Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

НУКЛЕОТИД-ЗАВИСИМАЯ ДЕГРАДАЦИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ДНК- И РНК-ПОЛИМЕРАЗАМИ

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "НУКЛЕОТИД-ЗАВИСИМАЯ ДЕГРАДАЦИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ДНК- И РНК-ПОЛИМЕРАЗАМИ"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. а л. ЭНГЕЛЬГАРДГА

На правах рукописи

СОСУНОВ Василий Валерьевич

Нуклеотид-зависимая деградация нуклеиновых кислот ДНК- и РНК-полимеразами

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2003

Работа выполнена в Лаборатория химического и биологического анализа биополимеров и клеток Института молекулярной биологии им. В А. Эш-ельгардта РАН (Москва) и в Нью-Йоркском институте здравоохранения (Нью-Йорк, США).

Научный рукряфдщшр.-

кандидат биологических наук Л. С. Викторова

Офапиальыые оппоненты:

доктор химических наук, профессор Н. Г. Долинная кандидат химических наук, сис В. Л. Туницкаа

Ведущая орриргмтшя- Институт Экспериментальной Кардиологии ВКНЦ РАМН

Защита состоится "_"_2003г. в_на заседании диссерташонного совета

Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологнн им. В.А. Эагельгардта РАН но адресу: 119991 Москва, ул. Вавилова, д.32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологин им. В А. Эительгардса РАН.

Автореферат разослав **_"_2003г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

А. М Крицын

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Многие ДНК-падимфазы (ДНКП) помимо фунмшк синтеза ДНК обладают рядом дополнительных активностей. Все ДНКП способны осуществлять пирофосфоролиз — реакцию обратную полимеризации. Кроме того, у многих полимераэ имеется отдельный эхзоиуклсазный активный центр, осуществляющий 3'—*5'-экзонуклеазную реакцию. Подобная активность описана дм прокариопгческих ДНКП Г типа (Joyce and Steitz, 1994) ж эукариотических ДНКП 8, а, и Ç (полимерам а обладает такой активностью лишь у некоторых видов) (Михайлов, 1999). ДНКП I прокариот обладают также дополнительной 5*—»З'-экзовуклеазной активностью, осуществляемой отдельным активным центром.

Клеточные РНК-полимеразы (РНКП) также способны катализировать реакцию пирофосфоролиза, Кроме этого, они обладают эндонужлеазной активностью, которая существенно стимулируется в присутствии белковых факторов ОгеА и GreB у прокариот (Boiukhov et al., 1993) и TFHS у эукариот (Reines, 1992; Izban and Luse, 1992). Предполагается, что эцдонухлеазное расщепление РНК осуществляется в том же активном центре, что и реакции полимеризации и пирофосфоролиза. Для эукариотнческой РНКП D описана также экзонукдеазная активность, которая как и эндонуклеазная стимулируется белковым фактором TFI1S (Wang and Hawley, 1993). Была показано, что фактор* стимулируемая экзонуклеазная активность РНКП II играет важную роль в процессе коррекции синтеза РНК гл vitro (Thomas et al., 1998).

Недавно была обнаружена новая реакция, кэтализнрумая различными ДНК* цолимеразами. Реакция заключается в выщеплении З'-концевого нуклеотида растущей цепи ДНК в присутствии относительно высоких концентраций иекомплементарных r/dNTP либо r/dNDP (например, величина Кт в згой реакции для rATP ~ 1.6 мМ), с образованием, соответственно, динухпеозид-5',5"-тетра- а -грифосфатов (Meyer et а!., 1998; Sosunov et al., 2000).

Механизм этой реакции, названной нами реакцией цсевдопирофосфоролиза, ло-видймому, аналогичен механизму реакции пирофосфоролиза; при этом в роли пнрофосфата выступают а,р-фосфаты стимулирующего NDP, лпбо (З.у-фосфаты стимулирующего NTP:

5'-...pNpNpNpN'oH + ppp(r/d)N" 5'-...pNpNpN0H + (r/d)N"-5Vpppp-5,-K' 5'-.. .pNpNpNpN'caj + pp(r/d)N" -> 5'-,, .pNpNpNcw + (г/а)М"-5'-ррр-5'-№

Hhewc^A ;

фот neywo* J*rmi

m-^MâiÊ- !

Предполагается, что эта реакция лежит в основе механизма резистентности вируса иммунодефицита человека (HIV) к азидотимиднну (AZI) - нуклеоз идиому ингибитору обратной транскриптазы HTV (HIV RT). Показано (Meyer et at., 1999), что HIV RT, содержащие замены, обусловливающие устойчивость вируса к AZT in vivo, существенно эффективней, чем фермент дикого типа, выщепляют З'-кониевой терминирующие остаток AZTMP ДНК-праймера в присутствия высокой концентрации АТР н смеси четырех природных нуклеозщщяфосфатов; при этом происходит разблокирование праймера и продолжение синтеза ДНК.

Кроме этого, роль реакции псевдопирофосфоролиза может заключаться в коррекции синтеза ДНК, что особенно важно для ферментов, не обладающих корректирующей 3'—+5'-эюонуклеазвой активностью (например, обратные транскрипт азы ретровирусов, в том числе и HIV RT, эукариоггические ДНКП а, ß и другие).

Для РНКП реакция псевдопирофосфоролиза не известна. Поиск подобнее реакции для РНКП интересен, особенно с точки зрения возможного ее участия в процессе коррекции синтеза РНК.

Цель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы являлся поиск и выяснение механизма реакции нуклеотвд-зависимой деградации РНК, катализируемой мультнеубьедивдчной клеточной РНКП £ coli. В работе ставились следующие задачи:

1. Выяснить, являются яц субстратами для ДНК- и РНК-полимераз продукты реакции псевдошфофосфоролиза - дннуклеозид-5 \ 5"-три- итепрафосфаты.

2. Поиск реакции нукдеотвд-зависнмой деградации РНК для РНКП Е coli и, в случае ее обнаружения, выяснение детального механизма этой реакции.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе продемонстрировано, что динуклеозид-51 >5"-три- и -тетрафоофаты, являющиеся продуктами реакции псевдопирофосфоролиза, могут служить субстратами для четырех классов ДНК-полимераз -обратных транскриптаз (HIV RT), ДНКП а и ß эукариот (ДНКП а и ß человека), прокариотических ДНКП I типа (ДНКП Ecoli и T.aquaticus). Наиболее эффективными субстратами для всех ДНКП оказались динуклеозид-5*,5"-те1рафосфаты. Для HIV RT субстратная активность этих соединений оказалась близкой к активности соответствующих dNTP, в то время как для остальных ферментов они были в той или иной степени менее эффективными, чем dNTP. Показано также, что дянуклезид-5',5"-тгграфосфаты являются субстратами для РНКП фага Т7 и мультисубъединичной РНКП Kcolt, при этом их эффективность оказалась сопоставимой с эффективностью соответствующих NTP. Таким

образом, в работе обнаружен новый класс субстратов для ДНК- в РНК-полимераз -динуклеозид-5 * ,5" -олигофосфаты.

Продемонстрировано, что РНКП Е. coli обладает 3'—+5*-экзонуклеазной активностью, которая существенно стимулируется в присутствии некомцлементарных r/dNTP, То есть, в отличие от ДНКП, в случае РНКП 3'-концевой нуклеотидный остаток растущей цепи РНК в присутствии некомплементарных r/dNTP выщешмется не в виде динуклеозид-5',5"-тетрафосфага, а в виде куклеозид-З'-монофосфага.

Показано, что для проявления этой активности необходимы два нова Мс2+, координированных в активном центре фермента.

Демонстрируется, что все каталитические активности РНКП (полимеризация, пирофосфоролнз, эндо- и экзонуклеазные реакции) осуществляются одаим активным центром.

Полученные результаты свидетельствуют о наличии дополнительного сайта связывания нуклеотнда в районе активного центра РНКП, который, возможно, является предварительным сайтом связывания входящего NTP при синтезе РНК, участвующим в процессе отбора субстратов.

На основе трехмерной структуры тройного элонгационного комплекса РНКП П S. cerevisiae (Gnatt et al., 2001) я полученных экспериментальных данных нами была построена молекулярная модель активного центра РНКП £ coli, включающего в себя два иона Mg2+, который осуществляет как полнмеризашно/пирофосфоролиз, так н экзо- » эндонуклеазные расщепления РНК.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на VI Международной конференции "Тонкие химические технологии", 1999, Москва; на Международной конференции "Современные проблемы молекулярной генетики ы клеточной биологии", 2000, Москва и на Международных ковференциях "Prokaryotic transcription initiation ", 2001 и 2003, Saxtons River, Vermont, USA.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит рисунков. Библиография включает названия.

Результаты и обсуждение

Работа состоит из двух разделов. Первый посвящен демонстрации NTP-зашсимого выщепления 3'-концевого нуклеотида растущей юли ДНК для ДНКП, а также изучению субстратных свойств продуктов этого выщепления - динуклеозид-5 ',5' '-олигофос фатов дня ДНКП и PHKTL Второй раздал посвящен детальному изучению обнаруженной экзовуклеазной активности РНКП £ coli, стимулируемой некомплемеатарньми нуклеозидірифосфатами.

Раздел I. Нуклеотнд-зявисимое выщепленнеЗ'-коадевогоостатке праймера ДНК-пол нмераіами (псевдопврофосфоролиз). Продукты реакции псевдопирофосфоролиза - динуклеознд-5\5"-тетра- и -три фосфаты - являются субстратами для различных ДНК-полнмераз в реакции полимеризации. Динуклеозид-51,5"-тетрафосфаты также являются субстратами для иекиторых РНК-иолимераз

Нами было продемонстрировано, что, по крайней мере, некоторые ДНКП могут катализировать реакцию, которая заключается в выщеппении З'-концевого нуклеотида растущей цепи ДНК в присутствии относительно высоких концентраций некомплементарных субстратов. Механизм реакции, названной вами псевдопирофосфорояизом, по-видимому, аналогичен механизму реакции пирофосфородиза, при этом в роли ігарофосфата выступают ßj-фосфзты стимулирующего некомплементарного r/dNTP. В данной работе наличие такой реакции показано для обратной транскриптаэы вируса миелобластоза птиц (AMV RT) а ДНКП 1 £ соИ (рис. 1) в присутствии некомплементарного нуклеотида I-ряда ß-i-dTTP. В присутствии природных некомплементарных нуклеозидгрнфосфатов (ß-D-NTP) для названных ферментов в нашей системе (в работе использовался гетерогенный праймер-матнчный комплекс, матрицей в котором служила одноинтевая ДНК фага М13) реакция псевдопирофосфоролиза не наблюдалась (рис. 1А).

Низкомояекулярный продукт выщепления З'-концевого нуклеотида праймера в присутствии ß-1-dTTP (в работе использовался праймер, содержащий радиоактивный фосфат [32Р] на 5'-конце и остаток [згР]АМР на 3'-конце) был идентифицирован с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) на РЕІ-пеллюлозе (рис.ІВ). Радиоактивный кизкомолекулярный продукт реакции выщепления ло подвижности совпадал с подвижностью химически синтезированного динуклеозидтетрафосфата dT-5'-pppp-5'-dA, что позволило предположить структуру образующегося соединения (рис. 1С).

Помимо совпадения подвижностей на ТСХ, продукт реакции псевдопирофосфоролиза оказался стабильным в присутствии щелочной фосфатазы, что говорит об отсутствии

кошевого фосфата, но гидролизовался в присутствии фосфодгостеразы змеиного яда, что подтвервднет предположенную структуру (в тех же условиях [а-мР}АТР гидролизовался обоями ферментами).

Таким образом, реакция псевдопирофосфоролиза в присутствии (ї-і-сіТТР происходит согласно схеме, приведенной на рве. Ш.

ферит UrJfíf dnapieeo*

ntp - ktv dctft^imp — «сто

[nt?!,,* - 6 — «h 300 60 I s»

D Silga*...- н«» —-

Рис. 1. Нуыеотад-заввсимое выпкяяевие 3'-юнцевого цуккеогида праймгра {оеевдощфофоефорсипоХ гатапизируемое AMV RT в ДНКПI ЕксоИ.

А. Влияние нехомплемеетаркьи dKTF на выздеплевяв 3 '-концевого вуисотнда праймера. Реаивюниа« смесь дм ДНКП 1 содержала 50 мМ Ttfs-HCl, рН 7.9,10 мМ MgClj, 50 мМ КО, 1 мМ DTT, 0,8 ед. акт. ДНКП, J0 яМ праймер-матричвый комплекс «указанные щ рнс. субстраты; смесь инкубировали иыннпрв250С,Реакционная смесь для AMV RT содержала 10 uM Tris-ttCI, pli 8.2, 5 мМ MgC!b 40 мМ КС1,1 мМ DTT, 3 ед. акт. фермеяга, 50 вМ праймер-матричный ' комплекс в указанные субстраты; смесь дахубиромяиЗО юш при ЗТС. В. Идевгифимдия шокомопекушфного продукта, образующегося i присутствии некоиплемевгарвого p-1-dTTP, Продукта реакции разделив с помощью TOC на PEJ-целлюлозе в системе: 0.2М Na-фосфагкьШ буфер СрН 8,0), содержащий 10% этавола. С, Структура продукта реакции псевоотгарофосфоролиза. П. Уравнение, согласно которому происходит реакция мевдопнрофмфореяюа

Параллельно с нашей работой группой W, Scott реакция псевдопирофосфоролиза была продемонстрирована для HIV RT, AMV RT и M-MuLV RT (Meyer et al., 199S) с использованием праймер-матричного комплекса, праймер в котором содержал на Э'-конце терминаторный остаток ddAMP. При этом HIV RT оказалась приблизительно в 100 раз более эффективной в этой реакции, чем AMV RT и M-MuLV RT. В той же публикации было продемонстрировано, что HTV RT способна катализировать эту реакцию в присутствия природных t/dNTP и r/dNDP, при этом величины Кш для этих соединений оказались на уровне 1-4 мМ. Это позволяет предположить возможность существования псевдопирофосфоролиза in vivo, по крайней мере для АТР, значение Кя, которого в этой реакции составляет 1.6 мМ, а его концентрация в клетке - более 4 мМ (Gamberucci et al, 1994).

Предполагается, что реакция псевдодирофосфоролиза лежит в основе механизма резистентности HIV к AZT - нуклеозидному ингибитору HIV RT. Показано (Meyer et al., 1999), что HIV RT, содержащее замены, обусловливающие устойчивость вируса к AZT in viro, существенно эффективней, чем фермент дикого тияа, выщепляют Э'-концевой терминирующий остаток AZTMP ДНК-сраймера в присутствии высокой концентрации АТР и смеси четырех природных dNTP; при этом происходит разблокирование праймера и продолжение синтеза ДНК.

Кроме этого, как уже говорилось выше, роль псевдопирофосфоролиза может заключаться в коррекции синтеза ДНК, что особенно важно для ферментов, не обладающих корректирующей 3'-*5'-экзонукпеазиой активностью.

Продуктами реакции NTP-зависимого выщеплеыия являются динуклеозид-5\5 тетрафосфаты и дннуклеазэд-5\5**-трифосфаты (в случае NTP- и NDP-сгимулируемого выщеплення, соответственно).

Нами была протестирована субстратная активность соединений, приведенных на рис. 2, для четырех классов ферментов: обратных транскршггаз (HIV RT), ДНКП аир эукариот (ДНКП а и ß человека), прокариотическях ДНКП I типа (фрагменты Кленова полнмераз Е. coli и Т. aquaticus).

А

Рис. 2. Структуры соединений, оказавшихся субстратами для различных классов ДНК-пелимераз. Соединения были синтезированы в ЛХБА ИМБ РАН. Тестирование проводилось а условиях односубстратной реакции (удлинение праймера а присутствии одного субстрата) в системе, содержащей гетерогенный праймер-матричный комплекс

3.3VThy, BWTty

С

Субстратные свойства этих соединений зависят ках от их структуры, так и от природы фермента. Для ШУ ЯТ субстратная активность динуклеозндтетрафосфатов оказалась близкой к активности соответствующих ¿МТР (см. табл. 1), в то время как для остальных ферментов они были в той или иной степени менее эффективными субстратами, чем соответствующие ЙЫТР, Эти результаты согласуются с тем, что реакция псевдопярофосфоролиза, которая является по суш реакцией, обратной включению б ДНК динуклеозидтрн- и тетрафосфатов, наиболее эффективно осуществляется именно ШУ ИТ.

Таблица 1. Кинетические параметры ¿Ар4<1А и <Щц<1Т и соответствую пщх природных (ШТР для ПТУ ЕТ

Субстрат Кщ.мкМ Утйах(<1Мр,(<1ЫуУтах{<1МТР)

(1Арі4<іА 2,б±0,б 0.56

<1АТР 0.5±0.3 -

¿Тр^Т 2.2±0,5 0.96

(ІТТР 1.2*0.6 -

Для всех ферментов динухлеозидтрифосфаты оказались менее эффективными субстратами, чем динуклеозиятеграфосфаш. При этом, если для ШУ ЯТ разница в активности между ними не превышала 10 раз, то для ДНКП Г активность дануклеошдтрифосфатов оказалась иа два порядка ниже, чем тетрафосфатов.

Теоретически можно предположить два молекулярных механизма удлинения цраймера в присутствии дянукпеозидолигофоофатов (¿ЫрДЬО. Первый заключается в том, «гш непосредственно {ВДр^ДЫ' являются субстратами ДНКП; второй механизм предполагает предварительный гидролиз до соответствующего ¿N1?, который является

природным субстратом ДНКП:

I. Праймер + (Шр^' Праймер-рйН + ¿М'ТР П. 1. <ШР4<Ш' + (ШТР

2. Праймер+<ЮТР Праймер-р<1Ы + РРі

Для выяснения, по какому пути проходит реакция, было синтезировало соединение іісні+АрзіІТ (рис. 2С), которое содержит устойчивую к энзяматическому гидролизу Р-С связь во фрагменте СУ-О-СНгРСОХОНІ-О-. Оказалось, что данное соединение способно включаться в растушую цепь ДНК обеими нуклеотвдныыи частями в соответствии с последовательностью матричной цепи. Если бы реакция проходила по второму механизму, предусматривающему гидролиз до трнфосфага, то включение остатка (ІТМР в ДНК было бы невозможно, т.к. исходное соединение не может быть гидролизоваво до сГГТР и <ЦА. Таким

образом, показано, что реакция идет по первой схеме, т.е. субстратами служат непосредственно дияуклеозидолиго фосфаты.

Чтобы выяснить, являются ли динухлеозвд-5',5,т-алигофосфаш субстратами для РНКП, было синтезировано соединение UpnU. Его свойства были протестированы для однссубьеднничаой РНКП фага Т7 и для миогосубъединичной клеточной РНКП E.colt в системе тотального синтеза РНК, содержащей фермент, матричную ДНК, [a-^PJATP, неразиоакгавные АТР, СГР, GTP и либо UTP, либо Up^U в различных концентрациях. Матрицей при этом служили плазннда pTZ-18 (д ля Т7 РНКП) и ДНК фага Т2 (для РНКП Rcoli). Субстратные свойства UTP н Up«U оценивали по количеству образующейся радиоактивной РНК,

Соединение UpiU оказалось субстратом как для Т7 РНКП, так и для РНКП Rcoli, причем эффективность его включения оказалась не намного ниже эффективности включения UTP (при равных концентрациях в присутствии Up^U синтезировалось лишь в 3 раза меньшее количество радиоактивной РНК, чем в присутствии UTP),

Таким образом, в работе обнаружен новый класс субстратов для ДНК- и РНК-полимераз - динуклеозид-5 *,5' '-олигофосфаты.

Раздел II, Нуклеотвд-завяснмое выщеоленне 3'««mts»ro остатка РНК РНК-полнмеразой Е coli — экзонуклеазное вьпдеоление. Единый механизм реакций полимеризация в деградации РНК, катализируемых «днем активным центром РНК-полимерягы

В данной работе нами продемонстрировано, «по РНКП Е. coli обладает 3'-»5*-экзонуклеазной активностью, которая резко стимулируется в присутствии некомплементарных нуклеозндгрифосфатов.

Детальное изучение обнаруженной экзонухлеазной реакции проводилось с использованием системы остановленного тройного элонгационного комплекса (ТЭК), состоящего из РНКП Е. coli, ДНК (397 н.п.), содержащей промоторный фрагмент AI бактериофага Т7, и РНК различной длины, чаще длиной 21 нуклеотид (ТЭК-2Ш, здесь и далее в обозначении различных ТЭК будет указываться длина РНК н 3'-концевой нуклеотид); при этом в З'-концсвое положение РНК вводился радиоактивно-меченный остаток [äiPJNMP. В экспериментах использовалась РНКП, иммобилизованная па NiJ+-NTA-агарозе. Последовательность РНК в составе ТЭК в общая схема обнаруженной экзонуклеазной реакции приведены на рис. ЗА, В.

A. Нукяеотидиая последовательность начала транскрибируемой области Т7А1 промоторе

5"-A'TCQAGAGGG,,ACACGGCGAA'°T,tAQCCATi7CCCM...-3'

B. Схема экюнуклезаной реакции, каттлизируечой РНКП

Мв*\НгО

РНК 5'-,..pGpCpGpApAp*U -S4..pGpCpGpApAoH+p*U

([MNTP)

C. Соединении, стимулирующие зкзонуклеазную активность

СНв

некошшсментарпые rNTP, dNTP ҐіГ^І

P-0-P-CH2-P-0-N оС^^О^

(нуКЛЄОЗИДгО,[}-МЄТИПЄИ- (умбеллиферонїрифосфат)

дифосфонат-^-фосфет)

D. Соединения, не стимулирующие экхонуклеаэную активность

rMNDP.rWJMP Ряс. З

Стимуляция эюонуклеазиой активности РНКП £, coli некомпяементарними нуклеозидтрнфосфатани. Нами было показано, что экзонуклеазная активность резко стимулируется в присутствии некомплементарных iNTP и dNTP (рис. 4А). Так, при инкубация ТЭК-2Щ в транскрипционном буфере (см. подпись к рис. 4А) наблюдается накопление РНК длиной 10 нуклеотвдов, которая является продуктом эндонуклеазного расщепления исходной РНК ТЭК, и радиоактивного UMP, являющегося продуктом экзонуклеазного отщепления З'-концевого остатка РНК (дорожка 2). В присутствии высоких концентраций некомплементарных r/dNTPs накапливается существенно большее количество UMP (дорожки 5-8). В присутствии комплементарного АТР РНК удлиняется на один нуклеотид, согласно контексту матрицы (дорожка 3). В пробах, содержащих РРі, наблюдается классический пирофосфоролиз - выщепление З'-концевого нуклеотида в виде нуклеозид-5 '-тряфосфата (дорожка 4). Константа связывания некомплементарных N77 с РНКП при стимуляции экэонуклеазной активности составляет 0.8±0.1 мМ. Аналоги комплементарных NTP, не способные элонгировать цепь РНК (например, popCH^p-N), также активируют эту реакцию, хотя и менее эффективно. Нуклеозидшг- а монофосфаты не стимулируют зкзонуклеазную реакцию. В то же время, в присутствии умбеллиферонтрифосфата (структура приведена на рис. ЗС) наблюдается стимуляция этой реакции. Таким образом, для стимуляции экзонуклеазной активности природа нуклеозидной

9

части стимулирующего иекомжлементариого ИГР, по-видимому, не важна, в то время как наличие трифосфатной части абсолютно необходимо.

Экзонуклеазное выщепленне З'-концевого нуклеотида не является нуклеотид-специфической активностью - эта реакция наблюдалась в разных комплексах: ТЭК-2 Ш (рис, 4А), ТЭК-2711 (ряс. 4Б), ТЭК-12С, ТЭК-14С.

А В С О

Рис. 4. Свойства этнумсазяой реакдаа, кат&юввруемой РНКП £сЫ1. А. Стимуляция эюонумеазной активное™ в присутствия некомолементарныхНГР, Различные ТЭК получали, как в работе (КшЫст м а], 19%), путем добавления к открытому комплексу РНКП с промотором праймера (АрирС) в различных комбинаций субстратов, с доследующими промывками (РНКП иммобилизована на ЫШТА-агарозе), Экзонуклеазное вищепление провощили при 3 ГС в транскрипционном буфере (ТБ), содержащем ¡6 иМ Тпз-НС1(рН7.9), 100 мМ КС1,1 иМ 2-мерющтоэтавол и 10 мМ М£С1) в присутствии, либо в отсутствие МТР, Время реакций указано на рисунке. Реакции удлинения РНК н пирофосфоролкэа также проводили 1 ТБ. Реакции останавливали добавлением равного объема стоп-буфера (7 М мочевина, 20 мМ ЕОТА, красители: бром феноловый синий и ксиленцвайол Б? - по 023%), Продукты реакция разделяли в 20% ПААГе (19:3 -акрШ1амяд;биоакриламид, 1хТВБ, 1 М мочевина). Во всех ТЭК З'-коицевой нухпеотид содержит рад иоактивную метку 31Р. В. ТЭК-21 и, содержащий РНК-транскрипг, радаюастяиижеченный как ио 3'-коииевому нукпеотиду, так и по длине РНК. Демонстрируете» устойчивость ТЭК-2011 как к щрофосфоролнзу, так и к экзонуздеашоЯ решат. С Влияние стрегггсянлкгищ на маонуклеазиую реакцию. Б. Влияние белковых факторов СгеА и СгеВ на экзоиуклеазауго реакцию в системе, содержащей ТЭК-27и

В тоже время, в ТЭК-20А экзонуклеазная реакция ае наблюдается при сходных условиях (рис. 4В), Этот комплекс также слабо подвержен пирофосфоролизу. Из рис, 4В видно, что начальный траяскрипт 2Щ, который в этом случае содержит радиоактивную метку как в 3'-концевом нуклеогиде, так и по длине РНК, деградирует только до 20-мера как в присутствии РР, (дорожка 4), так и в присутствии некомплементарных ОТР (дорожки 5-7). В присутствии некомплементарного иТР, после выщепления 3'-концевого радиоактивного остатка ЦМР, нерадиоаггивный субстрат становится комплементарным и встраивается на его место, поэтому на рис. 4В (дорожка 5) не исчезает полоса, соответствующая транскрипту

2Ш. Считается, что пирофосфороднз в ТЭК-20А идет медленно за счет того, что 3'-концевой нуклеотид РНК в этом комплексе находится в активном центре преимущественно в ¿-сайте (реакция пирофосфоролиза возможна только в том случае, если З'-концевой нуклеотид занимает і+І-сайт). Корреляция между скоростями тшрофосфоролиэа и экзонуклеазного вьнцешіения позволяет предположить, что обе эти реакции осуществляются из состояния, когда 3'-концевой нуклеотид находится в і+7-саЙте.

Об участии активного центра полимеразы в катализе экзонуклеазной реакции свидетельствует то, что эта реакция (рис. 4С, дорожки 2, 6-8), так же как и реакция полимеризации (дорожки 3-5), подавляется стрептолшшгииом — антибиотиком, блокирующим работу активного центра фермента (МсСІше, 1980). При этом ингнбированне экзонуклеазной реакции происходит как в присутствии некомплемеитариых нуклеозидтрафосфатов, так и в их отсутствие.

Экзонуклеазная реакция не стимулируется в нашей системе белковыми факторами (їгеА и (їгеВ, стимулирующими эндонуклеазное расщепление РНК (ВошкЬоу ег а!., 1993). Как видно из рис. 40, в системе, содержащей ТЭК-27и, в присутствии Сге-факторов накапливаются короткие олигоиуклеотиды длиной 2-5 остатков (дорожки 5,6), а количество ЦМР не увеличивается. В системе, содержащей ТЭК-2Ш, Оге-фаггоры также не стимулируют экзонукяеазное расщепление.

Некомплементарные нуклеозидтрифосфвты приносят и ориентируют в активном центре ион катализирующий эюонуклеазное «ыщепяение. Нами

показано, что для эхэоиухлеазной активности абсолютно необходимо наличие ионов двухвалентных металлов. Экспериментальные данные демонстрируют, что скорость экзонуклеазной реакции линейно возрастает в зависимости от концентрации ионов в интервале 0-100 мМ (рис. 5, черные ромбики). Другими словами, константа диссоциации М52+ с активным центром фермента в этой реакции выше 100 мМ.

О

-Ф- +аттр [1тМ), Мдг* ^

+йТТР (1тМ1, Мп2* і^г»

-о некомплеметярноготрнфосфага (<1ТТР). Время реакции йыбиралось с таким расчетом, чтобы укорачивалось ве более 20% от ^ исходного количества РНК с составе ТЭК-2Ш

0 10 20 30 40 50 60 [Ме2Ч, тМ

Для известного иона Mg1* (нон Mg-Q, который удерживается тремя остатками Asp ю NADFDGD мотива (З'-субъедшшаы и принимает участие в катализе прямой реакции, величина константы диссоциации с активным центром РНКП составляет около 100 мкМ (Korea and Mildvan, 1977; Mustaev et al., 1997). Таким образом, в катализе зкзонуклеазной реакции наряду с ионом Mg-I (см. ниже) принимает участие другой ион Mg24, обозначим его как ион Mg-11. Ионы Мп3" стимулируют экзонуклеазную реакцию более эффективно, чем Mg1" (рис. 5, черные квадраты), однако константа диссоциации Мп1+ с ферментом также не может быть определена экспериментально (выше 15 мМ).

В присутствии некомплементарного dTTP (рис. 5, белые ромбики) сродство к ионам металла резко возрастает, константа диссоциации Mg2" с ферментом уменьшается, по крайней мере, в 30 раз (табл. 2). Мы предполагаем, что механизм стимуляции зкзонуклеазной реакции некомплементарными нуклеозидтрифосфагамя заключается в привнесении и ориентации ими в активном центре фермента второго каталитического иона Mg1" (Mg-П), В этом, очевидно, участвуют Р,у-фосфаты NTP, на что указывает необходимость наличия трифосфаткой группы для проявления стимулирующей активности (как уже упоминалось выше, нуклеозидди- и монофосфаты не стимулируют эту реакцию).

Ла аналогии с экзонуклеаэным активным центром ДНКПI E.coli, в нашем случае роль второго иона Mg2+ в катализе экзонуклеазной реакции, вероятно, заключается в активации и координации молекулы воды с образованием ОН -иона, который, в свою очередь, атакует фосфат 3'-концевого нуклеотида РНК. При этом Э1-концевой нуклеотид должен располагаться в i+1 сайте, т.е. находиться в претранслокацнонном состоянии. О том, что реакция происходит именно тогда, когда концевой нуклеотид находится в претранслокацнонном положении, свидетельствуют данные о корреляции скорости гидролиза и пирофосфоролиза (см. выше).

Влияние мутаций в РНКП Kcoli на экэонуклеазную активность. Недавно в работе (Сгашег et al., 2001) было показано наличие второго иона Mg1" в активном центре РНКП Л S. cereviskк в отсутствие лигандов. Авторами высказывается предположение, что в координации данного иона в активном центре могут принимать участие высококонсервативные остатки Е836 и D837, соответствующие остаткам ES13 и DS14 консервативного района F ß-субьеданицы РНКП B.coli.

На основании этих данных нами была получена муталтная форма РНКП, содержащая двойную замену ED813.814AA. Кроме этого, нами была получена РНКП с мутационной заменой RU06A в консервативном мотиве PSRM Н-района ß-субъеяишщы (обе мутантные ШЯИмеразы были получены Е. Сосуновой). Из анализа трехмерной структуры РНКП И

дрожжей следует, что боковые группы остатков D814 и R1106 могут электростатически взаимодействовать друг с другом (образовывать солевой мостяк).

Обе мутантяые РНКП проявили сильно выраженные дефекты в активности и оказались неспособными синтезировать полиоразмерный РНК-продукт, но сохранили способность катализировать образование фосфодгофярной связи. Основной дефект у мутантных РНКП проявлялся при переходе от инициации к элонгация. Кроме того, у мутанта RltOSA оказалась ве менее чем на два порядка завышена величина Km для NTP в процессе инициации, что согласуется с литературными данными (Polyakov etal, 1999) о сильном Кп-цефекте у мутанта PSRM1104-1007АААА. Для мутанта ED813,814AA наблюдается лишь незначительное увеличение величины Km для NTP в инициации по сравнению с полиыеразой дикого типа.

В другой работе (Vassyiyev et al., 2002), в которой была разрешена структура холоферметента Т. tkermopklus, авторами было высказано предположение, что второй ион MgJ+ удерживается аминокислотными остатками D460ß\ D462ß' и N4SSß'. В связи с этими данными нами была получена РНКП, содержащая замену N458A. По активности этот мутант оказался близким к WT РНКП (скорость полимеризации для него оказалась несколько ниже, а значения Km(NTP) примерно такие же, как у фермента дикого типа).

Нами была протестирована зкзонуклеазная активность мутантных ферментов (рис. 6).

i ви1іща

"W

да

т

ЗЛО

ШИШ/

XZZ7

ш

в

40 60

[Мд2+], mM

100

Ряс. 6. Влияние мутаций на экзонуклеззную активность РНКП. А. Влияние мутаций в системе ТЭК2Ш, РНК которого содержала радиоактивную метку [і:Р] я 3'-концевом остатке ЦМР. В. Зависимость начальных скоростей экзонуклеазного внщеплениі от концентрации ионов для мутантов и фермента дикого типа

С помощью экзояуклеазиой реакции было показано, что константа связывания

второго иона с мутакгными РНКП, содержащими замены Е0813,814АА и N45 8А, так

13

же, как и в случае полимераэы дикого типа, неизмерима в интервале концентраций М^* от О до 100 мМ (К^ выше 100 мМ). При этом и скорость экэонуклеазной реакции у этих мутантов оказалась такой же, как у ^Т РНКП (рис. 6В). Для РНКП с заменой 1Ш06А скорость экзонуклеазиой реакции оказалась существенно более высокой, чем у ТУТ РНКП, при этом К^ для М£-П оказалась равной 10 мМ (рис. 6В,табл. 2).

Таким образом, мы демонстрируем, что в отсутствие лигандов остатки Е813, 0814 и N458 не принимают участия в удержании второго иона Мд?*, вопреки предположениям, сделанным в работах (Статег й а1., 2001 Уаа^уеч ег а1., 2002).

Таблица 1. Влияние мутаций, рН и некомплементарного нуклеоэидгрифосфата на ковсташу

связывание М%-П с РНКП

Фермент К^Мд-П), мМ

рН 7,9(10 мМ рН 10.0

-<ЛТР + <ПТР -ЛТР

>100 2.3 50-60

Е0813,814АА >100 2-3 >100

ИН06А -10 -10 -10

Остаток ЯПОб препятствует связыванию второго иона М£5+ либо за счет своего положительного заряда, либо благодаря нейтрализации остатка Ю814, который в отсутствие НД106, возможно, приближается к сайту связывания второго иона М^1* н способствует более прочному его удерживанию. Вероятность такой "подвижки" вполне можно допустить, исходя из анализа трехмерной структуры дрожжевой РНКП 1!.

Ярким качественным отличием мутантов £0813,814 АА н 1Ш06А от \"/Т РНКП является то, что РР| вместо классического пирофосфоролнза стимулирует у этих ферментов экзонуклеазную активность (рис. 6А, дорожки Юн 15).

Некомплемект арный (1ТТР в случае мутанта ВДШ,814АА стимулирует экзонуклеазную {наивность а 2-3 раза эффективнее, чем ^Т РНКП. Это может быть объяснено повышенным сродством мутантиой нолнмеразы к стимулирующему нуклеогнду: КД(ЗТТР) ~ 0.35±0.1 мМ (для ШТ 0.8±0.1 мМ).

Для мутанта ЯП Об А мы не наблюдали стимуляцию экзонуклеазной активности некомолементарными Ш? (ср. дорожки 14 и 16, рис. 6А).

Для мутанта N45 8 А в присутствии пирофосфата наблюдается обычный пирофосфоролнз (дорожка 20), однако при добавлении к этому мутанту некомплементарного (ИГР экэонуклеазкое вышепление практически не стимулируется (лишь в 2-3 раза). При этом константа диссоциации некомплементарного 4ТТР с мутантиой РНКП, оказалась существенно выше (более 5 мМ), чем для РНКП дикого типа. Таким образом, данная мутация, вероятно, нарушает связывание нехомплементарого ШР с РНКП (см. ниже).

14

Пирофосфат может «шмми» либо пирофмфоролт, либо эюонуклелзный гидролиз РНК. Как сказано выше, в присутствии РР{ у мутантов £0813,814АА и 1Ш06А наблюдается стимуляция экзонуклеазного выщесяения 3'-концевого нуклеотида. Является ли этот эффект специфичным только для данных мутантов, либо он отражает то, что пирофосфат в зависимости от условий может стимулировать либо пирофосфоролнз, либо экэонуклеазное вышепление? На рте. 7 показано действие днрофосфата на мутант Е0813.814АА и полимеразу дикого -тала в зависимости от рН.

Как видно из рис, 7А, для мутанта Е0813,814АА при рН 6 в присутствии РР| пирофосфоролнз (образование ШР) происходит интенсивнее, чем экзонуклеазиый гидролиз. При рН>7 пирофосфат стимулирует исключительно экзонуклеазный гидролиз. В случае \УТ РНКП (рис. 7В) пирофосфат также стимулирует экзонукяеазную активность, но только при рН выше 9 (такой же эффект наблюдается для мутанта Ж58А). Две эти реакции, по-видимому, являются конкурентными, и повышение рН способствует увеличению стимуляции пирофосфатом экзонуклеаэной активности по сравнению с пнрофосфоролизом. Мутации усиливают этот эффект.

Е0813,814АА Ш

Ряс, 7. Влияние рН ва пирофосфоролнз и Эоонуклеазную активность мутанта ВД81Э,814АА и ШТ РНКП. На рисунке показаны продукты выщеплення З'-концевого нуклеотида в ТЭК-2Ш

Наиболее простым объяснением этих результатов на наш взгляд является то, что пирофосфат может связываться в активном центре РНКП двумя альтернативными способами, зависящими от мвкроокруження, на которое влияют рН и мутация.

Стимуляция зюонуклеазной активности щелочными рН. рН-зависимости начальных скоростей экзонуклеазньк реакций для мутантных РНКП И полямеразы дикого типа приведены на рис. 8 (для мутанта N458А рН-зависимость совпадает с зависимостью для

МП" РНКП).

В интервале рН от 6 до 9 экзонуклеазная активность всех ферментов стимулируется приблизительно в равной степени, несмотря на то, что из-за высокого сродства ко второму иону исходный уровень реакшк у мутанта ЇШ06А сущестьенио выше, чем у мутантов Е0813,814А, N43 8А и РНКП. Вероятно, рост скорости экзонуклеазной реакции в этом

15

интервале рН преимущественно объясняется увеличением степени депрогонизании молекулы вода, участвующей в катализе реакции.

В интервале рН от 9 до 10 обнаруживаются серьезные различия в рН-зависнмости скорости экзонуклеэзной реакции у мутантов и 'ЛТ РНКП (рис. 8). Скорость реакции у полимеразы дикого типа в этом интервале возрастает в 7-10 раз (для мутанта N458А рН-зависимостъ совпадает зависимостью для Ч/Т РНКП), тогда как для мутантов Я11 Об А и Е0813,814АА скорость увеличивается лишь в 1,5 и 2раза, соответственно.

-ОТ

- ЕМ1Э.814АА

- ЕШОбА

'Е 2 0.25 0.20

Рис, 8. рН-зависимости начальных скоростей эюонуклеазной реакции для

мутантов и полимеразы

1.8 С- дикого типа (для мутанта

1.5 ^ К458А рН-зввнсимоиь

1.2 '£ — совпадает с зависимстью

09 дляШТРШП)

V1 10

Мы полагаем, что причиной этих различий является положительный заряд остатка Ю106, который в этом интервале рН, вероятно, частично нейтрализуется (известно, что р*члг» ~ 12.5, но эта величина сильно зависит от белкового окружения и вполне вероятно, что в нашем случае она снижена за счет находящихся рядом положительно заряженных аминокислотных остатков). В случае РНКП, благодаря частичной нейтрализации при рН выше 9 положительного заряда остатка ЯНОб, остаток 0814, по-видимому, может придвигаться к сайту связывания второго иона М^, что приводит к усилению связывания последнего и, соответственно, к увеличению скорости экзонуклеазной реакции. Возможность такой подвижки и участие остатка 0814 в связывании второго иона у РНКП допускается при анализе трехмерной структуры полимеразы. Действительно, оказалось, что если в интервале рН 7 - 9 величина Кй(Мй-11) для РНКП неизмерима высокая, т.к. скорость реакции возрастает линейно при увеличении концентрации то при рН 10 эту константу удается измерить - она оказалась равной 50-60 мМ (табл. 2). В то время как для мутантов Ю106А и Ш813,814АА во всем интервале рН (от 7 до 10) значение Кч^Т^-П) не меняется (около 10 мМ и выше 100 мМ, соответственно) (табл.2).

Слабая стимуляция экзонуклеазной активности мутантов Ю106А и Е0813,814АА в интервале рН 9-10 может быть объяснена, как и для интервала рН 6 — 9, эффектом повышения степени депротоннзации воды.

Моделирование активного центра РНКчіолимеразм E-coli. На основании вышеизложенных результатов нами предлагается модель активного центра РНКП Kcoli (рис. 9, 10). Построение модели основывалось на следующих принципах: I) реакции полимеризации, пирофосфоролнза и экзонуклеазного гидролиза осуществляются единым активным центром; 2) в катализе реакций принимают участие два иона Mg2"*, один из которых прочно связан с активным центром (Mfi-Q. второй - слабо (Mg-П); 3) в реакция полимеризации Mg-П стабилизируется в активном ценіре р,у-фосфатамв входящего NTP, а в случае стимулируемой экзояуклеазной реакции - р.у-фосфатами стимулирующего некомшгемектарного NTP; 4) реакции проходят по $п2-механизму (Yee at al, 1979), т.е. нуклеофнльная группа атакует молекулу строго с противоположной стороны от уходящей группы (атакующий нуклеофнл, атахуемая молекула и уходящая группа находятся на одной линии), при этом направления нуклеофильной атаки при полимеризации и при экзонуклеазной реакции (а парофосфоролизе) противоположны; 5) в соответствии с геометрией реакции два нона Mg^ должны находиться на одинаковом расстоянии от несвязанного атома кислорода атакуемого фосфата и располагаться на линии, параллельной направлению нуклеофильной атаки.

Ион Mg-I обнаруживается в каталитическом центре при разрешении кристаллических структур РНКП. Его удерживают три остатка Asp из консервативного NADFDGD мотива Р'-субъедкницн. Моделирование сводилось к расположению в активном центре второго иона магния (таким образом, чтобы он отвечал требованиям реакций полимеризащш/пирофосфоролиза и экзонуклеазного гидролиза), а также входящего NTP при полимеризации и стимулирующего некомплементарного NTP при экзонуклеазном расщеплении.

В предлагаемых моделях за основу взята структура тройного элонгационного комплекса РНКП П дрожжей, в котором З'-конец РНК занимает /+/ сайт в активном центре (Gnattetal., 2001).

1. Структурная модель активного цецтра в случае 3'^>5'-экзонуклеазной реакции в отсутствие стимулирующего NTP (схец{> приведена на рис. 9А"|. Расположение РНК, аминокислотных остатков н нона Mg-I полностью соответствует их расположению в структуре РНКП П (Gnart et al., 2001). Ион Mg-П помещен в структуру активного центра в соответствии с геометрией предлагаемого двуметаллического механизма катализа. По аналогии с известным двуметаллическим механизмом 3—>5'-экзонуклеазной реакции, описанным для ДНКП I (Brautigam and Steitz, 1998), оба иона Mg^ располагаются параллельно линии нуклеофильной атаки и на одинаковом расстоянии от несвязанного атома кислорода атакуемого фосфата. Ион Mg-I координируется тремя консервативными

17

остатками Asp из мотива NADFDGD Р'-субьетиннцы (D460, D462 и D464). Ион Mg-П координируется двумя из этих аспартатов (D460 и D462). Гидролиз фосфодиэфирной связи происходит за счет нуклеофильной атаки, осуществляемой депротонированной молекулой воды. В предлагаемой модели молекула воды координируется и активируется ионом Mg-П и, в соответствии с механизмом реакции (Sa2), располагается на одной линии с атакуемой фосфодиэфирной связью. В случае 3 '-+51 -экзонуклеазвой реакции у ДНКПI в координации молекулы воды помимо иона Mg2* принимают участие еще два аминокислотных остатка. В нашем случае мы не обнаружили подходящих кандидатов для этой роли.

Как сказало выше, в нашей модели мы рассматриваем возможность регуляции связывания второго нона MgI+ за счет дополнительной его координации аминокислотным остатком D814 (рнс. 9Е), вследствие чего увеличивается скорость экзонуклеазной реакции. Согласно исходной струхтуре, остаток D814 образует электростатическую пару с R1106 и в таком состоянии не принимает участия в связывании металла. На основании экспериментальных данных мы предполагаем, что в определенных условиях (увеличение рН, мутация) взаимодействие DS14 с R110Ó нарушается, вследствие чего "высвободившийся" D814 может принимать участие в связывании второго иона Mg2*. При этом мы допускаем небольшую подвижку боковой цепи D814, хотя не исключена возможность подвижки всей петли, на шторой находите* этот остаток.

2. Структурная модель активного пентра р случае ?'-5'-экзонуклеазной реакпии в присутствии стимулирующего некомплементарного NTP (тс. 9С. рис, 10А. О. Расположение РНК, аминокислотных остатков, ионов Mg*+ и молекулы йоды - как в предыдущей модели. В координации иона Mg-П помимо остатков D460 и D4Ó2 принимают участие р,у-фосфаты стимулирующего нуклеотнда. Их расположение относительно иона

выбрано таким образом, чтобы не нарушалось координационное взаимодействие металла с молекулой воды. При этом у-фосфат оказывается в окружении трех абсолютно консервативных положительно заряженных аминокислотных остатков р-субъедишщы К1073, R1I06 и R678, Нуклеозидную часть и a-фосфат стимулирующего NIP мы располагаем на две "вторичного" хавала, вдоль NADFDGD сегмента таким образом, что азотистое основание оказывается в окружении абсолютно консервативных остатков субъединицы N458, Е925 и Q929, а З'-гндроксял рибозы - вблизи остатка Е813 субъединицы (подробнее о сайте связывания некомплементарного NTP говорится ниже).

3. Структурная модель активного пентра в полимеразрой реакции в присутствии входящего NTP Срис. 9В. рис. 10BV Расположение РНК, аминокислотных остатков и ионов Mg2* - как в предыдущих моделях. В координации иона Mg-ll помимо

остатков D460 и D462 принимают участие Р.у-фосфаты входящего нуклеотида. NTP расположен по аналогии с расположением входящего dNTP в известных структурах активных центров ДНК-полимераз (Pelletier et al., 1996; Huang et al, 1998; Li et al., 1998), Расположение у-фосфата при этом приблизительно такое же, как у у-фосфата, стимулирующего экзолуклеазный гидролиз NTP, в то время как р-фосфат расположен по-другому, так что кислород, связывающий а- и (i-фосфаты (bridging oxygen) оказывается на месте молекулы воды в случае экзонуклеазной реакции. Расположение а-фосфата и нукдеознда полностью соответствует положению 3'-концевого остатка NMP РНК в исходной структуре.

А

В

<H)-slte

С

D

E-sjta

Е

(i+i>iite

Рис. 9. Скемы миашпиов различных реакций, катализируемых активным центром РНКП£соЛ. А. Механизм З'—З'-экзонуклеазнойреаими в отсутствие сгамупврующего трвфосфата. В. Меишизм реахшш полимеризации, Изображено переходное пентакоординаииоаное состояние атакуемого атома фосфора входящего NIF. С Механизм 3*-»5'-э1оонуиеазноЙ реакции в присутствии стимулирующего некомппемевдарного NTF. Схематично обозначено расположение аминокислотных остатков, образующих Е-сайт, D. Два альтернативных способа связывания сирофосфата в активном центре РНКП. Стрелкой показана возможность перехода тшрофосфапга из одного положении в другое (при этом вон Mg-11 остается на месте). Е, Возможность регуляции связывания второго лона Mg1* за счет дополнительной его координации остатков DS14

Модель активного центра удовлетворяет требованиям 8п2-мехаиизма катализа реакций. При этом нояы Mg^ функционально меняются ролями, а направление нуклеофильной атаки меняется на противоположное для реакции полимеризации и для экзонуклеазного гидролиза (и пирофосфородиза) (ряс. 9В). В случае реакции экзонуклеазного гидролиза ион Mg-П ориентирует и активирует молекулу воды (за счет понижения значения рКа, что способствует депротонизащш) с образованием гидроксил-иона, который атакует атом фосфора "атакуемой" фосфодиэфирной связи; ион Mg-I взаимодействует с уходящей труппой и, действуя как кислота Льюиса, облегчает разрыв связи и высвобождение 3'-оксианиона за счет нейтрализации образующегося на нем отрицательного заряда. В случае же реакции полимеризации ионы магния, как было сказано, функционально меняются ролями: ион Mg-I координирует и активирует З'-ОН труппу концевого NMP РНК, с образованием О'-иона, который атакует а-фосфат входящего пуклеотида, тогда как ион Mg-П выполняет роль Mg-I в случае гидролиза (взаимодействует с уходящей группой, облегчает разрыв связи и высвобождение З'-оксианиоиа за счет нейтрализации образующегося на нем отрицательного заряда).

Оба иона в случае как гидролиза, так и реакции полимеризации

взаимодействуют с несвязанным атомом кислорода атакуемого фосфата, стабилизируют переходное дентакоординациоаное состояние атома фосфора и способствуют его правильной ориентации в активном центре.

На рнс. 9D представлена модель, демонстрирующая два альтернативных способа связывания пирофосфата в активном центре РНКП (см. также рис. 7). При пнрофосфоролнзе положение пирофосфата совпадает с положением |3,у-фосфатов входящего NTP при полимеризации. В случае, когда РР; стимулирует экэонуклеазное расщепление - Р,у-фосфатов стимулирующего некомплеметарного NTP. Из анализа модели следует, что цирофосфат может перемещаться из одной позиции в другую без изменения положения (относительно фермента) связанного с ним иона Mg-П.

Сайт с*язы*ания некомплементарного нуклет идтрифосфата. Нами постулируется наличие сайта связывания некомплеметарного нуклеозидгрифосфата (Е-сайта, E-site) (рте. 10А, С). По нашей модели, описанной выше, у-фосфат некомллементарного NTP занимает примерно такое же положение, что и у-фосфат входящего иуклеотида в случае реакции полимеризации, и находится в окружении трех абсолютно консервативных положительно заряженных аминокислотных остатков субьедшнщы К1073, R1106 к R678. Расположение (1-фосфата некомплементарного NTP отличается от положения р-фосфата входящего нуклеотида при полимеризации. Он расположен относительно иона таким образом, чтобы не нарушалось координационное

20

взаимодействие металла с молекулой воды (в случае полимеризации на месте воды расположен атом кислорода, находящийся между о,р-фосфагами). То, что р,у-фосфаты могут связываться двумя разлитыми способами (при полимеризации и при стимуляции гидролиза), подтверждается данными о том, что пирофосфат в зависимости от условий может стимулировать либо пнрофосфоролиз, либо экзонуклеазиый гидролиз (рис. 7, рис. 9П).

В

Рис. 10. Модель активного цеятра РНКП Е,сЫ1. Модель построена на основе кристаллографических данных (Сгипег et aL, 2001) и результатов, полученных в настоящей работе. А. Структура активного центра в случае стнмулнроваиіой некомщемекгер-ным МТР мчонуклеаэиой реакции. Щелочные а.*, остатки выделены синим, кислые - красным цветом. З'-концевой остаток РНК находится і і+і сайте и спарен с основанием матричной пели ДНК. Иов Mg-1 расположен так, как он обнаруживается как в этой, так н в других структурах (Zbsrng et aL, 1999; Vassylyev et 2002). Ион Mg-ll помешен нами на основании зкеперименгаяьных данных и в соответствии с геометрическими требованиями механизма катализа реакций. Зеленым цветом показав второй ион Mg , который обнаруживается в работе (V&ssylyev et aL, 2002), фиолетовым - t работе (Cramer etal., 2001).

Ит наших экспериментальных данных следует, что ни тот, ни другой не принимают умасти» в зкзонуклеазной реакции; кроме того, их расположение не соответствует геометрии предполагаемого двумеїаллического механизма кагал та. Молекула воды не показана. Стимулирующий нуклеотид расположен таким образом, что его основание оказывается в окружении абсолютно консервативных остатков (Г-субъешОашьг N438, ЕІ074 и Q107S, а 3*-пцроксил сахара вблизи остатка £813 ^-субьеаишши, образуя с его карбоксильной группой вадородку» связь. Этот сайт обозначен как E-site. В. Стереонзобраясешк активного центра при тищмернзаіши. Верхняя чаешь: молекулы показаны в виде палочек. В виде шариков показаны два нона мяли» (Mg-1 - выделен малиновым цветом, Mg-II - голубым), входящий NTP, удерживающий и координирующий р,т-фосфатами нон Mg-ll показан желтым цветом, показаны И подписаны важнейшие а.к, остатки. Нижняя часты модскулы показаны объемными, демонстрируется отсутствие стерических перекрываний между молекулами. Нухлеотнд РНК, занимающий f-caftr, не показан. На верхнем я м&еяем рисунках активный центр показан под разними углами. С. Стереоизображение активного центра при экзоиухлеазиой реакции. Верхняя чисть: показаны два концевых нуклеоткда РНК, занимающие і и /+ /-сайты, стимулнрущнй нукдеотяд, удерживающий н коорди-ннруюшкй р,у-фосфатами нон Mg-II и занимающий Е-сайт, выделен желтым цветом. Стрелкой указана молекула волы, которая атакует фосфодгофнрную связь 3'-концевого нуклеотяда. Нижняя часть: Нуклеотид РНК, занимающий (-сайт, не показан. На верхм&и н нижнем рисунках активный центр показан под разными углами

Нуклеозндную часть и а-фосфагг стимулирующего NIP мы располагаем на дне вторичного канала, вдоль NADFDGD сегмента таким образом, что азотистое основание оказывается в окружении абсолютно консервативных остатков N458, Е925 и Q929 р'-субьеднннцы, а 3 '-гндроксил рнбозы - вблизи остатка ESI3 Р-субьедшшцы. Последнее согласуется с тем, что экзокуклеазная активность мушнта ED813.814AA в присутсвии некомплементарного NTP стимулируется в 2-3 раза сильнее, чем WT РНКП (вероятно, имеется небольшое стерическое препятствие между боковой группой остатка E8I3 и 3*-гидроксилом рнбозы некомплементарного NTP), Модель подтвержаается и тем, что замена отстатка N458 ва аланин приводит к тому, что экзокуклеазная активность мутанта N458A практически не стимулируется некомплементарным NTP. При этом константа связывания векомплементарного NTP оказалась выше 4 мМ (для WT около 0,8±0.1 мМ). Зависимость скорости экзонуклеазного гидролиза в присутствии стимулирующего NTP оказалась линейной, так же как и в отсутствие NTP, в то время как дат WT РНКП в присутствии трифосфата быстро достигалось насыщение по Mg (см. рис. 5). Все это говорит о той, что некомплементарный стимулирующий NTP практически не связывается с мутантаым ферментом.

Мы предполагаем, что Б-сайт является предварительным местом связывания входящего NTP при синтезе РНК. Анализ модели показывает, что NTP, находясь в этом сайте, повернувшись вокруг Mg-H и не отрываясь от него, может перейти в 1+1 сайт (при этом сам Mg-П остается на месте). Учитывая, что время, когда i+1 сайт свободен от 3'- конца РНК, очень невелико (3'-концевой нуклеотнд РНК находится в равновесия между i и (+/ сайтами), такое предварительное связывание субстрата должно ускорять синтез (другими словами, можно сказать, что повышается локальная концентрация NTP непосредственно в районе активного центра). Вероятно, этим объясняется пониженная скорость элонгации у мутанта N458А по сравнению с WT РНКП.

Замена каталитических acnapmamot в активном центре РНКП блокирует палимеризацию/пирофосфоролиз и нуклеазный гидролиз, катализируемый РНКП. Для подтверждения предложенной модели единого , активного центра РНКП Rcoli, осуществляющего все реакции, катализируемые этим ферментом, нами были проанализированы ферменты, содержащие замены P'D460N, (TD462N и P'D464N. Остатки D460, D462 н D464 входят в состав абсолютно консервативного мотива NADFDGD в Р'-субьеднннце и образуют каталитическую триаду, удерживающую ион Mg-I (Zhang, et at., 1999; Cramer et al., 2001; Gnatt et al., 2001; Vassylyev et al., 2002; Zaychikov et al„ 1996) н, согласно нашей модели, принимающую участие в удержании нона Mg-H.

Все полимеризующие ферменты содержат в активном центре подобные каталитические триады, однако в случае ДНКП и односубьединичных РНКП только два остатка триады находятся рядом в первичной структуре (ВгаШЬіеат еі а1., 1993). Третичная структура активных центров также заметно отличается для ДНКП и односубьединичных РНКП, с одной стороны, и для многосубьединичных РНКП - с другой.

Все три мутанта, также как и мутант, содержащий тройную замену (ТШШбО,462,464ААА, їаусійкоу еі а1„ 1996), оказались не способными инициировать синтез РНК в системе, содержащей Т7А1 промотор. Этот результат нельзя объяснить неспособностью этих мутантов связывать промоторный фрагмент - было показано, что все три мутанта связывают ДНК так же, как и фермент дикого типа.

Была протестирована способность этих мутантов связывая, ион (ноны) металла. Для этого был использован метод "железного расщепления" (ТаусЬікої й а!., 1996), в котором вместо ионов к полемеразе добавляются ионы Ре24", связывающиеся с поднмеразой в том же сайте, что я ионы магния (\lg-l) (ТаусЬікоу еі аі., 1996). Как уже говорилось выше, этот сайт образован остатками 0460, 0462 и 0464. При добавлении ОТТ в качестве восстановителя, связанные ионы Ге2+ генерируют свободные гидроксильные радикалы (реакция Фенгона), которые, в свою очередь, разрушают как белок, так и нуклеиновые кислоты (если они есть) в радиусе около 10 А от иона. С помощью этого метода было продемонстрировано, что все мутавтные РНКП (свободные, а также связанные с ДНК), по-крайией мере в 20-30 раз хуже связывают ноны металла.

Так как на промоторном фрагменте все три мутантых РНКП оказались неактивными, для их тестирования нами была создана искусственная система из синтетических олигонуклеотидов, показанная на рис. 11 А,

Подобная система (другая последовательность и длина олигонуклеотидов), имитирующая в присутствии РНКП элонгационный комплекс, использовалась ранее (8і<іогепко¥ ет а1., 1998), однако в отличие от неё в вашей системе мы имеем возможность изучать помимо реакции полимеризации пирофосфоролиз и нухлеазную активность (эндонуклеазную активность) (рис. 11В). Роль нематричной цени ДНК, как было показано ранее (Яісіогепкоу « аі., 1998), заключается в увеличении стабильности элонгационного комплекса.

Все три мутантные РНКП оказались способными эдонгаровать РНК-праймер в такой системе. Отношение параметра Уцщ/К,,, (дня односубстратной реакции, в присутствии только одного нуклеотида — СТР) для мутантов и РНКП оказалось следующим 1ЙГГ : 046СМ : 0462М:Е>464М=1 : 1.8x10-4: 1.2x10°: 4x10^ (табл. 3).

taoqagaqoqaoa

Рнс. ] 1. Характеристика искусственной системы, использованной дна изучения свойств РНКП,

. -----------і содержащих мутация do каталитическим

I \ аспавгатаы агптвого центра D460N, D462N в

ÄS^S^crcTCCCTörteSSI WWNiNADFDGDMonfflP'^be™,)^

..........і Последовательность нуклеинового каркаса

S'-AUCOAOAGGGAC«' искусственного мокпшноиного компекса (ТЭК}.

Последовательность ДНК совладает с

3 __ _| и последовательностью Т7А1 промотор» ■ регистре

-Ii нт.... +35 нт. относительно точки начала тркнекрипнии. ДНК-депи полностью юишимен-тарны друг другу. РНК-араймер комплементарен матричной де cm РНК, за жключекиен двух нуклееггндов с У-конпа. В жперимектах использовалась РНК, содержащая радиоактивную метку [ЧР] на J'-жонце. Длд полученм TECJ3 1 пиол иммобилизованной на Ni-NTA агароэе РНКП инкубировали с I nuwi смеси матричной ДНК и РНК-праймера в течение S мин при 37 °С. После этого РНКП промывалась от нее вязавшихся нуклеиновых кислот ХОЛОДНЫМ ТВ (см. подпись к рис.4), ее содержащего еонов Me1*, во избежание эндонуклеолитичккого расщсплснй*. После промьівкн к комплексу РНКП'матрнчнааДКК/РНК добавляю 10-кратный избыток нематричной ни™ ДНК, ивду&фовали 5 мин при 37 "С к промывали холодным ТБ без ионов металла. В, Активности, ва&гюдаемые в искусственном ТЕС13: эндонуклеамгое выщетшеиие (дорожка 2\ эндонуклеазное выщепленне, стимулированное белковыми факторами GreA и GreB (дорожки 6 и 7), реакции полимеризации (дорожки 3,4), шфофосфоролаз (дорожка 5)

Таким стразом, замена любого из трех каталитических аспартатов приводит к резкому снижению скорости катализа. Для бактериальной ДНКП I, например, замена только двух остатков триады приводит к практически полной инактивации фермента (скорость падает в 500-1000 раз), в то время как замена третьего остатка приводит лишь к менее чем 10-кратному снижению скорости. Для HIV RT все три остатка, так же как и в нашем случае, абсолютно необход имы для катализа.

Интересно, что зависимости скорости элонгации РНК (в одяосубстрапіой реакции) от концентрации ионов Mg1* для мутантных ферментов и WT РНКП отличаются не сильно. Значения констант диссоциации Mg1* с активным центром РНКП, полученные из этих зависимостей, оказались следующими: для WT РНКП 100-150 мкМ, для мутантов около 600 мкМ, Разница в величинах K^Mg2*) между мутантами и ферментом дикого типа в этом случае существенно меньше, чем в случае просто связанных с промотором ферментов (20-30 раз, по методу "железного расщепления", см. выше). Таким образом, в присутствия входящего NTP при полимеризации остатки D460, D462 и D464 не вносят большого вклада в удержание ионов магния (при этом нов Mg-II, вероятно, привносится в активый центр трнфосфагом, a Mg-I стабилизируется его «-фосфатом, что следует кз приведенной выше модели). Роль каталитических аспартатов в этом случае, вероятно, заключается в правильной

коордиинации ионов нарушение которой может приводить к столь сильному

снижению скорости реакции.

Таблица 3. Кинетические параметры мутантных полимераз и полкмераэы дикого типа в системе синтетического элонгационного комплекса (ТЕС 13)

ПИАР: VI ІМ62М Ш64М

1. Эдокгаши РНК (2 мМ СТР, 2 ГС), Ксл ШШ'1 і ЙГ злкіаг1 1.4 0.7

ґтмоснтляьне 100 0.07 1.8 0.9

Ъ КпКСт икМ ' 7Ь 20-30 #0-100 200

3. Ксл'Кяици СТР: 11 0.2x10' 1.4x10' 0^*10 і

относительно 100 0.013 о.п 0.04

4°. Эндонугаеазное расщепясиие РНК (10 мМ М^Ч КоЬэ, миіґ1: относительно а и 100 ТхЮ"* 0.І їхШ"1 о. и Иґ 0.07

5'. Ркшепление РНКюрнсуктіки 1 мМ РРІ ([ОмММі5*),КоЬімин : относительна опшвсипнльно "н^стимулиру^мог^^ расщбпдїни*: ая т 5.? ТиМ4 0.09 1 їхІО" 0.1 4 1СҐ 0.01 !

в". Эндомумеазнм расщепление РНК ■ присутствия 20>крагпого нзбшка ОгеА, КоЬа, мни'1: ошкшимо относфпмьнб "нватапншругмою" раацегаст*: 0.« ¡00 6.6 ЇХІО'1 0.2 2.9 2x10* 0.02 1 3,7x10"* 0.4 37

7*. Энаонуклеаэкое расщепление РНК в присутствии 20-храгного юбыты СЗгеВ, КлК мин'1: ллмгосцтевьш Н Т.% ойщосятелъно "нестимулцруемого" расщеплены: 0.6 і и 1<Ґ 0.17 и ОЛхПҐ 0.033 1 0^x10" 0.033 2

"Все измерении проводились на линейном участке зависимости скорости реакции от времена (не более 20-30% исходного количества В-мерной РНК переходило в продукт реакпии - 14-ыер в случае полимеризации, И-мер в случае эндонуклеазного растепления и пирофосфородиза).

•Велнчкка экстраполирована из величины скорости редошш при I мкМ СТР, учитьюа*. что Юл-7 мкМ. ^Ввиду высокой скорости элоитапви величина Кщ для РНКП определена для СТРаЗ (дна мутанта значения Кт дня СТР н СТРої схожи), 'Определилось іфн Э7°С

Скорость эндонуклеазното расщепления также оказалась существенно снижена у всех трех мутантных РНКП по сравнению с ферментом дикого типа. Относительные скорости выщепленяя 3'-концевого динуклеотида РНК оказались следующими: 1УТ : 154бОИ: П462И : = 1: 5x10'3 : 1.4x10'3 ; 0.7x1 О*3. В присутствии (ЗгеА и СтеВ факторов, стимулирующих эндонуклеазную активность, скорость расщепления в случае мутантов оказалась на 3-4 порядка ниже скорости расщепления у полимеразы дикого типа (табл. 3).

Что касается пирофосфоролиза, то только у одного мутантного фермента, содержащего замену ЕМЙЫ, добавление РР[ стимулировало деградацию РНК (табл. 3).

Таким образом, данные, полученные при анализе ферментов, содержащих мутации по каталитическим аспаргатам, еще раз подчеркивают то, что как реакция полимеризации (пирофосфоролиза), так и реакции нуклеазяых расщеплений РНК осуществляются одним каталитическим центром РНКП.

Выводы

1. ДНК-нолнмераза IК coli и обратная транскршгдаа вируса мвелобластоза птиц способны катализировать реакцию выщепления 3'-кошевого иуклеотидного остатка ДНК в присутствии высоких концентраций некомплементарных нуклеошц-5'-трифосфатов. При этом З'-концевой остаток выщепляется в виде динуклеозид-5*,5*,-тетрафосфата.

2. Динуклеозид-5*,5'-тетрафосфаты могут служить субстратами для различных классов ДНК-и РНК-полнмераз. Динуклеозид-5' ,5'' -три- и пенгафосфаты также являются субстратами для ДНК-полимераз, хотя и менее эффективными, чем тетрафосфаты.

3. РНК-полимераза E.coli обладает 3*—*5'-э>кзонуклеазной активностью.

4. Некомплементарные т/dNTP резко стимулируют эту активность.

5. На основе трехмджой структуры к данных, полученных при изучении 3'—*5'-экзонуклеазной активности, включающих в себя мутационный анализ, построена модель активного центра РНК-полямеразы Kcoli.

6. Все реакции, осуществляемые РНК-полимеразоЙ ЕсоИ (полимеризация, пирофосфоролиз, экзо- и эвдонуклеазные расщепления РНК), катализ*фуются одним активным центром.

7. Активный центр РНК-полимеразы Е.соН включает два иона Mg*4", Один из ионов прочно связан с активным центром (Mg-I); второй (Mg-П) - слабо. В случае реакции полимеризации ион Mg-II дополнительно стабилизируется в активном центре ß,y-фосфатами входящего NTP, в случае стимулированной зкзонуклеззиой активности - ß,?-фосфатами некомплементарного NTP. В зависимости от типа реакции (синтез либо деградация) ионы Mg2* функционально меняются ролями,

8. В работе постулируется наличие сайта связывания некомплементарного нухлеозидтрифосфата (Е-сайт), который может являться предварительным местом связывания входящего NTP и играть роль в отборе правильного NTP в процессе синтеза РНК,

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Sosunov V, V., Зашатала F., Victorova L. S., Gosselia G., Rayner В., Rrayevsky А. A. Stereochemical control of DNA biosynthesis. Nucleic Acids Res., 2000,28 (5): 11701175.

2. Victorova L., Sosunov V., Skoblov A., SMpytsin A., Rrayevsky A. New substrates of DNA polymerases. FEBSLett., 1999,453 (1-2): 6-10.

3. Victorova L.S., Sosunov V.V., Skoblov A.Yu., Murabuldaev A.M., Alexandrava LA„ Rrayevsky AA. "New substrates of DNA polymerases. New terminating substrates of HIV reverse transcriptase". Special Issue of "Current problems ofmolecular genetics and cell biology", 2000, P. 258-264.

4. Sosunov V., Sosunova E„ Mustaev A., Bass I., Nikiforov V4 Goldfarb A. Unified two-metal mechanism of RNA synthesis and degradation by RNA polymerase. EMBOJ,, 2003,22(9): 2234-2244.

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от01.12.99 г. Подписано к печати 23.10.2003 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л, 1,5. Тираж 110 экз. Заказ 846. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. МВ Ломоносова,

#210 3V