Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация генов-мишеней транскрипционного фактора GAGA, участвующих в формировании дорзальных выростов хориона яйца Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Идентификация генов-мишеней транскрипционного фактора GAGA, участвующих в формировании дорзальных выростов хориона яйца Drosophila melanogaster"

На правах рукописи

ОМЕЛИНА ЕВГЕНИЯ СЕРГЕЕВНА

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНОВ-МИШЕНЕЙ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА GAGA, УЧАСТВУЮЩИХ В ФОРМИРОВАНИИ ДОРЗАЛЬНЫХ ВЫРОСТОВ ХОРИОНА ЯЙЦА DROSOPHILA MELANOGASTER

03.02.07 - генетика

Автореферат диссертации на соискание степени кандидата биологических наук

1 8 АПР 2013

Новосибирск 2013

005052191

005052191

Работа выполнена в лаборатории механизмов клеточной дифференцировки Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Баричева Элина Михайловна

Официальные оппоненты: Демаков Сергей Анатольевич

доктор биологических наук, заведующий лабораторией хромосомной инженерии, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск.

Федорова Светлана Александровна

кандидат биологических наук, заведующий сектором генетики клеточного цикла, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится «ДЗ» 2013 г. на заседании

диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук в ИЦиГ СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект ак. Лаврентьева, 10, т/ф. (383) 363-49-06, факс (383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН. Автореферат разослан « » (Хлф-С/иЯ- 2о/^ г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

ДНК-связывающий белок GAGA, кодируемый геном Trithorax-like (Tri), требуется для развития многих органов и тканей D. melanogaster. Этот эволюционно-консервативный белок принимает участие в формировании «открытой» конформа-ции хроматина в различных регуляторных элементах, задействованных в регуляции транскрипции (Parkas et al., 2000; Matharu et al., 2010). Данные по локализации белка GAGA на политенных хромосомах (Raff et al, 1994), сравнительный анализ промоторных последовательностей (Arkhipova, 1995; FitzGerald et al, 2006), результаты экспериментов по профилированию хроматина с использованием Darn (van Steensel et al., 2003), а также данные ChIP-chip анализа (Negre et al., 2010) говорят о том, что число генов, регулируемых GAGA-фактором, может быть очень большим. Однако на сегодняшний день к экспериментально доказанным генам-мишеням GAGA-фактора относится небольшое число генов, включая Ultrabithorax (Ubx), fushi-tarazu (ftz) и engrailed (eri). В регуляторных районах этих генов были обнаружены сайты связывания GAGA-фактора (Biggin and Tjian, 1988; Soeller et al., 1988; 1993; Katsani et al., 1999; Mahmoudi et al., 2003: Schweinsberg et al., 2004), a также были проведены эксперименты, доказывающие участие GAGA в регуляции транскрипции этих генов (Topol et al., 1991; Farkas et al., 1994; Bhat et al., 1996; Laney and Biggin, 1996; Orihara et al., 1999; Bejarano and Busturia, 2004: Огиенко и др., 2006).

В данной работе с использованием комбинированного компыотерно-экспе-рименгального подхода был проведен поиск генов, в регуляции экспрессии которых участвует GAGA-фактор. Поиск осуществляли среди генов, контролирующих формирование дорзальных выростов хориона (ДВХ). ДВХ - респираторные фила-менты, расположенные на переднем конце яйца дрозофилы и обеспечивающие дыхание развивающегося эмбриона. Реорганизация эпителиальной ткани в трубчатые структуры (тубулогенез) лежит в основе формирования не только ДВХ, но и таких органов, как сердце, почки, легкие, кишечник, нервная трубка у различных видов животных. Понимание генетических механизмов, контролирующих развитие трубчатых структур, необходимо для выяснения закономерностей формирования и функционирования органов не только в условиях in vivo, но и органов, выращенных искусственных путем (Berg, 2008).

Известно, что формирование ДВХ контролируется большим количеством генов, многие из которых входят в состав важнейших сигнальных путей, участвующих в органогенезе не только дрозофилы, но и позвоночных (Berg, 2008). Участие гена Tri в формировании ДВХ в настоящее время не изучено, однако в данной работе было обнаружено, что при недостатке белка GAGA наблюдаются нарушения этого процесса. Поскольку белок GAGA являйся эволюционно-консерватив-ным (Matharu et al., 2010; Kumar, 2011), результаты данной работы могут быть полезны при исследовании роли GAGA-фактора у млекопитающих, включая человека. Также полученные данные могут послужить основой для понимания генетических процессов, контролирующих формирование органов, в основе которых лежит образование трубчатых структур.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было выявление генов-мишеней транскрипционного фактора GAGA среди генов, участвующих в формировании дорзальных выростов хориона Drosophila melanogaster.

В ходе выполнения данной работы были поставлены следующие задачи:

1. провести анализ ранее доказанных сайтов связывания транскрипционного факто-

ра GAGA для выявления структурных вариантов этих сайтов и создать обучающие выборки для последующего компьютерного распознавания сайтов связывания GAGA-фактора.

2. проверить эффективность предсказания GAGA-сайтов методом задержки ДНК-пробы в геле.

3. проанализировать распределение потенциальных сайтов связывания GAGA-фак-тора в геноме в целом и в различных районах генов дрозофилы.

4. провести поиск потенциальных сайтов связывания GAGA-фактора в регулятор-ных районах генов, играющих ключевую роль в формировании ДВХ.

5. проверить генетическое взаимодействие Tri с генами, участвующими в формиро-

вании ДВХ.

6. с использованием Г1ЦР в реальном времени провести сравнительный анализ относительной экспрессии генов, контролирующих развитие ДВХ, в норме и у 7Н-мугантов.

Научная новизна

В данной работе впервые созданы две качественных выборки (структурные варианты GAGnGAG и GAGnnnGAG) для компьютерного распознавания GAGA-сайтов в последовательностях ДНК. Экспериментально подтверждено связывание с 30-ю новыми сайтами GAGA-фактора. Впервые показано, что мутации гена Tri вызывают нарушение формирования ДВХ и оперкулума яйца дрозофилы. Обнаружено генетическое взаимодействие Tri с gurken, decapentaplegic, Notch, broad, saxophone, thickveins и bunched в развитии ДВХ. Показано, что экспрессия генов gurken и saxophone понижается, а экспрессия гена Notch увеличивается на фоне снижения количества белка GAGA в ходе оогенеза дрозофилы.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные результаты дополняют имеющуюся информацию о сайтах связывания и генах-мишенях транскрипционного фактора GAGA, показывают важность экспрессии гена Tri для нормального формирования ДВХ. На основании результатов, полученных в данной работе, модифицирована генетическая сеть, контролирующая формирование ДВХ. Материалы данной диссертационной работы могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и биоинформатических специальностей.

Положения, выносимые на защиту

1. Белок GAGA участвует в регуляции морфогенеза дорзальных выростов хориона дрозофилы.

2. Гены gurken и saxophone, играющие ключевую роль в формировании дорзальных

выростов хориона, являются генами-мишенями транскрипционного фактора GAGA.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на следующих конференциях: VII Международной конференции по биоинформатике регуляции и структуры геномов и системной биологии (Bioinformatics of Genome Régulation and Structure\Systems Biology — BGRS\SB-2010) (Россия, г. Новосибирск, 2010 г.); III

Международной конференции «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии» (Украина, г. Канев, 2012 г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 6 работ - статьи в отечественной и зарубежной печати (в журналах, входящих в список ВАК).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, а также выводов, списка цитируемой литературы, в который входит 266 ссылок. Работа изложена на 144 страницах печатного текста, содержит 12 таблиц, 36 рисунков и 2 приложения на 9 страницах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена с использованием линий D. melanogaster, описание которых приводится в базе данных FlyBase (www.flybase.org) и в статьях (Огиенко и др., 2006, 2008). Связывание рекомбинантного белка His-GAGA (синтезированного в Е. coli) с олигонуклеотидами, соответствующими участкам ДНК, содержащим предсказанные GAGA-сайты, изучали методом задержки ДНК-пробы в геле. Иммунохимическое окрашивание яичников дрозофилы проводили с использованием первичных моноклональных мышиных антител 1D12 против белка Gurken, С458.2Н против Notch и 25E9.D7 против белка Broad-core, полученных из Developmental Studies Hybridoma Bank (http://dshb.biology.uiowa.edu/). Микроскопический анализ проводился в ЦКП микроскопического анализа биологических объектов ИЦиГ СО РАН на микроскопах Axioscope 2 plus, LSM 510 Meta и LSM 780 ("Zeiss", Германия). Уровень экспрессии генов измеряли с помощью ПЦР в реальном времени. Анализ относительной экспрессии генов проводили в ЦКП функциональной геномики ИЦиГ СО РАН на приборе ABI PRISM® 7000 Sequence Detection System фирмы Applied Biosystems с использованием 7000 System SDS Software, Version 1.2.3.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Поиск сайтов связывания GAGA в последовательностях ДНК D. melanogaster с помощью программного пакета SITECON

В данной работе для выявления потенциальных генов-мишеней транскрипционного фактора GAGA мы проводили поиск сайтов связывания GAGA в регуляторных районах генов, играющих ключевую роль в формировании ДВХ. Наличие сайтов связывания определенного транскрипционного фактора в регуля-торном районе гена свидетельствует о том, что экспрессия данного гена может регулироваться анализируемым транскрипционным фактором. Для выявления GAGA-сайтов в последовательностях ДНК мы использовали программу SITECON (Oshchepkov et al., 2004). Эффективность компьютерных методов распознавания сайтов связывания транскрипционных факторов всегда зависит от качества обучающих выборок, т.е. создание метода распознавания сайтов связывания конкретного транскрипционного фактора это, прежде всего, создание хорошей обучающей выборки. Поэтому для создания обучающих выборок нами были проанализированы литературные данные, в результате чего была собрана выборка экспериментально доказанных GAGA-сайтов, включающая 120 GAGA-сайтов из 18 генов D. melanogaster, связывание с которыми было показано с помощью одного из методов: задержка в геле/ футпринтинг с использованием рекомбинантного/ очищен-

ного белка; задержка в геле с использованием ядерного экстракта и антител к транскрипционному фактору.

Анализ первичной структуры GAGA-сайтов из выборки показал, что, несмотря на очевидное разнообразие, сайты можно разделить на 4 структурных варианта (СВ):

- СВ1 (сайты типа GAGnGAG (12%), их кластеры (6%) GAGnGAGnGAGnGAG);

- СВ2 (сайты типа GAGnnnGAG (21%), их кластеры (14%) GAGnnnGAGnnnGAG);

- СВЗ (сайты (16%), содержащие одиночный мотив GAGAG);

- СВ4 (сайты (31%), соответствующие микросателлитам (GA)n, п=3-9).

Общей чертой всех проанализированных GAGA-сайтов является наличие одного или нескольких гомологов тринуклеотида GAG (не более чем с одной заменой), разделенных спейсерами различной длины. Следовательно, тринуклеотид GAG можно рассматривать как элементарную единицу, которая используется для построения GAGA-сайтов.

Для поиска GAGA-сайтов в последовательностях ДНК были построены две обучающих выборки СВ1 и СВ2. При использовании выборки СВ1 также распознаются сайты СВ4. С использованием созданных выборок мы провели поиск потенциальных GAGA-сайтов в промоторных районах (-4000/ 0 п.н. относительно старта транскрипции) 33-х генов развития (участвующих в оогенезе, в т.ч. в формировании ДВХ и т.д.) D. melanogaster и во втором интроне гена 7>/. В результате в промоторных районах 33-х исследуемых генов было обнаружено 264 потенциальных GAGA-сайта, из которых 124 сайта было найдено с использованием выборки СВ1 и 140 сайтов - с помощью СВ2. Для дальнейшей экспериментальной проверки мы отобрали 36 сайтов, стараясь взять, по меньшей мере, по одному сайту из каждого анализируемого гена и изучить сайты, расположенные на разном расстоянии от старта инициации транскрипции внутри -4000/ 0 п.н. промоторных районов (Рис. 1, Табл. 1). Экспериментальное подтверждение предсказанных сайтов мы проводили с помощью метода задержки ДНК-пробы в геле с использованием рекомбинантного белка His-GAGA.

Экспериментальная проверка связывания сайтов с His-GAGA продемонстрировала высокую эффективность распознавания как в случае использования выборки СВ1, так и СВ2. Связывание наблюдали с 13-ю из 18 сайтов, предсказанных с помощью СВ1 (72.2%), и с 17-ю из 18 сайтов в случае СВ2 (94.4%) (Рис. 1, Табл. 1). Таким образом, использование выборки СВ2 при выбранных параметрах можно расценивать как очень надежный подход для поиска GAGA-сайтов с ошибкой перепредсказания, составляющей только 5%. Надежность применения выборки СВ1 несколько ниже по сравнению с СВ2, однако даже в этом случае почти 3/4 предсказанных сайтов действительно связываются с GAGA-фактором. Вероятно, наблюдаемая разница в эффективности предсказания связана с меньшим размером выборки СВ1 (14 сайтов) по сравнению с СВ2 (25 сайтов). Высокую эффективность предсказания GAGA-сайтов с помощью СВ1 и СВ2 можно объяснить именно разделением обучающих выборок, которое стало следствием анализа и выявления разных структурных вариантов GAGA-сайтов.

Для распознавания GAGA-сайтов такое разделение обучающих выборок было проведено впервые. Ранее сайты GAGA-фактора были проанализированы в работе (Granok et al., 1995), в результате чего в 27 из 48 исследуемых сайтов был определен сайт типа GAGAGAG, который был признан консенсусом. Однако остальные сайты не были классифицированы (Granok et al., 1995). Следует отме-

■5 i?

б. +

? 'S & 3 ее «e 5 или"

ü Sí í

г a S ^

тить, ч то н собранной в данной работе выборке 120-ти экспериментально доказанных сайтов, микросателлит GAGAGAG встречается только в 25% случаев. В работах (Omichinski et al., 1997; van Steensel et al., 2003) в качестве консенсусной последовательности GAGA-сайтов рассматривали мотив GAGAG, который в выборке из

120 GAGА-сайтов составляет всего 16%. .. , „

Рис. 1. Экспериментальная проверка GAGA-сайтов, предсказанных с помощью выборки: (А) СВ1 и (Б) СВ2. ДНК-пробы: (1 и 2) - положительный контроль (Horard et at., 2000); (3) — отрицательный контроль - (TTTG)e; (4-10) -пробы, соответствующие предсказанным сайтам. Связывание с экстрактом Е. coli: (1) бет His-GAGA; (2) содержащим His-GAGA.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

к.

Ч +

§

у УуЫУУ У

ü ЩИНИР ^

234 5678 9 10

Следует отметить, что девять из 33-х генов относятся к потенциальным генам-мишеням в соответствии с (van Steensel et al., 2003), для 17-ти генов мы продемонстрировали связывание Ílis-GAGA с предсказанными в промоторных областях сайтами (Табл. 1). В промоторе 7>/ уже было показано большое количество GAGA-сайтов (Kosoy et al., 2002). Для оставшихся шести генов (Notch, bunched, сир, singed, sickle, broad) связывание с выбранными для экспериментальной проверки сайтами не подтвердилось (Табл. 1), однако в промоторных областях этих генов было предсказано еще как минимум по одному потенциальному GAGA-сайту. Поэтому далее выборки, включающие 33 гена развития и 202 гена из работы (van Steensel et al., 2003), мы рассматриваем как наиболее вероятные гены-мишени GAGA-фактора.

Определение потенциальных GAGA-сайтов в последовательностях ДНК дрозофилы

С использованием выборок СВ1 и СВ2 и программы SITECON мы проанализировали частоту встречаемости потенциальных GAGA-сайтов в среднем по геному (Рис. 2). Кроме того, мы анализировали распределение GAGA-сайтов в регуля-торных районах 12114 генов дрозофилы. В промоторных районах (-500/ 0) этих генов частота встречаемости GAGA-сайтов немного больше (приблизительно в 1.2 раза для обеих выборок) средней плотности сайтов по геному (Рис. 2). В 5'-некоди-рующих районах экзонов этих генов плотность потенциальных GAGA-сайтов больше средней плотности по геному в 1.3 раза для обеих выборок (Рис. 2). В первых интронах 12114 генов плотность GAGA-сайтов сравнима со среднегеномной плотностью для выборок СВ1 и СВ2.

Мы провели поиск потенциальных GAGA-сайтов в промоторных областях, некодирующих районах экзонов, интронах и кодирующих областях экзонов наиболее вероятных генов-мишеней GAGA - 33-х генах развития и 202-х генах из работы (van Steensel et al., 2003). Было обнаружено, что частота потенциальных GAGA-сайтов в промоторных районах (-500/ 0) 33-х генов выше средней плотности сайтов по геному - в i .5 и 2.6 раза для выборок СВ1 и СВ2, соответственно (Рис. 2).

Таблица 1. Потенциальные GAGA-сайты, предсказанные с помощью выборок

СШ и СВ2, и результат!.! их экспериментальной проверки.

№ Ген Позиция/ цепь Уровень конф. сходства Последовательность EMSA

a) GAGA сайты типа GAGnGAG (выборка СВ1)

1 domeless -321/ — 0.882 ttTGTCCGTGTGAGI'GAGAAAGTGACG +

2 mfas -1516/- 0.856 ttCTTACATCGGAGAGAGCTGCACGCT +

3 string -246/- 0.868 t tTAATAATGT GAGArCCACGCAT ТСС +

4 rhino -2448/ + 0.878 t tGCAAAAACCGAGAGACAAAAGCAGG +

5 cut up -1407/- 0.862 t tGGGCTGCGAGAGCGAGAGCGGGAGA +

6 Notch -950/ + 0.876 t tAAAACATTTGAGCGATCTACCAAAA -

7 bunched -1243/- 0.865 t tTCCACTAAGGAGT TCmTATATGTA -

8 grim -74/ + 0.851 t tATTCACTGCGAGAGAGGAACTCGCT +

9 BarHl -307/ + 0.908 t tGAAACCGGGGäGAGACTTTATTTCA +

10 BarH2 -156/+ 0.857 11СAGG T CAAT GAGCGAAAAAGAGACG +

11 12 otu -652/ + 0.867 ttT GAAACAC С GAGAGGAAATAGAAT T +

cup -1349/- 0.854 ttACCTTCGCCGAGTGAIATGACTACT -

13 pUf6S -2602/ + 0.859 t tCTCGGTAGAGAGC rCCAAACTGGAC +

14 psq -133/- 0.859 t tTTTAAAATTGAGTGAGAACTCATTT +

15 combgap -466/- 0.881 11С T GAACAC GGAGAGAAT TCGCTATT +

16 singed -1794/ + 0.874 ttACGGGTCCTGAGCGÄGAAACAGAAG

17 sickle -1780/- 0.881 ttTCAAGACGAGAGTGATGAAAGGATA _

18 reaper -3848/+ 0.908 t tAAGGTAGGAGAGTGAGT TAAT GАСС +

б) GAGA-сайты типа GAGnnnGAG (выборка СВ2)

1 gurken -14/ — 0.840 ttAGGAAAACAGAGC CAGAGAAACAGA +

2 chickadee -995/- 0.775 ttCAGT GCAGG GAGT GGGÄGTGAGAGG +

3 effete -2421/ + 0.792 t tCATGCGAGGGAGGGAGAGAACGAAC +

4 bifl -1528/- 0.858 t fcTTTTTACTAGAGTAAGAGTTCGGCT +

5 biß -1717/+ 0.760 t tTTATGATCCGAGGTGGAGCAGACGA +

6 frayed -125/- 0.822 t tATTTGTAGGGÄGTGAGAGPGTGTTA +

7 thickveins -502/- 0.789 ttCGTGTGATTGAGGTTGAGTTTTTTT +

8 sax -154/+ 0.786 t tCTTTGATGGGAGTTCGAGTTTGACG +

9 slbo -284/- 0.809 t tCCTGTGGATGAGAGCGAGAGCCGCG +

10 brinker -202/- 0.826 t tCAGCAGTGGGAGAGAGAGTGAGAGG +

11 lola -145/- 0.817 t tAGAACAAGT GÄGT G С GAGC GAG AT G +

12 scalloped -67/ + 0.836 t tCTCCATTTC GAGATA GAGATCTTСT +

13 grh -179/+ 0.803 t tTCTCTCGGAGAGCGTGAGCTTAAAG +

¡4 e(y)3 -888/- 0.788 t tCCGTTCAGCGAGTTC TCGCCGACAC +

15 broad -90/- 0.777 ttTCGCAGGCTGÄGGCTGAGACTGAGG _

16 Trll +330/ + 0.801 t tGGAGAACGAGAGAGT GÄGACGTAGA +

17 Trl2 +363/ + 0.819 11G СAGACAGAGAGG GA GAGAGCGAGA +

18 Trl3 + 1905/+ 0.812 t tGAGGACGGAGÄGi'GTGAGCGACGCT +

Примечание: в столбце «Последовательность» курсивом выделены нуклеоти-ды и, добавленные к 5'-концам олигонуклеотидов для мечения (а-Э2Р)-йАТР. Районы, гомологичные мотивам вАСпСАС и САСпппСАС, выделены жирным курсивом. Для поиска сайтов СВ1 мы использовали минимальный уровень конформаци-

0Н1ЮГ0 сходства 0.85, в случае СВ2 - 0.76. На этих порогах ошибки недопредсказания составляют 0.64 н 0.52, ошибки перепредсказания равны 1/2127 и 1/3123 для СВ1 и СВ2, соответственно. Ошибки рассчитывали стандартным способом в соответствии с (Oshchepkov et eil., 2004).

При этом в 5'-некодирующей области экзонов плотность сайтов в 1.9 и 3.1 раза больше относительно средней плотности GAGA-сайтов по геному для СВ1 и СВ2, соответственно. В первом интроне плотность сайтов в 2.2 и 3.2 раза больше средней плотности по геному для СВ1 и СВ2, соответственно. Плотность в кодирующих областях экзонов сравнима со средней плотностью по геному для выборки СВ1 и с плотностью в промоторах этих же генов для СВ2. Плотность сайтов в З'-некодирующих областях экзонов 33-х генов ниже средней плотности по геному в 1.5 и 1.4 раза для выборок СВ1 и СВ2, соответственно (Рис. 2).

А

** Структурный вариант сайтов GAGnGAG

X

с 1,8 ..............................................................3..........................................

о 1,6 ,( 2

s 1,4...........................................................|{

™ 1,2 2 l|¡¡4 ¿J

1 i«3

« 0,6 I

° 0,4 I

£ 0,2 I

о ' ÍB

о О ™

5 Геном 12114 33 гена 202

5 генов гена

I2'5 >

: 2

: 1,5

)

I

: i j

I 0,5

: о

Структурный вариант сайтов GAGnnnGAG

,3

11з

Геном 12114 генов

202 гена

1 ■ промотор

2 « 5'-некодирующая обл. экзонов

за первый интрон

4 й остальные интроны

5 в экзоны

6 З'-некодирующая обл. экзонов

Рис. 2. Плотность потенциальных GAGA-сайтов: (А) типа GAGnGAG и (Б) типа GAGnnnGAG в различных последовательностях ДНК D. melanogaster. Первый столбец обозначает плотность предсказанных сайтов по всему геному, вторая группа столбцов относится к плотности сайтов в различных районах 12114 генов дрозофилы. Третья группа столбцов показывает плотность сайтов в различных последовательностях 33-х генов развития. Четвертая группа обозначает плотность сайтов в последовательностях 202-х генов нз работы (van Steensel et al., 2003).

Частота потенциальных GAGA-сайтов в промоторных районах (-500/0) 202-х генов (van Steensel et al., 2003) в 1.6 раза больше средней плотности сайтов по геному по обеим выборкам. В 5'-некодирующих областях экзонов этих генов частота сайтов в 2 и 2.7 раза выше средней плотности по геному. Первые интроны 202-х генов также обнаружили повышенную плотность GAGA-сайтов по сравнению со средней плотностью по геному (приблизительно в 1.5 раза больше средней плотности по геному для СВ1 и СВ2), хотя и более низкую по сравнению с первыми интронами 33-х генов (Рис. 2).

Таким образом, отличительной особенностью наиболее вероятных генов-мишеней транскрипционного фактора GAGA может являться высокая плотность GAGA-сайтов в 5'-некодирующих районах экзонов. Кроме того, как показано на Рис. 2, высокая плотность GAGA-сайтов может наблюдаться и в первых интронах потенциальных генов-мишеней GAGA-фактора. Такую особенность локализации GAGA-сайтов можно объяснить тем, что GAGA вовлечен не только в инициацию,

но и в элонгацию транскрипции (O'Brien et al., 1995; Shimojima et al., 2003). В пользу этой гипотезы говорит также и то, что сайты связывания GAGA наблюдаются (хоть и с меньшей частотой) и в других районах, расположенных ниже старта транскрипции, - в остальных интронах и кодирующих областях экзонов 33-х исследуемых генов (Рис. 2). Также следует отметить высокую частоту встречаемости GAGA-сайтов по геному дрозофилы. В среднем в геноме один сайт типа GAGnGAG встречается на каждые 1342 п.н., а один сайт типа GAGnnnGAG на каждые 1410 п.н.

Для данной работы особенно важным представляется поиск GAGA-сайтов в генах, играющих ключевую роль в развитии дорзальных выростов хориона (ДВХ) (Рис. 3). В настоящее время известно большое количество генов и сигнальных путей, участвующих в развитии ДВХ. Однако многие гены до сих пор не выявлены. Так, например, ранее не была показана роль гена Tri в формировании ДВХ.

то снижение количества белка GAGA приводит к нарушению формирования ДВХ. Средние значения ДВХ и оперкулума яиц Oregon R составляют, соответственно: 675±41 мкм и 139±21 мкм. У 7>/-мутантов нарушена длина ДВХ, а также их морфология (Рис. 3). ДВХ мутантов Trl362/TrlR8\ укорочены в значительно большей степени (средняя длина ДВХ 445±37 мкм) по сравнению с яйцами, отложенными самками Trle"82/TrlR85 (средняя длина 586±31 мкм), что коррелирует со степенью снижения экспрессии Tri в яичниках этих мутантов. Большинство яиц мутантов также имеют редуцированные оперкулумы (средняя длина 72±18 мкм и 73±10 мкм для

гг. j362 гг iR85 rj, ,еп820 /гг ,R85 _________

Tri /Tri и Tri /Tri , соответственно). В контроле значительных отклонений длины и морфологии ДВХ от нормы не наблюдается. С помощью генетических скрещиваний в геном мутантов Tri362/ТгГ5 и ТгГ82/ТгГ5 был введен транспозон hsp83:GAGA-519, экспрессирующий кДНК гена Tri В результате длина ДВХ увеличилась, морфология ДВХ и оперкулумов нормализовалась. Таким образом, было показано, что GAGA действительно необходим для правильного формирования ДВХ и оперкулумов. Поскольку GAGA является транскрипционным фактором, можно предположить, что среди генов, контролирующих формирование ДВХ, есть гены-мишени GAGA-фактора. Для дальнейшего анализа из вышеописанных 33-х генов развития были отобраны гены, играющие ключевую роль в формировании ДВХ: gurken (grk), decapentaplegic (dpp), saxophone (sax), thickveins (tkv), Notch (N), broad (br) и bunched (bun). С использованием выборок CB1 и CB2 и программы SITECON в промоторных областях, 5'-некодирующих районах экзонов и первых интронах

Участие гена Tri в формировании ДВХ

В данной работе было обнаружено,

Рис. 3. Фенотипы яйцевых оболочек. Яйцо, отложенное: (А) самкой дикого типа. (Б) структура передне-дорзальной стороны яйца дикого типа. (В) яйцо, отложенное самкой Tri362/ ТгГ5 и (Г) самкой ТгГ82/ Tri"81. ДВХ - дорзальные выросты хориона, О - оперкулум, М - микропиле, Н -ножка, JI - лопасть. Масштаб 100 мкм.

выбранных генов были выявлены потенциальные GAGA-сайты, для некоторых сайтов показано связывание с His-GAGA (Табл. 1).

Генетическое взаимодействие Tri с br, bun, dpp, tkv, grk, sax и Notch

В данной работе мы исследовали генетическое взаимодействие Tri с br, bun, dpp, tkv, grk, sax и Notch в процессе развития ДВХ. Для выявления генетического взаимодействия мы проводили измерение 4-х параметров передне-дорзальных структур яйца. В соответствии с (Twombly et al., 1996) мы анализировали длину и морфологию ДВХ, размер оперкулума и размер яйца. Во всех экспериментах по исследованию взаимодействия мы использовали две мутации гена Tri ~ нуль-аллель Tri"85 (Karch et al., 1994) и гипоморфную мутацию Tri362, обусловленную встройкой Р-элемента в 5'-некодирующую область гена Tri и прилегающей к нему делецией размером 97 п.н. Делеция удаляет два первых сайта инициации транскрипции, используемых в яичниках (Огиенко и др., 2006). Во всех экспериментах мы исследовали фенотипы яиц трансгетерозигот и контролей - мух, несущих мутацию только по одному гену.

Oregon R Б br2Bc1/+. Tr,R85/+ ниш» у ^v ьипвво1б*\7ЯЩ+ irp dpp10638/+;Trl362/*

Д / Е ж Hl I 11 aWTflTTTfrrtIUI 111 3

"у

tkv7/*; TrlR85/+ sax4/*; TrlR85/+ ^ ' .......IIIII II ......... 2E12 _ 362 grk /+; Tri /+ Nnd\;TrlR8S/+

Рис. 4. Генетическое взаимодействие Trl с генами: (Б) br; (В) bun; (Г) dpp; (Д) tkv; (Е) sax; (Ж) grk; (3) Notch в процессе формирования ДВХ. А - яйцо самки Oregon R.

Для исследования взаимодействия Tri с геном br (Рис. 4Б) мы использовали гипоморфную мутацию br' (Galceran et al., 1990) и «loss of function, amorphic» аллель br2Bc'' (Bayer et al., 1997). Исследование контролей не выявило достоверных отличий от соответствующих параметров яиц дикого типа (Табл. 2). При этом 432% яиц трансгетерозигот br/+; Tri/л- укорочены, 4-6% яиц демонстрировали уменьшение оперкулума. Среди ДВХ были обнаружены аномальные по форме (519% ДВХ) и укороченные (5-36% ДВХ).

Для исследования взаимодействия Tri с геном bun (Рис. 4В), были использованы гипоморфная мутация Ьипвао'623, обусловленная встройкой транспозона P{GT1} во второй интрон гена (Bellen et al., 2004), и рецессивная деталь bun00255, вызванная инсерцией Р-элемента P{PZ} во второй интрон гена bun (Spradling et al., 1999). Количество наблюдаемых отклонений у гетерозигот Ьип/+ и Trl/+ значительно не отличается от нормы (Табл. 2). 15-26% яиц трансгетерозигот Ьип00255/+; ТН/+ укорочены. В 7-11% яиц, отложенных мухами bun/+; Trl/+, встречается уменьшенный оперкулум. Короткие ДВХ наблюдали в 3-16% яиц анализируемых мутантов (Табл. 2).

Таблица 2. Частота встречаемости нарушений структур яйцевой оболочки

ДВХ, % Оперкулум, % Размер яйца, %

Генотип Дик. типа Укороч.1 Аномал.2 Дик. типа Укороч.3 Дик. типа Короткое4

Oregon Я 96.5 1.5±0.8 2±0.9 100 0 100 0

grk'tu/+; TrtKS5/+ 71.5 11.5±3.4 17±3.9 99 1 83 17±3.7

grk?E,2/+; Trt*62/+ 55 39±3.5 6±2.1 99 1 99 %

grl<i,FJ9/+;Tr^5/+ 84 12.5±3.4 3.5 93 7 91 9±2.8

grk"F4S/+; Trtm/+ 57 38.5±5.5 4.5±2.1 91 9±2.8 91 9±2.8

grk2B6/+; TrfS5/+ 71.5 16.5±3.8 12±3.3 76 24±4.2 77 23±4.2

grh^B6/+; Trf62/+ 42 46.5±5.9 11.5±3.3 77 23±4.2 100 0

dppd,4/+; ТгГ>/+ 78 10±3.08 12±3.3 90 10±3.0 89 11±3.1

dppd,4/+; Trf62/+ 74.5 19±4.1 6.5±2.5 99 il 98 2

dpphr92/+; ТгГ5/+ 83.5 3.5±1.8 13±3.4 97 3 100 0

dpphr"/+; Тг?62/+ 78 12±3.3 10±3.1 97 3 99 1

dpp,063S/+;Tr/"5/+ 80 11.5±3.3 8.5±2.8 93 7±2.5 46 54±4.9

dpp1M38/+;Trt3r'2/+ 78.5 12.5±3.4 9±2.9 100 0 98 2

Гг/™5/+ 81.5 4±1.9 14.5±3.6 100 0 99 1

№р'~'/+; Trf62/+ 77.5 9±2.9 13.5±3.5 100 0 100 0

N"J-'/+; Trfss/+ 85 % 14±3.6 99 к 99 1

N"d~'/+; Trf'2/+ 72.5 18±4.0 9.5±3.1 96 4±1.9 100 0

br'/+; Trt"S5/+ 76 5±2.2 19±4.1 94 6±2.3 90 10±3.0

br'/+; Trf62/+ 84 11±3.2 5±2.2 96 4±1.9 96 4±1.9

Ь^с-'/+; ТгГ5/+ 82 2 16±3.8 98 1 100 0

Ь^-'Я; Trt,62/+ 61 36±5.4 3 95 5±2.2 68 32±4.6

saxJ/+; Trt""/+ 76 7±2.5 17±3.9 98 2 97 3

sax4/+; Trt*62/+ 62.5 29±4.9 8.5±2.8 99 « 99 1

sax5/+; Trfss/+ 96 1 1 96 4±1.9 90 10±3.0

sax5/+; Trf"/+ 79 13±3.4 8±2.3 91 9±2.4 96 4

tkv'/+; Trf5/+ 77.5 2 20.5±4.2 100 0 98 2

tkv'/+; Trt,62/+ 72.5 8±2.7 19.5±4.1 100 0 99 1

tkv7/+; TrfS5/+ 71 9±2.9 20±4.2 92 8±2.7 99 X

tkv7/+; Tr^62/+ 57.5 31.5±5.1 11±3.2 91 9±2.8 95 5±2.1

Ьиптп'/+;ТгГ'/+ 86 6.5±2.5 2.5 93 7±2.5 74 26±4.3

bun00255/+;Tr^2/+ 84 16±3.8 0 90 10±3.1 85 15±3.5

bunBG0,623/+; TrlRSS/+ 95 3±1.7 i 89 11±3.1 99 1

bunBaom3/+;Trf62/+ 92 5±2.2 3 99 1 100 0

Trfs5/+ 96.5 0 3.5 97 3 99 1

Тг?62/+ 96 2.5 1 98 i 100 6

grk2E,2/+ 96 2 i 98 2 98 2

grk"F4S/+ 94 2.5 3.5 100 0 98 2!

gr^B6/+ 96 2 2 99 1 99 *

Nspl',/+ 95.5 1 3.5 100 0 100 0

N"d~'/+ 97 0 3 100 0 100 0

tkv'/+ 96 2 2 100 0 100 0

tkv7/+ 96 2 2 98 ' 2 99 1

sax4/+ 97 2 1 100 ft 99 1

sax5/+ 97 0 3 99 1 98 2

br'/+ 96 1 3 99 1 98 2

97 2 1 100 0 98 2

dppd,4/+ 95.5 1 3.5 97 3 99 1

dpph'"/+ 97.5 zs íf 99 1 100 Q

dppmss/+ 95.5 i 99 1 97 3

ЬипШ55/+ 97 0 % 98 2 97 3

bunBCm23/+ 99 1 0 97 i 100 a

Примечание: 'Длина менее 80% от средней длины ДВХ яиц, отложенных мухами дикого типа. ^Широкие, топкие, разветвленные, сближенные/ слившиеся. 3Длина 0-60% ог средней длины оперкулумов дикого типа. 4Длина до 85% от средней длины яйца дикого типа. Средние значения ДВХ, оперкулума и длины яйца у Oregon R составляют, соответственно: 675±40.1 мкм, 139±20.3 мкм, 652±35.9 мкм. Примечание: серым цветом выделены нарушения, частота встречаемости которых не обнаруживает достоверного различия с Oregon R.

В случае гена dpp (Рис. 4Г) были использованы гиноморфная мутация dppá14, обусловленная делецией фрагментов хромосомы 2L (22F1-22F2; 23А2); рецессивная леталь dpp'063", обусловленная инсерцией Р{Р2}-транспозоиа в 5'-область гена dpp (BDGP Project Members, 1994-1999); мугация dpphr92 («loss of function», Arora and Nusslein-Volhard, 1992), обусловленная однонуклеотидной заменой, приводящей к замене 587-ой аминокислоты (Wharton et al., 1996). В контроле достоверных отличий от нормы не наблюдали. Основная масса яиц трансгетерозигот dpp/+; 7>//+ по форме напоминает яйца дикого типа. 3.5-19% ДВХ мутантов - укороченные, также ДВХ могут быть тонкими или очень толстыми, неправильной формы (всего частота аномальных ДВХ варьирует в пределах 6.5-12%, см. Табл. 2).

Для исследования взаимодействия Trl с геном tkv (Рис. 4Д) мы использовали гиноморфную мутацию tkv' (de Celis, 1997) и «loss of function» аллель tkv (Horsfíeld et al., 1998), который содержит точечную замену, приводящую к замене аминокислоты (Nellen et al., 1994). В контроле мы не обнаружили достоверных отличий от Oregon R (Табл. 2). 5% яиц tkv7/+; Тг1ш/+ уменьшены. ДВХ мутантов tkv/+; ТН/+ укорочены (8-31.5% ДВХ), также встречаются тонкие и/ или сближенные (11-20.5% ДВХ). Оперкулум яиц tkv7/+; Trl/+ уменьшен (8-9% яиц).

Для исследования генетического взаимодействия Trl и sax (Рис. 4Е) мы использовали «amorphic alíele» saxs и «loss of function, amorphic alíele» sax1 (Singer et al., 1997). Исследование контролей не выявило достоверных отличий от нормы. 10?/о яиц, отложенных самками saxs/+; TrlRS5/+, короче яиц Oregon R (Табл. 2). ДВХ могут быть укороченными (7-29% ДВХ) и тонкими (8-17% ДВХ). В 4-9% яиц sax3/+; Trl/+ мутантов оперкулум уменьшен (Табл. 2).

В случае гена grk (Рис. 4Ж) были использованы нуль-аллели: grk2E12 (содержит стоп-кодон в середине последовательности гена), grlcm (содержит делецию в промоторной области) и grk"''48 (содержит стоп-кодон в начале гена). В контроле достоверных отличий от нормы обнаружено не было (Табл. 2). Для яиц мутантов grk/+; ТН/+ наиболее характерно нарушение длины ДВХ (11.5-46.5%). Также были обнаружены сближенные/ слившиеся у основания ДВХ (Табл. 2), либо ДВХ не имели выраженных лопастей (Рис. 4Ж). У мутантов grk2B6/+; Trl/+ более чем в 20% случаев наблюдали укороченный по сравнению с контролем оперкулум (Табл. 2). Длина яиц мутантов grh'+; Trl/+ отличалась от контроля в 9-23 % случаев.

Для исследования взаимодействия генов Trl и Notch (Рис. 43) мы использовали "antimorphic/ hypomorphic" алелль If1'' (de Celis and Garcia-Bellido, 1994), обусловленный однонуклеотидной заменой, приводящей к замене аминокислоты (Lieber et al., 1992), и "loss of function/ hypomorphic" алелль N"d'' (Rabinow and Birchler, 1990), обусловленный делецией 41 п.н. на З'-конце 8-ого экзона и 3-х нук-

леотидной инсерцией, приводящей к вставке дополнительного глутамина между Q2567 и Q2568 (Lyman and Young, 2003). Достоверных отличий от нормы в контроле обнаружено не было. У траисгетерозигот Notch/+; Trl/+ размер яиц и оперкулумов почти не отличался от нормы (Табл. 2). В отличие от яиц и оперкулумов, * среди ДВХ таких мух встречаются укороченные (4-18% ДВХ), тонкие, сближенные или неправильной формы (9.5-14.5% ДВХ).

Таким образом, на фоне снижения количества белка GAGA наблюдается усиление проявления фенотипа мутаций по генам br, bun, dpp, tkv, grk, sax и Notch. Следовательно, Tri взаимодействует с этими генами в процессе формирования ДВХ.

Анализ локализации белков Grk, Notch, Br в яйцевых камерах 7У/-мутантов и мух дикого типа

Иммунохимическое окрашивание яичников Тг1362/Тг1Ю5-мутшюа и мух дикого типа на антитела против Gurken, Notch и Broad-core показало нарушение локализации анализируемых белков в яйцевых камерах на фоне снижения количества белка GAGA.

В норме к началу 9-ой стадии белок Grk располагается в переднем дорзаль-ном углу ооцита (Queenan et al., 1999), обозначая очертания ядра ооцита (Рис. 5А). Такое окрашивание было обнаружено в 94.3% яйцевых камер дикого типа (п=58). В большинстве яйцевых камер (58%, п=42) Гг/^-'/Гг^-мутантов Grk располагается не вдоль фолликулярного эпителия, обозначая очертания ядра, а хаотично распределен в цитоплазме ооцита в виде довольно крупных гранул (Рис. 5Б). Поскольку в норме передача белка Grk фолликулярным клеткам осуществляется с помощью везикулярного транспорта, мы предполагаем, что GAGA может участвовать в процессе направленного трансмембранного переноса веществ.

В яйцевых камерах мух дикого типа на стадии 10А Вг выявляется в большинстве фолликулярных клеток, покрывающих ооцит, исключая иередне-дорзальную Т-область и задний полюс (Рис. 5В). На стадии 10В белок Вг можно наблюдать только в двух группах передних латерально-дорзальных клеток (Deng and Bownes, 1997). У 7>/5"/7>/яв5-мутантов (Рис. 5Г) наблюдается неравномерное окрашивание на anti-Broad (25E9.D7, Hybridoma Bank) фолликулярных клеток, покрывающих ооцит (32% яйцевых камер, п=72). Таким образом, в яйцевых камерах 7>/-мутантов нарушена локализация белка Вг.

В норме на 10-й стадии оогенеза белок Notch прекращает продуцироваться почти во всех фолликулярных клетках, за исключением центрипетальных клеток и нескольких клеток, расположенных на задней стороне ооцита (Рис. 6А). Также на поздних стадиях Notch выявляется в фолликулярных клетках, покрывающих питающие клетки, и на поверхности питающих клеток (Рис. 6Б), тогда как ооцит не содержит белка Notch (Xu et al., 1992). В яйцевых камерах Г^"/7>/л,5-мутантов по сравнению с диким типом (Рис. 6В) нарушена локализация белка Notch (48% яйцевых камер, п=64). У Тг1162/ТН^5-мутантов практически исчезает окрашивание на anti-Notch' в фолликулярных клетках и основная часть Notch располагается в цитоплазме ооцита в виде гранул (Рис. 6В). Сходное нарушение локализации Notch было обнаружено ранее при окрашивании на anti-NotchEC крыловых имагинальных дисков мугантов dNSF2E/Q С96 (Stewart et al., 2001). Белок Notch, в норме располагающийся на мембранах клеток крыловых имагинальных дисков, у мутантов dNSF2F Q С96 обнаруживал внутриклеточную локализацию.

Oregon R

Белок NSF является одним из ключевых компонентов, отвечающих за трансмембранный перенос веществ. Поскольку у мутантов Trl362/TrlR85 обнаруживается нарушение локализации не только Notch, но и Grk, можно предположить, что снижение количества белка GAGA приводит к нарушению трансмембранного транспорта, т.е. GAGA может участвовать в процессе Рис. 5. Распределение в яйцевых камерах трансмембранного переноса дикого типа и 7>/ ЛУ^-мутантов белков: (А, Б) веществ. Grk; (В, Г) Broad.

Oregon R

Рис. 6. Распределение белка Notch в яйцевых камерах: (А, Б) дикого типа; (В) Trti62/TrlRSS- мутантов.

Анализ относительного количества транскриптов генов br, bun, dpp, tkv, grk, sax и Notch в яйцевых камерах мух дикого типа и

С помощью ПЦР в реальном времени была проанализирована относительная

экспрессия генов br, bun, dpp, tkv, grk, sax и Notch в яичниках мух дикого типа и Тг1зб2/ТгГ5-мутантов. Было обнаружено, что количество транскриптов генов br, bun, dpp и tkv в яйцевых камерах 7>/-мутантов меняется незначительно по сравнению с нормой (Рис. 7). На основании обнаруженного генетического взаимодействия Trl с br, bun, dpp и tkv мы предполагаем скооперированное действие GAGA с продуктами этих генов в ходе оогенеза

Oregon R ч/ганты Oregon Ft мутанты Oregon R wyiaimJ Oregon R мутат

Рис. 7. Относительная экспрессия генов br, bun, dpp, tkv в яйцевых камерах мух дикого типа и Тг^/ТгР*5 -мутантов.

дрозофилы. Под скооперированным действием мы подразумеваем такой процесс

регуляции экспрессии какого-либо гена, при котором для нормального уровня экспрессии требуется одновременное действие двух белков и/ или транскрипционных факторов (Рис. 8). На Рис. 8, схематично представлен механизм предполагаемого скооперированного действия белка GAGA с транскрипционными факторами Вг и Bun (Рис. 8А) и с ключевыми компонентами сигнального пути DPP

Рис. 8. Схематичное изображение предполагаемого скооперированного действия белка GAGA с: (А) транскрипционными факторами (TF) Вг и Bun; (Б) с ключевыми компонентами сигнального пути DPP-DPP и TKV.

В случае остальных генов наблюдали изменение экспрессии в яйцевых камерах на фоне снижения количества белка GAGA (Рис. 9, 10). Было обнаружено, что в яичниках 7У/-мутантов уровень относительной экспрессии sax и grk в 2 и 2.67 раза ниже по сравнению с нормой, соответственно (Рис. 9). Таким образом, гены ш и grk являются мишенями GAGA-фактора. На фоне снижения количества белка GAGA относительная экспрессия гена Notch достоверно увеличена более чем в 9 раз по сравнению с нормой (Рис. 10). Следовательно, GAGA-фактор участвует в регуляции экспрессии Notch в ходе оогенеза и формирования ДВХ.

— лигандом DPP и рецептором TKV (Рис. 8Б).

дгк

Oregon R мутанты Oregon R мутанты

Рис. 9. Относительная экспрессия генов sax и grk в яичниках мух Oregon К и -мутантов.

Notch

Oregon R мутанты

Рис. 10. Относительная экспрессия гена Notch в яичниках мутантов и мух дикого типа.

В настоящее время известно, что GAGA-фактор может выступать не только в качестве активатора/ антирепрессора транскрипции генов дрозофилы, но и в качестве репрессора (Berger and Dubreucq, 2012). Поэтому мы полагаем, что белок GAGA может участвовать в подавлении экспрессии гена Notch в ходе оогенеза дрозофилы как прямо, так и опосредованно (Рис. 11).

Модификация генной сети, контролирующей формирование ДВХ

В соответствии с полученными данными генная сеть, контролирующая формирование ДВХ, была модифицирована (Рис. 11). Нами было обнаружено, что белок GAGA необходим для активности генов grk и sax. Кроме того, снижение

уровня белка GAGA приводит к активации транскрипции гена Notch. Как показано на Рис. 11, GAGA прямо или опосредованно (через некоторый фактор X) подавляет экспрессию Notch. Возможно, фактором X является белок Tramtrack (ТТК), с которым GAGA образует репрессорный комплекс (Pagans et al., 2002, 2004). Поскольку

ТТК является известным репрессором Notch в процессе формирования ДВХ, мы полагаем, что белок GAGA может образовывать с ТТК комплекс GAGA/TTK, подавляющий экспрессию гена Notch.

Заключение

В ходе данной работы были получены следующие результаты: (1) выявлены различные структурные варианты GAGA-сай-тов. Для компьютерного распознавания GAGA-сайтов созданы две качественных обучающих выборки (структурные варианты GAGnGAG и GAGnnnGAG); (2) экспериментально подтверждено связывание белка GAGA с 30-ю новыми сайтами в дополнение к 120 ранее доказанным сайтам; (3) установлено, что снижение количества белка GAGA приводит к формированию аномальных ДВХ и укорочению оперкулума; (4) выявлено, что у потенциальных генов-мишеней GAGA-фактора наблюдается высокая плотность GAGA-сайтов в 5'-некодирующей области; (5) показано, что экспрессия генов gurken и saxophone понижается, а экспрессия гена Notch увеличивается на фоне снижения количества белка GAGA в ходе оогенеза дрозофилы.

ВЫВОДЫ

1) Анализ 120 ранее подтвержденных-GAGA-сайтов выявил четыре структурных варианта этих сайтов. Для компьютерного распознавания сайтов GAGA "фактора впервые использованы раздельные выборки (структурные варианты GAGnGAG и GAGnnnGAG).

2) С помощью метода задержки ДНК-пробы в геле продемонстрирована высокая эффективность выбранного подхода для компьютерного распознавания GAGA-сайтов (разделение обучающих выборок и применение метода SITECON): связывание подтвердилось для 72% предсказанных сайтов типа GAGnGAG, и для 94% сайтов типа GAGnnnGAG; в результате к ранее подтвержденным ¡20 сайтам были добавлены 30 новых экспериментально доказанных GAGA-сайтов.

3) С помощью разработанного компьютерного подхода показано, что в 5'-некоди-рующей области наиболее вероятных генов-мишеней GAGA-фактора наблюдается высокая плотность потенциальных GAGA-сайтов.

4) Выявлено, что у Tnthorax-like-uytamon нарушено формирование дорзальных выростов хориона и оперкулума.

5) В регуля горных областях генов gurken и saxophone, играющих ключевую роль в формировании дорзальных выростов хориона, выявлены потенциальные и экспериментально подтвержденные GAGA-сайты; показано генетическое

Рис. 11. Генная сеть, контролирующая формирование ДВХ. Стрелки, направленные от белка GAGA, обозначают процессы регуляции генов, выявленные в данной работе.

взаимодействие Trithorax-like с этими генами; обнаружено снижение относительной экспрессии gurken и saxophone на фоне снижения количества белка GAGA. Следовательно, gurken и saxophone являются генами-мишенями транскрипционного фактора GAGA.

6) В регуляторных областях гена Notch предсказаны потенциальные GAGA-сайты; продемонстрировано генетическое взаимодействие Trithorax-like и Notch; обнаружено значительное повышение уровня относительной экспрессии Notch на фоне снижения количества белка GAGA. Таким образом, GAGA-фактор прямо или опосредованно участвует в подавлении экспрессии гена Notch.

1) В регуляторных районах генов broad, bunched, decapentaplegic и thicbeins обнаружены сайты связывания GAGA-фактора; показано генетическое взаимодействие Trithorax-like с этими генами, однако не было обнаружено изменения экспрессии этих генов на фоне снижения количества белка GAGA.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ НО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Омелина Е.С., Павлова Н.В., Огиенко А.А., Баричева Э.М. Для формирования дорзальных выростов хориона Drosophila melanogaster требуется белок GAGA // Доклады Академии Наук. - 2011. - Т. 436. - № 5. - С. 696-698.

2. Omelina E.S., Baricheva Е.М., Oshchepkov D.Y., Merkulova T.I. Analysis and recognition of the GAGA transcription factor binding sites in Drosophila genes // ComputBiol. Chem.-2011.-Vol. 35.-P. 363-370.

3. Омелина E.C., Баричева Э.М. Основные компоненты генной сеги, контролирующей развитие дорзальных выростов хориона яиц Drosophila melanogaster И Онтогенез. -2012. - Т. 43. -№ 3. - С. 163-174.

4. Омелина Е.С., Баричева Э.М., Федорова Е.В. Основные типы строения респираторных систем яйцевых оболочек насекомых и гены, участвующие в их формировании // Журнал общей биологии. - 2012. - Т. 73. - № 3. - С. 210-221.

5. Ogienko А.А., Karagodin D.A., Lashina V.V., Baiborodin S.I., Omelina E.S., Baricheva E.M. Capping protein beta is required for actin cytoskelcton organization and cell migration during Drosophila oogenesis // Cell Biol Int. - 2013. - Vol. 37 -P. 149-159.

6. Karagodin D.A., Omelina E.S., Fedorova E.V., Baricheva E.M. Identification of functionally significant elements in the second intron of the Drosophila melanogaster Trithorax-like gene // Gene. - 2013. Принято в печать.

7. Omelina E.S., Oshchepkov D.Y., Baricheva E.M., Merkulova T.I. AN EXPERIMENTAL AND COMPUTATION APPROACH TO SEARCH FOR THE TRANSCRIPTION FACTOR GAGA BINDING SITES // 7,h International conference on bioinformatics of genome regulation and structure\system biology (BGRS/SB'2010). Novosibirsk, 2010.

8. Омелина E.C., Баричева Э.М., Лашина B.B. Взаимодействие гена Trithorax-like с

генами, участвующими в формировании дорзальных выростов хориона яйца Drosophila melanogaster // III Международная конференция «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии». Украина, г. Канев, 2012.

Подписано к печати 28.03.2013 г. Формат бумага 60x90 1/16. Печ. л. 1. Уч.-изд. л. 0,7 Тираж 110 экз. Заказ 26

Отпечатано на полиграфической базе ИЦиГ СО РАН

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Омелина, Евгения Сергеевна, Новосибирск

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201356873

ОМЕЛИНА ЕВГЕНИЯ СЕРГЕЕВНА

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНОВ-МИШЕНЕЙ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА GAGA, УЧАСТВУЮЩИХ В ФОРМИРОВАНИИ ДОРЗАЛЬНЫХ ВЫРОСТОВ ХОРИОНА ЯЙЦА DROSOPHILA MELANOGASTER

03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к.б.н. Баричева Э.М.

Новосибирск 2013

Оглавление

Список сокращений...............................................................................5

Введение..............................................................................................6

Глава 1. Обзор литературы....................................................................11

1.1. Структура гена Trithorax-like.............................................................11

1.2. Строение белка GAGA......................................................................13

1.3. Функции белка GAGA......................................................................15

1.4. Основные методы определения сайтов связывания транскрипционных факторов.............................................................................................17

1.5. Сайты связывания транскрипционного фактора GAGA.............................19

1.6. Взаимодействие GAGA с другими белками............................................21

1.7. Влияние GAGA на структуру хроматина...............................................22

1.8. Ген Trithor ax-like относится к группе генов ЕТР (Enhancer of trithorax and Polycomb group)...................................................................................25

1.9. Белок GAGA является эволюционно-консервативным..............................26

1.10. Формирование дорзальных выростов хориона Drosophila melanogaster........27

1.11. Генетический контроль формирования дорзальных выростов хориона D. melanogaster.........................................................................................29

1.11.1. Сигнальный путь EGFR обусловливает начало формирования дорзальных выростов хориона.................................................................................29

1.11.2. Сигнальный путь DECAPENTAPLEGIC контролирует развитие дорзальных выростов хориона.................................................................................33

1.11.3. Сигнальный путь NOTCH также контролирует развитие дорзальных выростов хориона.................................................................................36

1.11.4. Генная сеть развития дорзальных выростов хориона.............................40

Заключение и постановка задач.............................................................45

Глава 2. Материалы и методы...............................................................47

2.1. Материалы, использованные в работе...................................................47

2.2. Олигонуклеотиды............................................................................47

2.3. Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе..........................49

2.4. Плазмиды......................................................................................52

2.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)...................................................52

2.6. Трансформация плазмидной ДНК в химически обработанные клетки Е. coli...52

2.7. Электропорация плазмидной ДНК в «электро-компетентные» клетки Е. coli BL21/DE3............................................................................................53

2.8. Выделение плазмидной ДНК из ночной культуры....................................53

2.9. Секвенирование с использованием набора для секвенирования ABI PRISM BigDye Terminator Ready Mix...................................................................54

2.10. Выделение плазмидной ДНК для скрининга большого количества клонов....54

2.11. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции..........................................55

2.12. Подготовка вектора для клонирования.................................................55

2.13. Лигирование.................................................................................55

2.14. Получение очищенного рекомбинантного белка с помощью HisTrap HP колонки.............................................................................................55

2.15. Метод задержки ДНК-пробы в геле.....................................................56

2.16. Микроскопический анализ................................................................57

2.16.1. Иммуногистохимия.....................................................................57

2.16.2. Характеристика фенотипов яйцевых оболочек и дорзальных выростов хориона..............................................................................................58

2.17. Статистическая обработка данных, полученных при измерении длины дорзальных выростов хориона, оперкулумов и яиц мух.................................58

2.18. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозных гелях............................59

2.19. Определение относительной экспрессии генов с помощью ПЦР в реальном времени.............................................................................................59

2.19.1. Выделение тотальной РНК из яичников дрозофилы..............................59

2.19.2. Обратная транскрипция.................................................................60

2.19.3. ПЦР в реальном времени...............................................................60

2.19.4. Праймеры для ПЦР-РВ..................................................................60

Глава 3. Результаты и обсуждение..........................................................62

3.1. Структурные варианты GAGA-сайтов...................................................62

3.2. Поиск сайтов связывания транскрипционного фактора GAGA в геноме D. melanogaster с помощью программного пакета SITECON................................65

3.3. Экспериментальное подтверждение взаимодействия белка GAGA с предсказанными SITECON сайтами связывания............................................68

3.4. Определение потенциальных сайтов связывания GAGA в последовательностях ДНК Drosophila melanogaster...................................................................72

3.5. Участие гена Tri в формировании ДВХ..................................................77

3.6. Гены broad, bunched, decapentaplegic, thickveins и Trithorax-like действуют скооперированно в процессе формирования ДВХ..........................................79

3.6.1. Сайты связывания GAGA-фактора.....................................................79

3.6.2. Взаимодействие генов......................................................................82

3.6.3. Анализ распределения белка Вг в яйцевых камерах 7>/-мутантов...............88

3.6.4. Анализ относительного количества транскриптов генов br, bun, dpp, tkv в яйцевых камерах мух дикого типа и Tri-мутантов..........................................89

3.7. saxophone и gurken являются генами-мишенями GAGA-фактора..................91

3.7.1. Сайты связывания транскрипционного фактора GAGA............................91

3.7.2. Анализ генетического взаимодействия Tri с генами s ах и grk в процессе формирования ДВХ...............................................................................93

3.7.3. Анализ влияния 7>/-мутаций на локализацию белка Grk..........................95

3.7.4. Относительная экспрессия генов sax и grk в яйцевых камерах мух дикого типа и 7>/-мутантов...............................................................................97

3.8. GAGA-фактор участвует в регуляции экспрессии генаNotch.......................98

3.8.1. Сайты связывания GAGA-фактора в регуляторных областях тепа Notch......98

3.8.2. Анализ взаимодействия генов Tri я Notch в ходе формирования ДВХ.........99

3.8.3. Анализ влияния Tri мутаций на локализацию белка Notch......................100

3.8.4. Анализ относительного количества транскриптов гена Notch в яйцевых камерах Trl362/TrlR85-мутантов по сравнению с диким типом...........................101

3.9. Модификация генной сети, контролирующей формирование ДВХ..............105

Заключение......................................................................................106

Выводы............................................................................................109

Список литературы............................................................................110

Приложение 1....................................................................................136

Приложение 2....................................................................................138

Список сокращений

а.о. - аминокислотные остатки

п.н. - пар нуклеотидов

т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

кДа - килодальтон

ВТВ - Bric-a-brac, Tramtrack, Broad Complex

EST - Expressed Sequence Tags

SDS - додецилсульфат натрия

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Dam - DNA adenine methyltransferase

OPC - открытая рамка считывания

DBD - ДНК-связывающий домен

EMSA - electromobility shift assay (метод задержки ДНК-пробы в геле)

ChIP - Chromatin iMmunoprecipitation (метод иммунопреципитации хроматина)

ChlP-chip - Chromatin immunoprecipitation coupled with genome tiling microarrays

ChlP-seq - Chromatin immunoprecipitation coupled with sequencing

NURF - nucleosome remodeling factor

ISWI-субъединица - Imitation Switch

FACT - facilitates chromatin transcription

dSPT16 - Drosophila homolog of yeast SPT16

dSSRPl - Drosophila homolog of mammalian structure-specific recognition protein

PcG - белки (гены) группы Polycomb

trxG - белки (гены) группы trithorax

ДВХ - дорзальные выросты хориона

ПААГ - полиакриламидный гель

кДНК - кодирующая ДНК

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - ПЦР в реальном времени

PRE - polycomb responsive element

Введение

Актуальность проблемы

ДНК-связывающий белок GAGA* кодируемый геном Trithorax-like (Tri), требуется для развития многих органов и тканей D. melanogaster. Этот эволюционно-консервативный белок принимает участие в формировании «открытой» конформации хроматина в различных регуляторных элементах, задействованных в регуляции транскрипции (Farkas et al., 2000; Matharu et al., 2010). Данные по локализации белка GAGA на политенных хромосомах (Raff et al., 1994), сравнительный анализ промоторных последовательностей (Arkhipova, 1995), результаты экспериментов по профилированию хроматина с использованием Dam (van Steensel et al., 2003), а также данные ChlP-chip анализа (Negre et al., 2010) говорят о том, что число генов, регулируемых GAGA-фактором, может быть очень большим. Однако на сегодняшний день к экспериментально доказанным генам-мишеням GAGA-фактора относится небольшое число генов, включая Ultrabithorax (Ubx), fushi-tarazu (ftz) и engrailed (en). В регуляторных районах этих генов были обнаружены сайты связывания GAGA-фактора (Biggin and Tjian, 1988; Soeller et al., 1988; 1993; Katsani et al., 1999; Mahmoudi et al, 2003; Schweinsberg et al., 2004), a также были проведены эксперименты, доказывающие участие GAGA в регуляции транскрипции этих генов (Topol et al., 1991; Farkas et al., 1994; Bhat et al., 1996; Laney and Biggin, 1996; Orihara et al., 1999; Bejarano and Busturia, 2004; Огиенко и др., 2006).

В данной работе с использованием комбинированного компьютерно-экспериментального подхода был проведен поиск генов-мишеней GAGA-фактора среди генов, контролирующих формирование дорзальных выростов хориона (ДВХ). Реорганизация эпителиальной ткани в трубчатые структуры (тубулогенез), лежащая в основе формирования ДВХ, является фундаментальным процессом при развитии таких органов, как сердце, почки, легкие, кишечник, нервная трубка. Понимание генетических механизмов, контролирующих развитие трубчатых структур, необходимо для выяснения закономерностей формирования и функционирования органов не только в условиях in vivo, но и органов, выращенных искусственных путем (Berg, 2008). ДВХ дрозофилы представляют собой прекрасную модель для изучения процессов тубулогенеза, поскольку

процесс развития ДВХ во многом очень схож с процессом закладки нервной трубки у позвоночных. Поэтому исследование генетических механизмов, контролирующих формирование ДВХ, представляет большой интерес не только для современной биологии развития, но и для медицины.

Известно, что формирование ДВХ контролируется большим количеством генов, многие из которых входят в состав важнейших сигнальных путей, участвующих в органогенезе не только дрозофилы, но и позвоночных (Berg, 2008). До настоящего времени не было исследовано участие гена Tri и его продукта, белка GAGA, в формировании ДВХ. В данной работе было обнаружено, что при недостатке белка GAGA наблюдаются нарушения этого процесса. Поскольку белок GAGA является эволюционно-консервативным (Matharu et al., 2010; Kumar, 2011), результаты данной работы могут быть полезны при исследовании роли GAGA-фактора у млекопитающих, включая человека, что может послужить основой для понимания генетических процессов, контролирующих формирование органов, в основе которых лежит образование трубчатых структур.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было выявление генов-мишеней транскрипционного фактора GAGA среди генов, участвующих в формировании дорзальных выростов хориона Drosophila melanogaster.

В ходе выполнения данной работы были поставлены следующие задачи:

1. провести анализ ранее доказанных сайтов связывания транскрипционного фактора GAGA для выявления структурных вариантов этих сайтов и создать обучающие выборки для последующего компьютерного распознавания сайтов связывания GAGA-фактора.

2. проверить эффективность предсказания GAGA-сайтов методом задержки ДНК-пробы в геле.

3. проанализировать распределение потенциальных сайтов связывания GAGA-фактора в геноме в целом и в различных районах генов дрозофилы.

4. провести поиск потенциальных сайтов связывания GAGA-фактора в регуляторных районах генов, играющих ключевую роль в формировании ДВХ.

5. проверить генетическое взаимодействие Tri с генами, участвующими в формировании ДВХ.

6. с использованием ПЦР в реальном времени провести сравнительный анализ относительной экспрессии генов, контролирующих развитие ДВХ, в норме и у 7>/-мутантов.

Научная новизна и практическая ценность работы

В данной работе впервые созданы две качественных выборки (структурные варианты GAGnGAG и GAGnnnGAG) для компьютерного распознавания GAGA-сайтов в последовательностях ДНК. Экспериментально подтверждено связывание с 30-ю новыми сайтами GAGA-фактора. Впервые показано, что мутации гена Tri вызывают нарушение формирования ДВХ и оперкулума яйца дрозофилы. Обнаружено генетическое взаимодействие Tri с gurken, decapentaplegic, Notch, broad, saxophone, thickveins и bunched в развитии ДВХ. Показано, что экспрессия генов gurken и saxophone понижается, а экспрессия гена Notch увеличивается на фоне снижения количества белка GAG А в ходе оогенеза дрозофилы.

Научно-практическая значимость

Полученные результаты дополняют имеющуюся информацию о сайтах связывания и генах-мишенях транскрипционного фактора GAGA, показывают важность экспрессии гена Tri для нормального формирования ДВХ. На основании результатов, полученных в данной работе, модифицирована генная сеть, контролирующая формирование ДВХ. Материалы данной диссертационной работы могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и биоинформатических специальностей.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на следующих конференциях: - VII Международная конференция по биоинформатике регуляции и структуры геномов и системной биологии (Bioinformatics of Genome Régulation and Structure\Systems Biology — BGRS\SB-2010). Россия, г. Новосибирск, 2010 г.

- III Международная конференция «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии». Украина, г. Канев, 2012 г.

Публикации

1. Омелина Е.С., Павлова Н.В., Огиенко A.A., Баричева Э.М. Для формирования дорзальных выростов хориона Drosophila melanogaster требуется белок GAGA // Доклады Академии Наук. - 2011. - Т. 436. - № 5. - С. 696-698.

2. Omelina E.S., Baricheva Е.М., Oshchepkov D.Y., Merkulova T.I. Analysis and recognition of the GAGA transcription factor binding sites in Drosophila genes // Comput Biol. Chem.-2011.- Vol. 35.-P. 363-370.

3. Омелина E.C., Баричева Э.М. Основные компоненты генной сети, контролирующей развитие дорзальных выростов хориона яиц Drosophila melanogaster // Онтогенез. - 2012. - Т. 43. - № 3. - С. 163-174.

4. Омелина Е.С., Баричева Э.М., Федорова Е.В. Основные типы строения респираторных систем яйцевых оболочек насекомых и гены, участвующие в их формировании // Журнал общей биологии. - 2012. - Т. 73. - № 3. - С. 210-221.

5. Ogienko A.A., Karagodin D.A., Lashina V.V., Baiborodin S.I., Omelina E.S., Baricheva E.M. Capping protein beta is required for actin cytoskeleton organization and cell migration during Drosophila oogenesis // Cell Biol Int. - 2013. - Vol. 37. - P. 149— 159.

6. Karagodin D.A., Omelina E.S., Fedorova E.V., Baricheva E.M. Identification of functionally significant elements in the second intron of the Drosophila melanogaster Trithorax-like gene // Gene. - 2013. Принято в печать.

Вклад автора

Основные результаты работы получены автором самостоятельно. Поиск сайтов связывания GAGA-фактора в последовательностях ДНК дрозофилы проводился в сотрудничестве с Д.Ю. Ощепковым (Лаборатория теоретической генетики, ИЦиГ СО РАН). Постановка метода задержки ДНК-пробы в геле проводилась под руководством Е.В. Антонцевой (Лаборатория регуляции экспрессии генов, ИЦиГ СО РАН). Праймеры для ПЦР и ПЦР-РВ, а также олигонуклеотиды для экспериментов EMSA были синтезированы в ЦКП по

синтезу олигонуклеотидов и их аналогов ИЦиГ СО РАН, а также в компании ООО «БИОССЕТ». Микроскопический анализ был проведен в ЦКП микроскопического анализа биологических объектов ИЦиГ СО РАН при участии С.И. Байбородина. Секвенирование ДНК проводили в ЦКП СО РАН «Геномика» на базе ИХБФМ СО РАН. Метод ПЦР-РВ был поставлен под руководством Е.В. Кашиной в ЦКП функциональной геномики ИЦиГ СО РАН. Материалы, вошедшие в данную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем.

Структура и объем диссертации

Диссертация, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, а также выводов, списка цитируемой литературы, в который входит 265 ссылок. Работа изложена на 144 страницах печатного текста, содержит 12 таблиц, 36 рисунков и 2 приложения на 9 страницах.

Благодарности

Автор глубоко благодарен Э.М. Баричевой, под руководством и при содействии которой была выполнена данная работа. Автор благодарен всем сотрудникам лаборатории механизмов клеточной дифференцировки ИЦиГ СО РАН -Е.В. Федоровой, Д.А. Карагодину, В.В. Лашиной, Н.В. Баттулиной, A.A. Огиенко за помощь, отзывчивость и поддержку в ходе работы. Особую благодарность хотелось бы выразить Д.Ю. Ощепкову за плодотворное сотрудничество, Г.В. Васильеву за предоставление экспрессирующего вектора рЕТ-28 и компетентных клеток E.coli BL21/DE3 для наработки рекомбинантного белка, Е.В. Антонцевой за консультации при постановке метода EMSA, а также Т.И. Меркуловой за неоценимую помощь в планировании экспериментов и обсуждении результатов. Кроме того, автор выражает благодарность С.И. Байбородину, сотрудникам ЦКП по синтезу олигонуклеотидов и их аналогов ИЦиГ СО РАН, сотрудникам ЦКП «Геномика» на базе ИХБФМ СО РАН. Искреннюю благодарность и признательность за помощь в постановке метода ПЦР-РВ и ценные советы автор выражает Е.В. Кашиной.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Структура гена Trithorax-like

Ген Trithorax-like (Tri) D. melanogaster, кодирующий белок GAGA, расположен в 70F1-2 районе хромосом