Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новый TRITHORAX-ассоциированный регуляторный элемент в промоторной области гена fork head в Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Новый TRITHORAX-ассоциированный регуляторный элемент в промоторной области гена fork head в Drosophila melanogaster"

На правах рукописи

Ряховский Алексей Алексеевич

Новый TRITHORAX-ассоциированный регуляторный элемент в промоторной области гена fork head в Drosophila melanogaster

03 00 03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□ОЗ176531

Москва 2007

003176531

Работа выполнена в группе «Эпигенетические механизмы регуляции активности генов» Института биологии гена РАН

Научные руководители: кандидат биологических наук С В Тиллиб

Официальные оппоненты- доктор биологических наук

Ведущая организация* Институт биологии развития им Н К Кольцова РАН

Защита состоится 19 декабря 2007 г в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002 037 01 при Институте биологии гена РАН по адресу 119334, Москва, ул Вавилова, д 34/5

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН по адресу 119991, Москва, ул Вавилова, д 32

Автореферат разослан /6 ноября 2007 г

Ученый секретарь

С Г Георгиева

кандидат биологических наук

Ф К Хасанов

диссертационного совета канд фарм наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Недавние исследования на дрозофиле и млекопитающих убедительно продемонстрировали, что продукты двух групп генов, позитивные регуляторы группы триторакса (trxG) и негативные регуляторы группы поликомба (PcG), являются ключевыми компонентами запрограммированного в геноме механизма поддержания дифференцированного состояния клеток (Ringrose, Paro, 2007, Schwartz, Pirrotta, 2007) Эти белки предотвращают изменения транскрипционной программы, характерной для данного типа клеток, через взаимодействие со специфическими регуляторными цис-элементами, называемыми PRE/TRE ("Polycomb-/tnthorax- response elements") Предполагается, что наличие PRE/TRE характерно для очень многих, если не всех, регуляторных генов, связанных с процессом дифференцировки Эти элементы отвечают за поддержание экспрессионного статуса конкретного гена-мишени, хотя при этом они могут находиться достаточно далеко от его промоторной области Изучение принципиальных особенностей самих PRE/TRE, деталей механизма узнавания их белковыми комплексами и последующего распространения специфического воздействия на экспрессию гена является крайне актуальной задачей для ученых, работающих в самых различных областях биологии и медицины от изучения структуры и функционирования генома, исследования механизмов поддержания плюрипотентности стволовых клеток и клеточной дифференцировки до выявления причин различных нарушений, ведущих к серьезным заболеваниям, таким как, например, раковые заболевания Об актуальности данной тематики говорит также заметное увеличение в последние годы количества публикаций, посвященных этой проблеме

PcG/TrxG-зависимая система регуляции активности гомеотических генов является очень консервативной в процессе эволюции Для всех генов PcG и TrxG дрозофилы существуют гомологичные гены у млекопитающих, мутации в которых либо критичны для развития организма, либо напрямую ассоциированы с возникновением рака В функционировании этой системы у млекопитающих важную роль играют LCR (локус

контролирующие районы), которые во многом могут быть схожи с регуляторными элементами дрозофилы PRE/TRE Поэтому изучение функционирования белков PcG и TrxG, как гомологов системы поддержания транскрипционной памяти млекопитающих, помимо фундаментального, может иметь еще и прикладное значение

Предполагается, что TRE и PRE в данном гене в значительной степени колокализуются и функционируют взаимоисключающе, в зависимости от типа клетки Однако, при более тонком картировании было показано, что эти элементы не идентичны Так, в дистальной промоторной области гена Ubx дрозофилы удалось разделить последовательности субэлементов, необходимых для формирования TRE, от расположенных по-соседству субэлементов PRE (Tilhb el al, 1999) Подобные работы с акцентом на исследование именно TRE довольно редки, несмотря на их актуальность Таким образом, ввиду недостатка информации, трудно выявить общие черты TRE и, соответсвенно, лучше понять принципы их функционирования, которые до сих пор остаются не выясненными С целью более точно локализовать и охарактеризовать еще один новый TRE и была предпринята данная работа

Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось выявление и изучение в регуляторной области гена fork head {fkh) элементов, связанных с функционированием TRX-ассоциированной системы поддержания активного состояния генов Соответственно, были поставлены следующие задачи

1) Выявить в протяженной промоторной области гена jkh элементы, непосредственно взаимодействующие с TRX в случае активного состояния гена,

2) Проверить т vivo функциональную значимость выявленных TRX-ассоциированных элементов как для связывания TRX, так и для экспрессии гена_/И,

3) Проанализировать распределение модификаций гистонов, являющихся маркерами активного состояния хроматина, в промоторной области гена jkh

4) Проверить наличие ассоциации TRE со структурами «ядерного матрикса» на примере изученного ранее TRE гена Ubx и исследуемого в этой работе TRE генаfkh

Научная новизна и практическая ценность работы В результате проделанной работы в регуляторной области гена fkh был обнаружен новый хромосомный регуляторный элемент, обладающий свойствами TRE С помощью трансгенной конструкции, содержащей энхансер слюнных желез, промоторную часть гена fkh и анализируемые элементы, обрамленные сайтами рекомбинации, позволяющими удалять эти элементы из встроенной в геном конструкции, была показана принципиальная функциональная значимость in vivo одного из них В частности, было показано, что четко детектируемый на политенных хромосомах в месте встраивания описанной трансгенной конструкции сигнал связывания белка ТРИТОРАКС (TRX) исчезал при вырезании изучаемого элемента из конструкции Кроме того, удаление этого элемента приводило к значительному снижению уровня транскрипции трансгенной "ттт-fkh" РНК Важно отметить, что используемую трансгенную конструкцию потенциально можно использовать как основу для создания универсальной тест-системы для функциональной проверки различных гипотетических TRE Иммунопреципитационный анализ с антителами, узнающими определенные модификации гистонов, являющиеся маркерами «открытого» хроматина (НЗК4теЗ, триметилированный лизин-4 в гистоне НЗ, и ацетилированные гистоны), показал значительное обогащение этими модифицированными гистонами промоторной области гена fkh в слюнных железах, в которых этот ген активен В то же время, в культуре клеток S2, для которых в данной работе было показано отсутствие заметной транскрипции гена fkh, подобного обогащения не наблюдалось Обогащение особо ярко выражено в районе выявленного TRE, и его уровень заметно снижается при приближении к промотору Интересно, что для НЗК4шеЗ показано также относительное обогащение и непосредственно в районе начала транскрипции fkh Это может указывать на механизм прямого взаимодействия TRE с промотором гена-мишени Помимо этого, в работе

получены данные, указывающие на колокализацию TRE в активном гене с местами ассоциации хромосом со структурами ядерного скелета

Представленное исследование имеет фундаментальный характер и вносит вклад в изучение механизмов функционирования системы поддержания транскрипционной памяти тканеспецифических генов Практическая значимость работы связана с тем, что млекопитающие (и человек, в частности) также обладают системой поддержания транскрипционной памяти, подобной таковой у дрозофилы Нарушения в работе этой системы являются причиной серьезных патологий, таких как лейкемии, ассоциированные с мутациями в гене регуляторного белка MLL1, являющегося структурным и функциональным гомологом дрозофилиного белка TRX у млекопитающих Таким образом, прогресс в понимании особенностей функционирования системы поддержания транскрипционной памяти может способствовать обнаружению возможных путей лечения подобных заболеваний

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на XII и XIII международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» и «Ломоносов-2006», а также на международной конференции EMBO "Nuclear Structure and Dynamics" (Монпелье, Франция, 2007)

Публикации По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ Из них статей -2, тезисов устных и стендовых сообщений на конференциях - 3

Стуктура и объем работы. Диссертация изложена на ¡гь страницах, содержит 'Л рисунков и 2 таблицы, состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и методов, Результатов исследования, Обсуждения, Выводов и Списка литературы, включающего ihi источников

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Иммунопреципитационное картирование TRX-ассоциированных элементов хроматина в промоторной области гена Jkh в клетках слюнных

желез D. melanogaster.

Данная работа базировалась на ботее ранних исследованиях, указывающих на существование сильного TRE в протяженной промоторной области гена fkh в D melanogaster Мы исходили из нескольких имеющихся принципиальных заделов и особенностей выбранной модели Во-первых, ген fleh был ранее достаточно детально охарактеризован в отношении локализации цис-регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию в различных тканях (IVeigei et al, 1990, Shou et al, 2001), в частности, был выявлен и детально охарактеризован энхансерный элемент, специфичный для клеток слюнных желез (sgE на рис 1 и 2) Во-вторых, было показано, что содержащий TRE промоторный участок (размером 8700 п н ) этого гена достаточен для возникновения нового сайта связывания TRX в месте встраивания соответствующего трансгена (Kuzin et al, ¡994) Подобный тест на связывание с трансгенной конструкцией на препарате политенных хромосом может быть использован в качестве фун-кцинального теста уменьшенного TRE Любопытно, что, если экспрессия fldi сильно подавляется в мухах, имеющих мутации по гену trx (Kuzin et al, 1994), то в случае мутации по гену Рс не обнаруживается заметных изменений в экспрессии этого гена (Jürgens, 1997), что отличает данный элемент от других PRE/TRE и может указывать на возможность существования TRE без выраженного PRE Наконец, в данной работе мы использовали поликлональные антитела против трех различных доменов белка TRX, полученные ранее (Kuzin et al, 1994, Лебедева, Типлиб, 2004) путем иммунизации кроликов Параллельное использование антител к различным доменам одного и того же исследуемого белка представляется принципиальным для повышения достоверности результатов иммунологических исследований, особенно таких, как иммунопреципитация сшитого формальдегидом и дробленного ультразвуком хроматина (метод X-ChIP), где очень высок неспецифический фон Нам

удалось существенно повысить разрешение данного метода с помощью комбинированых подходов на основе параллельного использования нескольких антител В частности, путем перекрестной гибридизации друг на друга библиотек последовательностей, первоначально получаемых с использованием различных антител мы смогли заметно повысить эффективность Х-СЫР эксперементов Мы провели несколько экспериментов, которые давали вос-призводимые результаты (один из типичных результатов представлен на рис 1 ,В) Из совокупности проведенных экспериментов нам удалось выявить в исследуемом районе два потенциальных ТЛЕ (размером около 700 п н ), находящихся на расстоянии примерно 7 т п н и 4 т п н от начала транскрипции гена ДА (рис 1 ,Б) Небольшое обогащение наблюдалось также для участка хроматина, непосредственно прилегающего к началу транскрипции

Помимо гибридизационного анализа мы провели прямой ПЦР анализ обогащения X-СМР проб путем включения радиоактивной метки в ходе многочисленных параллельных ПЦР с использованием 18 пар праймеров, подобранных с учетом покрытия всего исследуемого района Нормализованные по интенсивности сигнала в положительном контроле данные представлены на графике рис 1,А Выявляемые обогащающиеся фрагменты хорошо коррелировали с теми, которые были идентифицированы с использованием гибридизационного метода детекции, и соответствовали продуктам ПЦР, обоначенным на рис 1,А номерами 4 (основной обогащающийся район, находящийся в 7 т п н от начала транскрипции а также 10-11 (менее выраженный район в 3,5-4 тыс п н от начала транскрипции АЛ) На рисунке 1 представ тены суммарные результаты этих экспериментов, по итогам которых нами было отмечено 2 обогащающихся фрагмента РКНЗ-4 и РКН10-11 (названия даны в соответствии с номерами используемымых ПЦР-праймеров) (Ряхоеский, Тиллиб 2007) Особое внимание следует обратить наиболее удаленному от промотора выявленному ТЯЕ Этот элемент, соответствующий основному обогащающемуся материалу в большинстве наших экспериментов, хотя и не перекрывается, но находится в непосредственной близости от ранее выявленного регуляторного элемента sgE, определяющего специфическую

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

2_ _3. 4 ]_ 9_ 10 111213 14 1516 17

+ + + +

Б)

В)

1 кЬ

TRE2

J-1_I_L

fkh

Г

1-2 3-5

7-8 10-12 14-16

+ +++ 2-3 \ 6-7

8-10 12-14 16-17

I

— РЧ *г О N 03

IN m in fs 00 ° Г Г Г

- <ч m pi. ^ о гч r « in

ГШ r- r~.

- ••

,' I Г 1 ' 'i :

11 -

Рис. 1. X-ChIP анализ связывания TRX в предпромоторной области гена fkh

A) ПЦР анализ X-ChIP проб с 18 различными парами праймеров. Вверху: график показывает обогащение соответсвующих фрагментов (N1 ,N6 - различные антитела к белку TRX; ASH1 — антитела к белку ASH1). Внизу: показано положение анализируемых фрагментов ПЦР относительно промотора и sgE (обогащаемые фрагменты отмечены знаком «+»)

Б) Представлена схема регуляторной области гена fkh. sgE - энхансер слюнных желёз; TRE1, TRE2-два обогащающихся района (гипотетические TRE) , первый из которых обогащается предпочтительнее.

B) Анализ обогащенных X-ChIP проб саузерн-блот гибридизацией с использованием перекрывающихся ПЦР фрагментов синтезированных с гДНК (положение обогощаемых фрагментов отмечено знаком «+»). Представлен один из типичных результатов эксперимента (под радиоавтографом показана фотография разделённых электрофоретически фрагментов ДНК, переносимых на мембрану для гибридизации)._

экспрессию гена /кН именно в клетках слюнных желез. Стоит отметить, что помимо указанных выше последовательностей, мы наблюдали также некоторое специфическое обогащение

участка, находящегося вблизи качала транскрипции, в случае использования aHTH-TRX-N6 антител

В дополнение к TRE в данной работе были также картированы участки связывания другого белка тритораксной группы ASH1 (рис 1,А) Белок ASH1 является одним из самых функционально близких к TRX, и имеется много указаний на то, что эти два белка кооперативно участвуют в поддержании активности генов-мишеней и в значительной степени колокали-зуются (Rosovskaya et al, 1999), однако, эти два белка пока так и не удалось биохимически выделить в одном комплексе, и открытым остается вопрос, совпадают ли полностью или как близки участки их связывания в регуляторной области гена-мишени Недавно было продемонстрировано, что ASH1 взаимодействует с TRE при условии, что в этом районе происходит транскрипция малой некодирующей РНК (Sanchez-Eisner, 2006) При этом для связывания ASH1 требуется образование РНК-ДНК гибрида Наши данные указывают на непосредственную близость участков связывания ASH1 и TRX Если исходить из гипотезы, что и в данном случае образуются некодирующие регуляторные РНК, соответствующие последователь-ностям TRE, то также следует искать РНК в районах ПЦР-продуктов FKH3-4 HFKH10-11

Итоговые обобщенные результаты этого этапа работы представлены на схеме рис 2 В верхней части схемы обозначены определенные ранее энхансерные тканеспецифические элементы (Shou et al, 2001) Мы работали с клетками слюнных желез, и в них наиболее важным регуляторным элементом является sgE Далее на схеме указаны локализации обогащающихся в X-ChIP экспериментах элементов, являющиеся гипотетическими TRE (обозначены как TRE1 и TRE2) Для первого из них, как уже говорилось выше, наблюдалось значительно большее обогащение Интересный результат был получен при биоинформати-ческом анализе обогащения в исследуемой промоторной области участками связывания белков PHO("Pleiohomeotic"), Z("Zeste") и GAGA^aicropa(GAF) Обогащение этими участками, по-видимому, является характерной особенностью PRE/TRE, и была разработана

А)

fkh n

Б)

ps en1 z \ ..

ps - ' , v

z

ps4

z gaf

GAF

amg

TRE2

hg

If OAF PS

ps pf:p|,ps PM PS I ! ; 2

GAR gaf'

pf . -ps

liifilif 1

sgE

TRE1

gaf gaf

ps

PS ,Z

PSi îpf '

ps gaf i

ps gaf

! PF

! Ips

gaf ps ps z \

ps

pf ¡PS pm i ps Jjf pF

Z/ps s psî|ps

111 if if if

45 40 35 30 25 20 15 10 5 О -5

г\ .......... 1

А

... .1.

1

/

г .......... г/ и / \ .............А.......... /

\ 1 / \Л ; J \пг

8 9 10

Рис. 2 Обобщенные результаты X-ChIP экспериментов и их анализ.

*Ориентация промоторной области гена fkh на данной схеме противоположна той, что использовалась на рис. 1 для удобства сопоставления с данными биоинфрматического поиска PRE элементов (б).

А) На схеме обозначены определенные ранее энхансерные тканеспецифические элементы (amg -передней части средней кишки, pmg - задней части средней кигики, hg — задней кишки, mt — мальпигиевых сосудов, sgE - слюнных желез) и положение транскрипта distal fork hesd (dfk). В нижней части схемы указаны локализации выявленных предполагаемых TRE. Б) Биоинформатический анализ последовательности регуляторной области гена fleh проведённый программой ihttp://l)ibhen:.techfak.uni-bielefeld.de/prc>diclon'submission.html). оценивающей вероятность существования PRE в данном месте геномной ДНК, основываясь на локальном неслучайном обогащении сайтами связывания белков РНО, Zeste и GAF [16]. На рисунке отражены локализация этих сайтов связывания (сверху), а также положение гипотетических PRE (пики в нижней части рисунка), пердполагаемых в результате применения ппогпаммы.

программа поиска РЯЕ/ТЯЕ, основанная на выявлении районов геномной ДНК, обогащенной участками связывания этих трех белков СЛг'л^гаге еГ а!., 2003). На рис.2,Б отражен результат применения этой поисковой программы для исследуемой нами промоторной области гена

11

jkh Любопытно, что обнаруживается явная корреляция в локализации районов обогащения участками связывания трех упомянутых ДНК-связывающих белков и идентифицированных нами TRX-ассоциированных последовательностей (учитывая область промотора гена jkh, которая, возможно, является участком вторичного взаимодействия TRX, ранее связавшегося с основным TRE) Интересно, что для каждого из потенциальных PRE/TRE, предсказываемых для исследуемой промоторной области, можно указать идентифицированные ранее тканеспецифические энхансерные элементы (схема на рис 2,А) Возможно, в каждой конкретной ткани, где активен ген jkh, принципиально важны для активности гена энхансеры, специфичные именно для данной ткани, и соответственно принципиально важны расположенные по-соседству с этими энхансерами элементы, поддерживающие их активность (TRE) Соответственно, в тканях, где ген jkh неактивен, рядом с энхансерными элементами, по-видимому, формируются PRE Ранее было показано, что энхансерный элемент "sgE" является определяющим для специфической экспрессии гена jkh в клетках слюнных желез (Shou et al, 2001) В используемой для трансформации мух минимальной конструкции авторы помещали только этот элемент непосредственно перед промотором и видели слабую экспрессию репортерного гена именно в клетках слюнных желез В реальной же ситуации этот энхансерный элемент отстоит от промоторной области на 8 т п н , да и уровень экспрессии гена существенно выше Мы предполагаем, что выявленный нами в непосредственной близости от этого энхансерного элемента TRE1 отвечает за поддержание энхансера в «открытом» активном состоянии и, возможно, за пространственное сближение sgE с промотором

Исследование функциональной значимости гипотетических TRE in vivo при помощи трансгенных конструкций.

Для проверки функциональной значимости обогащающихся в X-ChIP экспериментах последовательностей нами была создана базовая трансгенная конструкция mim-Jkh (см

Рис. 3. Схема трансгенной конструкции

Вверху показана маштабированная схема исследуемой области. На схеме отмечены регуляторные элементы и выявленные гипотетические ТЯЕ (красные полоски с цифрами 1 и 2). Внизу показана схема созданной трансгенной конструкции, с указанием использрванных для клонирования последовательностей.

sgE - знхансер слюнных желез; РНК17-18 - область промотора; РКЮ-4 и РКН9-11 — гипотетические ТКЕ, которые могут быть удалены из конструкции использованием методом ГЯТ/УЬР- и/или Ьох/Сге зависимой рекомбинации (соответствующие сайты рекомбинации подписаны).

схему на рис. 3). В эту конструкцию мы включили энхансер слюнных желёз - уже изученный ранее элемент, необходимый для тканеспецифичной экспрессии гена /Ыг (Уйои е/ а!., 2001). Также в неё мы клонировали область промотора (длиной примерно 860 п.н), содержащую точку начала транскрипции гена (кИ и 5'-фрагмент первого экзона генаВключение части экзона позволило нам в последующем оценить влияние элементов конструкции на экспрессию гена-мишени путём измерения уровня транскрипции трансгенной РНК. Также стоит отметить, что мы наблюдали небольшое обогащение этого района в предшествующих Х-СЫР экспериментах, поэтому нельзя было исключить, что этот фрагмент важен для функционирования ТЯЕ. Помимо указанных элементов, конструкция также содержала проверяемые гипотетические ТЯЕ, выявленные нами на первом этапе работы и обозначенные РКНЗ-4 и РКН10-11. Чтобы иметь возможность более достоверно оценить значимость проверяемых элементов, мы поместили их между сайтами рекомбинации ЬОХ и РЯТ (рис. 3). Таким образом, при анализе трансгенных мух мы могли вырезать любой из этих элементов соответствующими рекомбиназами (СКЕ и РЬР), и получить производную 1рансгенную линию с конструкцией, находящейся в том же месте в геноме и отличающейся от исходной конструкции лишь отсутствием в ней одного из гипотетических ТШ5. Сравнение

А) Линия дикого типа В) Линия 2С с удалённым РКН10-11

Рис. 4. Иммунное окрашивание политенных хромосом антителами к ТИХ

Показаны результаты окрашивания для одной из линий трансгенных мух с удобным для детекции положением конструкции в районе /ООО / (на краю хромосомы рядом с двумя эндогенными сигналами связывания). Слева окрашивание по ПА Р1, справа анти-ТВХ.

А) Хромосомы дикого типа (отмечены эндогенные сигналы связывания ТЯХ в районах 9801 и 99В1). Б-Г) Трансгенная линия 2С и производные от неё линии (стрелочкой отмечено положение конструкции). Б — Линия с полной конструкцией; В — линия, с конструкцией с вырезанным фрагментом РКН10-11. Г-линия, с конструкцией с вырезанным фрагментом !гК[/3-4

конструкций, находящихся в одном и том же месте генома принципиально в подобном анализе, потому что, как известно, геномное окружение может существенно влиять на характер экспрессии гена. Благодаря такому подходу можно было более надёжно оценить как связывание белка ТЯХ с конструкцией, так и уровень транскрипции трансгена при наличии и отсутствии изучаемых последовательностей в конструкции.

В результате проделанной работы мы получили 8 трансгенных линий мух, местоположение конструкции в которых было определено методом инвертированного ПЦР. Пять из них мы отобрали для дальнейшего анализа (в трёх случаях конструкция находилась слишком близко к центромере, что сильно затрудняло анализ с помощью иммунного окрашивания). При иммуннофлюоресцентном окрашивании мы детектировали появление сильного сигнала связывания ТЯХ на политенных хромосомах в клетках слюнных желёз во всех анализируемых линиях (рис. 4). Положение и интенсивность нового флюоресцентного сигнала в месте встраивания конструкции мы сопоставляли с известными эндогенными участками связывания ТЯХ. Интересно отметить, что, как правило, новый сигнал окрашивания, как и в случае с эндогенным Дй, был одним из самых заметных.

Удаление фрагмента РКН10-11 из конструкции не приводило к какому-либо заметному эффекту, и мы по-прежнему наблюдали наличие нового сайта связывания ТИХ во многих ядрах различных исследуемых линий трансгенных мух. В то же время удаление из конструкции последовательности, наиболее сильно обогащающейся в иммунопреципитационных экспериментах (РКНЗ-4), было критичным и приводило к полному исчезновению флюоресцентного сигнала ТИХ в месте встраивания конструкции для всех анализируемых линий трансформированных мух (рис. 4). Таким образом, элемент РКНЗ-4 необходим для связывания ТЮС с конструкцией.

Помимо подтверждения значимости выявленного элемента для связывания белка ТЯХ мы также проанализировали влияние новых гипотетических ТКЕ на экспрессию гена-мишени. С этой целью для пяти исходных трансгенных линий и их производных (линии с вырезанными фрагментами РКНЗ-4 и РКН10-11) методом ПЦР в реальном времени мы проанализировали отношение уровня транскрипции РНК с трансгенного промотора ("пит-ДЛ" РНК) к уровню транскрипции мРНК эндогенного гена ¡кк (в качестве контроля). Интересно отметить, что уровень транскрипции с трансгенного промотора во всех линиях мух с базовой конструкцией тШ/кИ был сопоставим с уровнем транскрипции эндогенного генаДЛ: в четырёх случаях из пяти отношение уровней транскрипции составляло 40-80%, а в одном случае (линия 3-ге<1) уровень транскрипции с трансгенного промотора был даже втрое

1 оригинальная констр№«я ■ конструкция с удаленным ИОШЫ1 □ конструкция с удаленным РКНЗ-4

4-гес1 бВ-УУп 2С-геё 3-гес1 Ш-рУУп

Трансгенные линии мух

Рис. 5. Анализ уровня транскрипции «трансгенного» /кк в оригинальных трансформированных линиях и в производных из них На рисунке показано отношение уровней транскрипции «трансгенного mini-fk.Ii» к эндогенному/кИ для пяти различных оригинальных линий трансформированных мух и производных от них линих (с удалением указанных проверяемых элементов).

выше (рис 5) Во всех случаях при вырезании фрагмента ККНЗ-4 мы детектировали существенное снижение уровня транскрипции в несколько раз по сравнению с базовой трасгенной конструкцией (для различных линий уровень транскрипции снижался от 2 до 10 раз со средним значением примерно в 4 раза) (рис 5) В то же время удаление из конструкции фрагмента ИСН10-11 практически не оказывало влияния на уровень транскрипции

В результате описанных выше экспериментов мы идентифицировали новый ТЛЕ, расположенный в 7 т п н выше промотора гена ДА Нами было показано, что этот новый элемент важен как для связывания белка ТКХ, так и для экспрессии гена ДА в секреторных клетках слюнных желез личинки дрозофилы Этот элемент расположен поблизости от энхансера слюнных желез, что может быть важным обстоятельством функционирования данного ТКЕ

Также стоит отметить дополнительную ценность проделанной работы Мы впервые создали достаточно компактную конструкцию (3 т п н, включая сайты рекомбинации для удаления проверяемых последовательностей), включающую все необходимые элементы для формирования нового сайта связывания ТКХ, легко детектируемого на политенных хромосомах при иммунном окрашивании Мы показали, что удаление из конструкции небольшого фрагмента, при сохранении всех других регуляторных элементов, критично для связывания в этом районе белка ТЮС Таким образом, на основе созданной нами конструкции теоретически возможна функциональная проверка других гипотетических ТЯЕ путём замены выявленного нами ТЯЕ гена ДА внутри конструкции на проверяемые последовательности Поскольку в конструкцию входят регуляторные элементы, определяющие экспрессию гена ДА в клетках слюнных желез, можно ожидать формирование ТЮС-комплекса на ТЯЕ внутри конструкции, которое легко детектируется иммунным окрашиванием политенных хромосом, даже в том случае, когда ген, находящийся в геноме под регуляцией проверяемого ТЯЕ, неактивен в секреторных клетках слюнных желез

Анализ распределения модифицированных гистонов в промоторной

области гена fkh

Помимо выявления TRE в протяженной промоторной области гена fkh нами была поставлена задача изучить некоторые особенности его функционирования Как известно, транскрипционная память складывается из комбинации различных механизмов, включающих модификацию гистонов, ремоделирование хроматина, взаимодействие с основными транскрипционными факторами (Francis & Kingston 2001, Simon & Тапкип 2002), и синтез некодирующей РНК (Orlando, 2003) Причем, модифицирование гистонов является важным признаком транскрипционного статуса хроматина Так, метилирование лизинов в НЗ по положениям 9 и 27 является маркером репрессированного состояния хроматина, в то время как ацетилирование Н4 и метилирование лизина-4 в НЗ ассоциировано с активными районами Также известно, что некоторые белки группы триторакса (trx-G) обладают гистон-модифицирующими активностями Например, ASH1 и TRX содержат консервативный домен (SET-домен), способный метилировать определенные остатки лизина в гистонах, в частности, триметилировать лизин-4 в гистоне НЗ В связи с этими данными нам показалось интересным проанализировать методом иммунопреципитации хроматина характер обогащения предпромоторной области гена fkh данными модификациями гистонов в случаях активного и репрессированного состояния гена fkh Для этого в предварительном опыте методом RT-PCR мы показали отсутствие транскрипции fkh в культуре клеток S2, что позволило нам использовать эти клетки для анализа распределения модифицированных гистонов при неактивном состоянии гена fkh в сравнении с активным состоянием гена fkh в клетках слюнных желез Результаты данного исследования могут помочь в выяснении механизма функционирования TRE Так, например, если предполагать механизм распространения сигнала об активном состоянии гена вдоль хроматина от TRE до промотора, то следует ожидать равномерное обогащение специфически модифицированных

гистонов по всему району. А в случае механизма, предполагающего прямое взаимодействие TRE и энхансера слюнных желез с собственно промотором, можно ожидать преимущественное обогащение модифицированными гистонами в районах TRE и в начала транскрипции.

Проведённые нами X-ChIP эксперименты показали, что хроматин в протяжённой промоторной области гена fkh действительно обогащен в значительной степени ацетилированными гистонами и триметилированными по 4 остатку лизина гистонами НЗ (НЗК4шеЗ) в клетках слюнных желез, где ген активен (рис. 6), в отличие от клеток линии S2, в которых ген неактивен и сколько либо заметного обогащения при X-ChIP не наблюдается. Также мы показали, что обогащение промоторной области носит неравномерный характер, и имеется существенный пик обогащения в районе энхансера слюнных желёз и TRE с последующим затуханием сигнала при удалении от TRE. При этом, в случае анализа модификации НЗК4шеЗ мы наблюдали заметное усиление обогащения в районе начала транскрипции гена fkh, но в случае с антителами к ацитилированным гистонам такого эффекта не отмечено. Также видны некоторые другие различия в профилях обогащения протяжённой промоторной области гена fkh, но они не столь значительны и могут быть

1 2 3 41 4R 4F 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 16 16 17 18

анализируемые фрагменты ПЦР промоторной области гена fkh

Рис. 6 Анализ распределения модифицированных гистонов в промоторной области гена fkh

Показаны результаты ПЦР анализа Х-СЫР с антителами к модификации гистона НЗК4теЗ и к ацетилированным гистонам. Для проверки использовали те же 18 пар праймеров, что и в иммунопреципитационных экспериментах с антителами к ТЯХ. Также были использованы дополнительные прагшеры к району ТКЕ (фрагменты 4 '2, 4Я, 41') для более детального изучения этого участка. График показывает отношение количества ДНК в Х-СЫР пробах к положительному контролю (ачиквота хроматина, взятая непосредственно перед иммунопреципитацией) для соответствующих ПЦР фрагментов.

обусловлены погрешностью метода X-ChIP, хотя, возможно, стоит обратить внимание на неполное совпадение пиков обогащения для обеих проб и смещение этого пика ближе к энхансеру слюнных желез в случае проб с антителами к ацитилированным гистонам

TRX может триметилировать НЗК4, поэтому увеличение степени обогащения в районе начала транскрипции гена fleh именно этой модификацией, в отличие от модификации ацетилирования гистонов, выглядит не случайной (напомним, что при иммуннопреципитации с одним из антител к TRX мы также наблюдали обогащение в этом участке) Пока преждевременно делать общие выводы о механизме функционирования TRE На основе полученных данных можно предположить наличие прямого взаимодействия TRE с областью промотора

Представленные результаты и выводы хорошо согласуются с недавними исследованиями других авторов Так, например, в лаборатории Паро на примере гена Abd-B было показано, что белок TRX находится как в регуляторных элементах (описанных, как PRE), так и в районе промотора гена-мишени в случае активного состояния гена, в то время как в случае репрессированного состояния гена обогащения в районе промотора не наблюдалось (Betsei, 2007) В той же работе было проанализировано распределение ацетилированных гистонов в этих районах, показавшее, на примере генов Abd-B и dfd, что появляющееся обогащение в случае активного состояния генов также, как и в наших экспериментах, не затрагивает промоторную область

Демонстрация колокализации TRE с элементами хроматина, ассоциированными со структурами «ядерного скелета».

Недавно в нашей лаборатории было показано, что белок TRX является компонентом «ядерного матрикса» (Лебедева, Тиллиб, 2003) Поэтому мы решили проверить предположение о том, что TRE, подобно самому TRX, также могут быть ассоциированы с «ядерным матриксом», то есть могут являться потенциальными S/MAR Нами была

поставлена задача сравнить локализацию S/MAR-подобных участков с участкамии ранее нами определенных TRX-ассоциированных элементов в расширенной промоторной области (8,7 т п н) гена fkh в клетках слюнных желез личинки дрозофилы В качестве второго исследуемого района был взят район, наиболее детально изученного ранее TRE из дальней промоторной области гена Ubx (pbx/bxd) (Tillib et al, 1999) клеток эмбрионов дрозофилы Для тонкого картирования S/MAR-элементов мы использовали традиционную процедуру экстракции хроматина в низкосолевом буфере с сильным детергентом (LIS) (Craig et al, 1997, Mirkovitch et al, 1984) с некоторыми модификациями Для исследования промоторной области гена fkh в качестве исходного материала брали клетки слюнных желез личинки для анализа в случае активного состояния гена fkh и S2 культуральные клетки, где ген fkh, по нашим данным, не активен В случае исследования регуляторного района гена Ubx использовали клетки эмбрионов, содержащие клетки как с активным, так и с репрессированным геном Ubx Выделение ядер проводили параллельно как в указанной методике (Craig et al, 1997), так и согласно первому этапу экстракции (удалению цитоскелетной фракции), описанному в работе Хе и соавт (Не et al, 1990) В конце процедуры хромосомную ДНК расщепляли с помощью часто щепящей эндонуклеазы Mspl Анализ относительного обогащения перекрывающих исследуемый район фрагментов Mspl-Mspl проводили путем ПЦР с использованием специально подобранных пар праймеров, как для промоторной области гена fkh, так и для района pbx/bxd гена Ubx

По результатам нескольких повторных экспериментов нам удалось выявить в промоторной области гена fkh только один воспроизводимо и явно обогащающийся во фракции ядерного скелета участок ДНК (рис 7) Интересно, что этот же участок был ранее выявлен нами как основной TRX-ассоциированный элемент гена fkh в клетках слюнных желез (Ряховский, Тиллиб, 2007) Таким образом, с высокой степенью разрешения можно предполагать ко-локализацию этих двух типов регуляторных элементов Похожее исследование мы провели и на другой модельной системе, районе сильного PRE/TRE гена

Ubx в клетках эмбрионов дрозофилы. Полученные результаты (рис. В) указывают на существование выраженного S/MAR-элемента, перекрывающегося с районом локализации ранее выявленных «В»-, «С»- и «D»- PRE/TRE. В результате проделанной работы на двух модельных системах удалось впервые продемонстрировать, что TRE колокализуется с хромосомными элементами, ассоциированными со структурами ядерного скелета.

Многие исследователи полагают, что помимо постоянно формирующихся (стабильных, структурных) существует и другой тип S/MAR: динамичных, факультативных, тканеспецифических (Чернов и др., 2004). Этот второй тип S/MAR весьма напоминает TRB, а возможно, что следует из результатов данной работы, эти два типа элементов являются лишь

fkh а

TRE sgE

1 Т.П.Н.

„. __ ____ __ _ ___ _ _ _ положение ПЦР

J /// // / l \ I //\\\\ ф™

1ИгаВ1ЕЗШИ1в13ШЙ1Я контроль

§Щ Щ| фракция S/MAR

Рис. 7 Выявление S/MAR-элемента, колокализующегося с TRE, в промоторной области гена fkh

Вверху приведена маштабированная схема промоторной области гена fkh, с указанием положения начала транскрипции гена fkh (стрелка влево), энхансерного элемента (sgE), определяющего специфическую экспрессию гена fkh в клетках слюнных желез, а также TRE. Ниже показано положение ПЦР-фрагментов, соответствующие Mspl-фрагментам исследуемой области, и их относительное обогащение в получаемой S/MAR-фракции (приведены фотографии фрагментов геля с соответствующими электрофоретически разделенными ПЦР-продуктами) по сравнению с уровнями а.чплификации этих же фрагментов в тотальной хромосомной ДНК до экстракции (К+). Внизу - приведён график нормализованных данных относительного обогащения Мхр1-фрагментов в нескольких независимо проведенных экспериментах.

1т. л .н.

Übx*

■TRE/PRE (bxd/pbx)

положение ПЦР фрагмоктов

контроль фракция S/MAR

Рис. 8 Выявление З/МАК-элемента, коло кал и зу-ющегося с Ьх(1/рЬх РКЕ/ТКЕ, в промотор!юй области гена 11Ьх. М^1~фрагменты Вверху приведена схема дальней промоторной области гена 1Лх (координаты указаны согласно

последовательности из 1961) с указанием локализации исследованных ранее [4] элементов А, В, С и О и суммарного РЯЕ/ТЯЕ. Ниже показана локализация М$р1-фрагментов данного района, а также пар праймеров для ПЦР, используемых для анализа отнносителъного обогащения этих фрагментов. Еще ниже, как и на предыдущем рисунке, приведены данные обогащения как

условно разделимыми, а по существу они или очень близко располагаются или являются одним и тем же регуляторным элементом. В связи с этим следует упомянуть наши данные (не приведены) о подобном указанному выше анализе расширенной промоторной области гена fleh в культуральных S2 клетках дрозофилы, в которых ген fleh неактивен. В этом случае, в отличие от ситуации в клетках слюнных желез, где этот ген активен, мы не наблюдали обогащения участка FKH4, что указывает на зависимую от активности гена тканеспецифическую, динамичную природу подобных элементов.

выводы

1 Проведено иммунопреципитационное картирование TRX-асоциированных регуляторных элементов в нромоторной области гена fork head длиной 8 7 т п н в клетках слюнных желез третьей личиночной стадии D melanogaster, по результатам которого выявлены один мажорный и один менее выраженный районы потенциального связывания с белком TRX

2 В экспериментах ш vivo на трансгенных линиях мух показано, что только один из выявленных элементов, обогащавшийся в значительно большей степени, принципиально важен как для связывания белка TRX на политенных хромосомах, так и для транскрипции "mim-jW РНК в составе конструкции в секреторных клетках слюнных желез личинки дрозофилы

3 Показано значительное обогащение промоторной области гена JUi модифицированными гистонами НЗК4теЗ и ацетилированными гистонами в случае активного состояния гена в клетках слюнных желез личинки дрозофилы, и отсутствие подобного обогащения в случае репрессированного состояния гена в клетках культуры S2 Показано преимущественное обогащение данными модифицированными гистонами района TRE и некоторое обогащение НЗК4теЗ в районе промотора в клетках слюнных желез

4 Продемонстрировано на примере известного ранее TRE из гена Ubx и описанного в данной работе нового TRE из гена Jkh, что TRE в активном гене может колокализоваться с хромосомным элементами, ассоциированными со структурами ядерного скелета

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1 Ряховский А А , Тиллиб С В Иммунопреципитационное картирование TRX-асеоциированных участков хромосом в промоторе генаJkh в клетках слюнных желез Drosophila melanogaster Генетика, 2007, том 43,№9,стр 1181-1189

2 Ряховский А А, Тиллиб С В Колокализация S/MAR и TRE в регуляторных участках хромосом тканеспецифически экспрессирующихся генов Drosophila melanogaster Доклады Академии Наук, 2007, том 416,№3,стр 416-419

Материалы конференций

1 Ряховский А А , «Идентификация в геноме Drosophila melanogaster элементов, ответственных за образование триторакс-комплекса» XII международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» Секция биология, с 189

2 Ряховский А А , Арифов А О «Выявление последовательностей ДНК, связывающих комплекс триторакса в эмбрионах Drosophila melanogaster и в S2 клетках m vivo » XIII международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006» Секция биология, с 196

3 Rjakhovsky АА , Tillib SV, "Identification of Trithorax response elements m upstream promoter region of the gene fldi " EMBO Conference Series on Nuclear Structure & Dynamtcs, 1-5 September 2007,Montpellier, France,p 111

БЛАГОДАРНОСТИ

Хотелось бы поблагодарить сотрудников ИБГ РАН Кырчанову Ольгу и Максименко Оксану за предоставление базовых линий мух, используемых для получения исследуемых трансгенных линий, и за консультации по работе с ними, а также Паршикова Александра за трансформирование эмбрионов мух созданной нами трансгенной конструкцией

Подписано в печать 15 11 2007 г

Печать трафаретная

Заказ № 986 Тираж ЮОэкз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495)975-78-56 \v\vw autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ряховский, Алексей Алексеевич

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Гипотеза "гистонового кода"

1.1.1. Ацетилирование

1.1.2. Фосфорилирование

1.1.3. Метилирование аргинина

1.1.4. Метилирование лизина

1.1.5. Убиквитинилирование

1.2. Поддержание тканеспецифической экспрессии генов белками групп триторакса и поликомба

1.2.1. Функции и энзиматические активности белков групп поликомба и триторакса

1.2.1.1. Белки группы поликомба и их биохимические активности

1.2.1.2. Белки группы триторакса и их биохимические активности

1.2.2. Регуляторные хромосомные элементы, посредством которых осуществляют свою функцию белки групп поликомба и триторакса

1.2.2.1. Особенности строения PRE/TRE

1.2.2.2. Установление транскрипционной памяти

1.2.2.3. Сохранение информации о транскрипционном статусе. Роль «гистонового кода» в этом процессе

1.2.2.4. Переключение транскрипционного статуса гомеотических генов

1.2.3. Механизмы действия системы поддержания транскрипционной памяти 42 1.2.3.1. Распространение сигнала вдоль хроматина или выпетливание?

1.2.3.2. Роль некодирующей РНК в функционировании PcG/TrxG-завиеимой системы регуляции активности генов 45 1.2.4. MLL-ассоциированная система поддержания тканеспецифической транскрипции генов млекопитающих

1.2.4.1. Функции MLL - гомолога trx млекопитающих

1.2.4.2. MLL1 и его связь с канцерогенезом 49 Постановка задачи 52 2. Материалы и методы

2.1. Материалы

2.1.1. Используемое оборудование

2.1.2. Реактивы

2.1.3. Стоковые растворы.

2.1.4. Антитела.

2.1.5. Используемые ферменты

2.1.6. Фирменные наборы реактивов

2.1.7. Используемые в работе праймеры

2.2. Методы

2.2.1. Энзиматические реакции

2.2.2. Стандартные методы

2.2.3. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса.

2.2.4. Выделение геномной ДНК из мух D. melanogaster

2.2.5. Выделение слюнных желез из личинок D. melanogaster

2.2.6. Формальдегидная сшивка

2.2.7. Иммунопреципитация хроматина

2.2.8. Лигирование ДНК с адаптерами

2.2.9. Амплификация с праймерами к адаптерам

2.2.10. "Перекрёстная" и гибридизация

2.2.11. Саузерн блот-гибридизация

2.2.12. ПЦР с радиоактивной меткой

2.2.13. Молекулярное клонирование.

2.2.14. Генетические методы

2.2.15. Получение конструкции "mini-jkh "

2.2.16. Определение положения конструкции в геноме методом инвертированного ПЦР

2.2.17. Иммунное окрашивание политенных хромосом

2.2.18. ПЦР в реальном времени

2.2.19. Выделение S/MAR из слюнных желез личинок D. melanogaster 84 3. Результаты исследований.

3.1. Иммунопреципитационное картирование TRX-ассоциированных элементов хроматина в промоторной области гена jkh в клетках слюнных желёз D. melanogaster

3.1.1. Выявление участков хроматина, непосредственно взаимодействующих с TRX

3.1.2. Иммуннопреципитация с антителами к ASH1 и TRX выявляет схожие районы обогащения

3.2. Исследование функциональной значимости гипотетических TRE in vivo при помощи трансгенных конструкций

3.2.1. Трансгенной конструкции mini-jkh, включающей энхансер слюнных желёз, гипотетические TRE и район промотора, достаточно для связывания TRX in vivo

3.2.2. Фрагмент FKH3-4 принципиально важен для связывания TRX in vivo

3.2.3. Фрагмент FKH3-4 принципиально важен для поддержания высокого уровня транскрипции трансгенной РНК mini-jkh

3.3. Анализ распределения модифицированных гистонов в промоторной области гена jkh

3.4. Демонстрация колокализации TRE с элементами хроматина, ассоциированными со структурами ядерного скелета.

3.4.1. Положение локального пика фракции S/MAR обогащения в расширенной промоторной области нега Jkh совпадает с положением выявленного TRE генаJkh

3.4.2. Положение локального пика обогащения в фракции S/MAR совпадает с положением TRE гена Ubx

4. Обсуждение результатов.

5. Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новый TRITHORAX-ассоциированный регуляторный элемент в промоторной области гена fork head в Drosophila melanogaster"

Недавние исследования на дрозофиле и млекопитающих убедительно продемонстрировали, что продукты двух групп генов, позитивные регуляторы группы триторакса (trxG) ипегативные регуляторы группы поликомба (PcG), являются ключевыми компонентамизапрограммированного в геноме механизма поддержания дифференцированного состоянияклеток (Ringrose et al, 2007; Schwartz et al, 2007). Эти белки предотвращают изменениятранскрипционной программы, характерной для данного типа клеток, через взаимодействиесо специфическими регуляторными цис-элементами, называемыми PRE/TRE ("Polycomb/trithorax- response elements"). Предполагается, что наличие PRE/TRE характерно для оченьмногих, если не всех, регуляторных генов, связанных с процессом дифферен-цировки. Этиэлементы отвечают за поддержание экспрессиониого статуса конкретного гена-мишени, хотяиногда они могут находиться достаточно далеко от его промоторной области. Изучениепринципиальных особенностей самих PRE^RE, деталей механизма их узнаваниябелковыми комплексами и последующего распространения специфического воздействия наэкспрессию гена является крайне актуальной задачей для ученых, работающих в самыхразличных областях биологии и медицины: от изучения структуры и функционированиягенома, исследования механизмов поддержания плюрипотентности стволовых клеток иклеточной дифференцировки до выявления причин различных нарушений, ведущих к серьезным заболеваниям, таким как, например, раковые заболевания. Об актуальности даннойтематики говорит также заметное увеличение в последние годы количества публикаций,посвященных этой проблеме,PcG/TrxG-зависимая система регуляции активности гомеотических генов являетсяочень консервативной в процессе эволюции. Практически для всех генов PcG и TrxGдрозофилы существуют гомологичные гены у млекопитающих, мутации в которых либокритичны для развития организма, либо напрямую ассоциированы с возникновением рака.Поэтому изучение функционирования белков PcG и TrxG, как гомологов системы10поддержания транскрипционной памяти млекопитающих, помимо фундаментального, можетиметь ещё и прикладное значение.Предполагается, что TRE и PRE в данном гене в значительной степени колокализуются и функционируют взаимоисключающе, в зависимости от типа клетки. Однако, приболее тонком картировании было показано, что эти элементы не идентичны. Так, в дистальной промоторной области гена Ubx дрозофилы удалось разделить последовательности субэлементов, необходимых для формирования TRE, от расположенных по-соседству субэлементов PRE (ГИИЬ et al, 1999). Подобные работы с акцентом на исследование именноTRE довольно редки, несмотря на их актуальность. Таким образом, ввиду недостаткаинформации, трудно вьивить общие черты TRE и, соответсвенно, лучше понять принципыих функционирования, которые до сих пор остаются невыясненными. С целью более точнолокализовать и охарактеризовать ещё один новый TRE и была предпринята данная работа.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Ряховский, Алексей Алексеевич

4. ВЫВОДЫ

1. Проведено иммуннопреципитационное картирование TRX-ассоциированных регулятор-ных элементов в промоторной области гена fork head длиной 8.7 т.п.н. в клетках слюнных желёз третьей личиночной стадии D. melanogaster, по результатам которого выявлены один мажорный и один менее выраженный районы потенциального связывания с белком TRX.

2. В экспериментах in vivo на трансгенных линиях мух показано, что только один из выявленных элементов, обогащавшийся в значительно большей степени, принципиально важен как для связывания белка TRX на политениых хромосомах, так и для транскрипции "mini-fkh" РНК в составе конструкции в секреторных клетках слюнных желез личинки дрозофилы.

3. Показано значительное обогащение промоторной области гена fkh модифицированными гистонами НЗК4шеЗ и ацетилированными гистонами в случае активного состояния гена в клетках слюнных желёз личинки дрозофилы, и отсутствие подобного обогащения в случае репрессированного состояния гена в клетках культуры S2. Показано преимущественное обогащение данными модифицированными гистонами района TRE и некоторое обогащение НЗК4шеЗ в районе промотора в клетках слюнных желёз.

4. Продемонстрировано на примере известного ранее TRE из гена Ubx и описанного в данной работе нового TRE из гена fkh, что TRE в активном гене может колокализоваться с хромосомными элементами, ассоциированными со структурами ядерного скелета.

112

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ряховский, Алексей Алексеевич, Москва

1. Agalioti, Т., Chen, G., Thanos D. (2002). Deciphering the transcriptional histone acetylation code for a human gene. Cell 111, 381-92.

2. Bae, E., Calhoun, С., V., Levine, M., Lewis, В., E., Drewell A., R. (2002). Characterization of the intergenic RNA profile at abdominal-A and Abdominal-B in the Drosophila bithorax complex. Proc Natl Acad Sci USA 99,16847-52.

3. Bantignies, F., Goodman, H., R., Smolik M., S. (2000). Functional interaction between the coactivator Drosophila CREB-binding protein and ASH1, a member of the trithorax group of chromatin modifiers. Mol Cell Biol 20,9317-30.

4. Bantignies, F., Grimaud, C., Lavrov, S., Gabut, M., Cavalli G. (2003). Inheritance of Polycomb-dependent chromosomal interactions in Drosophila. Genes Dev 17,2406-20.

5. Beisel, C., Buness, A., Roustan-Espinosa, M., I., Koch, В., Schmitt, S. et al. (2007). Comparing active and repressed expression states of genes controlled by the Polycomb/Trithorax group proteins. Proc Natl Acad Sci USA 104,16615-20.

6. Beisel, C., Imhof, A., Greene, J., Kremmer, E. and Sauer, F. (2002). Histone methylation by the Drosophila epigenetic transcriptional regulator Ashl. Nature 419, 857-62.

7. Berger L., S. (2002). Histone modifications in transcriptional regulation. Curr Opin Genet Dev 12,142-8.

8. Bhaumik, R., S., Green R., M. (2001). SAGA is an essential in vivo target of the yeast acidic activator Gal4p. Genes Dev 15,1935-45.

9. Birkc, M., Schreiner, S., Garcia-Cuellar, P., M., Mahr, K., Titgemeyer, F. et al. (2002). The MT domain of the proto-oncoprotein MLL binds to CpG-containing DNA and discriminates against methylation. Nucleic Acids Res 30,958-65.

10. Bloyer, S., Cavalli, G., Brock, W., H., Dura M., J. (2003). Identification and characterization of polyhomeotic PREs and TREs. Dev Biol 261,426-42.

11. Breiling, A., Bonte, E., Ferrari, S., Becker, В., P., Paro R. (1999). The Drosophila polycomb protein interacts with nucleosomal core particles In vitro via its repression domain. Mol Cell Bio, 19,8451-60.

12. Breiling, A., Sessa, L., Orlando V. (2007). Biology of polycomb and trithorax group proteins. Inl Rev Cytol 258, 83-136.

13. Breiling, A., Turner, M., В., Bianchi, E., M., Orlando V. (2001). General transcription factors bind promoters repressed by Polycomb group proteins. Nature 412,651-5.

14. Brickman, M., J., Adam, M., Ptashne M. (1999). Interactions between an HMG-1 protein and members of the Rel family. Proc Natl Acad Sci USA 96,10679-83.

15. Brock, W., H., Lohuizen, v. M. (2001). The Polycomb group-no longer an exclusive club? Curr Opin Genet Dev 11,175-81.

16. Brotherton, Т., Zenk, D., Kahanic, S., Reneker J. (1991). Avian nuclear matrix proteins bind very tightly to cellular DNA of the beta-globin gene enhancer in a tissue-specific fashion. Biochemistry 30, 5845-50.

17. Brown, E., C., Howe, L., Sousa, K., Alley, C., S., Carrozza, J., M. et al. (2001). Recruitment of HAT complexes by direct activator interactions with the ATM-related Tral subunit. Science 292,2333-7.

18. Brown, L., J., Fritsch, C., Mueller, J., Kassis A., J. (2003). The Drosophila pho-like gene encodes a YY1-related DNA binding protein that is redundant with pleiohomeotic in homeotic gene silencing. Development 130,285-94.

19. Brown, L., J., Mucci, D., Whiteley, M., Dirksen, L., M., Kassis A., J. (1998). The Drosophila Polycomb group gene pleiohomeotic encodes a DNA binding protein with homology to the transcription factor YY1. Mol Cell 1,1057-64.

20. Buchenau, P., Hodgson, J., Strutt, H., Arndt-Jovin J., D. (1998). The distribution of polycomb-group proteins during cell division and development in Drosophila embryos: impact on models for silencing. J Cell Biol 141,469-81.

21. Canaani, E., Nakamura, Т., Rozovskaia, Т., Smith, Т., S., Mori, T. et al. (2004). ALL-1/MLL1, a homologue of Drosophila TRITHORAX, modifies chromatin and is directly involved in infant acute leukaemia. Br J Cancer 90,756-60.

22. Cao, R., Wang, L., Wang, H., Xia, L., Erdjument-Bromage, H. et al. (2002). Role of histone H3 lysine 27 methylation in Polycomb-group silencing. Science 298,1039-43.

23. Cao, R., Zhang Y. (2004). The functions of E(Z)/EZH2-mediated methylation of lysine 27 in histone H3. Curr Opin Genet Dev 14,155-64.

24. Cavalli, G., Paro R. (1999). Epigenetic inheritance of active chromatin after removal of the main transactivator. Science 286,955-8.

25. Chan, S., C., RastcIIi, L., Pirrotta V. (1994). A Polycomb response element in the Ubx gene that determines an epigenetically inherited state of repression. Embo J13,2553-64.

26. Chernov, P., I., Akopov, В., S., Nikolaev G., L. (2004). Structure and function of nuclear matrix associated regions (S/MARs). BioorgKhim 30,3-14.

27. Conaway, C., R., Brower, S., C., Conaway W., J. (2002). Emerging roles of ubiquitin in transcription regulation. Science 296,1254-8.

28. Czermin, В., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A. et al. (2002). Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell 111, 185-96.

29. Dcjardin, J., Cavalli G. (2004). Chromatin inheritance upon Zeste-mediated Brahma recruitment at a minimal cellular memory module. Embo J 23, 857-68.

30. Dejardin, J., Rappailles, A., Cuvier, O., Grimaud, C., Decoville, M. et al. (2005). Recruitment of Drosophila Polycomb group proteins to chromatin by DSP1. Nature 434,533-8.

31. Dou, Y., Gorovsky A., M. (2002). Regulation of transcription by HI phosphorylation in Tetrahymena is position independent and requires clustered sites. Proc Natl Acad Sci USA 99, 6142-6.

32. Dover, J., Schneider, J., Tawiah-Boateng, A., M., Wood, A., Dean, K. et al. (2002). Methylation of histone H3 by COMPASS requires ubiquitination of histone H2B by Rad6. J Biol Chem 277,28368-71.

33. Drewell, A., R., Bae, E., Burr, J., Lewis В., E. (2002). Transcription defines the embryonic domains of cis-regulatory activity at the Drosophila bithorax complex. Proc Natl Acad Sci USA 99, 16853-8.

34. Dura, M., J., Brock, W., H., Santamaria P. (1985). Polyhomeotic: a gene of Drosophila melanogaster required for correct expression of segmental identity. Mol Gen Genet 198,213-20.

35. Ernst, P., Fisher, K., J., Avery, W., Wade, S., Foy, D. et al. (2004). Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene. Dev Cell 6,437-43.

36. Fauvarque, О., M., Dura M., J. (1993). polyhomeotic regulatory sequences induce developmental regulator-dependent variegation and targeted P-element insertions in Drosophila. Genes Dev 7,1508-20.

37. Felix А., С. (1998). Secondary leukemias induced by topoisomerase-targeted drugs. Biochim BiophysActa 1400,233-55.

38. Felix, A., C., Lange, J., В., Chessells M., J. (2000). Pediatric Acute Lymphoblastic Leukemia: Challenges and Controversies in 2000. Hematology (Am Soc Hematol Educ Program), 285-302.

39. Ficz, G., Heintzmann, R., Arndt-Jovin J., D. (2005). Polycomb group protein complexes exchange rapidly in living Drosophila. Development 132,3963-76.

40. Fischle, W., Wang, Y., Allis D., C. (2003a). Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond. Nature 425,475-9.

41. Fischle, W., Wang, Y., Jacobs, A., S., Kim, Y., Allis, D., C. et al. (2003b). Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains. Genes Dev 17,1870-81.

42. Fischle, W., Wang, Y., Jacobs, S. A., Kim, Y., Allis, C. D. and Khorasanizadeh, S. (2003c). Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb andHPl chromodomains. Genes Dev 17,1870-81.

43. Fitzgerald, P., D., Bender W. (2001). Polycomb group repression reduces DNA accessibility. Mol Cell Biol 21,6585-97.

44. Francis, J., N., Kingston E., R. (2001). Mechanisms of transcriptional memory. Nat Rev Mol Cell Biol 2,409-21.

45. Franke, A., DeCamillis, M., Zink, D., Cheng, N., Brock, W., H. et al. (1992). Polycomb and polyhomeotic are constituents of a multimeric protein complex in chromatin of Drosophila melanogaster. Embo J11,2941-50.

46. Furuyama, Т., Banerjee, R., Breen, R., Т., Harte J., P. (2004). SIR2 is required for polycomb silencing and is associated with an E(Z) histone methyltransferase complex. Curr Biol 14,181221.

47. Grimaud, C., Bantignies, F., Pal-Bhadra, M., Ghana, P., Bhadra, U. Cavalli, G. (2006). RNAi components are required for nuclear clustering of Polycomb group response elements. Cell 124,957-71.

48. Hassan, A. H., Neely, К. E. and Workman, J. L. (2001). Histone acetyltransferase complexes stabilize swi/snf binding to promoter nucleosomes. Cell 104,817-27.

49. Hcnikoff, S., Furuyama, Т., Ahmad K. (2004). Histone variants, nucleosome assembly and epigenetic inheritance. Trends Genet 20, 320-6.

50. Hess L., J. (2004). MLL: a histone methyltransferase disrupted in leukemia. Trends Mol Med 10, 500-7.

51. Horard, В., Tatout, С., Poux, S., Pirrotta V. (2000). Structure of a polycomb response elemen and in vitro binding of polycomb group complexes containing GAGA factor. Mol Cell Biol 20, 3187-97.

52. Hsich, J., J., Cheng, H., E., Korsmeyer J., S. (2003a). Taspasel: a threonine aspartase required for cleavage of MLL and proper HOX gene expression. Cell 115,293-303.

53. Hsieh, J., J., Ernst, P., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Korsmeyer J., S. (2003b). Proteolytic cleavage of MLL generates a complex of N- and C-terminal fragments that confers protein stability and subnuclear localization. Mol Cell Biol 23,186-94.

54. Hsu, Y., J., Sun, W., Z., Li, X., Reuben, M., Tatchell, K. et al. (2000). Mitotic phosphorylation of histone H3 is governed by Ipll/aurora kinase and Glc7/PPl phosphatase in budding yeast and nematodes. Cell 102,279-91.

55. Iizuka, M., Smith M., M. (2003). Functional consequences of histone modifications. Curr Opin Genet Dev 13,154-60.

56. Ingham, P. W., and Whittle, R. (1980). Trithorax: A new homeotic mutation of Drosophila melanogaster causing transformations of abdominal and thoracic imaginal segments.Putative role during embryogenesis. Mol Gen. Genet. 179,607-614

57. Jenuvvein T. (2006). The epigenetic magic ofhistone lysine methylation. Febs J213,3121-35.

58. Jenuwein, Т., Allis D., C. (2001). Translating the histone code. Science 293,1074-80.

59. Jurgens, G. (1985). A group of genes controlling the spatial expression of the bithorax complex in Drosophila. Nature 316,153-155

60. Kahn, G., Т., Schwartz, В., Y., Dellino, I., G., Pirrotta V. (2006). Polycomb complexes and the propagation of the methylation mark at the Drosophila ubx gene. J Biol Chem 281,29064-75.

61. Kal, J., A., Mahmoudi, Т., Zak, В., N., Verrijzer P., C. (2000). The Drosophila brahma complex is an essential coactivator for the trithorax group protein zeste. Genes Dev 14,1058-71.

62. Katsani, R., K., Arredondo, J., J., Kal, J., A., Verrijzer P., C. (2001). A homeotic mutation in the trithorax SET domain impedes histone binding. Genes Dev 15,2197-202.

63. Kennison A., J. (1995). The Polycomb and trithorax group proteins of Drosophila: trans-regulators of homeotic gene function. Annu Rev Genet 29,289-303.

64. Kennison, A., J., Tamkun W., J. (1988). Dosage-dependent modifiers of polycomb and antennapedia mutations in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA85,8136-40.

65. Ketel, S., C., Andersen, F., E., Vargas, L., M,, Suh, J., Strome, S. et al. (2005). Subunit contributions to histone methyltransferase activities of fly and worm polycomb group complexes Mol Cell Biol 25,6857-68.

66. Khorasanizadeh S. (2004). The nucleosome: from genomic organization to genomic regulation. Cell 116,259-72.

67. King, F., I., Emmons, В., R., Francis, J., N., Wild, В., Muller, J. et al. (2005). Analysis of a polycomb group protein defines regions that link repressive activity on nucleosomal templates to in vivo function. Mol Cell Biol 25,6578-91.

68. Klymenko, Т., Papp, В., Fischle, W., Kocher, Т., Schelder, M. et al. (2006). A Polycomb group protein complex with sequence-specific DNA-binding and selective methyl-lysine-binding activities. Genes Dev 20,1110-22.

69. Krajewski, A., W., Nakamura, Т., Mazo, A., Canaani E. (2005). A motif within SET-domain proteins binds single-stranded nucleic acids and transcribed and supercoiled DNAs and can interfere with assembly of nucleosomes. Mol Cell Biol 25,1891-9.

70. Krebs, E., J., Fry, J., C., Samuels, L., M., Peterson L., C. (2000). Global role for chromatin remodeling enzymes in mitotic gene expression. Cell 102,587-98.

71. Kuzin, В., Tillib, S., Sedkov, Y., Mizrokhi, L., Mazo A. (1994). The Drosophila trithorax gene encodes a chromosomal protein and directly regulates the region-specific homeotic gene fork head. Genes Dev 8,2478-90.

72. Lanzuolo, C., Roure, V., Dekker, J., Bantignies, F., Orlando V. (2007). Polycomb response elements mediate the formation of chromosome higher-order structures in the bithorax complex. Nat Cell Biol 9,1167-74.

73. Lcbedeva, A., L., Tillib V., S. (2003). Trithorax protein, a global factor for maintenance of tissue specific gene activation in Drosophila melanogaster, is associated with the nuclear matrix. Genetito 39, 250-8.

74. Lee, G., M., Villa, R., Trojer, P., Norman, J., Yan, P., K. et al. (2007). Demethylation of H3K27 regulates polycomb recruitment and H2A ubiquitination. Science 318,447-50.

75. Lee, N., Maurange, C., Ringrose, L., Paro R. (2005). Suppression of Polycomb group proteins by JNK signalling induces transdetermination in Drosophila imaginal discs. Nature 438,234-7.

76. Levine, S., S., Weiss, A., Erdjument-Bromage, H., Shao, Z., Tempst, P. et al. (2002). The core of the polycomb repressive complex is compositionally and functionally conserved in flies and humans. Mol Cell Biol 22,6070-8.

77. Levy-Wilson, В., Fortier C. (1989). The limits of the DNase I-sensitive domain of the human apolipoprotein В gene coincide with the locations of chromosomal anchorage loops and define the 5' and 3' boundaries of the gene. J Biol Chem 264,21196-204.

78. Lewis В., E. (1978). A gene complex controlling segmentation in Drosophila. Nature 276,56570.

79. Lo, S., W., Duggan, L., Emre, C., N., Belotserkovskya, R., Lane, S., W. et al. (2001). Snfl~a histone kinase that works in concert with the histone acetyltransferase Gcn5 to regulate transcription. Science 293,1142-6.

80. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F. and Richmond, T. J. (1997). Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature 389,251-60.

81. Mohd-Sarip, A., Cleard, F., Mishra, K., R., Karch, F., Verrijzer P., C. (2005). Synergistic recognition of an epigenetic DNA element by Pleiohomeotic and a Polycomb core complex. Genes Dev 19,1755-60.

82. Mohd-Sarip, A., Knaap, v. d., A., J., Wyman, C., Kanaar, R., Schedl, P. et al. (2006). Architecture of a polycomb nucleoprotein complex. Mol Cell 24,91-100.

83. Muller, J., Hart, M., C., Francis, J., N., Vargas, L., M., Scngupta, A. et al. (2002). Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell 111, 197208.

84. Muller, M., Hagstrom, K., Gyurkovics, H., Pirrotta, V., Schedl P. (1999). The mcp element from the Drosophila melanogaster bithorax complex mediates long-distance regulatory interactions. Genetics 153,1333-56.

85. Nakamura, Т., Mori, Т., Tada, S., Krajewski, W., Rozovskaia, T. et al. (2002). ALL-1 is a histone methyltransferase that assembles a supercomplex of proteins involved in transcriptional regulation. Mol Cell 10,1119-28.

86. Negre, N., Hcnnetin, J., Sun, V., L., Lavrov, S., Bellis, M. et al. (2006). Chromosomal distribution of PcG proteins during Drosophila development. PLoS Biol 4, el70.

87. Nekrasov, M., Klymenko, Т., Fraterman, S., Papp, В., Oktaba, K. et al. (2007). Pcl-PRC2 is needed to generate high levels of H3-K27 trimethylation at Polycomb target genes. EmboJld, 4078-88.

88. Ng, H., H., Xu, M., R., Zhang, Y., Struhl K. (2002). Ubiquitination of histone H2B by Rad6 is required for efficient Dot 1-mediated methylation of histone H3 lysine 79. J Biol Chem 277, 34655-7.

89. Nielsen, R., P., Nietlispach, D., Mott, R., H., Callaghan, J., Bannister, A. et al. (2002). Structure of the HP1 chromodomain bound to histone H3 methylated at lysine 9. Nature 416, 103-7.

90. Nowak, J., S., Corces G., V. (2000). Phosphorylation of histone H3 correlates with transcriptionally active loci. Genes Dev 14,3003-13.

91. Orlando V. (2000). Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde-crosslinked-chromatin immunoprecipitation. Trends Biochem Sci 25, 99-104.

92. Orlando V. (2003). Polycomb, epigenomes, and control of cell identity. Cell 112, 599-606.

93. Orlando, V., Jane, P., E., Chinvvalla, V., Harte, J., P., Paro R. (1998). Binding of trithorax and Polycomb proteins to the bithorax complex: dynamic changes during early Drosophila embryogenesis. Embo J17,5141-50.

94. Orlando, V., Strutt, H., Paro R. (1997). Analysis of chromatin structure by in vivo formaldehyde cross-linking. Methods 11,205-14.

95. Orphanides, G., Reinberg D. (2002). A unified theory of gene expression. Cell 108,439-51.

96. Papp, В., Muller J. (2006). Histone trimethylation and the maintenance of transcriptional ON and OFF states by trxG and PcG proteins. Genes Dev 20, 2041-54.

97. Peterson, L., C., Workman L., J. (2000). Promoter targeting and chromatin remodeling by the SWI/SNF complex. Curr Opin Genet Dev 10,187-92.

98. Petruk, S., Sedkov, Y., Brock, W., H., Mazo A. (2007a). A model for initiation of mosaic HOX gene expression patterns by non-coding RNAs in early embryos. RNA Biol 4,1-6.

99. Petruk, S., Sedkov, Y., Smith, S., Tillib, S., Kraevski, V. et al. (2001). Trithorax and dCBP acting in a complex to maintain expression of a homeotic gene. Science 294,1331-4.

100. Petruk, S., Sedkov, Y., Brock, H. W. and Mazo, A. (2007b). A model for initiation of mosaic HOX gene expression patterns by non-coding RNAs in early embryos. RNA Biol 4,1-6.

101. Pham, D., A., Sauer F. (2000). Ubiquitin-activating/conjugating activity of TAFII250, a mediator of activation of gene expression in Drosophila. Science 289,2357-60.

102. Polo, E., S., Almouzni G. (2006). Chromatin assembly: a basic recipe with various flavours. Curr Opin Genet Dev 16,104-11.

103. Poux, S., McCabe, D., Pirrotta V. (2001a). Recruitment of components of Polycomb Group chromatin complexes in Drosophila. Development 128,75-85.

104. Poux, S., Melfi, R., Pirrotta V. (2001b). Establishment of Polycomb silencing requires a transient interaction between PC and ESC. Genes Dev 15,2509-14.

105. Rank, G., Prestel, M. and Paro, R. (2002). Transcription through intergenic chromosomal memory elements of the Drosophila bithorax complex correlates with an epigenetic switch. Mol Cell Biol 22, 8026-34.

106. Rappailles, A., Decoville, M., Locker D. (2005). DSP1, a Drosophila HMG protein, is involved in spatiotemporal expression of the homoeotic gene Sex combs reduced. Biol Cell 97,779-85.

107. Rastelli, L., Chan, S., C., Pirrotta V. (1993). Related chromosome binding sites for zeste, suppressors of zeste and Polycomb group proteins in Drosophila and their dependence on Enhancer of zeste function. EmboJ 12,1513-22.

108. Richards, J., E., Elgin C., S. (2002). Epigenetic codes for heterochromatin formation and silencing: rounding up the usual suspects. Cell 108,489-500.

109. Ringrose, L., Ehret, H., Paro R. (2004). Distinct contributions of histone H3 lysine 9 and 27 methylation to locus-specific stability of polycomb complexes. Mol Cell 16,641-53.

110. Ringrose, L., Paro R. (2007). Polycomb/Trithorax response elements and epigenetic memory of cell identity. Development 134,223-32.

111. Ringrose, L., Rehmsmeier, M., Dura, M., J., Paro R. (2003). Genome-wide prediction of Polycomb/Trithorax response elements in Drosophila melanogaster. Dev Cell 5,759-71.

112. Robzyk, K., Recht, J., Osley A., M. (2000). Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast. Science 287,501-4.

113. Rozovskaia, Т., Tillib, S., Smith, S., Sedkov, Y., Rozenblatt-Rosen, O. ct al. (1999). Trithora: and ASH1 interact directly and associate with the trithorax group-responsive bxd region of the Ultrabithorax promoter. Mol Cell Biol 19,6441-7.

114. Sanchez-Eisner, Т., Gou, D., Kremmer, E., Sauer F. (2006). Noncoding RNAs of trithorax response elements recruit Drosophila Ashl to Ultrabithorax. Science 311,1118-23.

115. Sarcinella, E., Zuzarte, C., P., Lau, N., P., Draker, R., Cheung P. (2007). Monoubiquitylation of H2A.Z distinguishes its association with euchromatin or facultative heterochromatin. Mol Cell Biol 27,6457-68.

116. Saurin, J., A., Shao, Z., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Kingston E., R. (2001). A Drosophila Polycomb group complex includes Zeste and dTAFII proteins. Nature 412,655-60.

117. Schichman, A., S., Caligiuri, A., M., Gu, Y., Strout, P., M., Canaani, E. et al. (1994). ALL-1 partial duplication in acute leukemia. Proc Natl Acad Sci USA 91,6236-9.

118. Schmitt, S., Prestel, M., Paro R. (2005). Intergenic transcription through a polycomb group response element counteracts silencing. Genes Dev 19, 697-708.

119. Schwartz, В., Y., Kahn, G., Т., Nix, A., D., Li, Y., X., Bourgon, R. et al. (2006). Genome-wide analysis of Polycomb targets in Drosophila melanogaster. Nat Genet 38,700-5.

120. Schwartz, В., Y., Pirrotta V. (2007). Polycomb silencing mechanisms and the management of genomic programmes. Nat Rev Genet 8,9-22.

121. Shao, Z., Raible, F., Mollaaghababa, R., Guyon, R., J., Wu, Т., С. et al. (1999). Stabilization of chromatin structure by PRC1, a Polycomb complex. Cell 98,37-46.

122. Shi, Y., Lan, F., Matson, C., Mulligan, P., Whetstine, R., J. et al. (2004). Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell 119,941-53.

123. Sigrist, J., С., Pirrotta V. (1997). Chromatin insulator elements block the silencing of a target gene by the Drosophila polycomb response element (PRE) but allow trans interactions between PREs on different chromosomes. Genetics 147,209-21.

124. Simon, A., J., Tamkun W„, J. (2002). Programming off and on states in chromatin: mechanism: of Polycomb and trithorax group complexes. Curr Opin Genet Dev 12, 210-8.

125. Strahl, D., В., Allis D., C. (2000). The language of covalent histone modifications. Nature 403, 41-5.

126. Struhl G. (1983). Role of the esc+ gene product in ensuring the selective expression of segment-specific homeotic genes in Drosophila. J Embryol Exp Morphol 76,297-331.

127. Strutt, H., Paro R. (1997). The polycomb group protein complex of Drosophila melanogaster has different compositions at different target genes. Mol Cell Biol 17,6773-83.

128. Sun, W., Z., Allis D., C. (2002). Ubiquitination of histone H2B regulates H3 methylation and gene silencing in yeast. Nature 418,104-8.

129. Thiagalingam, S., Cheng, К. H., Lee, H. J., Mineva, N., Thiagalingam, A. and Ponte, J. F. (2003). Histone deacetylases: unique players in shaping the epigenetic histone code. Ann N Y AcadSci 983, 84-100.

130. Tie, F., Furuyama, Т., Prasad-Sinha, J., Jane, E., Harte J., P. (2001). The Drosophila Polycomb Group proteins ESC and E(Z) are present in a complex containing the histone-binding protein p55 and the histone deacetylase RPD3. Development 128,275-86.

131. Tripoulas N., LeJcunesse D., Gildea J., Shearn A. (1996). The Drosophila ashl gene product, which is localized at specific sites on polytene chromosomes, contains a SET domain and PHD finger. Genetics 143,913-928

132. Turner M., B. (2000). Histone acetylation and an epigenetic code. Bioessays 22, 836-45.

133. Turner M., В. (2002). Cellular memory and the histone code. Cell 111, 285-91.

134. Voncken, W., J., Schweizer, D., Aagaard, L., Sattler, L., Jantsch, F., M. et al. (1999). Chromatin-association of the Polycomb group protein BMI1 is cell cycle-regulated and correlate with its phosphorylation status. J Cell Sci 112 (Pt 24), 4627-39.

135. Wang, H„ Huang, Q., Z., Xia, L., Feng, Q., Erdjument-Bromage, H. et al. (2001). Methylation of histone H4 at arginine 3 facilitating transcriptional activation by nuclear hormone receptor. Science 293, 853-7.

136. Wang, H., Wang, L., Erdjument-Bromage, H., Vidal, M., Tempst, P. et al. (2004). Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature 431,873-8.

137. Wu, Т., С., Howe M. (1995). A genetic analysis of the Suppressor 2 of zeste complex of Drosophila melanogaster. Genetics 140,139-81.

138. Yano, Т., Nakamura, Т., Blechman, J., Sorio, C., Dang, V., C. et al. (1997). Nuclear punctate distribution of ALL-1 is conferred by distinct elements at the N terminus of the protein. Proc Natl Acad Sci USA 94,7286-91.

139. Yu, D., В., Hess, L., J., Horning, E., S., Brown, A., G., Korsmeyer J., S. (1995). Altered Hox expression and segmental identity in Mil-mutant mice. Nature 378, 505-8.

140. Zhang, Y., Reinberg D. (2001). Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev 15,2343-60.

141. Zhou, В., Bagri, A., Bcckendorf K., S. (2001). Salivary gland determination in Drosophila: a salivary-specific, fork head enhancer integrates spatial pattern and allows fork head autoregulation. Dev Biol 237,54-67.

142. Zink, D., Paro R. (1995). Drosophila Polycomb-group regulated chromatin inhibits the accessibility of a trans-activator to its target DNA. Embo J14,5660-71.

143. Zuckerkandl E. (1999). Sectorial gene repression in the control of development. Gene 238,263 76.