Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новый споровый пробиотик Ирилис и его использование в ветеринарной практике

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Новый споровый пробиотик Ирилис и его использование в ветеринарной практике"

На правах рукописи

□0305ЭТ4Т

МЕФЕД Кирилл Михайлович

новый споровый пробиотик ирилис и его

использование в ветеринарной практике

03 00 07 -микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 [.!ДП 2007

Москва 2007

003059747

Работа выполнена на кафедре микробиологии медицинского факультета Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов»

Научпый руководитель:

доктор биологических наук Осипова Ирина Григорьевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

член-корр РАСХН Девришов Давуд Абдулсемедович

доктор биологических наук

профессор Смирнова Ирина Павловна

Ведущая организация:

Государственное учреждение науки «Всероссийский научно-исследовательский институт биологической промышленности»

Защита состоится «30» _2007 г в /г> _часов на заседании

диссертационного совета Д 212 203 05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» по адресу 117198, г Москва, ул Миклухо-Маклая, д 8 корп 1

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» по адресу 117198, г Москва, ул Миклухо-Маклая, д 6

Автореферат разослан «

¿ ии^'АА/С 2007

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент

/ О Б Гигани

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Согласно данным Департамента ветеринарии РФ, патология ЖКТ инфекционной этиологии, в общей структуре заболеваний молодняка животных составляет до 75% (Антипов В А и соавт, 1980, 1992, Лоенко H H и соавт 2002, Наташкина M Ю , 2006)

Особенности этиологии и патогенеза инфекционных желудочно-кишечных заболеваний молодняка неонатального возраста связаны со структурными, количественными и качественными нарушениями в микробиоценозе кишечника, снижением активности колостралыюго иммунитета, низкой естественной резистентностью, повышенной восприимчивостью новорожденных к бактерийным и вирусным антигенам, поступающим пероральным путем (Малик H И, 2002, Alexopoulus С et al, 2004)

Особенно остро эта проблема стоит в одной из приоритетных областей пушного животноводства — кролиководческой отрасли По данным НИИ Пушного звероводства и кролиководства до 50% новорожденных крольчат подвержены различным инфекционным заболеваниям Падеж молодняка наблюдается в первые 20 дней жизни в основном от острых кишечных инфекций и пневмонии различной этиологии (Рютова В П 1986, Плугина И В 2004, Стрижаков А А , 2006)

Использование антибиотиков для профилактики желудочно-кишечных болезней, ассоциированных с дисбиотическими явлениями в микробиоценозе кишечника животных, проблему усугубило Негативные последствия фармакологического прессинга выразились в нарастании быстрыми темпами множественной лекарственной резистентности условно патогенных микроорганизмов, адаптации бактерий к несвойственным им экологическим нишам, появлении и циркуляции в хозяйствах высоко вирулентных штаммов эшерихий, сальмонелл, стафилококков, иер-синий, кампилобактерий и др микроорганизмов (Куликовский А В , 1997, Киржа-евФ С ,1999,Бакулина JI Ф,2001)

С 2007 г в странах Евросоюза вводится полный запрет на использование пищевых антибиотиков ветеринарного назначения (H A Hong et al, 2005) Вышеизложенное, заставляет исследователей пересмотреть многие методологические подходы к вопросам оптимизации контроля над эпизоотическим процессом болезней, возбудителями, которых являются условно патогенная бактериальная микрофлора Недостаточная эффективность традиционных мероприятий, направленная на повышение сохранности молодняка, обусловливает необходимость применения принципиально новых эффективных препаратов (G M M Quigley, В Flourie, 2007)

Наиболее полно этим требованиям отвечают пробиотики — препараты, содержащие живые микроорганизмы Аспекты использования пробиотиков в ветеринарии затрагивают широкий круг проблем, который включает коррекцию кишечного биоценоза, иммунной, гормональной и ферментной систем животных (Т W Тап-nock, 1997, M De Angehs, 2007, A E Flinterman, 2007)

В последние годы в ветеринарной практике в качестве препаратов-пробиотиков для терапии и профилактики желудочно-кишечных и других инфекций находят широкое применение бактерии рода Bacillus (M R Oggioni et al, 2003) В странах Евросоюза активно используются препараты Paciflor® СЮ, основу которого составляет штамм В cereus АТСС 1489, Тоуосепп (В cereus var toyoi NC1MB-40112/CNCM-1012), BioPlus 2B (В subtihs DSM5750 и В lichemformis DSM5749) и

некоторые другие (H A Hong et al, 2004, 2005) Следует отметить, что только японский препарат Тоуосепп с успехом применяется при лечении заболеваний кроликов (Т Т Hoa et al, 2001,2003)

В ветеринарную практику Российской Федерации внедрены несколько бациллярных пробиотических препаратов Споровит, Ветом-4, CJI-бактерин, Споро-лакт, Ветбактерин, Субтилис, Биоплюс 2Б (Литвин В П и др ,1986 , Бакулина Л Ф и др, 2001, Литвин В П и др , 1986, Ноздрин Г Л и др , 1997, Alexopoulus С et al, 2004) Но ни один из перечисленных пробиотиков не применяется в кролиководстве В последнее время российскими учеными разработан новый ветеринарный препарат Ирилис, включающий штаммы В subtilis ВКПМ 2335 и В licheniformis ВКПМ 2336 и обладающий рядом преимуществ перед отечественными и зарубежными аналогами (Сорокулова И Б с соавт, 2006) Однако этот препарат также не испытывался в кролиководстве

Использование бациллярных препаратов в ветеринарии делает необходимым тщательное изучение безопасности применяемых культур В тоже время, практически отсутствуют данные об изучении патогенности используемых штаммов пробиотиков

Кроме того, также требуют совершенствования методы и критерии оценки биологических свойств штаммов, обеспечивающих лечебную эффективность препаратов

Дели и задачи исследований Целью исследования явилось всестороннее изучение биологических свойств перспективного ветеринарного пробиотика Ирилис (В subtilis ВКПМ 2335 и В licheniformis ВКПМ 2336) in vitro и in vivo и внедрение его в систему лечебно-профилактических мероприятий при выращивании кроликов

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи

1 Сравнительное исследование пробиотических культур, входящих в перспективный ветеринарный препарат Ирилис и коммерческий пробиотик Paciflor СЮ, по физиолого-биологическим характеристикам

2 Изучение безопасности штаммов исследуемых пробиотиков

3 Сравнительное исследование колонизационной активности (антагонизма, адгезивных свойств и персистирования в желудочно-кишечном тракте) штаммов, входящих в Ирилис и Paciflor® С10

4 Проведение клинических испытаний и оценка лечебной и профилактической эффективности ветеринарного пробиотика Ирилис

Научная новизна

Впервые при сравнительном изучении биологических свойств перспективного ветеринарного пробиотика Ирилис выявлено его преимущество перед коммерческим ветеринарным препаратом Paciflor® СЮ, и доказана его безопасность для использования в ветеринарной практике

Впервые продемонстрировано преимущество пробиотического препарата Ирилис перед коммерческим ветеринарным препаратом Paciflor® СЮ по антагонистической активности в отношении клинических штаммов УПБ, выделенных от больных кроликов

Впервые доказана терапевтическая эффективность перспективного пробиотика Ирилис на фоне эпизоотии миксоматоза кроликов, позволившая значительно снизить падеж животных в различных возрастных группах, а также увеличить привес животных

Практическая значимость

Показана высокая лечебно-профилактическая эффективность перспективного препарата Ирилис на поголовье кроликов в хозяйстве длительно неблагополучном по многим инфекционным и инвазионным заболеваниям

Изучено влияние пробиотика на рост, развитие и сохранность молодняка кроликов Полученные данные подтверждены актами, утвержденными руководителями хозяйств

Разработаны наставления по применению ветеринарного пробиотического препарата Ирилис в кролиководческих хозяйствах

Положения, выносимые на защиту

1 При разработке новых пробиотических препаратов ветеринарного назначения на основе спорообразующих бактерий необходимо проведение доклинических испытаний штаммов, входящих в пробиотики для ветеринарной практики

2 Сравнительные исследования нового ветеринарного пробиотика Ирилис с коммерческим препаратом Paciflor® СЮ выявили преимущество первого по показателю безопасности и специфической активности

3 Экспериментально-клиническое изучение перспективного пробиотика Ирилис свидетельствует об его высоком лечебно-профилактическом потенциале

Апробация результатов диссертации Основные результаты диссертационной работы доложены и представлены в материалах научной конференции «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний» (Н Новгород 2006 г) и Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006 Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва 2006 г), на заседании кафедры микробиологии РУДН (2006, 2007)

Публикации По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ в том числе в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК России и в материалах всероссийских конференций

Объем и структура работы Диссертация построена по традиционному плану и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, заключения, выводов и списка литературы Работа изложена на 92 страницах текста компьютерной верстки и иллюстрирована 24 таблицами и 12 рисунками Список литературы представлен 126 источниками (59 отечественными и 67 зарубежными)

Собственные исследования

Материалы и методы

Работа выполнена в период с 2004 по 2007 год на кафедре микробиологии медицинского факультета РУДН, в лаборатории диагностических бактерийных препаратов с коллекцией микроорганизмов ФГУН ГИСК им Л А Тарасевича, кролиководческом хозяйстве ООО «ТрансАгро» Истринского района Московской области

В исследовании были использованы

- штаммы спорообразующих бактерий рода Bacillus В subtilis ВКПМ 2335 и В lichemformis ВКПМ2336, В cereus АТСС 1489,

- штаммы патогенных и условно патогенных микроорганизмов /УПБ/ (п = 210), выделенные от больных кроликов, а так же полученные из коллекции ГКПБ ФГУН ГИСК им Л А Тарасевича,

- препараты лабораторные серии препарата Ирилис, коммерческая серия ветеринарного пробиотика Paciflor® СЮ (Intervet International В V Wim de KoErverstraat 35 NL-5831 AN Boxmeer (NL)

Экспериментальные исследования проводились на лабораторных животных -беспородных мышах (п = 720) и мышах линии "black" (п = 100) обоего пола, массой 10 - 16 г, беспородных крысах (п=100) обоего пола, массой 100-120 г, самцах кроликов «шиншилла» (п = 15), массой 2-2,5 кг При выполнении экспериментов на животных руководствовались «Правилами гуманного обращения с лабораторными животными» (2003)

Клинические испытания проводились на 743 особях кроликов пород «Серебристый», «Черно-Бурый» и «Белый великан» обоего пола различных возрастных групп

В ходе работы использованы стандартные питательные среды, традиционно применяемые в микробиологии

При выполнении работы применялись следующие биологические жидкости желчь медицинская консервированная (ООО «Самсон - мед», г Санкт-Питербург) и сок желудочный натуральный «Эквин» («Иммунопрепарат», г Уфа)

При изучении видовой принадлежности штаммов рода Bacillus использовали Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий рода Bacillus из организма человека и животных (Смирнов В В с соавт 1983)

Идентификацию патогенных и условно патогенных микроорганизмов проводили общепринятыми методами (Бригер М 0, 1992)

Изучение токсичности, вирулентности, токсигенности проводили в соответствии с Методическими рекомендациями (Смирнов В В с соавт 1983), "острую" и "хроническую" токсичность - по РД 42-28-8-89

«Острую» токсичность культур изучали на мышах при пероральном введении культур в различных дозах (1х109-1х10 2 КОЕ/0,5 мл) и внутрибрюшинном (0,5х09, lxlO9, 5х109, 1x1010 КОЕ/0,5 мл) Животные контрольной группы получали забу-ференный физиологический раствор (ЗФР) Наблюдение за животными проводили в течение 7 сут Учитывали поведенческие реакции, состояние шерстяного покрова Через 1 и 7 сут после последнего введения пять мышей из каждой группы умерщвляли эфиром и проводили макроскопическое исследование внутренних органов Одновременно с этим отбирали пробы для гистологических и микробиологических исследований

При исследовании «хронической» токсичности животным в течение 30 суток ежедневно перорально вводили бактериальные культуры по 106 КОЕ/0,5 мл По окончании срока введения культур через 1 и 7 сут животных умерщвляли и их органы также подвергали макроскопическому, бактериологическому и гистологическому исследованию

Изучение влияния препарата Ирилис на морфологический состав и свойства крови было проведено на 15 кроликах массой 2-2,5 кг Было создано 3 группы животных - 2 опытных и 1 контрольная, по 5 голов в каждой Кроликам I опытной группы перорально вводили Ирилис по 1 дозе в течение 10 дней ежедневно, а кроликам II опытной группы - в той же дозе в течение 30 дней ежедневно, после чего брали кровь на исследование У кроликов контрольной группы, которым никаких препаратов не вводили, брали кровь на исследование на 10 и 30 дни с начала постановки опыта У кроликов как опытных, так и контрольной групп по общепринятым методикам определяли скорость оседания эритроцитов, лейкоцитарную форму-

лу, содержание гемоглобина, общего белка, общего билирубина, подсчитывали количество эритроцитов

Для определения устойчивости бактерий к действию биологических жидкостей (желчь медицинская консервированная, желудочный сок «Эквин») суточную культуру смывали ЗФР и доводили концентрацию до 109 КОЕ/мл В пробирку с 1 мл бактериальной взвеси добавляли 9 мл биологической жидкости, в контрольную пробирку вносили 9 мл ЗФР, все пробирки выдерживали в термостате при 37 °С в течение 2 ч, затем определяли количество жизнеспособных клеток методом серийных разведений с высевом на среду Гаузе №2 (Осипова И Г 2006)

Антагонистическую активность (АА) определяли методом отсроченного антагонизма на агаризованной среде Гаузе №2 (ФС 42-3476-98), по зоне задержки роста (ЗЗР) тест-штаммов (в мм) АА считали нулевой при зоне задержки роста до 5 мм, низкой — при ЗЗР от 5 до 10 мм, средней - от 10 до 15 мм, высокой - от 15 до 20 мм, очень высокой - свыше 20 мм

Адгезивные свойства бактерий рода Bacillus изучали на эпителиальных клетках кишечника крыс Уровень адгезии отдельных штаммов бактерий условно дифференцировали на 4 степени неадгезивную (СПА = 0), слабоадгезивную (СПА = 1 - 5), среднеадгезивную (СПА = 5-10), высокоадгезивную (СПА = 10 и выше) (Горская Е М с соавт 1989)

Изучение персистирования штаммов, входящих в исследуемые препараты проводили на мышах линии "black", массой 14 - 16 г Для исключения копрофагии группы мышей находились в отдельных клетках с сетчатым полом Суточную культуру после роста на агаризованной среде Гаузе №2 смывали забуференным физиологическим раствором (ЗФР) и доводили до концентрации 2x109 КОЕ/мл Пробиотик растворяли ЗФР из расчета 0,5 мл на дозу По 0,5 мл суспензии культуры вводили через зонд per os однократно Контрольным животным вводили 0,5 мл ЗФР Свежий кал взвешивали и гомогенизировали в ЗФР, затем путем последовательных десятикратных разведений высевали на агаризованную среду Гаузе №2 Посевы инкубировали при температуре 37° С в течении 48 ч Выросшие колонии морфологически и биохимически (Осипова И Г с соавт, 2005)

Исследования лечебно-профилактической эффективности препарата проводили на 504 особях кроликов обоего пола различных возрастных групп пород «Серебристый», «Черно-бурый» и «Белый великан»

Испытания профилактической эффективности с целью оценки влияния перспективного пробиотика Ирилис на рост, развитие и сохранность животных были проведены на 239 особях молодняка кроликов обоего пола пород «Серебристый», «Черно-бурый» и «Белый великан» в возрасте до 120 дней и на 36 самках в возрасте до 2 лет

Результаты и обсуждение Доклинические исследования перспективного препарата Ирилис

В ходе исследования изучены пробиотические культуры В subtilis ВКПМ 2335 и В licheniformis ВКПМ 2336, входящие в перспективный ветеринарный препарат Ирилис и штамм В cereus АТСС 1489, составляющий основу коммерческого пробиотика Paciflor® СЮ Культуры Ирилиса существенно различались своими физиоло-го-биохимическими характеристиками (табл 1) В subtilis ВКПМ 2335, в отличие от В licheniformis ВКПМ 2336, не проявил способности к росту в анаэробных условиях, что является одним из показателей различной адаптационной возможности

культур в разных отделах ЖКТ Различаются они и по другим свойствам, среди которых - ферментация углеводов, продукция аргининдегидролазы и пр В отличие от штамма В сегет АТСС 1489 штаммы ВКПМ 2335 и ВКПМ 2336 характеризуются отсутствием гемолитической активности, не проявляют вирулентность, токсичность и токсигенность Культуры не продуцируют ферменты, способные обусловливать патогенные свойства препарата (лецитиназа, гиалуронидаза)

Таблица 1 Культуральные, морфологические и биохимические свойства бактерий рода Bacillus

Штаммы бактерий рода Bacillus

Свойства В cereus В subtilis В hchemformis

АТСС 1489 ВКПМ 2335 ВКПМ2336

Рост в анаэробных условиях + - +

Ферментация

- глюкоза + + +

-арабинозы - + -

- ксилозы - + +

- маннита - + +

Катал аза + + +

Образование кислоты и газа из глюкозы - - -

Образование кислоты из глюкозы + + +

Утилизация

- цитрата + + +

- пропионата - - +

Гидролиз

- крахмала + + +

- мочевины - - -

- казеина + + +

- тирозина + - -

Лизоцимная активность - + +

Редукция нитратов + + +

Образование газа из N03 в анаэробных ус- + +

ловиях

Реакция Фогес-Проскауэра + + +

Аргининдегидролаза - - +

Лецитиназа + - -

Гиалуронидаза + - -

Гемолитическая активность + - -

Вирулентность +

(в/б доза 1хЮ'КОЕ/мл)

Токсичность 4-

(в/б доза 1хЮ9ОЕ/мл)

Токсигенность +

(в/б 1 мл супернатанта)

Примечание в/б - внутрибрюшинно

Изучение влияния пробиотика Ирилис на морфологический состав и свойства крови проводили на кроликах Животным вводили ежедневно препарат по 1 мл 1 опытной в течение 10 дней, а кроликам 2 опытной группы - в течение 30 дней, после чего брали кровь на исследование У кроликов контрольной группы, ин-тактных, брали кровь на исследование на 10 и 30 сутки с начала постановки опыта Изучение влияния Ирилис на морфологический состав и свойства крови показало, что препарат не влияет на состав и свойства крови животных (табл 2 )

Таблица 2 Показатели крови животных опытных и контрольных групп

Показатели Количество (М±т) в контроле (интактные) Количество (М±ш) после курса введения Ирилиса в

10 сут 30 сут 10 сут 30 сут

Общий белок, г% 7,1±1,0 6,5±0,5 7,8±0,2 7,2±1,5

Общий билирубин, мг% 0,1±0,1 0 0 0

Количество эритроцитов, млн/мл 6,0±1,5 6,5±1,0 6,6±1,0 6,5±0,5

СОЭ, мм/30 мин 0,4±1,0 0,4±1,0 0,4±1,0 0,4±1,0

Содержание гемоглобина, г/л 74,3±6,2 78,2±2,3 76,5±4,2 75,5±4,8

Лейкоциты тыс/ мл 8,0±1,5 9,0±0,5 8,5±1,0 8,8±0,9

Лейкоцитарная формула, % - базофилы - эозинофилы - миелоциты - нейтрофилы - лимфоциты 3,7±1,3 2,0±1,0 0 0 7,0±2,0 36,5±3,7 49,5±2,0 2,0±1,0 3,9±1,0 1,5±0,5 0 8,0±1,0 38,5±3,3 48,9±2,9 2,5±1,0 3,6±1,5 1,0±0,5 7,9±0,5 36,0±2,5 48,4±2,7 2,2±1,0 3,8±1,2 2,0±1,0 8,0±0,5 37,0±3,4 4,8±2,0 2,5±1,5

Препарат не оказывает побочного действия на организм, не вызывает осложнений и аллергических реакций, хорошо переносится животными и совершенно безвреден Следовательно, длительное пероральное введение изучаемых пробио-тических штаммов рода Bacillus является безопасным, поскольку не приводит к развитию токсических или инфекционных осложнений

При изучении "острой" и "хронической" токсичности выявлено (табл 3), что животные всех групп (кроме мышей, которым вводили В cereus АТСС 1489) во время периода наблюдения были здоровы, активны, их поведенческие реакции не нарушены, масса тела не снижалась, не выявлены побочные эффекты или осложнения, связанные с введением культур Не было отмечено каких-либо патологических изменений при макро- и микроскопическом изучении ЦНС и внутренних органов животных В то же время при исследовании «острой» и «хронической» токсичности в группе животных, которым вводили в/б культуры В cereus АТСС 1489 в дозе 1х109 КОЕ/О,5мл, отмечалась тотальная гибель Гибель 50% мышей имела место при введении В cereus АТСС 1489 дозы 0,5х109 КОЕ/0,5 мл У выживших животных объективно отмечались снижение массы тела, вялость, диарея При макроскопическом исследовании выявлены, неравномерное полнокровие внутренних органов и резкое полнокровие печени, кровоизлияния, признаки шоковых реакций в селезенке, ишемия коры почек, эмфизематозные изменения легких На 7-е сутки интенсивность указанных изменений значительно снижалась Сплено- и гепатомегалия характерные признаки инфекционного процесса В исследовании «хронической» токсичности не обнаружено микроскопических изменений морфологии селезенки и печени у животных, получавших исследуемые штаммы Селезеночный индекс мышей, которым вводили изучаемые штаммы, не отличался от показателей животных контрольной группы (табл 4)

Таблица 3 «Острая» и «хроническая» токсичность пробиотических штаммов рода Bacillus_____

Вид и штамм пробиотика Способ введения Доза введения, КОЕ/0,5 мл Количество животных, живых/павших

Bacillus subtihs ВКПМ 2335 в/б 10x10" 40/0

peros 100x10Ч 40/0

per os 1х106у 40/0

Bacillus licheniformis ВКПМ 2336 в/б 10x10* 30/0

peros 100x10* 30/0

per os 1х106 30/0

в/б 1,0x10" 0/10

В cereus в/б 0,5x10" 10/10

АТСС 1489 per os 100x10" 10

per os 1x10" 10

Контроль, изотонический физ раствор в/б 0,5 мл 30

per os 0,5 мл 30

per os 0,5 мл 30

Интактные - - 30

- - 30

Таблица 4 Селезеночный индекс мышей после перорального введения бактериаль-

ных культур (хроническая токсичность)

Исследуемый штамм Количество мышей в группе Селезеночный индекс (СИ)* вес селезенки (мг)/вес мышей (г)

Bacillus subtilis ВКПМ 2335 10 3,35+0,2

Bacillus licheniformis ВКПМ 2336 10 3,39+0,15

В cereus АТСС 1489 10 3,37+0,2

Контроль 10 3,40+1,4

При бактериологическом исследовании крови и внутренних органов животных установлено отсутствие диссеминации этих культур, т е изучаемые штаммы являются неинвазивными Таким образом, длительное пероральное введение изучаемых пробиотических штаммов рода Bacillus является безопасным, поскольку не приводит к развитию токсических или инфекционных осложнений

Следует отметить, что штамм В cereus АТСС 1489, в отличие от штаммов В subtilis ВКПМ2335 и В licheniformis ВКПМ 2336. характеризуется гемолитической активностью, а исследования, проведенные Научным Комитетом по питанию животных при Европейской Комиссии (SKAN), выявили у данного штамма способность к продукции энтеротоксинов НЫ и Nhe (2003) Таким образом, штамм В cereus АТСС 1489, входящий в коммерческий препарат Paciflor® СЮ обладает выраженными вирулентными свойствами

Следующим этапом нашей работы было изучение чувствительности штаммов бактерий рода Bacillus к действию желудочного сока и желчи Показано, наиболее чувствительным к желчи и желудочному соку из исследуемых культур оказался штамм В cereus АТСС 1489 (рис 1)

Исходное Желудочный Желчь Контроль 1Ф1* сои

Рис. 1. Устойчивость бацилл к воздействию желудочного сока и желчи

Важнейшей характеристикой колонизационной активности пробнотичеисих штаммов является изучение антагонизма и адгезии. В проведенном сравнительном изучении антагонистической активности (ЛА) Иршшса и Расз Лог:' СЮ особое внимание было уделено изучению воздействия этих биопрепаратов на культуры, выделенные от больных кроликов и тест-штаммов, используемых при контроле пробиотиков (табл. 5).

Полученные данные ¡свидетельствуй^ о том. что Ирилис характеризуется высокой АА в отношении стафилококков, энтерококков и кандид. Установлено также, что исследованные про биотические штаммы, входящие в состав препарата Ирилис, эффективно воздействуют на штаммы разных таксономических групп; выделенных от больных животных, в том числе и на пой и резистентные к антибиотикам культуры.

Следует отметить, что РасШрт® СЮ не проявлял высокой антагонистической активности воздействия па тест-штаммы: зоны задержки роста тест-штаммов были менее Ю- 12 мм.

Таблица 5, Сравнительное изучение антагонистической активности пробиотиков

Кол-во штаммов, чувствительных к

Количество пробиотикам

Тест-культура тсст- (зона задержки роста тест-культур

штам>юв более 15 мм)

Ирилис Paciflor СЮ

Escherichia coli (reмолит.) 12 6 0

Klebsiella pneumoniae* И) 0

Serratia marcescens If 5 0

Proteus vulgaris 18 П 0

Proteus mirabilis 19 14 0

Staphylococcus пи re us* 25 23 0

Pseudomonas aeruginosa* 18 0 0

Candida albicans 15 10 й

Emheroeoccus spp. 22 19 Ü

* штаммы^ полиреЗйстентные к антибиотикам

При сравнительном изучении адгезивной активности штаммов рода ВасШш к эпителиальным клеткам кишечника крые (зктсроциты и Колоноциты) обнаружено, что штамм В. шЫШ$ 2335 обладает низкой адгезявностью. Штамм В. ЦсИет/огтк 2336 проявляет средний уровень адгезивной активности к эпителиальным клеткам кишечника, однако лучше к колоноцитам (рис.2). Рис. 2. Адгезивная активность изучаемых штаммов к эпителиальным клеткам кишечника крыс

■ Энтероциты ОКолоноциты

14 12

10

5

6 4 2 П

■

В. subtiüs 2332

В. licheniformis 2336 В. cerens АТСС 1489

Обращает внимание факт, что штамм В. cereus АТСС 1489 обладает высокой адгезивностью к энтероцитам, это создает дополнительные условия неблагоприятного физиологического воздействия на организм животного при применении препарата, т. к. высокая адгезивная активность штамма приводит к колонизации и персиетированию в ЖКТ.

Исследование динамики персистирования показало, что штаммы Bacillus subtilis ВКПМ 2335, В. licheniformis ВКПМ 2336 быстро элиминировали из кишечника мышей, они не определялись в фекалиях уже через 8 сут после их однократною введения. Дольше всего в кишечнике персжтар<обал штамм ß. cereus A'VCC 1489-24 дня (рис 3).

В, Ii ehe и ¡form is 2336 - Лг B.cercus ГР 5H32

Рис.3. Динамика персистирования штамм ов-пробиотиков в ЖКТ мышей

Таким образом, в результате исследований установлено, что перспективный ветеринарный пробиотик Ирилис обладает рядом преимуществ перед коммерческим препаратом РасШог® СЮ, а именно безопасностью, выраженным антагонистическим воздействием на патогенные и условно патогенные штаммы, низкой адгезивной активностью и кратковременным персистированием в кишечнике

Завершающим этапом внедрения Ирилиса в систему лечебно-профилактических мероприятий при выращивании кроликов является изучение переносимости и клинической эффективности препарата, это и послужило предметом нашей дальнейшей работы

Клинические исследования Ирилиса

Исследование профилактической и терапевтической эффективности проводилось в кролиководческом хозяйстве ООО «ТрансАгро» Истринского района Московской области Первый этап исследования проводился на фоне эпизоотии миксоматоза кроликов - остро протекающей контагиозной вирусной болезни, летальность которой по данным литературы составляет до 100 %

Следует отметить, перед нашими исследованиями в хозяйстве в течение июня месяца проведена вакцинация кроликов против миксоматоза вакциной из штамма В-82, изготовленного в ШНУ ВНИИВВиМ Однако иммунизацию животных осуществили по сокращенной схеме, т е ревакцинацию не проводили В результате взрослое и «ремонтное» маточное поголовье было привито однократно, хотя согласно наставлению по применению вакцины первую вакцинацию кроликов необходимо проводить в 1,5-месячном возрасте, а ревакцинацию - через 3 мес (при этом напряженный иммунитет формируется на 7-е сутки после введения препарата и сохраняется в течение 9 мес) Нарушения в проведении в вакцинации привели к заболеваемости молодняка с клиническими признаками миксоматоза, заболеваемость достигала 80 %

Табл 6 Распределение больных животных по степени выраженности миксоматоза

Форма и степень выраженности заболевания Основная группа (Ирилис) п=343 Контрольная группа п=161 Общее количество больных п=504

Абс % Абс % Абс %

Нодулярная форма (серозно-гнойный конъюнктивит .образование опухолевых узелков на коже) 109 31,8 59 36,6 68 33,3

Классическая форма (отеки в области головы, подгрудка, гениталий) 145 42,3 58 36 203 40,3

Смешанная форма (совокупность клинических симптомов) 89 25,9 44 27,4 133 26,4

У больных кроликов наблюдались повышенная температура, одышка, воспаление слизистых оболочек серозногнойный конъюнктивит, переходящий в гнойный блефароконъюнктивит, гнойный ренит, на коже обнаруживались опухолевидные узелки У некоторых кроликов развивались студенистые отеки в области головы, ануса, гениталий, опухание век, ушей При вскрытии была выявлена отечно-

сосудистая инфильтрация подкожной клетчатки в области головы, туловища, ануса, изменения в легких Анализ эпизоотической обстановки и клинические проявления заболевания позволили поставить диагноз миксоматоз

При изучении лечебной эффективности Ирилиса животные были разделены по возрастным группам методом случайной выборки (табл 7) Опытные и контрольные группы были равноценны по форме и степени выраженности заболевания (табл 6)

Таблица 7 Схема проведения испытания лечебной эффективности Ирилиса

Возраст кроликов (дней) Название группы Подгруппа Доза препарата Способ введения Сроки введения

1-25 1 1 опытная 5хЮ9КОЕ/мл per os 14 дней

1 контрольная Питьевая вода per os 14 дней

25-80 2 2 опытная 5хЮ9КОЕ/мл per os 14 дней

2 контрольная Питьевая вода per os 14 дней

80-120 3 3 опытная 5хЮ9КОЕ/мл per os 14 дней

3 контрольная Питьевая вода per os 14 дней

Одним из наиболее частых, сопутствующих миксоматозу, заболеваний является пневмония, вызываемая различными УПБ По результатам бактериологических исследований, из легких и фекалий больных животных в больших количествах (107 -109 КОЕ/г) выделяли представителей патогенной и условно патогенной микрофлоры (стафилококки, эшерихии, энтерококки и др ), являющихся причиной се-кундарных инфекций

Кролики основной группы получали Ирилис per os в концентрации 5x109 КОЕ в 1 мл в течение 14 дней Кролики контрольной группе препарат не получали

Таблица 8 Состав микрофлоры, выделенной из легких и фекалий больных кроликов

Название микроорганизма Количество микрофлоры выделяемой от животных (КОЕ/г)

В начале опыта По завершению опыта

Опытная группа Контрольная группа

легкие фекалии легкие фекалии легкие фекалии

Staphylococcus aureus 105 107 - 10s 10" 109

S epidermidis - 10' - 10' - 10"

Enterococcus spp (гемолит ) - 109 - 10J 104 109

Escherichia coli (гемолит ) 103 10' - 10J - 10'

Enterobacter spp - 109 - 10' - 10'

Proteus vulgaris - ю8 - 106 10J 109

P mirabilis ю4 10' - ю4 - 109

Lactobacterium spp - ю4 - ÎO5"6 - lO3"4

Bifidobacterium spp - ю4 - 105"b - 10J'4

Учет лечебной эффективности препарата проводился на основании сохранности поголовья, нормализации клинической симптоматики и микробиоценоза

В таблице 9 представлены данные, которые свидетельствует, что использование препарата Ирилис в процессе выращивания молодняка кроликов позволило значительно снизить падеж животных В 1-й и 2-й опытных подгруппах выживших животных было 60,8% и 60,7% соответственно, тогда как в 1-й и 2-й контрольных подгруппах только 44,6% и 29,5 % соответственно

Таблица 9 Выживаемость животных опытных и контрольных подгруппах

Группа Подгруппа Выжило животных, % Пало животных, %

1 1 Опытная 60,8 39,2

1 Контрольная 44,6 55,4

2 2 Опытная 60,7 39,3

2 Контрольная 29,5 70,5

3 3 Опытная 100 0

3 Контрольная 100 0

У животных опытных групп отмечено положительное влияние Ирилиса на течение болезни со 2-го дня приема препарата у кроликов появился аппетит, животные стали более активными, на 6 сутки уменьшались явления конъюнктивита и одышки, на 6-7 сут нормализовалась температура, на 5-6 сут прекратились гнойные выделения из носа, на 10-12 сут исчезали отеки При вскрытии кроликов, через 1 сут после последнего введения препарата, видимых патологических изменений во внутренних органах не обнаружено В опытных группах зарегистрировано 39,2% и 39,3% павших животных Это связано с тем, что у части животных к началу лечения, была клиническая картина заболевании в разгаре, лечение начато поздно В третьей группе падежа не наблюдалось, т к в нее вошли животные, у которых сформировался иммунитет

В контрольной группе у кроликов наблюдались слизисто-фибринозные, а затем гнойно-фибринозные выделения из носа и глаз Из-за обильного гнойного отделяемого образовывались корочки у носовых отверстий, что затрудняло носовое дыхание, уши были отечными и опущенными Животные были сильно истощенны При проведении патолого-анатомического вскрытия павших кроликов обнаружены эмфизематозные изменения в легких, выявлена очаговая гнойная пневмония

Бактериологическое исследование показало, что Ирилис не только не оказывал отрицательного влияния на облигатных представителей кишечной микрофлоры, но и способствовал нарастанию их количества (табл 7) После проведенного лечения существенно возрастало количество бифидо- и лактобактерий (с 104 до Ю6КОЕ/г) Применение Ирилиса способствовало элиминации УПБ из легких, а об-семененность фекалий энтеробактериями и кокками под воздействием препарата снижалась в 2-3 раза

В контрольных группах выявлена тенденция к ухудшению бактериологических показателей понижение количества бифидо- и лактофлоры, уровень УПБ оставался без изменения, а в некоторых случаях зарегистрирован рост бактерий (например, количество стафилококков, Proteus mirabilis увеличилось на два порядка)

(табл. 7). Выявлено усиление контаминации УПБ в легких, являющейся причиной пневмонии.

Таким образом, проведенные испытания перспективного ветеринарного про-биотика Ирилис показали высокую терапевтическую эффективность и возможность его применения в ветеринарной практике для лечения секу н дар них инфекций.

На втором этапе исследования изучали влияние пробиотика Ирилис на сохранность, рост и развитие молодняка кроликов в хозяйстве, длительно неблагополучном но многим инфекционным заболеваниям бактериальной и вирусной этиологии в зимнее время. Испытания профилактической эффективности Ирилиса проведены на 239 особях молодняка кроликов обоего пола пород «Серебристый», «Черно-бурый» и «Белый великан» в возрасте до 120 дней и на 36 самках в возрасте до 2 лет.

Таблица 10. Схема проведения испытания профилактической эффективности Ирилиса

Группа Подгруппа 11 ре парат/дозы Способ введения Сроки введения/дни

1 опытная самки Ирилис 5х1(У' Per os 7

молодняк/до отъема - Per os 7

1 контроль самки Физ. раствор Per os 7

молодняк/до отъема - Per os 7

2 опытная самки - Per os 7

молодняк/после отъема Ирилис l\10v Per os 7

2 контроль самки - Per os 7

молодняк/после отъема Физраствор Per os 7

□ выжило животных ■ пало животных

Для проведения опыта по возрастному принципу методом случайной выборки было сформировано: 1-я и 2-я основные и 1-я и 2-я контрольные группы животных. Условия содержания групп были идентичны. С целью изучения опосредованного влиянии препарата на организм новорожденных, самки 1 основной грунта получали Ирилис peros, в дозе 5х 105 КОЕ/мл, в течение 7 суток (табл. 9). Вторую основную группу составил молодняк кроликов в возрасте после отъема, получавший препарат per os, в дозе 1x10^ КОЕ/мл, в течение того же времени. Самки и молодняк аналогично сформированных контрольных групп во время проведения эксперимента ежедневно получали ЗФР в том же объеме (табл.9). Длительность наблюдения в 1 опытной и 1 контрольной группах составила 120 сут; в 2 опытной и 2 контрольной - 90 суток. Профилактическая эффективность оценивалась по результатам сохранности, коррекции микробиоценоза и данным преду бой ного взвешивания.

опыт I контроль 1 опмт 2 контроль 2

Рис 4 Выживаемость молодняка кроликов в опытных и контрольных группах

Полученные данные свидетельствовали, что использование препарата Ирилис в процессе выращивания молодняка кроликов оказывает положительное действие на организм животных, обеспечивая сохранность поголовья выживших животных и больший прирост живой массы по сравнению с контролем В контрольных группах выявлена высокая летальность (47,2% и 62,2%), тогда как в опытных группах она была в три раза ниже (17,9% и 29,6%) /рис 4/ При проведении патолого-анатомического исследования кроликов контрольных групп обнаружены эмфизематозные изменения в легких, выявлена гнойная очаговая пневмония

Таблица! 1 Весовые характеристики молодняка кроликов

№ группы Количество кроликов Средний вес кроликов, кг Разница среднего веса опытной и контрольной группы (Г) Привес кроликов основной / контрольной групп (%)

1 основная 56 2,47±0,03 140 г 5,6

1 контроль 61 2,33±0,04 -

2 основная 56 2,95±0,13 160 г 2,4

2 контроль 66 2,79±0,13 -

Таблица 12 Состав микрофлоры, выделенной из легких и фекалий кроликов 2 опытной и 2 контрольной групп

Название микроорганизма Количество микрофлоры выделяемой от животных (КОЕ/г)

Начало опыта Конец опыта

2 опытная группа 2 контрольная группа

легкие фекалии легкие фекалии легкие фекалии

Staphylococcus aureus 103 106 - 103 104 10s

S epidermidis - 106 - 10' - 10"

Enlerococcus spp (гемолит ) - 108 - 103 103 10s

Escherichia coli (гемолит) 10' 10" - - - 10"

Enterobacter spp - 10' - 105 - 10'

Proteus vulgaris - 10' - ю4 10J 10s

P mirabilrs - 103 - 10" 103 10"

Lactobacterium spp - ю4 - 10" - ю4

Bifidobacterium spp - ю4 - 10" - ю4

Бактериологическое исследование показало, что Ирилис оказывал корректирующее действие на кишечную микрофлору, и способствовал увеличению количества бифидо-и лактобактерий (с 104 до 10 КОЕ/г) Наиболее выраженное влияние Ирилиса выявлено при оценке обсемененности легких условно патогенными бактериями, которые не были обнаружены у кроликов 2 опытной группы Обсеменен-ность фекалий УПБ под воздействием препарата снизилась от 2 до 5 ^ Во 2 контрольной группе выявлена тенденция к ухудшению бактериологических показателей понижение количества бифидо- и лактофлоры, уровень УПБ оставался без изменения, а в некоторых случаях зарегистрирован рост стафилококков (на 2

Выявлено усиление контаминации УПБ в легких, являющейся причиной пневмонии

Изучение влияния нового ветеринарного пробиотика Ирилис на сохранность, рост и развитие молодняка кроликов в хозяйстве, длительно неблагополучном по инфекционным заболеваниям показали возможность применения препарата для профилактики и лечения инфекционных заболеваний кроликов, при этом значительно снизить риск инфицирования молодняка кроликов УПМ

Выводы

1 Из>чение пробиотических свойств перспективного пробиотика Ирилис показало его безопасность, авирулентность, отсутствие токсичных и токсигенных свойств

2 Сравнительные исследования пробиотических культур, входящих в новый ветеринарный препарат Ирилис, показали их преимущества перед штаммом - основой коммерческого пробиотика Pací flor® CIO, по физиолого-биологическим характеристикам (по отсутствию гемолитической активности и ферментов, обусловливающих патогенные свойства, а также устойчивости к биологическим жидкостям)

3 Штаммы В subtihs ВКПМ 2335 и В hcheniformis ВКПМ 2336 проявляют низкий уровень адгезивной активности и кратковременное персистирование в желудочно-кишечном тракте, что исключает условия для неблагоприятного физиологического воздействия на организм животного при терапевтическом применении препарата

4 Перспективный ветеринарный пробиотик Ирилис обладает высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно патогенных штаммов, выделенных от больных животных

5 Применение Ирилиса для лечения и профилактики миксоматоза и секун-дарных инфекционных заболеваний животных оказывает защитное действие и позволяет увеличить выживаемость молодняка кроликов от 60,7 до 100%

6 Схема применения препарата Ирилис, апробированная в условиях кролиководческого хозяйства, длительно неблагополучного по инфекционным заболеваниям, показала высокую лечебно- профилактическую эффективность в рекомендуемых дозах при применении пробиотика в течение 7-14 суток

7 Препарат Ирилис способствует увеличению прироста живой массы новорожденных крольчат в среднем на 150 г к концу откорма

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Мефед К М , Осипова И Г, Васильева Е А Изучение антагонистической активности споровых пробиотиков в отношении грибов рода Candidal!Сборник научных трудов конгресса «Успехи медицинской микологии» - Москва -2005 -Том VII -с 148

2 Мефед К М , Осипова И Г, Давыдов Д С Результаты комплексного исследования безопасности штаммов-пробиотиков рода Bacillus/1 материалы научной конференции «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний» - Н Новгород - 2006 -с 236

3 Мефед К М, Осипова И Г, Васильева В А, Давыдов Д С Результаты сравнительного исследования новых ветеринарных пробиотиков Ирилис и Пациф-

лор// Вестник РУДН Серия медицина Юбилейный выпуск № 2(34) -2006 -с 27 -

4 Мефед К М , Давыдов Д С , Осипова И Г , Шарая В С , Васильева Е А Применение споровых пробиотиков в мировой практике// тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006 Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» - Москва 2006 - с 66

5 Стяжкин К К , Васильев Н Т , Поберий И А, Забокрицкий А Н , Рогожин А 3,СирикМ С,ЧебыкинА М, Давыдов Д С, Мефед К М 10-летний опыт серийного производства и применения пробиотика «Биоспорин» и новые задачи// Там же - с 89 - 90

31

МЕФЕД Кирилл Михайлович (Россия). Новый споровый пробиотик Ирилис и его

использование в ветеринарной практике

Диссертация посвящена комплексному исследованию нового пробиотического препарата на основе аэробных споровых бактерий рода Bacillus - Ирилис В ходе исследований были изучены биологические свойства штаммов препарата (В subtilis 2335и В lichem-formis 2336) in vitro и in vivo Исследование пробиотических культур, входящих в состав препарата Ирилис, проводилось в сравнении со штаммом В cereus АТСС 1489 - основой коммерческого ветеринарного пробиотика Paciflor СЮ

Было проведено исследование безопасности штаммов, которое включало изучение вирулентности, общей токсичности, токсигенности, «острой» и «хронической» токсичности, а также адгезивной активности штаммов-пробиотиков к энтероцитам и колоноцитам и динамики персистирования штаммов и препаратов в кишечнике Всестороннее изучение пробиотических штаммов В subtilis 2335 и В licheniformis 2336 показало их безопасность, они не вызывали патологических состояний животных

В ходе исследований было установлено, что пробиотические штаммы В subtilis 2335 и В licheniformis 2336 обладают широким спектром антагонистической активности в отношении клинических штаммов, выделенных от больных животных, а также вакцинных штаммов В работе рассмотрена возможность внедрения препарата Ирилис в систему лечебно-профилактических мероприятий при выращивании кроликов

Выполнены клинические исследования терапевтической и профилактической эффективности препарата Ирилис, проводившиеся на фоне эпизоотии миксоматоза кроликов Использование препарата позволило значительно снизить падеж животных в различных возрастных группах, а также увеличить привес животных опытных групп по сравнению с контрольными

Ключевые слова споровый пробиотик, Ирилис, пробиотические штаммы, кролики, мик-соматоз

MEFED К М (Russia) New spore-forming probiotic Inhs and its use in veterinary.

The dissertation is devoted to the complex research of new veterinary probiotic based on aerobic spore-formmg bacteria of Bacillus genus - Inlis During researches biological properties of preparation strains (В subtilis ВКПМ 2335 and В licheniformis ВКПМ 2336) in vitro and m vivo have been investigated Research probiotic cultures of Inlis was spent in comparison with strain В cereus ATCC 1489 - a basis of commercial veterinary probiotic Paciflor CIO

It has been carried out research of safety of the strains which included studying virulence, the general toxicity, toxigemcity, "acute" and "chronic" toxicity, and also adhesive activity of probiotic strains to enterocytes and colonocytes both dynamics of persistence of strains and preparations in intestines All-round studying of probiotic strains В subtilis 2335 and В licheniformis 2336 has shown their safety, they did not cause pathological conditions of animals

During researches it has been established that probiotic strains В subtilis 2335 and В licheniformis 2336 possess a wide spectrum of antagonistic activity concerning clinical strains, allocated from sick animal, and also vaccinal strains In work the opportunity of introduction of preparation Inlis in system of treatment-and-prophylactic actions at cultivation of rabbits is considered

Clinical researches of therapeutic and preventive efficiency of preparation Inlis, spent on a background of rabbit myxomatosis epizooty are executed Use of a preparation has allowed to lower considerably a mortality of animals in various age groups, and also to increase an additional weight of animal skilled groups in companson with control

Key words spore probiotic, Inlis, probiotic strains, rabbits, myxomatosis

Отпечатано в типографии "АРБАТ"

Адрес г Москва, ул Поварская, д 8/1, стр 2

Подписано в печать 26 04 2007 г ,

Тираж 100 экз Заказ № 84

Тел 291-71-42/62

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мефед, Кирилл Михайлович

ВВЕДЕНИЕ

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. МИКРОФЛОРА ОРГАНИЗМА КРОЛИКОВ В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ

1.1. Состав нормальной микрофлоры и его динамика

1.2. Значение микрофлоры кишечника и ее роль в поддержании гомеостаза

1.3. Этиологические факторы и последствия дисбаланса нормальной микрофлоры организма

ГЛАВА 2. АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ТЕРАПИИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КРОЛИКОВ

2.1. Проблемы антибиотикотерапии

2.2. Применение пробиотиков в ветеринарии

2.3. К вопросу о безопасности применения споровых пробиотиков ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1.1. Материалы

1.2. Методы

1.2.1. Исследование культурально-биохимических свойств бактерий р .Bacillus

1.2.2. Исследование культурально-биохимических свойств микроорганизмов

1.2.3. Определение устойчивости бактерий к действию биологических жидкостей

1.2.4. Методы изучения безопасности

1.2.4.1. Изучение безвредности

1.2.4.1.1. Изучение вирулентности

1.2.4.1.2. Изучение токсичности

1.2.4.1.3. Изучение токсигенности

1.2.4.2. Изучение острой и хронической токсичности

1.2.5. Определение антагонистической активности

1.2.6. Метод определения адгезии микробов к эпителиальным клеткам кишечника крыс или мышей

1.2.7. Оценка персистирования штаммов рода Bacillus в желудочно-кишечном тракте мышей

1.2.8. Изучение влияния препарата Ирилис на физиологические показатели периферической крови животных

1.2.9. Методы статистической обработки результатов исследований

ГЛАВА 2. ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРЕПАРАТА ИРИЛИС

2.1 Изучение культуральных, биохимических и морфологических свойств бактерий рода Bacillus

2.2 Изучение безопасности штаммов

2.3 Изучение биологических свойств штаммов пробиотиков в опытах in vitro

ГЛАВА 3. КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРЕПАРАТА ИРИЛИС

3.1. Изучение лечебной эффективности Ирилиса при миксоматозе кроликов

3.2. Исследования влияния Ирилиса на рост и сохранность молодняка кроликов

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новый споровый пробиотик Ирилис и его использование в ветеринарной практике"

Актуальность темы

Согласно данным Департамента ветеринарии РФ, патология ЖКТ инфекционной этиологии, в общей структуре заболеваний молодняка животных составляет до 75% (26; 29).

Особенности этиологии и патогенеза инфекционных желудочно-кишечных заболеваний молодняка неонатального возраста связаны со структурными, количественными и качественными нарушениями в микробиоценозе кишечника, снижением активности колострального иммунитета, низкой естественной резистентностью, повышенной восприимчивостью новорожденных к бактерийным и вирусным антигенам, поступающим пероральным путем (27; 28; 60).

Особенно остро эта проблема стоит в одной из приоритетных областей пушного животноводства - кролиководческой отрасли. По данным НИИ Пушного звероводства и кролиководства, до 50% новорожденных крольчат подвержены различным инфекционным заболеваниям. Падеж молодняка наблюдается в первые 20 дней жизни, в основном, от острых кишечных инфекций и пневмонии различной этиологии (45; 47; 55).

Использование антибиотиков для профилактики желудочно-кишечных болезней, ассоциированных с дисбиотическими явлениями в микробиоценозе кишечника животных, проблему усугубило. Негативные последствия фармакологического прессинга выразились в нарастании быстрыми темпами множественной лекарственной резистентности условно патогенных микроорганизмов, адаптации бактерий к несвойственным им экологическим нишам, появлении и циркуляции в хозяйствах высоко вирулентных штаммов эшерихий, сальмонелл, стафилококков, иерсиний, кампилобактерий и др. микроорганизмов (9; 28; 70; 76).

С 2007 г в странах Евросоюза вводится полный запрет на использование пищевых антибиотиков ветеринарного назначения (89). Вышеизложенное заставляет исследователей пересмотреть многие методологические подходы к вопросам оптимизации контроля над эпизоотическим процессом болезней, возбудителями, которых являются условно патогенная бактериальная микрофлора.

Недостаточная эффективность традиционных мероприятий, направленная на повышение сохранности молодняка, обусловливает необходимость применения принципиально новых эффективных препаратов (5; 18; 64).

Наиболее полно этим требованиям отвечают пробиотики - препараты, содержащие живые микроорганизмы. Аспекты использования пробиотиков в ветеринарии затрагивают широкий круг проблем, который включает коррекцию кишечного биоценоза, иммунной, гормональной и ферментной систем животных (4; 12; 15; 77; 79; 84; 102).

В последние годы в ветеринарной практике в качестве препаратов-пробиотиков для терапии и профилактики желудочно-кишечных и других инфекций находят широкое применение бактерии рода Bacillus (32; 34; 35; 37; 38; 40; 44; 52; 83). В странах Евросоюза активно используются препараты Paciflor® СЮ, основу которого составляет штамм В. cereus АТСС 1489; Toyocerin (В. сег-eus var toyoi NCIMB-40112/CNCM-1012)-, BioPlus 2B (Я subtilis DSM 5750 и В. licheniformis DSM 5749) и некоторые другие (61; 62; 83; 89; 115). Следует отметить, что только японский препарат Toyocerin с успехом применяется при лечении заболеваний кроликов (89,122).

В ветеринарную практику Российской Федерации внедрены несколько бациллярных пробиотических препаратов: Споровит, Ветом-4, CJI-бактерин, Спо-ролакт, Ветбактерин, Субтилис, Биоплюс 2Б (1; 15; 35; 37; 38; 39; 40). Но ни один из перечисленных пробиотиков не применяется в кролиководстве. В последнее время российскими учеными разработан новый ветеринарный препарат Ирилис, включающий штаммы В. subtilis ВКПМ 2335 и В. licheniformis ВКПМ 2336 и обладающий рядом преимуществ перед отечественными и зарубежными аналогами (32). Однако этот препарат также не испытывался в кролиководстве.

Использование бациллярных препаратов в ветеринарии делает необходимым тщательное изучение безопасности применяемых культур. В тоже время, практически отсутствуют данные об изучении патогенности используемых штаммов пробиотиков (31).

Кроме того, также требуют совершенствования методы и критерии оценки биологических свойств штаммов, обеспечивающих лечебную эффективность препаратов (82; 83; 91).

Цели и задачи исследований

Целью исследования явилось изучение биологических свойств перспективного ветеринарного пробиотика Ирилис (В. subtilis ВКПМ 2335 и В. licheniformis ВКПМ 2336) in vitro и in vivo и внедрение его в систему лечебно-профилактических мероприятий при выращивании кроликов.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Сравнительное исследование пробиотических культур, входящих в перспективный ветеринарный препарат Ирилис и коммерческий пробиотик Paciflor® СЮ, по физиолого-биологическим характеристикам.

2. Изучение безопасности штаммов исследуемых пробиотиков.

3. Сравнительное исследование колонизационной активности (антагонизма, адгезивных свойств и персистирования в желудочно-кишечном тракте) штаммов, входящих в Ирилис и Paciflor® СЮ.

4. Проведение клинических испытаний и оценка лечебной и профилактической эффективности ветеринарного пробиотика Ирилис.

Научная новизна

Впервые при сравнительном изучении биологических свойств перспективного ветеринарного пробиотика Ирилис выявлено его преимущество перед коммерческим ветеринарным препаратом Paciflor® СЮ и доказана его безопасность для использования в ветеринарной практике.

Впервые продемонстрировано преимущество пробиотического препарата Ирилис перед коммерческим ветеринарным препаратом Paciflor® СЮ по антагонистической активности в отношении клинических штаммов УПБ, выделенных от больных кроликов.

Впервые доказана терапевтическая эффективность перспективного пробиотика Ирилис на фоне эпизоотии миксоматоза кроликов, позволившая значительно снизить падеж животных в различных возрастных группах, а также увеличить привес животных.

Практическая значимость

Показана высокая лечебно-профилактическая эффективность перспективного препарата Ирилис на поголовье кроликов в хозяйстве, длительно неблагополучном по многим инфекционным и инвазионным заболеваниям.

Изучено влияние пробиотика на рост, развитие и сохранность молодняка кроликов. Полученные данные подтверждены актами, утвержденными руководителями хозяйств. Разработаны наставления по применению ветеринарного пробиотического препарата Ирилис в кролиководческих хозяйствах.

Положения, выносимые на защиту

1. При разработке новых пробиотических препаратов ветеринарного назначения на основе спорообразующих бактерий необходимо проведение доклинических испытаний штаммов, входящих в пробиотики для ветеринарной практики.

2. Сравнительные исследования нового ветеринарного пробиотика Ирилис с коммерческим препаратом РаЫАог® СЮ выявили преимущество первого по показателю безопасности и специфической активности.

3. Экспериментально-клиническое изучение перспективного пробиотика Ирилис свидетельствует об его высоком лечебно-профилактическом потенциале.

Апробация результатов диссертации

Основные результаты диссертационной работы доложены и представлены в материалах научной конференции «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний» (Н. Новгород 2006 г.) и Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва 2006 г.), на заседании кафедры микробиологии РУДН (2006,2007).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК России, и в материалах всероссийских конференций.

Объем и структура работы

Диссертация построена по традиционному плану и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 2 глав собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 92 страницах текста компьютерной верстки и иллюстрирована 24 таблицами и 12 рисунками. Список литературы представлен 126 источниками (59 отечественными и 67 зарубежными).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Мефед, Кирилл Михайлович

ВЫВОДЫ

1. Всестороннее изучение пробиотических культур В. subtilis ВКПМ 2335 и В. licheniformis ВКПМ 2336, входящих в состав препарата Ирилис, показало их безопасность, так как они не вызывали никаких патологических состояний у животных, не проявляли вирулентных, токсичных и токсигенных свойств.

2. Сравнительные исследования пробиотических культур, входящих в новый ветеринарный препарат Ирилис, показали их преимущества перед штаммом -основой коммерческого пробиотика Paciflor® СЮ по физиолого-биологическим характеристикам (по отсутствию гемолитической активности и ферментов, обусловливающих патогенные свойства, а также устойчивости к биологическим жидкостям).

3. Штаммы В. subtilis ВКПМ 2335 и В. licheniformis ВКПМ 2336 проявляют низкий уровень адгезивной активности и кратковременное персистирование в желудочно-кишечном тракте, что исключает условия для оказания неблагоприятного физиологического воздействия на организм животного при терапевтическом применении препарата.

4. Новый ветеринарный пробиотик Ирилис обладает выраженным антагонистическим воздействием на патогенные и условно патогенные штаммы.

5. Схема применения препарата Ирилис, апробированная в условиях кролиководческого хозяйства, показала высокую лечебно-профилактическую эффективность в рекомендуемых дозах при применении пробиотика в течение 7 суток.

6. Препарат Ирилис способствует увеличению прироста живой массы новорожденных крольчат в среднем на 150 г к концу откорма.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мефед, Кирилл Михайлович, Москва

1. Ананьина Ю. Г., Астраханцев В. И. Микробиологические и биохимические характеристики пищеварительных процессов у кроликов // Научные труды. Т. 17. «Содержание пушных зверей и кроликов». М.; 1978. С. 143-147.

2. Бакунина Л.Ф., Тимофеев И.В., Перминова Н.Т. Пробиотики на основе спорообра-зующих микроорганизмов рода Bacillus и их использование в ветеринарии //Биотехнология.-2001. № 2.-С. 48.

3. Бондаренко В.М., Воробьев A.A. Дисбиозы и препараты с пробиотической функци-ей.//Журн.микробиол.- 2004. -№1. С.84-92.

4. Войчишина Л.Г., Чаплинский В.Я., Вьюницкая В.А Применение спорообразующих бактерий в лечении больных дисбактериозом // Врачебное дело. 1991.-№ 6. - С. 73 -75.

5. Воробьев A.A., Лыкова Е.А. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойства и защитные функции // Ж. микробиол., эпидемиол., иммунол. — 1999. — № 6. — С. 102-105.

6. Гончарова Г.И., Дорофейчук В.Г., Смолянская А.З., Соколова К.Я. Микробная экология кишечника в норме и при патологии // Антибиотики и химиотерапия. 1989. - 34, № 6. - С. 462-466.

7. Горская Е.М., Манохина И.М., Горелов A.B., Поспелова В.В., Рахимова Н.Г. Методические рекомендации по определению адгезии бактерий кишечного происхождения к эпителиальным клеткам тонкого и толстого кишечника// М.- 1989.- 7 С.

8. Гриценко В.А., Брудастов Ю.А., Кудря Е.В., Васильева Л.И. Сравнительный анализ чувствительности к желчи энтеробактерий // Журн.микробиол.- — 2002. — № 3. — С. 65-67.

9. Девришов Д.А., Печникова Г.Н., Бедоева З.М. Биоспорин как терапевтическое средство против желудочно-кишечных заболеваний поросят//Новое в диагностике, лечении и профилактике болезней животных: Межвуз.сб. науч. тр.-М.:МГАВМиБ, 1996.-С. 15-19.

10. Н.Жданов П.И. Применение споробактерина жидкого поросятам // Ветеринария. -1994.-№7.- С. 41-44.

11. Емельяненко П. А., Козловский Ю. Е., Бурмистрова О. Е. Пробиотики как кормовые добавки для песцов // Тезисы докладов 3 Международной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве». С.398-399

12. Кириллов А. К. Миксоматоз кроликов// Кролиководство и звероводство. 2001 . N 1. С. 23-25.

13. Кругликов В.Д., Цураева Р.И., Рыжков И.В. и др. Возможность приживления Lactobacillus acidophilus в кишечнике белых мышей на фоне бактериальной терапии // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997. - № 1. - С. 67-69

14. Круглова Н. М. Терапия желудочно-кишечных заболеваний кроликов // Научные труды. Т.26. «Биология и ветеринария пушных зверей и кроликов». М.; 1981. С. 35-39.

15. Круглова Н. М. Незаразные желудочно-кишечные заболевания кроликов // Кролиководство и звероводство. №2. М.; 1980. С. 32-33.

16. Круглова Н. М. Предупреждение желудочно-кишечных заболеваний. // Кролиководство и звероводство, №1. М.; 1985. С. 26.

17. Круглова Н. М. Микрофлора желудочно-кишечного тракта кроликов в норме и при энтеритах // Научные труды. Т. 21. «Вопросы ветеринарии и биологии клеточных пушных зверей и кроликов». М.; 1980. С. 77-79.

18. Круглова Н. М. К вопросу бактериальной обсеменённости кормов для пушных зверей // Сборник научных трудов. Т. 36. «Биологически активные вещества в звероводстве и кролиководстве и пантовом оленеводстве». М.; 1989. С. 189-195.

19. Круглова Н. М. Выделение молочно-кислой микрофлоры // Научные труды. Т. 24. «Проблемы ветеринарии в пушном звероводстве и кролиководстве». М.; 1980. С. 64-67.

20. Круглова H. M. Бифидобактерии в ЖКТ кроликов // Научные труды. Т. 29. «Клеточное содержание норок, лисиц, соболей, песцов, нутрий и кроликов». M.; 1983. С. 223-227.

21. Литвин В.П., Резник С.Р., Вьюницкая В.А. Бактерин-CJI при острых желудочно-кишечных болезнях // Проблемы диагностики, терапии и профилактики незаразных болезней с.-х. животных: Сб. науч. тр. Воронеж: ВЗВИ, 1986.-С. 76-78.

22. Малик Н. И., Панин А.Н, Вершинина И.Ю. Пробиотики: теоретические и практические аспекты// Био №3(18), март 2002

23. Наташкина М.Ю. Профилактика миксоматоза кроликов // Журнал кролиководство и животноводство. 2006.2 с 19-22

24. Ноздрин Г.Л., Крачковская В.А., Наумкин И.В. и др. // Акт. вопр. ветеринарии / Тез. докл. науч.-практ. конф. факультета вет. мед. Новосибирск: НГАУ, 1997. - С. 20-21.

25. Осипова И.Г., Сорокулова И.Б., Васильева Е.А., Буданова Е.В. Доклинические испытания новых споровых пробиотиков//Вестн.РАМН №12,2005., с.36-39.

26. Пат. РФ 2264453 Биопрепарат «Ирилис» ветеринарного назначения» С 12 N 1/20, С12R, 2003

27. Пат. 5372810 США, МКИ5 А61К 37/00, C12N 1/00. Composition for the prévention and treatment of diarrhea in livestock / Onishi N., Yamashiro A., Ajinomoto C., Inc. (Япония) -№ 973572; Заявл. 09.11.92; Опубл. 13.12.94, № 1-229653; НКИ 424/93.4

28. Пат. 63-209580 Япония, МКИ6 C12N 1/20. Bacillus subtilis С-3102./ Япония. Опубл. 31.08.88

29. Патент РФ 2035186. Профилактический биопрепарат споролакт. А 61К 35/66, БИ №14,1995.

30. Патент РФ 1563699. Способ профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных. А 61 КЗ 5/74, БИ№ 18,1990.

31. Патент РФ 2129432. Биопрепарат субтикол для профилактики и лечения инфекционных болезней. А 61К 35/74, БИ №12,1999.

32. Патент РФ 2130316. Лечебно-профилактический биопрепарат бак-тиспорин. А61К35/74, БИ№14,1999.

33. Патент СССР 1710575. Штамм бактерий Bacillus sp компонент лечебно-профилактического препарата против дисбактериозов и аллергий, С 12 N1/20, БИ №5, 1992.

34. Патент СССР 1723117. Штамм бактерий Bacillus pulvifaciens, ис пользуемый для изготовления лечебно-профилактического препарата против бактериальных инфекций у животных. С 12 N 1/20, БИ №12,1992.

35. Патент РФ № 2188001 способ лечения миксоматоза и вирусной геморрагической болезни кроликов.

36. Плугина И. В. Молекулярно-генетический анализ распространения токсигенной микрофлоры// Автореферат на соискание учёной степени кандидата биологических наук. Пос. Родники МО.; 2004.18 с.

37. Пшеничнов В.А., Малинкин Ю.Н. Антивирусная активность интерферонов в экспериментах на животных //Вопр. вирусологии 1988.- 33, № 3. - С. 261-267

38. Резник С.Р., Вьюницкая В.А., Сорокулова И.Б. Биологические свойства споровых аэробных бактерий, выделенных из организма человека и животных./ Фитонциды. -Киев: Наукова думка, 1981. С. 35-40.

39. Рютова В. П., Несцепляева Л. И., Есипилан В. А. Роль бактериальной и вирусной инфекции в этиологии респираторных заболеваний кроликов // Научные труды. Т. 27. Разведение и содержание пушных зверей и кроликов. М.; 1982. С. 153-158.

40. Рютова В. П., Гришина Л. Е. Кормовые антибиотики в промышленном кролиководстве // Сборник научных трудов. Т. 34. «Биология и ветеринария в клеточном пушном звероводстве и промышленном кролиководстве». М.; 1986. С. 54-59.

41. Самгородская Н.В., Сорокулова И.Б., Ралко Н.М. Изучение действия HeicoTopix биопрепаратов на бактерии рода Yersinia // Микробиол. журн. 1994. - 56, № 4. - С. 8182

42. Смирнов В.В., Резник СР., Вьюницкая В.О. Современные предста ления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus // Микробиол. журн. 1993. - № 4. - С. 92-112.

43. Смирнов В.В., Резник СР., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ. - Киев: Наукова Думка, 1982.

44. Самгородская Н.В., Сорокулова И.Б., Ралко Н.М. Изучение действия некотор1х биопрепаратов на бактерии рода Yersinia // Микробиол. журн. 1994. - 56, № 4. - С. 8182

45. Сорокулова И.Б. Влияние пробиотиков из бацилл на функциональную активность макрофагов//Антибиотики и химиотерапия, 1998,43:2 С.20-23

46. Сорокулова И.Б. Теоретическое обоснование и практика применения бактерий рода Bacillus для конструирования новых пробиотиков/Дис.док.биол.наук., Киев., 1999., 180 с.

47. Сорокулова И.Б., Осипова И.Г., Терешкина Н.В., Васильева Е.А., Буданова Е.В. Изучение безопасности бацилл-пробиотиков// Вестн.РАМН №1,2006., с. 50-54

48. Стрижаков A.A. Проявление миксоматоза в 2005 г. на примере кролиководческих хозяйств из разных Регионов//Журнал кролиководство и животноводство. 2006. 1с 1922

49. Тараканов П. В., Эрнст JI. К. Перспективы создания новых пробиотиков на основе рекомбинантных штаммов бактерий, экспрессирующих эукариотические гены.//М.; 2002.

50. Тинаев H. Н. Эффективность применения пробиотиков нового поколения в кролиководстве // Кролиководство и звероводство, №4,2006. С. 5-7

51. Шевченко A.A., Шевченко JI.B. "Вирусные болезни кроликов", "АКВАРИУМ ЛТД", 2000. 80 с.

52. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Том I: Микрофлора человека и животных и ее функции. М., 1998. - 287 с.

53. Alvarez-Olmos M. I., Oberhelman R.A. Probiotic Agents and Infectious Diseases: A Modern Perspective on a Traditional Therapy//CID 2001:32 (1 June) • 1567-1576

54. Behrent G. Aufzuchtleistung abgesetzter Ferkel mit dem Probiotikum PACIFLOR // Schweinewelt. 1994. - 19, N 6. - P.219

55. Benedettini G., Delibero G., Pierotti R. et al Immunomodulation by Bacillus subtilis spores II Boll. Ist. Sieroter. Milan. 1983. -62, N 6. - P. 509-516.

56. Bengmark S. Ecological control of the gastrointestinal tract: the role of probiotic flora. Gut 1998; 42:2-7.

57. Bergey,s Manual of Systematic Bacteriology: Vol.1., 3 /Ed. N. R. Krieg, H. G. Holte- Baltimore etc.: Williams & Wilkins. 1986. -P. 965-1600.

58. Bonomi A. Probiotics in swine feeding: The use of Bacillus subtilis and Bacillus licheni-formis (experimental contribution) // Riv. della Soc. Italiana di Scienza Dell'Alimentazione. -1992.-21, N4.-P. 481-499

59. Brankova R., Gyosheva B., Michailova M., Georgiev G. Antimicrobial activity of lactic acid bacteria against intestinal and food-borne pathogens // Biotechnol. and Biotechnol. Equip.- 1994.-8,N4.-P. 13-18.

60. Cartman S.T. and La Ragione R.M. Spore probiotics as animal feed supplements //In: Bacterial SPORE Formers: Probiotics and Emerging Application (Ricca, E., Henrigues, A.O. and Cutting, S.M., Eds).- 2004. -p.155-161

61. Casula G, Cutting SM. Bacillus probiotics: spore germination in the gastrointestinal tract. Appl Environ Microbiol 2002;68:2344-52.

62. Corazza G.R., Sorge M., Strocchi A. et al. Non-absorbable antibiotics and small bowel bacterial overgrowth // Ital. J. Gastroenterol. 1992. - 24, N 9. - P. 4-9.

63. Davidson J.N., Hirsch D.C. Bacterial competion as a means of preventing diarrhea in pigs. Infect. Immunol. -1976:13:17773-1774.

64. Due L. H., Hong H. A., Barbosa T.M. et al. Characterization of Bacillus Probiotics available for human use,//App. and Environmental. Macrobiol., Apr. 2004, V.70, № 4 p.2161-2171

65. Ducluzeau R., Dubos F., Rainbaud P., Abrams G. Production of an antibiotic substance by Bacillus licheniformis within the digestive tract of gnotobiotic mice //Antimicrob.Agents Chemother. 1978. - 13, N 2. - P. 97-103

66. Fais S. Lymphocyte activation by Bacillus subtilis spores // Boll. 1st. Sieroter. Milan. -1987. -66,N5.-P. 391-394.

67. Fiorini G., Cimminello C., Chianese R. et al. Bacillus subtilis selectively stimulates the synthesis of membrane bound and secreted IgA // Chimioterapia. 1985. - 4. - P. 310-315.

68. Fuller R. A review: probiotics in man and animals // J. Appl. Bacterid.- 1989.- 66, N 5.-P.365-378.

69. Fuller R. History and development of probiotics // Probiotics. The scientific basis. London: Chapman & Hall, 1992. - P. 1-9.

70. Fuller R., Gibson G.R. Modification of the intestinal microflora using probiotics and pre-biotics // Scand. J. Gastroenterol. 1997. - 32, Suppl. n 222. - P. 28-31.

71. Green D.H., Wakeley P.R., Page A., et al. Characterization of two Bacillus probiotics. Appl Environ Microbiol 1999;65:4288-91.

72. Haenal H., Bendig J. Intestinal flora in health and disease // Progr. Food and Nutr. Sci. -1975.-N 1.-P. 21-64.

73. Hatch R.C., Thomas R.O., Thayne W.V. Effect of adding Bacillus acidophilus to milk fed baby calves// J.Dairy Sci. 1973. - 56, N 4. - P.682-687

74. Havenaar R., Ten Brink B., Huis in't Veld JHJ. Selection of strains for probiotic use//Probiotics. The scientific basis. London: Chapman & Hall, 1992. - P. 209-224.

75. Henry R., Mielle F., Morh H. Le Bacillus subtilis en therapeutique intestinale // Gaz. Med. France. 1950. - 57, N 10. - P. 537-541

76. Hoa NT, Baccigalupi L, Huxham A, et al. Characterization of Bacillus species used for oral bacteriotherapy and bacterioprophylaxis of gastrointestinal disorders. Appl Environ Microbiol 2000; 60:5241-7.

77. Hoffman T., Troup B., Szabo A., et al. The anaerobic life of Bacillus subtilis: Cloning of the genes encoding the respiratory nitrate reductase system // FEMS Microbiol. Lett. 1995. -131, N2.-P. 219-225.

78. Holzapfel W.H., Schillinger U. Introduction to pre- and probiotics.//Food Research International 35(2002).- p. 109-116

79. Hooper LV, Bry L, Falk PG, et al. Host-microbial symbiosis in the mammalian intestine: exploring an internal ecosystem. BioEssays 1998; 20:336-43.

80. Hosoi T, Amenati A, Kiuchi K, Kaminogawa S. Changes in fecal microflora induced by intubation of mice with Bacillus subtilis (natto) spores are dependent upon dietary components. Can J Microbiol 1999;45:59-66.

81. Hong H.A., Due Le Hong, Cutting Simon M. The use of bacterial spore formers as probi-otics//FEMS Microbiology Reviews 29 (2005).- c.813-835

82. Impey C.S., Mead G.C., George S.M. Competitive exclusion of Salmonellas from the chicken caecum using a defined mixture of bacterial isolates from the caecal microflora of the adult bird//J. Hygiene (Camb.). 1982. - 89, N 2. - 479-490

83. Ishibashi N., Yamazaki S. Probiotics and safety/Mm J Clin Nutr 2001;73(suppl):465S-470S.

84. Jenny B.F., Vandijk H.J., Collins J.A. Performance and fecal flora of calves fed a B.subtilis concentrate// J.Dairy Sci. 1991. - 74, N 6. - 1968-1973

85. Jiraphocakul S. Influence of dried B.subtilis culture and antibiotics on performance and intestinal microflora in turkeys//Poultry Science. 1990. - 69, N 11. - P. 1966-1973

86. Jorgensen J.H. Probiotika till svin. En litteraturoversigt og en afprovning at 2 probiotikas effekt under forskellige produktionsformer // Dansk Vet. Tidskr. 1988. - 71. - P.1211-1221

87. Katz E., Demain A.L. The peptide antibiotics of Bacillus: chemistry, biogenesis and possible function // Bacteriol. Rev. 1977. - 41, N 2. - P. 449-474.

88. Kornegay E.T., Thomas H.R. Bacterial and yeast preparations for starter and grower rations // Virginia polytechnic Institute and State University, Research Division Report, N 151. Blacksburg, Virginia, USA, 1973.

89. Lammers K. M., Helwig U., Swennen E., et al. Effect of Probiotic Strains on Interleukin 8 Production by HT29/19A Cells//The Americ. of Gastroent. 2002- V.97. №5. -S.l 182-1186

90. Landsudvalget for svin. Bioplus 2B till smagrise //Den rullende Afprofning af staid- og produktionssystemer. Copenhagen, Meddelse, 1989. - 162 p

91. Lawrence C., Nauciel C. Production of interleukin-12 by murine macrophages in response to bacterial peptidoglycan// Infect. Immun. 1998. - 66, N 10. - P. 4947-4949.

92. Lebbadi M., Galvez A., Valdivia E. et al. Biological activity of Amoebicin m4-A from Bacillus licheniformis M-4 // Antimicr. Agents and Chemother.- 1994. 38, N 8. - P. 18201823.

93. Lee M.-L.T., Ross R.A., Onderdonk A.B. Application of in vitro and in vivo to the study of microflora//Microb. Ecol. Health and Bisease. -1995. -8 №1. -P.31.

94. Lyons T.P., Fallon R.J. The probiotic concept: comming of age// World Biotech. Rept., 1986. prot. Conf., San Francisco, nov. 1986. Vol.2., Pt.7., New York, London. 1986. -P.69-80.

95. Marteau P., Seksik P. Jian R. Probiotics and intestinal health effects: a clinical perspective // British Journal of Nutrition (2002), 88, Suppl. 1, S51-S57

96. Maruta Kiyoshi, Miyazaki Hiroshi, Tadano Yukie et al. Effect of Bacillus subtilis C-3102 intake on fecal flora of sows and on diarrhea and mortality rate of their piglets. // Anim. Sci. and Technol. 1996. - 67, N 5. - P. 403-409

97. Mazza P. The use of Bacillus subtilis as an antidiarrhoeal microorganism // Boll. Chem. Farm. 1994. - 133, N 1. - P. 3-18

98. Mc Farland L.V. Biotherapeutic agents: boon or bane? //Microbiol. Ecol. Health and Disease. 1994. - 7, N 1. - P. 585-586

99. Michel M., Gutman L. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus and vancomycin-resistant enterococci: Therapeutic realities and possibilities// Lancet. 1997. - 349, N 9069. -P. 1901-1906

100. Muscettola M, Grasso G, Blach-Olszewska Z, et al. Effects of Bacillus subtilis spores on interferon production. Pharmacol Res 1992;26:176-7.

101. Muscettola M., Grasso G., Migliaccio P., Gallo V.C. Plasma interferon-like activity in rabbits after oral administration of Bacillus subtilis spores // J. Chemother. -1991. 3, Suppl. 3.-P. 130-132.

102. Onda T., Yanagida F. Tsuji M., et al. Time series analysis of aerobic bacterial flora during Miso fermentation// Letters in Applied Microbiology 2003,37,162-168

103. Ozawa K., Yokota H., Kimura M., Mitsuoka T. Effect of administration of Bacillus subtilis strain BN on intestinal flora of weanling piglets// Japan. J. Vet. Sci. 1981. - 43, N 5. - P. 771-775

104. Pelug W., Lingens F. Vitamin B6 biosynthese in Bacillus subtilis II Hoppe-Seyler's Z. Phisiol. Chem. 1978. - 359, N 5. - P. 559-570.

105. Penna F.J., Filho L.A.P, Cal9ado A. C. et al. Up-to-date clinical and experimental basis for the use of probiotics/ Jornal de Pediatria Vol. 76, Supl.2,2000. S.209-217

106. Pollman D.S. Probiotics in pig diets. // Recent Advances in Animal Nutrition. -Butterworth, London, 1986. P. 193-205

107. Pollman D.S., Danielson D.M., Peo E.F. Effects of microbial feed additives on performance of starter and growing-finishing pigs// J.Anim.Sci. 1980. - 51,N 3. - 577-581

108. Prokesova L., Novakova M., Mara M. Effect of Bacillus firmus and other sporulating aerobic microorganisms on in vitro stimulation of human lymphocytis // Folia Microbiol. -1994. 39. - P. 501-504.

109. Roth F.X., Kirchgessner M. Nutritive Wirksamkeit von Toyocerin. 1. Mitteilung: Ferkelaufzucht.// Landwirtsch. Forsch. 1988. - 41, N1. - P. 58-62

110. Simon GL, Gorbach SL. Normal alimentary tract microflora. In:Blaser MJ, Smith PD, Ravdin JI, Greenberg HB, Guerrant RL, eds. Infections of the gastroenterology tract. New York: Raven Press, 1995 P:53-68.

111. Su Li, Zhang Zhihong, Xiao Xianzhi, Wang Xiaomin. Влияние нового живого препарата Bacillus на микрофлору кишечника животных и функции иммунитета // J.Wuhan. Univ. Natur. Sei. Ed. 1996. - 42, N 4. - P. 516-518

112. Tachikawa T; Seo G; Nakazawa M; Sueyoshi M; Ohishi T; Joh К Estimation ofpro-biotics by infection model of infant rabbit with enterohemorrhagic Escherichia coli 0157-.H7. KansenshogakuZasshi, 72(12):1300-5 1998 Dec

113. Tannock G.W. Probiotics. A Critical Review. Horizon Sei. Press, Norfolk, England. 1999

114. Tannock G.W. Molecular assessment of intestinal microflora. Am.J.Clin.Nutr. 2001,73 (suppl):410-414

115. Thach P.N., Vu T.C., Nguen Т.Н. Le Bacillus subtilis en therapeutique et dans la prophilaxie // Rev. Immunol. 1968. - 72, N S. - P. 53-58

116. Tihole F. Fizioloski pomen bacteriemije z jejunalno mikrofloro// Zdrav. vestn. 1982. -51.-P.3-56