Исследование молекулярных механизмов функционирования продуктов гена trithorax в регуляции тканеспецифической экспрессии генов у Drosophila melanogaster

Тиллиб, Сергей Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование молекулярных механизмов функционирования продуктов гена trithorax в регуляции тканеспецифической экспрессии генов у Drosophila melanogaster
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование молекулярных механизмов функционирования продуктов гена trithorax в регуляции тканеспецифической экспрессии генов у Drosophila melanogaster"

Учреждение Российской академии наук Институт биологии гена РАН

На правах рукописи

Тиллиб Сергей Владимирович

Исследование молекулярных механизмов функционирования продуктов гена ШЬогах в регуляции тканеспецифической экспрессии генов у ОгозорЫ1а те1аподаз1ег

Специальности:

03.01.03 - молекулярная биология и 03.01.07 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2011

2 1 АПР 2011

4844233

Работа выполнена в Университете Томаса Джефферсона (Филадельфия, США) и в Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН (ИБГ РАН)

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Чуриков Николай Андреевич Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, г. Москва

чл.-корр. РАН, доктор химических наук, профессор Габибов Александр Габибовнч Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г. Москва

доктор биологических наук Томил и н Алексей Николаевич

Учреждение Российской академии наук Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, г. Москва

Защита состоится 28 апреля 2011 г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН (ИБГ РАН) по адресу: 119334 г. Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991 г. Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан 28 марта 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета канд. фарм. наук

ГрабовскаяЛ.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

Данная работа посвящена очень актуальной в последние годы теме молекулярной и клеточной биологии - эпигенетической регуляции активности тканеспецифических генов в процессе развития. Особый интерес в этой связи связан с белками группы Поликомба (PcG, Polycomb Group) и группы Триторакса (trxG, trithorax Group). Эти белки, первоначально описанные у дрозофилы, являются консервативными хромосомными факторами, которые, находясь в составе многокомпонентных комплексов, поддерживают задаваемое на самых ранних этапах эмбрионального развития тканеспецифическое распределение активного или репрессированного состояния многих генов-мишеней (в частности, гомеотических генов) путём поддержания соответственно «открытой» или «закрытой» их локальной хромосомной структуры. Нарушение регуляции генов этих групп (trxG, PcG) ведёт к потере «клеточной памяти», аберрантной клеточной пролиферации и злокачественному перерождению клетки. Эти факторы играют важную роль в таких разнообразных эпигенетических процессах, как плюрипотентность и пластичность стволовых клеток, геномный импринтинг и инактивация Х-хромосомы.

Интерес к генам и белкам групп Триторакса и Поликомба особенно усилился несколько лет тому назад, когда была обнаружена непосредственная связь данных хромосомных белков с энзиматическими активностями, модифицирующими гистоны и структуру нуклеосом. Так, например, белок TRX и его гомолог у млекопитающих, протоонкоген MLL (ALL1, HRX), обладают гистон-метилтрансферазной активностью, за которую отвечает высококонсервативный SET-домен. Этот домен специфически метилирует лизин 4 гистона НЗ, что является эпигенетическим маркером, типично ассоциированным с транскрипционно активным хроматином.

участков ДНК на сегодняшний день остаётся довольно запутанным: "довольно протяжённый без чётко выраженных краёв элемент, чья функция зависит от множественных кооперативно работающих суб-элементов". Эти «модули клеточной памяти» обычно непосредственно соседствуют с энхансерными и репрессорными элементами, или даже включают их в свой состав. Интересные, но пока противоречивые данные были получены недавно о связи этих элементов с районами транскрипции некодирующих регуляторных РНК, о возможной связи PRE/TRE с системами транскрипционной интерференции или транскрипционной активации/репрессии близко расположенного промотора гена. Принципиальная сложность изучения этих элементов связана с тем, что их активность проявляется только в контексте развития и зависит от конкретного типа ткани/клетки. Большая часть сведений о PRE/TRE была получена при функциональном изучении in vivo всего нескольких генетических локусов, что, очевидно, недостаточно. При этом не было выявлено протяжённых гомологичных последовательностей или каких-то воспроизводимых выраженных структурных особенностей. Большинство Pc-G/trx-G - белков, по-видимому, не способны связываться со строго специфической последовательностью ДНК. Некоторые белки (PHO/PHOL, GAGA factor, Zeste, Pipsqueak, Dspl, Grainyhead/Elf, Spl/KLF) в разной мере обладают подобной активностью. Эти белки, очевидно, участвуют в каких-то элементах процесса связывания регуляторных белковых комплексов с определёнными участками ДНК, однако, только участием этих белков объяснить процесс специфического узнавания не удаётся. Предполагается, что TRE и PRE в данном гене в значительной степени колокализуются и функционируют взаимоисключающе, в зависимости от типа клетки.

Исторически большинство исследователей эпигенетической регуляции уделяли большее внимание механизмам репрессии генов, считая поддержание их активности пассивным процессом. В настоящее время происходит заметный пересмотр такого одностороннего представления. Накапливается все больше веских аргументов об активной природе эпигенетически регулируемого поддержания активной экспрессии многих важных регуляторных генов. Именно исследованию экспрессии и механизмов функционирования продуктов одного из главных факторов поддержания тканеспецифической активности генов, гена trithorax, и посвящена данная работа.

Цели и задачи исследования.

Цель работы заключалась в изучении экспрессии и молекулярных механизмов функционирования продуктов гена trithorax.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить ряд следующих задач.

Изучить структуру и распределение в эмбрионах Drosophila melanogaster на разных стадиях развития транскриптов гена триторакс (trx).

Исследовать структурно-функциональные особенности основных белковых продуктов (TRX) гена trx.

Провести определение и сравнительный анализ первичных структур гена trx и соответствующих альтернативных транскриптов у наиболее эволюцношю удаленных видов Drosophila: D.virilis и D.melanogaster.

Исследовать взаимодействия TRX с другими ядерными компонентами, в первую очередь, с белковыми продуктами других генов группы Триторакса. Исследовать на модельных системах хромосомные регуляторные элементы, необходимые для функционирования Триторакс-ассоциированной системы поддержания заданного уровня тканеспецифической транскрипции соответствующих регулируемых генов-мишеней.

Предложить новые подходы для исследования in vivo функционирования Триторакс-ассоциированной регуляторной системы и других подобных регуляторных белков.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Определена структура и локализация в эмбрионах на разных стадиях развития альтернативно сплайсируемых транскриптов гена trithorax (trx) Drosophila melanogaster.

2. Детектированы соответствующие альтернативным транскриптам основные белковые изоформы Триторакса (TRX). Установлено, что TRX является ядерным белком, и способен связываться с определенными участками политенных хромосом слюнных желёз.

3. Проведен сравнительный анализ первичной структуры гена trx и соответствующих альтернативных транскриптов у Drosophila virilis и у Drosophila melanogaster. Выявлена высокая консервативность как структуры этого гена, так и распределения его транскриптов в эибриогенезе.

4. TRX и ASH1, продукт другого гена группы Триторакса, непосредственно взаимодействуют, и их участки связывания с политенными хромосомами совпадают или находятся в непосредственной близости друг от друга.

5. Исследован ш vivo регуляторный элемент PRE/TRE из дальней промоторной области гена Ultrabithorax. Выявлена необычно сложная его структура, состоящая из многих функционально значимых участков, способных взаимодействовать с белками и активационной и репрессионной систем.

6. Определена локализация и продемонстрирована функциональная значимость in vivo нового регуляторного элемента (TRE), необходимого для TRX-зависимого поддержания экспрессии гена fork head в клетках слюнных желёз личинки дрозофилы.

7. Проведено крупномасштабное исследование изменений транскрипции генов человека (на микрочипах фирмы Аффиметрикс) в случае лейкемий с хромосомными нарушениями, затрагивающими ген ALL1/MLL1 (гомолог дрозофилиного TRX). Выявлены гены, которые могут быть непосредственно вовлечены в онкогенез. Полученные результаты демонстрируют наличие характерного рисунка транскрипционной активности генов в ALLI-ассоциированных опухолях.

8. Показано, что белок Триторакс (TRX) может быть выявлен в ассоциации с не хромосомными элементами ядерного скелета. Получены данные о колокализации TRE со скаффолд/матрикс-ассоциированными участками хромосом.

9. Разработан новый подход к исследованию клеточных компонентов (в том числе и пока неизвестных), ассоциированных с определенным белком на примере получения однодоменных мини-антител к компонентам хроматина, ассоциированным с регуляторным белком Триторакс (TRX).

10. Продемонстрирован новый метод наблюдения за антигеном в живых клетках с помощью специально генерированных флуоресцирующих мини-антител.

Научная новизна и практическая ценность работы.

регуляции экспрессии генов теплового шока, г) в работе по крупномасштабному исследованию изменений транскрипции многих тысяч генов человека (на микрочипах фирмы Аффиметрикс) в случае лейкемий с хромосомными нарушениями, затрагивающими ген ALL1/MLL1 (гомолог дрозофилиного TRX), в результате которой были выявлены гены, которые могут быть непосредственно вовлечены в онкогенез. Было установлено, что применяемые ранее условия фракционирования (выделение комплекса ТАС1, Petruk et al., Science, 2001) могут приводить к потере значительной доли TRX вследствие его тенденции к ассоциации с нерастворимыми компонентами ядерного скелета (Лебедева и Тиллиб, Генетика 2003). Более того, подобная ассоциация является, по-видимому, характерной особенностью белков, связанных с системой модификации гистонов (хроматина). Одним из основных инструментов в исследовании белков являются антитела. На протяжении многих лет исследований мы генерировали различные антитела, узнающих разные домены исследуемых белков. Конечно же, в первую очередь, получали антитела к доменам TRX. Эти антитела используются во многих лабораториях мира. Также использовались полученные нами для исследования TRE/PRE конструкции и соответстующие линии трансгенных мух. В последние годы мы уделяли большое внимание разработке и использованию новой высокоэффективной технологии генерирования однодоменных мини-антител. С помощью этой технологии мы разработали новый подход к исследованию клеточных компонентов (в том числе и пока неизвестных), ассоциированных с определённым белком на примере получения однодоменных мини-антител к компонентам хроматина, ассоциированным с регуляторным белком Триторакс.

Совместно с зарубежными коллегами мы разработали новый подход для наблюдения за антигеном в живых клетках с помощью специально получаемых однодоменных мини-антител, соединенных (экспрессирующихся в одной общей рамке считывания) с флуоресцирующим белком. Полученные в настоящее время мини-антитела к различным доменам TRX планируется использовать для получения трансгенных конструкций, экспрессирующих такие мини-антитела, соединенные с флуоресцирующим белком в разных тканях дрозофилы. Мы надеемся, что этот подход позволит изучать процессию" и функционирование белковых продуктов гена trithorax в максимально приближенных к нативным условиях. Полученные результаты используются в курсах лекций для студентов и молодых ученых, в частности на кафедре эмбриологии МГУ им М.В. Ломоносова, на школах по биологии развития.

Апробация работы.

Материалы работы докладывались на различных отечественных и международных конференциях и семинарах, в том числе на международных конференциях по исследованию дрозофилы (Сан Диего, США, 1996, и Питтсбург, США, 2000), на ежегодной конференции Института молекулярной генетики Макса-Планка (Берлин, Германия, 2002), на 6-ой международной конференции им. Энгельгардта (Санкт-Петербург - Москва, Россия, 2003), на конференции ЕМВО «Структура и динамика ядра» (Монпелье, Франция, 2007), на российско-немецком двустороннем симпозиуме «Молекулярная биомедицина» (Санкт-Петербург, Россия, 2008), на XV Школе «Актуальные проблемы биологии развития». (Звенигород, Россия, 2008), на международном симпозиуме «Однодоменные антитела достигли совершеннолетия» (Гент, Бельгия, 2010), отчетных конференциях по программе фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (Москва, Россия, 2005,2007 и 2009), межинститутском семинаре «Хромосома» (Москва, Россия, 2011).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 20 статей в международных и отечественных рецензируемых журналах.

Структура и объём работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, состоящей из 9 тематических глав, каждая из которых включает как раздел описания материалов и методов, так и раздел «результаты и обсуждение», заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 245 наименований. Работа изложена на 233 страницах машинописного текста, содержит 60 рисунков и 9 таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Определение структуры и локализации в эмбрионах Drosophila melanogaster на разных стадиях развития альтернативно сплайсируемых транскриптов гена trithorax (fx).

Предшествующие данной работе предварительные исследования (Northern-гибридизационные эксперименты) показали, что ген trx, по-видимому, кодирует несколько очень длинных мРНК (размером примерно 10-15 т.п.н.), по-разному экспрессирующихся в процессе раннего эмбрионального развития (Mozer and David, 1989; Breen and Harte, 1991). Был получен ряд кДНК, соответствующих некоторым, но не всем, участкам trx мРНК. Эти последовательности кДНК с помощью метода ОТ-ПЦР (RT-PCR) удалось соединить, в результате чего была выявлена гипотетическая очень протяженная открытая рамка считывания (ORF), кодирующая гигантский белок, состоящий из 3759 аминокислот (Mazo et al., 1990).

На начальном этапе данной работы был проведен детальный анализ структур и экспрессии на разных стадиях эмбрионального развития альтернативно сплайсируемых транскриптов гена trx. Полученные результаты суммированы в рисунке 1. 5'-конец Ггх-мРНК был определен в результате применения методов «защиты от РНКазы» (RNase protection) и «удлинения праймера» (primer extension). Выявленное положение начала транскрипции совпало с началами последовательности двух ранее полученных клонов кДНК (Mozer and David, 1989). Для определения положения З'-концов /rx-мРНК был использован метод 3' RACE-PCR (Frohman, 1990). Наши предварительные Норзерн-гибридизационные эксперименты позволили предположить, что З'-конец /гс-мРНК локализуется внутри Xbal-Xhol фрагмента размером 2,2 т.п.н. (рис.1). Мы просеквенировали этот фрагмент геномной ДНК (в то время еще не было данных геномного секвенирования) и на основе полученной последовательности синтезировали несколько олигонуклеотидных праймеров для ПЦР-экспериментов. Секвенирование полученных ПЦР-продуктов позволило выявить два альтернативных 3'-конца Гпг-мРНК: ближний - локализующийся в 154 нуклеотидах от конца белок-кодирующей последовательности, и дальний - в 1732 нуклеотидах от конца белок-кодирующей последовательности. Эти 3'-концы локализуются соответственно в 16 и 32 нуклеотидах от сигнала полиаденилирования (ААТААА). Пять форм /пг-мРНК (М,МЕ,Е1,Е2 и L), образующихся в результате альтернативного сплайсинга, было идентифицировано в результате применения комбинации различных методических подходов: обратной транскрипции, сопряженной с ПЦР-амплификацией, метода «защиты от РНКазы», Норзерн-

гибридизационного анализа. Впервые были детектированы структуры, соответствующие М, МЕ и Е2 РНК (в районе экзонов 1-4), обнаружен ряд ранее неизвестных микроинтронов. Представленные на рис.1 структуры пяти Сгх-мРНК, опубликованные в 1994 году, и на сегодняшний день являются базовой информацией о транскриптах гена ¡гх.

ХЬ Е HN Е НЕ Е

НЕНЕЕ НЕ Mb X Е 1.--, ;I II .■- -1 I_|_

—RNA BU E3

M ATG TAA uir^

О ME ATO TAA llir

см> El ATG ~—■II TAA lllf

Е2 AT& TAA llir

L 1 1 1 ____^ATG f J i TAA inr

,(А)П

. <А)„

.(А)п

.(А)ц

exl

ех2 ехЗ

ех4

probe 2

probe 1

3'end

Рисунок 1. Молекулярная структура /гх-мРНК. В верхней части рисунка показана схема геномной ДНК в районе гена trx (kb - т. н.). Показаны участки расщепления рестрикционными эндонуклеазами Xb, Xbal; Е, EcoRl; N, Ndel; H, HindIII; X, Xhol. B11 (trx^") и E3 (trxFJ) - локализации делеционных мутаций, картированных ранее (Mazo et al., 1990). frxs" - делеция с нарушением рамки считывания («нулевой аллель»); trxE1 - делеция аминокислот 2164-2443 с сохранением рамки считывания. Стрелка под верхней линией указывает на локализацию общего для trx-мРНК участка начала транскрипции, который мы детектировали с помощью методов "защиты от РНКазы" (RNase protection) и «удлинения праймера» (primer extension). (A)n - обозначает два сайта полиаденилирования, которые были определены с помощью метода «З'-RACE». Пять вариантов гга-мРНК были детектированы и проанализированы: М, 10941 н., ME, 12519 н., El, 13519 н., Е2, 12968 н., L, 14205 н. (последовательности этих мРНК были депозитированы в GenBank (регистрационный номер - Z31725). Положение экзонов в кДНК последовательности и размеры мРНК определяли, основываясь на результатах предыдущего секвенирования кДНК (Mazo et al., 1990) и секвенирования полученных в данной работе продуктов RT-PCR. Показаны инициирующий и терминирующий кодоны в каждой мРНК. Микроинтроны обозначены вертикальными линиями. кДНК-пробы, использованные для Northern-blot и in situ гибридизаций показаны в нижней части рисунка. Слева схематически представлены данные по in situ детекции соответствующих írx-мРНК в фиксированных эмбрионах.

Экспрессию пяти различных ?пг-мРНК на разных этапах развития анализировали с помощью Норзерн-блот- гибридизации (рис.2).

embryo (hours) di го CL ■D - 1

ш 1Л о го го GJ

! ^ M т s ; 7 ™ с с _>ч F

о ; m i ^ ц ï - (N1 8 Е <У I ¿J £ 6 2 Е r-l |

I Г1| 1111

общая проба 1

„,1__

-МЕ-

— М-

е/

-L

ехоп 2

ч 1 ехоп 3

Г' |Г! 1 3'end

-ME

И К

-L

-ME

-M

Рисунок 2. Пять ?гх-мРНК (М,МЕ,Е1,Е2 и L, рис.1) экспрессируются в варьирующих количествах на определенных стадиях развития эмбриона. (А) Норзерн-блот-гибридизации с поли(А)+РНК (примерно по 10 мкг на дорожку) из эмбрионов («embryo», показаны временные интервалы сбора эмбрионов на разных стадиях развития в часах; из личинок 1 и 2 стадии («1 instar», «2 instar»); ранней куколки («early pupae»); из взрослых самцов («maie») и самок («female»). Два фильтра (блота) с РНК гибридизовали с Р32-мечеными фрагментами кДНК: с общей (детектирующей все irx-мРНК) пробой 1 (3541-6172 н., согласно нумерации нуклеотидов в fnr-MpHK-L), экзоном 2 («ехоп 2», 888-1096 н.), экзоном 3 («ехоп 3», 11402252 н.) и пробой к З'-концу («3'end», 12718-14145 н.).Гибридизации двух фильтров с контрольной пробой «гр49» (кДНК рибосомного белка 49) были практически идентичны. (Б) Норзерн-блот-гибридизация поли(А)+РНК из эмбрионов отобранных стадий (2-4 часа, 0-1 час, 7-20 часов) и из взрослых мух с Р32-меченным фрагментом кДНК, общей пробой 2, специфической к экзонам 1, 3 и началу экзона 4 (рис.1, «probe 2»), (В) Сравнительная Норзерн-гибридизация поли(А)+РНК из самок двух эволюционно отдаленных видов мух D. virilis (V) и D. melanogaster (M).

Любопытно отметить, что во всех проведенных экспериментах мы наблюдали очень узкий пик экспрессии РНК размером примерно 12-13 т.н. - в период 2-4 часов эмбрионального развития. Этот результат хорошо согласуется с обнаружением характерного рисунка экспрессии /го-РНК на стадии формирования индивидуальных плазматических мембран (стадия целлюляризации, рис. 3). РНК размером примерно 14 т.н. также сначала экспрессируется временно, в период 11-15 часов эмбрионального развития. Эта РНК снова выявляется в большом количестве на стадии ранней куколки, а во взрослых самцах является основным вариантом /гх-РНК. РНК размером примерно 14 т.н. детектируется с примерно одинаковой относительной интенсивностью пробами к экзону 2 и к экзону 3, из чего можно заключить, что это РНК-Ь, которая содержит оба эти экзона. В зоне РНК размером примерно 12-13 т.н. в период 2-4 часов, исходя из различий в относительной интенсивности гибридизационных сигналов при использовании разных проб, можно предположить наличие трех вариантов РНК, МЕ, Е1 и Е2, экспрессирующихся в примерном количественном соотношении 11:3:1. РНК М с примерным размером 10-11 т.н. выявляется только во взрослых самках и самых ранних эмбрионах (0-1 час), что указывает на то, что она является материнской РНК. При использовании в качестве гибридизационного зонда длинного 3'-нетранслируемого участка («З'епё») детектировались все виды /пс-РНК кроме короткой материнской (М).

две

Рисунок 3. Экспрессия ранних /rx-РНК в эмбриогенезе ограничена в пространстве и времени. Гибридизация in situ фиксированных целых эмбрионов, используя дигоксигенин-меченную РНК пробу (соответствующую общей пробе 1, рис.1 и 2) за исключением (Е), где использовали пробу, соответствующую экзону 3. Эмбрионы ориентированы: антериальной стороной - слева, вентральной стороной - внизу. (F) Для определения границ домена экспрессии /rx-РНК на стадии целлюляризации было проведено двойное окрашивание: с антителами анти-ftz и trx РНК-пробой 1.

Из рис. 3 видно, что на стадии ранних делений ядер выявляется равномерное распределение материнских /пг-РНК (рис.3, А). Затем в течение короткого промежутка времени (примерно на стадии 9-10 деления ядер) вообще не детектируется íra-PHK (рис.3, В). Зиготическая экспрессия trx-РНК детектируется на ранней стадии 4 (стадия синтициальной бластодермы; стадии различали согласно Campos-Ortega and Hartenstein, 1985) и локализована (рис. 3, С) в постериальной части эмбриона в вентральной области (соответствует будущей мезодерме). На стадии целлюляризации /nr-РНК экспрессируется как в вентральной области (презумптивной мезодерме), так и в виде четырех полос, перекрывающихся с распределением продуктов «pair-rule» генов, таких как fushi tarazu (ftz) (рис.3, D-F). Причем мажорный тип РНК-ME экспрессируется в основном в вентральной области, тогда как РНК-Е1 - равномерно распределена вдоль всего видимого окрашивания (рис. 3, Е). Антериальная граница экспрессии гпг-РНК на этой стадии соответствует постериальной части парасегмента

5 (между 2 и 3 полосами ftz), а постеральная граница локализуется в парасегменте 13 (между

6 и 7 полосами ftz). Рисунок экспрессии trx-PHK заметно не меняется на стадии начала гаструляции (на рис. 3 показаны латерально (G) и вентрально (Н) расположенные эмбрионы). «Ранняя эмбриональная frx-PHK» также детектируется в мезодерме на стадии удлинения зародышевой полоски (рис.3,1,J)., после чего наблюдается заметное ослабление ее экспрессии. На более поздних стадиях эмбриогенеза наблюдается снова усиление экспрессии уже «поздней эмбриональной trx-РНК» (рис.3, K,L), что согласуется с данными Норзерн-гибридизации (PHK-L, рис.1 и 2).

Известно, что ген trx требуется во время развития для поддержания экспрессии гомеотических генов комплексов bithorax (ВХ-С) и Antennapedia (ANT-C). В соответствии с выявленными паттернами экспрессии trx-РНК можно предполагать, что trx может участвовать в очень ранней регуляции гомеотических генов, экспрессирующихся в постериальном районе эмбриона там же, где и ранние /га-РНК, внутри парасегментов 6-13. Эта локализация совпадает с доменами экспрессии генов ВХ-С. В самом деле, нам удалось показать, что экспрессия генов ВХ-С заметно понижена в сильном frx-мутанте trxBU (рис.1) уже на стадии удлинения зародышевой полоски (рис. 4). Интересно, что экспрессия генов ANT-C локализуется в более антериальной части эмбриона, и лишь на поздних стадиях эмбриогенеза (13-16 часов) можно увидеть ослабление их экспрессии в /гх-мутанте. Более того, в («-мутанте tr/3 (рис. 1) экспрессия генов ВХ-С не изменена, а экспрессия генов ANT-С понижена. Из наших данных можно заключить, что правильная экспрессия генов этих двух гомеотических комплексов поддерживается продуктами различных to-PHK на разных стадиях эмбриогенеза.

гъ.х

abd-A

-ibd-3

Рисунок 4. Экспрессия генов ВХ-С (Ubx, Abd-A и Abd-B а) заметно понижена в mv-мутанте (try?" , А, С, Е) по сравнению с эмбрионом дикого типа (wt, В, D, F) уже на ранних стадиях эмбриогенеза (стадии 10-11).

Исходя из определенной структуры ггх-РНК, мы проанализировали возможные открытые рамки считывания на предмет предсказания белковых продуктов. Различия в кодирующих районах frx-PHK определяются альтернативным использованием экзона 3. Первый AUG-кодон локализуется в начале экзона 3 и может быть использован для инициации трансляции to-PHK El и L. Инициация трансляции irx-PHK М, ME и Е2 может начинаться с первого AUG-кодона, находящегося в 21 н. от начала экзона 4. Оба AUG-кодона окружены последовательностями, которые оптимальны для инициации трансляции (Cavener and Ray, 1991). Проведенный нами анализ кодирующих последовательностей в гене trx из D.virilis показал, что эти два AUG-кодона консервативны между этими двумя видами. Интересно, что альтернативный сплайсинг также обнаружен в N-концевой кодирующей части у белка человека (MLL1/ALL1), являющегося гомологом trx (Domer et al., 1993).

2. Определение и сравнительный анализ первичной структуры и экспресии гена trx у Drosophila virilis и у Drosophila melanogaster.

С целью выявить консервативные элементы структуры и экспрессии гена trx в эпоху до геномного секвенирования была проведена трудоемкая работа по клонированию и ручному секвенированию геномных последовательностей гена ttx из D. virilis наряду с

досеквенированием аналогичных последовательностей этого гена у О. melanogaster (СепВапк-регистрационный номера, соответственно, 250038 и 250152). Выявлена высокая консервативность как структуры этого гена (рис. 5, А,Б), так и распределения его транскриптов в эибриогенезе (рис. 5, В и рис. 2В).

ше1ипо^аыег

те1апо^а51ег

I II ИИИИ1 I 1111 !!■ тнх

, "»= / | \ 3 »

РНО ВЯ РНЭ ТЕ АТ 1 2 МТ \ \ | 3 ЛО_

III 14 11 1 Ш \:л. 1

1.000 г.ооо

Рисунок 5. (А) Дот-плот сравнение 18 т.н. геномной последовательности Ггх из £>. утИх (вертикальная ось) и /гх из £>. melanogaster (от -2,9 т.н. от начала транскрипции и до +23 т.н.; горизонтальная ось). Прямоугольники соответствуют предсказанным белок-кодирующим последовательностям. Положение протяженных сильно гомологичных последовательностей в интронах и З'-нетранслируемой последовательности указано стрелками. (Б) Дот-плот сравнение предсказанных белковых ТЮС-последовательностей для £>. уМНэ (вертикальная ось) и для £>. melanogaster (горизонтальная ось, сверху), а также последовательности человеческого ортолога Триторакса, белка АЬЫ/МЦЛ (горизонтальная ось, снизу). В средней части рисунка представлены результаты сравнения этих белков в виде прямоугольников с указанием консервативных доменов (выделены черным). (В) Экспрессия 1г.х-РНК в эмбрионах £>. уШэ (А, С, Е) так же, как и у В. Ме1апоёа51ег (В, О, Б) локализована в постериальной части презумптивной мезодермы на стадии клеточной бластодермы.

3. Исследование основных белковых продуктов гена триторакс.

В результате большой проделанной работы по получению антител к различным доменам предполагаемого белкового продукта гена ¡гх и по оптимизации Вестерн-блот-процедуры нам впервые удалось детектировать соответствующие альтернативным /ге-мРНК две основные белковые изоформы триторакса, названные ТЯХ I и ТЯХП, с размером примерно 450 и 475 кДа (рис. 6).

N1 Ь: N4 I 1,9 ап!1Ык)у

(ГХ| 240 кРа_Т 200 кРа

{Гх|| 275 к Ра_У 200 к Па

ЕЗ

N1 Ь2 N4 М1+Н4 Ь9 L2+N4

ЕЗ »1 ЕЗ »1 ЕЗ %И от В11 В11 ж! \1| 8-20 0-7

Рисунок 6. Детекция белковых продуктов гена (гх в эмбриональных экстрактах. (А) Схема идентифицируемых белковых продуктов гена ¡гх. N1, Ь2, N4, Ь9 обозначают локализации белковых доменов, к которым получали соответствующие антитела. ЕЗ и черный прямоугольник обозначают локализацию белкового домена в 280 аа, делетированного в Шсз. Стрелка показывает, что специфическое расщепление обеих белковых изоформ происходит внутри участка, делетированного в /гхд1.

(Б) Серия фильтров, полученных в результате Вестерн-блот-анализа белков из эмбриональных (тотальных или ядерных) экстрактов. Для детекции ^-белков использовали поликлональные кроличьи аффинно очищенные антитела N1, Ь2, N4, Ь9 в разведениях 1:200-1:400. (ЕЗ) Ядерные экстракты из эмбрионов, собранных из гетерозиготных мух, содержащих мутацию т^3; (\\Т, левая панель) ядерные экстракты из эмбрионов дикого типа; (В11) тотальные экстракты, приготовленные из специально отобранных гомозиготных по мутации ¡гх " эмбрионов; (\у1, правая панель) тотальные экстракты из гетерозиготных /гхв" эмбрионов, отобранных в том же, что и гомозиготные мутанты, эксперименте. С целью увидеть большие белковые изоформы с помощью Ь9 антител было нанесено в 10 раз большее количество экстракта (и^, вторая из двух справа). Фильтр Ь2+Ш показывает разницу в количестве /га-белковых изоформ в ранних (0-7 ч) и поздних (8-20 ч) эмбрионах. В соответствиями с данными альтернативного сплайсинга в ранних эмбрионах мажорной является изоформа ТЯХ1, а в поздних - ТКХН.

С помощью полученных и охарактеризованных на специфичность анти-ТЯХ антител было установлено, что ТЮС является ядерным белком и способен связываться с определенными участками политенных хромосом из секреторных клеток слюнных желёз личинок 3-ей стадии (рис. 7). Мы прокартировали 16 мажорных сайтов связывания ТЮ( (рис. 7, Б), многие из которых близко локализуются с сайтами связывания нескольких белков группы Поликомба. Следует заметить, что эти первые окрашивания хромосом проводили еще до использования флуоресцирующих белков, использование которых впоследствии позволило заметно повысить чувствительность метода и выявить большее число сайтов связывания ТЯХ.

m Mte Pc G and zeste sucs

ID Pc ph Pic

4C Pc ph Psc' Su z

?B Pc pli Psc Su z 22F/23A Psc • Su z

29E Pc ph Pic" Su

49EF Pc ph Psc Su z"

56C Pc ph Psc Su z '

ЮК/Ъ Pc ph Pic• z

(WA/B Pc ph Psc Su z"

KSE1 Pc

IWO'DJ Pc ph

ЮЛ1) Pc ph Psc• Su z•

Рисунок 7. Иммунное окрашивание с помощью анти-TRX антител препаратов политенных хромосом из личинок мух дикого типа. Стрелка указывает на один из сильных сигналов связывания TRX, соответствующий цитологичекой локализации гена fork head (fkh, 98D1). Справа приведена таблица с картированными сайтами связывания TRX («trx site») и некоторых белков группы Поликомба («Pc-G and zeste sites», из работ ряда других авторов).

Интенсивность связывания TRX заметно ослабевало в личинках несущих мутации (использовали температурочувствительные мутации) в другом гене группы Триторакса, ash-1, и ослабевало в несколько меньшей степени в личинках с мутацией в гене E(z) группы Поликомба, что может указывать на взаимодействие белковых продуктов этих генов, которое способствует связыванию с этими хромосомными сайтами.

Сильный сайт связывания TRX был локализован в области регион-специфического гомеотического гена fork head (Jkh), не входящего в гомеотические комплексы. Последующий анализ связывания TRX с помощью трансгенов, содержащих фрагменты гена fkh, которые достаточны для выраженной экспрессии с его промотора в трансгене репортерного reHa(lacZ), показал, что 8,4 т.н.-расширенная промоторная область этого гена

достаточна для связывания TRX (рис. 8, А) и для поддержания экспрессии в нескольких эмбриональных и личиночных тканях, включая слюнные железы. Экспрессия эндогенной Д/г-мРНК сильно ослабляется в мутантных по trx эмбрионах и тканях личинки (например, в слюнных железах), как видно на рис.8, Б. Эти результаты указывают на то, что белковые продукты гена trx (TRX) поддерживают экспрессию генов-мишеней посредством взаимодействия с регуляторными участками этих генов (эти участки можно обозначить как «TRE», «trithorax response element»).

Рисунок 8. (А) Детекция нового участка связывания ТЯХ в месте встраивания трансгенной конструкции, содержащей 8,4 т.н.- промоторную область гена ДА (указан стрелкой, внизу). Сверху показано отсутствие сигнала в этом месте в случае хромосомы дикого типа (без трансгена). (Б) Экспрессия ДА-мРНК сильно ослабляется в гомозиготных /гх311 эмбрионах на стадии 14 (верхний ряд, справа) по сравнению с эмбрионом дикого типа (верхний ряд, слева), а также в слюнных железах личинки в случае гомозиготной /гх-мутации /гх^'2 (нижний ряд, справа) по сравнению с экспрессией в личинке дикого типа (нижний ряд, слева).

4. Исследование взаимодействий белковых продуктов гена 1гх с другими ядерными белками, с белковыми продуктами других генов группы Триторакса.

Среди белков группы Триторакса нам представляется наиболее близким к ТРХ по свойствам белок АБШ, являющийся продуктом гена а$И-1. Уже, базируясь на анализе генетических взаимодействий между /гх и ж/г-/ (и ¿м/г-2), было предпложено, что эти белки функционируют в составе общего многокомпонентного комплекса (811еаш, 1989). Правда, до сегодняшнего дня пока не удалось выделить такой комплекс с помощью биохимического фракционирования. Другим веским аргументом в пользу взаимодействия этих белков явлется уже упомянутые выше наши данные о том, что связывание ТЮС с политенными хромосомами заметно ослабевало при повышенных температурах в личинках, гомозиготных по температурочувствительному мутантному аллелю ¿в/г-/. Оба белка, ТЯХ и АЭШ, содержат похожие консервативные домены. Это «РНО-1^ег»-домены, которые являются богатыми цистеинами «цинковый палец»-подобными мотивами, участвующими в белок-белковых взаимодействиях, а также очень важный многофункциональный

высококонсервативный «5ЕТ»-домен. Все известные лизиновые гистон-метилтрансферазы содержат «SETw-домен, который собственно и обладает этой активностью. Оба рассматриваемых белка, TRX и ASH 1, также являются гистон-метилтрансферазами. Нам удалось получить еще ряд данных указывающих на функциональную близость этих белков. Эндогенные белки TRX и ASH1 коиммунопреципитируют из эмбрионального экстракта и практически полностью колокализуются на политенных хромосомах слюнных желез (Рис.9).

I ASH-1 . V TRX V-

» /,» » i « V* t 1 » ,* ,

> . 1 4 é' 1 4- 1

: / i V г

_ \ 'Д i j i V v * >

'У-М V » - - "

Рисунок 9. Эндогенные белки ASH 1 (окраска с использованием вторичных антител, конъюгированных с красным флуоресцентным белком) и TRX (окраска с использованием вторичных антител, конъюгированных с зеленым флуоресцентным белком) колокализуются на политенных хромосомах слюнных желез (при наложении этих двух окрашиваний в случае совпадения сигналов получается желтый цвет, на рисунке справа).

Мы также показали, что TRX и ASH1 оба связываются in vivo со сравнительно небольшим (4 т.н.) суб-регионом из /7&с/?№/-регуляторной области гомеотического гена Ultrabithorax (Ubx), который содержит несколько TRE (рис.10). Анализ эффектов мутаций ashl на активность (окраску глаз, зависимую от репортерного гена white) этого регуляторного суб-региона показал, что этот регион также содержит «^/-зависимые регуляторные элементы. Позднее мы также показали, что TRX и ASH1 ведут себя очень похоже при ступенчатой экстракции ядерных белков. Оба эти белка имели тенденцию к ассоциации с так называемым материалом «ядерного матрикса», или со скаффолд/матрикс-прикрепленными участками ДНК. В совокупности эти результаты указывают на то, что TRX и ASH1 функционально очень близки и взаимодействуют, являясь компонентами одного трудновыделяемого trxG-комплекса или двух различных комплексов, которые находятся вблизи друг от друга на регуляторном элементе и совместно участвуют в поддержании экспрессии гена-мишени (как в случае с Ubx).

Ubx 240

230 220 210 200 kb

esa ЕЕЕНЕНКР ЕаВЕКНЕМ HB EBB 8

TRES/PRES

N L_J

un»-while I

Рисунок 10. TRX и ASH1 связываются in vivo с 4 т.н.-регионом из р&с/йха'-регуляторной области гена Ubx. (А) Сверху - карта района ВХ-С, соответствующего протяженной предпромоторной зоне гена Ubx. Внизу - карта анализированных нами (см. следующий раздел) TRE/PRE-содержащих модулей (D, С и В) в pbx/bxd-районе гена Ubx и в используемой трансгенной конструкции. (Б) Колокализация эндогенных TRX (зеленый) и ASH1 (красный) на политенных хромосомах в месте встраивания трансгенной конструкции N18(nepBbiñ рисунок слева, зеленый сигнал, - определение локализации трансгена с помощью гибридизации in situ; на втором рисунке слева показано двойное окрашивание TRX и ASH1 того же участка в случае хромосомы дикого типа).

Ряд важных результатов, связанных с тематикой данной работы и полученных в результате нашей совместной работы со многими другими исследователями, коротко упомянуты ниже (подробное изложение - в тексте диссертации).

Установлено, что ТЯХ дрозофилы и его ортолог у человека (МЬЬ/АЬЬ-1/НЯХ) непосредственно взаимодействуют с белками комплексов (5^/1/8№, ВЯМ), участвующих в структурных изменениях хроматина, ведущих к активации генов.

Выделен белковый комплекс (ТАС1), содержащий помимо ТИХ еще два белка - БЬП и с1СВР. Белок ёСВР способен ацетилировать гистоны. Этот факт является одним из первых свидетельств связи ацетилирования гистонов с механизмами наследуемого поддержания активного состояния определённых генов. Позднее было показано, что этот комплекс способен также специфически метилировать гистон НЗ по четвертому лизину (НЗК.4). Эта модификация является эпигенетическим маркером активного хроматина.

ТЯХ-содержащий комплекс ТАС1 требуется для метилирования и ацетилирования гистонов нуклеосом в 5'-кодирующем районе гена ЬврТО и ряда других генов теплового шока после индукции, что предполагает наличие у ТАС1 новой функции в процессе элонгации транскрипции.

5. Исследование хромосомного регуляторного элемента (TRE/PRE), необходимого для функционирования Триторакс-ассоциированнон системы поддержания заданного уровня тканеспецифической транскрипции и локализованного в дальней промоторной области гена Ultrabithorax.

Данный раздел работы посвящен масштабному и уникальному в своем роде исследованию in vivo одного из наиболее ярких примеров TRE/PRE-регуляторных элементов, находящегося внутри pbx/bxd регуляторного района б/гЛо/та-комплекса (ВХ-С). Вначале мы провели предварительные эксперименты по иммунопреципитации, сопряженной с ПЦР-амплификацией, комплексов TRX-ДНК, образующихся в эмбриональном ядерном экстракте, с целью картировать потенциальные места связывания TRX в ВХ-С. Сразу три фрагмента ДНК, связывающихся с TRX, были картированы в области pbx/bxd, наименьшего из картированных на тот момент TRE/PRE-регуляторных элементов. Эта регуляторная область pbx/bxd необходима для правильной тканеспецифической экспрессии гена Ultrabithorax (Ubx) (Chan et al., 1994; Chang et al., 1995). Именно на этом регуляторном районе мы и решили сосредоточить свои усилия при планировании экспериментов по функциональному исследованию in vivo выявленных сайтов связывания TRX. Мы выбрали довольно редко используемый и трудоемкий подход, который сочли более подходящим в данном случае. Вместо исследования относительно небольших регуляторных фрагментов данного района отдельно от остальных регуляторных элементов гена Ubx, мы решили создать базовую трансгенную конструкцию (встраиваемую в вектор pCaSpeR3 для последующей Р-элемент-зависимой трансформации дрозофштиных эмбрионов), которая включает сайты связывания TRX в наболее приближенном к реальности контексте, в составе комбинированной регуляторной последовательности гена Ubx размером в 13 т.н. (рис. И), в которую мы включили весь регуляторный генетический район bxd, все известные на тот момент значимые регуляторные элементы (в частности, эмбриональные и личиночные энхансеры и репрессоры) расширенной промоторной области этого гена. В качестве репортерного гена использовали ген lacZ (ген р-галактозидазы), введенный в конструкцию путем присоединения к фрагменту транскрибируемой части гена Ubx ниже его промоторной области. Таким образом, экспрессия lacZ отражала активность промотора гена Ubx, находящегося в составе трансгенной конструкции. Нам сопутствовала удача в том, что экспрессия нашей базовой конструкции почти полностью соответствовала нормальному эмбриональному экспрессионному паттерну эндогенного гена Ubx (рис. 12). Анализ паттернов экспрессии был дополнен анализом эффектов на второй репортерный ген, ген white, включенный в ту же базовую конструкцию. Также мы изучали чувствительность различных трансгенов к мутациям в генах групп trxG и PcG. На рис. 11 показана как схема

базовой конструкции (N), так и различных ее производных, содержащих небольшие (размером примерно 400-500 п.н.) делеции, первоначально соответствующие участкам (В, С, D), связывающимся с TRX in vitro, а также контрольной конструкции (А), содержащей делецию в 1410 п.н. в близлежащем районе (для контроля). Позднее были получены трансгенные мухи, содержащие делеции между В и С, между С и D фрагментами (не показаны), двойную делециш (ВС), а также малые делеции внутри С фрагмента (рис. 11).

UbX гА<> гм WO

я ¡S _|_| t. SjHy К i> I Щpjjl у и» 1| »1 8

jЦ........'а ...............i '" ™■ттттшшттт^.-. яМ-»НШ |

— Trx protein

D С В _

С . 0 , ВС, CI , C3

Рисунок 11. Схемы «больших» конструкций, используемых для идентификации и исследования TRE/PRE в pbx/bxd-pamne гена Ubx. Сверху приведена частичная карта ВХ-С (согласно последовательности в GenBank с per. номером U31961), включающая регуляторный районpbx/bxd. Базовая конструкция (исследуемая регуляторная последовательность, встраваемая в вектор между двумя репортерными генами) размером в 13 т.п.н. показана утолщенными отрезками сразу под картой. Делеции в конструкциях обозначены незакрашенными прямоугольниками.

На рисунке 12 в верхнем ряду показаны (слева - схема, справа - результат in situ гибридизации с Шк-РНК) паттерны экспрессии гена Ubx в позднем эмбрионе как дикого типа (wt), так и в случае мутаций по гену trilhorax (trx") или гену Polycomb (Рс"). Видно, что эффект trx" - это ослабление экспрессии Ubx в том же постериальном домене, где этот ген в норме экспрессируется, тогда как в случае Рс" выявляется сильное антериальное распространение экспрессии (нарушение границ экспрессии). Важно отметить, что эти эффекты мутаций генов групп trxG/PcG проявляются лишь на поздних эмбриональных стадиях (после 10 стадии; на этапах поддержания заданного уровня экспрессии) и не влияют на правильное формирование паттерна (инициацию) экспрессии в ранних эмбрионах. Из полученных нами трансгенных линий для последующего анализа брали только те линии (их было большинство), в которых паттерн экспрессии репортерного гена lacZ на стадии ранних эмбрионов напоминал (был практически идентичен) паттерн(у) экспрессии эндогенного Ubx.

В эмбрионах всех отобранных трансгенных линий экспрессия репортерного гена lacZ была ограничена (по крайней мере до эмбриональной стадии 10) районом, расположенным постериальнее парасегмента 5 (рис. 13, А, верхний ряд), аналогично эндогенной Ми-РНК. Экспрессия lacZ в эмбрионах, несущих базовую конструкцию bxdl3, «N» (рис.12, рис.13,А), а также укороченную конструкцию ДА, были очень похожи на паттерн экспрессии эндогенного Ubx на всех проверенных стадиях развития. Эти результаты указывают на то, что все существенные для правильной инициации экспрессии Ubx регуляторные элементы из bxd-райна не были делегированы в наших конструкциях и что наши базовые трансгены содержали практически все TRE и PRE, требующиеся для правильного поддержания экспрессии Ubx в эмбриогенезе. Делеция ДА (1,4 т.п.н.) в дистальной области не оказывала какого-либо эффекта на паттерн эмбриональной экспрессии. В нижнем ряду рис. ¡2 слева схематически показаны эффекты, наблюдаемые при исследовании экспрессии наших трансгенных конструкций, а справа показаны реальные результаты in situ гибридизации с lacZ- РНК.

Рисунок 12. Экспрессия эндогенного (верхний ряд) и репортерного (нижний ряд) генов с промотора гена Ubx в поздних эмбрионах дикого типа (wt) и в случае мутаций по генам trithorax (trx-) или Polycomb (Рс-). Слева -схематическое изображение, справа - результат in site гибридизации; bxd 13 — обозначение базовой («нормальной», N) конструкции; bxd 1 ЗАВ и bxdl3AC - конструкции, содержащие делеции соответственно фракментов В и С (рис.11).

Анализ паттернов экспрессии трансгенов с делециями АВ, ДС и ДО выявил неожиданные результаты. Хотя во всех трех случаях инициация и поддержание экспрессии на ранних стадих эмбриогенеза были идентичны конструкциям N и ДА, начиная с 11 стадии, 1ас1-РНК в этих трех вариантах трансгенов начинала абнормально экспрессироваться в антериальных районах центральной нервной системы и структурах головы (рис. 13).

J ДВ

ffp , ^

ЛВС

2а. "X

ДВ

ДС

âD

N/wt N/trx" ДС/wt ЛСДгх" AD/wt AD/trx"

K -t»

■ 'É

« » r V

Рисунок 13. Эмбриональная экспрессия lacZ в трансформированных линиях мух дикого типа и в случае мутации (А) Детектируемая с помощью in situ гибридизации на фиксированных эмбрионах lacZ-РНК экспрессировалась в районе парасегментов 6-13 на ранней эмбриональной стадии 10 как в показанных N и ДВ (верхний ряд), так и во всех других анализируемых трансгенных линиях (антериальный район - слева). На более поздних эмбриональных стадиях (ст. 15-16) экспрессия конструкции N (и ДА) оставалась ограниченной этим постериальным участком, а вот экспрессия конструкций ДВ, ДС и AD заметно отличалась: наблюдалась сильная экспрессия в антериальных нейромерах и в головных структурах, при этом также происходило относительное ослабление экспрессии в постериальных сегментах. (Б) Экспрессия /acZ-РНК в центральной нервной системе поздних эмбрионов трансгенных линий N, ДВ, ДС и AD (антериальный район - вверху). (В) Эффект мутации

ira®" на экспрессию трансгенов N, ДС и AD. Эмбрионы были окрашены антителами к Р-галактозидазе (коричневый цвет) и несильно окрашены с помощью in situ гибридизации с пробой, специфичной для эндогенной (Лиг-РНК (синий цвет).Мутантные эмбрионы идентифицировали по ослаблению экспрессии Ubx.

Как время в эмбриогенезе, так и уровень этой абнормальной экспрессии в антериальной части эмбриона указывают на делецию сильного PRE, что приводит к потере антериальной границы экспрессии. Детали паттернов и уровней экспрессии немного различаются в каждом из трех вариантов анализируемых трансгенов (рис. 13,Б), что указывает на то, что каждая из этих делеций может удалять PRE с несколько отличными характеристиками, вероятно, с несколько отличающимися комплексами связывающихся белков PcG. Наряду с этим Рс-подобным мутантным фенотипом мы также наблюдали в случае каждого из этих делеционных конструкций ослабление экспрессии на периферии нейромеров в районе постериальнее парасегмента 6 (по сравнению с линиями N и ДА). Это ослабление lacZ-экспрессии похоже на ослабление экспрессии Ubx в эмбрионах, гомозиготных по мутации tnP". Для того, чтобы уточнить эти данные, указывающие на то, что существенные TRE были также делегированы в этих трансгенах, несущих делеции TRX-связывающих элементов, мы дополнительно проанализировали экспрессию трансгенов N, ДВ, ДС и AD в эмбрионах, несущих мутацию try?" (рис. 13, В). По сравнению с ожидаемо сильным эффектом trxB", выражающимся в ослаблении lacZ-экспрессии, в конструкции N, не было заметного ослабления экспрессии в постериальном районе эмбриона, несущего исследуемые трансгены с делениями ДВ, ДС и ДО (рис. 13, В). Эти результаты указывают на то, что все три TRX-связывающих элемента, детектированные в наших предварительных иммунопреципитационных экспериментах, содержат функциональные TRE и что, по крайней мере, в контексте нашего трансгена все эти элементы существенны для нормальной экспрессии регулируемого гена в эмбрионах.

Абнормальная экспрессия трансгена в антериальной части позднего эмбриона, детектируемая в случае делеций, как мы показали, также зависит от наличия TRX (ослабевает в эмбрионах, несущих мутацию А зависимость от наличия

соответствующих TRE в трансгене нам удалось продемонстрировать, сконструировав трансгенные линии, несущие делецию сразу двух TRE/PRE, В и С (ДВС, рис. 11, рис. 13,А). Экспрессия репортерного гена lacZ в линиях ЛВС сильно ослаблена в антериальной части эмбриона по сравнению с экспрессией в линиях ДВ и ДС и напоминет экспрессию в этих линиях с одиночными делециями в эмбрионах, несущих мутацию trxB". Таким образом, одновременное удаление двух TRE приводит к тому же эффекту, что и полное удаление функции TRX в антериальной части позднего эмбриона.

Помимо анализа экспрессии репортерного гена lacZ мы также анализировали в полученных трансгенных линиях экспрессию второго репортерного гена, mini-white, оценивая окраску глаз во взрослых мухах, которая определяется этим геном. Зависимость работы этого гена (работающего в органе, расположенном в антериальной области тела мухи) от функции гена

trithorax была подобна той, что мы обнаружили для абнормальной экспрессии lacZ в антериальной части эмбриона в линиях N, ДВ, AC, AD и ЛВС, то есть, если в первых четырех окраска глаза ослабевала в гетерозиготных по мутации trxBU, то в линии ЛВС окраска глаза не менялась.

Мы использовали этот факт на следующем этапе работы, посвященном исследованию суб-элементов одного из выявленных PRE/TRE, С-элемента, с целью выяснить, одни и те же суб-элементы важны для функционирования TRE и PRE, или же эти суб-элементы могут быть разделены. Для этого было получено большое число новых трансгенных линий, несущих «малые» конструкции, содержащих регуляторный участок размером в 4 т.п.н., включающий В, С и D элементы, небольшую 800 п.н,- фланкирующую последовательность, репортерный ген mini-white и векторную часть. Базовая 4 т.н.-конструкция (без делеций, N) была способна генерировать новый участок связывания с TRX в месте встраивания трансгена (рис. 14). На сегодняшний день, это один из самых коротких элементов,

Рисунок 14. Связывание TRX с 4т.н.-трансгеном на политенных хромосомах. Сверху - локализация N18-трансгена в цитологическом участке 100F хромосомы 3R (зеленый сигнал in situ гибридизации). В середине -область хромосомы дикого типа, содержащая только 2 сигнала связывания TRX (красного цвета); внизу - та же область хромосомы трансгенной линии, где детектируется третий сигнал в месте локализации трансгена (указан стрелкой) на самом конце хромосомы в райне 100F.

В исследуемых конструкциях B-элемент был делетирован, а в С-элементе были сделаны небольшие делеций (рис. 15). В качестве контрольной также были получены трансгенные линии с конструкций, несущей делецию только B-элемента (не показано). Полученные трансгенные линии тестировали на потерю активностей TRE и/или PRE, визуально анализируя изменения в окраске глаз мух в результате введения мутантного аллеля гена trxG- или PcG-группы путем генетического скрещивания с мухами, несущими мутации или в гене trx (trxB") или в генах группы PcG (Psc1, Pel", Senf"). Было показано, что делеция С1-фрагмента (но не С2- или СЗ-фрагментов) нарушает эффект введения в трансгенные линии мутации trxB" во всех 11 протестированных линиях АВС1. При этом больше половины линий ЛВС 1 продолжали отвечать на введение мутации в гене группы PcG (окраска глаза усиливалась).

обладающих такой способностью.

TFEs/PREs

BC1 всг вез

ВС1 ВС1 ВС1 ВС1 ■ ВС1 вез вез вез

•А

•в

-с -о

• D"

РЮ1 . РН02 . РН01-2 .

FSC

га am

Bw Son Тгк

сз a ci

$ м

гооы>

Рисунок 15. Схемы «малых» конструкций, используемых для исследования TRE/PRE в составе базовой 4 т.н.-конструкции с репортерным геном mini-white.

Обратная картина наблюдалась в линиях ДВСЗ (с делецией СЗ-фрагмента). В этом случае, наоборот, во всех 5 проанализированных линиях терялась чувствительность ко всем трем мутантным аллелям генов группы PcG и при этом почти во всех линиях сохранялась чувствительность к мутации в гене trx (trxBn). Эти результаты указывали на весьма важный вывод о том, что TRE и PRE в С-элементе могут быть разделены. Для того, чтобы подтвердить этот факт, мы получили новые трансгенные линии, несущие нашу базовую конструкцию размером 13 т.н., в которой или С1 TRE-содержащий фрагмент или СЗ PRE-содержащий фрагмент были делегированы (рис.11, рис. 16).

ДС1

дез

Рисунок 16. Экспрессия 1ас1 в трансгенных линиях ДС1 и ДСЗ. В левой колонке - как в исходной линии без делеций (К), так и в линиях с делециями, видно сохранение экспрессии в границах парасегментов (ПС) 6-13 на эмбриональной стадии 10. В правой колонке -экспрессия на эмбриональной стадии 15-16: в ДС1 сохраняется антериальная граница экспрессии и ослабевает экспрессия по сравнению с N ; в ДСЗ - антериальная граница экспрессии сдвинута от ПС 6 (большая стрелка) к ПС 5 (малая стрелка).

Из рис. 16 видно, что в поздних эмбрионах в ДС1 сохраняется антериальная граница экспрессии и ослабевает постериальная экспрессия (особенно в ПС6) по сравнению с N и ДСЗ ; в ДСЗ- антериальная граница экспрессии сдвинута от ПС 6 к ПС 5. Эти данные подтверждают, что первичные активности TRE и PRE внутри С-элемента зависят от разделяемых суб-элементов.

Таким образом, наши исследования in vivo тканеспецифического узнавания продуктами trx- и Яс-групп генов специфического регуляторного элемента из дальней промоторной области гена Ultrabithorax выявили необычно сложную его структуру, состоящую из многих функционально значимых участков, способных взаимодействовать с белками и активационной и репрессионной систем. По-видимому, имеется конкурентное (этих двух альтернативных систем) и кооперативное (внутри каждой системы) взаимодействие регуляторных белков одновременно с различными составными частями таких довольно протяженных элементов.

6. Исследование хромосомного регуляторного элемента (TRE), необходимого для функционирования Триторакс-ассоциированной системы поддержания заданного уровня тканеспецифической транскрипции и локализованного в промоторной области гена fork head (ßh).

Данная работа базировалась на наших более ранних исследованиях, указывающих на существование сильного TRE в протяженной промоторной области генаJkh в D. melanogaster (см. выше). Мы исходили из нескольких имеющихся принципиальных заделов и особенностей выбранной модели. Во-первых, ген ßh был ранее достаточно детально охарактеризован в отношении локализации цис-регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию в различных тканях (Weigel et al., 1990; Shou et al., 2001), в частности, был выявлен и детально охарактеризован энхансерный элемент, специфичный для клеток слюнных желез (sgE на рис. 17 и 18). Во-вторых, было показано, что содержащий TRE промоторный участок (размером 8700 п.н.) этого гена достаточен для возникновения нового сайта связывания TRX в месте встраивания соответствующего трансгена (Kuzin et al., 1994). Подобный тест на связывание с трансгенной конструкцией на препарате политенных хромосом может быть использован в качестве функцинального теста при уточнении границ TRE. Любопытно, что, если экспрессия fleh сильно подавляется в мухах, имеющих мутации по гену trx (Kuzin et al., 1994), то в случае мутации по гену Рс не обнаруживается заметных изменений в экспрессии этого гена (Jürgens, 1997), что отличает данный элемент от других PRE/TRE и может указывать на возможность существования TRE без выраженного PRE.

Наконец, в данной работе мы использовали поликлональные антитела против трех различных доменов белка ТЛХ, полученные нами ранее. Параллельное использование антител к различным доменам одного и того же исследуемого белка представляется принципиальным для повышения достоверности результатов иммунологических иследований, особенно таких, как иммунопреципитация сшитого формальдегидом и дробленого ультразвуком хроматина («Х-СЫР» метод), где очень высок неспецифический фон. Мы смогли существенно повысить разрешение данного метода, используя комбинирование подходы на основе параллельного использования нескольких антител. В частности, путем дополнительного перекрестного гибридизационного обогащения библиотек последовательностей, первоначально получаемых с использованием различных антител мы смогли заметно повысить эффективность Х-СЫР эксперементов. Было проведено несколько экспериментов, которые давали воспроизводимые результаты (один из типичных результатов представлен на рис. 17,В). Из совокупности проведенных экспериментов нам удалось выявить в исследуемом районе два потенциальных ТЯЕ (размером около 1000 п.н.), находящихся на расстоянии примерно 7000 п.н. и 4000 п.н. от начала транскрипции гена АД (рис. 17,Б). Особое внимание следует обратить наиболее удаленному от промотора из выявленных ТЯЕ. Этот элемент, соответствующий основному гибридизующемуся материалу в большинстве наших экспериментов, хотя и не перекрывается, но находится в непосредственной близости от ранее выявленного регуляторного элемента, 5§Е, определяющего специфическую экспрессию гена/кк именно в клетках слюнных желез. Наряду с вышеизложенным «гибридизационным» подходом мы также ис-пользовали метод прямого включения радиоактивной метки в ходе многочисленных параллельных ПЦР с использованием 18 пар праймеров, подобранных с учетом покрытия всего исследуемого района. При анализе получаемых данных проводилась нормализация относительных интенсивностей сигналов с помощью сравнения интенсивностей детектируемых полос в обогащенном материале и относительной эффективности наработки данного продукта в положительном контроле. Нормализованные данные отражены на графике рис. 17,А.Выявляемые участки хорошо коррелировали с теми, которые были идентифицированы с использованием гибридизационного метода детекции, и соответствовали продуктам ПЦР, обозначенным на рис.17 номерами 4 (мажорный обогащающийся район), а также 10 и 11. В дополнение к данным о локализации потенциальных ТЯЕ были также получены данные о непосредственной близости участков связывания АБШ и Т11Х (рис.17,А). Итоговые обобщенные результаты этого этапа работы представлены на схеме рис. 18.

7_ S_ 9 10 111213 14 1516 17 18_

+ +

Б)

В)

1 кЬ

TRE2

I I I

J_I

fkh

1-2 3-5

7-8

10-12 14-16

17-18

н : j

** ** шя "" ** **

Рис. 17. Анализ связывания TRX с хромосомными участками в предпромоторной области гена fkh с помощью метода иммунопреципитации хроматина (X-ChIP). (А) Прямой ПЦР-анализ получаемых в результате применения Х-СЫР-метода проб с включением радиоактивной метки и с использованием 18 различных пар праймеров. Вверху: график показывает обогащение соответствующих фрагментов, обозначенных на оси абсцисс (разными значками и цветом обозначены обогащения, полученные в результате использования разных антител: N1,N6 - различные антитела к белку TRX; ASH1 -антитела к белку ASH1). Внизу: показано привязанное к карте (ниже) положение анализируемых ПЦР-фрагментов в промоторной области гена fkh (обогащаемые фрагменты отмечены знаком «+»). (Б) Представлена карта-схема регуляторной области гена fkh. sgE - энхансер экспрессии гена fkh в клетках слюнных желёз; TRE1, TRE2- два обогащающихся района (гипотетические TRE). Стрелкой вправо показано начало транскрипции гена fkh. (В) Сверху показана схема полученных с помощью ПЦР перекрывающихся фрагментов геномной ДНК, которые разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле (фотография внизу), переносили на мембрану и использовали для анализа методом Саузерн-блот-гибридизации участков обогащения в радиоактивно меченных ДНК-пробах, получаемых в результате иммунопреципитации хроматина (X-ChIP) с помощью различных антител, узнающих TRX. Представлен один из типичных результатов эксперимента (в середине). Положение обогощаемых фрагментов отмечено знаком «+».

Hin dl 11 Pvull Bglli

I ^

fkh

EcoRI Bgllli Xbal I

Ncol Kpnl Notl I I

шШийЩ" '

_L_

....is.........

J_1_L

sgE

ttt

Гибридизация

, - -Л. - J._± ± «-L

+ + +

+ +

+± J. +

+ +

N1 18< 1 N6 ПЦР

ASH1

TRE3

TRE2

TRE1

\ GAF z - ÖAF : j F

PS PF:

PM ps ;

; GAff ÖAF/ -

........—т Pi

\ А

i л ...................... i

\/ и .................J,...............1 \ !

ft ..Уд.........1 1 1 i 1

M АЛ : / \ nri j

: Ч..../

Рисунок 18. Обобщенные результаты иммуноприципитационного картирования потенциальных TRE в промоторной области генаJkh. (А) Ориентация промоторной области гена fkh на данной схеме противоположна той, что использовалась на рис. 17 для удобства сопоставления с данными биоинфрматического поиска PRE элементов. В верхней части схемы указаны положения сайтов рестриктаз, положение последовательности малоизученного транскрипта distal fork head (dfk), обозначены определенные ранее энхансерные тканеспецифические элементы (amg - передней части средней кишки, pmg - задней части средней кишки, hg - задней кишки, int - мальлигиевых сосудов, sgE - слюнных желез). Далее на схеме (сверху вниз) представлены данные гибридизационной детекции TRX-ассоциированных последовательностей, а затем и данные прямого ПЦР-анализа обогащающихся коротких фрагментов ДНК. Количество и размер «+» на схеме соответствует степени обогащения данной последовательности. В нижней части схемы указаны локализации трех выявленных предполагаемых TRE. (Б) - Биоинформатический анализ последовательности регуляторной области гена fkh проведён программой (http://bibiserv.techfak.uni-

bielefeld.de/predictor/submission.html), оценивающей вероятность существования PRE в данном месте геномной ДНК, основываясь на локальном неслучайном обогащении сайтами связывания белков РНО, Zeste и GAF (Ringrose et al., 2003). На рисунке отражены локализация этих сайтов связывания (сверху), атакже положение гипотетических PRE (пики в нижней части рисунка), пердполагаемых в результате применения программы.

В верхней части схемы обозначены определенные ранее энхансерные тканеспецифические элементы. Мы работали с клетками слюнных желез, и в них наиболее важным регуляторным элементом является sgE. Далее на схеме (сверху вниз) представлены данные гибридизационной детекции TRX-ассоциированных последовательностей, а затем и данные прямого ПЦР-анализа обогащающихся коротких фрагментов ДНК. В нижней части схемы указаны локализации трех выявленных предполагаемых TRE. TRE1 -мажорный из выявленных участков, более слабый элемент - TRE2, a TRE3 - едва детектируем и, возможно, является участком вторичного взаимодействия TRX, ранее связавшегося с основным TRE. Интересный результат был получен при анализе обогащения в исследуемой промоторной области участками связывания белков РНО ("Pleiohomeotic"), Z ("Zeste") и GAGA-фактора (GAF). Обогащение этими участками, по-видимому, является характерной особенностью PRE/TRE, и была разработана программа поиска PRE/TRE, основанная на выявлении районов геномной ДНК, обогащенной участками связывания этих трех белков (Ringrose et al., 2003). На рис.18,Б отражен результат применения этой поисковой программы для исследуемой нами промоторной области гена fkh. Любопытно, что обнаруживается явная корреляция в локализации идентифицированных нами TRX-ассоциированных последовательностей и районов обогащения участками связывания трех упомянутых ДНК-связывающих белков.

Интересно, что для каждого из трех потенциальных PRE/TRE, предсказываемых для исследуемой промоторной области, можно указать идентифицированные ранее тканеспецифические энхансерные элементы (схема на рис. 18,А). Можно предположить, что в каждой конкретной ткани, где активен ген fkh, принципиально важны для активности гена энхансеры, специфичные именно для данной ткани, и соответственно принципиально важны расположенные по-соседству с этими энхансерами элементы, поддерживающие их активность (TRE). Соответственно, в тканях, где ген fkh неактивен, рядом с энхансерными элементами, по-видимому, формируются PRE. Ранее было показано, что энхансерный

элемент "sgE" является определяющим для специфической экспрессии гена fkh в клетках слюнных желез (Zhou et al., 2001). В используемой для трансформации мух минимальной конструкции авторы помещали только этот элемент непосредственно перед промотором и видели слабую экспрессию репортерного гена именно в клетках слюнных желез. В реальной же ситуации этот энхансерный элемент отстоит от промоторной области на 8 тыс. п.н., да и уровень экспрессии гена существенно выше. Мы предполагаем, что выявляемый нами в непосредственной близости от этого энхансерного элемента TRE1 отвечает за поддержание энхансера в «открытом» активном состоянии и, возможно, за пространственное сближение sgE с промотором.

Полученные результаты в дальнейшем были использованы при создании трансгенных конструкций с целью проверки in vivo функциональной значимости выявленных TRE. Схема «базовой» трансгенной конструкции «мини-fkh» представлена на рис. 19.

fkh

_i_i_i___i_' '_i_i_LT

sgE 1 2

Рисунок 19. Схема «базовой» трансгенной конструкции «мини-fkh» для проверки in vivo функциональной значимости гипотетических TRE (TRE1 обозначен как FKH3-4; TRE2 обозначен как FKH9-11). Вверху показана маштабированная схема исследуемой области. На схеме отмечены регуляторные элементы и выявленные гипотетические TRE (красные полоски с цифрами 1 и 2). Внизу показана схема созданной трансгенной конструкции, с указанием использованных для клонирования последовательностей. sgE - энхансер слюнных желез; FHK17-18 - область промотора; FKH3-4 и FKH9-11 - гипотетические TRE, которые могут быть удалены из конструкции с использованием методов соответственно FRT/FLP- и/или Lox/Cre-зависимых рекомбинаций (указаны соответствующие сайты рекомбинации, фланкирующие проверяемые элементы).

В эту конструкцию мы включили энхансер слюнных желёз - уже изученный ранее элемент, необходимый для тканеспецифичной экспрессии гена fkh (Shou et al., 2001). Также в

неё мы клонировали область промотора (длиной примерно 860 п.н), содержащую точку начала транскрипции гена fkh и 5'-фрагмент первого экзона гена fleh. Включение части экзона позволило нам в последующем оценить влияние элементов конструкции на экспрессию гена-мишени путём измерения уровня транскрипции трансгенной РНК. Также стоит отметить, что мы наблюдали небольшое обогащение этого района в предшествующих X-ChIP экспериментах, поэтому нельзя было исключить, что этот фрагмент важен для функционирования TRE. Помимо указанных элементов, конструкция также содержала проверяемые гипотетические TRE, выявленные нами на первом этапе работы и обозначенные FKH3-4 (TRE1) и FKH10-11 (TRE2). Чтобы иметь возможность более достоверно оценить значимость проверяемых элементов, мы поместили их между сайтами рекомбинации LOX и FRT (рис. 19). Таким образом, при анализе трансгенных мух мы могли вырезать любой из этих элементов соответствующими рекомбиназами (CRE и FLP), и получить производную трансгенную линию с конструкцией, находящейся в том же месте в геноме и отличающейся от исходной конструкции лишь отсутствием в ней одного из гипотетических TRE. Сравнение конструкций, находящихся в одном и том же месте генома принципиально в подобном анализе, потому что, как известно, геномное окружение может существенно влиять на характер экспрессии гена. Благодаря такому подходу можно было более надёжно оценить как связывание белка TRX с конструкцией, так и уровень транскрипции трансгена при наличии и отсутствии изучаемых последовательностей в конструкции.

В результате проделанной работы мы получили 8 трансгенных линий мух, местоположение конструкции в которых было определено методом инвертированного ПЦР. Пять из них мы отобрали для дальнейшего анализа (в трёх случаях конструкция находилась слишком близко к центромере, что сильно затрудняло анализ с помощью иммунного окрашивания). При иммуннофлуоресцентном окрашивании мы детектировали появление сильного сигнала связывания TRX на политенных хромосомах в клетках слюнных желёз во

всех анализируемых линиях (рис. 20). Положение и интенсивность нового флюоресцентного сигнала в месте встраивания конструкции сопоставляли с известными эндогенными участками связывания ТЯХ. Интересно отметить, что, как правило, новый сигнал окрашивания, как и в случае с эндогенным ДЛ, был одним из самых заметных. Удаление фрагмента РКН10-11 из конструкции не приводило к какому-либо заметному эффекту, и мы по-прежнему наблюдали наличие нового сайта связывания ТЮС во многих ядрах различных исследуемых линий трансгенных мух. В то же время удаление из конструкции последовательности, наиболее сильно обогащающейся в иммунопреципитационных экспериментах (РКНЗ-4), было критичным и приводило к полному исчезновению флюоресцентного сигнала ТЯХ в месте встраивания конструкции для всех анализируемых линий трансформированных мух (рис. 20).

№1»ха456

100Р1

Чеха456

100Р1

|А1еха456

9801

А1еха45б 99В1

1РАР1

А1вха456

1РАР1

10001# "

А) Линия дикого типа

В) Линия 2С с удалённым РКН10-11

Б) Трансгенная линия 2С

Г) Линия 2С с удалённым РКНЗ-4

Рисунок 20. Иммунное окрашивание политенных хромосом антителами к ТЯХ. Показаны результаты окрашивания для одной из линий трансгенных мух с удобным для детекции положением конструкции в районе 10001 (на краю хромосомы рядом с двумя эндогенными сигналами связывания). В каждой паре фотографий слева - окрашивание по ОАР1, справа - детекция ТЯХ. (А) Хромосомы дикого типа. (Б)-(Г) Исходная трансгенная линия 2С и производные от нее линии (в результате рекомбинационного удаления одного из исследуемых элементов). (Б) - Линия с полной «базовой мини-АЛ» конструкцией; (В) -линия с конструкцией, в которой был удален фрагмент РКН9-11; (Г) - линия с конструкцией, в которой был удален фрагмент РКНЗ-4 (ТЯЕ). Стрелками указаны эндогенные сигналы связывания ТЯХ в районах 9801 и 99В1, а также отмечено положение трансгенной конструкции в районе 1 ООО 1.

Таким образом, элемент РКНЗ-4 необходим для связывания ТЮ( с конструкцией. Помимо подтверждения значимости выявленного элемента для связывания белка ТЮС мы также проанализировали влияние новых гипотетических Т11Е на экспрессию гена-мишени. С этой целью для пяти исходных трансгенных линий и их производных (линии с вырезанными фрагментами РКНЗ-4 и РКНЮ-11) методом ПЦР в реальном времени мы проанализировали отношение уровня транскрипции РНК с трансгенного промотора ("мини-Дй "-РНК) к уровню транскрипции мРНК эндогенного гена ДА. Интересно отметить, что уровень транскрипции с трансгенного промотора во всех линиях мух с базовой конструкцией т/и/-ДА был сопоставим с уровнем транскрипции эндогенного гена ДА: в четырёх случаях из пяти отношение уровней транскрипции составляло 40-80%, а в одном случае (линия З-геё) уровень транскрипции с трансгенного промотора был даже втрое выше (рис. 21). Во всех случаях при вырезании фрагмента РКНЗ-4 мы детектировали существенное снижение уровня транскрипции в несколько раз по сравнению с базовой трасгенной конструкцией (для различных линий уровень транскрипции снижался от 2 до 10 раз со средним значением примерно в 4 раза) (рис. 21).

□ оригинальная конструкция I конструкция с удалённым РКНЮ-11

□ конструкция с удаленным РКНЗ-4

ИЛЬ

4-гес1 бВ-У-Чп 2С-гес1 3-гес1 Трансгенные линии мух

Ш-рУЛщ

Рисунок 21. Анализ уровня транскрипции с «трансгенного» ЯЛ-промотора в полученных первичных и производных трансгенных линиях. Показано отношение уровней транскрипции «трансгенной гтш-Дй-РНК» к эндогенномйДй-РНК для пяти различных линий трансгенных мух и производных от них линий (с удалением указанных проверяемых элементов).

В то же время удаление из конструкции фрагмента FKH10-11 практически не оказывало влияния на уровень транскрипции. В результате описанных экспериментов мы идентифицировали новый TRE, расположенный в 7 т.п.н выше промотора гена fkh и имеющий размер примерно 600 п.н. Было показано, что этот новый элемент важен как для связывания белка TRX, так и для экспрессии гена fkh в секреторных клетках слюнных желез личинки дрозофилы. Этот элемент расположен поблизости от энхансера слюнных желёз, что может быть важным обстоятельством функционирования данного TRE.

Помимо выявления TRE мы также проанализировали распределение модификаций коровых гистонов, характерных для активного гена, в протяжённой промоторной области гена jkh. Определенный тип модификаций гистонов является важным признаком (маркером) транскрипционного статуса хроматина. Так, метилирование лизинов в гистоне НЗ по положениям 9 и 27 является маркёром репрессированного состояния хроматина, в то время как ацетилирование Н4 и метилирование лизина-4 в НЗ ассоциировано с активными районами. Также известно, что некоторые белки группы триторакса (trx-G) обладают гистон-модифицирующими активностями. Например, ASH1 и TRX содержат консервативный домен (SET-домен), способный метилировать определённые остатки лизина в гистонах, в частности, гриметилировать лизин-4 в гистоне НЗ. В связи с этими данными нам показалось интересным проанализировать методом иммунопреципитации хроматина характер обогащения предпромоторной области гена fkh данными модификациями гистонов в случаях активного и репрессированного состояния гена Jkh. Для этого в предварительном опыте методом RT-PCR мы показали отсутствие транскрипции fkh в культуре клеток S2, что позволило нам использовать эти клетки для анализа распределения модифицированных гистонов при неактивном состоянии гена fkh в сравнении с активным состоянием гена fkh в клетках слюнных желёз. Проведённые X-ChIP-эксперименты показали, что хроматин в протяжённой промоторной области гена jkh действительно обогащен в значительной степени ацетилированными гистонами и триметилированными по 4 остатку лизина

гистонами НЗ (НЗК4шеЗ) в клетках слюнных желез, где ген активен (рис. 22), в отличие от клеток линии Б2, в которых ген неактивен, и сколько либо заметного обогащения при Х-СЫР не наблюдается. Также мы показали, что обогащение промоторной области носит неравномерный характер, и имеется существенный пик обогащения в районе энхансера слюнных желёз и ТЯЕ с последующим затуханием сигнала при удалении от ТЯЕ. При этом, в случае анализа модификации НЗК4шеЗ мы наблюдали заметное усиление обогащения в районе начала транскрипции гена ДА, но в случае с антителами к ацитилированным гистонам такого эффекта не было отмечено.

•8 -о х Ф

1 2 3 42 4Й 4Р ! 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 18 17 18 анализируемые фрагменты ПЦР промоторной области гена АсЬ

Рисунок 22. Анализ распределения модифицированных гистонов в промоторной области гена ДА. Показаны результаты опытов по иммунопреципитации хроматина (Х-СЫР) с использованием антител к модификации гистона НЗК4шеЗ и к ацетилированным гистонам, сопряженной с ПЦР-амплификацией. Для анализа результатов обогащения использовали те же 18 пар праймеров, что и в иммунопреципитационных экспериментах с антителами к ТЯХ. Были использованы дополнительные праймеры к району ТЯЕ (фрагменты 4'2, 4Я, 4Р) для более детального изучения этого участка. График показывает отношение количества ДНК в обогащенных Х-СЫР-пробах к ДНК положительного контроля (аликвота хроматина, взятая непосредственно перед иммунопреципитацией) для соответствующих ПЦР фрагментов.

На основе полученных данных можно предположить наличие прямого взаимодействия ТЯЕ с областью промотора. Представленные результаты и выводы хорошо согласуются с недавними исследованиями других авторов. Так, например, в лаборатории Паро на примере гена Abd-B было показано, что белок TRX находится как в регуляторных элементах («PRE»), так и в районе промотора гена-мишени в случае активного состояния гена, в то время как в случае репрессированного состояния гена обогащения в районе промотора не наблюдалось (Beisel, 2007). В той же работе было проанализировано распределение ацетилированных

гистонов в этих районах, показавшее, на примере генов АЬс!-В и ¿/с], что появляющееся обогащение в случае активного состояния генов так же, как и в наших экспериментах, не затрагивает промоторную область.

7. Обнаружение ассоциации продуктов гена /гШогах (белков ТИХ) с компонентами ядерного скелета (матрикса).

С помощью иммуннофлуоресцентного окрашивания и «Вестерн-блот» анализа распределения белка во фракциях экстрагированных ядер впервые было показано, что белок ТЯХ может быть выявлен в ассоциации с нерастворимыми компонентами экстрагированных ядер, так называемым "ядерным матриксом" (рис. 23,24).

Рисунок 23. Иммунофлуоресцентный анализ ТЯХ в ядрах клеток слюнных желёз, подвергавшихся последовательной экстракции:

(а) после удаления цитоплазмы (слева - окрашивание ДНК. справа - окрашивание ТЯХ)

(б) после ДНКазной обработки и экстракции «растворимого» хроматина 0.25М сульфатом аммония (слева - окрашивание ДНК, справа - окрашивание ТЯХ)

(в) после доплнительной экстракции в 2М №С1 и обработки РНКазой А (две разных глубины фокуса)

(г) ТШ£ в ядрах (две разных глубины фокуса) после обработки ДНКазой и альтернативной экстракции в буфере с низкой йонной силой, содержащим 25 мМ 3,5-дийодосалицилат лития

2 3 4 1 2 3 4

кДа 250

150

А Б В

Рисунок 24. Детекция ТИХ в последовательно экстрагируемых ядерных фракциях: 1- «растворимый» хроматин, 2 - экстракция 2М №С1, 3 - обработка РНКазой А, 4 - «ядерный матрикс», экстракция 8М мочевиной. Детекция ТЯХ с помощью антител (А) к С-половине белка (антитела N6) и (Б) к Ы-концу белка (антитела N1). (В) Детекция РНК-полимеразы П.

Нам удалось также показать на двух описанных выше модельных системах (на промоторной области гена fkh в клетках слюнных желез личинки и на районе сильного PRE/TRE гена Ubx в клетках эмбрионов дрозофилы), что два типа регуляторных хромосомных элементов, так называемые скаффолд- / матрикс-ассоциированные ДНКи TRE, колокализуются. Причем, эта колокализация, по-видимому, имеет динамический, тканеспецифический характер и выявляется лишь в том случае, когда ген активен. Так, эта колокализация имеет место в области участка TRE1 в расширенной промоторной области гена fiih в клетках слюнных желез, где этот ген активен, и не выявляется в культуральных клетках S2 дрозофилы, в которых ген flih неактивен.

Пока трудно интерпретировать функциональную значимость обнаруживаемой ассоциации. С одной стороны, нельзя исключить, что это артефакт используемых процедур экстракции. С другой стороны, существуют многочисленные данные, указывающие на важность ядерного скелета (матрикса, скаффолда) для поддержания специфической структурно-функциональной организации хромосом и правильного протекания разнообразных ядерных процессов, таких как транскрипция, репликация ДНК, процессии-РНК, рекомбинация и конденсация хромосом, для наследуемого поддержания тканеспецифической активности генов. С практической стороны, учет выявленного факта при разработке оптимизированной процедуры экстракции/фракционирования ядерных компонентов может способствовать выделению новых или более полных TRX-содержащих комплексов.

8. Исследование изменений транскрипции различных генов человека в случае лейкемий с хромосомными нарушениями, затрагивающими ген ALL1/MLL1 (гомолог дрозофилиного TRX).

Ген человека MLL1 (ALL-1, HRX, hTRX), являющийся структурным и функциональным гомологом дрозофилиного trx, прямо вовлечен в 5-10% всех острых лимфобластических лейкемий (ALL) и острых миелоидных лейкемий (AML). Первичным событием, вызывающим трансформацию клеток в этих случаях, является хромосомная

транслокация, в результате которой образуется новый гибридный белок, в котором N-концевой фрагмент MLL1 присоединён к С-концевому фрагменту одного из многих (порядка 50) известных партнёров. Наиболее частые транслокации - t(4;l 1) при ALL и t(9;l 1) при AML - составляют 40 и 27 % случаев, соответственно. MLL1-ассоциированные лейкемии типа ALL характеризуются как CD 10", CD19+, имеют фенотип предшественников B-клеток и обычно отличаются повышенной экспрессией миелоид-ассоциированных маркёров (CD 15, CD65). Они часто обозначаются как бифенотипичные или лейкемией смешанного типа ("mixed-lineage leukaemia", или MLL).

Мы провели крупномасштабное исследование изменений транскрипции многих тысяч генов человека (на микрочипах фирмы Аффиметрикс) в случае лейкемий с хромосомными нарушениями, затрагивающими ген MLL1.

ALLs with t(4;ll)

other ALLs

T-cHI СР1Г rh* CD10*

Infi

ALL t(4 11)ALL

Рисунок 25. (А) Исследование с помощью ДНК-микроэррейной технологии (Affimetrix) экспрессионных профилей острых лимфобластических лейкемий (ALL) с перестройками MLL-1 [t(4; 11)] от других ALL. (Б) Относительные уовни экспрессии отобранных генов. Экспрессионные уровни выше и ниже 0 обозначены соответственно красным и зеленым цветом.

Было проанализировано более 50 разных образцов РНК. Все MLL1-ассоциированные лейкемии имели экспрессионные профили, отличающие их от других типов ALL и AML. Мы получили списки дифференциально экспрессирующихся генов, которые могут иметь важное значение как для диагностики, так и для последующего изучения критических метаболитических путей, ведущих к онкогенезу. Особое внимание было уделено, в частности, случаям ALL с t(4;l 1) (рис. 25). Многие из идентифицированных генов, характеристических для таких трансформированных клеток, были ранее ассоциированы с раком, апогггозом или контролем роста.

9. Развитие новой эффективной технологии получения и использования однодоменных мини-антител с целью исследования продуктов гена trithorax и других внутриклеточных компонентов (антигенов) in vitro и in vivo.

С целью разработать новые подходы для исследования in vivo функционирования Триторакс-ассоциированной регуляторной системы и других подобных регуляторных белков, а также более эффективно генерировать антитела к изучаемым белкам и структурам, мы решили освоить и развивать далее новую эффективную технологию генерирования «верблюжьих» однодоменных мини-антител (или «наноантител»). Наноантителами (или «нанотелами») называют однодоменные антиген-узнающие вариабельные фрагменты особых антител, присутствующих (наряду с традиционными антителами) в природе в норме у представителей семейства Верблюдовые (рис. 26, А и Б) и у некоторых видов хрящевых рыб. Наличие эффективной технологии получения (рис. 26, В), а также ряд уникальных особенностей наноантител, выгодно отличающих их от классических антител и их производных (малый размер, способность узнавать спрятанные для обычных антител эпитопы, высокая растворимость, стабильность, экономичность их наработки, простота генно-инженерных модификаций), предполагают большой потенциал использования наноантител в иммунобиотехнологии и медицине.

Мы разработали новый метод идентификации и исследования клеточных компонентов (в том числе и пока неизвестных), ассоциированных с определённым белком на примере получения однодоменных мини-антител (наноантител) к компонентам хроматина, ассоциированным с регуляторным белком TRITHORAX (TRX) в ядрах клеток Drosophila melanogaster (рис. 28).. Предлагаемый подход включает: а) иммунизацию верблюда смесью эндогенных антигенов («хроматином»), б) генерирование библиотеки антиген-связывающих вариабельных доменов особых одноцепочечных верблюжьих антител и в) использование этой библиотеки для отбора с помощью модифицированного метода

Щарнирны участок (существенно удлинён в IgG2)

Антитела НСАЬ, состоящие из димера только тяжелой цепи иммуноглобулина (^02,1^3)

Антиген-связывающий домен (12-15 кДа), «Наноантитело» (Nanobody ®)

Рисунок 26. Схематическое изображение обнаруживаемых у верблюдовых традиционных антител (А) и антител, состоящих только из тяжелых цепей (Б). Показаны также антиген-связывающие фрагменты этих антител. (В) Схема основных этапов процедуры генерирования «наноантител».

Процедура получения антиген-специфичных наноантител

Иммунизация верблюда материалом, обогащенным заданным антигеном

Экспрессия

растворимого

наноантитела

Трансформация £. coli

Взятие

крови =>

Получение Выделение

лимфоцитов мРНК

> » => ^^ I

RT-PCR с

и сполз ов анием специфических прайм ер о в

Встраивание генов

наноантител в вектор для фагового дисплея

Селекция клонов

специфиче ских наноантител

Генерирование библиотеки наноантител (~107 клонов) у

<-1

Экспрессия наноантител на поверхности фагов М13

фагового дисплея, «сэндвич-иммунной селекции»(рис.28), наноантител, узнающих клеточные компоненты, белки и комплексы, ассоциированные с определенным исследуемым белком.

Ягейва 1 с ак те-ТТиС 1еО цюлии

\УУ/

Ячейка 2 (контроль)

; 1гО кгныи укнзиро Банного цютдака

Контрольные ячвЧки:

1 • с мини-антителами, узнающими ТЯХ,

2 - без мини-антител

Ячейки с проверяемыми ыннн-анштелами

Ъз °

Инкубация с ^хроматином»

\а/

Инкубация с 5»5г.кот=кой

МИКИ-аНТИТвЛ.

поверхности бастгрисфга

Искомое антитело'

Инкубация с анти-ТЯХ

и детекция связывания

Эгооци*сБЯ5ашшхсяф|гоб(нх ангатфикацн я к повторение цикла сглавщнн). анализ отобранньк слонов кини-антнтгл

—<

Фоновый сигнал

Сильный сигнале сл\чае искомых мини-знштел

Рисунок 28. (А) Схема метода селекции бактериофагов, содержащих на поверхности наноантитела, специфически связывающихся с компонентами хроматиновых комплексов, ассоциированных с белком ТЮС. (Б) Схема анализа отобранных наноантител на способность связывать компоненты хроматина, содержащие ТЮС.

Принципиально новым в разработанном подходе является использование при селекции фаговых частиц метода, названного нами «сэндвич-иммунной селекцией». При этом подходе вначале на иммобилизованные специфические антитела к известному изучаемому белку (в данном случае аффинно-очищенные анти-ТЮС кроличьи антитела N1 и N6, полученные нами ранее) из материала хроматина вылавливаются (за счет связывания с ТЮС) специфические комплексы (ТЮС-содержащие), а затем отбираются фаговые частицы, содержащие экспрессированные на поверхности наноантитела (а также, внутри частицы, кодирующие их плазмидные клоны ДНК), которые связываются с другими (ТЮС-

ассоциированными) компонентами этих комплексов. Нам удалось отобрать несколько различных наноантител, которые узнают ядерные компоненты, по-видимому, способные к ассоциации с белком TRX. Мы надеемся, что разработанный подход позволит нам определить с помощью полученных наноантител компоненты хроматина или ядерного скелета, с которыми TRX взаимодействует in vivo.

Мы предложили ряд модификаций процедуры фагового дисплея для повышения эффективности селекции наноантител. В частности, мы впервые экспериментально продемонстрировали повышение эффективности процедуры селекции наноантител методом фагового дисплея путем дополнительного параллельного использования наряду с традиционным фагом-помощником также и модифицированного фага-помощника с N-концевой деледией в поверхностном белке рШ. Было показано (путем проведения нескольких независимых полномасштабных селекций против 2 различных антигенов), что данные методы являются взаимодополняющими, в совокупности позволяющими отбирать большее разнообразие наноантител к данному антигену.

В результате совместной работы с зарубежнами коллегами был разработан и продемонстрирован новый метод наблюдения за антигеном в живых клетках с помощью специально генерированных флуоресцирующих мини-антител. Генерированные нами наноантитела (анти-ламин, анти-цитокератин-8) были соединены с красным флуоресцентным белком, RFP ( путем клонирования их нуклеотидных последовательностей в одной общей рамке считывания), чтобы получить флуоресцирующие антиген-связывающие белки. Было показано, что такие флуоресцирующие мини-антитела могут быть экспрессированы в клетках (насекомых или млекопитающих) и могут связывать эпитопы в соответственно различных клеточных компартментах (рис. 29). Используя микроскопию живой клетки, оказалось возможным прослеживать динамические изменения антигенов сквозь весь клеточный цикл. Мы надеемся в скором будущем использовать этот новый метод наблюдения за антигеном в живых клетках для дальнейшего исследования TRX и функционально связанных с ним белков in vivo.

0АР1 тггде а-1лгл1п

Рисунок 29. Использование полученных однодоменных мини-антител (наноантител) для детекции антигенов в фиксированных клетках. (А) Окрашивание ядер слюнных желез О. melanogaster антителами к ламину. Окрашивание ламина (на периферии ядра) провдилось для сравнения как коммерчески-доступными моноклональными антителами (верхний ряд), так и полученными нами наноантителами (нижняя часть). (Б) Двойное окрашивание ядер клеток слюнных желез антителами к Тритораксу совместно с наноантителами к ламину (эти окрашивания не перекрываются). (В) Окрашивание фиксированных клеток (сверху вниз: мышиные миобласты С2С12, дрозофилиные клетки, НеЬа клетки человека, внизу - снова Б2 клетки) через 24-48 часов после трансфекции плазмидными ДНК, экспрессирующими соответственно анти-цитокератин-ЛРР (верхний ряд) или анти-ламин- ЯБР мини-антитела.

выводы

1. Определена структура и локализация в эмбрионах на разных стадиях развития альтернативно сплайсируемых транскриптов (длиной от 11 до 14,5 тысяч нуклеотндов) гена trithorax (trx) Drosophila melanogaster.

2. Проведены определение и сравнительный анализ первичной структуры гена trx у Drosophila virilis и у Drosophila melanogaster. Выявлена высокая консервативность как структуры этого гена, так и распределения его транскриптов в эибриогенезе.

3. Детектированы соответствующие альтернативным транскриптам две основные белковые изоформы триторакса (TRX I и TRXII, белки размером более 400 КДа). Установлено, что TRX является ядерным белком и способен связываться с определенными участками политенных хромосом слюнных желёз, по-видимому, соответствующими его генам-мишеням, активно транскрибируемым в данном типе клеток.

4. Показано, что TRX и ASH 1, продукт другого гена группы Триторакса, непосредственно взаимодействуют, и их участки связывания с политенными хромосомами совпадают или находятся в непосредственной близости друг от друга.

5. Проведено исследование in vivo регуляторного элемента PRE/TRE из дальней промоторной области гена Ultrabithorax с помощью специальных трансгенных конструкций. Выявлена необычно сложная его структура, состоящая из многих функционально значимых участков, способных взаимодействовать с белками как группы Триторакса, так и группы Поликомба.

7. Проведено крупномасштабное исследование изменений транскрипции многих тысяч генов человека (на микрочипах фирмы Аффиметрикс) в случае лейкемий с хромосомными нарушениями, затрагивающими ген ALL1/MLL1 (гомолог дрозофилиного TRX). Выявлены гены, которые могут быть непосредственно вовлечены в онкогенез. Полученные результаты помимо общей схожести изменений экспрессии генов с другими случаями раковой трансформации клеток демонстрируют также и наличие характерного рисунка транскрипционной активности генов в ALLl/MLLl-ассоциированных опухолях.

8. Показано, что белок Триторакс (TRX) может быть выявлен в ассоциации с не хромосомными элементами ядерного скелета. Получены данные о колокализации TRE со скаффолд/матрпкс-ассоциированными участками хромосом.

9. Разработан и продемонстрирован принципиально новый метод исследования клеточных компонентов, ассоциированных с заданным белком, на примере получения однодоменных мини-антител к компонентам хроматина, ассоциированным с регуляторным белком Триторакс (TRX). Продемонстрировано, что параллельное использование наряду с традиционным фагом-помощником предложенного модифицированного фага-помощника с N-концевой делецией в поверхностном белке рШ ведет к повышению эффективности селекции мини-антител методом фагового дисплея .

10. Разработан и продемонстрирован принципиально новый метод наблюдения за антигеном в живых клетках с помощью специально генерируемых флуоресцирующих мини-антител.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Sedkov I.*, Tillib S.*, Mizrokhi L. and Mazo A. (1994) The bithorax complex is regulated by trithorax earlier during Drosophila embryogenesis than is the Antennapedia complex, correlating with a bithorax-like expression pattern of distinict early trithorax transcripts. Development 120,1907-1917.

2. Kuzin B.*, Tillib S.*, Sedkov I., Mizrokhi L. and Mazo A. (1994) The Drosophila trithorax gene encodes a chromosomal protein and directly regulates the region-specific homeotic gene fork head. Genes & Dev. 8,2478-2490.

3. Tillib S., Sedkov Y., Mizrokhi. L., Mazo A. (1995) Conservation of structure and expression of the trithorax gene between Drosophila virilis and Drosophila melanogaster. Mechanisms of Development S3, 113-122.

4. Rozenblatt-Rosen O.*, Rosovskaya T.*, Burakov D.*, Tillib S*., Sedkov Yu.*, Blechman J., Nakamura T.,Croce C., Mazo A. and Canaani E.(1998) The C-terminal SET domains of ALL-I and TRITHORAX interact with the INII and SNRI proteins, components of the SWI/SNF complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,4152-4157.

5. Sedkov Y„ Benes J., Berger J., Riker K., Tillib S., Jones R. and Mazo A. (1999) Molecular genetic analysis of Drosophila trithorax-related gene that encodes a novel SET domain protein. Mechanisms of Development 82, 171-179.

6. Tillib S., Petruk S., Sedkov Y., Kuzin A., Fujioka M., Goto T. and Mazo A. (1999) Trithorax and Polycomb group response elements within a Ultrabithorax transcription maintenance unit consist of closely situated but separable sequences. Mol. Cell. Biol. 19, 5289-5202.

7. Rosovskaya Т., Tillib S„ Smith S. , Sedkov Y„ Rozenblatt-Rosen O., Petruk S., Yano Т., Nakamura Т., Ben-Simchon L., Gildea J., Croce C., Shearn A., Canaani E and Mazo A. (1999)

Trithorax and ASH 1 interact directly and associate with the Trithorax-Group responsive bxd region of the Ultrabithorax promoter. Mol. Cell. Biol. 19, 6441-6447.

8. Petruk S., Sedkov Y., Smith S., Tillib S., Kraevsky V., Nakamura Т., Canaani E., Croce C.M., Mazo A. Epigenetic regulator trithorax and acetyltransferase dCBP act in a protein complex to maintain expression of a homeotic gene. Science, 2001,294: 1331-1334.

9. Tillib S.V., Mirzabekov A.D. (2001) Advances in the analysis of DNA sequence variations using oligonucleotide microchip technology. Cuir Opin Biotechnol. 12, 53-58.

10. Rozovskaia Т., Ravid-Amir O., Tillib S., Getz G., Feinstein E., Agrawal H., Nagler A., Rappaport E.F., Issaeva I., Matsuo Y., Kees U.R., Lapidot Т., Lo Coco F., Foa R., Mazo A., Nakamura Т., Croce C.M., Cimino G., Domany E., Canaani E. Expression profiles of acute lymphoblastic and myeloblasts leukemias with ALL-1 rearrangements, Proc Natl Acad Sci USA. 2003, 100(13):7853-7858.

11. Л.А.Лебедева, С.В.Тиллиб. Глобальный фактор поддержания тканеспецнфического активного состояния генов Diosophila melanogaster белок TRITHORAX, ассоциирован с ядерным матриксом. Генетика 2003, 39(2):250-258.

12. Smith S.T., Petruk S., Sedkov Y., Cho E., Tillib S., Canaani E., Mazo A.

Modulation of heat shock gene expression by the TAC1 chromatin-modifying complex. Nature Cell Biol. 2004; 6(2): 162-7.

13. Rothbauer U., Zolghadr K., Tillib S., Nowak D., Schermelleh L., Galil A., Backmann N., Conrath K., Muyldermans S., Cardoso M.C., Leonhardt H. Targeting and tracing antigens, in live cells with fluorescent nanobodies. Nature Methods 2006, 3, 887-889.

14. Ряховский А.А., Тнллиб C.B. Иммунопреципитационное картирование TRX-ассоциированных участков хромосом в промоторе гена fkh в клетках слюнных желез Drosophila melanogaster. Генетика 2007, Т. 43, №9, С. 1181-1189.

15. Ряховский А.А., Тиллнб С.В. Колокализация S/MAR и TRE в регуляторных участках хромосом тканеспецифически экспрессирующихся генов Drosophila melanogaster. Доклады Академии Наук 2007, Т. 416, №3, С. 416-419.

16. Вятчанин А.С., Тиллиб С.В. Новый подход к исследованию клеточных компонентов, ассоциированных с определённым белком. Доклады Академии Наук. 2008. Т.421. №6. С. 826-829.

17. Вятчанин А.С., Тиллнб С.В. Модификации процедуры фагового дисплея для повышения эффективности селекции антиген-связывающих доменов особых одноцепочечных верблюжьих антител. Биотехнология. 2008. №4. С. 32-34.

18. S. Muyldermans, T.N. Baral, V. Cortez Retamozzo, P. De Baetselier, E. De Genst, J. Kinne, H. Leonhardt, S. Magez, V.K. Nguyen, H. Revets, U. Rothbauer, B. Stijlemans, S. Tillib, U. Wernery,

L. Wyns, Gh. Hassanzadeh-Ghassabeh and D. Saerens. Camelid immunoglobulins, nanobody technology. Veterinary Immunology andImmunopathology. 2009, 128(l-3):178-83.

19. Тиллиб C.B., Иванова Т.И., Васильев Jl.A. Фингерпринтный анализ селекции «наноантител» методом фагового дисплея с использованием двух вариантов фагов-помощников. 2010. Acta Naturae 2, №3 (6), 100-108.

20. Тиллиб С. В. «Верблюжьи антитела» - эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. 2011. Молекулярная биология 45, №1, 77-85.

♦Равное участие в работе на правах первого автора

Автор благодарит проф. Крамерова Д.А., академика Георгиева Г.П. и других сотрудников лаборатории «биосинтеза нуклеиновых кислот» в ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН (1982-1991 гг.) за полученную хорошую базовую подготовку в области молекулярной биологии; проф. Мазо A. (Mazo А.) и проф. Канаани Э. (Canaani Е.), а также сотрудников их лабораторий в Университете Томаса Джефферсона (г. Филадельфия, США), в первую очередь, моих бывших коллег - д-ра Седкова Ю.А. и проф. Кузина Б.А., за участие, помощь и поддержку в работе; проф. Муйлдерманса (S. Muyldermans) и сотрудников его лаборатории в Свободном Университете Брюсселя (г. Брюссель, Бельгия) за помощь в освоении технологии получения однодоменных верблюжьих антител; сотрудников моей группы и сотрудников других подразделений ИБГ РАН, особенно проф. Георгиеву С.Г., сотрудников лаборатории академика Георгиева П.Г., администрацию ИБГ РАН за помощь в работе; Рутовскую М.В. и сотрудников научно-экспериментальной базы «Черноголовка» ИПЭЭ имени А.Н. Северцова РАН за помощь в работе с верблюдами; Программу «Молекулярная и клеточная биология» и Российский фонд фундаментальных исследований за финансовую поддержку работы.

Благодарности.

Заказ № 176-А/03/2011 Подписано в печать 25.03.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 2.5

:ч\ ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

\ шс»с.с/г. ги; е-таИ:т/о@ф.ги

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Тиллиб, Сергей Владимирович

Список сокращений

I. Введение

II. Обзор литературы

1. Молекулярные механизмы эпигенетической регуляции «клеточной памяти»

1.1. Модификации гистонов, гипотеза «гостонового кода»

1.2. Варианты гистонов и эпигенетическая память

1.3. Метилирование ДНК, или динуклеотид «Св» как геномный сигнальный модуль

1.4. Белки, кодируемые генами групп Поликомба (РсО) и Триторакса — ключевые эпигенетические факторы поддержания тканеспецифической экспрессии генов.

1.4.1. Система генов РсСДгхО

1.4.2. Белки группы Поликомба

1.4.3. Белки группы Триторакса 48 1.4.3.1. Белок М1Х1 — ортолог ТКХ у млекопитающих

1.4.4. Регуляторные хромосомные элементы (РКЕ/ТЯЕ), посредством взаимодействия с которыми осуществляют свою функцию белки групп Поликомба и Триторакса

1.5. Хроматин-ремоделирующие комплексы

1.6. Некодирующие РНК

1.7. Ядерная организация генома 71 1.7. Единство эпигенетических систем регуляции

2. Однодоменные мини-антитела - новый эффективный инструмент для исследований, применения в иммунобиотехнологии и медицине

2.1. Введение

2.2. Неканонические верблюжьи антитела (НСАЬ), состоящие из Димера только тяжелой цепи иммуноглобулина.

2.3. Технология получения однодоменных мини-антител наноантител») с заданной специфичностью III. Экспериментальная часть

1. Определение структуры и локализации в эмбрионах БгоБорЬИа melanogaster на разных стадиях развития альтернативно сплайсируемых транскриптов гена іїШогах (ігх)

1.1. Материалы и методы.

1.2. Результаты и обсуждение

2. Определение и сравнительный анализ первичной структуры и экспресии гена ігх у ОгояоркПа уігіШ и у ВгояоркПа melanogaster.

2.1. Материалы и методы.

2.2. Результаты и обсуждение

3. Исследование основных белковых продуктов гена іїИІюгах (ігх)

3.1. Материалы и методы.

3.2. Результаты и обсуждение

4. Исследование взаимодействий белковых продуктов гена ігх с другими ядерными белками, с белковыми продуктами других генов группы Триторакса.

4.1. Материалы и методы.

4.2. Результаты и обсуждение

5. Исследование хромосомного регуляторного элемента (ТКЕ/РКЕ), необходимого для функционирования Триторакс-ассоциированной системы поддержания заданного уровня тканеспецифической транскрипции и локализованного в дальней промоторной области гена иЬгаЬикогах.

5.1. Материалы и методы.

5.2. Результаты и обсуждение

6. Исследование хромосомного регуляторного элемента, Необходимого для функционирования Триторакс-ассоциированной системы поддержания заданного уровня тканеспецифической транскрипции и локализованного в промоторной области гена fork head (fkh).

6.1. Материалы и методы.

6.2. Результаты и обсуждение

7. Обнаружение ассоциации продуктов гена trithorax белков TRX) с компонентами ядерного скелета (матрикса).

7.1. Материалы и методы.

7.2. Результаты и обсуждение

8. Исследование изменений транскрипции различных генов человека в случае лейкемий с хромосомными нарушениями, затрагивающими ген ALL1/MLL1 (кодирующего ортолог TRX)

8.1. Материалы и методы.

8.2. Результаты и обсуждение

9. Развитие технологии получения и использования однодоменных мини-антител с целью исследования продуктов гена trithorax и других внутриклеточных компонентов (антигенов) in vitro и in vivo.

9.1. Материалы и методы.

9.2. Результаты и обсуждение

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование молекулярных механизмов функционирования продуктов гена trithorax в регуляции тканеспецифической экспрессии генов у Drosophila melanogaster"

Интерес к генам и белкам групп Триторакса и Поликомба особенно усилился несколько лет тому назад, когда была обнаружена непосредственная связь данных хромосомных белков с энзиматическими активностями, модифицирующими гистоны и структуру нуклеосом. Так, например, белок TRX (сокращение от TRITHORAX, или Триторакс, продукт гена trx) и его гомолог у млекопитающих, протоонкоген MLL1 (ALLI, HRX), обладают гистон-метилтрансферазной активностью, за которую отвечает высококонсервативный SET-домен. Этот домен специфически метилирует лизин 4 гистона НЗ, что является эпигенетическим маркером, типично ассоциированным с транскрипционно активным хроматином.

Эпигенетические регуляторы групп Триторакса и Поликомба осуществляют свою функцию посредством взаимодействия с особыми регуляторными цис-элементами генов-мишеней. Эти элементы обычно называют PRE/TRE («Polycomb- / trithorax- response elements»). Так как PRE и TRE часто колокализуются, их вместе также называют «элементами поддержания» («maintenance elements») тканеспецифической активности гена, или «модулями клеточной памяти». Принципиальные особенности самих PRE/TRE, детали механизмов их узнавания хромосомными факторами и последующего распространения специфического воздействия на экспрессию регулируемого гена остаются слабо изученными. Эти элементы в некоторых случаях локализуются на значительном (десятки тысяч пар нуклеотидов) отдалении от промотора. Представление об организации этих участков ДНК на сегодняшний день остаётся довольно запутанным: "довольно протяжённый без чётко выраженных краёв элемент, чья функция зависит от множественных кооперативно работающих суб-элементов". Эти «модули клеточной памяти» обычно непосредственно соседствуют с энхансерными и репрессорными элементами, или даже включают их в свой состав. Интересные, но пока противоречивые данные были получены недавно о связи этих элементов с районами транскрипции некодирующих регуляторных РНК, о возможной связи PRE/TRE с системами транскрипционной интерференции или транскрипционной активации/репрессии близко расположенного промотора гена. Принципиальная сложность изучения этих элементов связана с тем, что их активность проявляется только в контексте развития и зависит от конкретного типа ткани/клетки. Большая часть сведений о PRE/TRE была получена при детальном функциональном изучении in vivo всего нескольких генетических локусов, что, очевидно, недостаточно. При этом не было выявлено протяжённых гомологичных последовательностей или каких-то воспроизводимых выраженных структурных особенностей. Большинство Рс-G/trx-G - белков, по-видимому, не способны связываться со строго специфической последовательностью ДНК. Некоторые белки (PHO/PHOL, GAGA factor, Zeste, Pipsqueak, Dspl, Grainyhead/Elf, Spl/KLF) в разной мере обладают подобной активностью. Эти белки, очевидно, участвуют в каких-то элементах процесса связывания регуляторных белковых комплексов с определёнными участками ДНК, однако, только участием этих белков объяснить процесс специфического узнавания не удаётся. Предполагается, что TRE и PRE в данном гене в значительной степени колокализуются и функционируют взаимоисключающе, в зависимости от типа клетки.

Исторически большинство исследователей эпигенетической регуляции уделяли большее внимание механизмам репрессии генов, считая поддержание их активности пассивным процессом. В настоящее время происходит заметный пересмотр такого одностороннего представления. Накапливается все больше веских аргументов об активной природе эпигенетически регулируемого поддержания активной экспрессии многих важных регуляторных генов. Именно исследованию экспрессии и механизмов функционирования продуктов одного из главных факторов поддержания тканеспецифической активности генов, гена triihorax, и посвящена данная работа.

Данная диссертационная работа включает в себя проверенные временем и признаваемые ведущими учеными разных стран пионерские исследования в области изучения транскриптов и белковых продуктов гена triihorax, их взаимодействий с другими белками группы Триторакса, а также исследования in vivo с помощью трансгенных конструкций регуляторных элементов (TRE), необходимых для TRX-зависимого поддержания экспрессии генов-мишеней. Впервые было показано, что TRE/PRE элемент может состоять из множественных суб-элементов, существенных для функционирования как trxG-, так и PcG-белков, причём эти суб-элементы явно взаимодействуют друг с другом. В результате сложных как конкурентных, так и кооперативных взаимодействий определяется структура локального хроматина и, как следствие, соответствующий для данной ткани уровень экспрессии гена. В ходе проделанной работы были впервые получены и опубликованы в ведущих журналах новые данные, посвященные белок-белковым взаимодействиям среди продуктов различных генов группы trx-G; очистке первого белкового комплекса (ТАС1), содержащего TRX, Sbfl (вероятно, антифосфатаза) и гистон-ацетилтрансферазу dCBP; участию TAC 1-комплекса в регуляции экспрессии генов теплового шока. Было проведено крупномасштабное исследование изменений транскрипции многих тысяч генов человека (на микрочипах фирмы Аффиметрикс) в случае лейкемий с хромосомными нарушениями, затрагивающими ген ALL1/MLL1 (гомолог дрозофилиного TRX), в результате которого были выявлены гены, которые могут быть непосредственно вовлечены в онкогенез. Было установлено, что применяемые ранее условия фракционирования (выделение комплекса ТАС1, \Petruk et al., 2001]) могут приводить к потере значительной доли TRX вследствие его тенденции к ассоциации с нерастворимыми компонентами ядерного скелета [Лебедева и Тшлиб, 2003]. Более того, подобная ассоциация является, по-видимому, характерной особенностью белков, связанных с системой модификации гистонов (хроматина). Одним из основных инструментов в исследовании белков являются антитела. На протяжении многих лет исследований мы генерировали различные антитела, узнающие разные домены исследуемых белков. Конечно же, в первую очередь, получали антитела к доменам TRX. Эти антитела затем использовались во многих лабораториях мира. Также использовались полученные нами для исследования TRE/PRE конструкции и соответстующие линии трансгенных мух. В последние годы мы уделяли большое внимание разработке и использованию новой высокоэффективной технологии генерирования однодоменных мини-антител. С помощью этой технологии мы разработали новый подход к исследованию клеточных компонентов (в том числе и пока неизвестных), ассоциированных с определённым белком на примере получения однодоменных мини-антител к компонентам хроматина, ассоциированным с регуляторным белком Триторакс.г

Совместно с зарубежными коллегами мы разработали новый подход для наблюдения за антигеном в живых клетках с помощью специально получаемых однодоменных мини-антител, соединенных (экспрессирующихся в одной общей рамке считывания) с флуоресцирующим белком. Полученные в настоящее время мини-антитела к различным доменам ТКХ планируется использовать для получения трансгенных конструкций, экспрессирующих такие мини-антитела, соединенные с флуоресцирующим белком в разных тканях дрозофилы. Мы надеемся, что этот подход позволит изучать процессинг и функционирование белковых продуктов гена ггШогах (а также других белков) в максимально приближенных к нативным условиях.

Прежде, чем перейти к описанию экспериментальной части работы, мы остановимся на обзоре литературных данных, связанных с тематикой работы. Основное внимание в обзоре будет уделено молекулярным механизмам «эпигенетической регуляции», связанным с модификациями гистонов, метилированием ДНК, особенностями функционирования белков групп Поликомба и Триторакса, с некодирующими РНК и ядерной организацией генома. Будет также дан обзор особенностей свойств и технологии получения однодоменных мини-антител.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Тиллиб, Сергей Владимирович

V. выводы

1. Определена структура и локализация в эмбрионах на разных стадиях развития альтернативно сплайсируемых транскриптов (длиной от 11 до 14,5 тысяч нуклеотидов) гена trithorax (trx) Drosophila melanogaster.

4. Показано, что TRX и ASH1, продукт другого гена группы Триторакса, непосредственно взаимодействуют, и их участки связывания с политенными хромосомами совпадают или находятся в непосредственной близости друг от друга.

7. Проведено крупномасштабное исследование изменений транскрипции многих тысяч генов человека (на микрочипах фирмы Аффиметрикс) в случае лейкемий с хромосомными нарушениями, затрагивающими ген АЫЛ/МЬЫ (гомолог дрозофилиного ТЮС). Выявлены гены, которые могут быть непосредственно вовлечены в онкогенез. Полученные результаты помимо общей схожести изменений экспрессии генов с другими случаями раковой трансформации клеток демонстрируют также и наличие характерного рисунка транскрипционной активности генов в АЬЫ/МЬЬ1 -ассоциированных опухолях.

8. Показано, что белок Триторакс (ТЮС) может быть выявлен в ассоциации с не хромосомными элементами ядерного скелета. Получены данные о колокализации ТЯЕ со скаффолд/матрикс-ассоциированными участками хромосом.

9. Разработан и продемонстрирован принципиально новый метод исследования клеточных компонентов, ассоциированных с заданным белком, на примере получения однодоменпых мини-антител к компонентам хроматина, ассоциированным с регуляторным белком Триторакс (ТЮС).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

5. Sedkov Y., Benes J., Berger J., Riker K., Tillib S., Jones R. and Mazo A. (1999) Molecular genetic analysis of Drosophila trithorax-related gene that encodes a novel SET domain protein. Mechanisms of Development 82, 171-179.

7. Rosovskaya Т., Tillib S., Smith S. , Sedkov Y., Rozenblatt-Rosen O., Petruk S., Yano Т., Nakamura Т., Ben-Simchon L., Gildea J., Croce C., Shearn A., Canaani E and Mazo A. (1999) Trithorax and ASH1 interact directly and associate with the Trithorax-Group responsive bxd region of the Ultrabithorax promoter. Mol. Cell. Biol. 19, 6441-6447.

8. Petruk S., Sedkov Y., Smith S., Tillib S., Kraevsky V., Nakamura Т., Canaani

E., Croce C.M., Mazo A. Epigenetic regulator trithorax and acetyltransferase

221 dCBP act in a protein complex to maintain expression of a homeotic gene. Science, 2001, 294: 1331-1334.

9. Tillib S.V., Mirzabekov A.D. (2001) Advances in the analysis of DNA sequence variations using oligonucleotide microchip technology. Curr Opin Biotechnol. 12, 53-58.

11. Л.А.Лебедева, С.В.Тиллиб. Глобальный фактор поддержания тканеспецифического активного состояния генов Diosophila melanogaster белок TRITHORAX, ассоциирован с ядерным матриксом. Генетика 2003, 39(2):250-258.

12. Smith S.T., Petruk S., Sedkov Y., Cho E., Tillib S., Canaani E., Mazo A. Modulation of heat shock gene expression by the TAC1 chromatin-modifying complex. Nature Cell Biol. 2004; 6(2): 162-7.

13. Rothbauer U., Zolghadr K., Tillib S., Nowak D., Schermelleh L., Gahl A., Backmann N., Conrath K., Muyldermans S., Cardoso M.C., Leonhardt H. Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nature Methods 2006, 3, 887-889.

14. Ряховский A.A., Тиллиб C.B. Иммунопреципитационное картирование TRX-ассоциированных участков хромосом в промоторе гена fkh в клетках слюнных желез Drosophila melanogaster. Генетика 2007, Т. 43, №9, С. 11811189.

15. Ряховский А.А., Тиллиб С.В. Колокализация S/MAR и TRE в регуляторных участках хромосом тканеспецифически экспрессирующихся генов Drosophila melanogaster. Доклады Академии Наук 2007, Т. 416, №3, С. 416-419.

17. Вятчанин А.С., Тиллиб С.В. Модификации процедуры фагового дисплея для повышения эффективности селекции антиген-связывающих доменов особых одноцепочечных верблюжьих антител. Биотехнология. 2008. №4. С. 32-34.

18. S. Muyldermans, T.N. Baral, V. Cortez Retamozzo, P. De Baetselier, E. De Genst, J. Kinne, H. Leonhardt, S. Magez, V.K. Nguyen, H. Revets, U. Rothbauer, B. Stijlemans, S. Tillib, U. Wernery, L. Wyns, Gh. Hassanzadeh-Ghassabeh and D. Saerens. Camelid immunoglobulins, nanobody technology. Veterinary Immunology andImmunopathology. 2009, 128(l-3):178-83.

19. Тиллиб C.B., Иванова Т.И., Васильев JI.А. Фингерпринтный анализ селекции «наноантител» методом фагового дисплея с использованием двух вариантов фагов-помощников. 2010. Acta Naturae 2, №3 (6), 100-108.

20. Тиллиб С. В. «Верблюжьи антитела» - эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. 2011 .Молекулярная биология 45, №1, 77-85.

Равное участие в работе на правах первого автора

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор благодарит проф. Крамерова Д.А., академика Георгиева Г.П. и других сотрудников лаборатории «биосинтеза нуклеиновых кислот» в ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН (1982-1991 гг.) за полученную хорошую базовую подготовку в области молекулярной биологии; проф. Мазо A. (Mazo А.) и проф. Канаани Э. (Canaani Е.), а также сотрудников их лабораторий в Университете Томаса Джефферсона (г. Филадельфия, США), в первую очередь, моих бывших коллег - др. Седкова Ю.А. (Sedkov Y.) и проф. Кузина Б.А. (Kuzin В.), за участие, помощь и поддержку в работе; проф. Муйлдерманса (S. Muyldermans) и сотрудников его лаборатории в Свободном Университете Брюсселя (г. Брюссель, Бельгия) за помощь в освоении технологии получения однодоменных верблюжьих антител; сотрудников моей группы и сотрудников других подразделений ИБГ РАН, особенно проф. Георгиеву С.Г., сотрудников лаборатории академика Георгиева П.Г., администрацию ИБГ РАН за помощь в работе; Рутовскую М.В. и сотрудников научно-экспериментальной базы «Черноголовка» ИПЭЭ имени А.Н. Северцова РАН за помощь в работе с верблюдами; Программу «Молекулярная и клеточная биология» и Российский фонд фундаментальных исследований за финансовую поддержку работы.

IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Данная работа, проводимая в течение последних 20 лет, включает в себя проверенные временем и признаваемые ведущими учеными разных стран пионерские исследования в области изучения транскриптов и белковых продуктов гена trithorax, их взаимодействий с другими белками группы Триторакса, а также исследования in vivo с помощью трансгенных конструкций регуляторных элементов (TRE), необходимых для TRX-зависимого поддержания экспрессии генов-мишеней. Впервые было показано, что TRE/PRE элемент может состоять из множественных субэлементов, существенных для функционирования как TrxG-, так и PcG-белков, причём эти суб-элементы явно взаимодействуют друг с другом. В результате сложных как конкурентных, так и кооперативных взаимодействий определяется структура локального хроматина и, как следствие, соответствующий для данной ткани уровень экспрессии гена. В ходе проделанной работы были впервые получены и опубликованы в ведущих журналах новые данные, посвященные а) белок-белковым взаимодействиям среди продуктов различных генов группы trx-G, б) очистке первого белкового комплекса (ТАС1), содержащего TRX, в котором также выявлялась гистон-ацетилтрансфераза dCBP и вероятная антифосфатаза Sbfl, в) участию TAC 1-комплекса в регуляции экспрессии генов теплового шока, г) в работе по крупномасштабному исследованию изменений транскрипции многих тысяч генов человека (на микрочипах фирмы Аффиметрикс) в случае лейкемий с хромосомными нарушениями, затрагивающими ген ALL1/MLL1 (гомолог дрозофилиного TRX), в результате которой были выявлены гены, которые могут быть непосредственно вовлечены в онкогенез. Было установлено, что применяемые ранее условия фракционирования (выделение комплекса ТАС1, Petruk et al., Science, 2001) могут приводить к потере значительной доли TRX вследствие его тенденции к ассоциации с нерастворимыми компонентами ядерного скелета (Лебедева и Тиллиб,

Генетика 2003). Одним из основных инструментов в исследовании белков являются антитела. На протяжении многих лет исследований мы генерировали различные антитела, узнающих разные домены исследуемых белков. Конечно же, в первую очередь, получали антитела к доменам ТЮС Эти антитела используются во многих лабораториях мира. Также использовались полученные нами для исследования ТЯЕ/РЯЕ конструкции и соответстующие линии трансгенных мух. В последние годы мы уделяли большое внимание разработке и использованию новой высокоэффективной технологии генерирования однодоменных мини-антител. С помощью этой технологии мы разработали новый подход к исследованию клеточных компонентов (в том числе и пока неизвестных), ассоциированных с определённым белком на примере получения однодоменных мини-антител к компонентам хроматина, ассоциированным с регуляторным белком Триторакс.

Совместно с зарубежными коллегами мы разработали новый подход для наблюдения за антигеном в живых клетках с помощью специально получаемых однодоменных мини-антител, соединенных (экспрессирующихся в одной общей рамке считывания) с флуоресцирующим белком. Полученные в настоящее время мини-антитела к различным доменам ТЮС планируется использовать для получения трансгенных конструкций, экспрессирующих такие мини-антитела, соединенные с флуоресцирующим белком в разных тканях дрозофилы. Мы надеемся, что этот подход позволит изучать процессинг и функционирование белковых продуктов гена Ыйюгах в максимально приближенных к нативным условиях.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Тиллиб, Сергей Владимирович, Москва

1. Agalioti, T., Chen, G., Thanos D. (2002). Deciphering the transcriptional histone acetylation code for a human gene. Cell 111, 381-92.

2. Andrew D.J., Henderson K.D., Seshaiah P. (2000) Salivary gland development in Drosophila melanogaster. Mech. Dev. V. 92, P. 5-17.

3. Ayton P.V., Cleary V.L. Molecular mechanisms of leukemogenesis mediated by MLL fusion proteins. // 0ncogene.2001. V. 20, P. 5695-5707.

4. Bae, E., Calhoun, C., V., Levine, M., Lewis, B., E., Drewell A., R. (2002). Characterization of the intergenic RNA profile at abdominal-A and Abdominal-B in the Drosophila bithorax complex. Proc Natl Acad Sci USA 99, 16847-52.

5. Bantignies, F., Goodman, H., R., Smolik M., S. (2000). Functional interaction between the coactivator Drosophila CREB-binding protein and ASH1, a member of the trithorax group of chromatin modifiers. Mol Cell Biol 20, 9317-30.

6. Bantignies, F., Grimaud, C., Lavrov, S., Gabut, M., Cavalli G. (2003). Inheritance of Polycomb-dependent chromosomal interactions in Drosophila. Genes Dev 17, 2406-20.

7. Barbas III C.F., Burton D.R., Scott J.K., Silverman G. J. (2001) Phage Display: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 738 pp.

8. Barrack E.R., Coffey D.S. The specific binding of estrogens and androgens to the nuclear matrix of sex responsive tissues. // J. Biol. Chem. 1980. V. 255,1. P. 7265-7275.

9. Beisel, C., Buness, A., Roustan-Espinosa, M., I., Koch, B., Schmitt, S. et al. (2007). Comparing active and repressed expression states of genes controlled by the Polycomb/Trithorax group proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 16615-20.

10. Beisel, C., Imhof, A., Greene, J., Kremmer, E. and Sauer, F. (2002). Histone methylation by the Drosophila epigenetic transcriptional regulator Ashl. Nature 419, 857-62.

11. Berezney R., Mortillaro M.J., Ma H., Wei X., Samarabandu J. The nuclear matrix: a structural milieu for genomic function. // Int. Rev. Cytol. 1995. V. 162, P. 1-65.

12. Berger L., S. (2002). Histone modifications in transcriptional regulation. Curr Opin Genet Dev 12, 142-8.

13. Bernstein B.E., Mikkelsen T.S., Xie T.S., Kamal M et al. (2006). A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell 125, 315-326.

14. Bhaumik, R., S., Green R., M. (2001). SAGA is an essential in vivo target of the yeast acidic activator Gal4p. Genes Dev 15, 1935-45.

15. Bird A. (2011) The dinucleotide CG as a genomic signalling module. J. Mol. Biol, (in press, doi:10.1016/j.jmb.2011.01.056).

16. Birke, M., Schreiner, S., Garcia-Cuellar, P., M., Mahr, K., Titgemeyer, F. et al. (2002). The MT domain of the proto-oncoprotein MLL binds to CpG-containing DNA and discriminates against methylation. Nucleic Acids Res 30, 958-65.

17. Blomen V.A. and Boonstra J. (2011) Stable transmission of reversible modificationsA maintenance of epigenetic information through the cell cycle. Cell. Mol. Life Sci. 68, 27-44.

18. Bloyer, S., Cavalli, G., Brock, W., H., Dura M., J. (2003). Identification and characterization of polyhomeotic PREs and TREs. Dev Biol 261, 426-42.

19. Bode J., Benham C., Knopp A., Mielke C. Transcriptional augmentation: modulation of gene expression by scaffold/matrix-attached regions (S/MAR elements). // Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 2000. V. 10, P. 73-90.

20. Breen T.R. and Harte P.J. (1991). Molecular characterization of the trithorax gene, a positive regulator of homeotic gene expression in Drosophila. Mech. Dev. 35, 113-127.

21. Breiling, A., Bonte, E., Ferrari, S., Becker, B., P., Paro R. (1999). The Drosophila polycomb protein interacts with nucleosomal core particles In vitro via its repression domain. Mol Cell Biol 19, 8451-60.

22. Breiling, A., Sessa, L., Orlando V. (2007). Biology of polycomb and trithorax group proteins. Int Rev Cytol 258, 83-136.

23. Breiling, A., Turner, M., B., Bianchi, E., M., Orlando V. (2001). General transcription factors bind promoters repressed by Polycomb group proteins. Nature 412, 651-5.

24. Brickman, M., J., Adam, M., Ptashne M. (1999). Interactions between an HMG-1 protein and members of the Rel family. Proc Natl Acad Sci USA 96, 10679-83.

25. Brissette R., Goldstein N.I. 2007. The use of phage display peptide libraries for basic and translational research. Methods Mol Biol. 383, 203-213.

26. Brock, W., H., Lohuizen, v. M. (2001). The Polycomb group-no longer an exclusive club? Curr Opin Genet Dev 11, 175-81.

27. Brotherton, T., Zenk, D., Kahanic, S., Reneker J. (1991). Avian nuclear matrix proteins bind very tightly to cellular DNA of the beta-globin gene enhancer in a tissue-specific fashion. Biochemistry 30, 5845-50.

28. Brown, E., C., Howe, L., Sousa, K., Alley, C., S., Carrozza, J., M. et al. (2001). Recruitment of HAT complexes by direct activator interactions with the ATM-related Tral subunit. Science 292, 2333-7.

29. Brown, L., J., Fritsch, C., Mueller, J., Kassis A., J. (2003). The Drosophila pho-like gene encodes a YY1-related DNA binding protein that is redundant with pleiohomeotic in homeotic gene silencing. Development 130, 285-94.

30. Brown, L., J., Mucci, D., Whiteley, M., Dirksen, L., M., Kassis A., J.1998). The Drosophila Polycomb group gene pleiohomeotic encodes a DNA227binding protein with homology to the transcription factor YY1. Mol Cell 1, 1057-64.

31. Buchenau, P., Hodgson, J., Strutt, H., Arndt-Jovin J., D. (1998). The distribution of polycomb-group proteins during cell division and development in Drosophila embryos: impact on models for silencing. J Cell Biol 141, 46981.

32. Burton D. R. 1985. Immunoglobulin G: functional sites. Mol. Immunol. 22, 161-206.

33. Butler L.H., Slany R., Cui X., Cleary M.L., Mason D.Y. The HRX proto-oncogene product is widely expressed in human tissues and localizes to nuclear structures. // Blood. 1997. V. 89, P. 3361-3370.

34. Campos-Ortega J.A. and Hartenstein V. (1985). The embryonic development of Drosophila melanogaster. Springer-Verlag, Berlin, Germany.

35. Canaani, E., Nakamura, T., Rozovskaia, T., Smith, T., S., Mori, T. et al. (2004). ALL-1/MLL1, ahomologue of Drosophila TRITHORAX, modifies chromatin and is directly involved in infant acute leukaemia. Br J Cancer 90, 756-60.

36. Cao, R., Wang, L., Wang, H., Xia, L., Erdjument-Bromage, H. et al.2002). Role of histone H3 lysine 27 methylation in Polycomb-group silencing. Science 298, 1039-43.

37. Cao, R., Zhang Y. (2004). The functions of E(Z)/EZH2-mediated methylation of lysine 27 in histone H3. Carr Opin Genet Dev 14, 155-64.

38. Caslini C., Alarcon A.S., Hess J.L., Tanaka R., Miirti K.G., Biondi A. The amino terminus targets the mixed lineage leukemia (MLL) protein to the nucleolus, nuclear matrix and mitotic chromosomal scaffolds. // Leukemia. 2000. V. 14, P. 1898-1908.

39. Cavalli, G., Paro R. (1999). Epigenetic inheritance of active chromatin after removal of the main transactivator. Science 286, 955-8.

40. Cavener D.R. and Ray S.C. (1991). Eukaryotic start and stop translational sites. Nucleic Acids Res. 19, 3185-3192.

41. Chalkley G., Moshkin Y., Langenberg K., Bezstarosti K. et al.(2008). Thetranscriptional coactivator SAYP is a trithorax group signature subunit of the PBAP chromatin remodeling complex. Mol Cell Biol. 28(9), 2920-2929.

42. Chan, S., C., Rastelli, L., Pirrotta V. (1994). A Polycomb response element in the Ubx gene that determines an epigenetically inherited state of repression. EmboJ 13, 2553-64.

43. Chen Z., Zang J., Whetstine J., Hong X. et al. (2006). Structural insights into histone demethylation by JMJD2 family members. Cell 125, 691-702.

44. Chen Y., Sprung R., Tang Y., Ball H., Sangras B., Kim S.C., Falck J.R., Peng J., Gu W., Zhao Y. (2007). Lysine propionylation and butyrylation are novel post-translational modifications in histones. Mol Cell Proteomics 6, 812-819.

45. Chernov, P., I., Akopov, B., S., Nikolaev G., L. (2004). Structure and function of nuclear matrix associated regions (S/MARs). Bioorg Khim 30, 314.

46. Clapier C.R. and Cairns B.R. (2009) The biology of chromatin remodelling complexes. Annu. Rev. Biochem. 78, 273-304.

47. Conaway, C., R., Brower, S., C., Conaway W., J. (2002). Emerging roles of ubiquitin in transcription regulation. Science 296, 1254-8.

48. Conrath K.E., Lauwereys M., Galleni M., Matagne A., Frere J.M., Kinne J., Wyns L., Muyldermans S. 2001. Beta-lactamase inhibitors derived from single-domain antibody fragments elicited in Camelidae. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2807-2812.

49. Cooper D.and Krawczak M. (1990) The mutational spectrum of single base-pair substitutions causing human genetic disease: patterns and predictions. Hum. Genet 85, 55-74.

50. Corona D.F., Siriaco G., Armstrong J.A., Snarskaya N., et al. (2007). ISWI regulates higher-order chromatin structure and histone HI assembly in vivo. PLoSBiol. 5, e232.

51. Cortez-Retamozo V., Backmann N., Senter P.D., Wernery U., de Baetselier P., Muyldermans S., Revets H. 2004. Efficient cancer therapy with a nanobody-based conjugate. Cancer Res. 64, 2853-2857.

52. Cosgrove M. S. and Patel A. (2010) Mixed lineage leukemia: a structure-function perspective of the MLL1 protein. FEBSJ. 277, 1832-1842.

53. Cuthbert G.L., Daujat S., Snwden A.W. et al. (2004). Histone deimination antagonizes arginine methylation. Cell 118, 545-553.

54. Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A. et al. (2002). Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell 111, 185-96.

55. Decanniere K., Muyldermans S., Wyns L. 2000. Canonical antigen binding loop structures : more structures, more canonical classes ? J. Mol. Biol. 300, 83-91.

56. De Genst E., Handelberg F., Van Meirhaeghe A., Vinck S., Loris R., Wyns L., Muyldermans S. 2004. Chemical basis for the affinity maturation of a camel single domain antibody. J. Biol. Chem. 279, 53593-53601.

57. De Genst E., Saerens D., Muyldermans S., Conrath K. 2006. Antibody repertoire development in camelids. Develop. Comp. Immunol. 30, 187-198.

58. De Genst E., Silence K., Decanniere K., Loris R., Kinne J., Wyns L., Muyldermans S. 2005. Strong in vivo maturation compensates for structurally restricted H3 loops in antibody repertoires. J. Biol. Chem. 280, 14114-14121.

59. De Genst E., Silence K., Decanniere K., Loris R., Kinne J., Muyldermans S. 2006. Molecular basis for the preferential cleft recognition by dromedary heavy-chain antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 4586-4591.

60. Dejardin, J., Cavalli G. (2004). Chromatin inheritance upon Zeste-mediated Brahma recruitment at a minimal cellular memory module. Embo J23, 85768.

61. Dejardin, J., Rappailles, A., Cuvier, O., Grimaud, C., Decoville, M. et al.2005). Recruitment of Drosophila Polycomb group proteins to chromatin by T>SP\. Nature Ш, 533-8.

62. Dingwall A.K., Beek S.J., McCallum C.M., Tamkun J.W., Kalpana G.V., Goff S.P., Scott M.P. (1995). The Drosophila snrl and brm proteins are related to yeast SWI/SNF proteins and are components of a large protein complex. Мої Biol Cell. 6(7), 777-791.

63. Dirscherl S.S., Krebs J.E. (2004). Functional diversity of ISWI complexes. Biochem. Cell. Biol. 82, 482-489.

64. Dou, Y., Gorovsky A., M. (2002). Regulation of transcription by HI phosphorylation in Tetrahymena is position independent and requires clustered sites. Proc Natl Acad Sci USA 99, 6142-6.

65. Dover, J., Schneider, J., Tawiah-Boateng, A., M., Wood, A., Dean, K. et al. (2002). Methylation of histone H3 by COMPASS requires ubiquitination of histone H2B by Rad6. J Biol Chem 277, 28368-71.

66. Doyen C.M., An W., Bondarenko V., Mietton F., Studitsky V.M., et al.2006) Mechanism of polymerase II transcription repression by the histone variant macroH2A. Мої. Cell.Biol. 26, 1156-1164.

67. Drewell, A., R., Bae, E., Burr, J., Lewis B., E. (2002). Transcription defines the embryonic domains of cis-regulatory activity at the Drosophila bithorax complex. Proc Natl Acad Sci USA 99, 16853-8.

68. Dumoulin M., Last A.M., Desmyter A., Decanniere K., Canet D., Larsson G., Spencer A., Archer D.B., Sasse J. et al. 2003. A camelid antibody fragment inhibits the formation of amyloid fibrils human lysozyme. Nature 424, 783-788.

69. Dura, M., J., Brock, W., H., Santamaria P. (1985). Polyhomeotic: a gene of Drosophila melanogaster required for correct expression of segmental identity. Mol Gen Genet 198, 213-20.

70. Dwek R.A., Sutton B.J., Perkins S.J., Rademacher T.W. 1984. Structure-function relationships in immunoglobulins. Biochem. Soc. Symp. 49, 123136.

71. Ernst, P., Fisher, K., J., Avery, W., Wade, S., Foy, D. et al. (2004). Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene. Dev Cell 6, 437-43.

72. Ernst J. and Kellis M. (2010) Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome. Nat. Biotechnol. 28, 817-825.

73. Fauvarque, O., M., Dura M., J. (1993). polyhomeotic regulatory sequences induce developmental regulator-dependent variegation and targeted P-element insertions in Drosophila. Genes Dev 7, 1508-20.

74. Felix A., C. (1998). Secondary leukemias induced by topoisomerase-targeted drugs. Biochim Biophys Acta 1400, 233-55.

75. Felix, A., C., Lange, J., B., Chessells M., J. (2000). Pediatric Acute Lymphoblastic Leukemia: Challenges and Controversies in 2000. Hematology (Am Soc Hematol Educ Program), 285-302.

76. Ficz, G., Heintzmann, R., Arndt-Jovin J., D. (2005). Polycomb group protein complexes exchange rapidly in living Drosophila. Development 132, 3963-76.

77. Fillon G.J., van Bemmel J.G., Braunschweig U. et al. (2010) Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell 143,212-224.

78. Fischle, W., Wang, Y., Allis D., C. (2003a). Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond. Nature 425, 475-9.

79. Fischle, W., Wang, Y., Jacobs, A., S., Kim, Y., Allis, D., C. et al. (2003b). Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains. Genes Dev 17, 1870-81.

80. Fischle, W., Wang, Y., Jacobs, S. A., Kim, Y., Allis, C. D. and Khorasanizadeh, S. (2003c). Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains. Genes Devil, 1870-81.

81. Fitzgerald, P., D., Bender W. (2001). Polycomb group repression reduces DNA accessibility. Mol Cell Biol 21, 6585-97.

82. Flanagan J.F, Mi L.Z., Chruszcz M., Cymborowski M., Clines K.L. et al. (2005). Double chromodomains cooperate to recognize the methylated histone H3 tail. Nature 438, 1181-1185.

83. Francis, J., N., Kingston E., R. (2001). Mechanisms of transcriptional memory. Nat Rev Mol Cell Biol 2, 409-21.

84. Franke, A., DeCamillis, M., Zink, D., Cheng, N., Brock, W., H. et al. (1992). Polycomb and polyhomeotic are constituents of a multimeric protein complex in chromatin of Drosophila melanogaster. EmboJll, 2941-50.

85. Fujioka M., Yusibova G.L., Zhou J., Jaynes J. (2008). The DNA-binding Polycomb-group protein Pleiohomeotic maintains both active and repressed transcriptional states through a single site. Development 135, 4131-4139.

86. Furuyama, T., Banerjee, R., Breen, R., T., Harte J., P. (2004). SIR2 is required for polycomb silencing and is associated with an E(Z) histone methyltransferase complex. Curr Biol 14, 1812-21.

87. Gardner K.E., Allis C.D., Stral B.D. (2011). Operating on chromatin, a colorful language where context matters. J. Mol. Biol. (doi:i0.i0i6/j.jmb.20ii.0i.040)

88. Ghahroudi M.A., Desmyter A., Wyns L., Hamers R., Muyldermans S. 1997. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 414, 521-526.

89. Glover D.M. (1987). DNA cloning. A practical approach, vol.3. IRL Press, Oxford, UK.

90. Greenberg A.S., Avila D., Hughes M., Hughes A., Mckinney E.C., Flajnik M.F. 1995. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. Nature 374, 168-173.

91. Gregory G.D., Vakoc C.R., Rozovskaia T. et al. (2007). Mammalian ASH1L is a histone methyltransferase that occupies the transcribed region of active genes. Mol. Cell. Biol. 27, 8466-8479.

92. Grimaud, C., Bantignies, F., Pal-Bhadra, M., Ghana, P., Bhadra, U. Cavalli, G. (2006). RNAi components are required for nuclear clustering of Polycomb group response elements. Cell 124, 957-71.

93. Gueorguieva D., Li S., Walsh N., Mukerji A., Tanha J., Pandey S. 2006. Identification of single-domain, Bax-specific intrabodies that confer resistance to mammalian cells against oxidative-stress-induced apoptosis. FASEB J. 20, 2636-2638.

94. Haaf T. (2006) Methylation dynamics in the early mammalian embryo: implications of genome reprogramming defects for development. Curr. Top. Microbiol. 310; 13-22.

95. Hake S.B., Allis C.D. (2006) Histone H3 variants and theirpotential role in indexing mammalian genomes: the "H3 barcode hypothesis". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 6428-6435.

96. Hamers-Casterman,C., Atarhouch,T., Muyldermans,S., Robinson,G., Hamers,C., Bajyana Songa,E., Bendahman,N., Hamers,R. 1993. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature 363, 446-448.

97. Harmsen M.M., Haad H.J. 2007. Properties, production, and applications jf camelid single-domain antibody fragments. Appl. Microbiol. Biotechnol. 77 (1), 13-22.

98. Hassan, A. H., Neely, K. E. and Workman, J. L. (2001). Histone acetyltransferase complexes stabilize swi/snf binding to promoter nucleosomes. Cell 104, 817-27.

99. He D., Nickerson J.A., Penman S. Core filaments of the nuclear matrix. // J. Cell Biol. 1990. V. 110, P. 569-580.

100. Henikoff, S., Furuyama, T., Ahmad K. (2004). Histone variants, nucleosome assembly and epigenetic inheritance. Trends Genet 20, 320-6.

101. Hess L., J. (2004). MLL: a histone methyltransferase disrupted in leukemia. Trends Mol Med 10, 500-7.

102. Ho L. and Crabtree G.R. (2010) Chromatin remodelling during development. Nature 463, 474-484.

103. Hoogenboom H.R. 2005. Selecting and screening recombinant antibody libraries. Nat Biotechnol. 23(9), 1105-16.

104. Hsieh, J., J., Ernst, P.,Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Korsmeyer

105. J., S. (2003b). Proteolytic cleavage of MLL generates a complex ofN- and C235terminal fragments that confers protein stability and subnuclear localization. Mol Cell Biol 23, 186-94.

106. Hsu, Y., J., Sun, W., Z., Li, X., Reuben, M., Tatchell, K. et al. (2000). Mitotic phosphorylation of histone H3 is governed by Ipll/aurora kinase and Glc7/PPl phosphatase in budding yeast and nematodes. Cell 102, 279-91.

107. Iizuka, M., Smith M., M. (2003). Functional consequences of histone modifications. Curr Opin Genet Dev 13, 154-60.

108. Ingham, P. W., and Whittle, R. (1980). Trithorax: A new homeotic mutation of Drosophila melanogaster causing transformations of abdominal and thoracic imaginal segments.Putative role during embryogenesis. Mol. Gen. Genet. 179, 607-614.

109. Jackson D.A., Hassan A.B., Errington R.J., Cook P.R. Visualization of focal sites of transcription within human nuclei. // EMBO J. 1993. V. 12, P. 1059-1065.

110. Jenuwein T. (2006). The epigenetic magic of histone lysine methylation.1. Fefe / 273,3121-35.

111. Jenuwein, T., Allis D., C. (2001). Translating the histone code. Science 293, 1074-80.

112. Jin C., Felsenfeld G. (2007) Nucleosome stability mediated by histone variants H3.3 andH2A.Z. Genes Dev. 21, 1519-1529.

113. Jobling S.A., Jarman C., Teh M.M., Holmberg N., Blake C., Verhoeyen

114. M.E. 2003. Immunomodulation of enzyme function in plants by singledomain antibody fragments. Nat. Biotechnol. 21, 77-80.

115. Jones P.A., Liang G. (2009) Rethinking how DNA methylation patterns are maintained. Nat .Rev. Genet. 10, 805-811.

116. Jurgens, G. (1985). A group of genes controlling the spatial expression of the bithorax complex in Drosophila. Nature 316, 153-155.

117. Kabat E., Wu T.T., Perry H.M., Gottesman K.S., Foeller, C. 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interest. US Public Health Services, NIH, Bethesda, MD, Publication no. 91-3242.

118. Kahn, G., T., Schwartz, B., Y., Dellino, I., G., Pirrotta V. (2006). Polycomb complexes and the propagation of the methylation mark at the Drosophila ubx gene. J Biol Chem 281, 29064-75.

119. Kal, J., A., Mahmoudi, T., Zak, B., N., Verrijzer P., C. (2000). The Drosophila brahma complex is an essential coactivator for the trithorax group protein zeste. Genes Dev 14, 1058-71.

120. Kanhere A., Viiri K., Araújo C.C., Rasaiyaah J. et al. (2010). Short RNAs are transcribed from repressed polycomb target genes and interact with polycomb repressive complex-2. Mol. Cell 38, 675-688.

121. Katsani, R., K., Arredondo, J., J., Kal, J., A., Verrijzer P., C. (2001). A homeotic mutation in the trithorax SET domain impedes histone binding. Genes Dev 15,2197-202.

122. Kennison A., J. (1995). The Polycomb and trithorax group proteins of Drosophila: trans-regulators of homeotic gene function. Annu Rev Genet 29,289.303.

123. Kennison, A., J., Tamkun W., J. (1988). Dosage-dependent modifiers of polycomb and antennapedia mutations in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A 85, 8136-40.

124. KeteI, S., C., Andersen, F., E., Vargas, L., M., Suh, J., Strome, S. et al.2005). Subunit contributions to histone methyltransferase activities of fly and worm polycomb group complexes. Mol Cell Biol 25, 6857-68.

125. Khorasanizadeh S. (2004). The nucleosome: from genomic organization to genomic regulation. Cell 116, 259-72.

126. King, F., I., Emmons, B., R., Francis, J., N., Wild, B., Muller, J. et al.2005). Analysis of a polycomb group protein defines regions that link repressive activity on nucleosomal templates to in vivo function. Mol Cell Biol 25, 6578-91.

127. Klymenko, T., Papp, B., Fischle, W., Kocher, T., Schelder, M. et al.2006). A Polycomb group protein complex with sequence-specific DNA-binding and selective methyl-lysine-binding activities. Genes Dev 20, 111 022.

128. Konev A.Y., Tribus M., Park S.Y., Podhraski V., Lim C.Y. et al. (2007) CHD1 motor protein is required for deposition of histone variant H3.3 into chromatin in vivo. Science 317, 1087-1090.

129. Kouzarides T. (2007). Chromatin modifications and their function. Cell 128, 693-705.

130. Krajewski, A., W., Nakamura, T., Mazo, A., Canaani E. (2005). A motif within SET-domain proteins binds single-stranded nucleic acids and transcribed and supercoiled DNAs and can interfere with assembly of nucleosomes. Mol Cell Biol 25, 1891-9.

131. Krajewski W.A., Vassiliev O.L. (2011). Interaction of SET domains with histones and nucleic acid structures in active chromatin. Clin. Epigenet. 2, 1725.

132. Kramer H., Zipursky I. (1992). Whole mount in situ hybridization to imaginal discs using digoxygenin labeled DNA probes. Dros. Inf. Serv. 71, 147.

133. Krebs, E., J., Fry, J., C., Samuels, L., M., Peterson L., C. (2000). Global role for chromatin remodeling enzymes in mitotic gene expression. Cell 102, 587-98.

134. Kuzin, B., Tillib, S., Sedkov, Y., Mizrokhi, L., Mazo A. (1994). The Drosophila trithorax gene encodes a chromosomal protein and directly regulates the region-specific homeotic gene fork head. Genes Dev 8, 2478-90.

135. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. //Nature. 1970. V. 227, P. 680-685.

136. Lanzuolo, C., Roure, V., Dekker, J., Bantignies, F., Orlando V. (2007). Polycomb response elements mediate the formation of chromosome higherorder structures in the bithorax complex. Nat Cell Biol 9, 1167-74.

137. Lauwereys M., Ghahroudi M., Desmyter A., Kinne J., Holzer W., De Genst E., Wyns L., Muyldermans S. 1998. EMBO J. 17, 3512-3520.

138. Lebedeva, A., L., Tillib V., S. (2003). Trithorax protein, a global factor for maintenance of tissue specific gene activation in Drosophila melanogaster, is associated with the nuclear matrix. Genetika 39, 250-8.

139. Lee, G., M., Villa, R., Trojer, P., Norman, J., Yan, P., K. et al. (2007). Demethylation of H3K27 regulates polycomb recruitment and H2A ubiquitination. Science 318, 447-50.

140. Lee, N., Maurange, C., Ringrose, L., Paro R. (2005). Suppression of Polycomb group proteins by JNK signalling induces transdetermination in Drosophila imaginal discs. Nature 438, 234-7.

141. Lee J.-H., Skalnik D.G. (2005) CpG-binding protein (CXXC finger protein 1) is a component of the mammalian Setl histone H3-Lys4 methyltransferase complex, the analogue of the yeast Setl/COMPASS complex. J. Biol. Chem.lSQ, 41725-41731.

142. Lee J.-H., Voo K.S., Skalnik D.G. (2001) Identification and characterization of the DNA binding domain of CpG-binding protein. J. Biol. Chem. 276, 44669-44676.

143. Levine, S., S., Weiss, A., Erdjument-Bromage, H., Shao, Z., Tempst, P. et al. (2002). The core of the polycomb repressive complex is compositionally and functionally conserved in flies and humans. Mol Cell Biol 22, 6070-8.

144. Levy-Wilson, B., Fortier C. (1989). The limits of the DNase I-sensitive domain of the human apolipoprotein B gene coincide with the locations of chromosomal anchorage loops and define the 5' and 3' boundaries of the gene. J Biol Chem 264, 21196-204.

145. Lewis B., E. (1978). A gene complex controlling segmentation in Drosophila. Nature 276, 565-70.

146. Li G. and Reinberg D. (2011) Chromatin higher-order structures and gene regulation. Curr. Opinion in Genet. Dev. 21, 1-12.

147. Li H., Ilin S., Wang W., Duncan E.M., Wysocka J., Allis C.D., Patel D.J. (2006). Molecular basis for site-specific read-out of histone H3K4me3 by the BPTF PHD finger of NURF. Nature 442, 91-95.

148. Liu Y., Cheng E.H., Hsieh J.J. (2009). MLL fusions: pathways to leukemia.

149. Cancer Biol. Ther. 8, 1204-1211.

150. Lo, S., W., Duggan, L., Emre, C., N., Belotserkovskya, R., Lane, S., W. et al. (2001). Snfl~a histone kinase that works in concert with the histone acetyltransferase Gcn5 to regulate transcription. Science 293, 1142-6.

151. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F. and Richmond,

152. T. J. (1997). Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature 389, 251-60.

153. MacDonald P.M. and Strul G. (1986). molecular gradient in early Drosophila embryos, and its role in specifying the body pattern. Nature 324, 537-545.

154. Marschalek R. (2010). Mixed lineage leukemia: roles in human malignancies and potential therapy. FEBS J. 277, 1822-1831.

155. Mazo A.M., Huang D.H., Mozer B.A., Dawid I.B. (1990). The trithorax gene, a trans-acting regulator of the bithorax complex in Drosophila, encodes a protein with zink-binding domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 21122116.

156. Mikkelsen T.S., Hanna J., Zhang X., Ku M., Wernig M., et al. (2008) Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature 454, 49-55.

157. Milne T.A., Dou Y., Martin M.E. et al. (2005). MLL associates specifically with a subset of transcriptionally active target genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 14765-14770.

158. Milne T.A., Kim J., Wang G.G. et al. (2010). Multiple interactions recruit MLL1 and MLL1 fusion proteins to the HOXA9 locus in leukemogenesis. Mol. Cell 38, 853-863.

159. Mirkovitch J., Mirault M.-E., Laemmli U.K. Organization of the higherorder chromatin loop: specific DNA attachment sites on nuclear scaffold. // Cell. 1984. V. 39, P. 223-232.

160. Miyagishima, H., Isono, K., Fujimura, Y., Iyo, M., Takihara, Y. et al. (2003). Dissociation of mammalian Polycomb-group proteins, Ring IB and

161. Rae28/Phl, from the chromatin correlates with configuration changes of the chromatin in mitotic and meiotic prophase. Histochem Cell Biol 120, 111-9.

162. Mizuguchi G., Shen X., Landry J., Wu W.H., Sen S., Wu C. (2004). ATP-driven exchange of histone H2AZ variant catalyzed by SWR1 chromatin remodeling complex. Science 303, 343-348.

163. Mohd-Sarip, A., Cleard, F., Mishra, K., R., Karch, F., Verrijzer P., C. (2005). Synergistic recognition of an epigenetic DNA element by Pleiohomeotic and a Polycomb core complex. Genes Dev 19, 1755-60.

164. Mohd-Sarip, A., Knaap, v. d., A., J., Wyman, C., Kanaar, R., Schedl, P. et al. (2006). Architecture of a polycomb nucleoprotein complex. Mol Cell 24, 91-100.

165. Mozer D.F., Dawid I.B. (1989). Cloning and molecular characterization of the trithorax locus of Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3738-3742.

166. Muller, J., Hart, M., C., Francis, J., N., Vargas, L., M., Sengupta, A. et al.2002). Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell 111, 197-208.

167. Muller, M., Hagstrom, K., Gyurkovics, H., Pirrotta, V., Schedl P. (1999). The mcp element from the Drosophila melanogaster bithorax complex mediates long-distance regulatory interactions. Genetics 153, 1333-56.

168. Muyldermans S., Cambillau C., Wyns L. 2001. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. TIBS 26, 230-235.

169. Muyldermans S., Baral T.N., Retamozzo V.C. et al. 2009. Camelid immunoglobulins and nanobody technology. Vet. Immunol. Immunopathol. 128(1-3), 178-183.

170. Nakamura, T., Mori, T., Tada, S., Krajewski, W., Rozovskaia, T. et al.2002). ALL-1 is a histone methyltransferase that assembles a supercomplex of proteins involved in transcriptional regulation. Mol Cell 10, 1119-28.

171. Nakayama T., Nishioka K., Dong Y.X., Shimojima T., Hirose S. (2007) Drosophila GAGA factor directs histone H3.3 replacement that prevents the heterochromatin spreading. Genes Dev. 21, 552-561.

172. Nan X., Campoy J., Bird A. (1997) MeCP2 is a transcriptional repressor with abundant binding sites in genomic chromatin. Cell 88, 471-481.

173. Nathan D., Ingvarsdottir K., Sterner D.E. et al. (2006). Histone sumoylation is a negative regulator in Saccaromyces cerevisiae and shows dynamic interplay with positive-acting histone modifications. Genes Dev. 20, 966-976.

174. Negre, N., Hennetin, J., Sun, V., L., Lavrov, S., Bellis, M. et al. (2006). Chromosomal distribution of PcG proteins during Drosophila development. PLoSBiol 4, el 70.

175. Nekrasov, M., Klymenko, T., Fraterman, S., Papp, B., Oktaba, K. et al.2007). Pcl-PRC2 is needed to generate high levels of H3-K27 trimethylation at Polycomb target genes. EmboJ26, 4078-88.

176. Nelson C.J., Santos-Rosa H., Kouzarides T. (2006). Proline isomerization of histone H3 regulates lysine methylation and gene expression. Cell 126, 905-916.

177. Ng R.K., Gurdon J.B. (2008) Epigenetic inheritance of cell differentiation status. Cell Cycle 7, 1173-1177.

178. Ng H.H., Robert F., Young R.A. et al. (2003). Targeted reqruitment of Setl histone methylase by elongating Pol II provides a localized mark and memory of recent transcriptional activity. Mol. Cell 11, 709-719.

179. Ng, H., H., Xu, M., R., Zhang, Y., Struhl K. (2002). Ubiquitination of histone H2B by Rad6 is required for efficient Dotl-mediated methylation of histone H3 lysine 79. J Biol Chem 277, 34655-7.

180. Nguyen V.K., Hamers R., Wyns L., Muyldermans S. 1999. Loss of splice consensus signal is responsible for the removal of the entire CHI domain of the functional camel IGG2A heavy-chain antibodies. Mol. Immunol. 36, 515524.

181. Nguyen V.K., Hamers R., Wyns L., Muyldermans S. 2000. Camel heavy-chain antibodies: diverse germline VHH and specific mechanisms enlarge the antigen-binding repertoire. EMBO J. 19, 921-931.

182. Nguyen V.K., Desmyter A., Muyldermans S. 2001. Functional heavy-chain antibodies in camelidae. Adv. Immunol. 79, 261-296.

183. Nickerson J.A., Blencowe B.J., Penman S. The architectural organization of nuclear metabolism. // Int. Rev. Cytol. 1995. V. 162A, P. 67-123.

184. Nielsen, R., P., Nietlispach, D., Mott, R., H., Callaghan, J., Bannister, A. et al. (2002). Structure of the HP1 chromodomain bound to histone H3 methylated at lysine 9. Nature 416, 103-7.

185. Nottke A., Colaiacovo M.P., Shi Y. (2009). Developmental roles of the histone lysine demethylases. Development 136, 879-889.

186. Nowak, J., S., Corces G., V. (2000). Phosphorylation of histone H3 correlates with transcriptionally active loci. Genes Dev 14, 3003-13.

187. Nuttall S.D., Krishnan U.V., Hattarki M., De Gori R., Irving R.A., Hudson P.J. 2001. Isolation of a new antigen receptor from wobbegong sharks, and use as a scaffold for the display of protein loop libraries. Mol. Immunol. 38,313-326.

188. Orlando V. (2000). Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde-crosslinked-chromatin immunoprecipitation. Trends Biochem Sci 25, 99-104.

189. Orlando V. (2003). Polycomb, epigenomes, and control of cell identity. Cell 112, 599-606.

190. Orlando, V., Jane, P., E., Chin walla, V., Harte, J., P., Paro R. (1998). Binding of trithorax and Polycomb proteins to the bithorax complex: dynamicchanges during early Drosophila embryogenesis. Embo JYl, 5141-50.

191. Orlando, V., Strutt, H., Paro R. (1997). Analysis of chromatin structure by in vivo formaldehyde cross-linking. Methods 11, 205-14.201.0rphanides, G., Reinberg D. (2002). A unified theory of gene expression. Cell 108, 439-51.

192. Padlan E.A. 1994. Anatomy of the antibody molecule. Mol. Immunol. 31, 169-217.

193. Padlan E.A.I 996. X-Ray crystallography of antibodies. Adv. Protein Chem. 49, 57-133.

194. Papp, B., Muller J. (2006). Histone trimethylation and the maintenance of transcriptional ON and OFF states by trxG and PcG proteins. Genes Dev 20, 2041-54.

195. Pattatucci A.M. and Kaufman T.C. (1991). The homeotoc gene Sex combs reduced of Drosophila melanogaster is differentially regulated in the embryonic and imaginal stages of development. Genetics 129, 443-461.

196. Peterson, L., C., Workman L., J. (2000). Promoter targeting and chromatin remodeling by the SWI/SNF complex. Curr Opin Genet Dev 10, 187-92.

197. Petruk, S., Sedkov, Y., Smith, S., Tillib, S., Kraevski, V. et al. (2001). Trithorax and dCBP acting in a complex to maintain expression of a homeotic gene. Science 294, 1331-4.

198. Petruk, S., Sedkov, Y., Brock, H. W. and Mazo, A. (2007b). A model for initiation of mosaic HOX gene expression patterns by non-coding RNAs in early embryos. RNA Biol 4, 1-6.

199. Pham, D., A., Sauer F. (2000). Ubiquitin-activating/conjugating activity of TAFII250, a mediator of activation of gene expression in Drosophila. Science 289,2357-60.

200. Polo, E., S., Almouzni G. (2006). Chromatin assembly: a basic recipe with various flavours. Curr Opin Genet Dev 16, 104-11.

201. Porter R.R. 1973. Structural studies of immunoglobulins. Science 180, 713716.

202. Poux, S., McCabe, D., Pirrotta V. (2001a). Recruitment of components of Polycomb Group chromatin complexes in Drosophila. Development 128, 7585.

203. Poux, S., Melfi, R., Pirrotta V. (2001b). Establishment of Polycomb silencing requires a transient interaction between PC and ESC. Genes Dev 15, 2509-14.

204. Qian C. and Zhou M.M. (2006) SET domain protein lysinemethytransferases: Structure, specificity and catalysis. Cell Mol. Life Sci., 63, 2755-2763.

205. Rank, G., Prestel, M. and Paro, R. (2002). Transcription through intergenic chromosomal memory elements of the Drosophila bithorax complex correlates with an epigenetic switch. Mol Cell Biol 22, 8026-34.

206. Rappailles, A., Decoville, M., Locker D. (2005). DSP1, a Drosophila HMG protein, is involved in spatiotemporal expression of the homoeotic gene Sex combs reduced. Biol Cell 97, 779-85.

207. Rast J.P., Amemiya C.T., Litman R.T., Strong S.J., Litman G.W. 1998. Distinct patterns of IgH structure and organization in divergent lineage of chondrichthyan fishes. Immunogenetics 47, 234-245.

208. Rastelli, L., Chan, S., C., Pirrotta V. (1993). Related chromosome binding sites for zeste, suppressors of zeste and Polycomb group proteins in Drosophila and their dependence on Enhancer of zeste function. Embo J12, 1513-22.

209. Reyes J.C., Muchardt C., Yaniv M. Components of the human SWI/SNF complex are enriched in active chromatin and are associated with the nuclear matrix. // J. Cell Biol. 1997. V. 137, P. 263-274.

210. Richards, J., E., Elgin C., S. (2002). Epigenetic codes for heterochromatin formation and silencing: rounding up the usual suspects. Cell 108, 489-500.

211. Ringrose, L., Ehret, H., Paro R. (2004). Distinct contributions of histone H3 lysine 9 and 27 methylation to locus-specific stability of polycomb complexes. Mol Cell 16, 641-53.

212. Ringrose, L., Paro R. (2007). Polycomb/Trithorax response elements and epigenetic memory of cell identity. Development 134, 223-32.

213. Ringrose, L., Rehmsmeier, M., Dura, M., J., Paro R. (2003). Genome-wide prediction of Polycomb/Trithorax response elements in Drosophila melanogaster. Dev Cell 5, 759-71.

214. Robzyk, K., Recht, J., Osley A., M. (2000). Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast. Science 287, 501-4.

215. Rothbauer U., Zolghadr K., Tillib S., Nowak D., Schermelleh L., Gahl A., Backmann N., Conrath K., Muyldermans S., Cardoso M.C., Leonhardt L. 2006. Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nature Methods 3, 887-889.

216. Rozenblatt-Rosen O., Rosovskaya T., Burakov D., Tillib S.et al. The C-terminal SET domains of ALL-I and TRITHORAX interact with the INII and

217. SNRI proteins, components of the SWI/SNF complex. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95, P. 4152-4157.

218. Rozovskaia, T., Tillib, S., Smith, S., Sedkov, Y., Rozenblatt-Rosen, O. et al. (1999). Trithorax and ASH1 interact directly and associate with the trithorax group-responsive bxd region of the Ultrabithorax promoter. Mol Cell Biol 19, 6441-7.

219. Sakabe K., Wang Z., Hart G.W. (2010). Beta-N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) is part of the histone code. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 1991519920.

220. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989) Molecular cloning. A laboratory manual. Edn. 2. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

221. Sanchez-Eisner, T., Gou, P., Kremmer, E., Sauer F. (2006). Noncoding RNAs of trithorax response elements recruit Drosophila Ashl to Ultrabithorax. Science 311, 1118-23.

222. Sapountzi V., Logan I.R., Robson C.N. (2006). Cellular functions of TIP60. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 38, 1496-1509.

223. Sarcinella, E., Zuzarte, C., P., Lau, N., P., Draker, R., Cheung P. (2007). Monoubiquitylation of H2A.Z distinguishes its association with euchromatin or facultative heterochromatin. Mol Cell Biol 27, 6457-68.

224. Saurin, J., A., Shao, Z., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Kingston E., R. (2001). A Drosophila Polycomb group complex includes Zeste and dTAFII proteins. Nature 412, 655-60.

225. Schaft D., Roguev A., Kotovic K.M. et al. (2003). The histone 3 lysine 36 methyltransferase, SET2, is involved in transcriptional elongation. Nucleic Acids Res. 31, 2475-2482.

226. Schichman, A., S., Caligiuri, A., M., Gu, Y., Strout, P., M., Canaani, E. et al. (1994). ALL-1 partial duplication in acute leukemia. Proc Natl Acad Sei U SA 91, 6236-9.

227. Schmitt, S., Prestel, M., Paro R. (2005). Intergenic transcription through a polycomb group response element counteracts silencing. Genes Dev 19, 697708.

228. Schnetz M.P., Bartels C.F., Shastri K., Balasubramanian D. et al. (2009). Genomic distribution of CHD7 on chromatin tracks H3K4 methylation patterns. Genome Res. 19, 590-601.

229. Schubeler D., Scalzo D., Kooperberg C. et al. (2002). Genome-wide DNA replication profile for Drosophila melanogaster: a link between transcription and replication timing. Nat. Genet. 32, 438-442.

230. Schwartz, B., Y., Kahn, G., T., Nix, A., D., Li, Y., X., Bourgon, R. et al. (2006). Genome-wide analysis of Polycomb targets in Drosophila melanogaster. Nat Genet 38, 700-705.

231. Schwartz,JB., Y., PjrrottaJV1(2007). Polycomb silencing mechanisms and the management of genomic programmes. Nat Rev Genet 8, 9-22.

232. Sedkov Y., Benes J., Berger J., Riker K., Tillib S., Jones R. and Mazo A.1999) Molecular genetic analysis of Drosophila trithorax-related gene that encodes a novel SET domain protein. Mechanisms of Development 82, 171179.

233. Shao, Z., Raible, F., Mollaaghababa, R., Guyon, R., J., Wu, T., C. et al.1999). Stabilization of chromatin structure by PRC1, a Polycomb complex. Cell 98, 37-46.

234. Shearn A. (1989). The ash-J, ash-2 and trithorax genes of Drosophila melanogaster are functionally related. Genetics 121, 517-525.

235. Shi, Y., Lan, F., Matson, C., Mulligan, P., Whetstine, R., J. et al. (2004). Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell 119, 941-53.

236. Sidhu S.S., Koide S. 2007. Phage display for engineering and analyzing protein interaction interfaces. Curr Opin Struct Biol. 17(4), 481-487.

237. Sigrist, J., C., Pirrotta V. (1997). Chromatin insulator elements block the silencing of a target gene by the Drosophila polycomb response element (PRE) but allow trans interactions between PREs on different chromosomes. Genetics 147,209-21.

238. Simon J.A. and Kingston R.E. (2009). Mechanisms of Polycomb gene silencing: knowns and unknowns. Mol. Cell. Biol. 10, 697-708.

239. Simon, A., J., Tamkun W., J. (2002). Programming off and on states in chromatin: mechanisms of Polycomb and trithorax group complexes. Curr Opin Genet Dev 12, 210-8.

240. Sims R.J., Millhouse S., Chen C.F., Lewis B.A., Erdjument-Bromage H. et al. (2007) Recognition of trimethylated histone H3 lysine 4 facilitates therecruitment of transcription postinitiation factors and pre-mRNA splicing. Mol. Cell 28, 665-676.

241. Sing A., Pannell D., Karaiskakis A., Sturgeon K. et al. (2009). A vertebrate Polycomb response element governs segmentation of the posterior hindbrain. Cell 138, 885-897.

242. Smith S.T., Petruk S., Sedkov Y., Cho E., Tillib S., Canaani E., Mazo A.2004) Modulation of heat shock gene expression by the TAC1 chromatin-modifying complex. Nature Cell Biol. 6(2), 162-167.

243. Srinivasan S, Dorighi KM, Tamkun JW. (2008) Drosophila Kismet regulates histone H3 lysine 27 methylation and early elongation by RNA polymerase II. PLoS Genet.; 4, el000217.

244. Sterner D.E. and Berger S.L. (2000). Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, 435-459.

245. Strahl, D., B., Allis D., C. (2000). The language of covalent histone modifications. Nature 403, 41-5.

246. Struhl G. (1983). Role of the esc+ gene product in ensuring the selective expression of segment-specific homeotic genes in Drosophila. JEmbryol Exp Morphol 76, 297-331.

247. Strutt, H., Paro R. (1997). The polycomb group protein complex of Drosophila melanogaster has different compositions at different target genes. Mol Cell Biol 17, 6773-83.

248. Sun, W., Z., Allis D., C. (2002). Ubiquitination of histone H2B regulates H3 methylation and gene silencing in yeast. Nature 418, 104-8.

249. Song J.J., Kingston R.E. (2008). WDR5 interacts with mixed lineage leukemia (MLL) protein via the histone H3-binding pocket. J. Biol. Chem. 283, 35258-35264.

250. Spellman P.T., Rubin G.M. (2002). Evidence for large domains of similarly expressed genes in the Drosophila genome. J. Biol. 1,5.

251. Tang Y., Getzenberg R.H., Vietmeier B.N., Stallcup M.R. et al. The DNA-binding and U2 transactivation domains of the rat glucocorticoid receptor constitute a nuclear matrix-targeting signal. // Molecular Endocrinology. 1998. V. 12, P. 1420-1431.

252. Tahiliani M., Koh K.P., Shen Y., Pastor W.A., et al. (2009) Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science 324, 930-935.

253. TaIbert P.B. and Henikoff S. (2010). Histone variants- ancient wrap artists of the epigenome. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 11, 264-275.

254. Tautz D., Pfeifle C. (1989). A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma, Berl. 98, 81-85.

255. Tchurikov N.A., Kretova O.V., Sosin D.V., Zykov I.A., Zhimulev I.F., Kravatsky Y.V. (2011). Genome-wide profiling of forum domains in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. (doi:10.1093/nar/gkql353).

256. Tchurikov N.A. and Ponomarenko N.A. (1992). Detection of DNA domains in Drosophila, human and plant chromosomes possesing mainly 50- to 150-kilobase stretches of DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6751-6755.

257. Thiagalingam, S., Cheng, K. H., Lee, H. J., Mineva, N., Thiagalingam, A. and Ponte, J. F. (2003). Histone deacetylases: unique players in shaping the epigenetic histone code. Ann N Y Acad Sci 983, 84-100.

258. Tie, F., Furuyama, T., Prasad-Sinha, J., Jane, E., Harte J., P. (2001): The Drosophila Polycomb Group proteins ESC and E(Z) are present in a complex containing the histone-binding protein p55 and the histone deacetylase RPD3. Development 128, 275-86.

259. Tillib S.V., Mirzabekov A.D. (2001) Advances in the analysis of DNA sequence variations using oligonucleotide microchip technology. Curr Opin Biotechnol. 12, 53-58.

260. TilIib S., Sedkov Y., Mizrokhi. L., Mazo A. (1995) Conservation of structure and expression of the trithorax gene between Drosophila virilis and Drosophila melanogaster. Mechanisms of Development 53, 113-122.

261. Thomson J.P., Skene P. J., Selfridge J., Clouaire T., et al. (2010) CpG islands influence chromatin structure via the CpG-binding protein Cfpl. Nature 464, 1082-1086.

262. Tripoulas N., LeJeunesse D., Gildea J., Shearn A. (1996). The Drosophila ashl gene product, which is localized at specific sites on polytene chromosomes, contains a SET domain and PHD finger. Genetics 143, 913928.

263. Tolhuis B., Muijrers I., de Wit F. et al. (2006). Genome-wide profiling of PRC1 and PRC2 Polycomb chromatin binding on Drosophila melanogaster. Nat. Genet. 38, 694-699.

264. Tsukada Y., Fang J., Erdjument-Bromage H. et al. (2006). Histone demethylation by a family of JmjC domain -containing proteins. Nature 439, 811-816.

265. Turner M., B. (2000). Histone acetylation and an epigenetic code. Bioessays 22, 836-45.

266. Turner M., B. (2002). Cellular memory and the histone code. Cell 111, 28591.

267. Vaquero A., Scher M.B., Lee D.H., Sutton A. et al. (2006). SirT2 is a histone deacetylase with preference for histone H4 Lys 16 during mitosis. Genes Dev. 20, 1256-1261.

268. Versteeg R., van Schaik B.D., van Batenburg M.F. et al. (2003). The human transcriptome map reveals extremes in gene density, intron length, GC content, and repeat pattern for domains of highly and weakly expressed genes. Genome Res. 13, 1998-2004.

269. Vincke С., Loris R., Saerens D., Martinez-Rodriguez S., Müyldermans S., Conrath K. 2009. General strategy to humanize a camelid single-domain antibody and identification of a universal humanized nanobody scaffold. J. Biol. Chem. 284 (5), 3273-3284.

270. Wang, H., Huang, Q., Z., Xia, L., Feng, Q., Erdjument-Bromage, H. et al.2001). Methylation of histone H4 at arginine 3 facilitating transcriptional activation by nuclear hormone receptor. Science 293, 853-7.

271. Wang, H., Wang, L., Erdjument-Bromage, H., Vidal, M., Tempst, P. et al. (2004). Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature 431, 873-8.

272. Weigel D., Jürgens G., Kuttner F. et al. (1989). The homeotic gene fork head encodes a nuclear protein and is expressed in the terminal regions of the Drosophila embryo. Cell 51, 645-658.

273. Weigel D., Seifert E., Reuter D., Jackie H. (1990). Regulatory elements controlling expression of the Drosophila homeotic gene fork head. EMBO J. 9, 1199-1207.

274. Wesolowski J., Alzogaray V., Reyelt J. et al. 2009. Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. Med. Microbiol. Immunol. 198, 157-174.

275. Winston F., Carlson M. (1992). Yeast SNF/SWI transcriptional activators and the SPT/SIN chromatin connection. Trends Genet. 8, 387-391.

276. Wirbelauer C., Bell O., Schubeler D. (2005) Variant histone H3.3 is deposited at sites of nucleosomal displacement throughout transcribed genes while active histone modifications show a promotor-proximal bias. Genes Dev. 19, 1761-1766.

277. Wong M.M., Cox L.K., Chrivia J.C. (2007). The chromatin remodeling protein, SRCAP, is critical for deposition of the histone variant H2A.Z at promoters. J. Biol. Chem. 282, 26132-26139.

278. Woo C.J., Kharchenko P.V., Daheron L., Park P.J., Kingston R.E. (2010). A region of the human HOXD cluster that confers Polycomb-group responsiveness. Ce//140, 99-110.

279. Woolven B. P., Frenken L., van der Logt P., Nicholls P.J. 1999. The structure of the llama heavy chain constant genes reveals a mechanism for heavy-chain antibody formation. Immunogenetics 50, 98-101.

280. Wu, T., C., Howe M. (1995). A genetic analysis of the Suppressor 2 of zeste complex of Drosophila melanogaster. Genetics 140, 139-81.

281. Wutz A. (2007) Xist function: bridging chromatin and stem cells. Trends Genet. 23, 457-464.

282. Wysocka J., Swigut T., Xiao H., Milne T.A. et al. (2006). A PHD finger of NURF couples histone H3 lysine 4 trimethylation with chromatin remodelling. Nature 442, 86-90.

283. Yano T., Nakamura T., Blechman J., Sorio C., Dang C.V., Geiger B., Canaani E. Nuclear punctate distribution of ALL-1 is conferred by distinct elements at the N terminus of the protein. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94, P. 7286-7291.

284. Yau K.Y., Groves M.A., Li S., Sheedly C., Lee H., Tanha J., MacKenzie C.R., Jermutus L., Hall J.C. 2003. Selection of hapten-specific singledomain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library. J. Immunol. Methods 281, 161-175.

285. Yokoyama A., Wang Z., Wysocka J., Sanyal M. et al. (2004). Leukemia proto-oncoprotein MLL forms a SETl-like histone methyltransferase complex with menin to regulate Hox gene expression. Mol. Cell. Biol. 24, 5639-5649.

286. Yu, D., B., Hess, L., J., Horning, E., S., Brown, A., G., Korsmeyer J., S. (1995). Altered Hox expression and segmental identity in Mil-mutant mice. Nature 378, 505-8.

287. Zink B., Paro R. In vivo binding pattern of a transregulator of homeotic genesin Drosophila melanogaster. //Nature. 1989. V. 337, P. 468-471.

288. Zhang Y., Ng H.H., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Bird A., Reinberg D. (1999) Analysis of the NuRD subunits reveals a histone deacetylase core complex and a connection with DNA methylation. Genes Dev. 13, 1924-1935.

289. Zhang, Y., Reinberg D. (2001). Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev 15, 2343-60.

290. Zhou, B., Bagri, A., Beckendorf K., S. (2001). Salivary gland determination in Drosophila: a salivary-specific, fork head enhancer integrates spatial pattern and allows fork head autoregulation. Dev Biol 237, 54-67.

291. Zhu B., Zheng Y., Pham A.D. et al. (2005). Monoubiquitination of human histone H2B: the factors involved and their roles in HOX gene regulation. Mol. Cell 20, 601-611.

292. Zink, D., Paro R. (1995). Drosophila Polycomb-group regulated chromatin inhibits the accessibility of a trans-activator to its target DNA. Embo J14, 5660-71.

293. Zuckerkandl E. (1999). Sectorial gene repression in the control of development. Gene 238, 263-76.

294. Вятчанин A.C., Тиллиб C.B. (2008а) Новый подход к исследованию клеточных компонентов, ассоциированных с определённым белком. Доклады Академии Наук. Т.421. №6. С. 826-829.

295. Вятчанин A.C., Тиллиб C.B. (20086) Модификации процедуры фагового дисплея для повышения эффективности селекции антиген-связывающих доменов особых одноцепочечных верблюжьих антител. Биотехнология. №4. С. 32-34.

296. Лебедева JI.A., Тиллиб C.B. (2003) Глобальный фактор поддержания тканеспецифического активного состояния генов Diosophila melanogaster белок TRITHORAX, ассоциирован с ядерным матриксом. Генетика 39(2):250-258.

297. Ряховский A.A., Тиллиб C.B. (2007а) Иммунопреципитационное картирование TRX-ассоциированных участков хромосом в промоторе гена fkh в клетках слюнных желез Drosophila melanogaster. Генетика Т. 43, №9, С. 1181-1189.

298. Ряховский A.A., Тиллиб C.B. (2007в) Колокализация S/MAR и TRE в регуляторных участках хромосом тканеспецифически экспрессирующихся генов Drosophila melanogaster. Доклады Академии Наук Т. 416, №3, С. 416-419.

299. Тиллиб C.B., Иванова Т.И., Васильев JI.A. (2010) Фингерпринтный анализ селекции «наноантител» методом фагового дисплея с использованием двух вариантов фагов-помощников. Acta Naturae 2, №3 (6), 100-108.

300. Тиллиб С. В. «Верблюжьи антитела» эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. (2011) Молекулярная биология 45, №1, 77-85.

Информация о работе

Тиллиб, Сергей Владимирович
доктора биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.03

Диссертация

Исследование молекулярных механизмов функционирования продуктов гена trithorax в регуляции тканеспецифической экспрессии генов у Drosophila melanogaster - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы