Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование структурно-функциональной организации тканеспецифического пуфа-кольца бальбиани BRa CHIRONOMUS TMUMMI

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование структурно-функциональной организации тканеспецифического пуфа-кольца бальбиани BRa CHIRONOMUS TMUMMI"

РГБ ОД

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК -5 СЕН 19РЛ СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

УДК 577.21:576.316.352:575.1

ЩЕРБИК Светлана Владимировна

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО - ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО ПУФА - КОЛЬЦА БАЛЬБИАНИ ВЯа

сшюыомиз тнимш

Генетика - 03.00.15

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1994

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СЮ РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, А.Г. Блинов

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Е.И.Каракин

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук, Н.П. Мертвецов

Институт биоорганической химии СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение:

Институт биологии развития РАН

ут Ix*«

;ите диссертг

■■ 6 "

Защита диссертации состоится " ^ " у*-" ¿-у- ^дд4 ГОда на заседании специализированного совета по

защите диссертации на соискание ученой степени доктора наук Л - 002.11.01 при Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

1994 года

А.Д.Груздев

Актуальность проблемы. Слюнные желевы хирономид являются одной И8 удобных моделей для исследования тканеспецифической экспрессии генов- у эукариот. В клетках слюнных желез интенсивно нарабатывается тканеспецифический продукт - секрет, образованный семейством родственных белков (Pustel1 et. al., 1984; Hoog et. al., 1988). Гены, кодирующие секреторные белки, расположены в кольцах Вальбиани - гигантских пуфах в политенных хромосомах слюнных желез хирономид и объединены в мультигенное семейство. Молекулярная структура колец Вальбиани, постоянно присутствующих в кариотипе, изучена достаточно хорошо, однако у ряда видов хирономид в нескольких клетках слюнных желез появляется дополнительное кольцо Вальбиани, продуцирующее специфический для этих клеток белок.

Так, особый интерес представляет изучение генов кольца Вальбиани BRa Chironomus thuimti. BRa представляет собой пуф, расположенный в районе A2b хромосомы IV C.thurrmi, который активно функционирует только в 4-х клетках специальной доли слюнной железы (Себелева, Кикнадзе, 1972). Эту активность связывают с появлением в спектре секрета слюнной желевы дополнительной фракции - белка с массой 160 кДа (Себелева и др., 1981). Для BRa описаны 2 гена - F6.2 и С1.2, обладающие на уровне структурной организации гомологией с генами других КБ - они содержит в своем составе константные и повторяющиеся единицы (Богачев и др., 1986, 1987). Было показано также, что ген F6.2 кодирует минорный полипептид размером 67 КДа , не обладающий тканевой специфичностью (Bogachev et. al, 1990). Таким образом, BRa представляет собой, по-видимому, сложную структуру, изучение которой как модели тканеспецифичесной . активности генов остается актуальным. Очевидно, только полная картина молекулярно - цитологической организации кольца Вальбиани BRa C.thurani даст возможность строить аргументированные гипотезы о тканеспецифической экспрессии BRa в 4 клетках специальной доли слюнной желеаы.

Цель и вадачи исследования. Цель настоящей работы -молекулярно-цитологическое изучение BRa Chironomus thurrmi, выявление кодирующих последовательностей, расположенных в BRa, установление полной структуры исследованного ранее гена F6.2 и первичной структуры других обнаруженных кодирующих

[

последовательностей, а также построение общей схемы организации ВЯа. В конкретные задачи работы входило :

1. Скрининг геномной библиотеки СЛЬшгп! с использованием в качестве вондов описанные ранее клоны ге.2 и С1.2, содержащих в своем составе последовательности ДНК из района В1?а. Для расширения исследуемой области провести второй этап скрининга, используя в качестве гондов краевые фрагменты отобранных гибридных фагов.-

2. Поиск в отобранных клонах кодирующих последовательностей ДНК и установление их отношений с Г6.2 и С1.2.

3. Установление полной нуклеотидной последовательности гена Гб.2, нуклеотидных последовательностей ДНК, входящих в состав других кодирующих районов В1?а.

4. Анализ и сравнение выведенных аминокислотных последовательностей.

5. Геномный блот - анализ кодирующих фрагментов ДНК и построение общей схемы организации групп геномных клонов из района Кольца Бальбиани а СЛЬитш1.

Научная новизна работы. В процессе проведенного исследования была установлена полная последовательность гена ге.2 из района В1?а, кодирующего неткакеспецифический белок р67. Установлена структурная организация других кодирующих последовательностей из района ВГ?а и показано. что они представляют собой ген С1.2, состоящий из четырех зкзонов, разделенных тандемными повторами - интронами. Показана высокая гомология выведенных аминокислотных последовательностей экзонов генов Г6.2 и С1.2.

Научно - практическое значение. Полученные в работе результаты дополняют и расширяют существующую информацию о структурной организации тканеспецифических локусов геномов хирономид - кольцах Бальбиани. ' Обнаружение кодирующих последовательностей в В{?а С. ЬИшии, принадлежащих двум гомологичным генам, подтверждает сложившееся представление о кольцах Бальбиани, как о сложных структурных локусах, где наряду с генами гигантских секреторных белков могут присутствовать гены других белков.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались, на

I

о

8 двустороннем симпозиуме СССР - ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов" (Иркутск, 1989), 11 международном совещании по клеточному ядру (Суэдаль, 1989), 6 международном совещании по структуре и функции Колец Бальбиани (Джексон, США, 1993).

Публикации. Основные результаты работы изложены в шести научных публикациях.

Структура и объем работы. Работа изложена на 102 страницах машинописного текста, включающих 15 рисунков и одну таблицу. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка цитируемой литературы.

Первая глава представляет обзор литературных данных по молекулярно - биологической организации секреторных белков слюнных желез хирономид, общего описания системы колец Бальбиани у хирономид и молекулярной организации генов колец Бальбиани, кодирующих секреторные белки. Вторая глава -описание молекулярно - биологических методов, испольэуемых в данной работе. В третьей главе приведены результаты экспериментального исследования и в четвертой - обсуждение полученных результатов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Для наработки гибридных фагов использовали штамм E.coli К-802. Для трансформации плавмид применяли компетеннтные клеточные культуры E.coli JM103 и М15, приготовленные по методу Чанга, Миллера (Chung, Miller, 1988). Субклонирование исследуемых фрагментов ДНК проводили с использованием плазмид pUC19, pUC128. In situ гибридизацию проводили по методу Гелл и Пардью (Gall, Par-due, 1971). Выделение суммарной РНК ив слюнных желеэ личинок C.thurrmi проводили методом кислого феноления клеточного лизата с последующим высажденйем РНК 0,1 объема IM NaCl и 2,5 объема 9'6% этанола. Остальные методики, использованные в данной работе, проводили, как описано в руководствах по молекулярному клонированию в книгах Маниатиса (Маниатис и др.,1984) и Мазина (Мазин и др., 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУВДЕНИЕ.

Изучение структурно - функциональной организации тканеспецифического пуфа BRa C.thuimi было начато с расширения изучаемой области: используя в качестве зондов описанные ранее клоны из района BRa- F6.2 и С1.2 (Богачев и др., 1986; Богачев и др., 1987) был проведен скрининг геномной библиотеки С.thurrani и отобрано 11 фаговых клонов. Далее после того, как были определены краевые фрагменты в фагах, был проведен второй этап скрининга геномной библиотеки, используя в качестве зондов краевые фрагменты 23D и 24А1 фагов А23 и Х24. В результате было отобрано еще 11 фаговых клонов. ДНК всех 22 клонов метили 3Н - дНТФ с помощью ник-трансляции и гибридивовали с препаратами политенных хромосом из клеток слюнных иелез C.thunmi. Все исследованные клоны гибридизовались на хромосоме IV в районе Д2Ь ив которого развивается тканеспецифический пуф BRa. В таблице 1 приведены результаты гибридизации in situ ДНК всех исследованных клонов.

Таблица I. Локализация X клонов ДНК из района.А2Ь хромосомы

IV на политенных хромосомах Chironomus thummi

N Обозначение клона

Основное место

гибридизации

Дополнительные места

гибридизации

1. XI.1

2. XI.2

3. Х6.1

4. XI2

5. Х18

6. Х20

7. Х21

8. Х23

9. Х24

10. Х36

11. Х38.2

12. Х40

13. Х41

14. X41N

15. Х43

16. Х44

17. Х45

18. Х51

19. X51N

20. Х52

21. Х57

22. Х60

А2Ь А2Ь А2Ь

Alb, Alc-d, Bb Alb, Alc-d, Bb Alb, Alc-d, Bb

Alb:

A2a-b A2b

>100 мест

A2b A2b A2b A2b A2b A2b A2b

>100 мест

>100 мест

A2b A2b A2b

>100 мест

A2b A2b A2b

Southern - гибридизация разделенных электрофорезом EcoRl гидролизатов ДНК фаговых клонов с 32Р - меченными фрагментами F6.2 и С1.2 показала, что (1) EcoRl фрагменты ДНК гибридных фагов, гомологичные F6.2 фрагменту, 35С, 440, 200, кмеят одинаковый размер. (2) Фрагменты, гомологичные С1.2 иогхо разделить на две группы по их размерам: 20D, 21D, 43D имезт размер около 1,6 т.п.н., т.е. близкий к размеру сашго фрагмента С1.2; 24А, 233, 44В, 41А фрагменты имеют большой размер - около 3,4 т.п.н.

Для выяснения того, какие из исследованных клокоз содержат в своем составе код}фующие последовательности, EcoRl гидролизаты гибридных фагов гибрндизовали с 32Р -меченной кДНК, синтезированной на матрице поли(А)+мРНК с поко^ьп обратной траис-фиптазы. В реакции использовали суммарную РНК, выделенную из слюнных г.олез C.thurrmi. При мечении с использованием ревертазы включение 32Р происходит преимущественно в з'-концевой области гена, так как затраЕком для синтеза кДНК служат олиго(<1Т) нуклеотиды, н, следовательно, синтез начинается с поли(А) тракта. Таким образом, гибридизация с меченной кДНК позволила выявите фрагменты, расположенные в з'-концевой- области генов. Ранее было показано, что клоны pF6.2 и рС1.2 несут в своем составе открытые рамки считывания, которые могут быть фрагмеитагги генов. Для клона pF6.2 было показано существование белкового продукта - нетканеспецифического белка рб7, что подтвердило реальность существования гена F6.2 (Bogachev et. al., 1990). Результаты гибридизации с меченной поли(А)+мРНК представлены на рис.1. Видно, что фрагмент фага АЗб - 36С, гомологичный F6.2, является действительно кодирующим, и клон Х36 может содержать полную копию гена F6.2. Белковый продукт гена рС1.2 не был изучен, однако гибридизация с меченой поли(А)+мРНК подтвердила, что фрагменты, гомологичные 01.2 - 43D и 20D -являются кодирующими. Причем, в клоне А43 кроме 43D фрагмента с кДНК гибридизуется и 43А фрагмент. Это позволило предположить, что в этом фаге в 43А фрагменте может находится продолжение гена рС1.2 - его з'-концевая часть. Кроме Х43 такая же ситуация имеет место и в случае клонов Х20 и А21, в которых ген, по - видимому, продолжается соответственно в 20В

и 21С фрагментах ДНК. Таким образом были выявлены EcoRI фрагменты ДНК в гибридных фагах, в которых предположительно расположены 3'-концевые части генов F6.2 и С1.2. Кодирующие последовательности несли в своем составе Karate клоны А23 и X24, а именно фрагменты 23В, 24А (или 24А1) и 24D, причем

Рис.1. Электрофорез в 1% агарозном геле ЕсоШ гидролизатов рекомбинантных фагов из района ЕНа С.Шши (А) и гибридизация с 32Р-меченной поли(А)+мРНК из клеток слюнных желез(В).

фрагмент 23В, как упоминалось, гомологиченен рС1.2, но имеет гораздо больший размер - около 3,4 т.п.и. Результаты рестрикции по Н1пП субклонированных фрагментов 36С и 44С показали, что эти фрагменты идентичны. Клон А44 также мог содержать полную копи» гена Г6.2. Дальнейшим рестрикционным картированием и анализом нуклеотидных последовательностей было подтверждено, что продолжение изученных ранее б'- областей генов ге.2 и С1.2 находится в клонах А44 и Х43 соответственно.

Для установления последовательности 3'-концевой части гена, кодирующего белок 67 кД была построена рестрикционная карта клона А44, из которой следовало, что продолжение гена находится в фрагменте 44А, для прочтения нуклеотидной последовательности вблизи ЕсоИ сайта между 44А и 44С, бьш

вырезан SalGl-SalGl фрагмент ДНК размером 2,3 т.п.н. и субклонирован в векторе pUC19. Он был обозначен как p44SS. Из рестрикционной карты фрагмента 44SS была выбрана стратегия секвенирования. Следует отметить, что 5'-концевая часть p44SS фрагмента полностью гомологична последовательности в F6.2 фрагменте ДНК, кодирующего белок 67 кД. Анализ нуклеотидной последовательности з'-концевой части 44SS фрагмента показал наличие в ее составе ОРС размером 732 п.н.. После терминирующего кодона TGA, который завершает обнаруженную открытую рамку считывания, не было обнаружено тандемиих повторов, которые могли бы быть интроном, и отсутствует отбытая ра»лса считывания. 1!а расстоянии 70 п.н. от терминирующего кодона расположен • вероятный сигнал полиаденилированкя - AATAAG. На основании полученных результатов можно сделать вывод, что ген, кодирующий белок 67 кД содержит два экзона « и в, размерами 723 и 732 п.н., что находится в соответствии с ранее полученными данными о размере белка, кодируемого этим геном (Bogachev , et. al.,1990). Из выведенной аминокислотной последовательности следует, что « и В экзоны кодируют полипептид размером 485 амино^шслотных остатков: 241 - « экзон и 244 - В экзон, что соответствует в суше 54 кД. По всей видимости, разница в молекулярных массах нативного белка (67 кД) и подсчитанного на основании нуклеотидной последовательности (54 КД) может быть обьяснена наличием полисахаридов в составе нативного белка, поскольку в составе обоих экзонав обнаружены два предополагаешх сайта гликозилирования: NES - в а экзоне и NDT - в В экзоне.

Для выяснения относительного расположения фрагментов в гибридном фаге А43 и окончательного установления ориентации исследуемого гена Cl.2, был произведен их рестрикционный анализ имеющимися в наличии рестриктазами. Было установлено, что продолжение гена расположено в фрагменте 43А. Размер фрагмента 43D меньше чем рС1.2 с которым он гибридизуется. Это связано с тем, что в рС1.2 расположен мобильный элемент размером 600 п.н. и при гибридизации in situ с хромосомами C.thunrii он дает более 90 мест локализации в равных хромосомах, в том числе и в BRa хромосомы IV (Богачев и др., 1986). Фрагмент 43D in situ давал гибридизацию только с

кольцом Бальбиани BRa, то есть не содержал «обильного элемента. Ранее было также показано, что 20D EcoRI фрагмент соответствует С1.2 фрагменту, но не содержит инсерции мобильного элемента ШЗ (Blinov et. al., 1S91). По результатам ргстрикционного картирования и гибридивации было показано, что гибридные фаги Х20 и Х43 имеют большую область перекрывания, а фрагменты 20D и 43D - полностью гомологичны. Результаты гибридивации с поли-А+мРНК подтвердилили, что продолжение гена С1.2 должно быть расположено в 43А фрагменте ДНК. Для определения нуклеотвдной последовательности вблизи сайта для эвдонуклеазы EcoRI между 43А и 43D субфрагментами из А43 был вырезан BamHl-BamHl фрагмент ДНК размером 1,4 т.п.н. и встроен в вектор pUC128. Он был обозначен как р4388. Для установления нуклеотвдной последовательности продолжения гена С1.2 были секвенированы фрагменты ДНК, содержащиеся в клонах р43В8 и р43А. В составе 43ВВ фрагмента был обнаружен кластер тандемных 'Повторов (21 п.н. повторены 24 раз) и открытая рамка считывания (ОРС), гомологичные таким ке последовательностям в С1.2 фрагменте ДНК , где эти повторы представляют собой интрон мезду а и В экзонами, а ОРС соответствует началу 8 экзона. Такие яе тандемные прямые несовершенные повторы, что содержатся в изученных ранее фрагментах С1.2 и 20D (Blinov et. al., 1991) и 43ВВ, были обнаружены также и в 43А фрагменте, где они разделяют три открытые рамки считывания. Хотя число этих повторов варьирует, и каждый такой повтор содержит канонический сигнал сплайсинга АфБТ, детальный анализ всех вариантов сплайсинга показал, что реальным может быть только один вариант, - сплайсинг может происходить■только в первой и последней единицах повторов, так как в остальных случаях не сохраняется открытая рамка считывания. Три открытые рамки считывания (В экзон, г зкзон и начало 6 экзона) из фрагмента 43А имеют гомологию между собой и с ct единицей, расположенной в 43D фрагменте.

Последовательность гена в клоне Х43 прерывается внедрением мобильного элемента NLRCTthl, который занимает часть 43А фрагмента, 43Е фрагмент и часть 43С (Blinov et. al.,. 1993). з'- концевая часть гена 01.2 расположена во фрагменте 43С, фланкируя мобильный элемент. Показано, что гибирвдный фаг

А24, а именно его фрагмент р24Л1, имеет гомологию с фрагмента?.«! р43А и р43С . Он не проявляет при этом полилокалыюсти ' при гибридизации in situ (как в случае А43), 1 гибридизуясь исключительно на хрсмосоме IV в paíon А2Ь, из которого развивается тиннеспецкфическшт пуф BRa. Ранее был проведен частичный анализ нук-леотидкой последовательности фрагмента 2-1А1 и показана полная гомология части его последовательности районам, фланкврущий мобильный элемент NLRCthl в 43А н 43С фрагментах (Blinov et.al., 1993). Дальнейший сикзенс-анализ 5'-области фрагмента р24А1 показал, что сна содержит последовательность, полностью гомологичную концу г экзона клока р43Л, тандемные повторы размером 21 п.н. в количестве 24, язлггсг,иеся по аналогии с таковыми из клона р43А нитроном, и полнул последовательность 3 эквска, где открытая рамка считывания завершается стоп-кодовом TSA. На расстоянии 64 п.н. от стоп-код сна расположен сигнал полиаденилирования для РНК-полимеразы II - ААТААА. Из нуклеотидной последовательности открытых- рамок считывания клонов p43D, р43А, р43ВВ, р43С к р24А1, соответствую®« эквонач «, а, т и 5, была выведена аминокислотная последовательность белка, представленная на рис. 2. а эквон содержит 245 аминокислотных остатков,. В - 225, 5 - 231. К сожалению последовательность кодирующая т гкзон установлена не полностью, и мы не можем определить точный размер этого экзона. Исходя из сравнения экзонов между собой и выравнивания их по консервативным цистеиновым аминокислотным остатка-! (об этом подробнее будет сказано ниже), ш оценили размер г этаона, как 200-250 аминокислотных остатков. Таким образом, суь«марный размер полипептида кодируемого геном 01.2 составляет около 100 кД. В составе аминокислотной последовательности было показано наличие потенциальных сайтов,глигеозилирования - НОТ, которые расположены в каждом из экзонов, причем в одном и тем же положении.

На рис. 2 приведено сравнение аминокислотных последовательностей кодируемых «ив экзонами гена рб7 и л, 3, г и 5 экзонами гена 01.2. Как видно из этого сравнения, все пять последовательностей имеют между собой гомологию от 20 до 40% . Максимальная гомология установлена для а экзонов обоих

<1 акэои R £ акзон

-....-.... гек FB.2 (рВ7)

акэов R . s> вкзоя R у- акзон R 8 акзон ------....______ предполагаемый ген С1.2 (oepieo)

направление транскрипции

«.F6.2 HKFI1RTILIA

Ы.С1.2 MKSI1KHILFV'

j>F0.2 GYVYYI fCl.Z

8 CI.2 VHAYPLSt

If L1A1INESRRDPRKFRLSRV-.LI SIIHDS9CRNFILKNRLE-'SSTAYQVNDTLNYYYKKDLVp rSSSAFL IKDTLNSYFMRFTI VSSSAHQRHPTLIFYLTQPlSft

-----FEKLI EKNSRHHENEREteUGKAFDMDCVKNFFKLPQMl;«

IF.....INRISELKEBDS-REAKLYKSFDI DCGKNFLKVQQNSCHl

T......DPDflEDPNGYYeRLtkvEEAIDKDCVKQKLNLPEH®K;

'A-----EFKDDPELHTSNEVIEXVINSIDLNCIKQQLKIPKNCBL

IPNLPSSLYDEEYI KEYIEHGI&VEEAIPFDCVNOXLNILKKGpA

ILKETE-EMVFMVASGKKCS IWEEE-ELVFKVASSLKCS VEPEATILIASAKS-KCI LEVEVRILLGSAIS-ECI 'LEVEARI LI ASAKL- RCL

<tF6. 2 TETK-IFGAMFpDFV---NEGLKEHIflCLKHQLKQYEPASKLIEf^EITEAELKV-CQEKFPl-YNEI&GFQKDLEDLLGPLNTYTCGAVSEDGAKDFLIF

«.CI. 2 J FB.2 JC1.2 8C1.2 yC1.2

AFB.2 dCl.2 £FB. 2 $C1.2 tfC1.2 8 C1.2

Рис.2,

SEDA-AFKFYE DEI I---RPKLCXGL

KIDQLEFSNLF KTSBYDFANLl

IEFALEEG8RHCRY5 LDYGFDEDAESCENV

KIPLIHFSKLFLNFAVLKR...СЕТИ

¡CFELHLB8BEPDSKLI K№11IKAEVEK- CKKSSPI — DDL iCARYKLHQLDPKSOUVIffSSDKSHSKB-CRHIE-IRLKPF 'CAEFHLBKLVSGSKIAKIBVIKPEIENS-CEYSS11SVYPF ¡CARYKLKQVEPTSKLLISgHHVHNDDMSSCF----ITFKLY

fENGLEDVIGPLDVFSCGAVT—SVDDYVLF UPINGYAESVGKLfcTAICGVLTDDFVNVVSLK °STIQXYQVLVGESQDTTCGSISQQFKMILAY-'DLAKDFKNYVGDLKQSSCGAIIDEFVKILTLK _VVFSCG- - TVSGSNDFHRF

FENEP6GXC

FEIDPKGTKFIFVGYVARF

bQRFVNIPVLDLVRRSL

VKLNII

fRSDPEGRFILLDGICDKKKLV

VSKGAIVEYC Э15EELKKTEKEKLKDYFKDISIKTAECH1KR VIKSVLIKFC ESSEAVKKVEMEKLKEYLKDIAFTTAECIPKR TMLPYDVKDK EPKINGTKEPFGPVT NLLSEVCSRVR —KS-LLIAVSKDEELKKIEIQFLYANVEEKLSBFADCVLBR ALKLVLAKYG JFDNEVKEAEMKKLKEYFKDITLKTCYCIICR ---TLLLIA-bKDEEVKKlEAKELFTVASDKLHKLAOCVFOS

Схемы строения генов F6.2 (pS7) и CI.2 (sspl60) (A); этих генов (В). P - область промотора; R - тандемные ______,

обозначены наиболее консервативные участки последовательности. Жирных«'шрифтом выделены консервативные цистеинн (С) и предполагаемые сайты глккозилировашта.

и элаймэнт шести ORFs (экзонов) повторы (интроны). В рамках

генов - 40%. Вне всякого сомнения, что все эти последовательности имеют общее . происхождение. Детальный ^сравнительный анализ показывает, что внутри этих последовательностей существуют консервативные участки, в которых гомология достигает 60% и более. Таких, участков выделено шесть, причем каждый из этих участков содержит цистеин в одном и том же месте у всех последовательностей.

Ранее было показано, что антитела, получение против белка р67, слабо реагируют и с тканеспецифическим белком sspl60, обнаруженным в [слетках спецдоли слюнной железы С. thirami (Bogachev et.al., 1990). Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей кодируемых генами р67 и С1.2 показывает их очень большую степень гомологии. Основываясь на результатах сравнительного анализа и иимунохиыическнх результатах, полученных ранее, мы сделали предположение, что ген 01.2 »тает ' кодировать тканеспецифический белок sspl60, тем более, что существует еще несколько косвенных данных подтверждающих это.

(1)Белок, кодируемый геном С1.2 имеет несколько особенностей, характерных для секреторных белков хирснсмид. К ним относятся наличие лидерного пептида на М-конце предполагаемого белка, ряда потенциальных сайтов фосфорияирсвания и гликозилирования. В-белке, кодируемом геном С1.2, обнаружено три потенциальных сайта гликозилирования. Показано ранее, что все три специфичных для специальной доли слюнных желез белка - ssp97, sspl60 и ssp500 - являются высоко гликозилированными белками (Chaudhuri, Case, 1993). Размер предполагаемого белка, кодируемого геном С1.2, примерно совпадает с размером белка sspl60 (с учетом полисахаридов).

(2) Существует предположение, что белок sspl60, образующийся, в клетках'специальной доли, после выведения в секреторный резервуар железы каким-то особым образом осуществляет сшивку нитей основных белков секрета между собой, что ведет к образованию крупных секреторных гранул. Наиболее вероятно, что такая сшивка происходит за счет дисульфидных связей между остатками цистеинов. Как показал аминокислотный анализ последовательности гена С1.2 - каждый из четырех экзонов содержит консервативные остатки цистеина: периодически совпадающие в аминокислотной последовательности и

расположенные, в одних и тех же местах во всех шести зкзонах.

Ив результатов гибридизации с меченной поли(А)+мРНК следует что, кроме исследованных нами фаговых .клонов А 38, 144, Х43 и Х24, клоны Х21 и Х23 также несут в своем составе кодируйте последовательности, расположенные во фрагментах 21С, 21D и 23В соответственно., Фрагменты 21D и 233 выявлялись таетэ при гибридизации с описанным ранее клоноы рС1.2. Рестрикцконный анализ , и частичный сиквекс-анализ фрагмента 21С показал, что его 5'-концевая область гомологична таковой во фрагменте 43А (до места внедрения мобильного элемента) и, соответственно этому же району во фрагменте 24А1, но содержит единичные нуклеотидные вамены. Поскольку также гомологичны фрагменты 21D и 43D (но по мелкощепящей рестрикции Hinfl ростриктавой не совпадает), мы предположили, что клон Х21 содержит другой вариант гена, гомологичного С1.2. Это было подтверждено татае тем, что по рестрикционному анализу и частичному сиквенс-аналиву последовательность, фланкируюидя з'-концевую область гена во фрагменте 21С, отличается от таковой во фрагментах 43С и 24А1 отсутствием блока повторов общей величиной около 700 п.н.

Что касается клона Х23, то его рестрикционное картирование н частичный сиквенс-анализ фрагмента 238 показали, что этот клон также содержит последовательность, гомологичную гену С1.2. Причем, последовательность, соответствующая началу гена (« экзон, повторы и начало ß экзона), расположена во фрагменте 23В, который гораздо больше по размеру фрагментов 20D, 43D и 21D, содержащих аналогичный' район.

Таким образом, исходя из данных гибридизации с меченной поли(А)+мРНК, рестрикционного анализа и анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов 43D, 43А, 43ВВ, 43С, 24А1, 21С и 23В мы предположили, что в районе Кольца Бальбиани а С. thimmi может быть расположено три различных копии гена, обозначенного ранее, как С1.2.

Для проверки этой гипотезы, (а также перекрытия исследуемого района - Кольца Бальбиани a C.thummi - и установления его общей структурной ооганизации была предпринята попытка. расположить ' друг относительно друга все

исследуемые фаги из района BRa. Сделать это только на основании перекрестных гибридизаций оказалось Довольно сложно, поскольку практически все фаги имели гомологичные друг другу фрагмента, не совпадающие по размеру. Поскольку мы показали, что кодирующие последовательности в районе BRa разделены тандемныыи повторами, являющимися нитронами, и количество этих повторов различается в пределах одного гена и между генами, то различную длину гомологичных фрагментов можно объяснить (1) различным числом повторов внутри фрагментов; (2) один из фрагментов может быть краевым^, фрагментом в рекомбинантном "фаге; (3) таких фрагментов в геноме присутствует несколько. Для проверки этих предположений гомологичные субклонированные фрагменты мы обрабатывали рестриктазой Hinfl и, далее,провели сравнительный рестрикционный анализ исследуемых клоноз. В результате мы убедились, что часть фрагментов действительно идентичны друг другу. Что касается других фрагментов, значительно различающихся в длине, но гомологичных друг другу

- мы попытались выяснить их количество с помощью Southern -блот гибридизации фрагментов с геномной ДНК C.thummi, обработанной EcoRI рестриктазой. Гибридизация с различными фрагментами гена С1.2, приведенная на рис.3, выявило разное количество геномных фрагментов. Гибридизация геномной ДНК с фрагментами 24А1 и 21 С, содержащих 3 - концевую область гена С1.2 подтвердила, что в геноме присутствует три варианта исследуемого гена. Причем гибридизацию с фрагментом 21С мы проводили на геномную ДНК, выделенную из личинок 4го возраста

- потомства 6 индивидуальных яйцекладок C.thuimii.

Результаты ее, приведенные на рис. 3,демонстрируют наличие полиморфизма по количеству гибридизующихся фрагментов - в двух кладках показано присутствие дополнительного фрагмента гибридизации. Поскольку отличие его по величине от основного не превышает 100 - 200 нуклеотидов, скорее всего, это различие обусловлено вариабельностью в количестве тандемных повторов, описанными нами между кодирующими областями.

На основанга перекрестных гибридизаций, гибридизаций субклонированных фрагментов с геномной ДНК и рестрикции субклонированных фрагментов по Hinfl, мы предложили схему организации групп геномных клонов в районе BRa С. thurmi

-110

- во

- во

- ?Л

-1Т

■ »7

- 1.7

5.6--А& 7А-36- » -16 5.8- -2 ^

- I 7

Д.

Рис.3. БоиШегп-блот гибридизация ЕооЫ (1) и Рв« (2) гидро-лизованной геномной ДНК С.Шляп! о 3£р-мечениыми фрагментами 230 (А), 43В (Б), 23В (В), 24А1 (Г), 21С (Д) из района ВИа.

I 1

1 7

I г

11.0

Х23

УМ. \36 А24

А20 Ш Х21

О С

|_ ц ц ц || | ^

С Е

II

Е

6

О

I_I.

С О

с

в

А

Р й

Р А

В Е А С

—411

с в

В1

А1

о

В В ?. А С С А О Р • В

ЧН^П-ЧНт-ШШН

РАЕ

Рис.4, Схема организации груш геномных клонов из района ВЕа С.Шлпт!.. Оданаковой штриховкой обозначены гомологичные фрагменты. ЩЩ -фрагменты, гомологичные С1.2; ^^^ -фрагменты, гомологичные Р6.2. * - мобильный .елемент.

В

В

(рис.4).Клоны Х20, А43 и Х24 образуют одну такую группу, клоны А23, Ж), А44 и А36 вторую группу, последовательность клона А21 располагается, по-видимому, отдельно от этих групп. Таким образом, в районе BRa C.thuroii расположено, как минимум три разные копии гена С1.2 и ген F6.2, кодирующий белок р67.

ВЫВОДЫ.

1. Исследована структурно - функциональная организация протяженного фрагмента ДНК из района кольца Бальбиани BRa C.thummi, с помощью in situ гибридизации, рестрикционного-анализа и Саузернблот гибридизации охарактеризовано 18 геномных клонов, содержащих фрагменты ДНК из этого района.

2. С помощью гибридизащт с меченной поли(А)+мРНК из слюнных желез С. thuirmi в составе этих геномных клонов выявлено несколько кодируют® последовательностей. Показано, что все кодирующие последовательности гомологичны двум генам - F6.2 и С1.2.

3. Установлена полная ¡г/клеотидная последовательность выявленного ранее^ гена F6.2, расположенного в BRa и кодирующего летканеспецифический белок р67. Установлена больпая часть нуклеотидной последовательности гена С1.2, расположенного в BRa. Показано, что этот ген состоит из четырех экзонов, размером около 700 п.н., разделенных прямыми несовершенными тандемными повторами, представляющими собой интроны. Сделано предположение о том, что ген С1.2 кодирует тканеспецифический белок sspl60.

4. Проведено сравнение выведенных аминокислотных последовательностей а, о экзонов гена F6.2 и а, 0, т, 5 экзонов гена С1.2. На основании высокой степени гомологии показано,чтЬ гены F6.2 и С1.2 могут иметь общее происхождение.

5. С помощью гибридизаций фрагментов гена 01.2 с геномной ДНК, выделенной из личинок C.thummi, показано, что в геноме присутствует три ьарианта исследованного гена 01.2. Предложенная схема организации трех групп геномных клонсв из района BRa, куда входят три варианта гена С1.2 и последовательность гена F6.2 перекрывает около 50 т.п.н. района BRa.

СЛИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Колесников H.H., Кикнадзе И.И., Блинов А.Г., Богачев С.С.,Щербик С.В., Гайдамакова Е.К., Собанов Ю.В. Семейство родственных генов и мобильный элемент кольца Бальбиани Chironomus thuimii // Tee. 8 двустороннего симп. СССР-ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов".- Иркутск, 1989. - С.72-73.

2. Богачев С.С., Щербик С.В., Таранин A.B., Себелева Т.Е. Анализ экспрессии гена из тканеспецифического пуфа КЕа Chironomus thuirmi, кодирующего низкомолекулярный секреторный . полипептид // Генетика. 1989. - Т. 25. - N 9. - С. 1541-1550.

3. Blinov A.G., Bogachev S.S., Scherbik S.V., Kolesnikov N.N., Kiknadze I.I. Structural elements of the tissue-spesific puff BRa of Chironomus thuirmi and their functional sinificance // Abst. 11 Nucl. workshop. - Suzdal. 1989. P.69.

4. Bogachev S.S., Blinov A.G., Kolesnikov N.N., Scherbik S.V., Taranin A.V., Sebeleva Т.Е., Baiborodin S.I. and Kiknadze I.I. A tissue-specific puff (Balbiani ring a) may contain a gene encoding a 67kD protein which exhibit non-tissue specific expression // Gene. 1989. -» V.96. -P.241-247.

5. Kolesnikov N.N., Bogachev S.S., Blinov A.G., Scherbik S.V., Taranin A.V., Baiborodin S.I., Donchenko A.P..Sebeleva Т.Е., - Kiknadze I.I. Structural elements of Balbiani Ring a of Chironomus thummi // Nuclear Structural and Function.1990. Ed. by R.Harris and J.B. Zbarski. Plenum Press. - N 4.- P. 53-57.

6. Scherbik S., Blinov A., Sobanov Yu. Analysis of molecular organiztion of the BRa in Chironomus thummi // Abst. of the 6th intern. Balbiani Ring workshop. Jackson. 1993.

Tfi