Диссертации » Общая биология » Генетика

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение и анализ мутаций, затрагивающих второй интрон гена Trithorax-like Drosophila melanogaster
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Получение и анализ мутаций, затрагивающих второй интрон гена Trithorax-like Drosophila melanogaster"

□03494024

На правах рукописи ФЕДОРОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ МУТАЦИЙ, ЗАТРАГИВАЮЩИХ ВТОРОЙ ИНТРОН ГЕНА ТШТНОЯАХ-ЫКЕ ВИОБОРНИА \iELANOGASTER

Генетика -03.02.07

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск, 2010

2 5 МАР.2010

003494024

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Наук, Сибирское Отделение, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск, лаборатория эволюционной биологии клетки.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Баричева Э.М.,

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Меркулова Т.Н., Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

кандидат биологических наук Волкова Е.И.,

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г.Новосибирск

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский университет

кафедра генетики, г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится «¿£_» au-Acou> 2010 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора биологических наук (Д 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10, т. (383)363-49-06, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан «/У» 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

\ ^

Т.М.Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из актуальных проблем современной генетики является изучение механизмов, обеспечивающих регуляцию дифференциальной активности генов. В настоящее время не вызывает сомнения, что интронные последовательности многих генов, наряду с их 5'-областями, являются полноценными регуляторными районами. К настоящему времени описано множество как позитивных, так и негативных регуляторных элементов, расположенных в интронах. Особенно часто регуляторньге последовательности располагаются в интронах генов, характеризующихся сложной картиной экспрессии. К таким генам относится и ген Thrithorax-like D.melanogaster, который кодирует многофункциональный белок GAGA, одна из основных функций которого заключается в регуляции экспрессии многих генов дрозофилы. Ген Tri экспрессируется на всех стадиях онтогенеза, однако картина его экспрессии меняется в зависимости от органа и типа ткани, от стадии онтогенеза и температуры окружающей среды. Разнообразная картина экспрессии гена Tri предполагает наличие сложной регуляции. В настоящее время с использованием культуры клеток и трансгенных мух исследована 5'-регуляторная область гена. Однако проведенные ранее в нашей лаборатории предварительные исследования позволили предположить наличие функционально-значимых последовательностей и во втором интроне гена, поскольку одна из гипоморфных мутаций jrfP(3'u'i\ локализованная в этом интроне, в гомозиготе или в сочетании с нуль-аллелями приводит к снижению жизнеспособности, оказывает негативное влияние на динамику компактизации и сегрегации хромосом, а так же нарушает процесс оогенеза.

В данной работе для идентификации и анализа функционально-значимых районов второго интрона гена Tri применяется комплексный подход, включающий использование компьютерных и молекулярно-генетических методов. Использование дрозофилы, как модельного объекта исследований, позволило получить набор мутаций, нарушающих структуру интрона, что делает возможным исследование функционально-значимых

элементов второго нитрона в эндогенном локусе в контексте целого организма.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выявление и анализ функционально-значимых районов второго интрона гена Tritkcrax-like D. meianogaster.

В ходе выполнения данной работы были поставлены следующие задачи:

1. Получение и картирование мутаций, затрагивающих второй интрон гена Tri D.meianogaster.

2. Молекулярно-генетический анализ полученных мутантов:

а) исследование влияния полученных мутаций на выживаемость дрозофил при различных температурах содержания мух;

б) изучение транскрипции гена Tri у мутантов.

3. Идентификация и анализ функционально-значимых участков второго интрона гена Tri:

а) выявление сайтов связывания белка GAGA во втором интроне и изучение связывания рекомбинантного белка GAGA и белков эмбриональных ядерных экстрактов с выявленными сайтами;

б) выявление эволюционно-консервативных последовательностей во втором интроне гена Tri.

Научная новизна. С помощью Р-элемент-индуцированной рекомбинации у самцов получены 23 новые мутации по гену Tri Dr.melanogaster, в том числе семь новых гипоморфных мутаций, представляющих собой делении, удаляющие различные участки второго интрона гена. Эти мутации являются удобным инструментом в изучении регуляции экспрессии гена Tri. Все полученные мутации (20 делеций и три дупликации) картированы. Проведенный генетический, компьютерный и молекулярный анализ позволил установить наличие функционально-значимых районов во втором интроне гена Tri. Впервые экспериментально показано связывание последовательностей второго интрона с рекомбинантным белком GAGA и белками ядерных экстрактов клеток эмбрионов.

Положения, выносимые на защиту. Данные, представленные в работе, свидетельствуют о наличии во втором интроне гена Tri функционально-значимых районов. В ходе работы были получены 23 новые мутации гена Tri, семь из которых затрагивали только второй интрон гена и были использованы в дальнейших экспериментах. Было установлено, что удаление различных фрагментов второго интрона гена Tri приводит к достоверному снижению выживаемости трансгетерозигот делеция/нуль-аллель при 25°С и/или 29°С. У мутантов Tri1'72, характеризующихся наиболее сильным снижением жизнеспособности, выявлено изменение по сравнению с нормой картины транскрипции гена Tri при 29°С на поздних стадиях эмбриогенеза. С помощью метода торможения ДНК-зонда в геле для трех теоретически предсказанных сайтов связывания белка GAGA во втором интроне гена Tri было показано наличие специфического связывания как с белками или белковыми комплексами эмбриональных ядерных экстрактов, так и с рекомбинантным белком GAGA. Используя известные геномные последовательности гена Tri двенадцати различных видов дрозофил, был проведен поиск эволюционно-консервативных элементов во втором интроне гена. В результате было идентифицировано семь таких элементов, с размерами, варьирующими от 17 до 23 п.н. Из них пять - со 100% гомологией.

Научно-практическая значимость. Полученные результаты дополняют имеющуюся информацию о регуляторном потенциале интронных последовательностей и расширяют возможности для дальнейших более детальных исследований регуляции гена Tri. Материалы данной диссертационной работы могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и медицинских специальностей. Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: International women's conference on Bien-technology (Daejion, Korea, 2003); Международная конференция "Генетика в России и мире" (Москва, 2006); ВОГИС III (Москва, 2004); XIV Школы по биологии развития «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии» (Звенигород,

2004); 10-ой Путинской Школы-конференции молодых ученых (Иущино, 2006); Международная конференция «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии» (Украина, Харьков, 2008).

По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в реферируемых журналах и 7 тезисов в сборниках конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в который входит 241 ссылка. Работа изложена на 139 страницах печатного текста, содержит 3 таблицы и 21 рисунок. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Линии D. melanogaster, использованные в работе, описаны в справочнике (Lindsley, Zimrn, 1992), базе данных FlyBase (www.Flybase.org), а также в статьях (Федорова и др., 2006; Огиенко и др., 2006).

Цитогенетические методы: приготовление препаратов политенных хромосом и анализ жизнеспособности дрозофил проводили по описанным ранее методикам (Федорова и др., 2001). Достоверность результатов оценивали, используя t-критерий Стьюдента и критерий Фишера. Молекулярно-генетические процедуры, связанные с выделением, очисткой, клонированием, амплификацией и введением 32Р-нуклеотидов в ДНК, проводили стандартными методами, описанными в руководстве Sambrook and Russell (www.MolecularCloning.com). Определение нуклеотидных последовательностей проводили на автоматическом секвенаторе ABI Prism 310 согласно методике производителя ("Applied Biosystems"). Выделение РНК и Нозерн-блот гибридизацию проводили по методике Бурнета (Burnett, 1997). Выделение ядерного экстракта эмбрионов дрозофил проводили согласно методике Soeller et al., 1988. Получение и очистку рекомбинантного белка осуществляли на колонках HisTrap™ HP (GE Healthcare), как описано в руководстве производителя. Торможение ДНК-зонда в геле (EMSA) проводили по Ueda et al., 1990,

Праймеры для ПЦР и олигонуклеотиды (для EMSA) синтезированы В.Ф.Кобзевым (ИЦиГ СО РАН).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Получение мутаций по второму интрону гена Tri

На момент начала настоящей работы только одна из доступных мутаций - пипомсрфная мутация Trf'P(3>m4 _ подходила для анализа регуляторного потенциала второго интрона. Поэтому было необходимо получить новые гипоморфные мутации по второму интрону, пригодные для исследования функционально-значимых районов гена Tri. Для этой цели был использован метод получения мутаций с помощью /'-элемент индуцированной рекомбинации у самцов, позволяющий получать перестройки в заданном районе (Preston et al., 1996А; Preston et al., 1996В).

Для получения мутаций были использовали две линии: l(3)s2325 и ЕР(3)3184. несущие транспозоны, локализованные, соответственно, в начале второго интрона и ближе к его 3'- концу. В эксперименте, проведенном с использованием линии ЕР(3)3184, было проанализировано 11268 мух и получено 183 рекомбинанта. В эксперименте с линией l(3)s2325 было проанализировано 20745 мух и получено 220 рекомбинантов. Поскольку рекомбинантные самки в дальнейших скрещиваниях не использовались (чтобы избежать последующих событий рекомбинации), а 34 рекомбинантных самца оказались стерильными, было получено 158 индивидуальных линий, которые далее обозначены как "1-п" для линий, полученных с использованием линии ЕР(3)3184, и "3-п" для линий, полученных с использованием линии l(3)s2325.

Все полученные линии были проверены на наличие перестроек, затрагивающих ген Tri, с помощью ПЦР-анализа. Оказалось, что 23 линии содержат новые мутации гена Tri (рис. 1).

ХЕ

i I

..... ,

Р И> BN X Р Е _1_11_LI_1_i_!_

0 12 3

рг*П 314iclown2'7_l

X

l<

I 1 'I •! : 5 : 6

■x2 lcv,20ä№townl311!4dowi)4.l_> ox5_2?v 2<»Äep Ж.Г6313МОТ

1 4 5a 5b

№ r ra

и i_1_

10 11

ехбь I

3-46 3-92

i. 3-48

II <

1-5« l-l i—3 1-36

3-23 3-3? - 3-5') _ i-:< _ (-72

ягв

____ 1-25

.... 3-47

.... 3-57

.... 3-101

Рисунок 1. Размеры полученных делеций. Верхняя линия изображает геномную последовательность гена Tri с отмеченными сайтами рестрикции BamHI (D), EcoRI (Е), Neo I (N), Pst (Р), Xho I (X). Под ней указано положение праймеров, использованных в данной работе. Треугольники обозначают места встроек Р-элементов в линиях I(3)s2325 и ЕР (3)3184, стрелки внутри треугольников указывают на ориентацию транспозонов. Ниже представлен фрагмент РНК гена Tri Низкие прямоугольники соответствуют некодирующим районам, высокие -кодирующим. Серым прямоугольником выделен второй интрон гена Tri. Делеции обозначены горизонтальными линиями.

I: делеции, затрагивающие кодирующую область гена Tri. Многоточие указывает на

то, что границы делеций лежат за пределами гена.

II: делеции, затрагивающие область второго интрона гена Tri.

Картирование полученных мутаций

Большие делеции, выходящие за границы гена Tri (линии 1-3, 1-36, 347, 3-74, 1-25, 3-57 и 3-101), были картированы с помощью световой микроскопии. Эти делеции удаляют различное число дисков, но все они удаляют диск 70F1-2, в котором локализуется ген Tri.

Границы остальных шестнадцати перестроек (три дупликации и тринадцать делеций) были определены с точностью до нуклеотида с помощью ПЦР и последующего секвенирования продуктов амплификации.

Было установлено, что размеры полученных небольших делеций, варьируют от 45 п.н. до 3.5 т.п.н. Эти делеции можно разделить на две группы (см. табл.1 и рис.1):

(1) делеции, затрагивающие наряду со вторым интроном также и кодирующую область гена (линии 1-1; 1-14; 1-56:1-68; 3-46; 3-92);

(2) делеции, затрагивающие только второй интрон гена (линии 1-23; 1-72; 323; 3-37; 3-48: 3-59; 3-85), которые и были использованы в дальнейших экспериментах.

Таблица 1. Характеристика полученных делеций по гену Тг1

Номер Границы делеции в соответ- Наличие концов Р- Размер Р-

ствии с последователь- элемента: Длина делеции, пн

линии ностью М22&042, ЕМВ!_ 5'-конец З'-конец элемента, пн

3-48 4440-4485 _ _ 26 45

3-85 4440-4586 _ 26 146

1-23 5456-5895 + — 995 439

1-72 5456-6094 — — 12 638

3-46 3309-4439 - + 146 1130

3-23 4440-5821 - - 4 1181

3-37 4440-5686 - - • 1246

3-92 1929-4439 - - 16 2510

3-59 4440-5815 + + Целый 1375

1-14 5456-8023 + + Целый 2567

1-56 2842-5448 — — 29 2606

1-68 3951-6749 — — Нет 2798

1-1 2141-5448 + + Целый 3307

3-47 4440-.... + * Удалены диски 70П-2 и 70Е7

3-74 — * То же

1-25 Нет Удалены диски 7(Ж1-2, 70Е7 и 70Е4-5

3-57 4440-... + - То же

3-101 4440-... + • Удалены дисхи 70Р1-2,70Е7, 70Е4-5 и 7ЭЕ1-2

1-3 ...-5448 • • •

1-38 ...-5448 * * *

' - нет данных

Анализ жизнеспособности полученных мутантов

Для линий 1-23; 1-72; 3-23; 3-59; 3-85 (с нарушениями только в интроне), были проведены стандартные генетические тесты на жизнеспособность (по признаку достижения взрослой стадии) при различных температурах: нормальной (25°С) и при температуре слабого теплового шока (29°С). В результате проведенных экспериментов было установлено, что удаление фрагмента в центральной части второго интрона гена Tri (делеции TriTri3'23 и Tri3'59) приводит к достоверному снижению выживаемости трансгетерозигот делеция/нуль-аллель при 25°С. Делеции, удаляющие районы в З'-конце интрона (Tri'~23 и Tri1'72), снижают выживаемость трансгетерозигот при 29°С примерно в семь и пять раз, соответственно, по сравнению с нормой (табл. 2).

Таблица 2. Выживаемость компаундов делеция/нуль-аллель, развивавшихся при температуре 25'С ив условиях слабого теплового шока (29'С)____

Количество Доля особей, Количество Доля особей,

Генотип отложенных доживших до отложенных доживших до

яиц при 25°С имаго при 25°С яиц при 29°С имаго при 29°С

f,;3-35/ TrlRS> 786 0,63±0,017*** 217 0,51±0,034ндр

Tri3'23/ Triш 1046 0,57±0,015*** 1690 0,40±0,012***

1569 0,53±0,013*** 1120 0,35±0,014***

Tri!'23/ TriRS1 310 0,84±0.021ндр 261 0,07±0,016***

Tri'-72/Triш 843 0,76±0,015*** 1165 0,12±0,009***

OregonR!Trfm 1012 0.85±0,011 1089 0,56±0,015

TrfP(3)HS4iTrfiSS 215 0,61±0,034,ир 877 0,51±0,017***

*** Отличие от контроля (Oregon R/Tri*"*) при Р< 0,001 ;

ндр - нет достоверного различия.

По-видимому, район второго интрона, удаляемый этими делециями, содержит функционально-значимый элемент, имеющий отношение к температурной чувствительности дрозофилы. Для мутации Tri1'73 было исследовано, как сказывается удаление этого района на протекание различных стадий онтогенеза. Результаты эксперимента представлены в таблице 3. При нормальной температуре почти все личинки, несущие аллель Tri1'72 в сочетании с нуль-аллелями (Trfss и Tri"67) окукливаются, а затем

превращаются в имаго. Если развитие идет при температуре слабого теплового шока (29°С) - менее половины окуклившихся личинок доживают до стадии имаго, а другая часть окуклившихся особей гибнет на стадии предкуколки и/или куколки (таб. 3). Напомним, что при температуре 29°С гибель мутантов Tri''72 происходит в основном на эмбриональной стадии развития (табл. 2).

Таблица 3. Выживаемость компаундов -аллель, отсаженных на стадии личинки 1-2 возраста, развивавшихся при температуре 25'С и в условиях слабого теплового шока (29'С)___р__

Генотип Количество отсаженных личииок-компаундоз (штук) Количество окуклившихся особей (в % от личинок) Количество вылетевших имаго (в % от личинок)

Trl'-72/TrlRS3 90 (при 25°С) 130 (при 29°С) 95% (при 25°С) 90% (при 29°С) 83% (при 25°С) 44% (при 29°С)

Trl'~n!Trf67 40 (при 25"С) 80 (при 29°С) 80% (при 25°С) 81% (при 29°С) 67% (при 25СС) 30% (при 29°С)

Таким образом, при 25°С у мутантов 7>/'"7*'/нуль-аллель наблюдается одна фаза летальности - эмбриогенез, а при 29°С появляется еще одна фаза - на стадии предкуколки/куколки. Это наблюдение согласуется с выдвинутым ранее предположением, что нормальная экспрессия гена Tri особенно необходима при преодолении особями дрозофилы основных критических моментов в развитии, таких как вылупление из яйца и вылет из куколки (Катохин и др., 2001).

Частичное восстановление жизнеспособности мутантов Tri1'72ITrf" при введении дополнительных кДНК копий гена Tri

Чтобы проверить, не является ли нарушение экспрессии гена Tri причиной вышеописанного снижения жизнеспособности, были проведены эксперименты по спасению фенотипа мутантных особей. С помощью генетических скрещиваний в геном мутантов Tri''72 были введены

транслозонь; hsp83:GAGA-519 или hsp83:GAGA-581, зкспрессирующие кДНК гена Tri. Линии, несущие транспозоны, любезно предоставлены профессором П.Шедлом (Greenberg and Schedl, 2001).

В результате проведенных экспериментов было установлено, что при добавлении одной копии любого из трансгенов выживаемость (по признаку достижения взрослой стадии) компаундов Trl''72!Trf8S при 29°С возросла - с 12% до 33% (для hsp83:GAGА-519) и до 36% (hsp83:GAGA-581) (рис. 2). Разница между различными тракспозонами несущественна, что свидетельствует о том, что обе изоформы белка одинаково важны для спасения фенотипа мутантов Tri'

Рисунок 2. GAGA-трансгены увеличивают выживаемость транс-гетерозигот TrlJ'72/TrlRä5 при 29°С (в % от ожидаемого, согласно Менделевскому расщеплению, числа).

1- генотип Trl'~7'ITrfss (1168 отложенных яиц);

2- генотип Tri'-7~ITrfa' + P[GAGA-581] (2050 отложенных яиц); 3- генотип ТгГ72ITrfK + P[GAGA-5!9] (1162 отложенных яиц).

Не полное, а частичное улучшение жизнеспособности (примерно на 20%) может объясняться тем, что «спасение» происходит только на одной стадии летальности. Можно предположить, что на эмбриональной и куколочных стадиях развития определяющими являются разные мРНК и, соответственно, разные изоформы белка.

Таким образом, восстановление выживаемости при введении в геном мутантных особей нормальной копии гена Tri свидетельствует о том, что снижение жизнеспособности у мутантов Tri1'72 обусловлено недостатком белка GAGA.

Анализ экспрессии гена Tri у мутантов Tri'72

У мутантов Tri1'72 с помощью Нозерн-блот гибридизации был проведен анализ экспрессии гена Tri при 25°С и 29°С на разных стадиях эмбриогенеза, так как было показано, что их гибель происходит б основном на этой стадии онтогенеза. У эмбрионов, гомозиготных по аллелю Tri1''2, выращенных при 25°С, картина транскрипции гена соответствует норме, тогда как у эмбрионов, выращенных при 29°С, отличается от нее (рис. 3). Па ранних стадиях развития эмбрионов (до В часов) представленность транскриптов гена Tri у мутантов не отличается от нормы (OregonR). Различия проявляются на поздних стадиях эмбриогенеза. В норме у эмбрионов после 12 часов развития преобладающим становится транскрипт длиной 3,0 т.п.н., а количество доминирующего на ранних стадиях развития транскрипта в 2,5 т.п.н. начинает постепенно уменьшаться. У мутантов в первые 12-16 часов эмбриогенеза представленность транскриптов 2,5 и 3 т.н. примерно одинакова, а на стадии 16-20 часов преобладающим является транскрипт длиной 2,5 т.н.

стадия

развития

OregonR Tri72

Рисунок 3. Нозерн-блот-анализ экспрессии гена Tri при 29°С: Нозерн-блот. содержащий тотальную РНК, выделенную из эмбрионов дикого типа (Oregon R) и гомозигот Tri1'" . Внизу - гибридизация этого же блота с зондом грП9 в качестве контроля нанесения РНК. В качестве зонда для гибридизации использовали [Р32]-меченые фрагменты кДНК гена Tri (экзоны 2, 3 и 4) и гена гр119.

По-видимому, функционально-значимые элементы, локализованные в районе второго интрона гена Tri, удаляемом делецией 1-72, необходимы для обеспечения правильной экспрессии гена Tri на поздних стадиях эмбриогенеза, а их удаление приводит к нарушению строго стадиеспецифичной картины наработки определенных транскриптов гена Tri.

Изучение связывания ядерных экстрактов и рекомбинантного белка GAGA с последовательностями второго интрона гена Tri

С помощью компьютерного анализа во втором интроне гена Tri выявляются сайты связывания белка GAGA. Для экспериментального подтверждения связывания белка или белкового комплекса с последовательностями второго интрона были синтезированы олигонуклеотиды, соответствующие трем потенциальным GAGA-сайтам второго интрона гена Tri: GA1 (5'-agaacgagagagtgagacgtagagacagagc-3'); GA2 (5'-gcagacagagagggagagagcgagagaa-3'); GA3 (5'-ggagagtgtgagcgacgctcgaccggagt- 3').

Методом торможения ДНК-зонда в геле было показано наличие взаимодействия вышеперечисленных олигонуклеотидов с белками или белковыми комплексами эмбриональных ядерных экстрактов, выделенные из клеток эмбрионов дрозофилы, развивающихся при нормальной (25°С) и повышенной (29°С) температурах (рис. 4). При связывании белков экстракта ядер эмбрионов дрозофилы, развивавшихся при 25°С, с олигонуклеотидами GAI, GA2, и GA3 выявляются три полосы задержки - А и Б и В (рис. 4). Эксперимент, когда олигонуклеотиды были нанесены на один гель, показал, что подвижность белковых комплексов, соответствующих этим полосам, одинакова для всех трех олигонуклеотидов. Специфичность полос А и Б подтверждается тем, что они исчезают, когда реакция связывания проводится в условиях конкуренции с тем же самым олигонуклеотидом, который использовался в качестве зонда (GAI, GA2 или GA3, соответственно), но при этом сохраняются при конкуренции с олигонуклеотидами,

последовательность которых не содержит GA-иоследовательноетей (CDC73 и С/ЕВР) (на примере олигонуклеотида GA2 - рис. 4). Из этих же экспериментов следует, что полоса задержки В не является специфичной.

При связывании белков экстракта ядер эмбрионов дрозофилы, развивавшихся при 29°С, картина связывания выглядит несколько иначе -медленномигрирующий комплекс А, специфичный для олигонуклеотидов GAi, GA2 и САЗ, присутствующий в ядерных экстрактах клеток эмбрионов, развивавшихся при нормальной температуре, отсутствует в ядерных экстрактах клеток эмбрионов, развивавшихся при 29°С (рис. 4).

123456789 10

•ЪЯЩ^У^-^ШГ "ЩИ - ЧЬ

Рисунок 4. Связывание белков экстракта ядер эмбрионов дрозофилы, развивавшихся при 25°С (дор. 1-6) и при 29°С (дор. 7-10) с олигонуклеотидом ОА2: 1 - свободный зонд; 2,7- связывание зонда с белками эмбрионального экстракта; 3 - связывание в присутствии 10х молярного избытка олигонуклеотида GA2;

4, 8 - связывание в присутствии 50х молярного избытка олигонуклеотида GA2;

5, 9 - связывание в присутствии ! ООх молярного избытка олигонуклеи гида С/ЕВР;

6, 10-связывание в присутствии ЮОх молярного избытка олитонуклеитида CDC73.

Таким образом, картина связывания олигонуклеотидов GA1 и GA2 и GA3 характеризуется наличием двух специфических белковых комплексов А и Б, если ядерный экстракт выделялся их эмбрионов, развивавшихся при нормальной температуре (25°С), и одного специфического комплекса - Б, если ядерный экстракт выделялся их эмбрионов, развивавшихся при повышенной температуре (29°С). Что представляют собой специфические полосы, сказать трудно - это могут быть как белковые комплексы, состоящие из различных ядерных белков, так и комплексы, состоящие только из белка GAGA, что также возможно, благодаря его способности к самоассоциации.

Для подтверждения того, что связывание данных районов второго интрона происходит именно с белком GAGA, был проведен эксперимент по торможению ДНК-зонда в геле с использованием экспрессированного и очищенного из клеток E.coli рекомбинантного белка GAGA, который подтвердил связывание синтезированных олигонуклеошцов с белком GAGA. Связывание есть и оно специфичное (рис. 5).

Í 2 3 4 5

Рисунок 5. Связывание рекомбинантного бежа GAGA, экспрессированного в клетках E.coli, с олигонуклеотидами: 1— экспериментально подтвержденный GAGA-сайт района bxd PRE гена Ultrabithorax (Horard et al., 2000): ccgtatcíctccctctctccgcagí (положительный контроль); 2- сайт связывания белков семейства FOXA: (ttttg)x6 (отрицательный контроль); 3-GA1; 4 - GA2; 5 - GA3.

Выявление консервативных фрагментов во втором интроне гена Tri

Одним из подходов к идентификации регуляторных элементов является поиск зволюционно-консервативных районов в ортологичных геномных последовательностях - метод филогенетического футпринтинга. Этот подход основан на том, что последовательности, имеющие функциональное значение, часто намного более эволюционно-консервативны, чем нефункциональные последовательности. Используя доступные геномные последовательности гена Tri двенадцати различных видов дрозофил http://www.genome.ucsc.edu (UCSC Genome Bioinformatics Site), был проведен поиск эволюционно-консервативных элементов во втором интроне гена. Было идентифицировано семь консервативных элементов, размеры которых варьируют от 17 до 32 п.н. Пять элементов имеют последовательности, полностью идентичные у всех 12 видов (рис. 6).

L(3)s2325 E(P)3I84

Рисунок 6. Схема второго интрона гена 7W. Треугольниками над линией обозначены транспозоны, под линией - эволюционно-консервативные элементы (!, 3-6 - со 100% гомологией). Стрелками указаны сайты гиперчузствителъности к ДНКазе I.

Наличие районов со 100% гомологией у всех видов дрозофил (чьи геномы на данный момент секвенированы и доступны для анализа), в том числе и тех, которые эволюционно «разошлись» более 40 млн. лет назад (например, виды D.melanogaster и D.viriiis), дает весомые основания считать, что эти районы являются функционально-значимыми (Harti and Lozovskaya 1994; Gumucio.et ai., 1993; SheSton et al., 1997). Эволюционное расстояние между D.melanogaster и D.viriiis примерно эквивалентно таковому между мышью и человеком и считается достаточны;»! для оценки возможной функциональности некодирующих последовательностей (Russo et а!., ¡995).

Следует отметить, что большая часть выявленных эволюционно-консервативных последовательностей находится вблизи районов, гиперчувствительных к ДНКазе I (неопубликованные данные Д.А.Карагодина). Районы гиперчувствительности к ДНКазе I. как правило, указывают на возможную локализацию в них регуляторных элементов генома, таких как промоторы, энхансеры, инсуляторы и сакленсеры (Satyamoorthy et al, 1997; Youn, 2001; Feisenield, et al., 2003).

Таким образом, во втором интроне гена ТУ/ выявлены функционально-значимые последовательности, о чем свидетельствуют следующие факты:

1) снижение выживаемости особей с делениями по второму нитрону;

2) изменение транскрипции гена Trl у ?4утантов с делецией во втором интроне;

3) наличие во втором интроне сайтов связывания белка GAGA;

4) наличие эволюционно-консервативных последовательностей во втором интроне;

5) перекрываемость этих консервативных последовательностей с сайтами гиперчувствительности к ДНКазе I.

Несмотря на то, что не все регуляторные элементы, локализованные во втором интроне гена Tri, идентифицированы, существование функционально-значимых районов во втором интроне и их влияние на экспрессию гена Tri не вызывает сомнений.

ВЫВОДЫ:

1. Получено 23 новых аллеля гена Tri, позволяющих детально исследовать регуляцию экспрессии гена Tri на разных стадиях онтогенеза у D.melanogaster. Проведено цигогенетическое картирование полученных мутаций, из которых 10 мутаций (7 делеций и 3 дупликации) затрагивают только район второго интрона гена Tri, а 13 мутаций, наряду с интронной, затрагивают и кодирующую область гена.

2. Установлено, что удаление фрагмента в центральной части второго интрона гена Tri (делении Tri3'85, Tri3'23 и Tri3"59) приводит к снижению выживаемости трансгетерозигот делеция/нуль-аллель при нормальной температуре (25°) относительно дикого типа, а удаляющие района в З'-конце интрона {Tri1'13 и Tri1'72) снижают выживаемость трансгетерозигот при температуре слабого теплового шока (29°С). Это свидетельствует о том, что центральная часть интрона содержит функционально-значимые элементы, имеющие значение для жизнеспособности дрозофил при нормальной, а З'-конец интрона - при повышенной температуре.

3. С помощью Нозерн-блот гибридизации показано, что удаление участка второго интрона длиной 700 п.н. приводит к нарушению строго стадиеспецифичной картины наработки определенных транскриптов гена Tri: картина транскрипции гена Tri у мутантов Tri1'72 при повышенной

температуре (29°С) на поздних стадиях эмбриогенеза отличается от нормы соотношением представленности трак скриптов 2,5 и 3,0 т.н.

4. Методом задержки ДНК-зонда в геле для трех потенциальных сайтов связывания GAGA, предсказанных методом SITECON во втором шпроне гена Tri, показано связывание с ними:

а) ядерных белков клеток эмбрионов дрозофил;

б) рекомбинантаого белка GAGA, экспрессированного в клетках Ecoli. Показано, что картина связывания трех GAGA сайтов с белковыми экстрактами ядер клеток эмбрионов меняется в зависимости от температуры, при которой развивались эмбрионы.

5. В результате сравнения последовательности гена Tri 12 различных видов дрозофил во втором интроне гена было выявлено семь эволюционно-консервативных элементов, размеры которых варьируют от 17 до 32 п.н., из них пять - со 100% гомологией.

Публикации:

1. А.В.Катохин, А.В.Пиндюрин, Е.В.Федорова, Э.М.Баричева. Молекуляряо-генетический анализ гена Trithorax-like, кодирующего транскрипционный фактор GAGA Drosophila melanogaster // Генетика. 2001. Т.37, № 4, С.467-474.

2. Е.В.Федорова, ААОгиенко., Д.А,Карагодин, К.Г.Айманова, Э.М.Баричева. Получение и анализ новых мутаций по гену Trithorax-like Drosophila melanogaster //Генетика. 2006. Т.42. №2. С. 149-158.

3. А.А.Огиенко, Д.А.Карагодин, СА.Федорова, Е.В.Федорова, В.ВЛашина,

3.М.Баричева. Анализ новой гапомофной мутации гена Trithorax-like, влияющей на оогенез Drosophila melanogaster // Онтогенез. 2006. Т. 37. № 3. С. 157-166.

4. Е.В.Федорова, А.ВЛиндюрин, Э.М.Баричева. Поддержание паттернов экспресии гомеозисных генов в развитии Drosophila melanogaster белками групп Polycomb, trithorax и ЕТР // Генетика. 2009. Т. 45. №.10. С.1301-1318.

Подписано к печати 18.00.2010 г.

Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ. 1. Уч.изд. 0,7

Тираж 100 экз. Заказ 9.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева. 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Федорова, Елена Владимировна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1, Интроны как функциональные элементы генома.

1.1.1 Представленность интронов у различных видов.

1.1.2. Теории возникновения интронов.

1.1.3. Консервативность интронов.

1.1.4. Роль интронов в геноме.

1.1.5. Интроны - источники некодирующих РНК.

1.2. Ген Trithorax-like (Trt) D.melanogaster.

1.2.1. Структура гена Trl.

1.2.2. Транскрипция гена Trl.

1.2.3. Регуляция экспрессии гена Trl.

1.2.4. Доменная структура продукта гена Trl - белка GAGA (GAF).

1.2.5. ДНК-связывающая активность белка GAGA.

1.2.6. Белок-белковые взаимодействия белка GAGA.

1.2.7. GAF как модификатор структуры хроматина.

1.2.7.1. Участие белка GAGA в регуляции экспрессии генов.

1.2.7.2. Роль белка GAGA в функционировании различных регуляторных элементов.

1.2.8. Взаимодействие белка GAGA с гетерохроматином и его влияние на деление клеток.

1.2.9. Белок GAGA требуется для дозовой компенсации у самцов дрозофилы.

1.2.10. Характеристика мутаций гена Trl.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Материалы, использованные в работе.

2.2. Олигонуклеотиды.

2.3. Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе.

2.4. Анализ жизнеспособности.

2.5. Приготовление препаратов для световой микроскопии.

2.6. Выделение геномной ДНК для использования в ПЦР.

2.7. Выделение тотальной РНК из яичников и других тканей дрозофилы.

2.8. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.9. Секвенирование с использованием набора для секвенирования ABI PRISM BigDye Terminator Ready Mix.

2.10. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозных гелях.

2.11. Получение Р32-меченых ДНК-зондов.

2.12. Нозерн-блот гибридизация.

2.13. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции.

2.14. Лигирование.

2.15. Подготовка электрокомпетентных клеток E.coli.

2.16. Электропорация плазмидной ДНК в клетки E.coli.

2.17. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса.

2.18. Скрининг бактериальных колоний с помощью ПЦР.

2.19. Трансформация генома дрозофилы /^-транспозонами.

2.20. Детекция (З-галактозидазы в органах и тканях дрозофилы.

2.21. Выделение ядерного экстракта из эмбрионов дрозофил.

2.22. Метод торможения ДНК-пробы в геле.

2.23. Выделение рекомбинантного белка.

2.24. Вектор для трансформации эмбрионов дрозофил.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Получение мутаций по второму интрону гена Trl.

3.2. Идентификация и картирование полученных мутаций

3.2.1. Отбор линий, несущих перестройки.

3.2.2. Картирование полученных перестроек.

3.3. Анализ жизнеспособности полученных мутантов. / 70 рог

3.3.1. Частичное восстановление жизнеспособности мутантов Trl I Trl при введении дополнительных кДНК копий гена Trl.

3.4. Анализ экспрессии гена 7>/у мутантов Trl''72.

3.5. Выявление консервативных фрагментов во втором интроне гена Trl.

3.6. Изучение связывания ядерных экстрактов и рекомбинантного белка

GAGA с последовательностями второго интрона.

3.7. Выявление энхансерных элементов второго интрона гена Trl с помощью трансформации эмбрионов дрозофилы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и анализ мутаций, затрагивающих второй интрон гена Trithorax-like Drosophila melanogaster"

Актуальность проблемы.

Для эукариотических организмов характерно наличие дифференциальной экспрессии генов: большинство генов высших эукариот активны только в определённых типах клеток в определённые периоды онтогенеза и функционально неактивны во всех остальных клетках и на других стадиях развития. В результате в разных тканях организма происходит избирательная активация специфических генов. В связи с этим одной из центральных проблем современной биологии является исследование механизмов, обеспечивающих регуляцию дифференциальной активности генов

В последнее время становится все более очевидным, что наряду с 5'-областями генов, существенный вклад в регуляцию их экспрессии вносят интроны. Роль интронов в регуляции транскрипции генов была продемонстрирована на множестве эукариотических организмов, включая грибы, растения, позвоночных и беспозвоночных животных. Предполагается, что во многих случаях интроны оказывают даже большее влияние на формирование уровня и паттерна экспрессии генов, чем промоторные регуляторные районы (цит. по Alan B.Rose, 2008). Например, известно, что в больших интронах генов могут располагаться цис-регуляторные элементы, участвующие в ткане- или стадия-специфической экспрессии генов. К настоящему времени описано множество как позитивных, так и негативных регуляторных элементов, расположенных в интронах. Чаще всего они располагаются в самых больших интронах генов, особенно тех, которые имеют сложную картину экспрессии.

Одним их таких генов является ген Trithorax-like (Trl) D.melanogaster, который кодирует многофункциональный белок GAGA. Его правильная экспрессия необходима для множества процессов, протекающих на разных уровнях: на уровне ядра, клетки и целого организма. Этот белок участвует в регуляции экспрессии многих генов дрозофилы (гомеозисных, генов сегментации, генов «теплового шока», «домашнего хозяйства» и др. (Granok et al., 1995), способствуя формированию и/или поддержанию открытой структуры хроматина в регуляторных районах генов, что облегчает доступ к этим районам РНК полимеразы II и других специфических факторов (Wilkins and Lis, 1998). Известно, что белок GAGA связан с GA-богатыми последовательностями гетерохроматина на протяжении всего клеточного цикла и, возможно, участвует в установлении границ между эу- и гетерохроматином (Raff et al., 1994). Косвенным свидетельством в пользу этого предположения может служить то, что некоторые мутации гена Trl являются доминантными энхансерами эффекта положения мозаичного типа (Farkas et al., 1994). Белок GAGA участвует в функционировании энхансеров, сайленсеров, граничных элементов и инсуляторов (Ohtsuki and Levin, 1998; Strutt et al., 1997; O'Donnell and Wensink, 1994; Mishra et al., 2001; Busturia et al., 2001). Благодаря своей способности к олигомеризации, GAF может обеспечивать связь энхансера с промотором, которые могут располагаться как в одной, так и в разных молекулах ДНК (Mahmoudi et al., 2002). Кроме того, было показано, что этот белок участвует в формировании "клеточной памяти" о выбранном пути дифференцировки (Cavalli and Paro., 1998). Правильная экспрессия гена Trl необходима для нормальной жизнедеятельности дрозофилы, а мутации этого гена приводят к различным аномалиям: нарушениям клеточного деления, стерильности, снижению жизнеспособности (Bhat et al., 1996; Трунова и др., 2001). То есть функции белка GAGA охватывают широкий спектр процессов, необходимых для нормального развития D.melanogaster. Белок GAGA необходим и в ходе клеточных делений (как митоза, так и мейоза), и в интерфазном ядре, участвуя в регуляции транскрипции большого числа генов, входящих в сложноорганизованные генные сети, описывающие процессы роста и развития.

Хотя ген Trl относится к числу повсеместно экспрессирующихся генов, картина его экспрессии зависит от органа и типа ткани, от стадии онтогенеза и от температуры окружающей среды (Bhat et al., 1996; Soeller et al., 1993; Перелыгина и др., 1992; Baricheva et al., 1997). Можно предполагать, что такая сложная, зависящая от многих факторов, экспрессия данного гена определяется сложной системой регуляторных элементов. Однако к настоящему времени регуляторные районы гена Trl изучены недостаточно. Нет никаких данных относительно того, какие последовательности гена Trl имеют значение для его экспрессии в различных тканях и органах на разных стадиях онтогенеза при различных температурных условиях in vivo.

Ранее было показано, что гипоморфная мутация TrlEP(3)3!84, локализованная во втором интроне гена Trl, оказывает негативное влияние на динамику компактизации и сегрегации хромосом и морфологию яйцевых камер на разных стадиях развития дрозофилы (Трунова и др., 2001), что можно рассматривать как косвенные свидетельства того, что второй интрон гена Trl обладает регуляторным потенциалом. В связи с этим поиск регуляторных элементов во втором интроне гена Trl представляется перспективным.

Использование дрозофилы, как модельного объекта исследований, позволяет получать мутации в изучаемом районе и исследовать регуляторные элементы в эндогенном локусе в контексте целого организма в системе in vivo.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выявление и анализ функционально-значимых районов второго интрона гена Trithorax-like D.melanogaster.

В ходе выполнения данной работы были поставлены следующие задачи:

1. Получение и картирование мутаций, затрагивающих второй интрон гена Trl D. melanogaster.

2. Молекулярно-генетический анализ полученных мутантов : а) исследование влияния этих мутаций на выживаемость дрозофил при различных температурах содержания мух; б) изучение уровня экспрессии гена Trl у мутантов.

3. Идентификация и анализ функционально-значимых участков второго интрона гена Trl : а) выявление эволюционно-консервативных последовательностей во втором интроне гена Trl; б) выявление сайтов связывания белка GAGA во втором интроне и изучение связывания рекомбинантного белка GAGA и белков эмбриональных ядерных экстрактов с выявленными сайтами.

Научная новизна и практическая ценность работы. С помощью Р-элемент-индуцированной рекомбинации у самцов получены 23 новые мутации по гену Trl Dr.melanogaster, в том числе семь новых гипоморфных мутаций, представляющих собой делеции, удаляющие различные участки второго интрона гена. Эти мутации могут служить удобным инструментом в изучении разнообразных функций белка GAGA. Все полученные мутации (20 делеций и три дупликации) картированы. Проведенный молекулярно-генетический анализ полученных мутантов позволил выявить во втором интроне гена Trl функционально-значимые районы: обнаружено, что делеции Trl3'85, Trl2'23, Trl3'59 , Trl1'23 и Trl1'72 во втором интроне гена Trl влияют на жизнеспособность мутантиых мух, выращенных при различных температурах (25° и 29°С), а делеция Trl1'72 во втором интроне вызывает изменение паттерна экспрессии гена при 29°С. Впервые экспериментально показано связывание последовательностей второго интрона с рекомбинаитным белком GAGA и белками ядерных экстрактов клеток эмбрионов.

Научно-практическая значимость. Полученные результаты дополняют имеющуюся информацию о регуляторном потенциале интронных последовательностей и расширяют возможности для дальнейших более детальных исследований регуляции гена Trl. Материалы данной диссертационной работы могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и медицинских специальностей.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях:

• International women's conference on Bien-technology (Daejion, Korea, 2003);

• Международная конференция "Генетика в России и мире" (Москва, 2006);

• ВОГИС III (Москва, 2004);

• XIV Школы по биологии развития «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии» (Звенигород, 2004);

• 10-ой Пущинской Школы-конференции молодых ученых (Пущино, 2006);

• Международная конференция «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии» (Украина, Харьков, 2008).

Публикации:

1. А.В.Катохин, А.В.Пиндюрин, Е.В.Федорова, Э.М.Баричева. Молекулярно-генетический анализ гена Trithorax-like, кодирующего транскрипционный фактор GAGA Drosophila melanogaster //Генетика. 2001. Т.37, № 4, С.467-474.

2. Е.В.Федорова, А.АОгиенко., Д.А.Карагодин, К.Г.Айманова, Э.М.Баричева. Получение и анализ новых мутаций по гену Trithorax-like Drosophila melanogaster // Генетика. 2006. Т.42. № 2. С. 149-158.

3. А.А.Огиенко, Д.А.Карагодин, С.А.Федорова, Е.В.Федорова, В.В.Лашина,

3.М.Баричева. Анализ новой гипомофной мутации гена Trithorax-like, влияющей на оогенез Drosophila melanogaster //Онтогенез. 2006. Т. 37. № 3. С. 157-166.

4. Е.В.Федорова, А.В.Пиндюрин, Э.М.Баричева. Поддержание паттернов экспресии гомеозисных генов в развитии Drosophila melanogaster белками групп Polycomb, trithorax и ЕТР // Генетика. 2009. Т. 45. №.10. С.1301—1318.

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Получение и картирование мутаций выполнялись при участии Огиенко А.А. и Карагодина Д.С. (ИЦиГ СО РАН, лаборатория эволюционной биологии клетки). Изучение экспрессии гена Trl проведено при участии Карагодина Д.А. (ИЦиГ СО РАН, лаборатория эволюционной биологии клетки). Микроскопический анализ политенных хромосом проведен совместно с научным руководителем. Получение и очистка рекомбинантного белка проводились при участии Омелиной Е. (ИЦиГ СО РАН, лаборатория эволюционной биологии клетки). Материалы, вошедшие в данную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в который входит 241 ссылка. Работа изложена на 139 страницах печатного текста, содержит 3 таблицы и 21 рисунок.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Федорова, Елена Владимировна

ВЫВОДЫ:

1. Получено 23 новых аллеля гена Trl, позволяющих детально исследовать регуляцию экспрессии гена Trl на разных стадиях онтогенеза у D.melanogaster. Проведено цито.генетическое картирование полученных мутаций, из которых 10 мутаций (7 делеций и 3 дупликации) затрагивают только район второго интрона гена Trl, а 13 мутаций, наряду с интронной, затрагивают и кодирующую область гена.

2. Установлено, что удаление фрагмента в центральной части второго интрона гена

5 Of Э Т 5 1 CQ

Trl (делеции Trl , Trl' и Trl' ) приводит к снижению выживаемости трансгетерозигот делеция/нуль-аллель при нормальной температуре (25°) относительно дикого типа, а удаляющие района в З'-конце интрона {Trl1'23 и Trl1' 72) снижают выживаемость трансгетерозигот при температуре слабого теплового шока (29°С). Это свидетельствует о том, что центральная часть интрона содержит функционально-значимые элементы, имеющие значение для жизнеспособности дрозофил при нормальной, а 3'-конец интрона - при повышенной температуре.

3. С помощью Нозерн-блот гибридизации показано, что удаление участка второго интрона длиной 700 п.н. приводит к нарушению строго стадиеспецифичной картины наработки определенных транскриптов гена Trl\ картина транскрипции ТУ гена Trl у мутантов Trl' при повышенной температуре (29°С) на поздних стадиях эмбриогенеза отличается от нормы соотношением представленности транскриптов 2,5 и 3,0 т.н.

4. Методом задержки ДНК-зонда в геле для трех потенциальных сайтов связывания GAGA, предсказанных методом SITECON во втором интроне гена Trl, показано связывание с ними: а) ядерных белков клеток эмбрионов дрозофил; б) рекомбинантного белка GAGA, экспрессированного в клетках E.coli. Показано, что картина связывания трех GAGA сайтов с белковыми экстрактами ядер клеток эмбрионов меняется в зависимости от температуры, при которой развивались эмбрионы.

5. В результате сравнения последовательности гена Trl 12 различных видов дрозофил во втором интроне гена было выявлено семь эволюционноконсервативных элементов, размеры которых варьируют от 17 до 32 п.н., из них пять - со 100% гомологией.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ген Trl относится к числу повсеместно экспрессирующихся генов, однако картина его экспрессии зависит от органа и типа ткани, от стадии онтогенеза и от температуры окружающей среды (Bhat et al., 1996; Soeller et al., 1993; Перелыгина и др., 1992; Baricheva et al., 1997). Можно предполагать, что такая сложная, зависящая от многих факторов, экспрессия данного гена определяется сложной системой регуляторных элементов. Однако о регуляции гена Trl известно не много. Делеционный анализ 5'-области гена выявил район минимального промотора и районы, содержащие функционально-значимые сайты, удаление которых значительно снижает активность гена или полностью блокирует транскрипцию гена Trl как в культуре клеток, так и в экспериментах по трансгенезу (Kosoy et al., 2002; Bernues et al., 2007). Известно, что регуляторные последовательности часто располагаются не только в 5'-областях, но и в протяженных интронах генов. Особенно это характерно для генов, имеющих сложную картину экспрессии. В данной работе была поставлена задача выявления возможного регуляторного потенциала второго интрона гена Trl.

Для выявления регуляторных последовательностей в настоящее время все чаще используют векторные конструкции, содержащие исследуемый район гена, встроенный перед промотором репортерного гена, и затем оценивают его влияние на экспрессию репортерного гена этой конструкции у трансгенных особей или в культуре клеток. Однако эта стратегия имеет ряд недостатков. Так, у трансгенных особей регуляторный элемент может оказаться не способным правильно функционировать в экзогенном локусе, например, из-за эффекта положения или вследствие близости другого регуляторного элемента, эндогенного для места встройки векторной конструкции. Использование трансфицированных клеточных линий еще больше усложняет трактовку результатов, т.к. активность генов в клеточных линиях может быть не идентичной их функционированию в целом организме. В связи с этим, для решения поставленной в данной работе задачи были использованы мутации, нарушающие те или иные участки второго интрона гена Trl. Если мутация затрагивает регуляторный элемент, она может нарушить его функционирование, что может быть выявлено с помощью цитогенетических и молекулярных методов. Этот подход, несмотря на значительную трудоемкость, связанную с получением мутаций в заданном районе, позволяет анализировать регуляторные элементы в эндогенном локусе и в контексте целого организма.

К началу данной работы в мировых коллекциях было представлено шесть мутаций, затрагивающих второй интрон гена Trl, но большинство из них являются эмбриональными деталями, что не позволяет изучать функционирование гена на более поздних стадиях развития. Только одна из доступных на момент начала настоящей работы мутаций - гипоморфная мутация TrlEP(3)3'84 - пригодна для анализа регуляторного потенциала второго интрона, так как она жизнеспособна в гомозиготе или в трансгетерозиготе с нуль-аллелями. Поэтому было необходимо получить новые гипоморфные мутации по второму интрону, пригодные для исследования функционально-значимых районов гена Trl. Для этой цели был использован метод получения мутаций с помощью Р-элемент индуцированной рекомбинации у самцов, позволяющий получать перестройки в заданном районе (Preston et al., 1996А; Preston et al., 1996B).

Для получения мутаций были использовали две линии: l(3)s2325 и ЕР(3)3184, несущие транспозоны, локализованные, соответственно, в начале второго интрона и ближе к его 3'- концу. В ходе экспериментов было получено 158 индивидуальных линий, все они были проанализированы с помощью ПЦР на наличие перестроек. В результате проведенных экспериментов было получено 23 новые мутации гена Trl. Пять делеций, выходящих за границы гена Trl (линии 1-3, 1-36, 3-47, 3-74, 1-25, 3-57 и 3-101), были картированы с помощью световой микроскопии. Границы остальных шестнадцати перестроек (три дупликации и тринадцать делеций) были определены с точностью до нуклеотида с помощью ПЦР и последующего секвенирования продуктов амплификации.

Для решения поставленной перед нами задачи - поиска регуляторных элементов во втором районе гена Trl подходило семь из полученных в данной работе линий, так как они содержали делеции, -затрагивающие только второй интрон гена. Для этих линий были проведены стандартные генетические тесты на жизнеспособность (по признаку достижения взрослой стадии) при различных температурах: нормальной - 25°С и при температуре слабого теплового шока -29°С. В результате проведенных экспериментов было установлено, что удаление

ЭОС ? Т 5 фрагмента в центральной части второго интрона гена Trl (делеции Trl , Trl' и

Trl3'59) приводит к достоверному снижению выживаемости трансгетерозигот делеция/нуль-аллель при 25°С. Делеции, удаляющие районы в 3'- конце интрона

I I уу

Trl' и Trl' ), существенно снижают выживаемость трансгетерозигот при 29°С. У 72 мутантов с делецией Trl' наблюдалось снижение жизнеспособности примерно в пять раз по сравнению в нормой.

Для подтверждения предположения о том, что именно снижение экспрессии гена Trl приводит к вышеописанному снижению жизнеспособности, были проведены эксперименты по спасению фенотипа мутантных особей. С помощью генетических скрещиваний в анализируемые мутанты Trl1'72 были введены транспозоны hsp83:GAGA-519 и hsp83:GAGA-581, экспрессирующие кДНК гена Trl. В результате проведенных экспериментов было установлено, что при добавлении одной копии любого из трансгенов происходит частичное восстановление жизнеспособности компаундов Trl!'72/TrlR85 при 29°С, что свидетельствует о том, что снижение жизнеспособности у мутантов Trl1'72 обусловлено недостатком белка GAGA.

1 72

Поскольку было установлено, что наличие делеции Trl' в гомозиготе или в сочетании с нуль-аллелями приводит к значительному снижению выживаемости мутантных особей при 29°С, был проведен анализ экспрессии данного гена у мутантов Trl1'72 на разных стадиях эмбриогенеза с помощью Нозерн-блот Т) гибридизации. Показано изменение картины экспрессии гена Trl у мутантов Trl при 29°С, характеризующееся соотношением представленности транскриптов на поздних стадиях эмбриогенеза по сравнению с нормой.

Одним из подходов к идентификации функционально-значимых элементов является поиск эволюционно-консервативных районов в ортологичных геномных последовательностях - метод филогенетического футприптинга. Этот подход основан на том, что последовательности, имеющие функциональное значение, часто намного более эволюционно-консервативны, чем не функциональные последовательности. Используя известные геномные последовательности гена Trl двенадцати различных видов дрозофил, был проведен поиск эволюционно-консервативных элементов во втором интроне гена. Отметим, что эволюционное расстояние между D.melanogaster и D.virilis примерно эквивалентно таковому между мышью и человеком и более чем достаточно для оценки возможной функциональности некодирующих последовательностей (Russo et al., 1995). В результате было идентифицировано семь консервативных элементов, размеры которых варьируют от 17 до 23 п.н. Из них пять - со 100% гомологией. Существенно, что эти элементы находятся вблизи выявленных ранее во втором интроне гена Trl районов гиперчувствительности к ДНКазе I.

Известно, что регуляторные районы генов часто характеризуются наличием в них сайтов связывания для различных позитивных и негативных белков-регуляторов. В данной работе экспериментально (с помощью метода задержки ДНК-зонда в геле) для трех теоретически предсказанных сайтов связывания белка GAGA во втором интроне гена Trl было показано наличие специфического связывания как с белками или белковыми комплексами эмбриональных ядерных экстрактов, так и с рекомбинантным белком GAGA. Сайты связывания белка

GAGA в интроне могут иметь значение как для его саморегуляции, так и для функционирования этого района в качестве энхансера, сайленсера, инсулятора или способствовать элонгации транскрипции.

Таким образом, во втором интроне гена Trl выявлены функционально-значимые последовательности, о чем свидетельствуют следующие факты:

1) снижение выживаемости особей с делециями по второму интрону;

2) наличие эволюционно-консервативных последовательностей во втором интроне;

3) перекрываемость этих консервативных последовательностей с сайтами гиперчувствительности к ДНКазе I;

4) изменение транскрипции гена Trl у мутантов с делецией во втором интроне;

5) наличие во втором интроне сайтов связывания белка GAGA.

Несмотря на то, что не все регуляторные элементы, локализованные во втором интроне гена Trl, идентифицированы, существование функционально-значимых районов во втором интроне и их влияние на экспрессию гена Trl не вызывает сомнений.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Федорова, Елена Владимировна, Новосибирск

1. Груздев Н.М. и Куллыев А.П. Инсуляторы Drosophila melanogaster: структура, функции // Успехи биологической химии. 2002. Т.42. С. 161-176.

2. Катохин А.В., Пиндюрин А.В., Федорова Е.В., Баричева Э.М. Молекулярно-генетический анализ гена Trithorax-like, кодирующего транскрипционный фактор GAGA Drosophila melanogaster // Генетика. 2001. Т.37. N 4. С. 467-474.

3. Огиенко А.А., Карагодин Д.А., Федорова С.А., Федорова Е.В., Лашина В.В., Баричева Э.М. Анализ новой гипоморфной мутации гена Trithor ax-like, влияющего на онтогенез Drosophila melanogaster II Онтогенез. 2006. T.37. N.3. С.157-166.

4. Перелыгина Л.М., Баричева Э.М., Себелева Т.Е., Катохин А.В., Соловьева И.В. и Кокоза В.А. Изучение особенностей экспрессии последовательностей Ncl8A, Nc34CD, Nc70F и Nc98F из генома Drosophila melanogaster II Генетика. 1992. Т.28. С.98-103.

5. Рогозин И.Б., Вульф Ю.И., Бабенко В.Н., Кунин Е.В. Эволюция геномов эукариот и принцип максимальной парсимонии // Вестник ВОГиС. 2005. Том 9. № 2. С.141-152.

6. Федорова Е.В., Огиенко А.А., Карагодин Д.А., Айманова К.Г., Баричева Э.М. Получение и анализ новых мутаций по гену Trithor ax-like Drosophila melanogaster //Генетика. 2006. T.42. N.2. С.149-158.

7. Федорова Е.В., Пиндюрин А.В., Баричева Э.М. Поддержание паттернов экспресии гомеозисных генов в развитии Drosophila melanogaster белками групп Polycomb, trithorax и ЕТР // Генетика. 2009. Т. 45. N.10. С. 1301-1318.

8. Чернов И.П., Акопов С.Б. Николаев Л.Г. 2004. Структура и функции участков прикрепления ДНК к ядерному матриксу (S/MAR)m // Биоорган.химия. Т.30. С.3-14.

9. Adkins N.L., Hagerman Т.A., Georgel P. GAGA protein: a multi-faceted transcription factor // Biochem Cell Biol. 2006. V.84(4). P.559-67.

10. Akopian A.N., Okuse K., Souslova V., England S., Ogata N. & Wood J.N. Trans-splicing of a voltage-gated sodium channel is regulated by nerve growth factor // FEBS Lett. 1999. V.445. P. 177-182.

11. Aravin A.A., Lagos-Quintana M., Yalcin A., Zavolan M., Marks D., Snyder В., Gaasterland T, Meyer J., Tuschl T. The small RNA profile during Drosophila melanogaster development//Developmental Cell. 2003. V.5. P.337-350.

12. Arkhipova I.R. Promoter elements in Drosophila melanogaster revealed by sequence analysis // Genetics. 1995. V. 139. P. 1359-69.

13. Ash J., Ke Y., Korb M., Johnson L.F. Introns are essential for growth-regulated expression of the mouse thymidylate synthase gene // Mol Cell Biol. 1993. V.3. P.1565-71.

14. Ashburner M. Drosophila. A laboratory handbook // Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989. P. 75-77.

15. Ashburner M. Europe must grant crucial funds for biological research 11 Nature. 1999. V.402. P.12.

16. Babenko V.N., Rogozin I.B., Mekhedov S.L., Koonin E.V. Prevalence of intron gain over intron loss in the evolution of paralogous gene families // Nucleic acids research. 2004. V.32. P. 3724-3733.

17. Bailey A.D., Pavelitz Т., Weiner A.M. The microsatellite sequence (CT)n x (GA)n promotes stable chromosomal integration of large tandem arrays of functional human U2 small nuclear RNA genes // Molecular and Cellular Biology. 1998. V.18(4). P.2262-71.

18. Bardwell V.J., Treisman R. The POZ domain: a conserved protein-protein interaction motif// Genes & development. 1994. V.8. P. 1664-1677.

19. Baricheva E.M., Katokhin A.V., Perelygina L.M. Expression of Drosophila melanogaster gene encoding transcription factor GAGA is tissue-specific and temperature-dependent // Febs Letters. 1997. V.414. P.285-288.

20. Bejerano G., Pheasant M., Makunin I., Stephen S., Kent W.J., Mattiek J.S., Haussler D. Ultraconserved elements in the human genome. Science. 2004. V.304(5675). P.1321-5.

21. Bejarano F., Busturia A. Function of the Trithorax-like gene during Drosophila development // Developmental biology. 2004. V.268(2). P.327-41.

22. Belozerov V.E. Majumder P., Shen P., Cai H.N. A novel boundary element may facilitate independant gene regulation in the Antennapedia complex of Drosophila И EMBO Journal. 2003. V.22. P.3113-3121.

23. Benyajati C., Mueller L., Xu N., Pappano M., Gao J., Mosammaparast M., Conklin D., Granok H., Craig C., Elgin S. Multiple isoforms of GAGA factor, a critical component of chromatin structure // Nucleic acids research. 1997. V.25. P.3345-3353.

24. Bergman C.M., Kreitman M. Analysis of conserved noncoding DNA in Drosophila reveals similar constraints in intergenic and intronic sequences // Genome Research. 2001. V.ll(8). P.1335-45.

25. Bernues J., Pin D. and Kosoy A. General, negative feedback mechanism for regulation of Trithorax-like gene expression in vivo: new roles for GAGA factor in flies //Nucleic Acids Research. 2007. P.l-10.

26. Bhat K.M., Farkas G., Karch F., Gyurkovics H„ Gausz J., Schedl P. The GAGA factor is required in the early Drosophila embryo not only for transcriptional regulation but also for nuclear division // Development. 1996. V.122. P.l 113-1124.

27. Biggin M.D, Tjian R. Transcription factors that activate the Ultrabithorax promoter in developmental^ staged extracts // Cell. 1988. V.53(5). P.699-711.

28. Black D.L. Protein diversity from alternative splicing: a challenge for bioinformatics and post-genome biology// Cell. 2000. V.103. P.367-370.

29. Bonet C., Fernandez I., Aran X. et al The GAGA protein of Drosophila is phosphorilated by CK2 // Journal of molecular biology. 2005. V.351. P.562-572.

30. Brett D, Pospisil H, Valcarcel J, Reich J, Bork P. Alternative splicing and genome complexity //Nat Genet. 2002. V. 30(1). P.29-30.

31. Brock HW, Fisher CL. Maintenance of gene expression patterns // Dev. Dyn. 2005. V.232(3). P.633-55.

32. Bruhat A., Tourmente S., Chapel S. et.al. Regulatory elements in the firs intron contribute to transcriptional regulation of /33 tubulin gene by 20-hydroxyecdysone in Drosophila Kc cells // Nucleic Acid Research. 1990. V.18. N.10. P.2861-2867.

33. Burnett W.V. Nothern blotting of RNA denatured in glyoxal without buffer recirculation //BioTechniques. 1997. V.22. P.668-671.

34. Busturia A., Lloyd A., Bejarano F., Zavortink M., Xin H., Sakonju S. The MCP silencer of the Drosophila Abd-B gene requires both Pleiohomeotic and GAGA factor for the mainteinance of repression // Development. 2001. V.128. P.2163-2173.

35. Butler J.E.F. and.Kadonaga J.T. Enhancer-promoter specificity mediated by DPE or TATA core promoter motifs // Genes & development. 2001. V. 15. P.2515-2519.

36. Cai H.N. and Shen P. Effects of cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity // Sceince. 2001. V. 291(5503). P.493-5.

37. Carels N., Bernardi G. Two classes of genes in plants // Genetics. 2000. V. 154(4). P.1819-25.

38. Carthew R.W. Gene regulation by microRNAs // Curr Opin Genet Dev. 2006. V.16(2). P.203-8.

39. Cavalli G, Paro R. Chromo-domain proteins: linking chromatin structure to epigenetic regulation // Curr. Opin. Cell. Biol. 1998. V.10. P.354-60.

40. Chung Y.T. and Keller E.B. Regulatory elements mediating transcription from the Drosophila melanogaster Actin 5C proximal promoter // Molecular and Cellular Biology. 1990. V.10(l). P.206-16.

41. Clement J.Q., Qian L., Kaplinsky N. and Wilkinson M.F. The stability and fate of a spliced intron from vertebrate cells // RNA. 1999. V.5. P.206-220.

42. Clement J.Q., Maiti S. and Wilkinson M.F. Localization and stability of introns spliced from the Pem homeobox gene // Journal of biological chemistry. 2001. V.276. P.16919-16930.

43. Coghlan A., Wolfe K.H. Origins of recently gained introns in Caenorhabditis // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2004. V.101(31). P.l 1362-7.

44. Corbin Y., Maniatis T. Role of transcriptional interference in the Drosophila melanogaster Adh promoter switch //Nature. 1989. V.337(6204). P.279-82.

45. Corbin V. and Maniatis T. Identification of cis-regulatory elements required for larval expression of the Drosophila melanogaster alcohol dehydrogenase gene // Genetics. 1990. V.124. P. 637-646.

46. Dermitzakis E.T., Clark A.G. Evolution of transcription factor binding sites in Mammalian gene regulatory regions: conservation and turnover // Mol.Biol.Evol. 2002. V.19(7). P.l 114-21.

47. Deuring R., Fanti L., Armstrong J.A., Sarte M., Papoulas O., et al. The ISWI chromatin-remodeling protein is required for gene expression and the maintenance of higher order chromatin structure in vivo // Mol. Cell. 2000. V. 5. P.355-365.

48. Deutsch M, Long M. Intron-exon structures of eukaryotic model organisms // Nucleic Acids Research. 1999. V.27(15). P.3219-28.

49. Dorn R., Reuter G. and Loewendorf A. Transgene analysis proves mRNA trans-splicing at the complex mod(mdg4) locus in Drosophila // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2001. V.98. P.9724-9729.

50. Dynlacht B.D., Flores O., Lees J.A., Harlow E. Differential regulation of E2F transactivation by cyclin/cdk2 complexes // Genes & development. 1994. V.8(15). P.1772-86.

51. Espinas M.L., Canudas S., Fanti L., Pimpinelli S., Casanova J.5 Azorin F. The GAGA factor of Drosophila interacts with SAP 18, a Sin3-associated polypeptide // EMBO Reports. 2000. V.l. P.253-259.

52. Farkas F., Gausz J., Galloni M., Reuter G., Gyurkovics H., Karch F. The Trithorax-like gene encodes the Drosophila GAGA factor //Nature. 1994. V.371. P.806.

53. Farkas G., Leibovitch В., Elgin S. Chromatin organization and transcriptional control of gene expression in Drosophila II Gene. 2000, V 253, P.117-136

54. Fink G.R. Pseudogenes in yeast? // Cell. 1987. V.49(l). P.5-6.

55. Fedorova L. and Fedorov A. Introns in gene evolution // Genetica. 2003. V.l 18. P.123-131.

56. Felsenfeld G., Groudine M. Controlling the double helix // Nature. 2003. V,421(6921). P.448-53.

57. Gerasimova T.I., Gdula D.A., Gerasimov D.V., Simonova O., Corces V.G. A Drosophila protein that imparts directionality on a chromatin insulator is an enhancer of position-effect variegation // Cell. 1995. V.82(4). P.587-97.

58. Gerasimova Т., Corces V. Polycomb and trithorax group protein mediate the function of chromatin insulator// Cell. 1998. V.92. P.511-521.

59. Geyer P.K., Corces V.G. Separate regulatory elements are responsible for the complex pattern of tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus in Drosophila melanogaster II Genes & development. 1987. V.l(9). P.996-1004.

60. Gilbert W. Why genes in pieces? II Nature. 1978. V. 271(5645). P.501.

61. Gildea J.J., Lopez R., Shearn A. A screen for new trithorax group genes identified little imaginal discs, the Drosophila melanogaster homologue of human retinoblastoma binding protein 2 // Genetics. 2000. V.156. P.645-663.

62. Gilmour D.S., Thomas G.H., Elgin S.C. Drosophila nuclear proteins bind to regions of alternating С and T residues in gene promoters // Science. 1989. V.245(4925). P.1487-90.

63. Gindhart J.G.Jr, King A.N., Kaufman T.C. Characterization of the cis-regulatory region of the Drosophila homeotic gene Sex combs reduced II Genetics. 1995. V. 139(2). P.781-95.

64. Glaser R.L., Thomas G.H., Siegfried E., Elgin S.C., Lis J.T. Optimal heat-induced expression of the Drosophila hsp26 gene requires a promoter sequence containing (CT)n(GA)n repeats II Journal of molecular biology. 1990. V. 211(4). P.751-61.

65. Gorman M.J., Kaufman T.C. Genetic analysis of embryonic cis-acting regulatory elements of the Drosophila homeotic gene Sex combs reduced I I Genetics. 1995. V. 140(2). P.557-72.

66. Granok H., Leibovitch B.A., Shaffer C.D., Elgin S.C.R Chromatin. Ga-ga over GAGA factor// Curr. Biol. 1995. V.5. P.238-241.

67. Granok H., Leibovitch B.A., Elgin S.C. A heat-shock-activated cDNA encoding GAGA factor rescues some lethal mutations in the Drosophila melanogaster Trithorax-like gene // Genet Res. 2001. V. 78(1). P.13-21.

68. Greenberg A.J. and Schedl P. GAGA factor isoforms have distinct but overlapping functions in vivo // Molecular and cellular biology. 2001. V.21. P. 8565-8574.

69. Greenberg A.J. Yanowitz J.L. and Schedl P. The Drosophila GAGA factor is required for dosage compensation in males and for formation of the male-specific-lethal complex chromatin entry site at 12DE // Genetics. 2004. V.166. P. 279-289.

70. Griffin C., Kleinjan D.A., Doe В., van Heyningen V. New 3' elements control Рахб expression in the developing pretectum, neural retina and olfactory region // Mech Dev. 2002. V.112. P.89-100.

71. Gurcovich II., Gausz J., Kummer J., Karch F. A new homeotic mutation in the Drosophila bithorax complex removes a boundary separating two domains of regulation // The EMBO Journal 1990, V.9. P.2579-2585.

72. Haerry Т.Е., Gehring W.J. A conserved cluster of homeodomain binding sites in the mouse Hoxa-4 intron functions in Drosophila embryos as an enhancer that is directly regulated by Ultrabithorax//Developmental biology. 1997. V.186. P. 1-15.

73. Hagstrom K., Muller M. and Schedl P. A Polycomb and GAGA dependent silencer adjoins the Fab-7 boundary in the Drosophila bithorax complex // Genetics. 1997. V.146. P.1365-1380.

74. Hare M.P., Palumbi S.R. High intron sequence conservation across three mammalian orders suggests functional constraints // Mol Biol Evol. 2003. V.20. P.969-78.

75. Hartl D.L. and Lozovskaya E.R. Genome evolution: between the nucleosome and the chromosome // EXS. 1994. V.69. P.579-592.

76. Haugen P., Simon DM, Bhattacharya D. The natural history of group I introns // Trends in genetics. 2005. V.21. P.l 11-9.

77. Hodgson J.W., Argiropoulos В., Brock H.W. Site-specific recognition of a 70-base-pair element containing d(GA)(n) repeats mediates bithoraxoid Polycomb group response element-dependent silencing // Mol.Cell.Biol. 2001. V. 21. P.4528-4543.

78. Horabin J. and P.Schedl. Splicing of the Drosophila Sex-lethal early transcripts involves exon skipping that is independent of Sex-lethal protein // RNA. 1996. V.2. P.l-10.

79. Horard В., Tatout C., Poux S., Pirrotta V. Structure of a Polycomb response element and in vitro binding of Polycomb group complexes containing GAGA factor //Mol.Cell.Biol. 2000. V.20. P.3187-3197.

80. Howe K.J., Ares M.Jr. Intron self-complementarity enforces exon inclusion in a yeast pre-mRNA // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1997. V.94. P. 12467-72.

81. Huang D.H., Chang Y.L., Yang C.C., Pan I.C., King B. Pipsqueak encodes a factor essentional for sequence-specific targeting of a Polycomb group protein complex // Mol. Cell.Biol. 2002. V.22. P.6261-6171.

82. Hunter C.P. Gene silencing: shrinking the black box of RNAi. Gene silencing: shrinking the black box of RNAi // Curr Biol. 2000. V.10. R137-40.

83. Hural J.A., Kwan M., Henkel G., Hock M.B., Brown M.A. An intron transcriptional enhancer element regulates IL-4 gene locus accessibility in mast cells //Journal of Immunology. 2000. V.165. P.3239-3249.

84. Jackson A.L. and Linsley P.S. Noise amidst the silence: off-target effects of siRNAs? // Trends in Genetics. 2004. V.20. N.l 1. P.521-524.

85. Jami M.S., Hemati S., Salehi Z., Tavassoli M. Association between the length of a CA dinucleotide repeat in the EGFR and risk of breast cancer // Cancer Invest. 2008. V.26(4). P.434-7.

86. Jareborg N., Birney E., Durbin R. Comparative analysis of noncoding regions of 77 orthologous mouse and human gene pairs // Genome Res. 1999. V.9(9). P.815-24.

87. Jeffares D.C., Mourier Т., Penny D. The biology of intron gain and loss // Trends in Genetics. 2006. V.22. N.l. P. 16-22.

88. Jimenez-Garci'a E., Vaquero A., Espinas M.L., Soliva R., Orozco M., Bernues J., Azorin F. The GAGA factor of Drosophila binds triple-stranded DNA // J Biol Chem. 1998. V.273(38). P.24640-8.

89. Kapoun A.M, Kaufman T.C. Regulatory regions of the homeotic gene proboscipedia are sensitive to chromosomal pairing // Genetics. 1995. V.140. P.643-58.

90. Karch F., Galloni M., Sipos L., Gausz J., Gyurkovics H., Schedl P. Мер and Fab-7: molecular analysis of putative boundaries of c/s-regulatory domains in the bithorax complex of Drosophila melanogaster 11 Nucleic Acids Research. 1994, V.22. P.3138-46.

91. Katsani K.R., Hajibagheri M.A., Verrijzer C.P. Co-operative DNA binding by GAGA transcription factor requires the conserved BTB/POZ domain and reorganizes promoter topology // The EMBO journal. 1999. V.8(3). P. 698-708.

92. Kawasaki Т., Okumura S., Kishimoto N., Shimada H., Ichikawa H. RNA maturation of the rice SPK gene may involve /гаш'-splicing // Plant J. 1999. V.18. P.625-632.

93. Kelley R.L., Meller P.R., Gordadze G., et al. Epigenetic spreading of the Drosophila dosage compensation complex from roX RNA genes into flanking chromatin // Cell. 1999. V.98. V.513-522.

94. Kelley R.L. and Kuroda M.I. The role of chromosomal RNAs in marking the X for dosage compensation // Curr.Opin.Genet.Dev. 2000. V.10. P.555-561.

95. Keightley P.D., Gaffney D.J. Functional constraints and frequency of deleterious mutations in noncoding DNA of rodents // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2003. V.100. N.23. P.13402-6.

96. Keplinger B.L., Guo X., Quine J., Feng Y., Cavener D.R. Complex Mahmoudi Т., Katsani K., Verrijzer P. GAGA can mediate enhancer funtion in trans by linking two separate DNA molecules // The EMBO Journal. 2002. V.21. N.7. P. 1775-1781.

97. Kerrigan L.A, Croston G.E., Lira L.M., Kadonaga J.T. Sequence-specific transcriptional antirepression of the Drosophila Kriippel gene by the GAGA factor // J Biol Chem. 1991. V.266. P.574-82.

98. Kleinjan D.A., van Heyningen V. Long-range control of gene expression: emerging mechanisms and disruption in disease // Am J Hum Genet. 2005. V.76. N.l.P.8-32.

99. Kleinjan D.A., Seawright A., Childs A.J. and van Heyningen V. Conserved elements in Рахб intron 7 involved in (auto)regulation and alternative transcription // Developmental biology. 2004. V.265. P .462-477.

100. Kikuchi M., Miki Т., Kumagai Т., Fukuda Т., Kamiyama R., Miyasaka N. and Hirosawa S. Identification of negative regulatory regions within the first exon and intron of the BCL6 gene // Oncogene. 2000. V.19. P.4941- 4945.

101. Koop B.F., Hood L. Striking sequence similarity over almost 100 kilobases of human and mouse T-cell receptor DNA // Nat Genet. 1994. V.7(l). P.48-53.

102. Kosoy A., Pagans S., Espinas M.L., Azorin F., Bernues J. GAGA factor down-regulates its own promoter. GAGA factor down-regulates its own promoter // J Biol Chem. 2002. V.277(44). P.42280-8.

103. Kremser Т., Hasenpusch-Theil K., Wagner E., Buttgereit D., Renkawits-Pohl R Expression of beta3 tubulin gene in visceral mesoderm of Drosophila is dependent on complex enchancer that binds Tinman and UBX // Mol Gen Genet. 1999, V.262. P.643-58.

104. Krichevsky A.M., King K.S., Donahue C.P., Khrapko K., Kosik K.S. A microRNA array reveals extensive regulation of microRNAs during brain development//RNA. 2003. V.9(10). P.1274-81.

105. Lagos-Quintana M., Rauhut R., Meyer J., Borkhardt A. and Tuschl T. New microRNAs from mouse and human // RNA. 2003, V.9. P. 175-179.

106. Lai E.C., Wiel C., Rubin G.M. Complementary miRNA pairs suggest a regulatory role for miRNA:miRNA duplexes // RNA 2004. V.10(2). P.171-5.

107. Lambowitz A.M. and Zimmerly S. Mobile group II introns // Annu Rev Genet. 2004. V.38. P.l-35.

108. Lauderdale J.D., Stein A. Introns of the chicken ovalbumine gene promote nucleosome alignment in vitro // Nucleic Acids Research. 1992, V.20. P.6589-6596.

109. Lee H., Kraus K.W., Wolfner M.F., Lis J.T. DNA sequence requirements for generating paused polymerase at the start of hsp70 // Genes & development. 1992. V.6. N.2. P.284-95.

110. Lehmann M., Siegmund Т., Lintermann K.G., Korge G. The Pipsqueak protein of Drosophila melanogaster binds to GAGA sequence through a novel DNA-binding domain//J. Biol. Chem. 1998. V.273. P.28504-28509.

111. Levy S., Hannenhalli S., Workman C. Enrichment of regulatory signals in conserved non-coding genomic sequence // Bioinformatics. 2001. V.l7. N.10. P.871-7.

112. Lim L.P., Lau N.C., Garrett-Engele P., Grimson A., Schelter J.M., Castle J., Bartel D.P., Linsley P.S., Johnson J.M. Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs // Nature. 2005. V.433. N.7027. P.769-73.

113. Lis J., Wu C. Promoter potentiationand activation: chromatin structure and transcriptional induction of heat shock genes // In: Elgin, S.C.R. (Ed.), Chromatin Structure and Gene Expression. 1995. IRL Press. Oxford. P.71-88.

114. Liu K., Sandgren E.P., Palmiter R.D., Stein A. Rat growth hormone gene introns stimulate nucleosome alignment in vitro and in transgenic mice //

115. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1995. V.92.N.17. P.7724-8.

116. Liu C.G., Calin G.A., Meloon В., Gamliel N. An oligonucleotide microchip for genome-wide microRNA profiling in human and mouse tissues // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2004. V.101. N.26. P.9740-4.

117. Logsdon J.M. Jr. The recent origins of spliceosomal introns revisited // Curr. Opin. Genet. Dev. 1998. V.8. P.637-48.

118. Lopez A.J. Alternative splicing of pre-mRNA: developmental consequences and mechanisms of regulation // Annu Rev Genet. 1998. V.32. P.279-305.

119. Lu Q., Wallrath L.L., Granok H„ Elgin S.C.R. (CT)n (GA)n repeats and heat shock elements have distinct roles in chromatin structure and transcriptional activation of the Drosophila hsp26 gene // Mol. Cell. Biol.1993. V.13. P.2802-2814.

120. Mahmoudi Т., Katsani K., Verrijzer C.P. GAGA can mediate enhancer function in trans by linking two separate DNA molecules // The EMBO Journal. 2002. V.21. N.7. P.1775-1781.

121. Makunin I.V., Volkova E.I., Belyaeva E.S. et al. The Drosophila Supressor of underreplication protein binds to late-replicating regions of polytene chromosomes // Genetics. 2002. V.160. P.1023-1034.

122. Majewski J., Ott J. Distribution and characterization of regulatory elements in the human genome // Genome Research. 2002. V.12. N.12. P. 1827-36.

123. Majumder P. and Cai H.N. The functional analysis of insulator interactions in the Drosophila embryo // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2003. V.100. P.5223-5228.

124. Maniatis Т., Sambrook J., Fritsch E.F. Molecular cloning (a laboratory manual) 1989.

125. Mattick JS. Introns: evolution and function // Curr Opin Genet Dev. 1994. V.4. N.6. P.823-31.

126. Mattick S.J. and Gagen M.J. The evolution of controlled multitasked gene networks: the role of introns and other noncoding RNAs in the development of complex organisms // Mol. Biol. Evol. 2001. V.l8. N.9. P.1611-1630

127. Mattick J.S. RNA regulation: a new genetics? // Nature reviews. Genetics. 2004. V.5. P.316-323.

128. Mattick J.S and Makunin I.V. Small regulatory RNAs in mammals // Human molecular Genetics. 2005. V.14. R121-R132.

129. Mattick J.S. and Makunin I.V. Non-coding RNA // Hum Mol Genet. 2006. V.l5. Spec N.l. R17-29.

130. Meisler M.H. Insertional mutation of 'classical' and novel genes in transgenic mice. Insertional mutation of 'classical' and novel genes in transgenic mice // Trends Genet. 1992. V.8. N.10. P.341-4.

131. Meller V.H., Gordadze P.R., Park Y., Chu X., Stuckenholz C., Kelley R.L., Kuroda M.I. Ordered assembly of roX RNAs into MSL complexes on the dosage-compensated X chromosome in Drosophila II Curr.Biol. 2000. V.10. P.136-143.

132. Mihaly J., Hogga I., Barges S. et al. Chromatin domain boundaries in the Bithorax complex // Cell.Mol.Life Sci. 1998. V.54. P.60-70.

133. Mishra К., Chopra V.S., Srinivasan A., Mishra R.K. 7V/-GAGA directly interacts with lola like and both are part of the repressive complex of Polycomb group of genes //Mech. Dev. 2003. V.120. P.681-689.

134. Morishita M., Kishino Т., Furukawa K., Yonekura A., Miyazaki Y., Kanematsu Т., Yamashita S.5 Tsukazaki T. A 30-base-pair element in the first intron of SOX9 acts as an enhancer in ATDC5 // Biochem Biophys Res Commun. 2001. V.288. N.2. P.347-55.

135. Mourier Т., Jeffares D.C. Eukaryotic intron loss // Science. 2003. V.300. N.5624. P.1393.

136. Mulholland N.M., King I.F., Kingston R.E. Regulation of Polycomb group complexes by the sequence-specific DNA binding proteins Zeste and GAGA // Genes Dev. 2003. V.17. N.22. P.2741-6.

137. Muller M., Hagstrom K., Gyurkovics H., Pirotta V., Schedl P. The mcp element from the Drosophila melanogaster bithorax complex mediates long-distance regulatory interactions // Genetics. 1999. V.153. P.1333-1356.

138. Muravyova E., Golovnin A., Gracheva E., Parshikov A., Belenkaya Т., Pirrotta V., Georgiev P. Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators // Science. 2001. V.291. N.5503. P.495-8.

139. Nadal-Ginard B. Muscle cell differentiation and alternative splicing // Curr Opin Cell Biol. 1990. V.2. N.6. P.1058-64.

140. Neugebauer K.M. On the importance of being, co-transcriptional // J Cell Sci. 2002. V.115(Pt 20). P.3865-71.

141. Nielsen C.B, Friedman В., Birren В., Burge C.B., Galagan J.E. Nielsen C.B., Friedman В., Birren В., Burge C.B., Galagan J.E. Patterns of intron gain and loss in fungi //PLoS Biol. 2004. V.2. N.12. e422.

142. Nilsen T.W. Evolutionary origin of SL-addition transsplicing: still an enigma // Trends Genet. 2001. V.17. P.678-680.

143. Nobrega M.A., Ovcharenko I., Afzal V., Rubin E.M. Scanning human gene deserts for long-range enhancers // Science. 2003. V.302. N.5644. P.413.

144. O'Brien Т., Wilkins R.C., Giardina C. and Lis T.J. Distribution of GAGA protein on Drosophila genes in vitro II Genes and Development. 1995. V.9. P. 1098-1110.

145. O'Donnell K.H., Chen C.T., Wensink P.C. Insulating DNA directs ubiquitous transcription of the Drosophila melanogaster alpha 1-tubulin gene // Mol Cell Biol. 1994. V.14.N.9. P.6398-408.

146. O'Donnell K.H., Wensink P.C. GAGA factor and TBF1 bind DNA elements that direct ubiquitous transcription of the Drosophila alpha 1-tubulin gene // Nucleic Acids Research. 1994. V.22. N.22. P.4712-8.

147. Ohtsuki S. and Levin M. GAGA mediates the enhancer blocking activity of the eve promoter in the Drosophila embryo // Genes & development. 1998. V.12. P.3325-3330.

148. Ohtsuki S., Levine M. and Cai H.N. Different core promoters possess distinct regulatore activities in the Drosophila embryo // Genes & Development. 1997. V.12. P.547-556.

149. Omichinski J.G., Pedone P.V., Felsenfeld G., Gronenborn A.M., Clore G.M. The solution structure of a specific GAGA factor-DNA complex reveals a modular binding mode//Nat Struct Biol. 1997. V.4.N.2. P. 122-32.

150. Orphanides G., LeRoy G, Chang CH, Luse DS, Reinberg D. FACT, a factor that facilitates transcript elongation through nucleosomes // Cell. 1998. V.92. P. 105-116.

151. Pagans S., Ortiz-Lombardia M., Espinas M.L., Bernues J., Azorin F. The Drosophila transcription factor tramtrack (TTK) interacts with Trithorax-like (GAGA) and represses GAGA-mediated activation // Nucleic Acids Research. 2002. V.30, N20. P.4406-4413.

152. Pang K.C., Frith M.C., Mattick J.S. Rapid evolution of noncoding RNAs: lack of conservation does not mean lack of function // Trends Genet. 2006. V.22. N.l. P.l-5.

153. Palmer J.D., Logsdon J.M. Jr. The recent origins of introns // Curr Opin Genet Dev. 1991. V.l. N.4. P.470-7.

154. Parch J. Selective Constraints on intron evolution in Drosophila // Genetics. 2003. V.165. N.4. P.1843-51.

155. Paro R., Strutt H., Cavalli G. Heritable chromatin states induced by the Polycomb and trithorax group genes //Novartis Found Symp. 1998. V.214. P.51-61.

156. Pasquinelli A.E, Reinhart B.J, Slack F. et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA // Nature. 2000. V.408. N.6808. P.86-9.

157. Pfeiffer B.D., Jenett A., Hammonds A.S., Ngo T.T., Misra S., Murphy C., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2008. V.105. N.28. P.9715-9720.

158. Pile L.A., Cartwright I.L. GAGA factor-dependent transcription and establishment of DNase hypersensitivity are independent and unrelated events in vivo // J Biol Chem. 2000. V.275. N.2. P. 1398-404.

159. Platero J.S., Csink A.K., Quintanilla A., Henikoff S. Changes in chromosomal localization of heterochromatin-binding proteins during the cell cycle in Drosophila // J. Cell Biol. 1998. V.140. P.1297-1306.

160. Preker P.J, Guthrie C. Autoregulation of the mRNA export factor Yralp requires inefficient splicing of its pre-mRNA // RNA. 2006. V.12. N.6. P.994-1006.

161. Preston C.R. and Engels, W.R. P-Element-induced male recombination and gene conversion in Drosophila И Genetics. 1996A. V.144. P1611-1622.

162. Preston C.R., Sved J.A., Engels W.R. Flanking duplications and deletions associated with P-induced male recombination in Drosophila II Genetics. 1996B. V.l44(4). P. 1623-38.

163. Raff J.W., Kellum R., Alberts B. The Drosophila GAGA transcriptional factor is associated with specific regions of heterochromatin throughout the cell cycle I I The EMBO Journal. 1994. V.13. P.5977-5983.

164. Read D., Nishigaki Т., Manley J.L. The Drosophila even-skipped promoter is transcribed in a stage-specific manner in vitro and contains multiple, overlapping factor-binding sites // Mol Cell Biol. 1990. V.10. N.8. P.4334-44.

165. Read D.R., et al. Functional studies of the BTB domain in the Drosophila GAGA and Mod(mdg4) proteins 11NAR, 2000, V.28. N.20. P.3863-3871.

166. Reinhart B.J., Slack F.J., Basson M., Pasquinelli A.E., Bettinger J.C., Rougvie A.E., Horvitz H.R., Ruvkun G. The 21-nucleotide let-7 RNA regulatesdevelopmental timing in Caenorhabditis elegans // Nature. 2000, V.403. N.6772. P.901-6.

167. Rodriguez A., Griffiths-Jones S., Ashurst J.L., Bradley A., Rodriguez A., Griffiths-Jones S., Ashurst J.L., Bradley A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units // Genome Research. 2004. У.14. N.10A. P. 190210.

168. Rogozin I.B., Lyons-Weiler J., Koonin E.V. Intron sliding in conserved gene families // Trends Genet. 2000. V. 16. P. 430-432.

169. Rogozin I.B., Wolf Y.I., Sorokin A.V., Mirkin B.G., Koonin E.V. Remarkable interkingdom conservation of intron positions and massive, lineage-specific intron loss and gain in eukaryotic evolution // Curr. Biol. 2003. V.13. P.1512-1517.

170. Rose AB. Intron-mediated regulation of gene expression // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2008. V.326. P.277-90.

171. Roxstrom-Lindquist K., Lindstrom-Dinnetz I., Olesen J., Engstrom Y., Faye I. An intron enhancer activates the immunoglobulin-related Hemolin gene in Hyalophora cecropia // Insect Mol Biol. 2002. V.l 1. N.5. P.505-15.

172. Roy S.W.,' Gilbert W. The evolution of spliceosomal introns: patterns, puzzles and progress //Nature Reviews. Genetics. 2006. V.7. N.3. P.211-21.

173. Rusch D.B., Kaufman T.C. Regulation of proboscipedia in Drosophila by homeotic selector genes // Genetics. 2000. V.l56. N.l. P. 183-94.

174. Russo C.A., Takezaki N. and Nei M. Molecular phylogeny and divergence times of drosophilid species //Mol. Biol. Evol. 1995. V.l2. P.391-404.

175. Salvaing J., Lopez A., Boivin A., et al. The Drosophila Corto protein interacts with Polycomb-group proteins and the GAGA factor // Nucleic Acids Research. 2003. V.31. N.l 1. P.2873-2882.

176. Satyamoorthy K., Samulewicz S.J., Thornburg L.D., Basu A. and Howe Ch.C. Identification of an intronic enhancer that nullifies upstream repression of SPARC gene expression // Nucleic Acids Research. 1997. V.25. N.15. P.3169-3174.

177. Schimojima Т., Okada M., Nakayama Т., Ueda H., Okawa К., Iwamatsu A., Handa H., Hirose S. Drosophila FACT contributes to Hox gene expression through phisical and functional interactions with GAGA factor // Genes Dev. 2003. V.l7. P.1605- 1616.

178. Schmucker D., J., Clemens J. S., Worby C., Xiao J., Muda M., Dixon J., Zipursky L. Drosophila Dscam is an axon guidance receptor exhibiting extraordinary molecular diversity // Cell. 2000. V.l01. P.671-684.

179. Schug J., Overton G.C. TESS: Transcription element search software on the WWW // Technical report CBIL-TR-1997-100 l-v0.0, of the Computational Biology and Informatics Laboratory, School of Medicine, University of Pensilvania. 1997.

180. Schweinsberg S., Hagstrom K, Gohl D, Schedl P, Kumar RP, Mishra R, Karch F. The enhancer-blocking activity of the Fab-7 boundary from the Drosophila Bithorax complex requires GAGA-factor-binding sites // Genetics. 2004. V.168. P.1371-1384.

181. Schwendemann A. and Lehmann M. Pipsqueak and GAGA factor act in concert as partners at homeotic and many other loci // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2002. V.99. V. 12883-12888.

182. Scohy S., Gabant P., Szpirer C., Szpirer J. Identification of an enhahcer and an alternative promoter in the first intron of the alpha-fetoprotein gene // Nucleic Acids Research. 2000. V.28. N.19. P.3743-51.

183. Scott K.C., Taubman A.D., Geyer P.K. Enhancer blocking by the Drosophila gypsy insulator depends upon insulator anatomy and enhanccr strength // Genetics. 1999. V.153. N.2. P.787-98.

184. Sekelsky J.J., McKim K.S., Messina L., et al. Identification of novel Drosophila meiotic genes recovered in a P-element screen // Genetics. 1999. V.l52(2). P.529-42.

185. Shabalina S.A., Kondrashov A.S. Pattern of selective constraint in C. elegans and C. briggsae genomes 11 Genet. Res. 1999. V.l A. N.l. P.23-30.

186. Shelton D.A., Stegman L., Hardison R., Miller W., Bock J.H., Slightom J.L., Goodman M., Gumucio D.L. Phylogenetic footprinting of hypersensitive site 3 of the beta-globin locus control region // Blood. 1997. V.89. N.9. P.3457-69.

187. Sheveleva E.V., Hallick R.B. Recent horizontal intron transfer to a chloroplast genome //Nucleic Acids Research. 2004. V.32. N.2. P.803-10.

188. Smale S.T., Kadonaga J.T. The RNA polymerase II core promoter // Annu Rev Biochem. 2003. V.72. P.449-479.

189. Soeller W.C., Poole S.J., Kornberg T. In vitro transcription of the Drosophila engrailed gene // Genes & development. 1988. V.2. N.l. P.68-81.

190. Soeller W.C., Oh C.E., Kornberg T.B. Isolation of cDNAs encoding the Drosophila GAGA transcription factor // Mol. Cell. Biol. 1993. V.13. P.7961-7970.

191. Spana C., Harrison D.A. & Corces V.G. The Drosophila melanogaster suppressor of Hairy-wing protein binds to specific sequences of the gypsy retrotransposon // Genes Dev. 1988. V.2. P.1414-1423.

192. Strutt H., Paro R. The Polycomb group protein complex of Drosophila melanogaster has different compositions at different target genes // Mol. Cell. Biol. 1997. V.17.N.12. P.6773-83.

193. Strutt H., Cavalli G. and Paro. Co-localization of Polycomb protein and GAGA factor on regulatory elements responsible for the maintenance of homeotic gene expression // The EMBO Journal. 1997. V.16. P.3621-3632.

194. Sverdlov A.V., Babenko V.N, Rogozin I.B, Koonin E.V. Preferential loss and gain of introns in 3' portions of genes suggests a reverse-transcription mechanism of intron insertion // Gene. 2004. V.338. N.l. P.85-91.

195. Swinburne I.A., Miguez D.G., Landgraf D., Silver P.A. Intron length increases oscillatory periods of gene expression in animal cells // Genes & development. 2008. V.22. P.2342-2346.

196. Takahara Т., Kanazu S.I., Yanagisawa S., Akanuma H. Heterogeneous Spl mRNAs in human HepG2 cells include a product of homotypic trans-splicing // J. Biol. Chem. 2000. V.275. P.38067-38072.

197. Tee M.K., Babalola G.O., Aza-Blanc P. et al. A promoter within intron 35 of the human C4A gene initiates abundant adrenal-specific transcription of a 1 kb RNA: location"of a cryptic CYP21 promoter element // Hum.Mol.Genet. 1995. V.4. N.l 1. P.2109-16.

198. Thomas J.W., Touchman J.W., Blakesley R.W., et al. Comparative analyses of multi-species sequences from targeted genomic regions // Nature. 2003. V.424. N.6950. P.788-93.

199. Tsukiyama Т., Becker P.B., Wu C. ATP-dependent nucleosome disruption at a heat-shock promotor mediated by binding of GAGA transcription factor // Nature. 1994. V.367. P.525-532.

200. Vaquero A,, Espina M., Azorn F., Bernue J. Functional Mapping of the GAGA factor assigns its transcriptional activity to the C-terminal glutamine-rich domain // JBC 2000. V.275. P.19461-19468.

201. Venter J.C., Adams M.D., Myers E.W., Li P.W., et al. The sequence of the human genome // Science. 2001. V.291. N.5507. P. 1304-51.

202. Vinogradov A.E. Noncoding DNA, isochores and gene expression: nucleosome formation potential //Nucleic Acids Research. 2005. V.33. N.2. P.559.

203. Wall G., Varga-Weisz P.D., Sandaltzopoulos R., Becker P.B. Chromatin remodeling by GAGA factor and heat shock factor at the hypersensitive Drosophila hsp26 promoter in vitro // The EMBO Journal. 1995. V.14. V.8. P.1727-36.

204. Wasserman W.W., Palumbo M., Thompson W., Fickett J.W., Lawrence C.E. Human-mouse genome comparisons to locate regulatory sites // Nat Genet. 2000. V.26. N.2. P.225-8.

205. West A.G., Gaszner M. and Felsenfeld G. Insulators: many functions, many mechanisms // Genes.Dev. 2002. V.16. P.271-288.39 1!

206. Wilkins R.C., Lis J.T. Dynamics of potentiation and activation: GAGA factor and its role in heat shock gene regulation // Nucleic Acids Research. 1997. V.25. P.3963-3968.

207. Wilkins R.C., Lis J.T GAGA factor binding to DNA via a single trinucleotide sequence element // Nucleic Acids Research. 1998. V.26. P.2672-2678.

208. Wilkins R.C., Lis J.T. DNA distortion and multimerization: novel functions of the glutamine-rich domain of GAGA factor // J.Mol.Biol. 1999. V.285. P.515-525.

209. Wittkopp P.J., Vaggaro K. and Carroll S.B. Evolution of yellow gene regulation and pigmentation in Drosophila//Curr.Biol 2002. V.12. P.1547-1556.

210. Xiao H., Sandaltzopoulos R., Wang H.M., Hamiche A., Ranallo R., Lee K.M., Fu D., Wu C. Dual functions of the largest NURF subunit NURF301 in nucleosome sliding and transcription factor interactions // Mol.Cell. 2001. V.8. P.531-543.

211. Yang J., Zimmerly S., Perlman P.S., Lambowitz A.M. Efficient integration of an intron RNA into double-stranded DNA by reverse splicing // Nature. 1996. V.381. N.6580. P.332-5.

212. Youn B-S, Lim Ch.L., Shin M.K., Hill J.M., and Kwon B.S. An intronic silenser of mouse perforin gene//Mol.Cells. 2001. V.13. N.l. P.61-68.

213. Yu J„ Yang Z., Kibukawa M., Paddock M., Passey D.A., Wong G.K. Minimal introns are not "junk" // Genome Research. 2002. V.12. N.8. P. 1185-9.

214. Zhou J., Ashe H., Burks C., Levine M. Characterization of the transvection mediating region of the abdominal-B locus in Drosophila И Development. 1999. V.126. P.3057-3065.

215. Zimmerly S., Huatao G., Perlman P.S and Lambowitz A.M. Group II intron mobility occurs by target DNA-primed reverse transcription // Cell. 1995. Vol. 82. P.545-554.

216. Zuckerkandl E. Sectorial gene repression in the control of development // Gene. 1999. V.238. N.l. P.263-76.

Информация о работе
  • Федорова, Елена Владимировна
  • кандидата биологических наук
  • Новосибирск, 2010
  • ВАК 03.02.07
Диссертация
Получение и анализ мутаций, затрагивающих второй интрон гена Trithorax-like Drosophila melanogaster - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно
Автореферат
Получение и анализ мутаций, затрагивающих второй интрон гена Trithorax-like Drosophila melanogaster - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации
Похожие работы