Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние гена Trithorax-like на формирование глаза Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Влияние гена Trithorax-like на формирование глаза Drosophila melanogaster"

На правах рукописи

БАТТУЛИНА НАДЕЖДА ВИКТОРОВНА

ВЛИЯНИЕ ГЕНА ТЯ1ТНОР1АХ-иКЕ(Щ НА ФОРМИРОВАНИЕ ГЛАЗА рЯОБОРНИ-А M£LA^VOGASГ£/?

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

10л::2

Новосибирск 2012

005017298

005017298

Работа выполнена в лаборатории эволюционной биологии клетки Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Барнчева Элина Михайловна

Захаров Илья Кузьмич

доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск.

Демаков Сергей Анатольевич

доктор биологических наук, заведующий лабораторией, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск.

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Национальный исследовательский Томский государственный университет», г. Томск.

Защита диссертации состоится «¿£» {¿•С&Л 2012 г. на заседании диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в ИЦиГ СО РАН в конференц-зале Инстшуга по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект ак. Лаврентьева, 10, т. (383) 363-49-06, факс (383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН. Автореферат разослан «20» G^jul aj( 20IZ г.

Ведущее учреждение:

Ученый секретарь

диссертационного совета, X ^^

доктор биологических наук yMw *9 Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение генетических систем, контролирующих формирование тканей и органов многоклеточного организма, является одним из основных направлений современной генетики развития. Особое значение имеет не только анализ отдельных генов, но и выявление групп генов, скоординировано действующих в процессах клеточной дифференцировки и установлении пространственно упорядоченной организации клеток. Развитие глаза дрозофилы является удобной модельной системой для подобного рода исследований. Этот процесс имеет ряд общих черт с развитием глаза позвоночных, а многие гены и сигнальные пути, вовлеченные в формирование глаза дрозофилы, являются эволюционно-консервативными (Kumar, 2009). Данные, касающиеся генетического контроля формирования глаза дрозофилы, имеют общебиологическое значение и могут быть использованы для выяснения общих закономерностей органогенеза и у других видов, для которых применение генетических и цитогенетических методов исследования в условиях in vivo имеет значительные ограничения.

Сложный глаз дрозофилы состоит из 700-800 повторяющихся функциональных единиц - омматидиев, образованных клетками нескольких типов. Каждый омматидий состоит из 8 фоторецепторных нейронов (фотонейронов R1-R8), 4-х конусных клеток, секретирующих лиизы, и 2-х первичных пигментных клеток. Вокруг омматидиев располагаются вторичные и третичные пигментные клетки, а также механо-сенсорные щетинки (Wolff. Ready. 1993). Формирование глаза дрозофилы является сложным многоэтапным процессом, каждая стадия которого контролируется множеством генов. К настоящему времени хорошо изучена роль сравнительно небольшого их числа, в частности, определены и изучены ключевые гены, ответственные за дифферепциронку клеток, формирующих омматидий (Voas. Rebay, 2004). Роль других генов в формировании глаза изучена слабо, хотя есть данные о том, что мутации в них приводят к нарушению струкгуры глаза (Call et al., 2007). К числу таких генов относится ген ТгШюгах-Нке {Tri), кодирующий транскрипционный фактор GAGA. Этот эволюционно-консервативный белок у дрозофилы принимает участие в формировании «открытой» конформации хроматина в различных регуляторных элементах, задействованных в регуляции транскрипции (Farkas et al... 2000; Lehmann, 2004; Mito et al., 2007; Deal et al., 2010; Matharu et al., 2010).

Нарушения поверхности глаза были обнаружены у Tri '^-мутантов (Farkas et al., 1994) и генетических мозаиков по аллелю ТгГ2325 (Call et al., 2007). В дальнейшем в глазах Tri ''""-мутантов было выявлено наличие дополнительных вторичных и третичных пигментных клеток и недостаток щетинок вокруг омматидиев. Подобные дефекты наблюдались и у генетических мозаиков, гомозиготных по аллелю Tri"1, у которых дополнительно были обнаружены изменения количества и формы первичных пигментных клеток (Dos-Santos et al.. 2008). Необходимо отмстить, что интерпретацию полученных авторами результатов затрудняет отсутствие данных об изменении количества продуктов гена Tri в развивающемся глазу мутантов и генетических мозаиков,

используемых в перечисленных работах. Поскольку механизмы нарушений структуры глаза у 7>/-мутантов выявлены не были, вопрос о роли транскрипционного фактора GAGA в процессе формирования данного органа остается открытым.

Вероятно, белок GAGA вовлечен в регуляцию экспрессии генов, задействованных в развитии глаза дрозофилы. Результаты исследований связывания белка GAGA с последовательностями ДНК генома дрозофилы свидетельствуют о том, что к его потенциальным мишеням относится более 600 генов (van Steensel et al., 2003, 2010; de Wit et al., 2008; Schuettengruber et al., 2009). Однако экспериментально доказано участие белка GAGA в контроле экспрессии не более 10 генов, среди которых нет генов, участвующих в формировании глаза. Для выявления генов-мишеней белка GAGA, необходимых для нормального развития глаза дрозофилы, предпочтителен анализ морфологии глаз Tri-мутантов. Результаты анализа клонов клеток, гомозиготных по аморфным 7У/-мутациям, которые обычно составляют лишь небольшую часть глазо-антеннального имагинального диска, могут не отражать нарушения всех процессов, в которые вовлечен белок GAGA. Возможно также, что данный белок участвует в регуляции экспрессии генов, продукты которых секретируются, в таком случае гомозиготные по 7У/-мутации клетки могут не демонстрировать некоторых нарушений, поскольку они получают секретируемые белки от окружающих клеток, не содержащих мутацию.

Среди аллелей гена Tri, доступных в мировых коллекциях, нет хорошо охарактеризованных мутаций, которые значительно нарушают структуру глаза жизнеспособных мутантов. Нами были получены и описаны две новые гипоморфные мутации - Tri и ТгГ82 (Огиенко и др., 2006, 2008), оказывающие такое действие на поверхность глаза. Одна из них - Tri""82, была охарактеризована в ходе данной работы. Эти мутации, приводящие к значительному снижению экспрессии гена Tri, дают уникальную возможность выявить весь спектр изменений структуры глаз 7У/-мутантов и определить потенциальные гены-мишени белка GAGA, задействованные в развития глаза дрозофилы. По нашим предварительным данным к таким генам могут относиться lozenge (lz) и BarHl. Данные гены кодируют эволюционно-консервативные транскрипционные факторы, которые участвуют в контроле нескольких процессов в ходе формировании глаза дрозофилы (Higashijima et al., 1992; Daga et al, 1996; Lim, Choi, 2004; Wildonger et al., 2005).

Цель и задачи исследования. Цель исследования заключалась в установлении роли гена Trithorax-like в процессе формирования глаза D. melanogaster и выявлении его взаимодействий с генами, участвующими в данном процессе.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. провести молекулярно-генетический анализ аллеля Triе"82;

2. охарактеризовать экспрессию гена Tri в глазо-антеннальных имагинальных дисках и мозго-вентральных ганглиях у гетерозигот ТгГпЯ21Тг!R"5 и Trl362/Trl""5;

3. исследовать влияние мутаций гена Tri на структуру глаза имаго и глазо-антеннальных имагинальных дисков 42-часовых куколок мутантов TrrS2ITrlRS5 и Tri302/Tri""5-,

4. выяснить влияние мутаций гена Tri на проявление мутаций генов lz и BarHI;

5. изучить экспрессию гена h в глазо-антеннальных имагинальных дисках у

_ т ien82fT l№5 г j362/t t R85

гетерозигот Tri I Tri и Tri /Tri ;

6. провести анализ связывания рекомбинантного белка GAGA с потенциальными сайтами, выявленными в 5'-областях генов lz и BarHI.

Научная новизна. Впервые показано, что снижение уровня экспрессии гена Tri в глазо-антеннальных имагинальных дисках и мозго-вентралыгом ганглии приводит к изменению количества фотонейронов и конусных клеток в части омматидиев, а также к изменению ориентации некоторых омматидиев в глазу дрозофилы. Установлено, что проявление мутации генов lz и BarHI усиливается на фоне мутаций по гену Tri, что свидетельствует о взаимодействии этих генов. Выявлено, что белок GAGA вовлечен в активацию экспрессии гена lz в клетках глазо-антеннальных имагинальных дисков предкуколок.

Паучно-практическая значимость работы. Результаты данной работы способствуют расширению фундаментальных знаний о процессе формирования глаза насекомых. Поскольку структурные гомологи белков GAGA, Lz и BarHI присутствуют и у позвоночных, то полученные результаты представляют интерес для всех биологов, занимающимися вопросами развития. Материалы данной диссертационной работы могут быть использованы в курсах лекций по генетике развития для студентов биологических факультетов.

Вклад автора. Основная часть экспериментальной работы и обработка полученных результатов выполнена автором самостоятельно. Анализ экспрессии генов Tri и lz в норме и у мутантов выполнен при участии Д.А. Карагодина (ИЦиГ СО РАН). Приготовление полутонких срезов глаза дрозофилы проводился совместно с С.И. Байбородиным (ИЦиГ СО РАН).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Мутации, вызывающие снижение экспрессии гена Tri, приводят к широкому спектру нарушений структуры глаза.

2. Мутации гена Тг! усиливают проявление мутаций генов lz и BarHI, участвующих в формировании глаза дрозофилы.

3. Снижение экспрессии гена Tri в глазо-антеннальных имагинальных дисках и мозго-вешральных ганглиях куколок 7>7-мутантов коррелирует со снижением количества белка Lz в глазо-антеннальных дисках.

Апробация работы. Полученные в ходе работы данные были представлены: на XLIV Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2006 г.); на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы

молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007 г.); на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК - 3, тезисов докладов и материалов конференций - 3.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение), выводов, списка литературы. Работа изложена на 135 страницах, содержит 6 таблиц и иллюстрирована 23 рисунками. В списке литературы приведен 241 источник.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Линии D. melanogaster описаны в справочнике (Lindsley, Zimm, 1992), базе данных FlyBase (www.Flybase.org), а также в статьях (Огиенко и др., 2006, 2008). Иммунохимическое окрашивание имагинальных дисков проводили по методу, предложенному в статье (Bonaccorsi et al., 2000). Использовались антитела N27A1 против белка Armadillo (DSHB) и вторичные антитела -коньюгаты иммуноглобулина G (rabbit anti mouse) с флюорохромом TRITC (Sigma).

Приготовление полутонких срезов глаз дрозофилы проводили по стандартной методике (Batterham et al., 1996).

Морфологический анализ срезов глаз проводили на микроскопе Axioscope 2 plus (Zeiss), глазо-антеннальных имагинальных дисков - на Axio Imeger с приставкой ApoTome (Zeiss), поверхности глаз - на сканирующем электронном микроскопе ТМ-ЮОО Tabletop (Hitachi). Обработку и анализ фотографий проводили с помощью программ AxioVision Reí. 4.8 (Zeiss) и Adobe Photoshop CS.

Выделение РНК проводили с использованием реагента TRIzol (Gibco BLR), согласно рекомендациям изготовителя.

Нозерн-блот-гибридизацию проводили по протоколу, описанному ранее (Maniatis et al., 1982). Для детекции сигналов использовали фосфоимиджер Pharos FX Plus Molecular Imager. Данные анализировали с помощью программного пакета Quantity One v.4.6.5 (Bio-Rad Laboratories).

Вестерн-блот-анализ проводили по методике, представленной в сборнике (Promega protocols and applications guide, 1991). Использовали антитела против белков Lozenge (DSHB) и ß-Tubulin (Travares et al., 1996) и вторичные антитела-коньюгаты иммуноглобулина G (rabbit anti mouse) с пероксидазой хрена (Биосан). Детекцию белков проводили с помощью набора реактивов ECL Detection Reagents (Amersham) по методике, описанной в статье (Alexander et al., 2002). Данные, полученные с помощью прибора Chemi Doc XR+ (BioRad), обрабатывали в программе Gel Pro 4.0.

Задержку ДНК-зонда в геле (EMSA) выполняли по методике, предложенной в статье (Ueda et al., 1990). Использовали рекомбинантный белок His-GAGA-519 (Omelina et al., 2011).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для детального исследования влияния гена Tr1 на процесс формирования глаза в данной работе использовались гипоморфиые мутации Tri362 и Tri2, приводящие к изменению поверхности глаза. Эти мутации являются наиболее «сильными» из охарактеризованных гипоморфных мутаций гена Tri. Мутация Tri362, полученная и охарактеризованная ранее A.A. Огиенко с соавторами (2006 г.), обусловлена встройкой транспозоиа Р(lacIV) и прилегающей к нему делецией 96 п.н. в 5'-некодирующей области гена Tri (рис. 1). Аллель Tri'""2 был выявлен при поиске генов, взаимодействующих с геном fe, и определен как аллель гена Tri по результатам генетического анализа (М.А. Волошина, персональное сообщение). В данной работе представлена детальная характеристика аллеля

-prjcn82

1. Молекулярная и цитогенетическая характеристика мутации ТгIе""2 С помощью ПЦР и последующего секвенирования продуктов амплификации было установлено, что мутация Tri""2 вызвана встройкой транспозоиа размером 1,4 т.п.п. в 5'-некодирующую область гена Tri (в позиции 2997 п.н., согласно последовательности GenBank #AJ225042) вблизи первого старта транскрипции (позиция 3067 п.н.) (рис. 1). Транспозон представляет собой делеционный вариант Р-элемента (удален участок с 810 по 2344 п.н., согласно последовательности GenBank #Х06779), встроенный в обратной ориентации относительно гена Tri (Огиенко и др. 2008). Кроме того, анализ нуклеотидной последовательности кодирующей области гена Tri у мутантов ТгГ"S2 выявил делецию 6 п.н. в экзоне 6 гена (9343-9348 п.н. GenBank #AJ225042). Данная делеция, не нарушая рамки считывания, удаляет два глутаминовых кодона в последовательности, кодирующей глутамин-богатый домен (ноли-(3-домен) одной из двух изоформ белка GAGA - GAGA-581. Две изоформы GAGA различаются структурой поли-(}-домена, который необходим для обеспечения транс-активационных функций (Vaquero et al, 2000), а также для формирования комплексов, состоящих из изоформ белка (Wilkins, Lis, 1999).

Рис. 1. Схема расположения мутаций гена Tri, используемых в работе. Треугольниками обозначены встройки транспозоиов в аллелях TrT"s2 и Tri362. Стрелками указана ориентация транспозонов. Черным прямоугольником и крестом обозначены делеции в аллелях Tri36' и Tri'""2, соответственно. Изогнутыми стрелками отмечены сайты инициации транскрипции гена Tri, заштрихованным прямоугольником - минимальный промотор гена (Kosoy et eil., 2002). Выделены две группы транскриптов транскрипты первой группы кодируют изоформу GAGA-519, второй - GAGA-581. Светлые прямоугольники соответствуют некодирующим районам, темные - кодирующим На схеме не представлены варианты первого некодирующего экзона гена Tri.

Цитогенетический анализ показал, что мутация Trle гетерозиготе с нуль-аллелем TrlRSi приводит к таким же дефектам в онтогенезе дрозофилы, как и другие гипоморфные мутации гена Tri. В частности, действие данной мутации на оогенез в целом сходно с действием мутации Tri362 (Огиенко и др., 2006). У гетерозигот ТгГ" 2ITrlR8D в яйцевых камерах нарушается процесс миграции фолликулярных и бордюрных клеток. Также выявляется нарушение формирования цитоплазматических актиновых филаментов в питающих клетках. У яиц, отложенных самками Tri*""2/Tri"85, наблюдаются дефекты структуры и расположения дорзальных выростов хориона (Огиенко и др., 2008; Омелина и др., 2011).

2. Анализ экспрессии гена Tri в глазо-антеннальных имагинальных дисках и мозго-вентральных ганглиях предкуколок дрозофилы

Для установления картины экспрессии гена Tri в развивающемся глазу дрозофилы методом Нозерн-блот-гибридизации был проведен анализ гранскриптов данного гена в глазо-антеинальных имагинальных дисках и мозго-вентральных ганглиях 0-часовых предкуколок дикого типа и гетерозигот ТгГ"821Тг1"85 и Tri362/ TriR85. Как показано на рис. 2, в РНК, выделенной из данных органов куколок дрозофил дикого типа (Oregon R), отчетливо выявляются два транскрипта размером 2,5 и 3 т.н. У 7>/-мутантов также выявляются два транскрипта тех же размеров. Однако относительное количество транскриптов гена Tri у мутантов Trl362/TrlRSi и Tri""81/Tri1"10 снижено в 2,5-3 раза по сравнению с нормой (Павлова и др., 2010).

fc Рис. 2. Транскрипция гена Tri у мутантов TrlmITrlm5 и

Я: ^ <?- xv Trl""s2/TrlRSS. Нозерн-блоты содержат суммарную РНК, ¿o \ ^ выделенную из глазо-антеннальных имагинальных дисков и

В d~a б О^ мозго-вентральных ганглиев 0-часовых предкуколок мутантов

Trl362/TrlKS5 (a), Tri'""/Tri™5 (б) и мух дикого типа - Oregon R. g|| При гибридизации блота с !2Р-меченным ДНК-зондом,

щ0 -з о т.н. содержащим константные экзоны гена Tri, выявляются два -2,5 т.н транскрипта размером 2,5 и 3 т.н. Гибридизация с зондом к гену RpLlO используется в качестве контроля нанесения.

Для анализа влияния снижения количества продуктов гена Tri па формирование глаза дрозофилы была исследована поверхность и Ü RpH9 внутренняя структура глаза гетерозигот Tri362/Tri"81

3. Анализ нарушений структуры глаза у //•/-мутантов 3.1. Анализ поверхности глаза

В норме поверхность глаза дрозофилы представляет собой правильно

организованные ряды шестиугольных линз, которые образованы секретом

конусных клеток омматидиев. Вокруг каждой линзы располагаются три механо-

сенсорные щетинки (рис. За, г). У '/'/-/-мутантов отсутствует примерно %

щетинок, тогда как в контроле отсутствие щетинок в должной позиции

наблюдается в 7 раз реже. В анализе не учитывались щетинки вокруг двух рядов

Рис. 3. Нарушения поверхности глаза имаго 7>/-мутантов. а, г - глаз мухи дикого типа. Линзы располагаются ровными рядами На схеме (г, вкладка) показано, что линза имеет форму шестиугольника, в трех вершинах которого располагаются щетинки; б, д - глаз мутанта Trlm81/Trlms\ в, е - глаз мутанта Tri362/ТНт5. (6, в, д, е) В глазах мутантов присутствуют линзы неправильной формы, наблюдается недостаток щетинок, (д, е) Пунктиром отмечено нарушение четкости рядов из линз, вызванное: (д) изменением формы некоторых линз и недостатком одной линзы; (е) внедрением между рядами дополнительных линз. Масштаб: 100 мкм (а-в), 25 мкм (г-е).

линз, находящихся на периферии глаза, поскольку они часто отсутствуют в глазах мух дикого типа (Ready et а/., 1976).

У гетерозигот ТгГ"2/Тг1R85 и Tri362/Tri"85 были выявлены и другие дефекты поверхности глаза, которые ранее не были описаны для 7>/-мутантов. Во-первых, у мутантов наблюдалось нарушение в организации рядов линз (рис. Зд, е). Это может быть вызвано отсутствием некоторых омматидиев и сформированных ими линз, появлением дополнительных омматидиев и линз, внедряющихся между регулярными рядами, а также изменением размера и формы некоторых линз. Во-вторых, было отмечено, что размер глаз у Trl-мутантов несколько меньше, чем у мух дикого типа. Количество линз (омматидиев) в глазах мутантов примерно на 10 % меньше, чем у мух дикого типа Oregon R (Павлова и др., 2010).

Внутренняя структура глаза 7>/-мутантов была проанализирована на поперечных срезах глаз имаго и оптических срезах глазо-антеннальных имагинальных дисков куколок мутантов.

3.2. Анализ полутонких срезов глаз имаго дрозофилы

Т-Г Т 1362ГГ ¡№5 „

При анализе серии полутонких срезов глаз гетерозигот Irl /Irl и Trrn82/TrlRS5 у части омматидиев были выявлены изменения количества и расположения фотонейронов, которые не были отмечены при исследовании Trl-мутантов другими исследователями (табл. 1, с. 13). В норме на каждом срезе глаза во всех омматидиях наблюдается только 7 из 8 фотонейронов (рис. 4а), поскольку тело фотонейрона R7 располагается над клеткой R8. Каждый фотонейрон содержит уплотненную структуру - рабдомер, представляющий собой около 60 тыс. светочувствительных микроворсинок, распределенных на центральной поверхности тела фотонейрона по всей его длине. Рабдомеры внешних фотонейронов R1-R6 образуют трапециевидную структуру, в центре которой располагается меньший по размеру рабдомер фотонейрона R7 (рис. 4а) или R8, в зависимости от глубины среза (Wolff, Ready, 1993). У мух дикого типа аномалий в расположении и количестве фотонейронов выявлено не было (табл. 1).

Oregon R ТгР^/ТгР85 ТгР6г/ТгГ!

' : ........ „.....

у i ' ä l ' В i ШЯШЯШШШШ

шШ д.. -У Jy( ж >< e -" '

Рис. 4. Изменения количества фотонейронов в омматидиях гетерозигот Tri""8''/TrlR8S и Tri162/TriRH\ а - омматидий мухи дикого типа; б-е - омматидии JW-мутантов. Цифрами 1-7 указаны фотонейроны R1-R7, соответственно, (б) Присутствует дополнительный внешний фотонейрон (отмечен звездочкой), (в-д) Недостаток внешних фотонейронов R1-R6. (д, е) наблюдается дополнительный фотонейрон, по расположению и морфологии рабдомера напоминающий R7 (отмечен стрелкой).

У 7>/-мутантов примерно в 2 % омматидиев обнаружено отличное от нормы количество внешних фотонейронов R1-R6 (табл. 1). Чаше встречались омматидии с меньшим (3-5) количеством данных клеток (рис. 4в-д). Иногда в омматидиях наблюдался дополнительный внешний фотонейрон (рис. 46). С частотой менее чем 0,5 % в омматидиях наблюдался дополнительный фотонейрон, по размеру и расположению рабдомера похожий на фотонейрон R7 (рис. 4д, е). Менее чем в 2 % омматидиев 7>/-мутантов рабдомер фотонейрона R7 не выявлялся на одном или нескольких срезах, однако, он чаще всего появлялся на других срезах этой серии. Это свидетельствует о его прерывистости или укорочении.

Впервые у 7>/-мутантов выявлено изменение ориентации омматидиев. В норме омматидии ориентированы так, что трапециевидные структуры из рабдомеров R1-R6 располагаются под углом 90°±20° к экватору - условной горизонтальной линии в середине глаза (рис. 5а, б) (Reifegerste, Moses, 1999; Mirkovic, Mlodzik, 2006). Около 10% омматидиев мутантов TrIe"S2/TrlRS5 и

т 1362 /гг, jR85 ...

Irl /Tri характеризуются отклонением трапециевиднои структуры из рабдомеров R1-R6 более чем на 20° от нормального расположения (Павлова и др., 2010). Данное нарушение продемонстрировано на примере среза глаза мутанта Trl362/TrlR85 (рис. 5в, г).

Рис. 5. Нарушение ориентации омматидиев в глазах TW-мутантов. а - срез глаза мухи дикого типа; в - срез глаза мутанта Trl362/Trlm5\ б, г - схемы, изображающие ориентацию омматидиев на срезах. Линией изображен экватор, относительно которого в дорзальной и вентральной частях глаза омматидии располагаются зеркально. (а, б) В норме трапециевидные структуры из рабдомеров располагаются под углом 90°±20° к горизонтали, отмечены черным, (в, г) У мутантов Trl362/TrlRSS в некоторых омматидиях трапециевидные структуры из рабдомеров отклоняются от нормального положения, отмечены пунктиром. Кругом обозначен омматидий с нарушением числа рабдомеров.

Иногда наблюдалось сильное отклонение, практически поворот на 180° (рис. 5г), что свидетельствует о нарушении процесса ротации кластера фотонейронов, в норме происходящем в глазо-антенналытом диске (Mirkovic, Mlodzik, 2006).

3.3. Анализ глазо-антеннальных имагинальных дисков 7>/-мутантов

Для изучения влияния гена Tri на структуру и распределение конусных и пигментных клеток были проанализированы оптические срезы глазо-антеннальных имагинальных дисков куколок 7>/-мутантов на стадии 42 часа после окукливания. К этому моменту все клетки глаза занимают свои окончательные позиции. В норме в вершине омматидия выявляются 4 конусные клетки, окруженные двумя первичными пигментными клетками одинакового размера (рис. 6а). Вокруг них располагаются 6 вторичных пигментных клеток, образуя гексагональную ячейку. В каждой из шести вершин этой структуры лежит одна третичная пигментная клетка или механо-сенсорная щетинка (Cagan, Ready, 1989).

При анализе дисков гетерозигот Tri ITrlR85 и TrlcnS2ITrl,№5 были выявлены как нарушения в количестве всех типов пигментных клеток и щетинок, описанные ранее у 7>/-мутантов (Dos-Santos et al., 2008), так и новый тип нарушений - изменение количества и расположения конусных клеток (Павлова и ДР., 2010).

Часть омматидиев (~ 3 %) анализируемых 7У/-мутантов содержит отличное от 4-х количество конусных клеток (табл. 1). Чаше встречались омматидии, в которых было 3 конусные клетки, в некоторых омматидиях их было 2 или 5 (рис. 6д, е). С частотой около 1 % в омматидиях наблюдалось отличное от нормы расположение конусных клеток. Изменялась ориентация контактов между этими клетками и сами контакты, в частности, одна из клеток могла значительно сократить контакт с соседней конусной клеткой (рис. 6ж, з).

ш ® у- ш V ГУ-М , W/r\ л \ fy ^ ' > (

Í > ? , л <■ ta ' Т 1,1 т к ' \ 4 ж* V h X ¿ « rJ /ГХ -K. 41 v-i ) Xjr A. 1 y av^c -/ Vj ♦ 4 ш i' '"V i J f s 'tbpC^ v

Рис. 6. Нарушения количества и расположения конусных и первичных пигментных клеток у гетерозигот TrlmS2/TrlRSS и Trl Ш/7г1!ш5. (а) Схема расположения клеток на апикальной поверхности глазо-антеннального имагинального диска 42-х часовых куколок дрозофилы дикого типа. Коричневым цветом отмечены 4 конусные клетки (КК), сиреневым - 2 первичные пигментные клетки (ППК), голубым - вторичные пигментные клетки, желтым - третичные пигментные клетки, зеленым - щетинки, (б-з) Омматидии 7>/-мутантов. В них присутствуют: (б) дополнительная ППК; (в) всего одна ППК; (г) 2 ППК неодинакового размера со смещенными контактами; (д) 3 КК; (е) 5 КК; (ж) 4 КК с измененной ориентацией контактов; (з) 4 КК с нарушением контактов между ними. Окрашивание антителами к белку Armadillo (Arm).

У гетерозигот Trl362/TrlR85 и Trlen82ITrlR85 около 2 % омматидиев содержат отличное от нормы количество первичных пигментных клеток. Чаще встречались омматидии с тремя такими клетками, иногда - с одной (рис. 66, в). В некоторых омматидиях (<0,6 %) первичные пигментные клетки различались по размеру. Это сопровождалось отклонением одного или обоих контактов между этими клетками от нормального расположения (рис. 6г).

У анализируемых Trl -мутантов часто изменено количество и других пигментных клеток (вторичных и третичных), окружающих омматидии (рис. 7). В норме в области между омматидиями, ограниченной тремя щетинками, лежат 4 пигментные клетки. У гетерозигот Trl362/TrlR85 и Trlen82/TrlR85 с частотами 43 и 29 %, соответственно, вместо 4 присутствовало 5 или 6 пигментных клеток (просмотрено, соответственно, 277 и 181 область). В норме избыток предшественников этих клеток удаляется апоптозом. По литературным данным у мутантов Trl130 снижена доля апоптирующих предшественников пигментных клеток (Dos-Santos et al., 2008).

У мутантов Trl362/TrlR83 и ТгГп82/Тг1к85 на поверхности глаза наблюдается нарушение распределения щетинок, окружающих омматидии. При анализе глазных дисков 42-часовых куколок было выявлено, что у Trl -мутантов на месте щетинки часто располагается третичная пигментная клетка, а иногда на месте третичной пигментной клетки располагается щетинка (рис. 7в, г).

гг. г* т i еп82 rrr i R85 т. 1362 /rj. , R85

1аким образом, у гетерозигот Jrl /Jrl и Irl /jrl ,

характеризующихся снижением экспрессии гена Trl, выявлены разнообразные дефекты в структуре глаз. Впервые у Trl-мутантов отмечены нарушения количества и расположения фотонейронов и конусных клеток. Вероятно, эти нарушения не были выявлены другими исследователями (Dos-Santos et al., 2008)

Рис. 7. Нарушение распределения пигментных клеток и щетинок вокруг омматидиев Tri-мутантов. Фотографии оптических срезов верхней поверхности глазо-антеннапьных имагинальных дисков 42-х часовых куколок: (а) дикого типа; (в) мутантов Tri'" 2/Trlms. Схемы расположения пигментных клеток (ПК) и щетинок в глазо-антеннальных дисках, представленных на фотографиях: (б) в норме; (г) у мутантов, (а, б) В норме между тремя щетинками лежат 3 вторичные ПК и 1 третичная ПК, отмеченные на схеме синим и желтым цветом, соответственно, (в, г) У 7>/-мутантов присутствуют дополнительные ПК, на схеме они отмечены красным цветом. У мутантов наблюдаются нарушения в распределении щетинок и третичных ПК. На месте щетинки часто располагается третичная ПК (отмечено широкой стрелкой), а иногда на месте третичной ПК располагается щетинка (черная стрелка). Иногда рядом со щетинкой присутствует дополнительная щетинка (белая стрелка). Окрашивание антителами к белку Arm.

из-за того, что у используемых ими мутантов и мозаиков уровень экспрессии гена Tri снижен меньше, чем у мутантов, исследованных в данной работе. Для мутантов Tri130 (несущих встройку транспозона Р (bluetail) во втором интроне гена) существуют лишь данные о качественном снижение экспрессии гена Tri в яичниках, где дополнительно выявляется и аберрантный транскрипт (Bhat et ai, 1996; Катохин и др., 2001). Для аморфной мутации Tri8", полученной с помощью этилметансульфоната (Greenberg, Schedl, 2001), вообще нет данных о вызываемом ею нарушении кртины транскрипции гена Tri. В статье Дос-сантоса и соавторов также нет доказательств полного отсутствия белка GAGA в клетках Tri8"/Tri8". Не исключено, что в этих клетках синтезируется некоторое количество белка и/или в них сохраняется белок GAGA, полученный от гетерозиготных клеток-предшественниц.

Большая часть описанных выше нарушений (недостаток конусных и первичных пигментных клеток, изменение количества внешних фотонейронов R1-R6 и фотонейронов R7, избыток вторичных и третичных пигментных клеток и недостаток щетинок вокруг омматидиев) характерна для мутантов по гену lz (Batterham et al., 1996; Crew et al., 1997; Wildonger et al., 2005). Это может говорить о том, что недостаток транскрипционного фактора GAGA сказывается на уровне экспрессии гена lz. В пользу того что, данный ген может являться мишенью белка GAGA, свидетельствует также тот факт, что мутация Tri'"82 была выявлена как энхансер проявления фенотипа температуро-чувствительной мутации fe"'. В то время как у мутантов lz'sl, выращенных при 25°С,

(si гг. ten82/,

\lrl /+

при тех же условиях выращивания были отмечены значительные нарушения (М.А. Волошина, персональное сообщение).

4. Взаимодействие генов Trithorax-like и lozenge В данной работе продемонстрировано, что проявление мутации lz'sl при 25°С значительно усиливается на фоне гипоморфпых аллелей Tri""82 или Tri362 в гетерозиготе с нуль-аллелем TrlR8S. У «двойных» мутантов lz's'\Trl362/TrlR81 и lz"'\Trlen82ITrlRSS на заднем краю глаза большинство линз имеет ненормальную форму и/нли размер (рис. 86, г. ж, и), тогда как у мутантов lz"', выращенных при 25°С, так же как у 7У/-мутаитов, в этом районе лишь некоторые линзы характеризуется такими нарушениями (рис. 3, рис. 8а, е).

Для уточнения того, что именно недостаток белка GAGA приводит к

i Is I гг, i 362 irr iRS5

сильному нарушению структуры глаз мутантов lz ;Trl /Irl и Ь"';ТгГп821Тг1Н85, были проведены эксперименты по «спасению фенотипа» данных мутантов. В их геном с помощью генетических скрещиваний были введены две копии трансгена hsp83.Trl-519, обеспечивающего наработку белка GAGA-519 в большинстве клеток дрозофилы при комнатной температуре (Greenberg, Schedl, 2001). Введение трансгенов привело почти к полному восстановлению нормальной поверхности глаз мутантов (рис. 8в, д, з, к) (Павлова, Карагодин, 2009).

tf" lzK';Trfa!/Trl"s5 U"S19:7tr*>mfm lz"'Jrfi^/Tif86 ti*i.-51B;Tri*a/Tif*

Рис. 8. Усиление проявления мутации к" на фоне мутаций по гену Tri и «спасение фенотипа»

мутантов lz Y,Trl /Tri и кш!Т,ТгГ2/ТгГ\ Фотографии глаз самцов: (а, е) I: У; (б. ж) Iz"1 Y,Trl",82/TrlR8s: (в, з) lz"'/Y; 519; ТгГв2/Тг1т5\ (г, и) lz"' Y,Tri3"/Tri™5; (д, к) lz"',Y, 519; Tri362/TriR8S. 519 - трансген hspS3:Trt-S19. экспрессирующий белок GAGA-519. (б, ж, г, и) На заднем краю глаз «двойных» мутантов многие линзы имеют ненормальную форму и размер, наблюдаются слитые (белая стрелка) и плохо сформированные линзы (черная стрелка), (в, з, д, к) «Спасение фенотипа» мутантов lza'/Y-,Trl'""lTHms и k"'/YJrl3i2ITrlm5-. введение в их геном двух копий трансгена hsp83:Trl-519 приводит к формированию поверхности глаза, характерной для одиночных мутантов к"'. Масштаб: 100 мкм (а д), 25 мкм |е к).

Было выявлено, что на фоне мутаций гена Tri происходит усиление фенотипа и другой гипоморфной мутации гена 1z - lzK. У «двойных» мутантов кK/Y\Tri362/Tri1183 и lzK/Y\TrT"82/TrlR85 значительно уменьшен размер глаза и сильнее изменена поверхность глаза, по сравнению с мутантами по одному из генов. Введение двух копий трансгена hsp83:TrI-519 в геном «двойных» мутантов приводит к формированию глаз, характерных для мутантов lzK.

Для более детального исследования взаимодействия генов Tri и lz был проведен анализ внутренней структуры глаз мутантов lz'sl и «двойных» мутантов lz'sl\Tri362ITrlR85 и lz'";ТгГ82/Tri"85.

4.1. Анализ внутренней структуры глаз у /г" и «двойных» мутантов

1гК,-,Тг1362/Тг1'"" и 1г""-,ТгГ"2/ТгГ5 В литературе не было детального описания внутренней структуры глаз «слабых» ¿-мутантов, в том числе, и мутантов Ь" , развивающихся при 25°С. В результате данной работы у этих мутантов были выявлены те же нарушения, что и у 7>/-мутантов (табл. 1) (Павлова, Карагодин, 2009). Нарушение ориентации омматидиев и наличие дополнительных первичных пигментных клеток для /г-мутантов были выявлены впервые. По-видимому, у исследованных «сильных» мутантов по гену к данные нарушения маскируется другими, более явными дефектами.

У «двойных» мутантов Ьш;Тг1362/Тг1К85 и кК1;ТНеп82/Тг1"83 встречаемость большей части структурных нарушений омматидия оказалась достоверно выше, чем у к"'- и 7>/-мутантов (табл. 1). Исключением стали такие нарушения, как

избыток фотонейронов R1-R6 и наличие дополнительного фотонейрона R7. К наиболее ярким нарушениям относятся: изменение ориентации омматидия (2535 %); уменьшение количества конусных клеток (19-23 %); недостаток числа внешних фотонейронов R1-R6 (7-12%); изменение непрерывности или длинны рабдомера фотонейрона R7 (4-8 %).

Наличие генетического взаимодействия между генами lz и Tri может свидетельствовать о том, что белок GAGA участвует в регуляции экспрессии гена fe. Для проверки данного предположения был проведен анализ экспрессии гена lozenge у 7>/-мутантов.

Таблица 1. Нарушения внутренней структуры глаз мутантов по генам fe и Tri

Тип нарушения Встречаемость нарушений у мух следующих генотипов, (%)

+/У; Tri162/Tri™5 +/У; ТгГ82/ТгГ5 h"'¡Y, И"3®" fa "'/У, ТгГ"2/Тг1т5 fe "'/У; +/+

Недостаток внешних фотонейронов 1,7±0,4аш 0,9±0,3ЬЬЬ 5,0±0,9ССС 12,l±l,6ddd 0,8±0,3

Избыток внешних фотонейронов 0,2±0,1а 0,7±0,3ЬЬЬ 0,7±0,4 1,2±0,5 0±0,1

Дополнительный фотонейрон Ю 0,5±0,2аа 0,1 ±0,1 1,1 ±0,4 3,3±0,9ddd 0,1±0,1

Отсутствие рабдомера К 7 на срезе 0,4±0,2аа 2,2±0,5ЬЬЬ 3,9±0,8ССС 7,6±l,3ddd 0,4±0,2

Изменена ориентация омматидия 11,7±1,0ааа 7,3±1,0ЬЬЬ 25,6±2,2ССС 35,7±3,0ddd 9,1±1,1

Просмотрено омматидиев (глаз) у имаго на срезах: 762 (4)

1107(7) 967(5) 561(5) 422(6)

Уменьшено число конусных клеток 4,3±0,4ааа 2,6±0,3ЬЬЬ 23,1±1,3ССС 19,0±0,8ddd 2,0±0,3

Изменена ориентация контактов между конусными клетками 0,8±0,2ааа 0,4±0,1ЬЬЬ 11,2±1,0ССС 4,4±0,4ddd 2,4±0,3

Нарушены контакты между конусными клетками 0,2±0,1 0,4±0,1 8,4±0,8ССС 3,0±0,4ddd 0,6±0,2

Изменено количество первичных пигментных клеток 2,4±0,Зааа 1,4±0,2ЬЬЬ 7,7±0,8ССС 3,0±0,4ddd 0,6±0,2

Изменен размер первичных пигментных клеток 0,6±0,2ааа 0,2±0,1Ь 5,9±0,7ССС 3,l±0,4ddd 1,4±0,3

Просмотрено омматидиев (дисков) куколок: 2679(16) 2841 (12) 1094(9) 2354(15) 2085 (11)

Примечание. У мух Oregon R (контроль) нарушения количества и расположения фотонейронов не выявлены (просмотрено 905 омматидиев, 5 глаз). У них наблюдались лишь изменение контактов между конусными клетками (0,2±0,1 %) и изменение количества первичных пигментных клеток (0,3±0,2 %) (просмотрено 1027 омматидиев, 15 дисков). Показана достоверность различий между частотами нарушений: (а) у мутантов Tri162/Tri и у мух Oregon Ä; (b) у мутантов Tri"""2/Tri""5 и у мух Oregon R, (с) у мутантов fa'"/У; Trl3e2/Trlms и fc-'/У; (d) у мутантов lz's'/YJrrs2/Trl,as и fa'"/y.

Достоверность различий определялась с помощью критерия Фишера, ааа - Р>0,999; аа - Р>0,99, а - Р> 0,95. Аналогично для Ь, с, d.

4.2. Анализ экспрессии гена lozenge у гетерозигот Tri362/ТrlRSS и Trle"S2/TrlR8S

Для анализа экспрессии гена lz в глазо-антеннальных имагинальных дисках 7)7-мутантов были использованы Нозерн-блот-гибридизация, ОТ-ГЩР и Вестерн-блот-анализ. Чувствительности первых двух методов в нашем случае оказалось недостаточно для выявления продуктов гена lz. Методом Вестерн-блот-гибридизации удалось сравнить количество белка Lz в имагинальных дисках белых предкуколок мух дикого типа и мутантов по гену Tri. Было

... i еп82 /гг. i R85 j362it lR85

установлено, что у мутантов Tri /Tri и Tri Url относительное количество белка Lz снижено до уровня 50 и 80 % от нормы, соответственно (рис. 9). Как видно на приведенной фотографии, белок Lz в клетках глазо-антеннальных имагинальных дисков представлен в виде двух основных изоформ. Молекулярный вес этих изоформ, определенный нами по электрофоретической подвижности, составляет приблизительно 75 и 82 кДа, эти значения близки к предсказанному молекулярному весу двух известных изоформ белка Lz (73.2 и 84.7 кДа).

Рис. 9. Результаты иммуно-блот гибридизации антител против

Or Tri"1*2 Trlm ст е . " белка Lz с белковыми экстрактами из глазо-антеннальных

имагинальных дисков предкуколок дрозофилы следующих

генотипов: OregonR, Tri'"82ITrlRas и Trl3"/TrlRSS Отмечено

положение белка BSA, молекулярный вес которого составляет

66 кДа. Во всех образцах выявляется по два сигнала,

соответствующие двум известным изоформам белка Lz. Внизу

__ ^^ Lozenge представлена гибридизация этого же блота с антителами

— I^P ^ * против белка ß-Tub, используемого в качестве внутреннего

66 kDa — контроля.

IjHI *m mm ß-iut Таким образом, у 7>/-мутанов,

характеризующихся снижением экспрессии гена Tri в развивающемся глазу, выявлено значительное снижение количества белка Lz. Это свидетельствует о том, что в норме транскрипционный фактор GAGA вовлечен в положительную регуляцию экспрессии гена lz.

5. Генетическое взаимодействие генов Tri и BarHl

Вероятно, действие белка GAGA в развитии глаза может также заключаться и в негативной регуляции экспрессии гена BarHl. Об этом свидетельствует усиление эффекта, вызываемого сверхэкспрессией данного гена - дупликацией В', на фоне 7>/-мутации. Глаз гетерозигот В'/+ содержит в среднем 350 омматидиев, что примерно вдвое меньше, чем в норме. У мух, гомозиготных или гемизиготных по мутации В1, формируется узкий глаз, уменьшенный в передне-заднем направлении, состоящий из ~ 90 омматидиев (Kojima et al., 1991). Глаза дигетерозигот В l+;Trl362/TrlR8S и В1 l+;TrlenS2/TrlR85 по форме и размеру такие же, что и у гомозигот В1. Кроме уменьшения размера глаза, у дигетерозигот почти полностью отсутствуют щетинки, в норме располагающиеся вокруг омматидиев, что отличает их от глаз мутантов В1 (рис. 10).

Фенотип мутантов В1 связан с замедлением и остановкой продвижения морфогенетической бороздки - своеобразной подвижной границей между

Рис. 10. Усиление проявления мутантного фенотипа дупликации В' гена BarHl на фоне му таций по гену Tri. (а) Глаз самки В'/+. (б) Глаз самки В'В'. (в) Глаз самки В1 •; Гг1а82/Гг1т-\ Масштаб: 100 мкм.

недифференцированными клетками глазного диска и формирующимися омматидиями (Kojima el al., 1991). Об участии белка ОАОА в контроле продвижения морфогенетической бороздки посредством подавления экспрессии гена BarHl либо посредством регуляции экспрессии других генов, задействованных в данном процессе, может свидетельствовать нарушение формирования регулярных рядов омматидиев, наблюдаемые нами у Trl-мутантов.

6. Анализ связывания рекомбинантного белка GAGA с последовательностями в 5'-областях генов lz и BarHl

В 5'-областях генов lz и BarHl нами были выявлены потенциальные сайты связывания белка GAGA, что может быть свидетельством того, что уровень экспрессии этих генов напрямую регулируется данным белком. Консенсусным сайтом для белка GAGA является последовательность GAGAG (Omichinski et al., 1997). В 5'-области гена lz был обнаружен G/1-богатый участок —

agaaGAGcaaGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG, расположенный в районе -281--

251 п.н. относительно старта транскрипции гена. В 5'-области гена BarHl

выявлен сайт gaaaccgggGAGAGACtttatttca, расположенный в районе -319--295

п.н. относительно старта транскрипции данного гена. Методом задержки ДНК-зонда в геле было подтверждено связывание рекомбинантного белка GAGA с данными последовательностями (рис. 11).

Заключение

Снижение экспрессии гена lz на фоне недостатка продуктов гена Trl и результаты in vitro связывания белка GAGA с сайтом из 5'-области гена lz говорят о возможности непосредственного участия GAGA-белка в активации данного гена. Мы полагаем, что снижение количества белка Lz является основной причиной изменений структуры глаз 7W-мутантов. В пользу данного предположения свидетельствует тот факт, что многие нарушения в глазах Tripue. 11. Связывание рекомбинантного белка GAGA с олигонуклеотидами: (1) 5'-tlGGCATAGAGAGGGAGAGAGGCGTCA-V, включающим сайт из района bxd гена Ultrabithorax - положительный контроль (Horard et al., 2000); (2) (TTTG)6 - отрицательный контроль;

(3) У-ttAGAAGAGCAAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG-У, включающим сайт из 5'-области гена lz,

(4) У-ttGAAA CCGGGGA GA GACTTTA ТТТСА-Ъ', включающим сайт из 5'-области гена BarHl.

мутантов и мутантов lz"' схожи и значительно усиливаются у «двойных» мутантов. Снижение количества транскрипционного фактора Lz может сказываться на картине экспрессии ряда генов, задействованных в формировании глаза. К таким генам относятся sparkling, prospero, seven-up и BarHl, кодирующие транскрипционные факторы (Daga et al., 1996; Flores et al., 2000; Xu et al., 2000). Недостаток белка Lz может также влиять на действие EGFR/Rasl -сигнального пути, поскольку данный белок взаимодействует с его ядерным эффектором — транскрипционным фактором Pointed, и активирует в некоторых клетках гены argos и klumpfuss, кодирующие негативные регуляторы данного каскада (Behan et al., 2005; Wildonger et al., 2005). Известно, что EGFR/Rasl-каскад задействован в запуске дифференцировки фотонейронов, конусных и пигментных клеток, в установлении ориентации омматидия, а также в блокировке клеточной смерти (Freeman, 1997; Bergmann et al., 1998; Gaengel et al., 2003).

Еще одним геном-мишенью белка GAGA, участвующим в развитии глаза, по-видимому, является ген BarHl, на что указывает наличие генетического взаимодействия между генами Tri и BarHl, а также связывание рекомбинантного белка GAGA с сайтом в 5'-области гена BarHl.

ВЫВОДЫ

1) Проведен молекулярно-генетический анализ новой гипоморфной мутации гена Trithorax-like - аллеля ТгГ"82. Установлено, что данная мутация обусловлена встройкой делеционного варианта /"-элемента размером 1,4 т.п.н. в 5'-некодирующую область гена Tri и делецией 6 п.н. в шестом экзоне гена. Делеция удаляет два глутаминовых кодона в последовательности, кодирующей глутамин-богатый домен изоформы белка GAGA-581.

2) Выявлено снижение экспрессии гена Tri в глазо-антеннальных имагинальных дисках и мозго-вентральных ганглиях у гетерозигот Tri /Tri 5 и Trl362ITrlR8S. Относительное количество транскриптов у этих мутантов в 2,5-3 раза меньше, чем в норме.

3) Впервые показано, что ген Tri задействован в контроле формирования фотонейронов и конусных клеток омматидия, в установлении ориентации омматидиев и в формировании рядов омматидиев.

4) Выявлено взаимодействие гена Tri с генами lz и BarHl в процессе формирования глаза:

а) на фоне мутаций гена Tri усиливается проявление мутаций генов lz и BarHl, влияющих на структуру поверхности глаза, а также на его размер и форму;

б) у мутантов lz'sl;TrienS2/TrlRS5 и lz'"-,Tri362/Tri"85, по сравнению с fe"'- и 7>/-мутантами, значительно выше доля омматидиев с меньшим количеством фотонейронов или конусных клеток, а также омматидиев с измененной ориентацией.

) Обнаружено, что на фоне снижения экспрессии гена Tri происходит снижение количества белка Lz в глазо-антеннальных имаганалышх дисках 0-часовых предкуколок гетерозигот ТгГ"82/Тг1т и Trl362/TrlR85. ) Установлено, что рекомбинантный белок GAGA in vitro связывается с сайтами, выявленными в 5'-областях генов lz и BarHl.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

. Огиенко A.A., Карагодин Д.А., Павлова (Баттулнна) Н.В., Федорова С.А., Волошина М.А., Баричева Э.М. Молекулярно-генетическая характеристика новой гипоморфной мутации гена Trithorax-like и анализ ее влияния на оогенез Drosophila melanogaster // Онтогенез. 2008. Т. 39 № 2. С. 134-142.

Павлова Н.В., Карагодин Д.А., Байбородин С.И., Баричева Э.М. Анализ структуры глаза мутантов по гену Trithorax-like Drosophila melanogaster II Информационный вестник ВОГиС. 2010. Т. 14. № 3. С. 558-568. Омелина Е.С., Павлова Н.В., Огиенко A.A., Баричева Э.М. Для формирования дорзальных выростов хориона Drosophila melanogaster требуется белок GAGA // Доклады Академии наук. 2011. Т. 436. № 5. С. 696-698.

Павлова Н.В. Молекулярно-генетическая характеристика нового пшоморфного аллеля гена Trithorax-like Drosophila melanogaster и анализ его взаимодействия с геном lozenge II Материалы XLIV международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс»: Биология / Новосибирск: Новосибирский государственный университет. 2006. С. 132.

Павлова Н.В., Карагодин Д.А. Анализ влияния нового гипоморфного аллеля гена Trithorax-like (TrienS2) на структуру глаза и оогенез Drosophila melanogaster II Проблемы молекулярной и клеточной биологии: Сб. матер. Международной молодежной научно-методической конференции. 9-12 мая 2007 г. / Томск: Томский государственный университет. 2007. с. 135. Павлова Н.В., Карагодин Д.А. Анализ влияния мутаций по гену Trithorax-like на формирование глаза Drosophila melanogaster II V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва. 21-28 июня 2009. Часть И. М.: ИОГен им. Н.И. Вавилова. С. 381.

Подписано к печати 12.04.2012 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16 Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7 Тираж 110 экз. Заказ № 36

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Баттулина, Надежда Викторовна, Новосибирск

61 12-3/992

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

НАУКИ

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

БАТТУЛИНА НАДЕЖДА ВИКТОРОВНА

ВЛИЯНИЕ ГЕНА ТШТНОйАХ-иКЕ НА ФОРМИРОВАНИЕ ГЛАЗА ОРЮБОРНИА ¡\HELANOGASTER

Генетика - 03.02.07

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук Баричева Элина Михайловна

Новосибирск

2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ____5

ВВЕДЕНИЕ____6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ______11

1.1. Структура глаза дрозофилы_._.___11

1.2. Развитие глаза дрозофилы__._13

1.2.1. Формирование и продвижение морфогенетической бороздки_15

1.2.2. Дифференцировка клеток омматидия______17

1.2.2.1. Индуктивные взаимодействия, обеспечивающие последовательную дифференцировку клеток омматидия____

1.2.2.2. Гены, требующиеся для дифференцировки клеток омматидия_21

1.3. Молекулярно-генетическая характеристика гена lozenge D. melanogaster_26

1.3.1. Гены-мишени белка Lz, участвующие в развитии глаза дрозофилы_29

1.3.2. Фенотипическое проявление мутаций гена lz_.__31

1.3.3. Регуляция экспрессии гена h ______34

1.4. Молекулярно-генетическая характеристика гена Trithorax-like (Tri)_35

1.4.1. Структура гена Tri _.______35

1.4.2. Транскрипция гена Tri________37

1.4.3. Структура белка GAGA, продукта гена Tri___________38

1.4.4. Функции белка GAGA_.____40

1.4.4.1. Участие белка GAGA в ремоделировании структуры хроматина_41

1.4.4.2. Участие белка GAGA в активации транскрипции____43

1.4.4.3. Участие белка GAGA в подавлении активности генов __45

1.4.4.4. Белок GAGA требуется для функционирования инсуляторов_46

1.4.5. Белковые взаимодействия GAGA-фактора_;__—-—-47

1.4.6. Участие белка GAGA в процессе формировании глаза дрозофилы_49

Заключение__________52

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ____54

2.1. Линии Огозорк'йа melanogaster, использованные в работе, и условия их разведения-------

54

2.2. Выделение ДНК____54

2.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)____55

2.4. Олигонуклеотиды____

55

2.5. Секвенирование с использованием набора для секвенирования ABI PRISM BigDye Terminator Ready Mix______56

2.6. Электрофорез ДНК в агарозном геле_.__57

2.7. Набор материала для выделения РНК__57

2.8. Выделение РНК____.___57

2.9. Получение 32 Р-меченых ДНК-зондов____58

2.10. Нозерн-блот-гибридизация __—58

2.11. ПЦР с использованием обратной транскрипции (ОТ-ПЦР)___59

2.12. Вестерн-блот-анализ____

2.13. Метод задержки ДНК-пробы в геле___

60

2.14. Иммунохимическое окрашивание имагинальных дисков___61

2.15. Приготовление полутонких срезов глаз дрозофилы__62

2.16. Микроскопический анализ____

62

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ_.___63

3.1. Молекулярная и цитогенетическая характеристика мутации Triеп82.-63

3.2. Анализ экспрессии гена Tri в глазо-антеннальных имагинальных дисках и мозго-вентральных ганглиях предкуколок дрозофилы_.___65

3.3. Анализ нарушений структуры глаза у 7У/-мутантов__66

3.3.1. Анализ поверхности глаза______66

3.3.2. Анализ полутонких срезов глаз имаго дрозофилы____69

3.3.3. Анализ глазо-антеннальных имагинальных дисков 7У7-мутантов-_72

3.4. Взаимодействие генов Trithorax-like и lozenge____78

, . 7 ^l.rpi362iT iR85 ,_,tsl.T jen82/T iR85 70

3.4.1. Анализ поверхности глаз мутантов lz ;Trl Url и lz ,lri uri -/0

3.4.2. Анализ срезов глаз имаго мутантов lztsl и «двойных» мутантов lztsl;Trl362/TrlR85

и lzts!; Triеп821 TriRS5____82

3.4.3. Анализ структуры глазо-антеннальных имагинальных дисков мутантов lztsl и

/ tsl гт, 1362/rpfR85 itsl.T ,еп82,т jR85 C¿¡

«двойных» мутантов fe ;7>/ /Tri и lz Arl Url --ou

3.5. Генетическое взаимодействие генов Tri и BarHl----90

3.6. Анализ связывания рекомбинантного белка GAGA с последовательностями из 5'-областей генов lz, BarHl и ВагН2-...---91

3.7. Анализ экспрессии гена lz у мутантов Tri362/TriR85 и Trlen82/TrlR85-—93

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ___95

4.1. Мутации гена Tri приводят к нарушению структуры омматидиев и организации глаза дрозофилы_______95

4.2. Взаимодействие генов Trithorax-like и lozenge ___—96

4.2.1. Снижение белка Lozenge у Гг/-мутантов ____97

4.3. Нарушения в структуре глаз 7У/-мутантов___—

4.3.1. Причины нарушения количества и распределения конусных клеток у Trl-

мутантов

101

4.3.2. Причины нарушения количества фотонейронов у Гг/-мутантов_103

4.3.3. Особенности формирования рабдомера фотонейрона R7 у мутантов по генам Tri

104

и к_______

4.3.4. Причины нарушения количества пигментных клеток у 7У/-мутантов_105

4.3.5. Недостаток щетинок вокруг омматидиев 7>/-мутантов_-—107

4.3.6. Причины нарушения ориентации омматидиев у 7>/-мутантов_107

4.3.7. Причины нарушения четкости рядов из омматидиев у Гг/-мутантов_108

Заключение ____

ВЫВОДЫ

111 115

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

DTT - дитиотреитол (dithiothreitol);

SDS - додецилсульфат натрия (sodium dodecyl sulphate);

Tri — Trithorax-like;

Iz - lozenge\

ДМСО - диметилсульфоксид;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

МБ - морфогенетическая бороздка;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота;

п.н. - пар нуклеотидов;

ПК - пигментные клетки;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с использованием обратной транскрипции;

т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов;

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Изучение генетических систем, контролирующих формирование тканей и органов многоклеточного организма, является одним из основных направлений современной генетики развития. Особое значение имеет не только анализ отдельных генов, но и выявление групп генов, скоординировано действующих в процессах клеточной дифференцировки и установлении пространственно упорядоченной организации клеток. Развитие глаза дрозофилы является удобной модельной системой для подобного рода исследований. Этот процесс имеет ряд общих черт с развитием глаза позвоночных, а многие гены и сигнальные пути, вовлеченные в формирование глаза дрозофилы, являются эволюционно-консервативными (Kumar, 2009). Данные, касающиеся генетического контроля формирования глаза дрозофилы, имеют общебиологическое значение и могут быть использованы для выяснения общих закономерностей органогенеза и у других видов, для которых применение генетических и цитогенетических методов исследования в условиях in vivo имеет значительные ограничения.

Сложный глаз дрозофилы состоит из 700-800 повторяющихся функциональных единиц - омматидиев, образованных клетками нескольких типов. Каждый омматидий состоит из 8 фоторецепторных нейронов (фотонейронов R1-R8), 4-х конусных клеток, секретирующих линзы, и 2-х первичных пигментных клеток. Вокруг омматидиев располагаются вторичные и третичные пигментные клетки, а также механо-сенсорные щетинки (Wolff, Ready, 1993). Формирование глаза дрозофилы является сложным многоэтапным процессом, каждая стадия которого контролируется множеством генов. К настоящему времени хорошо изучена роль сравнительно небольшого их числа, в частности, определены и изучены ключевые гены, ответственные за дифференцировку клеток, формирующих омматидий (Voas, Rebav. 2004). Роль других генов в формировании глаза изучена слабо, хотя есть данные о том, что мутации в них приводят к нарушению структуры глаза (Call et al., 2007). К числу таких генов относится ген Trithorax-like (Trl), кодирующий транскрипционный фактор GAGA. Этот эволюционно-консервативный белок у дрозофилы принимает участие в формировании «открытой» конформации хроматина в различных

регуляторных элементах, задействованных в регуляции транскрипции (Farkas et al., 2000; Lehmann, 2004; Mito et al., 2007; Deal et al., 2010; Matharu et al., 2010).

Нарушения поверхности глаза были обнаружены у Trl "с-мутантов (Farkas et al., 1994) и генетических мозаиков по аллелю Trls2325 (Cali et al., 2007). В дальнейшем в глазах Trl ^-мутантов было выявлено наличие дополнительных вторичных и третичных пигментных клеток и недостаток щетинок вокруг омматидиев. Подобные

rp 181.1

дефекты наблюдались и у генетических мозаиков, гомозиготных по аллелю írl , у которых дополнительно были обнаружены изменения количества и формы первичных пигментных клеток (Dos-Santos et al., 2008). Необходимо отметить, что интерпретацию полученных авторами результатов затрудняет отсутствие данных об изменении количества продуктов гена Trl в развивающемся глазу мутантов и генетических мозаиков, используемых в перечисленных работах. Поскольку механизмы нарушений структуры глаза у 7>/-мутантов выявлены не были, вопрос о роли транскрипционного фактора GAGA в процессе формирования данного органа остается открытым.

Вероятно, белок GAGA вовлечен в регуляцию экспрессии генов, задействованных в развитии глаза дрозофилы. Результаты исследований связывания белка GAGA с последовательностями ДНК генома дрозофилы свидетельствуют о том, что к его потенциальным мишеням относится более 600 генов (van Steensel et al., 2003, 2010; de Wit et al., 2008; Schuettengruber et al, 2009). Однако экспериментально доказано участие белка GAGA в контроле экспрессии не более 10 генов, среди которых нет генов, участвующих в формировании глаза. Для выявления генов-мишеней белка GAGA, необходимых для нормального развития глаза дрозофилы, предпочтителен анализ морфологии глаз 7>/-мутантов. Результаты анализа клонов клеток, гомозиготных по аморфным 7/7-мутациям, которые обычно составляют лишь небольшую часть глазо-антеннального имагинального диска, могут не отражать нарушения всех процессов, в которые вовлечен белок GAGA. Возможно также, что данный белок участвует в регуляции экспрессии генов, продукты которых секретируются, в таком случае гомозиготные по Г/7-мутации клетки могут не демонстрировать некоторых нарушений, поскольку они получают секретируемые белки от окружающих клеток, не содержащих мутацию.

Среди аллелей гена Tri, доступных в мировых коллекциях, нет хорошо охарактеризованных мутаций, которые значительно нарушают структуру глаза жизнеспособных мутантов. Нами были получены и описаны две новые гипоморфные мутации - Tri362 и Triеп82 (Огиенко и др., 2006, 2008), оказывающие такое действие на поверхность глаза. Одна из них - Trlen82, была охарактеризована в ходе данной работы. Эти мутации, приводящие к значительному снижению экспрессии гена Tri, дают уникальную возможность выявить весь спектр изменений структуры глаз 7W-мутантов и определить потенциальные гены-мишени белка GAGA, задействованные в развития глаза дрозофилы. По нашим предварительным данным к таким генам могут относиться lozenge (lz) и BarHl. Данные гены кодируют эволюционно-консервативные транскрипционные факторы, которые участвуют в контроле нескольких процессов в ходе формировании глаза дрозофилы (Higashijima et al., 1992; Daga et al, 1996; Lim, Choi. 2004; Wildonger et al, 2005).

Цель исследования заключалась в установлении роли гена Trithorax-like в процессе формирования глаза D. melanogaster и выявлении его взаимодействий с генами, участвующими в данном процессе.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. провести молекулярно-генетический анализ аллеля Triеп82;

2. охарактеризовать экспрессию гена Tri в глазо-антеннальных имагинальных дисках и мозго-вентральных ганглиях у гетерозигот Trlen82/TrlR85 и Tri362/ TriR85;

3. исследовать влияние мутаций гена Tri на структуру глаза имаго и глазо-антеннальных имагинальных дисков 42-часовых куколок мутантов Trlen82ITrlR85 и Tri362/TriRS5;

4. выяснить влияние мутаций гена Tri на проявление мутаций генов lz и BarHl;

5. изучить экспрессию гена lz в глазо-антеннальных имагинальных дисках у гетерозигот Trlen82/TrlR85 и Tri362/TriR85;

6. провести анализ связывания рекомбинантного белка GAGA с потенциальными сайтами, выявленными в 5'-областях генов lz и BarHl.

Научная новизна. Впервые показано, что снижение уровня экспрессии гена Tri в глазо-антеннальных имагинальных дисках и мозговентральном ганглии приводит к изменению количества фотонейронов и конусных клеток в части омматидиев, а также к изменению ориентации некоторых омматидиев в глазу дрозофилы. Установлено, что проявление мутации генов Iz и BarHl усиливается на фоне мутаций по гену Tri, что свидетельствует о взаимодействии этих генов. Выявлено, что белок GAGA вовлечен в активацию экспрессии гена lz в клетках глазо-антеннальных имагинальных дисков предкуколок.

Научно-практическая значимость работы. Результаты данной работы способствуют расширению фундаментальных знаний о процессе формирования глаза насекомых. Поскольку структурные гомологи белков GAGA, Lz и BarHl присутствуют и у позвоночных, то полученные результаты представляют интерес для всех биологов, занимающимися вопросами развития. Материалы данной диссертационной работы могут быть использованы в курсах лекций по генетике развития для студентов биологических факультетов.

Апробация работы. Полученные в ходе работы данные были представлены: на XLIV Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2006 г.); на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007 г.); на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009 г.).

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК - 3, тезисов докладов и материалов конференций-3.

Вклад автора. Основная часть экспериментальной работы и обработка полученных результатов выполнена автором самостоятельно. Анализ экспрессии генов Tri и/zb норме и у мутантов выполнен при участии Д.А. Карагодина (ИЦиГ СО РАН). Приготовление полутонких срезов глаза дрозофилы проводился совместно с С.И. Байбородиным (ИЦиГ СО РАН).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение), выводов, списка литературы. Работа изложена на 135 страницах, содержит 6 таблиц и иллюстрирована 23 рисунками. В списке литературы приведен 241 источник.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структура глаза дрозофилы

Сложный глаз дрозофилы состоит приблизительно из 800 структурных единиц, называемых омматидиями. Каждый омматидий содержит 8 фоторецепторных нейронов - фотонейронов (R1-R8), 4 конусные клетки, секретирующие линзы и 2 первичные пигментные клетки (ПК). Вторичные и третичные ПК, обеспечивающие световую изоляцию, а также мехапо-сенсорные щетинки окружают омматидии в виде сетки с гексагональными ячейками (Wolff, Ready, 1993) (рис. 1).

линза - х--

кристаллический

конус

рабдомер

рабдомер R7

конусная клетка

рабдомер R8

основание конусной клетки

аксон

фенестрированная мембрана

_ З'пигментная клетка

2'пигментная клетка щетинка

конусная клетка

-1 пигментная клетка

аШггтг

Рис. 1. Организация омматидия. Показан продольный срез (слева) и пять поперечных срезов на нескольких уровнях глубины сетчатки (справа). R1-R8- фоторецепторные нейроны [с модификациями из (Wolff, Ready, 1993)J.

Расположенные в середине омматидия 8 фоторецепторных нейронов подразделяются на три функциональные группы: ИЛ-Иб, К7 и 118. Фотонейроны каждой группы имеют различную спектральную восприимчивость, поскольку в них присутствуют разные фоточувствительные пигменты. Каждая из трех групп фотонейронов характеризуется различным положением синапсов в оптических долях мозгового ганглия: синапсы фотонейронов КЛ-Яб располагаются в л амине, тогда как синапсы фотонейронов 117 и Я8 занимают различные позиции в медуле, более глубоком слое оптической доли. Фотонейроны характеризуются наличием фоторецегггорной структуры - рабдомера. который представляет собой около 60 тыс. светочувствительных микроворсинок, содержащих родопсин. Рабдомеры внешних фотонейронов (Я1-Я6) образуют трапециевидную структуру вокруг внутренних рабдомеров (Я7 и Я8). Рабдомеры II)-Кб простираются на всю длину омматидия. Рабдомер фотонейрона 117 занимает центр верхней части омматидия. а рабдомер Я 8 -центральную позицию в нижней части омматидия (рис. 1). В дорзальной и вентральной частях глаза омматидии имеют зеркальные, относительно условной серединной линии - экватора, ориентации трапециевидных структур из рабдомеров (рис. 2).

Рис. 2. Расположение омматидиев в глазу дрозофилы. На срезе глаза видны трапециевидные структуры из рабдомеров фотонейронов 111-Кб (отмеченные на схеме цифрами 1-6). В дорзальной и вентральной частях глаза трапециевидные структуры из рабдомеров ориентированы зеркально относительно горизонтали - экватора (отмечен белой линией). Справа схематично изображена голова мухи. Показана ориентация омматидиев: стороны их трапециевидных структур, включающие рабдомеры фотонейронов располагается

ближе к передней части глаза [с модификациями из (ЯаиЬ еI а!., 2007)].

Над фоторецепторными нейронами располагается светопреломляющая часть омматидия, состоящая из заполненного жидкостью кристаллического конуса, который сверху ограничен корнеальной линзой, с боков - двумя первичными ПК, и снизу - четырьмя конусными клетками. Все клетки омматидия, за исключением первичных пигментных клеток и фотонейрона R8, имеют протяженность от верхней поверхности глаза до основания ретины. Дно глаза подстилает фенестрированная мембрана, которая физически отделяет фоторецепторные клетки ретины от клеток мозга. В формировании этой мембраны принимают участие основания вторичных и третичных пигментных клеток, основания конусных клеток и внеклеточный матрикс. В результате формируется мембрана с небольшими отверстиями, через которые проходят к м