергичному высвобождению молекул желчного пигмента из содержавших их мембранных частиц,более эффективно зашишает мембранные эстеразы от фотолинамической активности билидиена. Еще более сильный протектируимгий е данном отношении эффект оказывает присутствие е суспензии мономерного освобожденного от органофильных лигандог САЧ,более энергично связывающего молекулы высвобождающегося из мембранных частиц били длена и способствующего тем самым еще более энергичному освобождению частиц СМ от желчного пигмента.

Е связи с вышесказанным интерес представляют данные,согласно которым сывороточный, альбумин способен проявлять антиокси-дантную активность (А.И.Арчаков,П.М.МохосоеЕ,1989). Однако в отношении фотодинамической активности ЕР,иммобилизованного в СМ,молекулы сыророточного альбумина могут оказывать не только протектируюший,но и-прямо противоположный эффект. Присутствие в суспензии содержащих желчный пигмент частиц СМ мономерного нативного (содержащего органофильные лиганды) САЧ при F%o° 7,2 усиливает связанную с фотодинамической активностью иммобилизованного е мембранных частицах ЕР инактивацию мембранных эс-тераз. Не исключено,что такой эффект обусловлен дополнительным включением в упомянутый процесс пероксидирйрания связанных с нативным САЧ ненасыщенных жирных кислот,среди которых Еетущее место занимает олеиновая кислота Са.Таррве ,1973; U. Ktagh-Н0.П6СП ,1990). Следует особо отметить,что наиболее быстрое уменьпение удельной активности Na+ .К^-АТФазы и АХЭ в содержащих ЕР частицах СМ в данном исследовании имело место при облучении синим СЕетом суспензии мембранных частиц е присутствии мономерного натиЕного (содержащего органофильные лиганды) САЧ после подкисления ее до pHjqO 6.8.

Полученные в описанных сериях экспериментов результаты позволили установить принципиальную возможность взаимодействия молекул ЕР с частицами CM in vii.ro и возможные молекулярные механизмы повреждающего воздействия на плазматическую мембрану нейрональных окончаний молекул этого билидиена е стабильном или возбужденном видимым (синим) сгетом состоянии. Вместе с некоторыми полученными ранее данными (А.Г.Ткаченко, 1972) результаты этих экспериментов позволили выработать регламент получения стандартных по стоим седиментационным и спектрально-люминесцентнйм характеристикам,по удельной активности и термокинетическим параметрам Na+,K+-AT§a3u и АХЭ,а также по содержанию желчного пигмента и по его фотодинамической актиЕНОСти препаратов I? .иммобилизованного в СМ. Результаты проведенных экспериментов позволили найти оптимальные условия для длительного хранения таких препаратов и для работы с ними. Найденные условия обеспечивают достаточную физико-химическую стабильность связанного мембранными частицами билидиена.

Не менее важной при этом оказалась проблема функционально-морфологической стабильности частиц СМ до и после связывания ими молекул ЕР. Используя полученные данные о центрах связывания ЕР е частицах СМ (см.стр.16),возможность многократного связывания билидиена частицами СМ и высвобождения его из-них в зависимости от водородного показателя среды в присутствии САЧ или е отсутствие этого белка (см.стр.15),а также степень обратимости изменений удельной активности и термокинетических параметров Na+,Kf-AT$a3H и АХЭ е частицах СМ при связывании ими ЕР (см.стр.16-19-) е качестве показателей, функционально-морфологического состояния мембранных частиц in vitro .удалось найти условия гзаимодейстЕия их и билидиена,обеспечивавшие сохранение частицами СМ своей исходной натигности (по данным показателям) при связывании ими молекул желчного пигмента.

Полученные в одной из этих серий экспериментов результаты исследования елияния сывороточного альбумйна на фотодинамическую активность ЕР были использоеэнь ддя создания гелее0г0 фотодозиметра. В отличие от сушествуюших разнообразных применяемых е фототерапии по погоду желтухи новорожденных детей моделей,е созданном фотодозиметре е качестве СЕеточуЕстЕИтельного элемента используется комплекс ЕР-САЧ, находящийся е гидрофильном геле биологического происхождения. Этот гель имитирует некоторые механо-химические параметры дермы,а Еодородный показатель и ионная сила среды совместимы а нормальной жизнедеятельностью

клеток и тканей млекопитающих. Созданный е данной работе геле-еый фотодозиметр может быть использован для определения оптимальных (р зависимости,например,от количества применяемых для фототерапии источников света и их интенсивности) режимов фотолечения и их стандартизации,а также для поиска фармакологических средств,способных потенцировать ео внутренней среде организма лечебный эффект фотооблучения детей.

Е следующей серии экспериментов изучали связанное с высвобождением ЕР из суспензированных в еодной среде частиц СМ в присутствии мономерного освобожденного от органофильных лиган-дое САЧ образование комплекса ЕР-САЧ при изменениях Еодородно-го показателя и ионной силы среды, е- пределах,совместимых с нормальной жизнедеятельностью клеток.'и тканей млекопитающих. Интенсивность процесса образования-"комплекса е суспензии мембранных частиц сравнивали с. кинетаКли.'1 образования .такого же комплекса при взаимодействуй- 'Бр^й .-альбумина !е гбмогешгом' водном растворе при. прочих-'сопос$вр#мы'х-'усЛб£иях..' , ; В качестве растворителя' е- этиЗ^. Экспериментах испоЯьзорали- 50 мМ фосфат-цитретный буфер (рН '6.или, 7,5).? В-качестве . вариантов ионной силы испол550Еали'р«,ст1арителй;(литенная>ч N801 среда), 0,135 М, ОД^- ^Гилй^.Дбз'^.^аС!' в указанном; растворителе (е некоторых опытах^изуере-ния' -проводили 'в'..0-,30-'!"':, N601). ' '' "' • ' Л V-

По результатам дифф-еренциальной спектрсф'отометрии. прй. титроЕа- ' нии растЕора САЧ (3 х 10_7М) раствором ЕР (2 х 10~®Я)',в лишенной МаС1 среде при рН 6,8 (л=6), 7,2 (п=6) или 7,5 (п=6) определяемая посредством изотерм стехиометрического связывания Ееличина константы ассоциации (К&) ео Езаимодействии мономер-ного--овободного от. органофильных лигандов САЧ и желчного пигмента была практически одинаковой.и составляла соответственно (1,3+0,40)104 (1,3+0,30)Ю7 и (1,й-0,31)107 М-1. Добавление . е растворы МаС1 еплоть до .концентрации С,30 М при рН 6,8 существенных изменений величины Ка в сравнении с ее величиной при титроЕании е лйшенной №С1 среде не вызывало.

При рН 7,2 изменение величины Ка (увеличение ее е ^ 10 раз, р <5,0$),связанное с добавлением е растворы МаС1,имело место лишь^при уЕеличении концентрации ИвИ до 0,165 М (л=6).

При рН 7,5 связанное с добавлением е растворы N«01 изменение величины К0 (увеличение ее в~5 раз, р<5,0$) имело место лишь при повышении концентрации МаС1 до 0,150 или 0,165 М (Л=6).

Аналогичные изменения величины Ка е зависимости от указанных комбинаций водородного показателя и ионной силы среды обнаружили при исследовании кинетики взаимодействия ЕР и мономерного лишенного органофильных лигандоЕ САЧ е гомогенном еодном растворе методом ультрацентрифугироЕания смеси сыеороточного белка и fP-меченого желчного пигмента е разных молярных соотношениях (см.стр.9).

При изображении полученных данных в координатах Сэктчарда е .большинстве разнообразных комбинаций указанных величин водородного показателя и ионной силы (концентрации NaCI) среды в молекулах мономерного очищенного от органофильных лигандоЕ САЧ удалось идентифицировать единственный тип центров связывания ЕР,для которого К как правило колебалась е пределах от 1,7 х 10^ до'6,7 х 10^ ;ГГ,но. повышалась в среднем до 1,1 х 10®-1,8 х 10® при титровании в среде.лишенной NaCI или содержащей NaCI е концентрации от С,135 до 0,30 М, при рН 7,5. Идентифицировать е молекулах САЧ существование,по меньшей мере, двух типов центров связывания ЕР удалось при титровании е 0,150 М или в 0,165 М NaCI при рН 6,8 или рН 7,2,а также при титровании в 0,150 М NaCI при рН 7,5. Величина KQ для центров одного из этих типое составляла в среднем 0,9 х I0®-3,0 х 10® а для центров второго типа она составляла е среднем 2,0 х 10^-4,0 х I07 М-1.

Е расчете на массу сывороточного альбумина количество ЕР,связываемого центрами первого типа,было постоянным и составляло I моль/моль. Количество .ЕР,связываемого центрами Еторого типа, колебалось в пределах от 3 до 5-моль/моль-,достигая максимума при взаимодействии белка и желчного пигмента е 0,150 М NaCI (рН 6,8, 7,2 или 7,5),а также при их взаимодействии в 0,165 М NaCI при рН 7,2.

При изменениях годородного показателя и ионной силы среды, далеко выходящих за пределы физиологической нормы,сывороточный альбумин проявляет определенную конформационну ю подеижность, связанную с общеизвестными структурными переходами белка (£. В?а.иег Наг mats. ,1972). Полученные в настоящем исследовании .приведенные выше данные .СЕИдетельотЕувт.Е частности, о том,что конформационная подеижность-молекул САЧ может иметь место при изменениях названных физико-химических параметроЕ оредЕ'е Еесьма узких пределах,совместимых с нормальной жизнедеятельностью клеток и тканей млекопитающих (Д,Пол.1963). Проявлением такой подеижности могли бы служить описанные Еыше

четкие изменения количества типов центров связывания молекул ЕР е сывороточном альбумине .идентифицируемых при указанных изменениях еодородного показателя и ионной силы среды. Не исклю-чео.что обнаруженные изменения обусловлены маскирующим или,напротив, демаскирующим центры связывания эффектом происходящих при этом изменений эллиптичности молекул альбумина (Ц■ Beaten, aJ'QCiü. WJ/uktiei" ,1973),плотности их упаковки (Jf^atCitk, J. МсаеЪ ,1983). С возможной конформационной подвижностью САЧ могут'быгь связанны и обнаруженные'(хотя и неоднозначные) изменения Ка при взаимодействии ЕР и САЧ в водном растворе .вызываемые определенными изменениями водородного показателя и ионной силы среды. Однако изменения указанных параметров взаимодействия ЕР и САЧ в в од нем растворе могут буть обусловленными и такими факторами кинетики гомогенных химических реакций,как изменения степени протонировения участвующих е связывании молекул желчного пигмента функциональных групп в составе альбумина (например, e-NHg-rpynn лизиявных остатков с аномально низкой величиной рК),изменения степени экранировки таких групп ионами СГ~ ,а также происходящая при изменениях концентрации fJaCI е среде стабилизация или .напротив, дестабилизация гидрофобных взаимодействий,которые вместе с электростатическими взаимодействиями играют ведущую роль в сеязыеэнии ЕР сывороточным альбумином (В- Hofitee. ,1975; U. Кгау h-Hanse n.llül').-

При изучении динамики образования комплекса ЕР-САЧ в результате ЕыСЕобождения желчного пигмента из суспензированных в 50 мМ фосфат-цитратном буфере (лишенная NaCI среда) частиц СМ в присутствии мономерного очищенного от органофильных лигэндое альбумина (е среднем 0,8.мкМ) оказалось,что в такой среде максимальная концентрация ЕР .связанного молекулами САЧ ,по выходе процесса образования названного комлекса на плато насыщения при pH 6,8 или 7,2 практически одинакова и составляет в среднем 4,5%,тогда как при pH 7.5 она поЕыпена (р<0,1#) и составляет, в среднем 15,5? от исходной концентрации иммобилизованного е мембранных частицах билидиена (в среднем 1,1 мкМ).

При pH 6,8 или 7,2 конфигурация спектров поглощения еидимо-го света ff,иммобилизованным в частицах СМ,и оптическая плотность суспензии содержащих этот желчный пигмент, мембранных частиц ео всем диапазоне производимой спектрофотометрии (390-540 ни) практически одинаковы. На спектрах есть дев максимума соответственно при 460 нм и (менее выраженный) при 490 нм. Возникновение максимума при 460 нм обусловлено внедрением молекул

билидиена е гидрофобные участки клеточной мембраны (например,е мембранные липиды), тогда' как возникновение Еторого максимума (при 490 нм) обусловлено димеризациеи и агрегацией, молекул ЕР, связанных мембранными частицами (S%, Нод&ока. ,'М.С?омдеъ t 1978; a.Wceb/f ,J..Chcwdho.ty ,1, Qz/ai ,1983),чего практически не происходит г водном растворе при концентрации ЕР, использованной, для описанного выше спектрофотометрического титрования (R.Bzccktien , 1966; Q. faudsen,Ci&det*e.n .R.BtaJet-ien Д986; H,8atc ', B.Monetd , П Btoc/etxten, 1988), "При pF 7,5 оптическая плотность суспензии содержащих ЕР частиц СМ е интервале от 410 до 490 нм значительно возрастает е сравнении с тем,что имеет место при рН 6,8 или 7,2. Максимум поглощения света при 460 км сохраняется.тогда как максимум при 490 нм сглаживается и превращается е слабо выраженное плечо. Такие изменения спектра поглощения видимого света гогорят о том,что подшелачивание суспензии .содержащих ЕР частиц СМ до рН 7,5 способствует дезагрегации молекул желчного пигмента,агрегирующих на мембранных частицах при рН 6,8 или 7,2. Дезагрегация молекул ЕР способствует взаимодействию их с молекулами сывороточного альбумина (А.Е.Мышкин,В.Н.Сахаров,1982). Не исключено,что именно этим обстоятельстЕом обусловлено более интенсиное.чем это имеет, место при рН 6,8 или 7,2, образование комплекса ЕР-САЧ при рН 7,5,тогда как величина KQ при спектрофотометрическом титровании е лишенном MaCI еодном растворе при рН 6,8, 7,2 или 7,8 была практически одинаковой (см.стр,23). Исследование процесса образования комплекса ЕР-САЧ е результате ЕысЕобождения желчного пигмента из частиц СМ в присутствии сывороточного белка е лишенной или содержащей NaCI среде при рН 6,8 показало,что наиболее интенсивное образование данного комплекса имело-место в лишенной NaCI среде: максимальная концентрация связанного молекулами САЧ билидиена составляла е среднем 4,5-5,5$ от исходной концентрации иммобилизованного в мембранных частицах желчного пигмента.. При рН 7,2 связанное о высвобождением ЕР из частиц CM е присутствии САЧ образование комплекса ЕР-САЧ в содержащей NaCI среде происходило более интенсиЕНО.чем е среде,лишенной (4аС1. Максимальная концентрация ЕР,связанного молекулами САЧ,е 0,135, 0,150, 0,165 или 0,30 М l^aCI была практически одинаковой и составляла е среднем 9,1% от исходной -концентрации сеязэнного мембранными частицами билидиена.

При рН 7,5 наиболее интенсивное образование комплекса ЕР-САЧ,

связанное с высвобождением желчного.пигмента из частиц СМ в присутствии альбумина,имело место в-0,150 М MaCI: максимальная концентрация ЕР,связанного молекулами САЧ,достигала е среднем 34,1$ от исходной концентрации иммобилизованного р мембранных частица билидиена.

При всех перечисленных вариантах (см.стр.23) образование комплекса ЕР-САЧ в суспензии частиц СМ при рН 7,5 было более интенсивным,чем при рН 7,2,и еще более интенсивным,чем при рН 6,8, тогда как наиболее Еысокая KQ для связывания ЕР молекулами-САЧ в гомогенной еодной среде (е среднем 1,0 х 10® М'-'О.по результатам спектрофотометрического титроЕания (см.стр.23),была найдена при их взаимодействии в 0,165 М NaCI ,рН 7,2.

Е этой же серии экспериментов были получены спектры поглощения видимого СЕета суспензией содержащих ЕР частиц СМ е 0,150 • М NaCI (рН 7,5). при титровании ее 1,0 х 10"3М САЧ (рН 7,5). Исходная концентрация иммобилизованного е мембранных частицах билидиена- составляла 2,0 х Для-происходившего в процес-

се титрования постепенного превращения исходного спектра поглощения света связанным частицами СМ желчным пигментом г конечный спектр поглошегая СЕета связанным молекулами сыЕороточного альбумина билидиеном оказалось постоянным наличие четко выраженной изобестической точки е области 510 нм. Последняя сви-дельствовала о том,что переход ЕР из связанного с частицами СМ е СЕЯзанное с САЧ состояние е результате проведенного титрования осуществлялся без накопления е среде каких-либо промежуточных продуктов,е частности,без накопления свободного билидиена. Полученные результаты говорят о том,что связанное с высвобождением ЕР из частиц СМ е присутствии мономерног.о очищенного от органофильных лигандов САЧ образование комплекса ЕР-САЧ происходит в результате ЕзаимодейстЕия сывороточного белка как со спонтанно- ЕЫОЕобождающимая Из мембранных частиц' билидиена (концентрация свободного ЕР е среде при этом,как показали дополнительные измерения.не превышала 7,0 х 10~®М),так и,по гсей вероятности,непосредственно (и преимущественно) с иммобилизо-Еанным е мембранных частицах желчным пигментом-. Взаимодействию альбумина непосредственно с иммобилизованным в мембранных частицах ЕР в существенной мере способствует происходящая при рН 7,5 дезагрегация молекул связанного ими билидиена (csf.cTp.26).

- На основании упомянутого регламента получения стабильных стандартных препаратов желчного пигмента,иммобилизованного

г сохраняющей (по названным выие показателям) исходную натив-ность СМ,и на основании вышеизложенных результатов изучения взаимодействия ЕР и сыЕороточного альбумина как в гомогенной водной среде,так и в водной суспензии содержащих этот желчный пигмент мембранных частиц при разных сочетаниях различных величин Еодородного показателя и ионной силы среды в пределах,совместимых с нормальной жизнедеятельностью клеток и тканей млекопитающих,был разработан метод определения связанной с транспортом I? функциональной активности сывороточного альбумина in vitro .

Этот метод заключается в дифференциальной спектрофотометрии (420-510 нм) инкубируемой суспензии содержащих ЕР частиц СМ до и после введения в нее исследуемого альбумина. Количественной оценкой функциональной активности сывороточного белка служит максимальная концентрация связанного его молекулами ЕР,определяемая по выходе процесса образования комплекса IP-альбумин на плато насыщения в стандартных условиях эксперимента и выражаемая в процентах относительно исходной концентрации связанного мембранными частицами билидиена.

Влияние хронической гипоксической гипоксии на связанную с транспортом билирубина функциональную активность сывороточного альбумина in vitro .

В качестве экспериментальной модели в данной серии опытов были использованы Езрослые крысы.которых подвергали хронической прерывистой гипоксической гипоксии по 7-10 час в сутки ежедневно 6 дней в недели при 20-22° в течение 8 недель в условиях декомпрессии,соответствовавшей-подъему животных на высоту 8,5 км. Указанной-степени декомпрессии крыс,составлявших подопытную группу.подвергали после 3-4 дней постепенного понижения атмосферного давления в барокамерах: в 1-й день до 550, ео 2-й день до 450, на 3-й день- до 350,на 4-й день и далее- до 260-240 мм рт.ст. Необходимую степень разрежения воздуха в барокамерах создавали со скоростью 25 мм рт.ст. в I мин. Контрольную группу составляли интактные крыси,находившиеся в барокамерах по 7-10 час е сутки ежедневно 6 дней е неделю при 20-22° Е течение 8 недель е условиях нормоксии при обычном атмосферном давлении.

Доступ жиеотных контрольной и-подопытной групп к корму и'литьевой воде Е течение суток во время всего хронического Эксперимента был синхронным.

Сопровождавшая реактивный эритроцитоз гипербилирубинемия у крыс подопытной группы прогрессировала параллельно сроку гипо-ксического воздействия лишь в течение первых 4 недель хронического эксперимента. К концу этого срока концентрация ЕР е сыЕоротке крови у подопытных жиеотных повышалась (р<0,Й) в среднем с 17 (у интактных крыс контрольной группы) до 72 мкМ. Б течение последующих 4 недель гипоксического воздейстгия концентраций ЕР,несмотря на сохранявшийся реактивный эритроцитоз, понижалась (р<1,0$) е среднем до 47 мкМ. Вызываемые хронической гипоксией изменения концентрации ЕР е сыворотке кроЕи подопытных крыс происходили при практически постоянной концентрации альбумина в ней в течение всех 8 недель эксперимента (концентрация этого белка колебалась при этом е среднем е пределах от 2,6 до 3,5%). Определяемая спектрофотометрическим методом с применением колоночной фильтрации через сефадекс LH-20 (J.ft. O-sbtcw ,М.Н.Мигр!н{,1910') общая концентрация моно- и диглюкуронида ЕР в сыворотке крови крыс подопытной и контрольной групп в течение 8 недель эксперимента не превышала 0,4 кт%.

Дополнительное к алиментарному введение с^-токоферола жиеотным подопытной группы 2 раза в день рег <н в дозе 6-8 и II—17 мг/кг до и после сеанса гипоксического воздействия предотвращало происходившие у них через 6-8 недель эксперимента понижение концентрации ЕР в сыЕоротке кроЕи,способствуя тем самым сохранению значительной гипербилирубинемия на поздних сроках экспериментальной кислородной недостаточности.

Удельная активность гемоксигеназы (см.стр.10) .точнее, катализирующей образование ЕР ферментной системы из микросомной гемоксигеназы и NADPH-зэеисимой биливердинредуктазы цитозоля в селезенке и в головном мозге у интактных крыс контрольной группы составляла соответственно 10,3+0,1 (п=8) и 3,0+0,04 (п=8). У подопытных крыс удельная активность гемоксигеназы в селезенке оказывалась повышенной (е среднем на 1%, р<5,0$!) уже после перЕых 2 недель гипоксического воздействия и оставалась практически без изменений на достигнутом поЕышенном уроЕ-не е течение Есех последующих 6 недель эксперимента. В голоеном мозге удельная актиЕность данной ферментной системы оказывалась повышенной (е среднем на 7%, р<1,0#) лишь после первых 4 недель эксперимента,но в течение последующих 4 недель гипоксического воздействия оставалась практически тоже без изменений на достигнутом повышенном урогне.

Полученные результаты с учетом ослабления экскреции ЕР из организма при гипоксии в условиях декомпрессии,соответствующей подъему на высоту не меньше 5,0 км (Э.Ван Лир,К.Стикней,1967), позволили заключить,что обнаруженное у крыс через 6-8 недель гипоксического воздействия понижение концентрации ЕР в сыворотке крови (после значительной гипербилирубинемии на более ранних сроках эксперимента) в какой-то мере обусловлено,вероятно,нарушением осуществляемого сывороточным альбумином транспорта ЕР е системе циркуляции из периферических продуцирующих данный билидиен клеток в гепатоциты. Такое нарушение должно иметь своим следствием накопление ЕР в продуцирующих его клетках, е частности,в обладавших такой способностью клетках головного мозга. Предполагаемое нарушение транспорта ЕР сывороточным альбумином может иметь в СЕоей основе утрату этих белком присущей ему способности связывать этот билидиен,находящийся е плазматической мембране продуцирующих его клеток. Для оценки указанной способности сывороточного альбумина крыс контрольной и подопытной групп был применен разработанный е данном исследовании метод определения функциональной активности сывороточного альбумина ^-¿го (см.стр.26-27). Процесс образования комплекса ЕР-альбумин в суспензии содержащих желчный пигмент частиц СМ в присутствии мономерного ин-тактного (содержащего органофильные лиганда) сывороточного альбумина крыс контрольной или подопытной группы выходил на плато насыщения в течение первых 60-80 мин инкубации анализируемых проб.

При использовании альбумина сыворотки крови крыс контрольной группы (П=15) максимальная концентрация ЕР,связанного молекулами сывороточного белка,составляла в среднем от исходной концентрации иммобилизованного в мембранных частицах билидиена. При использовании сывороточного альбумина крыс подопытной группы (п=15) через 2 недели гипоксического воздействия-активность белка в связывании ЕР.находящегося в частицах СМ,оказалась е среднем на 12% ниже (р<5,0$) активности белка у крыс контрольной группы. '

Е течение последующих 2 недель гипоксического воздействия ак-тиеноств сывороточного альбумина у крыс подопытной группы (И=15) оставалась практически без изменений на данном- пониженном уровне. Однако через б недель гипоксии в условиях декомпрессии активность альбумина у крыс подопытной группы 01=15) оказывалась пониженной (р<1,0#) в среднем на 21%,а через 8

недель (п=15)-е среднем на 34$ (р<0,1$) е сравнении с активность ю сыЕороточного белка у крыс контрольной группы.

В расчете на массу сыЕороточного альбумина обшее содержание экстрагируемых смесью этанол-хлороформ(6:1 объем/объем) неэсте-рифицированных еысших жирных кислот е мономерной фракции белка у крыс контрольной группы не превышало 3 моль/моль.тогда как у крыс подопытной группы оно было повышено (р<1,0) в среднем 'до 6-8 моль/моль. Химический состав экстрактов альбумина при этом анализировали тонко-слойной хроматографией на пластинах SVéuj(св (Чехословакия) с проявлением хроматограмм родамином при 50-60°. Е качестве метчиков использовали препараты пальмитиновой,стеариновой и олеиновой кислот,капроновой,лаури-новой кислот,лецитина,холестерина,цетилового спирте, трипальми-тина и метилового эфира стеариновой кислоты. После производимой in viéro очистки сыЕороточного альбумина жи-еотных контрольной или подопытной группы от органофильных ли-ганяов (см.стр.8) общее содержание экстрагируемых неэстерифици-роЕанных еысших жирных кислот в мономерных фракциях белка не превышало 0,002 моль/моль.

Определяемая in vi tro активность очинённого от органофильных лигандов мономерного сывороточного альбумина крыс контрольной группы или подвергнутых гипоксии в условиях декомпрессии в течение 2, 4, 6 или 8 недель крыс подопытной группы е связывании ЕР,находящегося е частицах СМ,оказалась практически одинаковой и в среднем на 85$ преЕЫпала (р-с0,1$) активность содержащего органофильные лиганды мономерного альбумина крыс контрольной группы. После инкубации in vi tro (30-37°) очищенных от органофильных лигандов препаратов альбумина крыс контрольной или подопытной группы е присутствии пальмитата.стеарата и/или олеата натрия е указанных выше молярных соотношениях данная активность мономерного сыЕороточного белка приближалась к эктиености содержащего органофильные лиганды мономерного альбумина жиеотных контрольной группы,но Есе-таки оставалась, е среднем на 20-40$ Еыше (p.£l,0$) последней.

Активность мономерного содержащего органофильные лиганды сыЕороточного альбумина крыс контрольной и подопытной групп,получавших об-токоферол (см.стр.29).оказалась практически одинаковой и не отличалась от активности мономерного содержащего органофильные' лиганды альбумина у не получавших o^-токоферола животных контрольной группы,но значительно превышала (р 4.1,0$) активность альбумина у не получавших его жиеотных подопытной

гру ппы.

Таким образом,применение разработанного е донном исследовании метода определения связанной с транспортом ЕР функциональной актиЕности сывороточного альбумина ia vibro (см.стр.27-28) позеолило установить,что при хронической гипоксии в условиях декомпрессии сывороточный альбумин у подопытных взрослых крыс устрачиЕает присущую ему способность связывать молекулы ЕР,находящиеся в частицах СМ, Такая утрата е значительной мере обусловлена избыточным связыванием альбумином in vivo неэстери-фицированных высших жирных кислот. Она может быть устранена либо производимой in vibre очисткой сывороточного белка от орга-нофильных лигандоЕ,либо (в меньшей мере) ЕЕедением подвергаемым гипоксии животных сравнительно высоких доз «(-токоферола. При комбинации с(-токоферола с некоторыми другими фармакологическими препаратами оказалось,что обнаруженный эффект его могут потенцировать никотинамид и оксибутират натрия (или лития).

Влияние пре- и неонетальной кислородной недостаточности на обмен билирубина Е головном мозге- беременных крыс и новорожденных крысят. •

I'качестве экспериментальной модели е данной серии опытое использовали беременных крыс,которых за 2,0-2,5 недели до предполагаемого срока родоЕ подвергали гипоксической гипоксии при нормальном барометрическом давлении (22-25°) по 7-10 час. в сутки ежедневно 6 дней е неделю (беременные крысы подопытной группы). Для этого жиеотных помешали е вентилируемые камеры (эксикаторы) .снабженные поглотителями влаги,COg и NHg. F таких камерах поддерживали постоянный проток (8 л/час) смеси атмосферного воздуха и сухого бескислородного азота с пониженной до 910$ концентрациеи О^.что соответствовало подъему крыс на высо-' ту 5j8-6,7 км. Химический состаг газовой смеси на входе е камеры и на Еыходе из них контролировали с помошью газоанализатора ВТИ-2. СостеЕЛЯЕШие контрольную группу беременные крысы во Ере-мя таких сеансов находились е аналогичных камерах в условиях нормоксии при нормальном барометрическом давлении без доступа к корму и питьевой годе. По завершении каждого сеанса гипоксии животные контрольной и подопытной групп находились в обычных условиях со свободным доступом к корму и питьевой воде. Родившихся у жиеотных подопытной группы крысят Е течение первых 2 дней неонетачьного. периода подвергали (сразу после очередного кормления) двум длиешимся по 5 чао в сутки сеансам гипоксии то-

го же режима при 37° (крысята подопытной группы). Крысят,родившихся у животных контрольной группы,на гремя таких сеансов изолировали и содержали е условиях нормоксии и нормального барометрического давления при 37° (крысята контрольной группы). Сразу по завершении последнего сеанса гипоксии крысят обеих групп умерщвляли декапитацией под легким эфирным наркозом (в серии опытов аналогичным образом умерщвляли беременных животных по завершении 2,0-2,5-недельного гипоксического воздействия). Части беременных крыс подопытной группы перед каждым сеансом гипоксии вводили petoi «С-токоферол е дозе 11—17 мг/кг и нико-тинамид в дозе 0,6 мг/кг. После каждого сеанса гипоксии этим крысам повторно ееодили oí-токоферол е дозе 6-8 мг/кг. Через каждые 2-3 дня крысы данной группы получали Енутрибрюшинно ок-сибутират натрия е дозе 100 мг/кг. Кроме того,беременным животным этой группы через каждые 2 дня внутривенно ееодили трисамин (из расчета 1,5 мл I,ü М растЕора препарата на I кг массы тела). Названные препараты в указанных дозах и в указанном режиме взрослые крысы продолжали получать е течение первых 2 дней вскармливания родившихся у них крысят.

Перечисленные препараты е таких же дозах и в таком же режиме получала часть беременных животных контрольной группы.

Гистологически в срезах головного мозга перенесших пре- и неонвтальную гипоксию новорожденных крысят обнаруживали венозную гиперемию,диапедезный еыход единичных эритроцитов,умеренные дегенеративные изменения в нервных клетках с пролиферацией макро- и микроглии е палеокортексе и в безальных ганглиях без оча-гоеых кровоизлияний. Дегенеративные изменения в нервных клетках неокортекса были Еыражены Еесьма слабо.

Для фракционирования гомогената головного мозга беременных крыс и новорожденных крысят исПользоевли схему.примененную для фракционирования белков нео-,палеокортекса и полосатого тела головного мозга жиеотных (А.В.Ткаченко,1969,1970,1972). Ео . фракции,получаемой экстракцией остатка гомогената (после удаления растворимых в 0,03' i< KCl белков,е том числе и белкоЕ находившейся в мозге крови) раствором Еебера. (рН^о 9,2), спектрофо-т.ометрией е видимом области спектра обнаружили поглощение СЕета с максимумом в области 440 нм. Спектрофотометрически и спектро-флуориметрически (при добавлении в экстракты мономерного свободного от органофильных лигандов САЧ,рН22° 7,7) идентифицировали присутствие в данной фракции ЕР. Присутствие эгого желчного пигмента ео фракциях,получаемых экстракцией остатка гомогена-

та головного мозга раствором Вебера.было подтверждено положительно к реакцией с диазореактиЕОМ (метод Еан ден Берга),спект-трофотометрией хлороформных экстрактов остатка гомогената мозга до и после удаления упомянутой фракции,а также тонко-слойной хроматографией этих экстрактоЕ на силикагеле с использованием 'е качестве метчика препарата 1Хо£-изомера ЕР (см.стр.8).

Сухой остаток голоеного мозга у беременных крыс,а также у новорожденных крысят обеих групп был практически одинаковым и ' колебался е пределах от 19 до 25?. Е расчете на-Елажную массу • ткани концентрация ЕР е головном мозге (с учетом количества би-лидиена е находившейся в мозге кроЕи- см.стр.Ю) у получаЕших (¿-токоферол,никотинамид.оксибутират натрия и трисамин или не получавших эти препараты беременных крыс контрольной группы бы-> ла практически одинаковой и составляла соответственно 0,07+ 0,009 (п=8) и 0,09+0,005 (п=12) нмоль/г. В голоеном мозге крысят контрольной группы концентрация ЕР была практически одинаковой и составляла соотЕетсТЕенно 0,20^0,01 (л=8) и 0,19+0,01 (п=12) нмоль/г.

У не получавших с<-токоферол,никотинаиид,оксибутират натрия и трисаиин беременных крыс и крысят подопытной группы концентрация ЕР в головном мозге оказалась е среднем соответственно е 1,2 (р<1,0® и в 1,5 (р£5,0$) роза выше,чем у животных контрольной группы. Введение животным подопытной группы названных препаратов практически полностью нормализовало концентрацию ЕР е голоеном мозге как у беременных крыс,так и у.новорожденных крысят.

У получавших с(-токоферол,никотинамид,оксибутират натрия и трисамин или не получавших эти препараты беременных крыс контрольной группы водородный показатель цельной крови (22°) был практически одинаковым и составлял соответственно 7,46+0,05 (П=7) и 7,4*1+0,06 (п=5). Водородный показатель цельной кроЕи у крысят этой группы был практически тоже одинаковым и-составлял соответственно 7,48+0,08 (л-=13) и 7,40+0,02 (п=12).

Гипоксия указанного режима изменений водородного показателя цельной крови у получавших или не получавших перечисленные выше . препараты беременных крыс подопытной группы практически не вызывала (в сравнении с данным показателем у беременных крыс контролвной группы), Водородный, показатель цельной кроЕИ крысят,родившихся у не получавших препараты животных подопытной группы,оказался в среднем-на 0,19 единицы рН ниже (р-¿1,0$),чем у крысят контрольной группы. Введение .«^-токоферола,никотинами-

да.оксибутирата натрия и трисамина Езрослым животным подопытной группы полностью предотвращало возникновение некомпенсированного ацидоза у рождавшихся крысят;

У получавших о(-токоферол,никотинамид, оксибутират натрия и трисамин или не получавших эти препараты беременных крыо контрольной группы удельная активность катализирующей образование ЕР гемоксигеназы (см.стр.Ю) в головном мозге составляла соответственно 2,4+0,06 (л=8) и 2,7+0,02'(п=6), Активность гемоксигеназн в головном мозге крысят,родившихся у животных этой группы, практически отсутствовала.

Гипоксия указанного режима Еизыгала у не получавших перечисленные Еыше препараты беременных крыс подопытной группы увеличение удельной активности гемоксигеназы в мозге е среднем на 15$ (р<0,1$) в сравнении о активностью ферментной системы е мозге беременных крыо контрольной группы. Б головном мозге крысят, родившихся у не получавших препараты животных подопытной группы,удельная активность' гемоксигеназы составляла 2,3+0,70 (п=14). Введение взрослым животным подопытной группы «¿-токоферола, ни-котинамида.оксибутирата натрия и трисамина на активность- гемоксигеназы в мозге у них и у-рождавшихся крысят никакого влияния практически не оказывало.

При работе с выделенными препаратами сывороточного альбумина новорожденных крысят.особое внимание уделяли удалению из них возможной примеси ©¿-фетопротеина,который,яеляясь по СЕоему аминокислотному составу углеЕОД-солержащим гомологом альбумина, тоже обладает способностью СЕЯзыгать ЕР М. ¿ерра. С&. ,1979) со сравнительна высокой величиной К ао6 Для этого применяли колоночную хроматографию на

комплексе сефароза 4В-кднканавалин А ( ЛГ. иСсусЛ ,1970),при-которой о6-фетопротеин,если он присутствовал в белкоЕЫХ препаратах,в элюат не еыходил (Н. '¡ЬеиЫсН ,1978). Отсутствие «¿-фе-топротеина в содержащей сывороточный альбумин порции элюата подтверждали электрофорезом-в полиакриламидном- геле Кеъск<хег1, В. Вскдагс/. £ Ои;е/.¿^./З/зегЬлЧЧЪ).

¡При тонко-слсгйной хроматографии этанол-хлороформных экстрактов сывороточного альбумина родиЕшихся у не получавших упомянутые выше препараты жиеотных крысят подопытной группы (см.стр. 3]) среди экстрагируемых нелетучих органофиль'ных лигандоЕ идентифицировали сравнительно большое количество неэстерифицироЕан-ных высших жирных кислот. Кроме них,в экстрактах в качестве минорных фракций присутствовали фосфолипиды,холестерин (или еыс-

шие спирта),триглицериды и неидентифицированные субстанции, хроматографическая подеижностб которых, была близка подеижности Эф'ИрОЕ еыоших жирных кислот или СТерИДОЕ.

Г экстрактах содержащего органофильные лиганды сывороточного альбумина беременных крыс или 'новорожденных крысят, подопытной группы,не получавших препараты.пробой с о-дианизидином и флуорометрическои прйбой с о-фенилфенол£м в присутствии Иа!^

,1977) обнаружили присутствие ацетальдегида (экстракты для анализа получали обработкой сывороточного белка 10^-ным раствором трихлоруксусной кислоты или хлорной кислотой при -10°). Присутствие ацетальдегида в экстрактах белка подтвердил газохроматогрефический анализ равновесной паровой фазы

(С.Ег/каоп.Н.^'рр^б' , О.FctM.ii-

о1ег,19П).

В расчете на массу сывороточного альбумина содержание экстрагируемого ацетальдегида в белке получавших ©(-токоферол,никотин-амид, оксибутират натрия и трисамин или не получавших эти препараты беременных крыс контрольной группы,по результатам газохро-матографического анализа,составляло соответственно 0,04+0,012 01=14) и 0,07+0,003 (п=14) моль/моль. Е альбумине крысят,родившихся у животных этой группы,содержание ацетальдегида составляло соответственно 1,0+0,3 (п=14) и 1,3+0,4 01 = 14) моль/моль. Содержание экстрагируемого ацетальдегида в интакт-ном альбумине не получавших препараты новорожденных крысят подопытной группы превышало (р41,0$) содержание его в альбумине крысят, контрольной группы е среднем в 3,5 раза,а у беременных крыс-подопытной группы,не получавших препараты,оно превышало (р<5,0$) содержание ацетальдегида в альбумине беременных крыс контрольной группы е среднем в 1,8 раза.

Обшее содержание экстрагируемых неэстерифицированных еысших жирных кислот (е расчете на массу сывороточного альбумина) в интактном сывороточном- белке получавших оС-токоферол,никотин-амид, оксибутират. натрия и трисамин беременных крыс контрольной группы или не получавших эти препараты беременных крыс той же группы составляло соответственно 2,0+1,3 (п=13) и 4,0+0,8 01=13) моль/моль. В интактном (содержащем органофильные лиганды) альбумине крысят,родившихся у животных данной группы,оно составляло соответственно 3,0+0,5 (п=14) и 2,0+0,5 (п=14) моль/моль. В интактном альбумине не получавших препараты беременных крыс подопытной группы общее содержание экстрагируемых неэстерифицированных высших жирных кислот превышало (р<1,0#)

их общее содержание в интактном альбумине беременных крыс контрольной группы в среднем р 2,7 раза. Е интактном сывороточном альбумине крысят,родившихся у не получавших препараты животных подопытной группы.,обшее содержание экстрагируемых не-эстерифицированных высших жирных кислот было в среднем в 2,8 больше (р4.5,0$),чем в альбумине .крысят контрольной группы.

После производимой iin vitro очистки сывороточного альбумина беременных крыс или новорожденных крысят обеих групп от орга-нофильных лигандов (см.стр.8) общее содержание экстрагируемых неэстерифицированных еысших жирных кислот в белке не превышало 0,002 моль/моль,а содержание экстрагируемого ацетальдегида не превышало 0,007 моль/моль. Практически полностью отсутствовали остальные из упомянутых минорных фракций лигандов,обнаруживаемых при тонко-слойной хроматографии этанол-хлороформных экстрактов альбумина.

Е интактном (содержащем органофйльные лиганды) сывороточном альбумине беременных крыс подопытной группы,получавших е<-то-коферол,никотинамид,оксибутират>натрия и трисамин,общее содержание экстрагируемых неэстерифицированных высших жирных киелот оказалось пониженным (р<5,0$) др 5,0+0,7 (п=13) моль/моль,а содержание экстрагируемого ацетальдегида пониженным (р<5,0$) до 0,06+0,008 0l=l3) моль/моль. У родившихся в данной группе животных крысят общее содержание экстрагируемых неэстерифицированных высших жирных кислот в интактном сывороточном альбумине оказалось пониженным (р4 5,0$) до 3,0+0,3 (п=14),а содержание экстрагируемого ацетальдегида пониженным (р<1,0$) до 1,0+0,6 (п=14) моль/моль.'

В расчете на массу сывороточного альбумина содержание эндогенного связанного с интактным сывороточным белком экстрагируемого ЕР у получавших о(-токоферол,никотинамид,оксибутират натрия и трисамин или не получавших эти препараты беременных крыс контрольной группы' составляло соответственно 79+29 (п=8) и 39+11 (п=8) ммоль/моль. В интактном альбумине крысят,родившихся у животных этой группы,содержание эндогенного связанного с белком экстрагируемого ЕР составляло соответственно 70+22 (п=17) и 52+10 (и=17) ммоль/моль. Содержание эндогенного связанного с интактным-сыЕороточном альбумином экстрагируемого ЕР в белке беременных крыа подопытной группы,не получавших перечисленные препараты,и в белке родившихся у таких животных крысят оказалось в среднем соответственно в 3,7 (р<0,1$) и а 1,6 (р<5,0$) раза выше,чем у животных контрольной группы. У получавших с/-то-

коферол.никотинамид.оксибутират натрия и трисамин беременных крыс или крысят подопытной группы оно оказалось е среднем соответственно на 53 и 80? Еыше (р< 5,0?),чем у не получвЕШих препараты животных подопытной группы.

Для определения связанной с транспортом ЕР функциональной активности сывороточного альбумина in vitro применяли разработанный. в данном исследовании метод (см.стр.26-27). По полученным этим методом результатам,при использовании мономерного ин-тектного (содержащего органофильные лиганды) сывороточного альбумина крысят,родившихся у получавших или не получавших препараты животных контрольной группы,максимальная концентрация связанного исследуемым белком ЕР составляла в среднем 40?' (п=15) от исходной концентрации иммобилизованного в частицах СМ желч-. ного пигмент'а. При использовании мономерного интактного альбумина крысят,родившихся у не получавших препараты животных подопытной группы,максимальная концентрация Б?.связанного исследуемым белком .оказалась пониженной. (p^I.O?) в среднем до 19? (п=15) от исходной концентрации иммобилизованного в мембранных частицах билидиена.

При использовании мономерного интактного сывороточного альбумина получавших или не получавших препараты беременных крыс контрольной группы максимальная концентрация связанного исследуемым белком ЕР- составляла в-среднем 472 01=15) от исходной концентрации иммобилизованного е частицах СМ желчного пигмента. При использовании мономерного интактного альбумина не получавших препараты беременных крыс подопытной группы максимальная концентрация-ff,связанного исследуемым белком,ока залась пониженной (р<С5,0?) в среднем до 30? (п=15) от исходной концентрации иммобилизованного е мембранных частицах билидиена. При использовании очищенного in vitro от органофильных лигандов мономерного сывороточного альбумина беременных крыс или новорожденных крысят обеих групп максимальная концентрация связанного исследуемым белком "ЕР была практически одинаковой и колебалась в пределах от 54 до 60?. от исходной концентрации иммобилизованного в частицах СМ желчного пигмента. . В серии опытов препараты сывороточного альбумина,полученного у новорожденных крысят или у беременных крыс подопытной, группы, не получавших препараты,и очищенного in vitra от органофильных лигандов,инкубироЕали (10-20°) в присутствии пальмитата.олеата и/или стеарата натрия с добавлением ацетальдегида (И.И.Степуро, И.Б.Заводник.Ю.М.Островский, 1982) в указанных выше молярных со-

отношениях с сывороточным белком. При определении функциональной активности мономерного альбумина е состаЕе этих инкубированных препаратов максимальная концентрация ЕР,связанного исследуемым белком,составляла в среднем соответственно 17 (п=15) и 24$ (п=15) от исходной, концентрации иммобилизованного в мембранных частицах билидиена,т.е.практически не отличалась от соответстгуюпшх показателей при использовании мономерного ин-тактного альбумина крысят и беременных крыс подопытной группы, не получавших перечисленные выше препараты.

При использовании мономерного интактного сывороточного альбумина беременных крыс подопытной'группы .получавших <з£-токоферол, никотинамид.оксибутират натрия и трисамин,максимальная концентрация связанного исследуемым белком IP Се сравнении о таковой при использовании мономерного интактного альбумина беременных крыс подопытной группы,не получавших препараты) оказалась повышенной (р<5,0$) е среднем до 43$' (п=15) от исходной концентрации иммобилизованного е частицах СМ желчного пигмента. При использовании мономерного интактного сывороточного альбумина крысят,родившихся у животных подопытной группы,получавших перечисленные препараты.максимальная концентрация связанного исследуемым белком ЕР (в сравнении с Тэкоеой при использовании мономерного интактного альбумина крысят,родившихся у жиеотных подопытной группы,не получавших препараты)- оказалась повышенной (р<£Л,0$) в среднем до 34$ (п=15) от исходной концентрации иммобилизованного е мембранных частицах билидиена.

Обнаруженная коррекция набором фармакологических препаратов определяемой in vitro связанной с транспортом ЕР функциональной активности сывороточного альбумина жиеотных,его способности взаимодействовать с находящимся в частицах И желчным пигментом е условиях хроническом кислородной недостаточности в какой-то мере обусловлена,возможно,тем,что еходиеший е этот набор (¿-токоферол нормализует кровообращение во внутренних органах,стабилизирует их запасы креатина и белковый состав,противодействуя усилению протеолитических процессов,фиброзной дистрофии и атрофии органов при кислородном голодании (А.Е.Ткаченко,1965). Это,возможно,предотвращает усиление прочих катаболических (например, липолитаческих) процессов при гипоксии.продукты которых в качестве низкомолекулярных лигандов' связываются альбумином, конкурируя с молекулами ЕР за взаимодействие с данным белком. Введение с(-т.окоферола (дополнительно к его алиментарному поступ-

лению) е организм противодействует накоплению г циркулирующей кроЕи треонина (вместе с другими аминокислотами) при гипоксии. Между тем,треонин,помимо Есего,прочего,служит е жиеотном организме одним из метаболических предшественников ацетальдегида (А. Маис тер, 1961), энергично взаимодействующего с f-NHg-rpyn-пами лизилвных остатков в сывороточном альбумине (T&cno/iüe, 25. Tama • М- Sozzeó , ISS3; Joti ,Е. Redolí, F. £tí<faf¿efá',I988) и блокирующего тем самым эти группы .участвующие в связывании данным белком молекул ЕР (J. Btcwr) , Р. S'hcck(!ey,1982).. Обнаруженный корректирующий эффект «/-токоферола может потенцировать,как упомянуто Еыше.оксибутират натрия (или лития). Последний препятствует происходящему при гипоксии усилению гли-колитических процессов,стимулирует реакции цикла трикарбоновых кислот и противодействует тем самым накоплении во внутренней среде организма ДЕууглеродистых компонентов ацетил-КоА, среди которых находится и ацетальдегид (Л.Д.Лукьянова,1989). Потенцирующее обнаруженный эффект «¿-токоферола действие нико-тинакида.обусловлено,по-Еидимому,тем,что последний,помимо всего прочего,подавляет липолитические процессы при кислородной недостаточности (§,З.Меерсон,1984) и предотвращает тем самым избыточное накопление во внутренней среде организма неэстерифи-цированных жирных кислот,в частности,неэстерифицироЕанных еыс-ших жирных кислот,избыток которых е молекулах сыЕороточного альбумина в качестве низкомолекулярных анионных лигандов проти-Еодейст^ет связыванию этим белком молекул IP (Q.Spectaz, J.'Féetdhez ,1977; U. Ktagh-Hanjen.ISSti). Не исключено.что.по-дэеляя липолитические процессы,никотинамид е какой-то мере ограничивает процессы усиливающегося при гипоксии пероксидироЕа-ния ненасыщенных жирных кислот (Ю.А.Владимиров,Э.М.Коган, .

. 1981).ведущего к избыточному накоплению ео внутренней среде организма содержащих карбонильную группу метаболитов,среди которых может находиться и ацетальдегид.

Благоприятный эффект применения трисамина в комбинации с ^(-токоферол ом .никотин амидом', оксибутиратом натрия (или лития) при хронической кислородной недостаточности обусловлен,вероятно, тем,что он устраняет вызываемое гипоксией закисление среды как внутри,так и вне клеток (И.В.МаркоЕв,В.И.КалиничеЕа,1987). Такое действие трисамина вместе о вызываемым им небольшим защела-чИЕвннем циркулирующей крови способствует,возможно,упомянутой. Еыше дезагрегации находящихся в плазматической мембране клеток молекул ЕР,более энергичному высвобождении желчного пигмента

из продуцирующих его периферических клеток (например,из обладающих гемоксигеназной активностью клеток головного мозга) и более энергичному связыванию билидиена молекулами сывороточного альбумина,транспортирующего желчный пигмент в гепатоциты.

Еыводы.

1.Синаптосомальная мембрана клеток головного мозга крыс обладает,по меньшей мере,двумя типами центрог связывания билирубина хп узЛго .отличающимися друг от друга максимальным (в расчете на обшее содержание мембранных белков) количеством связываемого ими желчного пигмента (соответственно 5 и 7 нмоль/мг) и величинами константы ассоциации (соответственно б х 10^ и 2 х 10^

М"1).

2.Связывание билирубина частицами синаптосомальнои мембраны зависит от. водородного показателя и температуры среды,сопровождается существенными изменениями спектрально-люминесцентных характеристик билидиена,обусловленными фиксацией,агрегацией липо-фильных молекул желчного пигмента в гидрофобных участках мембраны.

3.Внедрение билирубина в синаптосомальную мембрану сопровождается инактигацией .К^-АТФазы и ацетилхолинэстеразы,изменениями термокинетических характеристик этих мембранных эстераз, причем степень обратимости этих эффектор зависит от количества связанного мембранными частицами билидиена,

Молекулы билирубина,иммобилизованные в частицах синаптосомальнои мембраны, проявляют фотодигамичаскую активность.Еызыва-• ющую более энергичную инактивацию |^а+,К+-АТФазы и ацетилхолинэстеразы,чему-противодействуют защелачивание среды до рН 7,8, отсутствие в ней 0^,присутствие в ней «/-токоферола или мономерного лишенного органофильных лигандоЕ сывороточного альбумина.

5.Изменения интенсивности процесса связывания мономерным сыео-роточным альбумином молекул билирубина,находящегося е суспензированных в водной среде частицах синаптосомальнои. мембраны,при разных комбинациях различных величин водородного показателя и ионной силы среды в пределах,совместимых с нормальной жизнедеятельностью клеток и тканей млекопитающих,не коррелируют с изменениями константы ассоциации при взаимодействии билирубина и альбумина в гомогенной еодной среде при прочих сопоставимых условиях.

6.Разработанный е данном исследовании метод определения функциональной активности сь'Еороточного альбумина позволил впервые количественно оценить способность данного сывороточного белка в качестве специфического транспортера некоторых органических анионоЕ связывать билирубин.находящийся е частицах плазматической (синаптосомальной) мембраны клеток головного мозга,при изучении елияния кислородной недостаточности на обмен билирубина в головном мозге. Этот ноеый аналитические метод основан на дифференциальной спектрофогометрии годной суспензии препаратов билирубина,иммобилизованного в сохраняющих по ряду признаков исходную натиЕность частицах синаптосомальной мембрены,стандартных по своим седиментсционным и спектрально-люминесцентным характеристикам,по количеству связанного ими бмидиена.по активности и-термокинетичесским параметрам Ма+,К+-АТФазы и аце-тилхолинэстерази.по фотодинамической активности иммобилизованного в мембранных частицах желчного пигмента,до и после введения г эту суспензию исследуемого альбумина.

7.Утрата сывороточным альбумином присущей ему способности связывать находящийся е синаптосомальной мембране клеток головного мозге билирубин служит причиной или,по меньшей мере,одной из осноеных причин накопления этого желчного пигмента в мозге бе- • ременных крыс и новорожденных крысят при вызываемых хронической гипоксией е течение пре- и неонатального периодов увеличении активности катализирующей образование билирубина ферментной системы (гемоксигеназы) в мозге и некомпенсированном ацидозе Су новорожденных крысят).

8.Происходящая при гипоксии утрата сывороточным альбумином способности связывать находящийся е синаптосомальной мембране билирубин обусловлена присутствием в молекулах альбумина избытка неэстерифицироЕанных высших жирных кислот и ацетальдегида е качестве анионных лигандов,удалекие которых производимой ¿л ^¿т очисткой альбумина от органофильных лигендов восстанавливает указанную способность сывороточного белка.

9.ЕЕедение животным при хронической гипоксии в течение пре«- и неонатального периодов «¿-токоферола,никогинамида.оксибутира-та натрия и трисамина предотвращает избыточное связывание неэс-терифшцированных высших жирных кислот и ацетальдегида сыЕоро-точным.альбумином,повышает содержание е этом белке эндогенного билирубина,предотвращает утрату белком способности связывать билирубин,находящийся е плазматической (синаптосомальной) мембране клеток головногб мозга,противодействует еозникноебнию аци-

доза у новорожденных животных,но не оказыгает влияния на активность гемоксигеназы в головном мозге,повышающуюся при денной экспериментальной модели кислородной недостаточности.

Основные публикации по теме диссертационной работы.

1.Ткаченко A.I. / Хлияние рибонуклеазы на тканевое дыхание пла-нарий Ijirvia. temi-s// Журнал эволюционной биохимии и физиологии.-IS67.T. З.'ЕЭ.-С. 266-266.

¿.Ткаченко A.I. / С рибонуклеодеполимеразной активности гиппо-кампа // Там же.-1969.-i.5,,'¿6.-С.529-534.

3.Ткаченко А.Е. / Метод обшей окраски проционовыми красителями белковых фореграмм на агароюм геле е условиях микроэлектрофореза.-// Вопросы мед.химии.-1969.-Т.15,И.-С.100-104.

4.Ткаченко A.B. / 0 рибонуклеодеполимеразной и гемоксигеназнсй активности белковых фракций гиппокампа.коры больших полушарий и полосатого тела головного мозга жиеотных при гипоксии //

II Всесоюзный биохимический съезд.Тезисы секционных сообщений.-

1969. -г. Ташке нт, ФАН УзССР. -С. 96-97.

5.Ткаченко А.Г. / Сравнительная характеристика рибонуклеодеполимеразной активности гиппокампа.неокортекса и полосатого тела головного мозга // Еурнел эволюционной биохимии и физиологии.-

1970.-Т.6,»I.C.30-34.

6.Ткаченко A.B. / Рибонуклеодеполимеразная и гемоксигеназная активность различных белковых фракций гиппокампа //'Материалы II Всесоюзной конференции молодых ученых.-1970.-г.Пущино.-С.57-62.

7.Ткаченко A.B. / Выделение синаптосомальных мембран из головного мозга жиеотных // Биохимия.-1972.-Т.37,К2.-С.248-254.

8.Ткаченко A.B. / Гипербилирубинемия при"хронической кислородной недостаточности // Материалы III Всесоюзного биохимического съезда.Тезисы секционных сообщений.-1974.-г.Рига,Зинатне.-С.100-101.

9.Ткаченко А.Е. / Способ связывания глобулярных белкоЕ с про-ционоеыми красителями- // Aet. се-во Iii 124198.

10.Ткаченко A.B. / Способ получения мономерного альбумина плазмы крови // Ает.се-во №1250301.

Н.Ткаченко А.Е. / Способ определения алкилсульфатоЕ'и алкил-сульфонатоЕ // Ает.се-ео И345118.

12.Ткаченко А.Е. / Взаимодействие билирубина,альбумина и синап-тосомалвной мембраны // Вопросы мед.химии.-1987.-Т.33,№6.-С.74-79. -

13.Ткаченко A.B. / Влияние билирубина на активность АТ'Фазы си-наптосомальных мембран головного мозга // Ионный гомеоотаз и влияние факторов внешней среды на жизнедеятельность клетки. Тезисы докладов Ы1 Всесоюзного совещания по транспортным А1§азам (A.A. Болдырев,oti. ред.). -1987. -г. Ирку тек, г. Москва, МГУ-С.107-108.

14.Ткаченко A.B. / Средство для фотодозиметрии и способ его изготовления // Ает.се-го Ы522508.

15.Ткаченко А.Р. / Спектрально-люминесцентные и функциональные характеристики взаимодействия синаптосомальной мембраны.билирубина и сиЕороточного альбумина // У1 Конференция по спектроскопии биополимеров.Тезисы докладов.-1988.-г.Харьков.-С.296-297.

16.Ткаченко A.B. / Влияние билирубина и сывороточного альбумина на активность' |^1а+,К+-АТФазы е синаптосомальной мембране // Цитология.-1988.-Т. 30,№7.-С. 849-865.

17.Ткаченко A.B. / Влияние (¿-токоферола,сыЕороточного альбумина,годородного показателя среды и присутствия е ней кислорода на фотодинамическую активность билирубина // III Всесоюзная конференция Биоантиоксидант (Е.Б.БурлакоЕа,пред.Оргкомитета).-1989.-г.МоскЕа.-Т.1.-С.78-79.

18.Ткаченко А.Е. / Влияние билирубина и сывороточного альбумина на активность гидролаз е синаптосомальной мембране // Биохимия.-

1989.-Т. 54Д7.-С.1С82-1089.

19.1каченко A.B. / Влияние билирубина и сывороточного альбумина на активность ацетилхолинэстеразы в синаптосомальной мембране. // Не йр о химия. -1989. -Т. 8, №2. -С. 2 38-247.

20.Ткаченко А.Е. / Функциональные изменения в синаптосомальной мембране при взаимодействии с билирубином и сывороточным альбумином in vitro // Вопросы мед.химии.-1989.-Кб.-С.39-44.

21.Ткаченко A.B./ Устройство для экстракции е микросистеме твердое тело-жидкость при непрерывном регулируемом протоке

// Приборы и оборудование для исследований в области физико-химической биологии и биотехнологии (А.Г.Аристакесян.оте.ред.).

1990.-г. Пущин о, ЩШ и НПО БП АН СССР.-С. 18-24.

22.Ткаченко A.B. / Прибор для препаративного электрофореза в полиакриламидном геле // Там же.-С.24-27.

23.Ткаченко A.B. / Изменения е синаптосомальной мембране при моделировании фоютерапеЕТического воздействия,применяемого при билирубинОЕОй энцефалопатии // Патологическая физиология и экспериментальная терапия.-1990.-№4.-С.29-32.

24;Ткаченко A.B. / Способ получения иммобилизованного на синап-44