Структурная организация, экспрессия и эволюция гена, кодирующего секреторный белок ssp160 у видов рода Chironomus

Березиков, Евгений Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурная организация, экспрессия и эволюция гена, кодирующего секреторный белок ssp160 у видов рода Chironomus
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурная организация, экспрессия и эволюция гена, кодирующего секреторный белок ssp160 у видов рода Chironomus"

На правах рукописи УДК 575.86:577.2:595.711

РГБ ОД

2 и С л I к У-,)

Березиков Евгений Викторович

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ, ЭКСПРЕССИЯ И ЭВОЛЮЦИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО СЕКРЕТОРНЫЙ БЕЛОК БЭР 160 У ВИДОВ РОДА апкомомиБ

Клеточная биология - 03.00.25

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2000

Работа выполнена в лаборатории клеточной биологии Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научные руководители: доктор биологических наук

Г. М. Дымшиц, кандидат биологических наук А. Г. Блинов

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

А. А. Ильичев

Государственный исследовательский центр вирусологии и биотехнологии "Вектор", г. Новосибирск.

кандидат биологических наук С. А. Демаков

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Ведущее учреждение: Институт биоорганической химии

СО РАН, г. Новосибирск.

Защита диссертации состоится и Ч СрЛЛ_ 2000 г. на утреннем

заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д - 002.11.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу:

630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат разослан ^ М Ю _2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

А.Д. Груздев

£ о

Г г) 1/п . /я п

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы. Функцией слюнных желез личинок хирономид является выработка специфического гликопротеинового секрета, в состав которого входит большое количество различных белковых компонентов. Гены, кодирующие секреторные белки, экспрессируются в слюнных железах очень интенсивно, что сопряжено с образованием специфических пуфов - колец Бальбиани на политенных хромосомах. Благодаря высокому уровню содержания секреторных белков и соответствующей мРНК в слюнных железах, а также из-за ограниченности экспрессии только одним типом ткани, гены секреторных белков хирономид являются одной из удобных моделей для изучения механизмов, обеспечивающих дифференциальную и тканеспецифичную экспрессию генов.

Молекулярная организация колец Бальбиани, постоянно присутствующих в кариотипе, и структура генов секреторных белков слюнной железы хирономид к настоящему времени достаточно хорошо изучены. У некоторых видов хирономид (С. thummi, С. pallidivittatus) в слюнной железе выделяют специальную долю, которая характеризуется появлением дополнительного пуфа на хромосоме IV, наличием дополнительного, специфического только для специальной доли белка с молекулярным весом 160 kDa (sspl60), наличием секреторных беермановых гранул и отличием в окрашивании на гликопротеины. В исследованиях Р. Хоффман с соавторами (Hoffman et al., 1996) было показано, что в дополнительном пуфе содержится ген, кодирующий белок sspl60, а также была установлена структура кДНК этого гена у С. thummi.

Установление структуры гена ssplóO и изучение его вариабельности как на внутривидовом, так и на межвидовом уровне, представляет интерес с точки зрения понимания эволюции и функции белка sspl 60 у личинок хирономид. Кроме этого, ген sspl 60 представляется удобной моделью для изучения регуляторных механизмов, обеспечивающих тканеспецифическую активность генов, в связи с чем исследование экспрессии гена ssplóO и установление структуры его промотора является актуальным.

Слюнные железы личинок хирономид и дрозофилид, а также silk-железы чашуйчатокрылых (Bombyx morí, Gallería mellonella) являются гомологичными органами, выполняющими похожие функции (Goldsmith, Kafatos, 1984; Turner, Mahowald, 1977). И хотя тканеспецифические гены желез у этих насекомых существенно различаются по своей структуре, регуляторные механизмы, обеспечи-

вающие корректную экспрессию генов секреторных белков, являются достаточно консервативными. Так, Б. Белло и П. Кубле (Bello, Couble, 1990) в экспериментах на Drosophila показали, что промотор гена Р25, который экспрессируется в задней части silk-железы В. morí, распознается и активируется только в передней части слюнной железы D. melanogasler. В связи с этим изучение генов siLk-белков представляет интерес не только в плане выяснения конкретных механизмов тканеспецифической регуляции, но и для изучения вопроса об эволюции сложных регуляторных систем.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучение структуры, экспрессии и эволюции тканеспецифического гена sspl60 у Chironomus thummi. В конкретные задачи работы входило:

1. Скрининг геномной библиотеки С. thummi с использованием в качестве зонда кДНК-клона гена ssplóO и получение геномного клона этого гена.

2. Установление полной нуклеотидной последовательности гена ssplóO, а также 5'-фланкируюхцей области гена, содержащей промотор.

3. Изучение внутри- и межвидовой вариабельности гена ssplóO и построение филогенетического древа, отражающего эволюцию гена ssplóO в роде Chironomus.

4. Изучение экспрессии гена ssplóO у разных видов хирономид и выяснение взаимосвязи" между наличием специальной доли в слюнной железе, присутствием гена ssplóO в геноме и его экспрессией.

Научная новизна работы. В результате проведенного исследования установлена полная нуклеотидная последовательность гена ssplóO у С. thummi и выявлено его прерывистое строение. Обнаружено существование аллельного полиморфизма по этому гену в популяциях С. thummi. Показано, что ген ssplóO имеется не у всех видов рода Chironomus. Для 18 видов хирономид установлена частичная нуклеотидная последовательность гена ssplóO и на основе полученных данных построено филогенетическое древо, согласующееся с существующими данными по эволюции хирономид. Исследована экспрессия гена ssplóO у разных видов хирономид и показано, что данный ген экспрессируется только у видов, имеющих специальную долю в слюнной железе.

Научно-практнческое значение. Полученные данные дополняют и расширяют существующую информацию о структуре и эволюции генов, кодирующих секреторные белки слюнных желез хирономид. Исследование экспрессии гена

sspI60 и получение последовательности его промотора являются основанием для дальнейшего изучения регуляции этого гена, как одной из моделей для выяснения молекулярных механизмов, обеспечивающих дифференциальную активность генов эукариот.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуэдения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, в который входит 237 ссылок. Работа изложена на 112 страницах машинописного текста, содержит 22 рисунка и 3 таблицы.

Публикации и апробаипя работы. По теме диссертации опубликовано 2 статьи. Результаты работы были представлены па трех международных конференциях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Сбор и определение личинок хирономия. Личинки австралийских видов хирономид были любезно предоставлены доктором Дж. Мартином (Мельбурнский университет, Австралия). Личинки палеарктических видов хирономид были собраны и определены сотрудниками лаборатории клеточной биологии ИЦиГ СО РАН.

Работа с нуклеиновыми кислотами. Все молекулярные методы, связанные со скринингом геномной библиотеки, выделением, очисткой, клонированием, амплификацией и сиквенсом ДНК, проводили стандартными методами, описанными в руководствах Sambrook et al. (1989), Dieffenbach et al. (1995). In situ гибридизацию на РНК целых слюнных желез проводили в соответствии с (Seydoux, Fire, 1995).

Компьютерный анализ последовательностей ДНК. Для построения филогенетических деревьев использовалась программа MEGA (http://evolgen.biol. metro-u.ac.jp/MEGA). Для распознавания лидерных последовательностей применяли программу SignalP-HMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0). Потенциальные сайты связывания транскрипционных факторов выявляли с помощью программы Matlnspector V2.2 (http://transfac.gbf.de/cgi-bin/matSearch /matsearch.pl).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Скрининг геномной библиотеки С. thummi. Клоп рС2А. Структура кДНК-копии гена ssplóO была определена Хоффман с соавторами (Hoffman et al., 1996). Для

получения клона, содержащего полную геномную копию гена sspl60, был проведен скрининг геномной библиотеки С. thummi, где в качестве зонда использовалась кДНК гена sspl60, амплифицированная из клона Л.160.1 с помощью ПЦР. В результате скрининга было получено два фаговых клона. С помощью рестрикционного анализа и Саузерн-блот гибридизации было показано, что один из них, /.С2, состоит из двух £coRI фрагментов размером 7.6 и 10 kb, причем только 7.6 kb фрагмент гибридизуется на кДНК гена sspJ60. Далее этот фрагмент субклонировали в вектор pUC19 и получили клон рС2А (рис. 1). Для цитологического картирования клона рС2А на политенных хромосомах С. thummi была проведена in situ гибридизация. Было показано, что клон рС2А гибридизуется в единственном сайте в районе А2Ь хромосомы IV.

ХС2 ? ">» . ■' 76КЬ k

рС2А

RI - - •

pNsiNsi

II... ' Seal H RV H H

N Sphl Taql

BamHI '"'""-.JRI

pHH700 pHH360

pHSca рШ1350

pRVNsi

pNsiBam

pHNsi

pSphBain pTaqBam

pBamRI

Рис. 1. Рестрикционная карта части клона рС2А и стратегия его субкпонирования. R] -£coRI, N - Nsil, Н - НтШ, Sea - Seal, RV - £coRV, Sph - Sphl, Bam - ВатШ, Taql - Taql.

Определение структуры гена юр/бО. Основываясь на известной последовательности кДНК-клона гена ¡зр160, была построена рестрикционная карта геномного клона рС2А и проведено его субклонирование. Всего было получено 12 субклонов (рис. 1), содержащих встройки размером 300-600 Ьр. Клоны были секвенированы, и на основе этого выведена первичная структура части Н-Ы клона рС2А. Структура геномной копии гена $яи160. При сравнении полученных последовательностей с последовательностью кДНК подтвердилось, что клон рС2А действи-

тельно содержит ген з$р160, причем весь ген находится в 3'-области клона рС2А и полностью помещается в фрагменте Н-Ю размером 3.6 кЬ. Полная копия гена состоит из 3372 Ьр (включая последовательности нетраслируемых районов) и содержит 5 интронов различного размера (315, 65, 465, 58 и 57 Ьр). Все интро-ны имеют классические сигнальные последовательности, т.е. начинаются на динуклеотид вТ и заканчиваются на АО. Кроме того, в геномной копии гена обнаружена инсерция длиной 18 Ьр, которая находится в повторяющемся районе гена и кодирует один из повторов ЗТБКЗТ. Также выявлено 35 нуклеотидных замен в геномной копии по сравнению с последовательностью кДНК.

Обнаруженные различия в последовательностях геномной и кДНК копиях гена объясняются полиморфизмом этого гена (см. ниже).

х Хч :

■<1 М Инсерция С::>::,\

f □ 1 ИГ trzr^n ан fa

р 1М1

1S0I 1502

Рис. 2. Структурная организация гена sspl60. Интроны обозначены закрашенными прямоугольниками. Р - промоторная область; +1 - сайт инициации транскрипции; М - сайт инициации трансляции; инсерция - положение инсерции размером 18Ьр в геномной копии гена относительно кДНК; стоп - терминирующий кодон; А - потенциальный сигнал поли-аденилирования. Праймеры, использовавшиеся для секвенирования вариабельного района (1601, 1602) и исследования иопуляциогаюго полиморфизма ().160.1-forward и Х160.1-reverse) обозначены стрелками. Н — положение HindtR сайтов; жирным шрифтом обозначен вариабельный HindiM сайт, полиморфизм по которому использовался в RFLP анализе. Цифрами обозначены длины фрагментов, получаемых при гидролизе эндонуклеазой HindlU ПЦР-продуктов, полученных с праймеров X 160.1 -forward и X160.1-reverse.

Экзон 1 содержит 5'-нетранслируемую область размером 37 Ьр, старг-кодон и последовательность, кодирующую большую часть сигнального пептида. Экзоны 2, 3 и 4 содержат только кодирующие последовательности гена, причем 70 % белка кодируется в экзоне 3. Последний, пятый экзон содержит 3'-нетранслируемую область размером 128 Ьр и несколько потенциальных сайтов полиаденилирования (рис. 2).

Консервативность подобной экзон-интронной организации гена ssplóO стало возможным оценить после того, как С. Кейс с соавторами устаиовили структуру гена ssplóO у Chironomus pallidivitíatus (Case S. Т., персональное сообщение). При сравнении последовательности гена ssplóO у С. thummi и С. pallidivitíatus оказалось, что экзон-интроннные границы гена полностью совпадают у этих видов, в то время как дивергенция последовательностей самих интронов достаточно существенна как за счет нуклеотидных замен, так и за счет делеций/встроек в интронах. Общий уровень гомологии между генами ssplóO С. thummi и С. pallidivitíatus составляет 70 %, в то время как в кодируемых ими белках 79 % аминокислот идентичны и 10 % относятся к одному и тому же классу, то есть на аминокислотном уровне белок ssp 160 является достаточно консервативным. Хотя sspl60 не имеет какой-либо существенной гомологии с другими silk-белками хирономид, можно сказать, что по экзон-интронной организации ген ssplóO очень похож на гены silk-белков, содержащих протяженные тандемные повторы .

Картирование сайта инициации транскрипции в гене ssp!60. Для определения сайта инициации транскрипции в гене ssplóO были проведены эксперименты по обратной транскрипции мРНК гена ssplóO и было выявлено 4 продукта различного размера: минорный фрагмент размером 39 bp и 3 мажорных фрагмента размером 66, 67 и 70 bp (рис. 3). Наличие минорного бэнда размером 39 bp говорит, скорее всего, о частой специфической терминации реакции обратной транскрипции in vitro в этом районе мРНК ssplóO. В свою очередь, мажорные бэнды свидетельствуют о том, что РНК полимераза II использует три близкорасположенных альтернативных сайтах для инициации транскрипции гена ssplóO in vivo. В качестве точки инициации транскрипции (+1 сайт па рис. 2) было решено выбрать положение, соответствующее наиболее интенсивному бэнду (67 bp).

Рис. 3. Картирование сайта инициации транскрипции гена 5зр160. Праймер 160.ЯТ использовался для сиквенса клона рС2А (С,А,Т,С) и обратной транскрипции в присутствии (+) и в отсутствии (-) мРНК из слюнной железы С. Аттт\. Слева показана последовательность, удлиняющая ранее установленную последовательность полноразмерной кДНК на 21 Ьр.

Определение сигнального пептида. Как известно, сигнальные пептиды контролируют транспорт практически всех белков как у эукариот, так и у прокариот, располагаются в N-концевой части белков н отщепляются во время транспорта белков через мембрану. С помощью программы SignalP-HMM (Nielsen, Krogh, 1998), в белке sspl60 в качестве сигнального пептида распознаются первые 22 аминокислоты, и, соответственно, расщепление должно происходить в районе AEG-GP, между позициями 22 и 23.

Анализ промотоппой области гена ssv!60. Для получения клона, содержащего промоторную область гена ssplöO, была сделана пара праймеров, один из которых соответствовал левой части клона pNsiNsi (см. рис. 1), а другой - обратно-комплементарен последовательности 5'-нетрапслируемой области гена. Полученный ПЦР-продукт размером l.lkb был клонирован в вектор pBlueScript и была установлена его полная нуклеотидная последовательность.

Промотор гена sspl60 содержит ТАТА-бокс в районе {-29, -26}. Однако последовательность ТАТА-бокса отличается от консенсусной последовательности ТАТАААА и представлена нуклеотидами ААТАААА. По всей видимости, именно мутация в ТАТА-боксе объясняет наличие нескольких близкорасположенных сайтов инициации транскрипции в гене ssplöO (см. рис. 3). Кроме ТАТА-бокса в промоторе гена ssplöO также имеется СААТ-бокс в области {-114, -111}.

При сравнении промоторых областей гена ssplöO размером 373 Ьр у С. thummi и С. pallidivittatus оказалось, что промоторы ssplöO существенно различаются у этих двух видов, причем дивергенция увеличивается в направлении

от сайта инициации транскрипции. Однако важные структурные элементы промотора, такие как TATA- и СААТ-боксы, полностью консервативны, что подтверждает их реальную функциональную значимость в промоторе ssplóO.

Для выявления потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов в промоторе гена ssplóO его последовательность была проанализирована с помощью программы Matinspector (Quandt et al., 1995). В промоторе гена ssplóO были обнаружены потенциальные сайты связывания некоторых транскрипционных факторов, роль которых в регуляции секреторных генов D. melanogaster и В. morí была подтверждена экспериментально. А именно, обнаружены множественные сайты связывания изоформ Z2 и Z4 белка BR-C, который опосредует сигнал экдистерона и необходим для экспрессии генов Sgs (Crowley et al., 1984; von Kalm et al., 1994). В районе СААТ-бокса располагаются последовательности, имеющие гомологию с сайтами связывания транскрипционных факторов SGFB и SGF-1, которые участвуют в регуляции экспрессии silk-генов В. morí (Matsuno et al., 1989; Nony et al., 1995). В районе -430 имеется потенциальный сайт узнавания транскрипционного фактора zeste (Benson, Pirrotta, 1989), связывание которого было показано в промоторе Sgs-4 (Mansukhani et al., 1988). Однако остается не ясным, действительно ли этот транскрипционный фактор играет роль в регуляции экспрессии Sgs генов. Также в промоторе ssplóO обнаружено несколько потенциальных сайтов связывания транскрипционного фактора croc (crocodile), который является представителем семейства Fork head (Hacker et al., 1996). Интересно, что транскрипционные факторы SEBP2 и SGF-1 тоже являются белками из семейства Fork head и необходимы сначала для формирования железы, а потом для экспрессии секреторных генов у D. melanogaster (Lehmann, Korge, 1996) и В. morí (Kokubo et al., 1996).

Для остальных транскрипционных факторов, потенциальные сайты связывания которых содержатся в промоторе гена ssplóO, экспериментально не было показано связывания с регуляторными элементами Sgs генов Drosophila и silk-генов В. morí. К этим факторам относятся Suppressor of hairless Su(H), CF2-I1 (ichorion transcription factor), dl (dorsal), Sn (Snail), Dfd (deformed) и ftz (Fushi tarazu), Hb (hunchback) и Krüppel (Kr), транскрипционные факторы теплового шока (HSF). Интересно, что все из перечисленных факторов, за исключением факторов теплового шока, являются продуктами ранних генов и составными частями регуляторных каскадов, определяющих развитие организма. Это свидетельствует,

хотя и косвенным образом, о существовании сложного механизма регуляции гена ssplôO. Наличие сайтов связывания транскрипционных факторов из семейства Fork head (SGF-1, croc) подтверждает роль транскрипционных факторов этого типа в формировании слюнной железы и регуляции silk-генов. Наконец, присутствие потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов BR-C говорит о том, что регуляция гена ssplôO может находиться под опосредованным контролем гормона экдистерона.

Популяппониый полиморфизм гена ssplôO у Chironomus thummi. При сравнении последовательности гена ssplôO с ранее полученной последовательностью кДНК был обнаружен ряд различий. Доя выяснения причин обнаруженных в последовательностях различий были проведены исследования полиморфизма гена sspl60. Одна из обнаруженных нуклеотидных замен в позиции 1067 приводит к появлению Hindlll сайта в геномной копии и его отсутствию в кДНК копии гена ssplôO. Это различие было использовано для проведения RFLP анализа. Для этого часть гена ssplôO амплифицировали с помощью праймеров Я160.1-forward и X 160.1 -reverse из геномной ДНК различных популяций С. thummi, продукты ПЦР

USA OER SIB рС2А

L - + - + - + M - +

347/356>j

I t ( L

Рис. 4. RFLP анализ гена sspl60. Геномная ДНК из личинок американской (USA), германской (GER) и сибирской (SIB) популяций использовалась для ПЦР с праймерами XlöO.l-forward и 1160.1-reverse (рис. 2). Аликвоты ПЦР-про-дуктов инкубировали в присутствии (+) или в отсутствии (-) эндонуклеазы Hindlll и разделяли в агарозном геле. Н - маркер X /HindlH; L -1 OObp маркер. Слева указаны длины полученных фрагментов.

подвергали ферментативному расщеплению эндонуклеазой НтсйII и разделяли в агарозных гелях. В зависимости от присутствия или отсутствия Нтс1Ш сайта в позиции 1067 должны получать фрагменты 68, 356,347 и 1663 Ьр или 68, 703 (356 + 357) и 1645 Ьр (см. рис. 2.). По такой схеме был проведен КРЬР анализ для 3-х

популяций С. Литтг. американской, сибирской и германской. Для всех популяций были получены фрагменты, обусловленные как присутствием, так и отсутствием НтсйИ сайта в позиции 1047, однако относительные интенсивности бэндов варьировали для различных популяций (рис. 4). С помощь денсито-метрического анализа было установлено, что соотношение первого варианта гена {ШпШ\ сайт есть, бэнды 356Ьр и 347Ьр) ко втором варианту {НтсйИ сайт отсутствует, бэнд 703Ьр) равно 80:20 для американской популяции, 20:80 для германской популяции и 5:95 для сибирской популяции С. Литт1. Наблюдаемая разница в интенсивности бэндов свидетельствует о существовании аллельных вариантов гена Я5р1б0 и его популяционном полиморфизме. Причем частоты аллелей существенно различаются между популяциями С. Життг. ПЦР-продукты, использовавшиеся для ВРЬР анализа, были также частично секвенированы и существование популяционного полиморфизма гена ¡зр160 было подтверждено на уровне иуклеотидных последовательностей гена.

Межвидовая вариабельность гена Для выявления корреляций между

наличием, структурой и экспрессией гена ирМО у разных видов хирономид с одной стороны и присутствием специальной доли в слюнной железе и дополнительного кольца Бальбиани у тех же видов с другой стороны, были проведены дополнительные исследования. 41 вид рода СЫгопотш, а также по одному представителю из других родов семейства СЫгопот1<1ае {АгсИаеосЫ рагаЪгипсИт и Зег^епйа Ьтсакпягз) были проанализированы на наличие гена 55/7/б"0 с помощью ПЦР. Только 30 видов из рода СЫгопотш показали положительные результаты (таблица 1). Для остальных 11 исследованных видов СЫгопоти.ч, а также для А. рагаЪгипсИт и & Ьтса1епл1$ не удалось получить специфического ПЦР-продукта, что скорее всего свидетельствует об отсутствии гена ¡¡р160 у этих видов.

Таблица. 1. Список видов хирономид, использовавшихся в исследовании. Филогенетически близкие виды объединены в группы согласно (Guryev et al, 2000) и отчеркнуты жирными линиями. В столбцах слева направо указаны: порядковый номер; название вида; наличие ПЦР-продукта с праймеров 1603, 1604; проводилось ли секвенирование ПЦР-продукта с праймеров 1601, 1602; результат in situ гибридизации на ПЦР-продукт с праймеров 1601, 1602 (данные для австралийских видов - из персонального сообщения Дж. Мартина); наличие специальной доли в слюнной железе; наличие дополнительного кольца Бальбиани BRa (Кикнадзе и др., 1990; Себелева Т.Е., персональное сообщение); результаты in situ гибридизации на РНК гена sspl60 в слюнных железах хирономид.

ПЦР Сиквенс In situ Спец. Доп. In situ

№ Виды 1603-1604 1601-1602 1601-1602 Доля КБ. РНК

Палеарктнческие вилы

1 С. luridus + - 1 место, плечо G + + Сильная

2 С. melanescens + - +

3 С р/^ет- + + 1 место, плечо G + +

4 С. pseudothummi + + 1 место, плечо G + +

5 С. thiimmi + + 1 место, апечо G + + Сильная

6 С. do г sal is + + 1 место, плечо G + ■+

7 С balatonicus - - Нет - - Нет

8 С enlisNA - - - ■

9 С muratensi.у + - - -

10 С plumosus + 1 место, плечо G - - Нет

11 С. agilis + - -

12 С. annularius + +

13 С cmgidatus + +

14 С bernensis + +

15 С. commutatus +

16 С. novosibiricus + + + + Слабая

17 С sororius + + +

IS С. tuvanicus + + + + Слабая

19 С heterodentatus + _ 1 место, плечо G +

20 С. obtusidens + + 1 место, плечо G + +

21 С. sokolovi + - 1 место, плечо G + + Слабая

22 С. temiistilus - -

23 С. biwaprimus + _

24 С. dilutus - - Нет - -

25 С. pallidivittatus + + 1 место, плечо G + +

26 С. tentans - - Нет - -

Австралийские виды

27 С. cloacalis + - 1 место, плечо G

28 С. circumdatus + _ 1 место, плечо G

29 С. februarius - - 1 место, плечо G

30 С nepeanensis + -

31 С. crassiforceps - - Нет

32 С. australis + - 2 места, плечо G

33 С. duplex + + 2 места, плечо G

34 С. jacksoni + + 1 место, плечо G

35 С. maddeni + -

36 С oppositus con + + 1 место, плечо G

37 С. spilleri + _ 1 место, плечо G

38 С. tepperi - - Нет

Другие виды

39 С. j/>. Raratonga - -

40 С. yashimatsue - -

41 С. sp. R. de Janeiro - -

Для большинства исследованных видов результаты ПЦР были также подтверждены данными по in situ гибридизации на препараты политенных хромосом из слюнных желез (таблица 1). Во всех случаях специфическая гибридизация происходила только в одном месте - в плече G, то есть там, где был картирован ген ssplôO у С. thummi. Лишь для некоторых австралийских видов хирономид была обнаружена гибридизация в два места в плече G (Дж. Мартин, персональное сообщение), однако дальнейшие исследования специфичности такой гибридизации не проводились.

Для тех видов, у которых не удалось детектировать ген ssplôO с помощью ПЦР, результаты in situ гибридизации оказались также отрицательными, за исключением одного вида - С. februarius. Из филогенетических исследований известно, что австралийские виды хирономид, к которым принадлежит С. februarius, являются наиболее древними в эволюционном плане представителями рода Chironomus. Поэтому отрицательные результаты ПЦР в случае С. februarius можно объяснить существенной дивергенцией последовательности гена ssplôO в районе использовавшихся праймеров.

Для оценки межвидовой вариабельности гена ssplôO на молекулярном уровне была установлена нуклеотидная последовательность части гепа для 18 видов рода Chironomus. Для этого ПЦР-продукты дополнительно секвенировали с внутренних праймеров 1602 и 1603 (рис. 2), фланкирующих часть гена размером 360 bp, в которой содержится вариабельный район встройки и N-X-S/T повторов.

266 302

С. plumosus LQGLANGTTSGNST---------------------------SNSTT-SNST

С. piger LEAFASGSASSN5T----------------------NSTSTSNSTTTTNST

С. thummi LEAFASGSASSNSTSNSTSTS---------------NSTTTSNSTTTTNST

С. dorsalis LOALANGTASSNSTANSTAST---------------NSTSTTNSTTSSNST

С. pseudothummi LOALANGTASRNSTANSTTAA---------------NSTTASNSTTTSNST

С. agilis LQGLANGTAS S NAT AS S NSTTAS T S T-------------TASTSTSSANST

С. sororius LQGLANGTAAANGTASSNST-------------------TASNSTTSGNST

С. novosibiricus LQGLANGTDSGNATAGSNSTTPSNST-------------TASNSTTSGNST

C. tuvanicus LQGLANGTASGNATASSTSTTASTSTTT-----------TASNSTTSGNST

C. duplex LQALANGTASSNSTAGSNSTTTT-------------------------N5T

C. pallidivittatus LQALANSTASANSTTSSNSTTTTTT---------------NSTSTTTTNST

C. cingula tus LQGLANGTASGNATASSNSTTASNST-------------TSSNSTTTANST

C. obtusituns LQALANGTASANATASSNSTTASNTT-----------------------ST

C. commutatus LQGLANGTASCKSTASSNSTTTSNSTTT-------------SNSTTTSNST

C. annularius LOGLANGTASSNATASSNSTTTSNSTTTTT-----------SNSTTTTNST

C. cppositus LQAFANGTASSNSTSTSNSTTTTSSSSNSTTTTTTSNSTTSTSSTSSSNST

C. jacksoni LQAFANGTASSNSTSTSNSTTTTSSSSNSTTTl'T-SNSTTSSSSTSSSNST

Рис. 5. Аминокислотные последовательности вариабельной части гена ssplôO (район встройки) у разных видов хирономид. Потенциальные сайты гликозилирования N-X-S/T подчеркнуты.

При анализе последовательностей гена sspl60 у разных видов хирономид оказалось, что эта часть гена является вариабельной и на межвидовом уровне: у разных видов появляются встройки и делеции (относительно последовательности С. thummi) разной длины, не нарушающие рамку считывания (рис. 5). Кроме этого, было обнаружено существенное число нуклеотидных замен и в других частях гена sspl60 у разных видов хирономид. Полученные последовательности были использованы для построения филогенетического древа, отражающего эволюцию reuasspl60 (см. ниже).

Экспрессия гена sspI60. Как было показано при изучении межвидового полиморфизма гена sspl60, у большинства видов рода Chironomus этот ген присутствует в геноме. Для выяснения вопроса о том, происходит ли экспрессия гена sspl60 у видов, не содержащих специальную долю, но имеющих последовательность этого гена в геноме, были проведены эксперименты по in situ гибридизации на РНК гена sspl60 в целых слюнных железах. Для исследования были выбраны следующие виды (таблица 1): а) содержащие ген sspl60, специальную долю и дополнительное кольцо Бальбиани (С. luridus и С. thummi из группы "pseudothummf'; С. sokolovi, С. tuvanicus и С. novosibiricus из группы "plumosus"); б) содержащие ген sspl60, но не имеющие специальной доли (С. plumosus); в) не содержащие гена sspl60 и специальной доли (С. balatonicus).

Для видов С. thummi и С. luridus был получен сильный гибридизационный сигнал, специфичный для специальной доли слюнной железы, что свидетельствует о высоком уровне транскрипции гена sspl60 в специальной доле слюнной железы у этих видов. Достоверность и специфичность гибридизации подтверждается контрольными экспериментами: при использовании в качестве зонда фрагмента той же цепи, что и РНК гена sspl60, гибридизационного ответа не наблюдалось; кроме этого, для вида С. balatonicus, не содержащего ген ssp!60 в геноме, результаты гибридизации были также отрицательными (данные не приведены). Для видов, имеющих специальную долю, но не входящих в комплекс "pseudothummr (С. novosibiricus, С. tuvanicus, С. sokolovi) результаты in situ гибридизации были положительными и специфичными для специальной доли, однако интенсивность ответа была значительно слабее, чем в случае видов С. thummi и С. luridus. Наконец, для вида С. plumosus, который содержит ген sspl60 в геноме, но не имеет специальной доли, при in situ гибридизации не удалось обнаружить транскриптов гена sspl60 в какой-либо части слюнной железы. На основе полученных данных

можно сделать следующий вывод о транскрипции гена sspl60: у видов группы "pseudothummi" ген sspl60 транскрибируется в специальной доле слюнной железы на высоком уровне; у остальных видов, имеющих специальную долю, также происходит транскрипция этого гена только в специальной доле, но со значительно меньшей интенсивностью; наконец, у видов, не имеющих специальной доли в слюнной железе, ген sspl60 вообще не транскрибируется. Таким образом, экспрессия гена sspl60 обуславливается наличием специальной доли, а уровень его экспрессии в специальной доле варьирует у разных видов хирономид. Эволюция гепа sso!60. Филогенетические взаимоотношения внутри рода Chironomus достаточно хорошо изучены на молекулярном уровне. В недавних работах Гурьев с соавторами на основе последовательностей митохондриальных генов цитохрома В и первой субъединицы цитохроиоксидазы, построили филогенетическое древо рода Chironomus, включающее более 50 видов, и выделили несколько кластеров филогенетически близких видов, а именно: I - "древние" австралийские виды, П - представители подрода Camptochironomus, III - "новые" австралийские виды, IV - комплекс видов "pseudothummi" и V - комплекс видов "plumosus", который, в свою очередь состоит из нескольких обособленных групп видов (Guryev et al., 2000). Наличие такого филогенетического древа, в целом согласующегося и с цитологическими, и с географическими данными, и отражающего эволюцию рода Chironomus, позволяет проводить сравнительный анализ конкретных генов хирономид и выявлять особенности их эволюции внутри рода Chironomus относительно эволюции самих видов.

Для 18 видов хирономид была установлена первичная структура части гена sspl60 размером 31 lbp и полученные данные использовались для филогенетического анализа. Построение филогенетических деревьев производили по методу связывания ближайших соседей (Saitou, Imanishi, 1987). Так как ни для одного из близких к Chironomus родов не удалось получить ПЦР-продукта гена sspl60, то не нашлось последовательности, которую можно было бы использовать в качестве внешней группы. В результате была построена бескорневая дендрограмма, отражающая эволюцию гена sspl60 (рис. 6). На древе были выявлены те же четыре кластера видов из пяти, определенных ранее по последовательностям митохондриальных генов (Guryev et al., 2000). Отсутствует кластер I, поскольку у всех видов, входящих в этот кластер, ген sspJ60 не удалось отсеквенировать. В целом, характер разбиения видов по группам и топология деревьев, построенных на

- С. соттиПа1ш

- С. Ьегпет^з

- С. аппи1аг1и$ • С. рЫтояш

- С. ст^Шиз

- С. /^¡Шз

- С. ¡огогт

- С. пп/атсиз

- С. поуояШпсиз

- С. р>сис1о!Иитт1

- С. р!дег

- С. 1китт1

- С. ЗагяаШ

■ С. ра1Штиа1из

■ С. ¿ир1ех

- С^асЪот

- С. оррозИш

Рис. 6. Филогенетическое древо видов рода СЫгопотт, построенное на основе последовательностей гена мр/бО. Кластеры видов обозначены римскими цифрами согласно (Сигуеу е1 а1., 2000) и выделены жирными вертикальными линиями. Над узлами древа показаны коэффициенты поддержки, вычисленные методом бутсрэп-анализа при количестве репликаций, равном 1000. Узлы с коэффициентами поддержки менее 50 свернуты и показаны в виде множественного ветвления из одного общего узла.

основе последовательностей гена ¡яр160 и митохондриальных генов, совпадают между собой. Кроме этого, обнаруживается корреляция между положением видов на древе и структурой вариабельной части гена $$р160 (см. рис. 5), которая не учитывалась при построении древа. В целом, наблюдается уменьшение размеров вариабельной части (количества Ы-Х-З/Т) повторов у более молодых в эволюционном плане видов, таких как С. рЬтозш. Таким образом, основной вывод, который можно сделать из филогенетического анализа последовательностей гена Я5р1б0 заключается в том, что эволюция кодирующей части гена в

целом отражает эволюцию видов внутри рода СЫгопотм.

Выводы.

1. Установлена полная нуклеотидная последовательность гена sspl60 Chironomus thummi. Ген имеет прерывистую организацию и содержит 5 интронов.

2. Показано существование аллельного полимофизма гена sspl60 у С. thummi. Аллели имеют различное распределение в разных популяциях С. thummi.

3. Методами ПЦР и in situ гибридизации исследовано наличие гена sspl60 у 41 вида хирономид. Показано, что у 30 изученных видов имеется ген sspI60. У остальных 11 видов ген обнаружен не был.

4. Для 18 видов хирономид были установлены нуклеотидные последовательности части гена sspl60. Обнаружена существенная вариабельность гена на межвидовом уровне. Наиболее вариабельным является район гена, содержащий N-X-S/T повторы. Филогенетическое древо, построенное на основе нуклеотидных последовательностей гена ssp!60, согласуется с существующими данными по филогенетическим взаимоотношениям хирономид.

5. Исследована экспрессия гена sspl60 у разных видов хирономид. Показано, что этот ген экспрессируется только у видов, содержащих специальную долю в слюнной железе. При этом уровень экспрессии гена у видов группы "pseudothummi" существенно выше, чем у видов, не входящих в эту группу. У видов, не имеющих специальной доли, но содержащих ген sspJ60 в геноме, экспрессии гена не обнаружено.

6. Установлена нуклеотидная последовательность промоторной области гена sspl60 размером 1.1 kb. Выявлены потенциальные регуляторные сайты, имеющие гомологию с известными регуляторньши последовательностями из промоторов генов других секреторных белков слюнной железы D. melanogaster и silk-железы В. топ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Berezikov Е., Blinov A.G., Scherbik S., Сох С.К., Case S.T. Structure and polymorphism of the Chironomus ihummi gene encoding special lobe-specific silk protein, sspl60 // Gene. 1998. V. 223. P. 347-354.

2. Макаревич И.Ф., Березиков E.B., Гурьев В.П., Блинов А.Г. Молекулярная филогения рода Chironomus, основанная на анализе нуклеотидных последовательностей двух ядерных генов, sspl60 и глобина 2Ь // Молекуляр Биол. 2000. В печати. 7 3> С/ Л/ С/

3. Berezikov Е., Blinov A.G., Case S.T. Structural organization of the cell-specillc silk protein gene sspI60 from Chironomus thummi (Diptera) // 9th International congress on genes, gene families and isozymes. April 14-19 1997. San Antonio, Texas.

4. Berezikov E., Blinov A.G., Case S.T. Structure and polymorphism of the Chironomus thummi gene encoding sspl60 // VIII International Balbiani ring workshop. Aug. 30 -Sep. 3, 1997. Falsterbo. Sweeden.

5. Makarevitch I., Berezikov E., Scherbik S., Aimanova K., Blinov A.G.. Case S.T. Evolutionary Instability of the Gene Encoding Chironomus Silk Protein, sspl60 // IX International Balbiani Ring Workshop, Sept. 12-16, 1999. Milwaukee, USA.

Подписано к печати 30.05.2000 г.

Формат бумаги 60x90 1/16 Печ. л. 1. Уч.-изд. л. 0,7.

Тираж 100 экз. Заказ № 72

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, проспект академика М. А. Лаврентьева, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Березиков, Евгений Викторович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Секреторные белки слюнных желез хирономид.

1.1.1. Исторический экскурс.

1.1.2. Структура и функция слюнной железы личинок хирономид.

1.1.3. Классификация silk-белков хирономид.

1.1.4. Белок ssp 160.

1.1.5. Регуляция silk-генов Chironomus.

1.2. Silk-белки Bombyx morí и их гены.

1.2.1. Фиброин.

1.2.2. Белок Р25 и L-chain-фиброин.

1.2.3. Серицин.

1.2.4. Регуляция экспрессии silk-белков Bombyx morí.

1.3. Silk-белки Galleríamellonella.

1.3.1. L-chain-фиброин.!.

1.3.2. БелокP25.

1.3.3. Сероин.

1.4. Роль гормонов в регуляции экспрессии генов silk-бежов.

1.5. Влияние внешних факторов на работу silk-железы.

1.6. Секреторные белки слюнной железы Drosophilamelanogaster.

1.6.1. Структура Sgs генов.

1.6.2. Регуляция Sgs генов Drosophila melanogaster.

1.7. Консервативность механизмов регуляции silk-генов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Сбор и определение личинок хирономид.

2.2. Скрининг геномной библиотеки.

2.3. Выделение ДНК.

2.3.1. Выделение фаговой ДНК.

2.3.2. Выделение геномной ДНК.

2.3.3. Выделение плазмидной ДНК.

2.3.4. Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей.

2.4. Клонирование ДНК.

2.4.1. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.

2.4.2. Лигировапие.

2.4.3. Приготовление компетентных клеток Е.coli.

2.4.4. Трансформация клеток Е. coli методом теплового шока.

2.5. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК.

2.6. ПЦР-амплификация.

2.7. Электрофорез ДНК в агарозных гелях.

2.8. Картирование сайта инициации транскрипции.

2.9. Гибридизация in situ.

2.9.1. Приготовление ДНК-зондов.

2.9.2. Гибридизации in situ на РНК слюнных желез хирономид.

2.9.3. Гибридизация in situ на политенные хромосомы хирономид.

2.9.4. Иммунологическая детекция.

2. Ю. Компьютерный анализ последовательностей ДНК.

2.10.1. Построение филогенетических деревьев.

2.10.2. Распознавание сигнальной последовательности.

2.10.3. Распознавание потенциальныхрегуляторных сайтов.

2.10.4. Распознавание потенциальных сайтов связывание нуклеосом.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Структурная организация гена ssp160.

3.1.1. Скрининг геномной библиотеки С. thummi. Клон рС2А.

3.1.2. Определение структуры кодирующей части гена ssplöO.

3.1.3. Картирование сайта инициации транскрипции в гене ssplöO.

3.1.4. Определение сигнального пептида.

3.1.5. Анализ промоторной области гена sspl60.

3.2. Полиморфизм гена ssp160.

3.2.1. Популяционный полиморфизм гена sspl60y Chironomus thummi.

3.2.2. Межвидовая вариабельность гена sspl60.

3.3. Экспрессия гена ssp160.

3.4. Эволюция гена ssp160.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурная организация, экспрессия и эволюция гена, кодирующего секреторный белок ssp160 у видов рода Chironomus"

Молекулярная организация колец Бальбиани, постоянно присутствующих в кариотипе, и структура генов секреторных белков слюнной железы хирономид к настоящему времени достаточно хорошо изучены. У некоторых видов хирономид (С. thummi, С. pallidivittatiis) в слюнной железе выделяют специальную долю, которая характеризуется появлением дополнительного пуфа на хромосоме IV, наличием дополнительного, специфического только для специальной доли секреторного белка (sspl60 у С. thummi), наличием секреторных беермановых гранул и отличием в окрашивании на гликопротеины (Beermann, 1961; Grossbach, 1977; Себелева, Кикнадзе, 1977; Себелева и др., 1981; Kolesnikov et. al., 1981; Кикнадзе и др., 1985). В исследованиях Р. Хоффман с соавторами (Hoffman et al., 1996) было показано, что в дополнительном пуфе содержится ген, кодирующий белок ssp 160, а также была установлена структура кДНК этого гена у С. thummi.

Установление структуры гена ssplóO и изучение его вариабельности как на внутривидовом, так и на межвидовом уровне, представляет интерес с точки зрения понимания эволюции и функции белка ssp 160 у личинок хирономид. Кроме этого, ген ssplóO представляется удобной моделью для изучения регуляторных механизмов, обеспечивающих тканеспецифическую активность генов, в связи с чем исследование экспрессии гена ssplóO и установление структуры его промотора является актуальным.

Слюнные железы личинок хирономид и дрозофилид и silk-железы чашуйчатокрылых (Bombyx mor i. Gallería mellonella) являются гомологичными органами, выполняющими похожие функции (Goldsmith, Kafatos, 1984; Turner, Mahowald, 1977). И хотя тканеспецифические гены желез у этих насекомых существенно различаются по .своей структуре, регуляторные механизмы, обеспечивающие корректную экспрессию генов секреторных белков, являются достаточно консервативными. Так, Б. Белло и П. Кубле (Bello, Couble, 1990) в экспериментах на Drosophila показали, что промотор гена Р25, который экспрессируется в задней части silk-железы В. mori, распознается и активируется только в передней части слюнной железы D. melanogaster. В связи с этим изучение генов silk-белков представляет интерес не только в плане выяснения конкретных механизмов тканеспецифической регуляции, но и для изучения вопроса об эволюции сложных регуляторных систем.

Дель и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучение структуры, экспрессии и эволюции тканеспецифического гена ssplóO у Chironomus thummi. В конкретные задачи работы входило:

1. Скрининг геномной библиотеки С. thummi с использованием в качестве зонда к ДНК-клона гена ssplóO и получение геномного клона этого гена.

2. Установление полной нуклеотидной последовательности гена ssplóO, а также 5'-фланкирующей области гена, содержащей промотор.

4. Изучение экспрессии гена ssplóO у разных видов хирономид и выяснение взаимосвязи между наличием специальной доли в слюнной железе, присутствием гена sspl60 в геноме и его экспрессией.

Научно-практическое значение. Полученные данные дополняют и расширяют существующую информацию о структуре и эволюции генов, кодирующих секреторные белки слюнных желез хирономид. Исследование экспрессии гена 55-рМО и получение последовательности его промотора являются основанием для дальнейшего изучения регуляции этого гена, как одной из моделей для выяснения молекулярных механизмов, обеспечивающих дифференциальную активность генов эукариот.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 9-ом Международном конгрессе по генам, генным семействам и изоферментам (Сан-Антонио, США, 1997), на 8-ом и 9-ом рабочих совещаниях по кольцам Бальбиани (Фалстербо, Швеция, 1997; Порт-Вашингтон, США, 1999).

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Березиков, Евгений Викторович

Выводы.

1. Установлена полная нуклеотидная последовательность гена ssplóO Chironomus thummi. Ген имеет прерывистую организацию и содержит 5 интронов.

2. Показано существование аллельного полимофизма гена ssplóO у С. thummi. Аллели имеют различное распределение в разных популяциях С. thummi.

3. Методами ПЦР и in situ гибридизации исследовано наличие гена ssplóO у 41 вида хирономид. Показано, что у 30 изученных видов имеется ген ssplóO. У остальных 11 видов ген обнаружен не был.

4. Для 18 видов хирономид были установлены нуклеотидные последовательности части гена ssplóO. Обнаружена существенная вариабельность гена на межвидовом уровне. Наиболее вариабельным является район гена, содержащий N-X-S/T повторы. Филогенетическое древо, построенное на основе нуклеотидных последовательностей гена ssplóO, согласуется с существующими данными по филогенетическим взаимоотношениям хирономид.

5. Исследована экспрессия гена ssplóO у разных видов хирономид. Показано, что этот ген экспрессируется только у видов, содержащих специальную долю в слюнной железе. При этом уровень экспрессии гена у видов группы "pseudothummi" существенно выше, чем у видов, не входящих в эту группу. У видов, не имеющих специальной доли, но содержащих ген ssplóO в геноме, экспрессии гена не обнаружено.

6. Установлена нуклеотидная последовательность промоторной области гена ssplóO размером 1.1 kb. Выявлены потенциальные регуляторные сайты, имеющие гомологию с известными регуляторными последовательностями из промоторов генов других секреторных белков слюнной железы D. melanogaster и silk-железы В. mori.

Заключение.

Хирономиды являются одним из традиционных и удобных объектов биологических исследований благодаря наличию крупных политенных хромосом в слюнных железах их личинок. В местах активной транскрипции на политенных хромосомах образуются тканеспецифические пуфы - кольца Бальбиани, в которых располагаются гены, кодирующие секреторные белки слюнной железы, или silk-белки. Возможность выделять отдельные компоненты секрета из слюной железы и наблюдать динамику их экспрессии на всех уровнях, от транскрипционного пуффинга хромосом и синтеза мРНК до секреции белковых продуктов, делает гены silk-белков удобной моделью для изучения регуляторных механизмов, обеспечивающих дифференциальную активность генов эукариот.

К настоящему времени гены, кодирующие секреторные белки хирономид, достаточно хорошо изучены. Так, в секрете Chironomus tentons выделяют по крайней мере 13 белковых компонентов, размер которых варьирует от 12 до 1100 kDa. Для большинства из этих белков определена структура кодирующих их генов и показано, что существенная часть этих генов представлена повторенными последовательностями, а сами белки имеют достаточно простой аминокислотный состав. На основе общности структуры и функции гены секреторных белков хирономид объединяют в мультигенное семейство.

У некоторых видов хирономид (С. thummi, С. pallidivittatus) в слюнной железе выделяют специальную долю, состоящую из 4 клеток. Характеристикой специальной доли является наличие дополнительного пуфа на хромосоме IV, наличие дополнительного, специфического только для специальной доли белка с молекулярным весом 160 kDa (ssplôO), наличие секреторных беермановых гранул и отличие в окрашивании на гликопротеины. В исследованиях Р. Хоффман с соавторами (HofFman et al., 1996) было показано, что в дополнительном пуфе содержится ген, кодирующий белок sspl 60, а также была установлена структура кДНК этого гена у С. thummi.

В настоящей работе была установлена структура геномной копии гена sspI60 С. thummi и показано, что этот ген имеет прерывистое строение и содержит 6 экзонов и 5 интронов. Полный размер гена составляет 3372 bp, из которых 960 bp (28%) приходятся на интроны, а 5'- и 3'-нетранслируемые области имеют размер 37 и 128 bp соответственно. Сравнение экзон-интронной организации гена ssp!60 у С. thummi и С. pallidivittatus показало, что границы и положение интронов в гене полностью консервативны у этих видов, хотя сами последовательности интронов существенно различаются как по длине, так и по нуклеотидному составу.

При сравнении нуклеотидных последовательностей геномной и к ДНК копий гена sspl60 был обнаружен ряд различий. Дальнейшие исследования методами ПЦР и RFLP-анализа показали, что у С. thummi существует аллельный полиморфизм по гену sspl 60, и аллели представлены неравномерно и различно в разных популяциях С. thummi. Аллели различаются между собой как по отдельным нуклеотидным заменам, так и по числу повторов в вариабельных районах гена.

Методами ПЦР и гибридизации in situ было проверено наличие гена sspl60 у 41 вида хирономид и показано, что этот ген имеется у большинства, но не у всех видов рода Chironomus. Так, у С. tentans, С. dilutus, С. tenuistilus, С. entis и С. balatonicus ген sspl60 не обнаружен, а результаты т situ гибридизации на 5' фланкирующую область гена свидетельствуют о том, что у этих видов, скорее всего, произошла делеция гена sspl60.

Для 18 видов хирономид была установлена частичная последовательность гена sspl60, включающая район повторов. У разных видов была обнаружена существенная вариабельность по числу повторов в этом районе, но ни для одного из исследованных видов не было обнаружено стоп-кодонов. На основе полученных нуклеотидных последовательностей было построено филогенетическое древо, которое совпадает с другими, независимыми данными по филогении хирономид, и можно сказать, что эволюция кодирующей части гена sspl60 отражает эволюцию видов внутри рода Chironomus.

Методом in situ гибридизации на РНК в целых слюнных железах было проведено исследование экспрессии гена sspl60 у разных видов хирономид. Оказалось, что этот ген экспрессируется только у видов, содержащих специальную долю, и только в специальной доле. Причем у видов группы "pseudothummi" гибридизационный ответ значительно сильнее, чем у остальных видов, содержащих специальную долю. В свою очередь у тех видов, которые содержат ген ssplóO, но не имеют специальной доли, транскриптов гена обнаружено не было. Таким образом, ген ssplóO не определяет формирование специальной доли, а наоборот, специальная доля обуславливает экспрессию этого гена. Вопрос о факторах, влияющих на дифферинцировку клеток специальной доли, остается открытым.

Для промоторной области гена sspJóO была установлена нуклеотидная последовательность района размером 1.2 kb. Промотор является TATA- и СААТ-содержащим. К сожалению, отсутствие экспериментальной системы для изучения промоторов хирономид in vivo не позволяет в настоящее время определить минимальные элементы промотора, необходимые для корректной и специфической экспрессии гена ssplóO в специальной доле слюнной железы. Однако наличие информации по регуляции генов silk-белков у Bombyx morí и Sgs-генов у Drosophila melanogaster, которые являются гомологичными по функции секреторным белкам хирономид, позволяет провести сравнительный контекстный анализ промоторных областей этих генов и сделать предположения о механизме регуляции гена ssplóO. Представляется вероятным, что ген ssplóO находится под опосредованным контролем стероидных гормонов, что приводит к изменениям в структуре хроматина в области промотора (точное позиционирование нуклеосом) и обеспечению тканеспецифичности экспрессии этого гена. В свою очередь, уровень экспрессии гена ssplóO может регулироваться рядом дополнительных транскрипционных факторов, входящих в достаточно сложный регуляторный каскад.

Роль и значение белка ssplóO в секрете личинок хирономид остается до конца не выясненным. С одной стороны, отсутствие гена ssplóO в геноме некоторых видов хирономид, и его транскрипционная неактивность у других, позволяет сделать вывод о том, что этот ген не является жизненно важным для личинок хирономид. С другой стороны, консервативность экзон-интронной организации гена и его целостность (отсутствие стоп-кодонов) у исследованных видов, свидетельствуют о том, что этот ген находится под селективным давлением отбора. Изучение популяционного и межвидового полиморфизма гена ssplóO обнаружило его высокую вариабельность в повторяющихся районах гена, обусловленную разным количеством мотивов N-X-S/T, которые являются потенциальными сайтами гликозилирования белка. Таким образом, ген ssplóO представляет собой достаточно динамичную структуру, а белок ssplóO не является совершенно необходимым для жизнедеятельности личинок хирономид, но, возможно, обеспечивает определенные адаптационные преимущества для тех видов, у которых он экспрессируется.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Березиков, Евгений Викторович, Новосибирск

1. Ashburner М. Patterns of puffing activity in the salivary gland chromosomes of Drosophila. VI. Induction by ecdysone in salivary glands of D. melanogaster cultured in vitro II Chromosoma. 1972. V. 38. P. 255-281.

2. Aviv H., Leder P. Purification of biologically active globin messenger RNA by chromotography on oligothymidylic acid-cellulose // Proc Natl Acad Sci USA. 1972. V. 69. 1408

3. Balbiani E.G. Sur la structure du noyau des cellules salivaires chez les larves de Chironomus. II Zool Anz. 1881. V 4. P. 637-641.

4. Bar dwell V.J, Treisman R. The POZ domain: a conserved protein-protein interaction motif// Genes Dev. 1994. V. 8. P. pl664-77.

5. Baumlein H., Pustell J , Wobus U., Case S.T., Kafatos F.C. The 3* ends of two genes in the Balbiani ring с locus of Chironomus thummi 11 J Mol Evol. 1986. V. 24. P. 72-82.

6. Beckendorf S.K., Kafatos F.C. Differentiation in the salivary glands of Drosophila melanogaster: characterization of the glue proteins and their developmental appearance // Cell. 1976. V. 9. P. 365-373.

7. Beermann W, Bahr G.F. The submicroscopic structure of the Balbiani ring // Exp Cell Res. 1954. V. 6. P. 195-201.

8. Beermann W. Ein Baibiani-ring als Locus einer Speicheldrusenmutation // Chromosoma. 1961. V. 12. P. 1-25.

9. Belikov S., Gelius В., Almouzni G., Wrange O. Hormone activation induces nucleosome positioning in vivo // EMBO J. 2000. V. 19. P. 1023-1033.

10. Bello В., Couble P. Specific expression of a silk-encoding gene of Bombyx in the anterior salivary gland of Drosophila II Nature. 1990. V. 346. P. 480-482.

11. Benson M., Pirrotta V. The Drosophila zeste protein binds cooperatively to sites in many gene regulatory regions: implications for transvection and gene regulation // EMBO J. 1989. V. 7. P. 3907-3915.

12. Bolshoy A., Shapiro K., Trifonov E.N., Ioshikhes I. Enhancement of the nucleosomal pattern in sequences of lower complexity // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 32483254.

13. Borcovec A.B., Masler E.P. Insect Neurochemestry and Neurophysiology. The Human Press, Clifton, NJ. 1990.

14. Botella L.M., Grond C., Saiga H., Edstrom J.E., Nuclear localization of a DNA-binding C-terminal domain from Balbiani ring coded secretory protein // EMBO J. 1988. V. 7. P. 3881-3888.

15. Botella L.M., Nieto A. The C-terminal DNA-binding domain of Chironomus BR gene products shows preferential affinity for (dA.dT)-rich sequences // Mol Gen Genet. 1996. V. 251. P. 422-427.

16. Brumley L.L., Bogachev S.S., Kolesnikov N.N., Waite J.H, Case ST. Divergence and conservation of epitopes in intermediate-size secretory proteins from three species of Chironomus II Comp Biochem Physiol. 1993. V. 104B. P. 731-738.

17. Burtis K.C., Thummel C.S., Jones C.W., Karim F.D., Hogness D.S. The Drosophila 74EF early puff contains E74, a complex ecdysone-inducible gene that encodes two ets-related proteins // Cell. 1990. V. 61. P. p85-99.

18. Case S.T., Byers M.R. Repeated nucleotide sequence arrays in Balbiani ring 1 of Chironomus tentans contain internally nonrepeating and subrepeating elements // J Biol Chem. 1983. V. 258. P. 7793-7799.

19. Case S T., Cox C., Bell W.C., Hoffman R.T., Martin J., Hamilton R. Extraordinary conservation of cysteines among homologous Chironomus silk proteins spl85 and sp220 //JMolEvol. 1997. V. 44. P. 452-462.

20. Case S T., Daneholt B. Cellular and molecular aspects of genetic expression in Chironomus tentans salivary glands // Int Rev Biochem. 1977. V. 15. P. 45-77.

21. Case S.T., Daneholt B. The size of the transcription unit in Balbiani ring 2 of Chironomus tentans as derived from analysis of the primary transcript and 75 S RNA // J Mol Biol. 1978. V. 124. P. 223-241.

22. Case S T., Summers R.L., Jones A G. A variant tandemly repeated nucleotide sequence in Balbiani ring 2 of Chironomus tentans 11 Cell. 1983. V. 33. P. 555-562.

23. Case S.T., Wieslander L. Secretory proteins of Chironomus salivary glands: structural motifs and assembly characteristics of a novel biopolymer // Results Probl Cell Differ. 1992. V. 19. P. 187-226.

24. Case S.T. Correlated changes in steady-state levels of Balbiani ring mRNAs and secretory polypeptides in salivary glands of Chironomus tentans II Chromosoma. 1986. V. 94. P. 483-491.

25. Chevillard M., Couble P., Prudhomme J.C. Complete nucleotide sequence of the gene encoding the Bombyx mori silk protein P25 and predicted amino acid sequence of the protein // Nucleic Acids Res. 1986. V. 14. P. 6341-6342.

26. Cortes E, Botella L.M., Barettino D., Diez J.L. Identification of the spl products of Balbiani ring genes in Chironomus thummi // Chromosoma. 1989. V. 98. P. 428-432.

27. Couble P., Chevillard M., Moine A., Ravel-Chapuis P., Prudhomme J.C. Structural organization of the P25 gene of Bombyx mori and comparative analysis of its 5' flanking DNA with that of the fibroin gene //Nucleic Acids Res. 1985. V. 13.P. 1801-1814.

28. Couble P., Michaille J.J., Garel A., Couble ML., Prudhomme J.C. Developmental switches of sericin mRNA splicing in individual cells of Bombyx mori silkgland // Dev Biol. 1987. V. 124. P. 431-440.

29. Couble P., Moine A., Garel A., Prudhomme J.C. Developmental variations of a nonfibroin mRNA of Bombyx mori silkgland, encoding for a low-molecular-weight silk protein // Dev Biol. 1983. V. 97. P. 398-407.

30. Crowley T.E., Bond M.W., Meyerowitz E.M. The structural genes for three Drosophila glue proteins reside at a single polytene chromosome puff locus // Mol Cell Biol. 1983. V. 3. P. 623-634.

31. Crowley T.E., Mathers P.H., Meyerowitz E.M. A trans-acting regulatory product necessary for expression of the Drosophila melanogaster 68C glue gene cluster // Cell. 1984. V. 39. P. 149-156.

32. Crowley T.E., Meyerowitz E.M. Steroid regulation of RNAs transcribed from the Drosophila 68c polytene chromosome puff// Dev Biol. 1984. V. 102. P. 110-121.

33. Daneholt B., Anderson K., Fagerlind M. Large-sized polysomes in Chironomus tentans salivary glands and their relation to Balbiani ring 75 S RNA // J Cell Biol. 1977. V. 73. P. 149-160.

34. Daneholt B., Hosick H. Evidence for transport of 74S RNA from a discrete chromosome region via nuclear sap to cytoplasm in Chironomus tentans // Proc Natl Acad Sci USA. 1973. V. 70. P. 442-446.

35. Daneholt B. Giant RNA transcript in a Balbiani ring // Nature New Biol. 1972. V. 240. P. 229-232.

36. Di B.P., Withers D.A., Bayer C.A., Fristrom J.W., Guild G.M. The Drosophila Broad-Complex encodes a family of related proteins containing zinc fingers // Genetics. 1991. V. 129. P. p385-97.

37. Diez J.L., Cortes E., Merino Y., Santa-Cruz M.C. Galactose-induced puffing changes in chironomus thummi Balbiani rings and their dependence on protein synthesis // Chromosoma. 1990. V. 99. P. 61-70.

38. Dignam S.S., Case S.T. Balbiani ring 3 in Chironomus tentcms encodes a 185-kDa secretory protein which is synthesized throughout the fourth larval instar // Gene. 1990. V. 88. P. 133-140.

39. Dignam S.S., Yang L., Lezzi M., Case S.T. Identification of a developmentally regulated gene for a 140-kDa secretory protein in salivary glands of Chironomus tentans larvae // J Biol Chem. 1989. V. 264. P. 9444-9452.

40. Dorer S., Douglas R., Henikoff S. Expansion of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila H Cell. 1994. V. 77. P. 993-1002.

41. Dreesen T.D., Lezzi M., Case S.T. Developmentally regulated expression of a Balbiani ring 1 gene for a 180-kD secretory polypeptide in Chironomus tentans salivary glands before larval/pupal ecdysis // J Cell Biol. 1988. V. 106. P. 21-27.

42. Durand B., Drevet J., Couble P. P25 gene regulation in Bombyx mori silk gland: two promoter-binding factors have distinct tissue and developmental specificities // Mol Cell Biol. 1992. V. 12. P. 5768-5777.

43. Dynan W.S., Tjian R. The promoter specific transcription factor Spl binds to upstream sequencese in the SV40 early promoter // Cell. 1983. V. 66. P. 563-567.

44. Edstrom J.E., Rydlander L., Francke C. Concomitant induction of a Balbiani ring and a giant secretory protein in Chironomus salivary glands // Chromosoma. 1980. V. 81. P. 115-124.

45. Edstrom J.E., Sierakowska H., Burvall Dependence of Balbiani ring induction in Chironomus salivary glandson inorgabic phosphate // Dev Biol. 1982. V. 91. P. 131-137.

46. Ekker SC., von Kessler D.P., Beachy P. A. Differential DNA sequence recognition is a determinant of specificity in homeotic gene action // EMBO J. 1992. V. 11. P. 4059-4072.

47. Emery IF., Bedian V., Guild G.M. Differential expression of Broad-Complex transcription factors may forecast tissue-specific developmental fates during Drosophila metamorphosis//Development. 1994. V. 120. P. p3275-87.

48. Felsenstei J. Confedence limits on phylogenies: an approach using the bootsrap // Evolution. 1985. V. 39. P. 783-791.

49. Fernandes M., Xiao H, Lis J.T. Fine structure analyses of the Drosophila and Saccharomyces heat shock factor-heat shock element interactions // Nucleic Acids Res.1994. V. 22! P. 167-173.

50. Fletcher J.C., Burtis K.C., Hogness D.S., Thummel C.S. The Drosophila E74 gene is required for metamorphosis and plays a role in the polytene chromosome puffing response to ecdysone // Development. 1995. V. 121. P. pl455-65.

51. Fletcher J.C., Thummel C.S. The ecdysone-inducible Broad-complex and E74 early genes interact to regulate target gene transcription and Drosophila metamorphosis // Genetics.1995. V. 141. P. pl025-35.

52. Florence B., Handrow R., Laughon A. DNA-binding specificity of the fushi tarazu homeodomain//Mol Cell Biol. 1991. V. 11. P. 3613-3623.

53. Fukuta M, Matsuno K , Hui C.C., Nagata T., Takiya S., Xu P.X., Ueno K., Suzuki Y. Molecular cloning of a POU domain-containing factor involved in the regulation of the Bombyx sericin-1 gene//J Biol Chem. 1993. V. 268. P. 19471-19475.

54. Gage LP., Manning R.F. Internal structure of the silk fibroin gene of Bombyx mori. I The fibroin gene consists of a homogeneous alternating array of repetitious crystalline and amorphous coding sequences // J Biol Chem. 1980. V. 255. P. 9444-9450.

55. Gall J.G., Pardue M L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations // Proc Natl Acad Sci USA. 1969. V. 63. P. 378-383.

56. Galler R., Edstrom J.E. Phosphate incorporation into secretory protein of chironomus salivary glands occurs during translation // EMBO J. 1984. V. 3. 2855

57. Galler R., Saiga H., Widmer R.M., Lezzi M., Edstrom J.E. Two genes in Balbiani ring 2 with metabolically different 75S transcripts //EMBO J. 1985. V. 4. P. 2977-2982.

58. Galli J., Lenaahl U., Paulsson G., Ericsson C., Bergman T., Carlquist M., Wieslander L. A new member of a secretory protein gene family in the dipteran Chironomus tentcms has a variant repeat structure // J Mol Evol. 1990. V. 31. P. 40-50.

59. Galli J., Wieslander L. Two secretory protein genes in Chironomus tentans have arisen by gene duplication and exhibit different developmental expression patterns // J Mol Biol. 1993a. V. 231. P. 324-334.

60. Galli J., Wieslander L. A repetitive secretory protein gene of a novel type in Chironomus tentans is specifically expressed in the salivary glands and exhibits extensive length polymorphism // J Biol Chem. 1993b. V. 268. P. 11888-11893.

61. Galli J., Wieslander L. A new member of the balbiani ring multigene family in the dipteran Chironomus tentans consists of a single-copy version of a unit repeated in other gene family members // J Mol Evol. 1994a. V. 37. P. 457-463.

62. Galli J., Wieslander L. Structure of the smallest salivary-gland secretory protein gene in Chironomus tentans IIJ Mol Evol. 1994b. V. 38. P. 482-488.

63. Gamo T., Inokuchi T., Laufer H. Polypeptides of fibroin and serecin secreted from the different sections of the silk gland in Bombyx mori // Insect Biochem. 1977. V. 7. P. 285295.

64. Garel J.P. Endocrinological aspacts of silk production // Experientia. 1983. V. 39. P. 461466.

65. Garfinkel M.D., Pruitt RE, Meyerowitz E.M. DNA sequences, gene regulation and modular protein evolution in the Drosophila 68C glue gene cluster // J Mol Biol. 1983. V. 168. P. 765-789.

66. Georgel P., Bellard F., Dretzen G., Jagla K., Richards G., Bellard M. GEBF-I in Drosophila species and hybrids: the co-evolution of an enhancer and its cognate factor // Mol Gen Genet. 1992. V. 235. P. 104-112.

67. Gilbert L.J. The endocrine control of molting: the Tobacco hornworm, Manduca sexta, as a model system // Ecdysone. (ed. Koolman, J.). Stuttgart. George Thieme. 1989. P. 448471.

68. Gogos J.A., Hsu T., Bolton J., Kafatos F.C. Sequence discrimination by alternatively spliced isoforms of a DNA binding zinc finger domain // Science. 1992. V. 257. P. 19511955.

69. Goldsmith M.R., Kafatos F.C. Developmentally regulated genes in silkmoths // Annu Rev Genet. 1984. V. 18. P. 443-487.

70. Grond C., Saiga H., Edstrom J.E. The sp-I genes in the Balbiani rings of Chironomus salivary glands // Results Probl Cell Differ. 1987. V. 14. P. 69-80.

71. Grossbach U. Chromosomen-Aktivitat und biochemische Zelldifrerenzierung in del Speichel-drusen von Camptochironomus II Chromosoma. 1969. V. 28. P. 136-244.

72. Grossbach U. Chromosome puffs and gene expression in polytene cells // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1973. V. 38. P. 619-627.

73. Grossbach U. The salivary gland of Chironomus (Díptera): a model system for the study of cell differentiation // Results Probl Cell Differ. 1977. V. 8. P. 147-196.

74. Grzelak K., Couble P., Garel A., Kludkiewicz B., Alrouz H. Low molecular wieght silk proteins in Gallería mellonella // Insect Biochem. 1988. V. 18. P. 223-228.

75. Grzelak K., Kluding H., Lasota Z. The effect of 20-hydroxyecdyson on expression of genes coding for low molecular weight silk proteins of Gallería mellonella II Insect Biochem Mol Biol. 1993. V. 18. P. 223-228.

76. Grzelak K. Control of expression of silk protein genes // Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 1995. V. 110. P. 671-681.

77. Guay P.S., Guild G.M. The ecdysone-induced puffing cascade in Drosophila salivary glands: a Broad-Complex early gene regulates intermolt and late gene transcription // Genetics. 1991. V. 129. P. 169-175.

78. Guild G.M., Shore E.M. Larval salivary gland secretion proteins in Drosophila. Identification and characterization of the Sgs-5 structural gene // J Mol Biol. 1985. V. 179. P. 289-314.

79. Guild G.M. Molecular analysis of a developmentally regulated gene which is expressed in the larval salivary gland oí Drosophila II Dev Biol. 1984. V. 102. P. 462-470.

80. Guryev V., Makarevitch I., Blinov A., Martin J. Phylogeny of the genus Chironomus (Diptera) inferred from DNA sequences of mitochondrial Cytochrome b and Cytochrome oxidase I // Mol. Phyl. Evol. 2000. V. in press.

81. Hacker U., Kaufmann E., Hartmann C., Jurgens G., Knochel W., Jackie H. The Drosophila fork head domain protein crocodile is required for the establishment of head structures//EMBO J. 1996. V. 14. P. 5306-5317.

82. Hagele K. Chironomus II Handbook of Genetics. N. Y. London. Plenum Press. 1975. P. 219-278.

83. Hamada Y., Yamashita O, Suzuki Y. Haemolymph control of sericin gene expression studied by organ transplantation // Cell Dff. 1987. V. 20. P. 65-76.

84. Hamodrakas S.J., Kafatos F.C. Structural implications of primary sequences from a family of Balbiani ring-encoded proteins in Chironomus IIJ Mol Evol. 1984. V. 20. P. 296-303.

85. Hansson L., Lambertsson A. The role of su(j) gene function adn ecdysterone in transcription of glue polupeptide mRNAs in Drosophila melanogaster II Mol Gen Genet. 1983. V. 192. P. 395-401.

86. Hansson L., Lambertsson A. Steroid regulation of glue protein genes in Drosophila melanogaster II Hereditas. 1989. V. 110. P. 61-67.

87. Hardy P.A., Pelling C. Cell-free synthesis and immunological characterization of salivary proteins from Chironomus tentans I I Chromosoma. 1980. V. 81. P. 403-417.

88. Hertner T., Eppenberger H.M., Lezzi M. The gain secretory proteins of Chironomus tentans salivary glands, the organization of their primary structure, their amino acid and carbohydrate composition//Chromosoma. 1983. V. 88. P. 194-200.

89. Hertner T., Meyer B., Eppenberger H.M., Mahr R. The secretion proteins in chironomus tentans salivary glands: electrophoretic characterization adn molecular weight estimation // Wilhel Roux's Arch Dev Biol. 1980. V. 189. P. 69-72.

90. Hoey T., Levine M. Divergent homeo box proteins recognize similar DNA sequences in Drosophila II Nature. 1988. V. 332. P. 856-861.

91. Hoffman R.T., Schmidt E.R., Case S T. A cell-specific glycosylated silk protein from Chironomus thummi salivary glands. Cloning, chromosomal localization, and characterization of cDNA// J Biol Chem. 1996. V. 271. P. 9809-9815.

92. Hofmann A., Garfinkel M.D., Meyerowitz E.M. cis-acting sequences required for expression of the divergently transcribed Drosophila melanogaster Sgs-7 and Sgs-8 glue protein genes I I Mol Cell Biol. 1991. V. 11. P. 2971-2979.

93. Hoog C., Engberg C , Wieslander L. A BR 1 gene in Chironomus tentans has a composite structure: a large repetitive core block is separated from a short unrelated 3'-terminal domain by a small intron // Nucleic Acids Res. 1986. V. 14. P. 703-719.

94. Hoog C, Wieslander L. Differen evolutionary behavior of structurally related, repetitive sequences occuring in the same Balbiani ring gene in Chironomus tentans // Proc Natl Acad Sci USA. 1984. V. 81. P. 5165-5169.

95. Horner M.A., Chen T., Thummel C.S. Ecdysteroid regulation and DNA binding properties of Drosophila nuclear hormone receptor superfamily members // Dev Biol. 1995. V. 168. P. p490-502.

96. Hui C.C., Matsuno K., Suzuki Y. Fibroin gene promoter contains a cluster of homeodomain binding sites that interact with three silk gland factors // J Mol Biol. 1990a. V. 213. P. 651-670.

97. Hui C.C., Suzuki Y., Kikuchi Y, Mizuno S. Homeodomain binding sites in the 5' flanking region of the Bombyx mori silk fibroin light-chain gene // J Mol Biol. 1990b. V. 213. P. 395-398.

98. Hui C.C., Suzuki Y. Enhancement of transcription from the Ad2 major late promoter by upstream elements of the fibroin- and sericin-1-encoding genes in silk gland extracts // Gene. 1989. V. 85. P. 403-411.

99. Jongens T.A., Fowler T., Shermoen A.W., Beckendorf S.K. Functional redundancy in the tissue-specific enhancer of the Drosophila Sgs-4 gene // EMBO J. 1989. V. 7. P. 25592567.

100. Jukes T.H., Cantor C.R. Evolution of protein molecule // Mammalian protein metabolism, (ed. Munro, N.H.). New York. Acad. Press. 1969. P. 21-132.

101. Jurgens G., Weigel D. Terminal versus seqmental development in the Drosophila embryo: the role of the homeotic gene fork head // Roux's Arch Dev Biol. 1988. V. 197. P. 345354.

102. Kao W.Y., Case S.T. A novel giant secretion polypeptide in Chironomus salivary glands: implications for another Balbiani ring gene // J Cell Biol. 1985. V. 101. P. 1044-1051.

103. Kao W.Y., Case S T. Individual variations in the content of giant secretory polypeptides in salivary glands of Chironomus II Chromosoma. 1986. V. 94. P. 475-482.

104. Karim F.D., Guild G.M., Thummel C.S. The Drosophila Broad-Complex plays a key role in controlling ecdysone-regulated gene expression at the onset of metamorphosis // Development. 1993. V. 118. P. p977-88.

105. Kasai Y., Nambu J R., Lieberman P.M., Crews S.T. Dorsal-ventral patterning in Drosophila: DNA binding of snail protein to the single-minded gene // Proc Natl Acad Sci USA. 1992. V. 89. P. 3414-3418.

106. Kiknadze I.I., E. L.O., Kolesnikov N.N., Gunderina L.I. Animal species for developmental studies, (eds. Dettlaff, T.A. and Vassetsky, S.G.). New York. Consultants Bureau. 1990. V. l.P. 133-178.

107. Kikuchi Y., Mori K., Suzuki S., Yamaguchi K., Mizuno S. Structure of the Bombyx mori fibroin light-chain-encoding gene, upstream sequence elements common to the light and heavy chain//Gene. 1992. V. 110. P. 151-158.

108. King-Jones, K., Korge G., Lehmann M. The helix-loop-heiix proteins dAP-4 and daughterless bind both in vitro and in vivo to SEBP3 sites required for transcriptional activation of the Drosophila gene Sgs-4 IIJ Mol Biol. 1999. V. 291. P. 71-82.

109. Kodrik D., Sehnal F. Juvenile hormone counteracts the action of ecdysterone on silk glands of Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Pyralidae) // Int J Insect Morphol Embryol. 1994. V. 23. P. 39-56.

110. Koeile M.R., Talbow W.S., Segrawes W.A., Bender M.T., Cherbas P., Hogness D.S. The Drosophila EcR gene encodes an ecdysteron receptor, a new member of a steroid receptor superfamily//Cell. 1991. V. 67. P. 59-77.

111. Kokubo H., Takiya S., Mach V., Suzuki Y. Spatial and temporal expression pattern of Bombyx mori fork head/SGF-1 gene in embryogenesis // Dev Genes Evol. 1996. V. 206. P. 80-85.

112. Kolesnikov N.N., Karakin E.I., Sebeleva T.E., Meyer L., Serfling E. Cell-specific synthesis and glycosylation of secretory proteins in larval salivary glands of Chironomus thummi II Chromosoma. 1981. V. 83. P. 661-677.

113. Koolman J. Ecdysteroids // Zool Sci. 1990. V. 7. P. 563-580.

114. Korge G. Chromosome puff activity and protein synthesis in larval salivary glands of Drosophila melanogaster II Proc Natl Acad Sci USA. 1975. V. 72. P. 4550-4554.

115. Korge G. Larval saliva in Drosophila melanogaster. production, composition, and relationship to chromosome puffs // Dev Biol. 1977. V. 58. P. 339-355.

116. Korge G. Genetic analysis of the larval secretion gene Sgs-4 and its regulatory chromosome sites in Drosophila melanogaster 11 Chromosoma. 1981. V. 84. P. 373-390.

117. Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA: molecular evolutionary genetics analysis, version 1.01 //Pennsylvania State Univ. 1993. v. 1.01.

118. Kumaran A.K. Modes of action of juvenile hormones at cellular and molecular levels // Recent Advances in Comparative Arthropod Morphology, Physiology and Development 1990. V. l.P. 182-227.

119. Kuzin B , Tillib S., Sedkov Y., Mizrokhi L., Mazo A. The Drosophila trithorax gene encodes a chromosomal protein and directly regulates the region-specific homeotic gene fork head // Genes Dev. 1994. V. 8. P. p2478-90.

120. Laemmli U.K., Kas E., Poljak L., Adachi Y. Scaffold assotiated regions: cis-acting determinants of chromatin structural loops and functional domains // Curr Opin Genet Dev. 1992. V. 2. P. 275-285.

121. Lecourtois M., Schweisguth F. The neurogenic suppressor of hairless DNA-binding protein mediates the transcriptional activation of the enhancer of split complex genes triggered by Notch signaling // Genes Dev. 1995. V. 9. P. 2598-2608.

122. Lehmann M., Korge G. Ecdysone regulation of the Drosophila Sgs-4 gene is mediated by the synergistic action of ecdysone receptor and SEBP 3 // EMBO J. 1995. V. 14. P. 716726.

123. Lehmann M., Korge G. The fork head product directly specifies the tissue-specific hormone responsiveness of the Drosophila Sgs-4 gene // EMBO J. 1996. V. 15. P. 48254834.

124. Lehmann M., Wattler F., Korge G. Two new regulatory elements controlling the Drosophila Sgs-3 gene are potential ecdysone receptor and fork head binding sites // Mech Dev. 1997. V. 62. P. 15-27.

125. Lehmann M. Drosophila Sgs genes: stage and tissue specificity of hormone responsiveness//Bioessays. 1996. V. 18. P. 47-54.

126. Lendahl U., Wieslander L. Balbiani ring 6 gene in Chironomus tentans. a diverged member of the Balbiani ring gene family // Cell. 1984. V. 36. P. 1027-1034.

127. Lendahl U., Wieslander L. Balbiani ring (BR) genes exibit different patterns of expression during development//Dev Biol. 1987. V. 121. P. 130-138.

128. Lizardi P.M., Brown D.D. The length of the fibroin gene in the Bombyx mori genome // Cell. 1975. V. 4. P. 207-215.

129. Lotz B., Colonna Cesari F. The chemical structure and the crystalline structures of Bombyx mori silk fibroin//Biochimie. 1979. V. 61. P. 205-214.

130. Mach V., Ohno K., Kokubo H., Suzuki Y. The Drosophila fork head factor directly controls larval salivary gland-specific expression of the glue protein gene Sgs3 II Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 2387-2394.

131. Mach V., Takiya S., Ohno K., Handa H., Imai T., Suzuki Y. Silk gland factor-1 involved in the regulation of Bombyx sericin-1 gene contains fork head motif // J Biol Chem. 1995. V. 270. P. 9340-9346.

132. Maniatis T., Goodborn S., Fisher J. Regulation of inducible and tissue specific gene expression// Science. 1987. V. 236. P. 1237-1244.

133. Mansukhani A., Crickmore A., Sherwood P.W., Goldberg M L. DNA-binding properties of the Drosophila melanogaster zeste gene product // Mol Cell Biol. 1988. V. 8. P. 615623.

134. Martin J., Hoffman R.T., Case S T. Identification of divergent homologs of Chironomus tentans spl85 and its Balbiani ring 3 gene in Australasian species of Chironomus and Kiefferulus II Insect Biochem Mol Biol. 1996. V. 26. P. 465-473.

135. Martin M., Giangrande A., Ruiz C., Richards G. Induction and repression of the Drosophila Sgs-3 glue gene are mediated by distinct sequences in the proximal promoter //EMBO J. 1989a. V. 8. P. 561-568.

136. Martin M., Mettling C., Giangrande A., Ruiz C., Richards G. Regulatory elements and interactions in the Drosophila 68C glue gene cluster // Dev Genet. 1989b. V. 10. P. 189197.

137. Matsuno K., Hui CC, Takiya S., Suzuki T., Ueno K., Suzuki Y. Transcription signals and protein binding sites for sericin gene transcription in vitro // J Biol Chem. 1989. V. 264. P. 18707-18713.

138. Matsuno K., Takiya S., Hui C.C., Suzuki T., Fukuta M., Ueno K., Suzuki Y. Transcriptional stimulation via SC site of Bombyx sericin-1 gene through an interaction with a DNA binding protein SGF-3 //Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 1853-1858.

139. McNabb S.L., Beckendorf S.K. Cis-acting sequences which regulate expression of the Sgs-4 glue protein gene of Drosophila II EMBO J. 1986. V. 5. P. 2331-2340.

140. Meyerowitz E.M., Hogness D.S. Molecular organization of a Drosophila puff site that responds to ecdysone // Cell. 1982. V. 28. P. 165-176.

141. Michaille J.J., Couble P., Prudhomme J.C., Garel A. A single gene produces multiple sericin messenger RNAs in the silk gland of Bombyx mori II Biochimie. 1986. V. 68. P. 1165-1173.

142. Michaille J. J., Garel A., Prudhomme J.C. The expression of five middle silk gland specific genes is territorially regulated during the larval development of Bombyx mori // Insect Biochem. 1989. V. 19. P. 19-27.

143. Michalik J., Szolajska E., Lassota Z. Brain factor from Galleria mellonella (Lepidoptera) stimulating silk gland activity // Experientia. 1992. V. 48. P. 762-765.

144. Mitchell P., Tjian R. Transcriptional regulation in mammalian cells by sequence specific DNA binding proteins // Science. 1989. V. 245. P. 371-378.

145. Mitsialis S.A., Kafatos F.C. Regulatory elements controlling chorion gene expression are conserved between flies and moths //Nature. 1985. V. 317. P. p453-6.

146. Mougneau E., von Seggern D., Fowler T., Rosenblatt J., Jongens T., Rogers B, Gietzen D., Beckendorf S.K. A transcriptional switch between the Pig-1 and Sgs-4 genes of Drosophila melanogaster II Mol Cell Biol. 1993. V. 13. P. 184-195.

147. Murre C., Bain G., van D M., Engel I., Furaari B.A., Massari M.E., Matthews J R., Quong M.W., Rivera R.R., Stuiver M.H. Structure and function of helix-loop-helix proteins // Biochim Biophys Acta. 1994. V. 1218. P. pl29-35.

148. Muskavitch M.A., Hogness D.S. Molecular analysis of a gene in a developmentally regulated puff of Drosophila melanogaster II Proc Natl Acad Sci USA. 1980. V. 77. P. 7362-7366.

149. Muskavitch M.A., Hogness D.S. An expandable gene that encodes a Drosophila glue protein is not expressed in variants lacking remote upstream sequences // Cell. 1982. V. 29. P. 1041-1051.

150. Nielsen H, Engelbrecht J., Brunak S., von Heijne G. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites // Protein Eng. 1997. V. 10. P. 1-6.

151. Nielsen H., Krogh A. Prediction of signal peptides and signal anchors by a hidden Markov model//Ismb. 1998. V. 6. P. 122-130.

152. Nony P., Prudhomme J.C., Couble P. Regulation of the P25 gene transcription in the silk gland of Bomhyxll Biol Cell. 1995. V. 84. P. 43-52.

153. Okamoto H, Ishikawa E., Suzuki Y. Structural analysis of sericin genes. Homologies with fibroin gene in the 5' flanking nucleotide sequences // J Biol Chem. 1982. V. 257. P. 15192-15199.

154. Paulsson G, Bernholm K , Wieslander L. Conserved and variable repeat structures in the Balbiani ring gene family in Chironomus tentans // J Mol Evol. 1992a. V. 35. P. 205-216.

155. Paulsson G., Hoog C., Bernholm K., Wieslander L. Balbiani ring 1 gene in Chironomus tentans. Sequence organization and dynamics of a coding minisatellite // J Mol Biol. 1992b. V. 225. P. 349-361.

156. Paulsson G., Lendahl U., Galli J., Ericsson C., Wieslander L. The Balbiani ring 3 gene in Chironomus tentans has a diverged repetitive structure split by many introns // J Mol Biol. 1990. V. 211. P. 331-349.

157. Felling C. Ribonukleinsauresynthese der Riesenchromosomen: autoradiographische Untersuchungen an Chironomus tentans // Chromosoma. 1964. V. 15. P. 71-122.

158. Prudhomme J.C., Couble P., Garel J.P., Daillie J. Silk synthesis // Comp Insect Physiol Biochem Pharmacol. 1985. V. 10. P. 571-594.

159. Pustell J., Kafatos F.C., Wobus U., Baumlein H. Balbiani ring DNA: sequence comparisons and evolutionary history of a family of hierarchically repetitive protein-coding genes // J Mol Evol. 1984. V. 20. P. 281-295.

160. Quandt K., Freeh K, Karas H, Wingender E., Werner T. Matlnd and Matlnspector New fast and versatile tools for detection of consensus matches in nucleotide sequence data // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 4878-4884.

161. Raghavan K.V., Crosby M.A., Mathers PH., Meyerowitz EM. Sequences sufficient for correct regulation of Sgs-3 lie close to or within the gene // EMBO J. 1986. V. 5. P. 33213326.

162. Ramain P., Giangrande A., Richards G., Bellard M. Analysis of DNase I-hypersensitive site in transgenic Drosophila reveals a key regulatory element of Sgs-3 // Proc Natl Acad Sci USA. 1988. V. 85. P. 2718-2722.

163. Rapoport T.A. Transport of proteins across the endoplasmic reticulum membrane // Science. 1992. V. 258. P. 931-936.

164. Ridderford L.M. Hormones and Drosophila development // The Development of Drosophila melanogaster. (eds. Bate, M. and A., M.A.). Cold Spring Harbor, NY. Cold Sprang Harpor Laboratory Press. 1993. V. 2. P. 899-939.

165. Roark M., Raghavan K.V., Todo T., Mayeda C.A., Meyerowitz E.M. Cooperative enhancement at the Drosophila Sgs-3 locus // Dev Biol. 1990. V. 139. P. 121-133.

166. Roth G.E., Wattler S., Bornschein H., Lehmann M., Korge G. Structure and regulation of the salivary gland secretion protein gene Sgs-1 of Drosophila melanogaster II Genetics. 1999. V. 153. P. 753-762.

167. Ruvkin G., Finney M. Regulation of transcriptional and cell identity by POU domain protein // Cell. 1991. V. 64. P. 475-478.

168. Rydlander L., Edstrom J.E. Large sized nascent protein as dominating component during protein synthesis in Chironomus salivary glands // Chromosoma. 1980. V. 81. P. 85-99.

169. Rydlander L. Isolation and characterization of the two giant secretory proteins in salivary gland of Chironomus tentans II Biochem J. 1984. V. 220. P. 423-431.

170. Saiga H., Grond C, Schmidt E.R., Edstrom J.E. Evolutionary conservation of the 3' ends of members af a family of gaint secretory protein genes in Chironomus pallidivittatus II J Mol Evol. 1987. V. 25. P. 20-28.

171. Saitou N, Imanishi M. The neghbour-joning method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. 1987. V. 4. P. 406-425.

172. Sehnal F., Akai H. Insect silk glands: their types, development and function, and effects of environmental factors and morphogenetic hormones on them // Int J Insect Morphol Embryol. 1990. V. 19. P. 79-132.

173. Sehnal F., Michaille J. Control of activity and regression of silk glands in the last-larval instar of Galleria mellonella IIJ Insect Physiol. 1984. V. 30. P. 119-126.

174. Serfling E., Meyer L., Rudolph A., Steiner K. Secretory proteins and balbiani ring gene activities in salivary glands of Chironomus thummi larvae // Chromosoma. 1983. V. 88. P. 16-23.

175. Seydoux G, Fire A. Whole-mount in situ hybridization for the detection of RNA in Caenorhabditis elegans embryos // Methods Cell Biol. 1995. V. 48. P. 323-339.

176. Shermoen A.W., Beckendorf S.K. A complex of interacting DNAse I -hypersensitive sites near the Drosophila glue protein gene Sgs-4 II Cell. 1982. V. 29. P. 461-468.

177. Shore E.M., Guild G.M. Larval salivary gland secretion proteins in Drosophila structural analysis of the Sgs-5 gene // J Mol Biol. 1986. V. 190. P. 149-158.

178. Shore E.M., Guild G.M. Closely linked DNA elements control the expression of the Sgs-5 glue protein gene in Drosophila I I Genes Dev. 1987. V. 1. P. 829-839.

179. Simmons R. Nucleosome positioning: occurence, mechanisms and functional consequences // Prog Nucleic Acids Res Mol Biol. 1991. V. 40. P. 143-184.

180. Sprague K.U. The Bombyx mori silk proteins: characterization of large polypeptides // Biochemistry. 1975. V. 14. P. 925-931.

181. Stanojevic D., Hoey T., Levine M. Sequence-specific DNA-binding activities of the gap proteins encoded by hunchback and Kruppel in Drosophila II Nature. 1989. V. 341. P. 331-335.

182. Sumegi J., Wieslander L., Daneholt B. A hierarchic arrangement of the repetitive sequences in the Balbiani ring 2 gene of Chironomus tentans II Cell. 1982. V. 30. P. 579587.

183. Talbot W.S., Swyryd E.A., Hogness D.S. Drosophila tissues with different metamorphic responses to ecdysone express different ecdysone receptor isoforms // Cell. 1993. V. 73. P. pl323-37.

184. Thisse C, Perrin-Schmitt F., Stoetzel C., Thisse B. Sequence-specific transactivation of thq Drosophila twist gene by the dorsal gene product // Cell. 1991. V. 65. P. 1191-1201.

185. Thompson E.M., Christians E., Stinnakre M.G., Renard J.P. Scaffold attachment regions stimulate HSP70.1 expression in mouse preimplantation embrios but not in differentiated tissues // Mol Cell Biol. 1994. V. 14. P. 4694-4703.

186. Thummel C.S., Burtis K.C., Hogness D.S. Spatial and temporal patterns of E74 transcription during Drosophila development //Cell. 1990. V. 61. P. pl01-ll.

187. Todo T., Roark M., Raghavan K.V., Mayeda C., Meyerowitz E. Fine-structure mutational analysis of a stage- and tissue-specific promoter element of the Drosophila glue gene Sgs-3II Mol Cell Biol. 1990. V. 10. P. 5991-6002.

188. Tokutake S. Isolation of the smallest component of silk protein // Biochem J. 1980. V. 187. P. 413-417.

189. Tripoulas N.A., Samols D. Developmental and hormonal regulation of sericin RNA in the silkworm, Bombyx mori // Dev Biol. 1986. V. 116. P. 328-336.

190. Truman J.W., Talbot W.S., Fahrbach S.E., Hogness D.S. Ecdysone receptor expression in the CNS correlates with stage-specific responses to ecdysteroids during Drosophila and Manduca development//Development. 1994. V. 120. P. p219-34.

191. Tsuda M., Suzuki Y. Faithful transcription initiation of fibroin gene in a homologous cellfree system reveals an enhancing effect of 5' flanking sequence far upstream // Cell. 1981. V. 27. P. 175-182.

192. Tsuda ML, Suzuki Y. Transcription modulation in vitro of the fibroin gene exerted by a 200- base-pair region upstream from the "TATA" box // Proc Natl Acad Sci USA. 1983. V. 80. P. 7442-7446.

193. Turner F.R., Mahowald A.P. Scanning electron microscopy of Drosophila melanogaster embryogenesis. II. Gastrulation and segmentation//Dev Biol. 1977. V. 57. P. p403-16.

194. Velissariou V., Ashburner M. The secretory proteins of the larval salivary gland of Drosophila melanogaster. Cytogenetic correlation of a protein and a puff // Chromosoma. 1980. V. 77. P. 13-27.

195. Wahle E., Kuhn U. The mechanism of 3' cleavage and polyadenylation of eukaryotic pre-mRNA//Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 1997. V. 57. P. 41-71.

196. Walker V.K., Ashburner M. The control of ecdysterone-regulated puffs in Drosophila salivary glands // Cell. 1981. V. 26. P. p269-77.

197. Weber F., Mahr R, Meyer B., Eppenberger H.M., Lezzi M. Cell-free translation of Balbiani ring RNA (75S) of Chironomus tentans salivary glands into high molecular weight products // Wilhel Roux's Arch Dev Biol. 1983. V. 192. 203

198. Weigel D , Jackie H. The fork head domain: a novel DNA binding motif of eukaryotic transcription factors? // Cell. 1990. V. 63. P. p455-6.

199. Weigel D., Jurgens G., Kuttner F., Seifert E., Jackie H. The homeotic gene fork head encodes a nuclear protein and is expressed in the terminal regions of the Drosophila embryo // Cell. 1989. V. 57. P. p645-58.

200. Wellman S.E., Hamodrakas S.J., Kamitsos E.I., Case S.T. Secondary structure of synthetic peptides derived from the repeating unit of a giant secretory protein from Chironomus tentans II Biochim Biophys Acta. 1992. V. 1121. P. 279-285.

201. Wieslander L., Daneholt B. Demonstration of Balbiani ring 75S RNA sequences in polysomes // J Cell Biol. 1977. V. 73. 264

202. Wieslander L., Hoog C., Hoog J.O., Jornvall H., Lendahl U., Daneholt B. Conserved and nonconserved structures in the secretory proteins encoded in the Balbiani ring genes of Chironomus tentans IIJ Mol Evol. 1984. V. 20. P. 304-312.

203. Wieslander L., Lendahl U. The Balbiani ring 2 gene in Chironomus tentans is built from two types of tandemly arranged major repeat units with a common evolutionary origin // EMBOJ. 1983. V. 2. P. 1169-1175.

204. Wieslander L., Paulsson G. Sequence organization of the Balbiani ring 2.1 gene in Chironomus tentans II Proc Natl Acad Sci USA. 1992. V. 89. P. 4578-4582.

205. Wieslander L., Sumegi J., Daneholt B. Evidence for a common ancestor sequence for the Balbiani ring 1 and Balbiani ring 2 gene in Chironomus tentans II Proc Natl Acad Sci U S A. 1982. V. 97. P. 6956-6960.

206. Wieslander L. The Balbiani ring multigene family: coding repetitive sequences and evolution of a tissue-specific cell function // Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 1994. V. 48. P. 275-313.

207. Wimmer E.A., Jackie H., Pfeiffe C., Cohen S. A Drosophila homologue human Spl is a head-specific segmentation gene//Nature. 1993. V. 336. P. 690-691.

208. Xu P.X., Fukuta M., Takiya S., Matsuno K., Xu X., Suzuki Y. Promoter of the POU-Ml/SGF-3 gene involved in the expression of Bombyx silk genes // J Biol Chem. 1994. V. 269. P. 2733-2742.

209. Yamaguchi К., Kikuchi Y., Takagi Т., Kikuchi A., Oyama F., Shimura K., Mizuno S. Primary structure of the silk fibroin light chain determined by cDNA sequencing and peptide analysis // J Mol Biol. 1989. V. 210. P. 127-139.

210. Yang C., Sehnal F. Ribosomal protein L5 of Bombyx mori: cDNA sequence and tissue differences in the L5 mRNA content II Insect Mol Biol. 1998. V. 7. P. 301-306.

211. Yang C., Teng X., Zurovec M., Scheller K., Sehnal F. Characterization of the P25 silk gene and associated insertion elements in Galleria mellonella II Gene. 1998. V. 209. P. 157-165.

212. Zurovec M., Kodrik D., Yang C., Sehnal F., Scheller K. The P25 component of Galleria silk // Mol Gen Genet. 1998a. V. 257. P. 264-270.

213. Zurovec M., Vaskova M., Kodrik D., Sehnal F , Kumaran A.K. Light-chain fibroin of Galleria mellonella L // Mol Gen Genet. 1995. V. 247. P. 1-6.

214. Zurovec M., Yang C., Kodrik D., Sehnal F. Identification of a novel type of silk protein and regulation of its expression // J Biol Chem. 1998b. V. 273. P. 15423-15428.

215. Агапова О.А., Кикнадзе ИИ. Строение слюнной железы хирономид и ее дифференцировка в онтогенезе // Организация и экспрессия тканеспецифической функции у Diptera. Новосибирск. Наука. 1985. С. 96-100.

216. Гундерина Л.И., Богачев С.С., Кикнадзе И.И. Сравнительный анализ белков секрета слюнных желез личинок видов трибы Chironomini (Diptera, Chironomidae) // Зоол. Ж. 1995. Т. 74. С. 53-67.

217. Гундерина Л.И., Шерудило А.И., Митина Р.С. Цикл репродукции ДНК при политенизации хромосом в клетках слюнных желез Chironomus thummi. II // Цитология. 1984. Т. 26. С. 927-935.

218. Истомина А.Г., Кикнадзе И.И., Христолюбова Н.Б. Ультраструктурная организация тканеспецифического кольца Бальбиани 3 (КБа) Chironomus thummi II Цитология. 1983. Т. 25. С. 1037-1042.

219. Кикнадзе И.И., Колесников Н.Н., Лопатин О.Е. Хирономус Chironomus thummi -лабораторная культура// Объекты биологии развития. М. Наука. 1975. С. 95-127.

220. Кикнадзе И.И. Сравнительная характеристика пуффинга в хромосомах слюнных желез Chironomus thummi в личиночном развитии и при метаморфозе. Пуффинг в 4 хромосоме//Цитология. 1976. Т. 18. С. 1322-1329.

221. Кикнадзе И.И., Истомина А.Г., Сиирин М.Т., Себелева Т.Е. Кариотипы и системы колец Бальбиани хирономид Fleuria Lacustris II Цитология. 1990. Т. 32. С. 371-377.

222. Кикнадзе И.И., Зайниев Г. А., Панова Т. М. и др. Идентификация хромомеров КБс, КБв, Кба и молекулярно-цитологическая организация колец Бальбиани у Chironomus thummi II Цитология. 1985. Т. 27. С. 376-385.

223. Левитский В.Г., Катохин A.B. Характерная модульная структура промоторов и ее применение для разработки программ распознавания // Вычислит Технол. 2000. В печати.

224. Макаревич И.Ф., Березиков Е.В., Гурьев В.П., Блинов А.Г. Молекулярная филогения рода Chironomus, основанная на анализе нуклеотидных последовательностей двух ядерных генов, ssplóO и глобина 2Ь // Молекуляр Биол. 2000. Т. 34. № 4.

225. Себелева Т.Е., Кикнадзе И.И. Цитохимический анализ мукополисахаридного состава секрета в слюнных железах личинок Chironomus thummi II Цитология. 1977. Т. 19. С. 147-153.

226. Себелева Т.Е., Колесников H.H., Кикнадзе И.И. Сравнительный анализ белков секрета клеток слюнной железы личинок Chironomus thummi, различающихся количеством колец Бальбиани//Докл. АН СССР. 1981. Т. 256. С. 975-978.

227. Шобанов H.A., Шилова А.И., Белянина С И. Объем и структура рода Chironomus Meigen (Díptera, Chironomidae): обзор мировой фауны // Экология, эволюция и систематика хирономид. ИБВВ иИЭВБ РАН. Тольятти, Борок. 1996. 178 с.

228. Шобанов H.A., Шилова А.И., Белянина С.И. Объем и структура рода Chironomus Meigen (Diptera, Chironomidae): обзор мировой фауны // Экология, эволюция и систематика хирономид. ИБВВ и ИЭВБ РАН. Тольятти, Борок. 1996. 178 с.

Информация о работе

Березиков, Евгений Викторович
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2000
ВАК 03.00.25

Диссертация

Структурная организация, экспрессия и эволюция гена, кодирующего секреторный белок ssp160 у видов рода Chironomus - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы