Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Организация и экспрессия генов тканеспецифической функции слюнных желез у двукрылых (Drosophila, Chironomus)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Организация и экспрессия генов тканеспецифической функции слюнных желез у двукрылых (Drosophila, Chironomus)"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ТКАНЕСПЕЦИфИЧЕСКОИ ФУНКЦИИ СЛЮННЫХ ЗЕЛЕЗ У ДВУКРЫЛЫХ (01Ю50РН11_А, сн^оыомиэ)

Генетика - 03.00.15

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук в Форме научного доклада

Новосибирск, 1990

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики Сибирского Отделения АН СССР, г.Новосибирск.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор Н.А.Захаров, доктор биологических наук, профессор В.А.Гвоздев, доктор биологических наук Е.А.Кузин

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ - Носковский государственный университет им. И.В.Ломоносова, кафедра генетики и селекции биологического факультета.

Защита состоится "_" _ 1990 г. на заседании

специализированного совета Д002.85.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биологии развития им. Н.К.Кольцова АН СССР по адресу. 117608, Москва, ул. Вавилова, 26.

С материалами диссертации можно ознакомится в библиотеке Института биологии развития им. Н.К.Кольцова.

Автореферат разослан "_" _ 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Е.Н.Протопопова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность тены. Усилия многих исследователей в настоящее вреия направлены на решение вопросов актуальной проблемы современной биологии - проблемы структурной и функциональной организации геномов эукариот. Структурные гены, экспрессирую-щиеся в определенных типах клеток с образованием мажорного продукта белка, являются составными компонентами генома и поэтому исследование молекулярно-цитогенетической организации локусов политенных хромосом, с известной локализацией в них тканеспеци-Фических генов, представляет особый интерес. Мажорные белки являются четкими маркерами отдельных этапов дифференцировки и соответственно исследование Функциональной организации генов, контролирующих их синтез, имеет важное значение для понимания процессов клеточной дифференцировки, выяснения типов организации генов, вовлеченных в реализацию тканеспецифической функции.

Слюнные железы двукрылых, в первую очередь дрозофилид и хи-рономид, обладая на определенных стадиях развития четкой тканеспецифической Функцией, заключающейся в продукции секреторного материала (Fraenkel, Brooks, 1953; Beermann,1961), являются благоприятной моделью изучения широкого круга вопросов этих двух тесно связанных между собой проблем. Дифференциальная экспрессия генов, лежащая в основе процессов цитодифференцировки (Корочкин, 1981; 1986), проявляется в этих тканях на уровне политенных хромосом в последовательной смене картины пуФФинга (Beermann, 1961; Ashburner 1972, 1978; Кикнадзе, 1972; Жимулев, 1974). Однако, до начала нашей работы сам продукт клеток слюнных желез и основные закономерности его образования были изучены недостаточно. Кроме того, вопрос о соответствии пуФФинга, как морфологического феномена на уровне хромосом, активности генов, регистрируемой на уровне синтеза специфических белков, оставался дискуссионным. Интерпретация сложной картины пуФФинга требовала проведения дальнейших исследований.

Цель и задачи работы. Целью работы являлось выяснение основных закономерностей процесса дифференцировки клеток слюнных желез дрозофилид и хирономид, установление генетического контроля некоторых секреторных белков дрозофилы, исследование функциональной молекулярно-цитологической организации тканеспецифи-ческого пуФа КБа, связанного с процессами внутриорганной специ-

ализации клеток слюнных желез хирономуса.

В ходе работы в составе ДНК пуфа КБа были обнаружены последовательности, имеющие множественную локализацию в геноме, в связи с чем возникла задача установления их молекулярной структуры и точной хромосомной локализации.

В конкретные задачи исследования входило:

- цитохимический и биохимический анализ основных этапов формирования специфического продукта (секрета) в клетках слюнных желез 0.те1аподавгег и СП\гопотив гнитт/-,

- выявление полиморфизма и изучение генетического контроля синтеза секреторных белков Р. у/г///я, локализация генов, ответственных за синтез некоторых секреторных полипептидов;

- клонирование участка хромосомы, содержащего пуФ КБа и хромосомное картирование клонированных фрагментов, поиск кодирующих последовательностей ДНК из района тканеспецифического пуфа (СБа С. Шлт/. Определение нуклеотидной последовательности клонированных фрагментов и их контекстный анализ;

- конструирование химерного гена, содержащего кодирующую последовательность из КБа, и его экспрессия в гетерологической системе;

- иммуноферментный анализ тканеспециФичности экспрессии кодирующей последовательности из КБа.

Научная новизна и практическая ценность работы. На основе комплексных исследований с применением методов генетико-биохими-ческого и цитохимического анализов, а также методов молекулярного клонирования, вскрыты основные закономерности организации и экспрессии генов, контролирующих синтез тканеспецифических белков в слюнных железах ЮгозорЬ))а и стгопотиэ. Впервые доказано, что в процесс формирования специфического продукта-секрета клеток слюнных желез как РгогорЛ/1а,так и СЫгопотиБ, вовлечены не только структурные гены, контролирующие синтез мажорных секреторных гликопротеинов, но и гены с общеклеточными Функциями, ответственные за синтез минорных белков секрета.

Установлена корреляция между качественными и количественными изменениями в спектре белков слюнных желез Р.те/аподазХег в ходе метаморфоза и изменениями в картине пуффинга, ранее описанной в литературе. Предложена интерпретация сложной картины пуффинга, высказано предположение, что активность "межлинечных" пуфов связана с синтезом секреторных белков. Это предположение

нашло затем подтверждение в работах других авторов.

Впервые описан полинорфизм по основный белковый компонентам секрета у 35 линий и 12 видов дрозофилы группы у/г///5, проведен генетический анализ и картированы три из пяти генов белков секрета. Обнаружен феномен активации структурных генов секреторных белков у межвидовых гибридов, не проявлявших своей активности у родителей. Показана кластерно-дисперсная организация семейства генов секреторных белков 0. у/г///5.

Проведено комплексное исследование тканеспецифической функции и внутриорганной специализации клеток слюнных желез СЛ/голо-тиз титт. Установлена корреляция между активностью тканеспе-цифического пуфа КБа, образующегося только в 4-х клетках специальной доли, и синтезом и гликозилированием в этих же клетках полипептида ззр-160. На этой модели применены методы молекулярного микроклонирования ДНК. Впервые получена микробиблиотека участка хромосомы, содержащего этот пуф.

Проведено хромосомное картирование клонированных фрагментов, выявлены клоны, как специфичные для различных районов хромосом, так и широко представленные в геноме. Таким образом, в ходе работы впервые для генома хирономид описаны два типа мобильных элементов, определена их структура и хромосомная локализация. Результаты данной работы составляют основу для развития нового направления, связанного с молекулярным изучением структурной организации функционально важных районов хромосом, таких как центромеры, теломеры, пуфы, а также молекулярно-цитологического картирования генома хирономид.

Данное направление реализовано на примере пуфа КБа. В ходе этих исследований получены новые оригинальные данные, носящие приоритетный характер. Определена первичная последовательность ряда Фрагментов из КБа общей длиной около 6000 пн. В их составе выявлены два сходных по строению гена мозаичного типа, повторы, мобильный элемент. Экспериментально показано, что один из генов кодирует синтез белка р-67, выявленного в составе минорных компонентов секрета. Установлено, что этот ген относится к классу генов с общеклеточной Функцией.

Сделан вывод, что КБа является сложным локусом, содержащим, по крайней мере, три гена, относящихся к разным семействам, но, возможно, связанным единой функцией - процессом секреции. Пред-

ложена модель Функциональной организации КБа, согласно которой этот район в разных клетках в зависимости от степени деконденса-ции материала может находиться в различных транскрипционных состояниях, что, в конечном итоге, может приводить к синтезу различных белков в этих клетках. Развиваемое в модели представление может носить более общий характер и быть справедливым для различных сложных локусов хромосом эукариот.

Полученные результаты углубляют и развивают представления о структурно-функциональной организации специфических районов эукариотических хромосом, дифференциальной экспрессии генов в ходе клеточной дифференцировки.

Апробация работы. Результаты настоящего исследования широко обсуждались и были представлены на Всесоюзных конференциях по генетике дрозофилы (Ленинград, 1973; Канев, 1975; Харьков, 1979; Минск, 1964),на XIV Международном генетическом конгрессе (Москва,1976), VI Европейской конференции по генетике и биологии дрозофилы (Югославия, 1979), симпозиумах СССР-ФРГ "Структура и транскрипция генома (Ереван,1981; Иркутск,1989), Международном совещании "Организация и экспрессия тканеспецифических генов" (Новосибирск,1982), 16 Конференции Европейских биохимических обществ (Москва,1984), Всесоюзных совещаниях по структуре и функции хромосом (Пущино,1965,1988), 3 национальной, конференции по цитогенетике (Болгария,1984), Втором Неждународомконгрессе по клеточной биологии (Венгрия,1985), рабочих совещаниях по структуре и эволюции генов колец Бальбиани (ГДР, 1983,1985; Швеция,1987; Швейцария,1989), Всесоюзном совещании "Нодекулярные механизмы генетических процессов" (Москва,1987), V съезде ВОГиС им.Н.И.Вавилова (Москва,1987), 11 Международном совещании по клеточному ядру (Суздаль,1989).Всесоюзной конференции "Современные проблемы цитогенетики развития" (Москва, 1989).

Структура и обьем работы. Работа выполнена в ИЦиГ СО АН СССР, часть экспериментов выполнена автором в 1980 и 1983 г.г. на базе лаборатории действия гена Центрального института генетики и исследования культурных растений АН ГДР (г.Гатерслебен).

Диссертация изложена в Форме научного доклада.

Материалы, использованные з диссертации, получены самостоятельно и в соавторстве с группой сотрудников - С.Я.Слободянюком, К.Г.Аймановой, А.Г.Блиновым, С,С.Богачевым, Ю.В.Собановым, А.П. Донченко, Л.Н.Перелыгиной, Е.К.Гайдамаковой, С.В.Щербик, работав-

ших под руководством автора. Ряд экспериментов выполнен совместно с И.И.Кикнадзе, Т.Е.Себелевой, Т.Н.Пановой, И.А.Шахмурадовым, В.Н. Блиновым, Г.А.Зайниевым, У.Вобусом, Х.Баумляйном, Э.Зерфлингом, Л.Нейером, И.Ф.Химулевым, В.А.Бердниковым, С.И.Байбородиным, A.B. Тараниным.

Всем коллегам автор приносит свою искреннюю благодарность и признательность за возможность совместной работы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. ГЕНЫ ТКАНЕСЛЕЦИфИЧЕСКОИ ФУНКЦИИ СЛЮННЫХ ЖЕЛЕЗ ДРОЗОФИЛЫ /22/* Слюнные железы представляют собой парный орган, который дифференцируется в процессе раннего эмбриогенеза, функционирует в процессе личиночного развития и дегенерирует после прохождения метаморфоза (Ross, 1939; Poulson,(950). Наиболее заметной и установленной функцией слюнных желез является наработка в ходе 3 возраста (72-120 ч.) материала, секретируемого из железы в конце личиночного развития. На предкуколочной стадии (0-12 ч.) в клетках происходит накопление лизосональных структур, железы подвергаются аутолизу (Gaudecker, 1972).

Процесс диФФеренцировки клеток слюнных желез личинок и пред-куколок на хромосомном уровне сопровождается существенной перестройкой транскрипционной активности политенных хромосом, сменой картины пуффинга (рис.1а) (Ashburner, 1972; Kress, 1972; Жимулев, 1974; Полуэктова, 1975). Вопрос о том, насколько изменения картины пуффинга связаны с изменением синтеза специфических белков, к началу нашей работы не имел однозначного ответа. Поэтому первая часть нашего исследования была направлена на выяснение основных закономерностей и процессов Формирования специфического продукта слюнных желез, анализ полиморфизма и генетического контроля синтеза некоторых белков секрета.

1.1. Основные этапы формирования секрета в слюнных

железах личинок 3 возраста D.melanogaster. /2,4,5,7/ Комплексное исследование позволило выяснить динамику образования секрета в слюнных железах (рис.1). Первые гранулы ШИК-поло-

* - цифры соответствуют номерам работ в списке литературы автореферата.

отельного материала появляются в 95 ч и, по мере развития, заполняют все клетки дистального отдела железы. В момент образования пупариума ШИК-положительное вещество секретируется в полость и проток железы. После выброса секрета из железы на стадии пред-хуколки г ч клетки железы сохраняют слабую ШИК-положительную реакцию. С 80 ч концентрация белка в железе возрастает более чем в S раз и достигает своего максимального значения (3 мкг/железу) в 120 ч. Доля белка, секретируеного железой, определенная для 3-х линий D.meianogaster составляет, как минимум, £1-32/. от содержания общего белка в слюнных железах.

Период 72-85 ч чувствителен к действию актиномицина.Обработка личинок актиноницином в этом возрасте приводит к существенному нарушению образования секрета более чем у вОУ. личинок. Возможно, в интервале 72-85 часов синтезируются долгоживущие матрицы РНК для белков секрета. Аналогичные результаты были получены на D.virilis (Онищенко и др., 1976).

1.2 Секреторные белки слюнных желез. /6,9,10,11/

Из ранних работ не было известно, что представляет собой секрет - моно или поликомпонентный материал. Ответу на этот вопрос была посвящена следующая часть исследования.

В составе суммарного спектра изолированного секрета после электрофореза в кислой буферной системе в присутствии мочевины обнаружено 69 белковых фракций, которые сильно варьируют по интенсивности окраски и своему удельному вкладу в общую массу секрета. Ножно выделить: а) основные компоненты - 20 фракций, среди которых 4-6 фракций являются мажорными и при денситометрическом определении составляют более 70'/. от общей массы секреторных белков, б) 37 фракций со средней интенсивностью окраски, в) 12 фракций - минорные компоненты. Около половины белков секрета обнаруживают ШИК-положительную реакцию и представляют собой гликопроте-ины. Сравнительный анализ с учетом всех выявляемых Фракций доказал, что 45 секреторных белков D.melanogaster и D.virilis обладают сходной подвижностью, 24 - являются видоспецифическими и в основном включают мажорные компоненты секрета. SDS-электроФорез показал, что м. масса белков секрета варьирует в широком диапазоне от ю ООО до 220 ООО и выше. Около половины белков секрета обладают м.м. до 40 ООО. Необходимо отметить, что в ряде работ в составе секрета D.melanogaster также обнаружено от 5 до 10 ма-

корныЕ компонентов (Korge, 1975,1977; Beckendorf, Kafatos, 1976; Кокоза и др.,1985), однако, не учитываются минорные белки.

Таким образом, секреторный продукт слюнных желез дрозофилы представляет собой гетерогенную смесь белков и гликопротеиноэ.

1.3. Изменения спектра белков слюнных желез в ходе метаморфоза. /1,8,10/ Сопоставление электроФоретической подвижности белков изолированного секрета с белковым спектром слюнных желез в течение 3 возраста позволило выяснить онтогенетические характеристики его образования (рис.1), 55 Фракций секрета обнаруживаются в спектрэ слюннкг желез на стадии 80 ч, т.е. до появления гранул секрета, и лишь 14 белковых фракций секрета появляются в слюнных железах в интервале 100-130 часов. Интенсивность окрашивания белковых фракций секрета увеличивается к 120 ч. Обнаружена корреляция мегду появление» ПИК-полояительных Фракций и ветвлением первых 2ИК-по-догнтспыпдЕ гранул секрета. Все ГИК-положительные фракции выявляет»« d_ccshhh2 »еаезах лотинки 120 ч представлены в секрете.

гттгп

Рис.1. Общая слепа сремекпых саотнояеика и некоторые характеристики основные процессов, наблюдаемых з слюнннг гелеэах D.me-Isnogaster в течение якчнночного л предкуколочного развития. По горизонтали - вреия после откладки яиц, на стадии предкуколки -от момента образования пупариука. Черные линии обозначают отрезке: времени, в течение которых наблюдали соответствующее процесси: А - картина пуффинга в клетках слюнных желез (Richards,1978), I-VI - классы пуфов: I - межли-нечные, И - ранние экдизоновые, III - поздние экдизоновые, IV -среднепредкуколочные, V - поздние предкуколочные, VI - поздние » »_в—.........-г—!—'-i— экдизоновые, в - период обнаружения НИК(PAS) - положительного вещества, с -актиномицин-чувствитель-ный (АНД) период, D - выявление секрета в полости и протоке железы, Е - изменение количества общего белка в железе (мкг), F - изменение числа белковых фракций, выявляемых в слюнных железах после электрофореза в 15/! ПААГ,содержащем 8М мочевины, 0.9Н уксусной к. О- общее число белковых фракций в слюнных железах, д- число секреторных белков в общем белковом спектре 0- постоянно выявляемые Фракции на стадии личинки, предкуколки

На стадии предкуколки отмечено ослабление интенсивностиОкрашивания многих секреторных гликопротеинов. Но уже на стадии предкуколки 2 и 4 ч в слюнных железах можно выявить 12 ЖИК-поло-жительных фракций, которые не встречаются в 3 личиночном возрасте. Интенсивность окраски новых типов гликопротеинов увеличивается к 9 ч предкуколки. Для 4 секреторных гликопротеинов личиночных слюнных желез отмечено увеличение интенсивности окрашивания в этот период. Ножно думать, что на стадии предкуколки происходит активация работы генов, специфичных не только для этой стадии развития, но и генов, проявлявших свою активность ранее на стадии личинки.

К тому же, на стадии предкуколки встречаются железы, полость и проток которых вновь заполнены секреторным материалом (рис.1), который после осаждения этанолом представляет собой рыхлый, хлопьевидный материал в отличие от твердого секрета личиночных слюнных желез. Таким образом, в начальный период метаморфоза слюнные железы выполняют новую Функцию, заключающуюся в образовании новых типов гликопротеинов, которые наряду с остаточными гликопротеина-ми личиночных слюнных желез, как показал сравнительный электрофо-ретический анализ, секретируются в гемолимфу.

Предкуколочная стадия развития характеризуется появлением специфических для слюнных желез белков. Максимальная гетерогенность белкового состава отмечена для стадии предкуколки 9 ч , что, по-видимому, является отражением смены функциональной активности генома клеток слюнных желез в ходе метаморфоза. 1.4. Активность генома и репрограммирование синтеза гликопротеинов в слюнных железах Drosophi1а. /1,2,5,7,8,10,22/

В плане установления связи активности генома с синтезом специфических клеточных белков значительный интерес представляет сопоставление характера изменений белкового спектра с ранее уже описанной в литературе (Ashburner,1970,1978; Химулев,1974; Беляева, 1982) картиной изменения пуффинга в слюнных железах. В нашей работе установлено два пика максимальной гетерогенности белкового состава железы: первый соответствует концу 3 личиночного возраста, второй характерен для стадии предкуколки 6-9 ч (рис.1). В геноме D.melanogaster на протяжении от 96 ч личиночного развития до конца предкуколки 350 районов хромосом проявляют свою активность, выявляемую по степени деконденсации дисков или по включению ури-дина (Беляева,1982). Причем 143 из них постоянны в своей актив-

ности, 207 являются стадиеспецифическими. Последние подразделяются на несколько классов (Richards,1978) в ответ на действие эк-дизона (рис. 1А). На основании результатов опытов с актиномкцинон и ,стадиеспецифических особенностей Формирования белкового спектра секрета, а также литературных данных, можно думать, что пуфы с максимальной активностью в 96 ч связаны с синтезом секреторных белков. Это предположение нашло подтверждение в работах по цито-генетической локализации генов, контролирующих синтез отдельных компонентов секрета D.melanogaster (Korge,1977;Akam е а., 1978; Ve11issario.Ashburner,I960; Кокоза,1983).

Периоду наиболее резких изменений в картине пуффинга предку-колки соответствует установленный в нашем исследовании второй пик максимальной гетерогенности белкового состава слюнных желез, значительное увеличение интенсивности окраски гликопротеинов, наличие секреторного материала в полости и протоке железы.

Таким образом, смена картины пуффинга отражает изменения транскрипционной активности генома, проявляющейся в синтезе стадиеспецифических белков в процессе метаморфоза.

На основании собственных и литературных данных (Berendes, Ashburner,1978;Kress,1981) можно предположить следующую схему связи активности генома и синтеза гликопротеинов в слюнных железах. Гены, контролирующие синтез секреторных белков, по всей видимости, локализованы в районах хромосом, образующих "межлинеч-ные" пуфы. В самом начале 3 возраста в этих районах начинается синтез стабильных матричных РНК для белков секрета. Трансляция этих РНК ведет к синтезу секреторных белков, подвергающихся посттрансляционной модификации - гликозилированию, и появлению первых гранул секрета в клетках дистального отдела железы в середине 3 возраста. Интенсивность синтеза и накопление секрета нарастают к концу личиночного развития. В этот момент белки секрета составляют ЗОХ от общего белка железы. Высвобождение экдизона незадолго до образования пупариума ингибирует активность "межлинечных" пуФов и индуцирует появление ранних "экдизоновых" пуфов. Белковые продукты ранних "экдизоновых" пуфов могут выполнять различные функции: терминировать синтез секреторных гликопротеинов, инакта-вировать Ферменты биосинтеза аминосакаров, контролировать процесс секреции материала из клеток в полость железы, индуцировать образование поздних экдизоновых пуфов личинки.

На этом завершается программа синтеза личиночных секреторных гликопротеинов и происходит переключение на программу синтеза гликопротеинов предкуколочных слюнных желез. Возможно продукты поздних экдизоновых пуфов личинки, в свою очередь, активируют IV группу пуфов средней предкуколки (рис.1А), связанных с образованием нового типа секреторного материала в клетках железы. Активность этой группы пуфов снижается к 8-9 ч предкуколки. Заманчиво предположить, что белковые продукты экдизоновых пуфов V группы репрессируют активность пуфов IV класса и индуцируют появление пуфов VI группы и, таким образом в очередной раз происходит каскадное переключение программы развития с синтеза и секреции предкуколочных гликопротеинов на подготовку к процессам гистолиза.

1.5. Генетический контроль секреторных гликопротеинов

слюнных желез у D.viril is /13,14,17,22,31,32/ В конце 70-х начале 60-х годов организация и экспрессия тканеспецифических генов, контролирующих синтез секреторных гликопротеинов в слюнных железах, была детально изучена на D.melanogaster (Колесников и др.,1975,1976; Korge, 1975,1977, 1981; Vellissario, Ashburner, 1981,1982; Кокоза и др., 1982; Meyerowitz, Hogness, 1982). На D. viril is более подробно прослежены этапы гликозилирования секреторных белков, процесс секреции (Kress, 1980; Enghofer, Kress, 1980), но отсутствовали работы по генетическому анализу тканеспецифической функции слюнных желез. Ниже будут приведены результаты наших исследований, посвященных данной проблеме.

Важной предпосылкой для проведения генетического анализа является установление полиморфизма по изучаемому признаку. Мы сосредоточили свое внимание только на основных (мажорных) компонентах секрета, которые соответственно обозначили lg - группа из 2-5 Фракций в зависимости от изученных линий и видов; sp 1-5 - секреторные бепки (рис. 2).

Предварительно установили, что мажорные компоненты секрета слюнных желез D.viril is представляют собой гликопротеины, и обладают тканеспецифичностыо. Активация структурных генов секреторных белков происходит на разных стадиях развития. Секреторные полипептиды sp 3-5 выявлются на стадии 32ч третьего личиночного возраста, sp 1-2 и группа lg - в 54 ч. Интенсивность окрашивания секретор-

ных компонентов в слюнных железах возрастает к моменту образования пупариума и резко ослабевает на стадии предкуколки 2 ч. Основные закономерности экспрессии генов секреторных белков d.viri-lis оказались сходными с таковыми D.melanogaster.

1.5.1. Полиморфизм белков секрета.

Сравнительный анализ изолированного секрета 35 лабораторных пиний D.vírilis выявил полиморфизм трех из пяти основных секреторных Фракций (рис.2). Выявлено 5 вариантов sp-2, четыре варианта по Фракции зр-4 и два по sp-5. Не обнаружено электрофорети-ческих вариантов фракций sp-1 и sp-З, отличия по этим компонентам наблюдали только у других видов группы virilis. Полипептид зр-4 не выявляется в 12 линиях и, по-видимому, представлен "0"-вари-антом. Два белковых спектра секрета: 1а, £с, За, 4Ь, 5а, и ta, 2d, За, 4"0", 5а наиболее распространены и характерны для 10 и 11 линий соответственно.

Среди 12 изученных видов группы virilis выявлены межвидовые различия по основным компонентам секрета. В филаде virilis количество электрофоретических вариантов колеблется от 3 до 5, в филаде montana - от 4 до 6. Представители Филады montana (например D.flavomontana, D. ladeóla) обладают более разнообразными спектрами секрета в сравнении с видами филады virilis.

1.5.2. Генетическое картирование белков секрета.

Последующие исследования продемонстрировали кодоминантный аутосомный характер наследования для медленно мигрирующих фракций lg и сцепленный с полом - для полкпептидов зр 1-5. Результаты кез-видовых скрещиваний показали, что синтез компонентов секрета зр-1 и sp-З (по которым не выявлено аллельных вариантов среди изученных линий D. virilis, а обнаружены только видовые отличия) также определяются генами, расположенными в X -хромосоме.

Интересный феномен обнаружен при анализе потомства от межвидовых реципрокных скрещиваний D.vírilis и D.texana. В спектре секрета гибридных самок выявляются две новые дополнительные Фракции, которые отсутствуют в составе секрета родителей. Для гибридных самцов независимо от направления скрещивания характерен только материнский спектр секрета. Анализ потомства F2 продемонстрировал расщепление по секреторным белкам. Только у личинок с двумя Х-хромосомами от разных видов в спектре секрета выявляются две дополнительные фракции, не выявлено влияние аутосои на их прояв-

ление, Возможно, в данном случае происходит активация "инакти-внрованных" или "молчащих" структурных генов родителей в результате межвидовой гибридизации.

Для генетической локализации генов некоторых секреторных белков использовали линии D.viritis, маркированные по X хро-иосоме: линия 139 - рецессивные мутации - у(2,9) и ар(I36), линия 127 - cv(25), V(25,5), w(105) и синтезированную на основе этой линии новую линию - 127N с введением в х-хромосому доминантной мутации Вх (94,5). Принципиальная схема локализации секреторных генов приведена на рис. 2с.

t.5.3. Локализация гена VSP-2.

В скрещиваниях использовали линию 139, характеризующуюся наличием варианта 2Ь, и линию 41, имеющую в составе секрета фракцию 2е. Определение частоты рекомбинаций между генами у,ар и VSP-2 показало, что ген VSP-2 расположен правее ар на 9.1 единиц карты (табл.1).

Таблица 1. Генетическая локализация гена VSP-2

Генотип F2 Число особей Всего 7. Генотип F2 Число особей Всего У.

+ + 2е 28 35 45 + + 2Ь 5

у ар 2Ь 7 у ар 2е - 5 6.5

+ ар 2Ь 25 + ар 2е 2

у + 2е 10 35 45 у + 2Ь - 2 2,6

При высоких частотах рекомбинации зависимость генетического расстояния (D) от наблюдаемой частоты рекомбинации (г) математически более точно выражается Функцией Косамби (Захаров, 1979):

г = 1/2 tanh (2d), где tanh - гиперболический тангенс или

D = 25 In [(1+2г)/(1-2г)] = 1OOd Это выражение дает хорошие результаты при расчете генетических расстояний у различных организмов.

Значение D, определенное по Функции Косамби, для генов ар-VSP-2 равно 8.4. Таким образом, ген VSP-2 локализован в положении 144.4+ единиц на генетической карте Х-хромосомы.

Igfí-,

sp 2

sp 3

sp 4

sp 5

Ití 139 127 2,3 ЮЗ 1.6 101 41 142 НО 109 133

a 1 I v к

H-

25

PP гс

127 M

cv B<

<1

+ + -t- 2'

cwB* w 2c

+ + 4- 2«

J

cvBiw( ) 44- 4- П

cvBx + < )

cv + + ( ) + 0« w ( )

CV + w ( ) + 8« *■ ( 1

1

F3 cv 0* + ( )

X

•H- 2»

+ 4- w( >

ТТТгГ

flfr RB

?4S —4—

136 144.5

' -4-

ap VSP2.4

X(l)

Рис.2. Схематическое изображение белкового спектра секрета слшных желез различных линия D. virilis (A) и видов группы virilis (В), генетической локализации генов некоторых секреторных белков D. virilis (С), ig-, sp 1-5 - Фракции секрета; цифрами под образцами обозначены линии, филада virilis: п - D. novamexi сапа, а - D.amsr¡cana, t - D.texana, I - D.lummei, филада montana: К. - D.HaneHoi, e - D.ezoana, i - D. imeretensis, b - D. boreal is, fl - 0. flavomontana, ic - О. Iacicola, m - D.montana.

a

b

a

a

b

n

Таблица 2. Генетическая локализация гена VSP-2

Генотип F2 Число особей Всего г Генотип F2 Число особей Всего 7.

+ + + 2e 7 13 9.4 + Вх + 2е 5 10 7.2

cvBx w 2C б cv + у/ 2с 5

+ BX W 2c 16 35 25.4 + + w 2е 10 19 13.8

cv+ + 2e 19 CV Вх + 2С 9

+ + W 2c 19 34 24.6 + Bx w 2е 9 16 11.6

cvBx + 2e 15 CV + + 2С 7

+ + + 2c 5 8 5.8 + BX + 2С 1 3 2.2

cvBx w 2e 3 cv + w 2е 2

Во второй серии опытов для локализации гена VSP-2 использовали скрещивания линий 127N (cv,Bx,w,2c) на 41 (2е) (табл.2).

Найдена следующая частота рекомбинации (в V.): cv-VSP-2 -58, Bx-VSP-2 - 49.7, w-VSP-2 - 33,4. Отсюда следует, что ген VSP-2 расположен правее гена w. Определение генетического расстояния между генами w и VSP-2 по Формуле Косамби дало значение 39.5, что соответствует положению 144.51 на генетической карте и совпадает со значением, полученным ранее.

1.5.4. Локализация генов VSP-4,5.

Для локализации генов VSP-4 и VSP-5 определяли частоту рекомбинации между ними и геном VSP-2, используя линии 41 (2e,4d,5a) и 101 (2Ь,4а,5Ь), характеризующиеся различными аллелями этих трех генов. Из 108 проанализированных особей не обнаружено ни одного рекомбинанта между генами VSP-2 и VSP-4, у всех гибридов F2 в спектре секрета выявляются только варианты,характерные для родительских типов. Кроме того, анализ 168 самцов второго поколения от скрещивания линий 9-8L (2d,4"0") и 127 (2Ь,4а) также не выявил рекомбинантных классов между этими генами. Эти факты, по-видимому, могут указывать на тесное сцепление генов 2 и 4.

Однако были обнаружены рекомбинантные классы между генами VSP-2 н VSP-5. В 26 случаях из 108 исследованных особей обнаружены классы, несущие варианты 2Ь,5а и 2e,5t>; из 36 самцов 12 были рекомби-нантными по фенотипу. При определении генетического расстояния по Функции Косаыби ген VSP-5 может быть удален от гена VSP-2 на 26.1 i единиц карты. На основании полученных данных пока нельзя сделать вывод, в какую сторону от гена VSP-2 расположен ген VSP-5.

Таким образом, результаты генетического анализа позволяют заключить, что структурная организация семейства генов тканеспеци-фической Функции у D.virilis несколько отличается от таковой у D.melanogaster, но вместе с тем наблюдаются и некоторые общие закономерности. У D.virilis 5 генов, определяющих синтез мажорных белковых компонентов секрета,расположены в Х-хромосоме, тогда как у D.melanogaster из 9 основных генов только один Sgs-4 локализован в Х-хромосоме (Когде,1977; Кокоза,1983). У D. vir i lis два.гена, контролирующих синтез секреторных белков зр-£ и SP-4, по-видимому, тесно сцеплены и локализованы в положении 144.41 на генетической карте Х-хромосомы. Для D.melanogaster описан локус 68С в хромосоме 3, содержащий кластер из трех генов

секреторных белков (Меуего*т2, Нодпезз, 1952).

К общим закономерностям Функциональной организации генов секреторных белков у разных видов дрозофилы можно отнести ткане-специфический характер экспрессии, последовательное включение генов в онтогенезе, кластерно-дисперсную локализацию в геноме.

2. ГЕНЫ ТКАНЕСПЕЦИфИЧЕСКОИ ФУНКЦИИ СЛЮННЫХ ЖЕЛЕЗ ХИРОНОНИД /2,22,38/ Второе направление исследований было посвящено изучению тка-неспецифической функции слюнных желез личинок СШгопотиз как уникальной модели внутриорганной специализации клеток в ходе дифференцировки. По морфологии и типу секреторного материала клетки слюнных желез можно подразделить на две доли: основная - из 30 клеток, составляющая большую часть железы и специальная доля из 4 клеток возле основания выводящего протока (рис.3).Политен-кые хромосомы этих 4-х клеток отличаются от хромосом клеток основной допн наличием дополнительного пуфа - кольца Бальбиани КБа з хромосоме IV. На долю тканеспецифических пуфов - КБ приходится около 507. синтеза РНК в клетке (К1кпас1ге, 1981). Клетки специальной и основной долей различаются по типу строения аппарата

Рис.3, Хромосомный контроль тканеспецифической Функции

слюнных желез С. Шиш'!. В(? - кольца Бальбиани (КБа,Ь,с) хромосомы IV, N - ядрышкосга организатор, (э1) - клетки специальной и (т1) - основной долей железы, зр - белки секрета.

Гольджи, шероховатой эндоплазматической сети и секреторных гранул (Агапова, Кикнадзе, 1978). На долю белков секрета личинок 4 возраста приходится более 60У. от общего белка слюнных желез (ко-lesnikov et а 1.,1981). Секрет клеток специальной доли составляет около 6.5Z от секрета целой железы, легко отличим от го-ногенного секрета клеток основной доли при гистохимической окраске (Себелева, Кикнадзе, 1977).

2.1. Синтез и гликозилирование белков слюнных желез. /15,16,22/

С целью выяснения специфических отличий в синтезе белков ыежду клетками основной и специальных долей, суммарные белки и белки секрета, после инкубации слюнных желез в среде Кэннона, содержащей Н3-аминокислоты и Н3-глюкозамин,Фракционировали в 808-содержащем 5-207. ПЛАТ. При окраске Кумасси в секрете слюнных гелез выявляются 45 Фракций с различной м.м. и различающихся по интенсивности окраски. Среди этих Фракций можно выделить пять основных мажорных компонентов. Для клеток и секрета специальной доли характерно наличие дополнительного полипептида ssp-160 (рис.3).

Значительная часть секреторного материала остается на старте и лшь после фракционирования в сложном агарозно-полиакрила-нвднои геле в составе секрета С, thu/nmi дополнительно вывляются еще две-три Фракции (рис.3), по своим размерам эти фракции секрета с. thumi соответствуют двум гигантским белкам секрета C.tentsns с н.н. в области от 800 до 1000 кД (Hertner е а.,1980).

Бее нагорные компоненты секрета интенсивно включают метку и могут быть подразделены на два семейства: высокомолекулярные белки (700 - 1000 КД) и белки со средним значением м.м. от 15 до 200 кД (рис.3), которые мы соответственно обозначили sp-180, sp-150, sp-35, sp-18 и sp-15. Интересно, что кроме этих мажорных фракций достаточно высокий уровень включения метки проявляют 6-6 белков с н.н. от 35 до 05 кД (например,Фракция с м.м. 67 кД), которые при окраске Кумасси были отнесены к минорным компонентам.

В клетках специальной доли отмечен преимущественный синтез полнпептвда ззр-160, уровень гликозилирования которого значительно превосходит таковой остальных секреторных белков, Около 80/. включения Н3-глюкоэаиина обнаружено в этой Фракции.

2.2. Сравнительный пептидный анализ секреторных белков. /15/ Для выяснения природы ssp-160 -компонента секрета клеток

специальной доли, а также ответа на вопрос обладают ли зр-150, sp-160 и sp-180 общими свойствами или значительно отличаются друг от друга, провели пептидное картирование этих белков. Радиойодирование выделенных Фракций, их энзиматический гидролиз и двумерное фракционирование гидролизата показало, что для каждой фракции sp-150, ssp-160 и sp-180 характерны уникальные пептиды на Фингенпринтах, с другой стороны, обнаружен ряд общих пептидов для всех Фракций, что может свидетельствовать о частичной гомологии этих белков и соответственно о наличии сходных структурных элементов в генах их кодирующих.

Аналогичные результаты были получены Копанцевым с соавторами (Kopantzev et ab, 1985}, Отмечено наличие уникальных и общих пептидов, а также кнмунохимическое сходство белков секрета sp-180, sp-150 и sp-35,

2.3. Кольца Бальбиани и секреторные белки. /12,15,18,22/

Гены, контролирующие специфическую Функцию слюнных желез хирономид объединены в семейство, и как было показано в наших работах, их экспрессия носит координированный и тканеспецифический характер. Это семейство можно подразделить на два подсемейства. Последующие молекулярные исследования ряда авторов, выполненные на разных видах хирононид, показали, что гены белков первой группы (эр-1) имеют сходную иерархическую организацию, необычайно велики по размеру - 37 тин и локализованы в пуфах - кольцах Бальбиани. Основная часть этих генов представлена тандеи-но повторенными белок кодирующими последовательностями от 150 до 270 пн. Высказано предположение, что в ходе эволюции гены КБ возникли из одной простой предковой последовательности (Pustel 1 е а.,1984; Wieslander е а.,1984). Вторая группа генов контролирует синтез секреторных белков с м.м. от 15 до 200 КО, и, по-видимому, обладает также частичной структурной гомологией (Koles-niKov е а,,1981; Kopantzev е а.,1985). Показано, что у С. tentans один из генов этой группы локализован также в КБ1 (Dreesen е а.,1985). Локализация остальных генов пока не определена.

Необходимо также учитывать, что кроме мажорных секреторных гликопротеинов в составе секрета как клеток специальной, так и основной долей железы, постоянно выявляются минорные компоненты, уровень синтеза которых, как было показано в наших исследованиях, сопоставим с таковым главных компонентов, Однако, по-видимо-

ну, они отличаются от основных компонентов по своей метаболической стабильности, функциональное значение минорных белков в составе секрета во многом пока остается неясным.

В связи с установленной корреляцией между активностью дополнительного кольца Бальбиани КБа и синтезом специфического гли-копротеина - ssp-i60 в клетках специальной доли слюнных желез С. thummi в дальнейшем исследовании была предпринята попытка найти подход к анализу молекулярной организации гканеспеци-фического пуфа КБа, выявить в нем кодирующие последовательности. Для решения этой задачи использовали метод микроклонирования ДНК, выделенной из отдельных участков политенной хромосомы (Sealenge е а., 198)).

3. СТРУКТУРНАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПУфА КБа. Участок IV хромосомы AI-2, содержащий локус A2b, из которого развивается КБа, был выделен микрохирургическим путем и получена микробиблиотека из 540 клонов ДНК этого района (Зайниев и др.,1984). Далее вставал вопрос об идентификации клонов, относящихся к локусу А2Ь, и их молекулярной характеристике.

3.1. Картирование клонированных фрагментов ДНК. /19-21,26/ Н3-меченую ДНК более 20 клонов из микробиблиотеки участка AI -2 хромосомы IV гибридизовали in situ с набором политенных хромосом. Оказалось, что исследованные клоны различаются по числу и интенсивности мест гибридизации. Основным местом гибридизации, как и ожидалось, являются районы Alb и А2Ь участка AI-2 хромосомы IV, из которой и была получена микробиблиотека.

Условно все изученные клоны подразделяются на 3 группы: "уникальные" клоны, гибридизующиеся только с одним районом IV хромосомы, "умеренные" - гибридизующиеся с двумя районами,"повторенные" - имеющие дисперсную локализацию на всех хромосомах. Детальное исследование одного из клонов третьей группы позволило открыть в его составе мобильный элемент и за счет свойств этого элемента объяснить варьирующую локализацию этого клона в геноме. Результаты этих исследований приведены в главе 4.

В целом .картирование позволило выявить Фрагменты ДНК, относящиеся к различным Функционально активным специфическим районам политенных хромосом (ЦМР, теломеры, экдиэонстимулируемый и ткане-специфический пуфы и др.), показать, что в составе ДНК участка

А1-2 содержатся уникальные и широко представленные в геноме последовательности. Полученные клоны представляют основу для построения молекулярно-цитологической карты генома хирономид и могут быть использованы в качестве зондов для последующего изучения молекулярной организации отдельных районов хромосом.

Существенным результатом работы явилось выделение клонов (С1,Гб), содержащих Фрагменты ДНК, проявляющих гомологию как с неактивным районом А2Ь, так и с активным пуфом КБа, что позволило предположить наличие в их составе генов или Фрагментов гена, в пользу этого предположения свидетельствовали также положительные результаты дот-гибридизации этих клонов с поли-А+ мРНК личинок 4 возраста и поли А* мРНК, выделенной из клеток специальной и основной долей слюнных желез.

3.2. Структурные элементы последовательности ДНК из района А2Ь. /23,25,26,27,29/ Участок А2Ь хромосомы IV с.ггишт! состоит из 9 дисков. Из 2 центральных дисков этого района образуется пуф КБа (К1кпай2е е а.,1985). Определили первичную последовательность ДНК двух суб-клонированных фрагментов рЗДЬС1.2 и рС1Г1Г6.2, проявлявших интенсивную гомологию с ДНК пуфа КБа. Длины исследованных фрагментов составляют для С1.2 - 2040 пн, Г6.2 - 2333 пн, доля АТ пар - 67/. и 63Х соответственно. Контекстный анализ выявил определенное сходство этих фрагментов и позволил выделить в их составе несколько структурных элементов: а)кодирующие области (а,0) с промотор-ной зоной (Р), б)прямые тандемные несовершенные повторы двух типов , (?2), в)псевдоген-цгр, г)мобильный элемент (НЕС) (Рис.4).

Кодирующим областям а размером 723 пн в фрагменте Г6.2 и 738 пн в Фрагменте С 1.2 предшествуют зоны, содержащие сигнальные последовательности для РНК-полимеразы II. На нуклеотидном уровне эти зоны обладают определенной гомологией с промотором глобиново-го гена С.гНипШ (Тге*1и е а., 1988). Области а фланкируют прямые повторы 1?1 из 21 пн каждый, повторенные 8 и 13 раз в фрагментах Г6.2 и С1.£ соответственно. В случае фрагмента Г6.2 открытая рамка считывания (ОРС) терминируется в первом из этих повторов, но может быть продолжена с последнего повтора до конца фрагмента -область р. При допущении процесса сплайсирования, кодирующие области а и 0 можно рассматривать как экзоны, а тандемные повторы как интрон. При анализе консенсуса этих повторов обращает на

себя внимание консервативная последовательность AGGT, динуклеотиды которой могут играть роль донорных и акцепторных сайтов сплайсиро-вания (Keller.Noon,1984).Аналогичную структуру имеет С).2.

В первой трети фрагмента F6.2 содержатся три перекрывающиеся ОРС. Однако вставки нуклеотида в двух позициях приводят к восстановлению ОРС длиной 654 пн. На расстоянии 33 пн от терминирующего кодона находится сигнал полиаденилирования. Выведенная аминокислотная последовательность по восстановленной рамке считывания имеет определенную гомологию с кодирующей областью а и более 50Х гомологии с областью ß. Подобная гомология позволяет считать, что первая треть Фрагмента F6.2 содержит псевдоген vP.

Анализ выведенных аминокислотных последовательностей кодирующих областей аир фрагментов F6.2 и С1.2 показал, что на N-коицах белковых молекул расположен кластер из 16 аминокислотных остатков со свойствами сигнального пептида (Неi jne,1984). Н.масса белка, кодируемого областью а без сигнального пептида, равняется 25 KD. В структуре белка F6.2 (а) выявлены сайт гликози-лирования и Т сайтов фосфорилирования, дополнительный сайт глико-зилирования обнаружен в области р. В белке С 1.2 (а) выявлено 7 потенциальных сайтов фосфорилирования и два сайта гликозилиро-вания в области р. Более 45Х гомологии при сравнительном анализе выявлено в аминокислотных последовательностях, кодируемых областями а фрагментов F6.2 и С 1.2, и около 40К- для областей р, причем, наиболее консервативными оказываются участки, содержащие цистеины. Подобное сходство кодирующих областей и повторов R1 позволяет предположить, что они произошли из одной предковой последовательности (рис. 4в).

Возможно, транскрипционная единица КБа включает несколько кодирующих областей (а, В, у....) размером 700 пн, представляющих собой экзоны, разделенные тандемными повторами - интроны. В КБа может существовать несколько сходных между собой транскрипционных единиц (F6.2,С1.2), минимальная единица транскрипции может состоять из двух экзонов а и р, и таким образом кодировать белок размером около 50 KD.

3.3. Экспрессия кодирующей последовательности F6.2 /33,35,36/

С целью выяснения Функционального значения последовательности из КБа был сконструирован гибридный ген р-галактозидаза-Р6.2а. Этой химерной плазмидой трансформировали бактериальную культуру.

GYLYLlSSFLa* И DT IHYFYTKSJKPI Y M E D D N I P E *

bLEALEKLi J D I [0 H fff~ E К L N |ГТ1 t CfTJ AX11LKVEATL1IA

С1ТТАСАА1£ТСТ1М££^ТТ1>АААСТ(*САТТ{*^

S V К J Reí 1 К V D К 7 IflMDFlHFAVAKHaVBtfKALCASHKl СТСАЬТСААС^АЛШОТАГО^пмсаааасаат™

OK IOpISklVK IPMNDKNYLKYCEYFY E»T RLilRGYFYSY ACAAAAAATCCAACUGAlCTCA£AAC7?tl7GAAAATCCCAAATAA7GA1AAAAATTA7TTAAAA1ATT0CGAATAT'l TTIA18AACAÁM fl'< <XM ACOCTjGCT Al 1111A1 AO) 1 At

V V О К s

fe S 1CGVFTKDDNDVI TFXTLLLAMCK DVELKE

»9 411

G^AAÍGT1GTCCCTAAG1CGAAÍC^1CAACCTG7COTG7GTTTACCAA««^TATOGAIGTOATT^ Ef| (pEUKbLLADVTDRLOKIAftCIYERIK

tQCMA«OATT0CAGATT6TATTTAtGAGCS) ATTAAGIAAATOCCAIIA^ A6A1GT m AGAOGTOCIBIM A1ÜA1 £ tt|

j»tAA^lCAAGCAATTCITtTTTAAGAAATGTTATTTTTITTTt^TT7TTTTAACAAATTTTCTTGATTATTTGCAT<aw^T7rrACA<>fiT ГИТВТПГ-АД^ГГАТТИ^Ц^ГТГ*^

П C£ T T CCCCt TCCCACtCCCC T T CCCAACCCCt CCCAT CC AC C7CACA T CCCCCT C7C АТС CCC С T 7 T CCA Y CCCCC 7 CCCA TCCCtCTCCCATCCtcCT 7 CC A t CCCCt tfcCCA 7CCC }S|

lCT7CTCAJtXCCCTCCtATCtlCCIHTCTTTGCTTTAA7CCTGATAATTATCOTCCAAftCACTATTTDCT i||{J

__И

MGAAAI 1 GCATCACAATCOCAAAAMtTüAGA7AACAAATLA^TA7177GACf2TO?^TCACTCA^^ ШВ

К F 1 1 R

I L I A L F I I A I I N E

U^>H(.AjtAtLAGAAC^TCTGAT1GCCnG71TCÍfl^ JJJJ

К N (|) fi H H E N E R E N E I 5 H » F Щ И IB С U TI N Г Г К ГГТЧ 0 К Н I L К Е Л

«WtAMI A.jCAkGCMCAlGAAAAlGAGL^GAGAACGAWTTGCAC^ I ITtAAÚGMMC iUfl

fcEñU>(,VASOH РГТ1 QOEYKlFGAHFRDFgMEeLREHLTCl.lC lQAAüAAA1GGTTlrTAIGGTTKG'CLGGCATGAAA7^TCtMTüAGTATMAATnT1GbAGCCATG11TAGAMlTT10TTMTGAAGOAT7GMC£AACA1CTlACQ7OCl líM^k lffB

Uní III.CI. Arfl >Г., - .. .

E f A S К L I £

FEITEACLKVCOEKFPI

N E N К

F С

A! bCLVW ПААААС^ТД ТСЛАССС'СССГСААААТТЬАПБЛАААТ TT7GA^TLACCGAAOClGM7TAA^CTATOCCAAC^WkAA11CtCAATL7 AC/WVlG/CAl GAA^VXiAI 1CCA 1Ш

К Ь L £ liLLbF'LNIYTCGAVSEOfiAKOFLIFVSKGAI VEYOO GAA/OAT11 AOAOC^tTALTTt^ACCArTA(«7ACJ7ACACAi LIOGTCtOH TAOTGAüíiAlMiai AA ЦМ

!SE6LKhCDtKEHtKDrFKOI©!KTAECMIKBFCHEPQbKC ПОД П TI nQAüGI7AAG7AACAA7777(»flj>GXAA7C7TGATCM7YITQAGOITAAA7At>CAACIT7TljACCT1AlCT7№7t>b^ Tib МЛП

pr vVVf'VSS TAVCIVHatLHVVVKkbLlil' 1 bfr Ь ft'T t, AMfiCM А7П ttftffi7TA10TTTATTATF7707CTCA7CAACACCAtATCAA6TCAAC&CACCC7t^AC7AC7ACTACAAArfyMG^ ДЦВ

I N br rOKLIKVtEAinÜK "> С " в К L И СВ Ю * " * Г V Е Р t А I lAAAlGGCIACTACCAACGAC7CATT^lAGAAGAAfTCATCÍ*^^ {{И

It 1 * s Л К Ь ¡H С/ 1 К i 1> О í Í f

TL I lAANrtOClilCAOCAAAGrCAArtGrijCA JCAAAAITDACCAACTTGAATTC JJJj

R1 <33 R2 P

U l IiiíiiI I

(n=21 1 J (n=13) 3 - AATAAA

¡Igt

TATA

K1

I P6.2

I чЫи

(n=ai

Rt 02

liUllll'

(n=13)

nmuunaog

- 63

103 -155

at 02

P'

f>¡

01.2

-1-1-1-1-1-1-1 i "1 1

200 160 160 UO 120 100 80 60 10 20 O

Рис. 4. Нуклеотидная и выведенная аминокислотная последовательности Фрагмента F6.2 (А), схематическое изображение структуры F6.2 и С1.2 (В), Филогенетическое дерево, построенное на основе сравнения и выравнивания аминокислотных последовательностей, выведенных по соответствующим нуклеотидным последовательностям -а, 0 и . D - величина относительного эволюционного расстояния (Feng е а.,1995).

После индукции ИПТГ электроФоретически по белковому продукту выявляли активность химерного гена. Гибридный белок появлялся только в случае правильной ориентации (5'-3') гена Гб.2а в векторе. Увеличение м.м. белка на 24 ко по сравнению с контролем р-галак-тозидазой, соответствовало м.м. выведенной аминокислотной последовательности, кодируемой областью а .

Таким образом, гибридный ген В-да1-Г6.2а экспрессировался в бактериальных клетках с образованием химерного белка. Этот белок, препаративно выделенный, давал положительную реакцию с антисывороткой против слюнных желез, т.е. относился к классу белков, синтезируемых в этом органе. Далее вставали вопросы об идентификации белка, кодируемого геном Г6.2, в спектре слюнных желез.

3.4. Иммунологический анализ экспрессии гена Г6.2 /33,35,36/

Специфичность антисыворотки,полученной при иммунизации кролика на выделенный и очищенный рекомбинантый белок, предварительно тестировали в контрольных экспериментах. Антисыворотка против гибридного белка, преабсорбированная с р-галактозидазой, интенсивно реагировала с белковой Фракцией с м.м.67 ко как в спектре белков слюнных желез, так и изолированного секрета (рис.5).

1

Рис.5. Электрофореграмма (а) белков сек-V/ рета основной (ш1) и специальной (э!) долей

слюнных желез СЛИиттл и Вестерн-блот (Ь) с 'Ь^ ■ I . _ антисывороткой против гибридного белка.

Г'

При выяснении вопроса о долеспецифичности оказалось, что белок р-67 выявляется как в секрете клеток специальной, так и основной долей (рис.5), т.е. ген Г6.2 экспрессируется во всех клетках железы. Кроме того, с антителами против гибридного белка реагировали секреторные полипептиды эр-180 и зр-150 и дополнительный полипептид ззр-160 (рис.5), хотя и менее интенсивно. Иммунологическое сходство указанных секреторных белков и р-67 возможно свидетельствует о сходных структурных элементах в составе генов, их кодирующих, Важно отметить, что подобного сходства не выявлено с

гигантскими секреторными белками первой группы с м.м. в 1000 КО.

Мы пришли к заключению, что а-элемент фрагмента Гб.2 кодирует часть белка с м.н. 67 кй. в составе секрета и клеток слюнных желез белок р-67 представлен в незначительных количествах, почти не выявляется на электрофореграммах при окраске Кумасси, и поэтому может быть отнесен к минорным компонентам секрета.

Неожиданными оказались последующие эксперименты. Оказалось, что ген Г6.2 проявляет свою активность не только в клетках слюнных желез, но и в других тканях с секреторной активностью на разных стадиях развития - эмбриональной, личиночной, имаго. В белковых спектрах клеток жирового тела, желудка, мальпигиевых сосудах, нейрального ганглия и в гемолимфе антисыворотка против гибридного белка реагировала с р-67 с такой ке интенсивностью, . как и в клетках слюнных желез. Имнуно-дот и Вестерн-блот анализы показали наличие этого белка в гомогенатах яйца, целой личинки и имаго. Белок р-67, кодируемый геном Г6.2, оказался вездесущим.

Электронномикроскопический анализ клеток слюнных аелез, кишечника и мальпигиевых сосудов показал, что р-67 имеет дисперсное распределение в клетке и встречается в цитоплазме и ядре всех клеток, в полости слюнных яелез; с тенденцией к локализации в надменбранном слое секретируюдах органов, дальнейший иммунофер-ментный анализ показал, что белок р-67 не обладает и видоспеци-Фичностью, он обнаружен в составе секрета и слюнных желез 7 видов семейства СЛ/голо/п/сГзе,- 0.те1аподазХег и 0. у/г///а. Однако, поиск гомологии белка р-67 с другими белками разных видов по банку данных, содержащем 3 тысячи аминокислотных последовательностей, не выявил существенного сходства с известными белками.

Совокупность полученных результатов позволяет предположить, что белок р-67 относится к общеклеточным белкам, участвующим в процессе секреции.

3.5. функциональная организация КБа /24,27,34,37/

Суммируя вышеприведенные данные можно прийти к заключению, что кольцо Бальбиани КБа - сложный локус, который содержит, по-крайней мере, три гена, относящихся к разным мультигенным семействам, но,, возможно, связанным единой функцией - процессом секреции.

Исходя из величины гаплоидного генома СЛПитт! - 0.15 пкг (№оЬиз,1975) и общего числа дисков 1920 (Кикнадзе,1981), количество ДНК, приходящегося в среднем на диск, составляет 75 тпн.

Кольцо Вальбиапи, таким образом, может содержать около 150 тпк, что достаточно для кодирования 15 генов размером 10 тпк. Соответственно, обнаружение в составе КБа трех генов, различных повторяющихся последовательностей, мобильного элемента не является удивительным. Выявленная мозаичная структура генов Г6.2 и С1.2, иммунологическое сходство ззр-160 и р-67 позволяют предположить частичную гомологию в их строении, например, наличке в кг: составе а зоны (рис.б), сходной для указанных генов.

Рис.б. Гипотетическая схема Функциональной организации КБа В зависимости от степени деконденсации материала район А2Ь может находится в двух различных транскрипционных состояниях. В случае полной деконденсации материала двух центральных дисков района А2Ь образуется пуф КБа, идет транскрипция комплекса генов, в том числе генов ЭБр-ЧбО и Г6.2, в клетках синтезируются соответствующие белки - секреторный полипептид эзрИбО и белок р-67. Эта ситуация реализуется в клетках специальной доли слюнных желез. В клетках основной доли железы КБа Функционирует на уровне "серого" диска, т.е. слабо деконденсированного материала. В этом случае осуществляется синтез белка р-67, но неактивен ген белка ззр-160.

- 15вкЬ

ге.г

I

4, МОБИЛЬНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ ГЕНО[(А ХКРОКОМГЩ. Мобильные элементы являются важной составной мастью генома эукариот. В геноме хирононид до нашей работы подвижные элементы не были описаны, Известны были лишь короткие последовательности длиной 120 пн, С1а-элементы, представленные в множестве копий в геноме (Schmidt,1934), и обладающих способностью к транспозиции (Schmidt,Hankeln,1989).Нами открыты два типа мобильных элементов НЕС и ТЕС, выявленных первоначально в составе клонированных фрагментов ДНК из тканеспецифических пуфов - КБа и КБс С. thumi.

4.1, Молекулярная характеристика НЕС /23,28,34/ НЕС обнарузен в составе Фрагмента С1.2. Общая его длина составляет 596 пн, содержание AT -TV/.. Тело элемента ограничено двумя совершенными инвертированными повторает по 107 пн, которые, з свою очередь, фланкированы прямыми повторна из 5 пн, представляющими собой миаени-дупликации хозяйской ДНК (рис.7).Инвертированные повторы содержат СААТ и TATA - боксы. Взутрп тэла НЕС выявлены 3 ОРС, перекрывающихся между собой. Перечисленные свойства НЕС сходны с известными для транспозабельных элементов эукариот и указывают на его инсерционную природу. Кроме того, из геномной библиотеки C.thummi был шделен клоп 20D, содераащиЯ ген С1.2 без НЕС.

J ТАГА СААТ

ТЕС |?ьь

pATTTATC TJTTTATCj

1С AAÇGCCAT АСА АСТСС -GO ASTTCTAT0GCCTTC|

Рис,7. Мобильные элементы НЕС и ТЕС генома хироноиид.

4,2. Хромосомная локализация НЕС /30,34/ Гибридизация in situ MEC с политенншш хромосомами лабораторных и природных популяций С.thumrni показала его варьирующую локализацию в геноме, суммарно выявлено более 90 сайтов гибридизации в Функционально различных участках хромосом. В их число входят центромерные и теломерные районы, тканеспецифические пуфы. У близкого подвида С. th.pige г общее число сайтов гибридизации с МЕС оказалось в два раза меньше, чем у С. th.thummi. У гибридных личинок этих подвидов по отдельным сайтам выявлено изменение лока-

лизации НЕС по сравнению с паттернами родителей, что возможно связано с транспозицией НЕС между гомологами.

Интересный Факт был обнаружен при изучении хромосомных перестроек в природных популяциях хирономид. Так, гетерозиготность по дискам в районе Clh-j хромосомы II С. îh. thummi, проявляющаяся в их разной толщине у гомологов, коррелировала с интенсивностью гибридизации с МЕС. В ряде случаев в этом районе в одном из гомологов наблюдали образование пуфа, в норме не проявляющегося, тогда как на другом гомологе этот район оставался конденсированным. При этом область пуфа оказалась меченной при гибридизации с НЕС. Возможно внедрение НЕС в район Clh-j приводит к активации генетического материала, проявляющейся в образовании пуфа.

4.3. Молекулярная характеристика ТЕС. /34/

В КБс C.thummi,b 3'-фланкирующем районе гена, был выявлен повторяющийся элемент (Baumlein е а,,1986), Нами выделена вторая копия этого элемента, определена его первичная последовательность. Сравнительный анализ этих двух копий позволил установить структуру транспозабельного элемента (рис.7).

Длина ТЕС составляет 1650 пн, содержание AT - 76Z. Элемент фланкирован совершенными инвертированными повторами длиной 17 пн и примыкающими к ним повторами - мишенями из 8 пн. Внутри тела выявлены терминальные блоки повторов по 250 пн и четыре несовершенных инвертированных повтора от 17 до 26 пн, Терминальные повторы составлены из тандемных коротких последовательностей, с консенсусом АСТТТ или с видоизмененной ее формой. Не обнаружено протяженных ОРС, для элемента характерна насыщенность терминирующими кодонами. Обе копии ТЕС очень сходны, различия заключаются в делении 45 пн во второй копии и замене некоторых нуклеотидов.

4.4. Хромосомная локализация ТЕС. /34,37/

Анализ картины гибридизации клона 54L, содержащего ТЕС, с политенными хромосомами показал наличие суммарно около 170 сайтов интеграции ТЕС. среднее число сайтов локализации ТЕС в хромосомах одной личинки варьирует от 40 до 75. Интенсивно метятся при гибридизации районы КБс и КБЬ, а также районы других пуфов. Разные лабораторные популяции различаются по картине сайтов гибридизации. Важно упомянуть, что сравнительный анализ хромосомной локализации НЕС и ТЕС выявил в геноме С. thummi общие и "уникальные" для каждого элемента сайты локализации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ /22,27,34/

Комплексное использование методов цитохимического и гене-тико-Оиохимического анализов позволило установить основные этапы формирования специфического продукта - секреторных гликопро-теинов в клетках слюнных желез двух видов представителей двукрылых - Drosophi1а и Chironomus. На уровне белковых продуктов охарактеризовать организацию и экспрессию генов, контролирующих их синтез. На основе сопоставления временных характеристик и детального анализа изменений в спектре белков слюнных желез D.mela-nogaster предложить интерпретацию сложной картины пуффинга, ранее описанной в литературе (разд. 1.4).

По типу организации (llyin, Georg iev, 1982; Рысков, 1989) структурные гены секреторных белков как DrosophiIа, так и Chironomus можно отнести к уникальным генам, обладающим специализированной Функцией. Они преимущественно экспрессируются в клетках слюнных желез с образованием мажорных белков - главных компонентов секрета. Однако, как показали наши исследования, Формирование секрета - сложный процесс, в который вовлечены не только тканеспецифические гены, но и гены с общеклеточными Функциями, ответственные за синтез белков - минорных компонентов секрета. Наличие минорных компонентов в составе секрета слюнных желез отмечено в ряде работ (Wobus е а.,1972; Grossbach,1974; Korge,1975; Bianchi.Terra,1975; Beckendorf.Kafatos,1976), хотя авторами учитываются только основные компоненты. Но при оценке и характеристике генов, вовлеченных в реализацию специфической Функции это обстоятельство представляется важным. Один из таких генов был обнаружен нами в составе клонированных Фрагментов ДНК тканеспецифического пуфа КБа С. thummi. Продукт активности этого гена был выявлен в составе секрета слюнных желез Chironomus а Drosophi Ia, a также в других тканях личинок хирономид с секреторной активностью на разных стадиях развития, то есть этот белок оказался вездесущим. Поца неизвестна Функция этого белка, но в настоящее время известны, например, "консервативные" гомео-боксы, играющие важную роль в развитии и обнаруженные у столь далеких в эволюционном плане видов, таких как дрозофила, мышь, человек (Lawrence,1981; McGinnis, Garber,(984; Gehring, 1985), В связи с этим, выяснение в дальнейшем функционального значения гена р-67 может иметь более общий характер и быть важным для по-

нимания процессов секреции в клетках эукариот.

На модели тканеспецифического пуфа КБа С. thummi проведено изучение молекулярно-цитологической организации отдельных локу-сов политенных хромосом. Также как и другие кольца Бальбиани хирономид (Pustell е а.,1984; Wieslander е а.,1986; Digman, Case, 1989), КБа оказался сложноорганизованным локусом. В его составе выявлены гены, относящиеся к различным мультигенным семействам, повторы, мобильный элемент. Предложенная на основе полученных данных модель Функциональной организации КБа (разд. 3.5) согласуется с данными о сложном информационном содержании хромомеров политенных хромосом (Zhimulev,1982; Semeshin е а.,1989) и различных уровнях транскрипционной активности хромомеров (Беляева,1982; Барский,1986)

функциональное значение присутствия мобильных элементов (НЕС и ТЕС) в кольцах Бальбиани пока остается неясным. Не известен также механизм их транспозиции. Представляют ли обнаруженные мобильные элементы делетированные варианты более крупных по размеру элементов, способных обеспечить собственную транспозицию или относятся к классу пассивных мобильных элементов (Георгиев,1939), использующих для перемещения Ферментные системы других транспозо-нов - вопрос требующий дальнейших экспериментов.

В большинстве случаев внедрение транспозонов ведет к возникновению мутаций и нарушению активности структурных генов (Green, 1980; Gvozdev е а.,1981; Finnegan, Fawcett,1986; Чуриков,1988). Л.И.Корочкиным (1986) высказано интересное предположение о возможной роли повторяющихся элементов генома, включая мобильные диспергированные гены, в регуляции тканеспецифичности проявления различных генов. В нашем случае наличие в инвертированных повторах НЕС сигнальных сайтов промоторной зоны позволяет предположить, что внедрение НЕС в 5'-область гена может приводить в этом случае к его активации и сам НЕС, таким образом, может действовать как регу-ляторный элемент.

ВЫВОДЫ

1. Специфической чертой дифференцировки слюнных желез Drosophila является образование гликопротеинов, секретируемых в конце 3 возраста личинки и в течение предкуколочной стадии развития. Установлено два пика увеличения гетерогенности белкового состава слюнных желез; первый совпадает с завершением

процесса образования секрета у личинки, второй соответствует стадии предкуколки 6-9 часов. Отмеченные изменения в белковом спектре коррелируют с картиной пуффинга, описанной в литературе и связаны со сменой функциональной активности слюнных желез в ходе метаморфоза.

1.1. Формирование специфического продукта слюнных желез личинки D.melanogáster начинается с синтеза матричных РНК, обладающих стабильностью в начале 3 возраста, первые гранулы секрета и 1ИК-положительные Фракции появляются в клетках дис-тального отдела в середине 3 возраста, накопление ШИК-положительного материала завершается его выводом из клеток в полость железы незадолго до образования пупариума. За этот период содержание общего белка в слюнных железах увеличивается в 5 раз, доля белков, секретируемых железой, составляет не менее 30Z от количества общего белка железы. Изолированный секрет представляет собой электрофоретически гетерогенную смесь гликопротеи-нов и белков. При определении числа генов, контролирующих тка-неспециФическую Функцию слюнных желез личинки, необходимо учитывать, что образование секрета - сложный процесс, в ходе которого происходит активация не только структурных генов секреторных полипептидов, но и генов Ферментов углеводного обмена и гликозилирования, а также генов минорных белков секрета.

1.2. На стадии предкуколки слюнные железы обладают новой дополнительной Функцией, заключающейся в образовании секрета "второго" типа, на стадии 6-9 часов предкуколки выявляемого в полости и протоке железы. Сравнительный анализ спектров гли-копротеинов позволил предположить, что образование этого продукта происходит как за счет включения новых структурных генов белков секрета "второго" типа, так и включения части "личиночных" генов секреторных белков.

2, в ходе изучения генов, контролирующих тканеспециФическую Функцию слюнных желез D.virilis, впервые описан полиморфизм по основным белковым компонентам секрета у 35 линий и 12 видов группы vir i lis. Из Э спектров секрета два оказались характерными для 21 из 35 изученных линий D.virilis. В составе секреторных белков spl-5 D.virilis выявлены "консервативные" (без электрофоретических вариантов) и полиморфные компоненты, обнаружены линии с "О" вариантом по Фракции sp-4. Определены тканевые и

онтогенетические характеристики Формирования спектра секрета.

Представители Фклады montana обладают более разнообразными спектрами секрета в сравнении с "примитивным" видомР.vi г i lis.

2.1. Генетический анализ показал аутосомный кодоминантный характер наследования для секреторных белков группы lg, состоящей из 2-5 Фракций у представителей разных линий и видов, и сцепленный с полом для секреторных белков sp 1-5. Ген VSP-2, контролирующий синтез секреторного белка sp-2, локализован в положении 144.41 единиц генетической карты Х-хромосомы, ген VSP-5 удален от него на 26.14 единиц карты.

В ходе гибридологического анализа из 276 особей не выявлено рекомбинантов между генами VSP-2 и VSP-4, что указывает на тесное сцепление этих генов.

Структурная организация генов специфической Функции у D.viri-lis несколько отличается от таковой у D.melanogaster, но наблюдаются и некоторые общие закономерности - тк ан е с п е цифич е с кий характер экспрессии, последовательное включение генов в онтогенезе, кластерно-дисперсное распределение семейства в геноме.

2.2. У кеквидоЕьс гибридов D. viriiis ка D.texana в спектре секрета обнаружено появление двух дополнительных фракций, отсутствующих у родителей, что возможно связано с реактивацией "инактивированных" у родителей структурных генов белков секрета при взаимодействии геномов. Показано, что этот феномен определяется взаимодействием только двух Х-хроносом от разных вкдое> не выявлено влияние аутосон.

3. На уровне образования конечного продукта изучена тка-неспецифическая Функция и внутриорганная специализация клеток слюнных желез C.thummi. Охарактеризованы мажорные белковые компоненты секрета, которые подразделяются на две группы: а) белки с м.н. около 1000 KDa, б) пять белков с м.к. от 15 до 180 kO - sp-180,-150,-36,-18,-16. Кроме того,в состав секрета Входят минорные компоненты (например р-67), не проявляющие тканевой специфичности.

3.1. Установлена корреляция между активностью кольца Бальби-ани КБа, образующегося только в 4-х клетках специальной доли слюнных желез и преимущественным синтезом и гликозилированием в этих же клетках полипептида ssp-160.

Пептидное картирование позволило выявить сходные и уни-

кальные пептиды для трех компонентов секрета зр-180, зр-150 и ssp-160, что может свидетельствовать о частичной гомологии этих белков и, соответственно, о наличии сходных структурных элементов в генах их кодирующих.

4. Гибридизацией in situ с политенными хромосомами проведено картирование более 20 клонированных Фрагментов ДНК микробиблиотеки участка А1-2 хромосомы IV С. thummi. Исследованные клоны различаются по числу и интенсивности мест гибридизации: выделены клоны,гибридизующиеся только с одним или двумя районами, и клоны, имеющие дисперсную локализацию на всех четырех хромосомах. Выявлены клоны, локализованные в функционально важных районах хромосом, таких как пуфы, теломеры и центромеры, что является предпосылкой для изучения их молекулярной ор- . ганизации.

Идентифицированы клоны (C1.2,F6.2), гибридизующиеся in situ боковыми петлями транскрипционно активного пуфа КБа.

5. определена первичная последовательность клонов F6.2 и С1.2 общей длинной более 4 тпн. В их составе выявлены два сходных по строению и нуклеотидной последовательности гена мозаичного типа, псевдоген, прямые и инвертированные повторы.

6. Сконструированный гибридный ген p-gal/F6.2a экспресси-ровался в бактериальной системе с образованием химерного белка. Вестерн-блот анализ показал, что ген F6.2 кодирует белок р-67, являющийся минорным компонентом секрета. Кроме слюнных желез белок р-67 обнаружен в ряде тканей личинки с секреторной активностью (кишечник, жировое тело и др.) и на разных стадиях развития, т.е. экспрессия гена не носит органоспецифический характер.

Показано, что белок р-67 не обладает и видоспецифичностью, он обнаружен в составе секрета слюнных желез 7 видов семейства Chironomidae, D.melanogaster и D.virilis.

Высказано предположение, что р-67 относится к общеклеточным белкам, участвующим в процессе секреции.

7. Предложена модель структурной и функциональной организации КБа, согласно которой КБа представляет собой сложный ло-кус, содержащий, по крайней мере, три гена, относящихся к разным семействам (Ssp-160 и F6.2, С».2). Возможны два состояния активности района КБа. Первое реализуется в клетках специфической доли с образованием пуфа КБа и синтезом двух белков sp-

160 и р-67, второе - в клетках основной доли, в которых транскрипционная активность КБа проявляется на уровне "серых" дисков и синтезируется р-67,' а ген белка ssp-160 остается в конденсированном состоянии и неактивен.

S. В геноме хирономид впервые описаны два новых мобильных элемента, МЕС - длиной 600 п.н. и ТЕС - 1700 п.н. Установлена их молекулярная структура и хромосомная локализация.

Характерной особенностью НЕС и ТЕС является наличие на их концах инвертированных повторов размером 107 и 17 п.н. соответственно. НЕС обнаружен в пуфе КБа и в 90 сайтах генома, ТЕС встречается в КБс, КБЬ и в 70 локусах политенных хромосом. Выявлены общие и специфические сайты их локализации.

По теме диссертации опубликовано 47 работ, из них основные:

1. Колесников Н.Н., Слободянюк С.Я., Бердников В.А., Кикнадзе И.И. ЭлектроФоретический анализ белков слюнных желез и жирового тела Drosophila те!anogaster в развитии //Докл.АН СССР.-1975.-Т.225.- N 1.- С.201-204.

2. Колесников Н.Н., Жимулев И.ф. Синтез мукопротеинового секрета в слюнных железах Drosophila melanogaster в течение III личиночного возраста //Онтогенез.-1975.-Т.6.-N2.- С.177-182.

3. Кикнадзе И.И., Колесников Н.Н., Лопатин О.Е. Хирономус Chironomus thummi Kieffer (лабораторная культура) //В кн.: Объекты биологии развития. Н:Наука.-1975.-С.95-127,

4. Химулев И.ф,, Колесников Н.Н. Нетоды отбора синхронно развивающихся личинок Drosophila melanogaster // Онтогенез,-1975.-Т.6.-С.635-639.

5. Zhimulev I.F., KolesniKov N.N. Synthesis and secretion of imjcoprotein glue in the salivary gland of Drosophila melanogaster //Withelm Roux'Archiv.-1975.-V.178.-P.15-28.

6. Kolesnikov N. N., Kiknadze 1.1, secretory protein of the salivary gland of Drosophila melanogaster during metamor-Phjsis //Abstracts of the 5th European Drosophila Research Conference.-Lou ivai n-La-Neuve,-1976.

7. Kolesnikov N. N., Zhimulev I.F. Synthesis of mucoprotein secretion in salivary glands of Drosophila met anogaster III instar larvae //The Soviet Journal of Developmental Biology. -1976.-V.6.-N2.-P.140-146.

8. Колесников Н.Н., Слободянюк С.Я., Бердников В.А., Кикнадзе И.И. Сравнительный электрофоретический анализ белков различных тканей Drosophi la melanogaster //Цитология.-1976.-Т.18.-N7.-С.862-870.

9. Колесников Н.н., Кикнадзе И.И. Белки секрета слюнных желез Drosophila //докл. АН СССР.-1976.- Г.229.-N4.-С.980-982.

10. Колесников Н.Н., Слободянюк С.Я., Кикнадзе И.И. функциональная активность слюнных желез Drosophi1а те!anogaster в ходе метаморфоза: сравнительный электрофоретический анализ белков слюнных желез, жирового тела и гемолимфы // Онтогенез. -1976.-Т.7.-N6.- С.547-557.

11. Колесников Н.Н, Синтез секреторных белков в ходе диФФеренци-ровки слюнных железDrosophila melanogaster//Тезисы докладов XIV Иеждунар.генетич.конгресса.-Москва,-1978.-Ч.1.-С.585.

12. Кикнадзе И.И., валеева Ф.С., Власова И.Е., Панова Т.М., Себе-лева Т.Е., Колесников Н.Н. Пуффинг и специфическая функция клеток слюнных желез Chironomus thummi.1.Количественные изменения белка и гликопротеинов в слюнной железе на разных стадиях развития личинок //Онтогенез.-1979.-Т.10.-С.161-172.

13. Kolesnikov N.N., Aimanova K.G. Genetical and biochemical analysis of secretory proteins of the salivary glands of Drosophila virilis //Abstracts of the 7th European Drosophila Research Conference.- Oula,FinI and.-1981.-P.65.

14. Kolesnikov N.N. The organization and expression of genes control ing the synthesis of secretion glycoprotein in Drosoptii la salivary glands //Abstracts of 4th Symposium USSR-FRG Structure and Transcription of Genome.-Yerevan.-1981.- P.72-73.

15. Kolesnikov N. N., Karakin I.E., Sebeleva Т.Е., Meyer L., Serfling E, CelI-specifiс synthesis and glycosylation of secretory proteins in larval salivary glands of Chironomus thummi //Chromosoma.-1981.-V.83.-P.661-667.

16. Себелева Т.Е., Колесников Н.Н., Кикнадзе И.И. Сравнительный анализ белков секрета клеток слюнной железы личинок Chironomus thummi, различающихся количеством колец Бальби-

. ани //Докл. АН СССР.-1981.-Т.256.-N4.-С.975-978.

17. Kolesnikov N. N,, Aimanova K,G., Pereligina L.M. Genetic and biochemical analysis of the tissue-spesifiс function of Drosophila virilis salivary glands //Abstracts of International

Symposium Organization and Expression of Tissue-specific Genes.-Novosi birsK.-1982.-P.35.

18. Sebeleva Т.Е., KolesniKov N.N., Karakin E.I., Kopantzev E.P., Kiknadze I.I. A comparative characteristics of the tissue-specific function of the cells in larval salivary glands of Chironomus thummi differing in the number of Balbiani rings //Abstracts of International Symposium Organization and Expression of Tissue-specific genes.-Novosibirsk.-1982.-P.59.

19. Колесников H.H., Кикнадзе и.И., Панова Т.Н., Захаренко Л.П. Блинов А.Г., Байбородин С.И., Христолюбова Н.Б. Микроклонирование ДНК специфических районов политенных хромосом Chironomus thummi //Труды 111 национальной конференции по цитогенетике.-Пловдив, Болгария.-1984.-Т.1.-С.211-214.

20. Zainiev G.A., Baumlein Н., Wobus и., KolesniKov N.N., Kiknadze I.I., Panova Т.Н., Zacharenko L.P., Blinov A.G. Microdissection and cloning of DNA from specific region of Chironomus thunmi polytene chromosomes // Abstracts of the 16 FEBS Conference.-Moskow.-1984.-P.256.

21. Зайниев Г.А., Баумляйн X., Вобус У., колесников Н.Н., Кикнадзе И.И., Захаренко Л.П., Панова Т.Н., Блинов А.Г. Микроклонирование ДНК района А1-2 хромосомы IV Chironomus thunmi, содержащего кольцо Бальбиани КБа // Цитология.-1985.-Т.-27.-N5.-С.528-534.

22. Кикнадзе И.И., Колесников Н.Н., Каракин Е.И., Кокоза В.А., Копанцев Е.П., Себелева Т.Е., Щербаков Д.ю., Зайниев г.А., Агапова О.А., Айманова К.Г. Организация и экспрессия генов тканеспецифической функции у Diptera //Новосибирск.- Наука - 1985.- С.1-237.

23. Богачев С.С., Блинов А.Г., Блинов В.М., Гайдамакова Е.К., Колесников Н.Н., Кикнадзе И.И., Шахмурадов И.А. Некоторые структурные элементы последовательности ДНК из района кольца Бальбиани (КБа) хромосомы IV Chironomus thummi // Докл. АН СССР.-1986.-Т.288.-N1.-С.230-233.

24. Kiknadze I.I., Sebeleva Т.Е., Istomina A.G., Panova T.M., KolesniKov N.N. A comparative study of the Balbiani Rings and the secretory functions of the salivary glands of genus Chironomus //Acta Biol. Hung.-1986.-V.37.-P.23.

25. KolesniKov N.N., Bogachev S.S., Blinov A.G., GaidamaKova

Е.К., Fedorov S.P., Kiknadze I.I. The molecular-cytologi-cal organization of the tissue-specific puff BRa 'in Chironomus thummi //Acta Biol. Hung.-1986.-V.37.-P.Zli

26. Колесников H.H., Кикнадзе И.И., Богачев с.с,, Блинов А.Г., Панова Т.Н., Гайдамакова Е.К., Федоров С.П., Собанов Ю.В., Шахиурадсв И.А., ЧекаевН.А., Назаренко И.А. ¡Нолекулярно-цитологические подходы в изучении специфических локусов политенных хромосом //В сб.: "Эволюция, видообразование и систематика хирономид".-Новосибирск.-1986.-С.146-156.

27. Колесников Н.Н., Кикнадзе И.И., Блинов А.Г., Богачев С.С., Блинов В.Н., Гайдамакова Е.К., Собанов Ю.В., Панова Т.Н., Федоров С.П., Шахмурадов И.А. Нолекулярно-цитологическая организация участка A2D хромосомы IV Chironomus thurni // Тезисы VI Всесоюзного симпозиума "Нолекулярные механизмы генетических процессов".-Носква.-1987.-с.30-31.

28. Колесников Н.Н., Блинов А.Г., Богачев С.С., Гайдамакова Е.К., Панова Т.Н. Мобильный элемент генома хирономид // Тезисы докладов 5 съезда ВОГИС им. Н.И.Вавилова.- Носква.-1987.- Т.6.- С.47-48.

29. Богачев С.С., Блинов А.Г., Колесников Н.Н., Блинов В.Н., Федоров С.П., Гайдамакова Е.К., Панова Т.Н., Кикнадзе И.И. Анализ последовательности ДНК из тканеспецифического пуфа КБа Chironomus thurni //Докл. АН СССР.-1987.- Т.296.- N6.-С.1473-1476.

30. Кикнадзе И.И., Колесников Н.Н., Панова Т.Н., Гайдамакова Е.К., Блинов А.Г., Филиппова Н.А. Нобильные генетические элементы генома хирономид. Сообщение 1. Локализация клона Р Cth С1.2 HR в политенных хромосомах подвидов Chironomus thummi thummi Kieffer, Chironomus thummi piger Strenzke и их гибридов //Генетика.-1987.-Т.23.-N8.-С.1366-1376.

31. Aimanova K.G., Pereligina L.M., Kolesnikov N.N. A biochemical analysis of the salivary gland secretory glycoproteins of Drosophi la virilis //Dros. Inform. Serv. -1987.

-V.66.-P.1-3.

32. Aimanova K.G., Pereligina L.M., Kolesnikov N.N. A genetic analysis of the tissue-specific salivary gland secretion proteins of Drosophila virilis // Dros. Inform. Serv.-1987.-V.66.-P.3-5.

/

33. БогачевС.С., ЩербккС.В., Тараннн А.В., Себелева Т.Е., Бай-Сородин С.И., Колесников Н.Н. Ген, локализованный в кольце БальСиани КБа, кодирует синтез белка с мол.массой 67 ООО // В сб.: Теоретические исследования и банки данных по молекулярной биологии и генетике.- Новосибирск.- 1988.- С.94-95.

34. кикнадзе И.И., Блинов А.Г., Колесников Н.Н. Нолекулярно-цито-логическая организация генома хирономид //В кн.¡Структурно-Функциональная организация генома.-Новосибирск.-Наука.-1989. -С.4-58.

35. Колесников Н.Н., Кикнадзе И.И., Блинов А.Г., Богачев с.С., Щербик С.В., Гайдамакова Е.К., Собанов Ю.В. Семейство родственных генов и мобильный элемент кольца Бальбиани КБа Chironomus thummi //Тезисы VIII двустороннего симпозиума СССР-ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов".-Иркутск.-1989.-С. 72-73.

36. В1inov A.G., Bogachev S.S., Scherbik S.V., Kolesnikov N.N., Kiknadze I.I. Structural elements of the tissue-specific puff BRa of Chironomus thummi and their functional significance //Abstracts of the 11th Nuclear workshop.-Suzdal.-1989.-P.59.

37. Kiknadze 1.1., Kolesnikov N.N., Bl inov A.G., Bogachev S.S, Panova Т.н., Istomina A.G. Homology of the Balbiani rings in some species of the Chironomus genus //Abstracts of the 11th Nuclear workshop.-Suzdal.-1989.-P.109.

38. Kiknadze 1.1., LopatinO.E., Kolesnikov N.N., Gunderina L.I. The midge Chironomus thummi // In: Animal Species for Developmental Studies.- Plenum Press.- 1990.- V.I.-

P. 180-213,