Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новый эффективный подход для получения рекомбинантных белков основного фактора роста фибробластов (FGF-2) и лиганд-связывающего внеклеточного домена рецептора II типа TGF-β (TβRII-ED) в E. coli

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Новый эффективный подход для получения рекомбинантных белков основного фактора роста фибробластов (FGF-2) и лиганд-связывающего внеклеточного домена рецептора II типа TGF-β (TβRII-ED) в E. coli"

484UZOU

На правах рукописи

ЕЛИСТРАТОВ ПАВЕЛ АЛЕКСЕЕВИЧ

НОВЫЙ ЭФФЕКТИВНЫЙ ПОДХОД ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ОСНОВНОГО ФАКТОРА РОСТА ФИБРОБЛАСТОВ (FGF-2) И ЛИГАНД-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ВНЕКЛЕТОЧНОГО ДОМЕНА РЕЦЕПТОРА II ТИПА TGF-ß (TßRII-ED) В Е. COLI

Специальность: 03.01.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О [JAP 2011

Москва-2011

4840280

Работа выполнена в лаборатории инженерии белка Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и на кафедре биоинженерии Биологического факультета МГУ.

Научные руководители: профессор, д.б.н. ДА.Долгих

к.б.н. М.Э. Гаспарян

Официальные оппоненты: профессор, д.х.н. В.И. Тишков

д.б.н. Л.А. Новикова

Ведущая организация: Государственный научный центр Российской Федерации ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Зашита состоится М » 2011 г. в « 14 » часов на заседании диссертационного

совета (Д 002.247.01) при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 1.

Автореферат разослан: «Я » 2011 года

Учёный секретарь /^'уДЛ^

диссертационного совета, / к.б.н. А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. За последние 30 лет индустрия биотехнологии создала более 50 успешных фармацевтических продуктов, основанных на терапевтических рекомбинантных белковых препаратах, таких как инсулин, интерфероны, цитокины, гормоны, факторы роста, биоинженерные антитела, ферменты и ингибиторы ангиогенеза. Более 500 новых рекомбинантных белковых препаратов в настоящее время проходят клинические испытания. Экспрессия белков в E.coli и их последующее выделение и очистка является одним из самых популярных способов получения рекомбинантных белков. Причинами этого являются простота культивации, быстрый рост, большое разнообразие векторных систем, безопасность и экономическая выгодность процесса.

Фактор роста фибробластов-2 (FGF-2) или основной фактор роста фибробластов (basic - bFGF) является членом большого семейства структурно похожих белков, которые влияют на рост, дифференцировку, миграцию и жизнеспособность (выживаемость) клеток различного происхождения. Белок FGF-2 стимулирует рост и развитие новых кровеносных сосудов (ангиогенез), а также нормальное заживление ран и рост тканей. Он может служить терапевтическим агентом для лечения ран различного происхождения, а при его введении в организм не наблюдается значительных побочных эффектов и общей токсичности. Белок FGF-2 эффективен как при лечении поверхностных ран и ожогов, так и при остром повреждении внутренних органов (в частности, легких и кишечника). Он способствует лечению незаживающих ран различного происхождения, в том числе ран, возникающих при радиационном поражении и при диабете. В настоящее время рекомбинантные препараты FGF-2 рассматриваются как хорошие средства для терапии ран различного происхождения. Разработка методов получения высокоочшценного, высокоактивного и стабильного препарата рекомбинантного FGF-2 человека без N- или С- концевых тагов и с высокими выходами белка является важной задачей и открывает широкие возможности для успешного использования FGF-2 как в доклинических, так и клинических испытаниях для стимуляции различных регенерационных процессов.

Другой группой факторов роста терапевтического назначения является семейство трансформирующих факторов роста-p (TGF-P), которое включает в себя пять изоформ -полипептидов: TGF-pi, TGF-P2, TGF-рЗ, TGF-P4 и TGF-p5. Эти многофункциональные белки регулируют рост и дифференцировку клеток, индуцируя синтез белков внеклеточного матрикса и модулируя иммунный ответ. В настоящее время TGF-pl рассматривается в качестве многообещающего терапевтического средства при терапии ран, лечении остеопороза, ишемических повреждений и аутоиммунных заболеваний. Однако многочисленные исследования показали, что существует ряд

фибропролиферативных нарушений, при которых избыточная экспрессия TGF-P играет ключевую роль. Суперэкспрессия TGF-p 1 наблюдается при гломерулонефрите, пульмонарном фиброзе, циррозе печени и при образовании келоидных рубцов. Это позволяет предположить, что молекулы-антагонисты TGF-P могут быть эффективны при лечении этих заболеваний. Высокий уровень TGF-p продуцируется также многими типами опухолей, включая меланому и рак груди, толстой кишки, пищевода, желудка, печени, легких, поджелудочной железы и простаты, а также при гематологических злокачественных заболеваниях. Нерегулируемая иммуноподавляющая активность TGF-p провоцирует развитие опухолей, в частности, на поздних стадиях болезни, когда опухоль начинает метастазировать. Накопленные доклинические и клинические данные указывают на то, что вещества, блокирующие сигнальные пути TGF-p, могут быть использованы для лечения фиброзных нарушений и раковых заболеваний.

Одной из успешных стратегий для блокирования сигнальных путей TGF-P является непосредственная нейтрализация отдельных изоформ TGF-p в крови. Нейтрализующие TGF-p реагенты могут быть разделены на две категории: нейтрализующие антитела и ловушки лиганда, такие, например, как его растворимые рецепторы. Сигналы TGF-P передаются посредством 2-х типов рецепторов: типа I и типа II (белки TpRI и TpRII). Исследования показали, что рекомбинантный растворимый внеклеточный домен рецептора TGF-p типа II (TpRII-ED, ED-extracelullar domain) обладает антифиброгенной и антиопухолевой активностью при метастазирующих опухолях, в результате нейтрализации высокого содержания TGF-p 1 и TGF-рЗ в крови. Молекула TpRII-ED обогащена остатками цистеина, которые образуют 6 дисульфидных связей, что затрудняет ее ренатурацию в прокариотических клетках, в частности, при экспрессии рекомбинантного белка в штаммах E.coli. Разработка эффективных методов экспрессии и очистки высокоактивного препарата белка TpRII-ED в E.coli расширит возможности его применения в клинике для терапии рака и фиброзных нарушений. Препарат может быть использован также для диагностики активной и латентной форм TGF-P в плазме крови при различных заболеваниях, с помощью метода иммуноферментного анализа ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Как альтернативный подход препарат рекомбинантного белка TpRII-ED может быть иммобилизован на сорбентах и использован для адсорбции TGF-p при его нежелательно высоком содержании в крови (метод гемоперфузии). Этот подход имеет преимущество, так как исключает нежелательные побочные эффекты, возникающие при введении белковых препаратов непосредственно в кровь.

Цель исследования.

Разработка новых эффективных подходов экспрессии в E.coli рекомбинантных белков терапевтического назначения основного фактора роста фибробластов (FGF-2) и лиганд связывающего растворимого внеклеточного домена рецептора II типа TGF-ß (TßRII-ED), разработка методов очистки этих препаратов и исследование их биологической активности,

Задачи исследования.

1. Получить эффективные экспрессирующие конструкции для продукции рекомбинантных белков FGF-2 и TßRII-ED в штаммах E.coli.

2. Разработать и оптимизировать методику очистки целевых рекомбинантных белков FGF-2 и TßRII-ED.

3. Получить целевые белки в количествах, необходимых для проведения исследований.

4. Исследовать физико-химические свойства полученных рекомбинантных белков FGF-2 и TßRII-ED с помощью методов спектроскопии кругового дихроизма, ЯМР-спектроскопии и масс-спектроскопии.

5. Исследовать биологическую активность полученного рекомбинантного белка FGF-2 путем стимуляции роста фибробластов.

6. Исследовать лиганд-связывающие свойства рекомбинантного белка TßRII-ED с помощью метода ELISA.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В данной диссертационной работе были разработаны новые эффективные подходы для экспрессии в E.coli и очистки рекомбинантных человеческих белков основного фактора роста (FGF-2), его мутантного варианта FGF-2/C78S/C96S с улучшенной растворимостью и лиганд-связывающего внеклеточного домена рецептора II типа TGF-ß (TßRII-ED). Разработанные методики позволяют получить высокоочищенные и высокоактивные стабильные препараты, 100-120 мг FGF-2 и 140-150 мг TßRII-ED из 1 л культуры клеток, что на 2 порядка больше, чем в ранее описанных работах. Такой высокий выход целевых белков позволяет рассматривать полученные препараты FGF-2 и TßRII-ED как потенциальные терапевтические средства, пригодные для диагностических и клинических испытаний. Низкая стоимость полученных препаратов открывает широкие возможности для их последующего использования в терапевтических нуждах.

Апробация работы.

Основные материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на следующих конференциях: Первый студенческий симпозиум по биоинженерии, 27-31 октября 2006 г., Москва, Россия; XIV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007», 20-23 апреля 2007 г., Москва, Россия; V Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» 16-20 марта 2009 г., Москва, Россия; XXII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», В-11 февраля 2010 г., Москва, Россия. II международный симпозиум «Биофарма-2010: от науки к промышленности», 17-20 мая 2010 г., Ереван, Армения.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 2 статьи, 5 тезисов конференций и 1 заявка на патент РФ.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждений, выводов и списка литературы. Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 42 рисунка, 4 таблицы. Список литературы включает 207 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Получение препарата рекомбинантаого белка FGF-2 человека.

1.1. Синтез гена FGF-2 и клонирование его в экспрессионный вектор рЕТ-32а

Последовательность ДНК, кодирующая внеклеточный фрагмент FGF-2 (513 пар нуклеотидов), была синтезирована из 20 перекрывающихя олигонуклеотидов (каждый длиной 35-42 оснований) с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полученный ген был клонирован в плазмидный вектор рЕТ-32а по сайтам рестрикции Bglll и Hindlll вслед за геном несущего белка тиоредоксина (Тгх) и, таким образом, сделан вектор для экспрессии FGF-2 - pET-32a/FGF-2. Вектор рЕТ-32а предназначен для продукции в Е. coli гибридных белков с тиоредоксином на iV-копце и целевым белком на С-конце, которые соединяются линкером, содержащим сайт узнавания энтеропептидазы (непосредственно перед целевым белком) и последовательность из шести гистидиновых остатков (6х His-tag), для очистки белка с помощью аффинной хроматографии (Рис. 1). Преимущество данной генетической конструкции заключается в том, что несущий белок тиоредоксин обеспечивает высокую экспрессию и растворимость целевого белка в

составе слитного белка тиоредоксин/целевой белок и способствует его правильному сворачиванию. Наличие 6х Шэ-тага в составе слитного белка облегчает очистку с помощью аффинной хроматографии, а после его расщепления высокоспецифичной протеиназой (в данной работе энтеропептидазой) целевой белок не содержит дополнительных тагов. Результатом является очищенный белок ГОР-2 с природной третичной структурой и цативным А'-копцом.

Смит шешкния Сайт щеплсния

ОДШ ЯШШ

Сийт щешнния зктсропеппщамй

Рис. 1. Схематическое изображение слитного белка Trx/FGF-2 в векторе рЕТ-32а.

1.2. Экспрессия и очистка слитного белка Trx/FGF-2 в Kcoli

Для экспрессии гибридного белка Trx/FGF-2 был выбран штамм Е. coli BL21(DE3), предназначенный для работы с системами экспрессии, основанными на активности промотора бактериофага Т7. Штамм E.coli BL21(DE3) экспрессирует Т7-РНК-полимеразу под промотором IacUVS. Это делает возможным индуцировать экспрессию рекомбинантных белков добавлением ИПТГ (изопропил-ß-D-тиогалактопиранозид) - специфического активатора Т7-промотора. Штамм Е. coli BL21(DE3) трансформировали полученным экспрессирующим вектором pET-32a/FGF-2 и оптимальную концентрацию индуктора ИПТГ (изопропил-р-тиогалактопиранозид) подобрали в предварительных экспериментах (Рис. 2).

Наибольший уровень экспрессии слитного белка Trx/FGF-2 (примерно 1 г из 1 л культуры клеток Е. coli) был достигнут при индукции клеток с помощью 0.02 мМ ИПТГ при росте в богатой среде ТВ в течение 24 часов при 25°С (Рис. 2).

В результате экспрессии был получен слитный белок Trx/FGF-2 молекулярной массой примерно 34 кДа (17.25 кДа FGF-2 и 17.07 кДа тиоредоксин с линкером). После разрушения клеток на Френч прессе в буфере, содержащем 50 мМ фосфата натрия, 300 мМ хлорида натрия и 10 мМ имидазола (pH 8.0), слитный белок Trx/FGF-2 очистили из растворимой фракции цитоплазматических белков с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе. Неспецифически связанные белки отмывали буфером для разрушения клеток, содержащим 20 мМ имидазола, после чего слитный белок элюировали с помощью того же буфера, содержащего 250 мМ имидазола (Рис. 3, лот 4).

Концентрация ИПТГ, мМ 0.0 0.01 0.02 0.05 0.1 0.2 0.5 0.75 1.0

кДа

LJL.J тЛшшК^Ь* <Ш». | г\ М.1 -2

J

21-

1 2 3 4 5 6 7

8 9

Рис. 2. Экспрессия слитного белка Trx/FGF-2 в штамме E.coli BL21(DE3). Пробы, содержащие по 10 мкл ночной культуры, анализировали на 12 % ДСН-ПААГ. 1-9 -клетки, трансформированные плазмидной ДНК pET-32a/FGF-2, индуцированные различными концентрациями ИПТГ.

1.3. Расщепление слитного белка Trx/FGF-2 энтеропептидазой в очистка нелевого

Расщепление гибридного белка Тгх/РОР-2 проводили с помощью рекомбинантной легкой цепи энтеропептидазы человека (получена в нашей лаборатории). Полное расщепление Тгх/РОР-2 происходил при соотношении фермент-субстрат 1:75 000, в буфере, содержащей 50 мМ Тпв-НСЛ (рН 7.8) и 50 мМ №С1, в течение 16 часов при комнатной температуре. После расщепления слитного белка Тгх/РОР-2 остаточную активность энтеропептидазы убирали с помощью аффинной хроматографии на колонке с Б'П агарозой (БТГ - соевый ингибитор трипсина). При расщеплении слитного белка образуется целевой белок РОР-2 (17.25 кДа) и белок носитель тиоредоксин с тагами (17.07 кДа), которые на полиакриламидном геле идут как одна полоса около 17 кДа (Рис. 3). При длительной инкубации слитного белка с энтеропептидазой образуется белок с молекулярным весом 15 кДа, что связано с неспецифическим расщеплением тиоредоксина с С-конца (примерно 2 кДа) и, как было показано ранее, является результатом расщепления тиоредоксина после остатка аргинина 143.

Природный белок РОР-2 имеет высокое сродство к гепарину. Поэтому, после расщепления слитного белка Тгх/РОР-2 энтеропептидазой окончательную очистку целевого белка РОР-2 проводили с помощью аффинной хроматографии на колонке с гепарин-сефарозой. После нанесения препарата, колонку отмывали фосфатным буфером (рН 7.5) содержащим 300 мМ ЫаС1 и целевой белок РОР-2 элюировали этим же буфером в присутствии 1.5 М хлорида натрия (Рис. 3, лоты 6-7).

белка FGF-2

—Trx/FGF-2

_FGF-2 —Trx, 17 кДа ПГгх, 15 кДа

2 3 4 5 6 7

Рис. 3. Экспрессия и очистка рекомбинантного белка FGF-2 человека. 1 - маркеры молекулярных масс; 2 - препарат ночной культуры; 3 - фракция цитоплазматических белков; 4 - препарат слитного белка Trx/FGF-2 после очистки на Ni-NTA-агарозе; 5 -препарат слитного белка Trx/FGF-2 после расщепления энтеропептидазой; 6,7 -препарат FGF-2, очищенный на гепарин-сефарозе FGF-2; 8 — фракция белков, не связавшихся с гепарин-сефарозой.

Очищенный белок FGF-2 диализовали против буфера, содержащего 50 мМ фосфатного буфера (рН 7.5) и 150 мМ хлорида натрия, после чего стерилизовали пропусканием через стерильный фильтр и хранили при 4°С. В результате, было получено примерно 10 мг высокоочищенного препарата FGF-2 из 100 мл культуры клеток. Выход очищенного препарата FGF-2 составил примерно 100 мг из 1 л культуры клеток. Использование двух различных стадий аффинной хроматографии (Ni-NTA агарозы, для очистки слитного белка Trx/FGF-2 и гепарин-сефарозы, для окончательной очистки целевого белка FGF-2) позволило получить высокоочищенные препараты FGF-2 (степень очистки примерно 98 % по данным ДСН-ПААГ). После переноса очищенного FGF-2 на мембрану PVDF, была определена N- концевая последовательность MAAGSI, что соответствует остаткам 1-6 белка FGF-2 человека.

Для определения молекулярной массы полученного нами препарата FGF-2, а также анализа его чистоты, был использован метод масс-спектроскопии (Рис. 4). Масс-спектрометрия показала наличие в образце только одного основного пика с молекулярной массой 17258 Да, что хорошо соответствует расчетной массе FGF-2 17257 Да. На графике масс-спектра присутствовал также пик с вдвое меньшей кажущейся молекулярной массой 8630 Да, который соответствует иону молекулы FGF-2 с зарядом 2+.

- 17258 3630 I X IV

и юЬсо чякх. .... ■■■■■ =та "

Рис. 4. Масс-спектр рекомбинантного белка РСР-2.

Таким образом, использование нами нового подхода экспрессии слитного белка Тгх/РОР-2 сильно увеличило выход экспрессии белка в растворимой форме, что значительно облегчает процедуру очистки белка. Известно, что неправильно собранный белок РйР-2 имеет низкую растворимость и образует димеры, тримеры и агрегаты, так как в его молекуле имеются 4 неспаренных остатков цистеина. Благодаря наличию белка носителя тиоредоксина, очищенный слитный белок Тгх/ТОР-2 образовал относительно мало агрегатов, и после расщепления энтеропептидазой только примерно 30 % целевого белка РОР-2 агрегировало (Табл. I). В результате разработанной методики экспрессии и очистки было очищено примерно 100 мг препарата РОР-2 из 1 литра культуры клеток,. Высокие выходы, а так же относительно низкая стоимость позволят в будущем использовать препарат в клинических испытаниях, для терапии различных регенерационных процессов, в частности для лечения незаживающих ран различного происхождения.

Надо отметить, что разработанные нами подходы позволяют получить стабильный уровень экспрессии слитного белка Тгх/РОР-2, что тобеспечивает ожидаемые выходы целевого белка при каждом новом выделении препарата РОР-2 (Табл. 1).

Табл. 1. Выходы очистки белка РОР-2 из 100 мл культуры клеток. Усредненные данные приведены из пяти независимых экспериментов.

Стадии очистки Количество белка, Выход от

мг предыдущей стадии, %

Тгх/РОР-2, очищенный на №-ЬГТА 41± 7 100

агарозе

Тгх/РОР-2 после диализа 35± 5 85

Тгх/РОР-2 после расщепления Ь- 28 ± 4 (14 РОР-2) 88.7

НЕР и удаления агрегатов

РОР-2 после очистки на гепарин- 10±3 71.4

сефарозе

1.4. Исследование вторичной струстуры препарата рекомбинантного ЕСР-2 методом спектроскопии кругового дихроизма

Для определения вторичной структуры очищенного рекомбинантного белка РСГ-2 был получен его спектр кругового дихроизма на спектрополяриметре .1-500С (Дивсо, Япония) в кювете с длиной оптического пути 0.01 см в дальней ультрафиолетовой области 190-240 нм (Рис. 5). Результаты расчета вторичной структуры РОР-2 с помощью программы Сопип II показали, что в белке преобладает р структура (63%), а-спирали составляют 4 %, а 33 % белка имеет неупорядоченную структуру. Эти результаты соответствуют приводимым в литературе данным для образцов ГОР-2, полученных различными способами.

Wavelength [nm]

Рис. 5. Спектр кругового дихроизма рекомбинантного белка FGF-2.

1.5. Исследование биологической активности рекомбинантного белка FGF-2

Биологическую активность препарата FGF-2 тестировали на фибробластах NIH3T3 из костного мозга человека с помощью набора реактивов фирмы Promega "The CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay" методом MTT (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолиум бромид). Фибробласты клеточной линии N¡(13X3 были выращены при различных концентрациях FGF-2 в течение 72 часов в присутствии и отсутствии дексаметазона - гормонального препарата противовоспалительного, противоаллергического, десенсибилизирующего действия (Рис. 6). Двукратная стимуляция роста клеток NIH3T3 под действием FGF-2 наблюдался при концентрации 1-2 нг/мл, и ED50 составила 0,3 нг/мл. Эти данные сопоставимы с митогенной активностью нативного белка FGF-2 (ED50 = 0,2 нг/мл) и различных рекомбинантных препаратов (ED50 = 0,3-1,2 нг/мл) на клетках N1H3T3. Тестируемый гормон дексаметазон не влиял на рост клеточной линии NIH3T3.

1.5 3.0 5.0 концентрация bFGF, нг/мл

Рис. 6. Митогенная активность рекомбинантного препарата FGF-2 на клетках NIH3T3 фибробластов в присутствии и отсутствии дексаметазона (деке.). Количество клеток в каждой лунке определили после инкубации с различными концентрациями FGF-2 в течение 72 часов.

2. Получение и исследование мутантного варианта FGF-2/C78S/C96S 2.1. Экспрессия и очистка мутантного варианта FGF-2/C78S/C96S

Молекула FGF-2 содержит четыре остатка цистеина, которые не образуют дисульфидные мостики. Известно, что при получении рекомбинантных препаратов FGF-2 образуются димеры, тримеры и агрегаты за счет образования дисульфидных связей между молекулами. Ранее было показано, что замена двух остатков цистеина (С78 и С96) на остатки серина в молекуле FGF-2 улучшает растворимость белка и увеличивает биологическую активность.

Мутантный вариант FGF-2, содержащий двойную мутацию был получен введением замен нуклеотидных остатков в соответствующие кодоны в гене белка с помощью метода сайт-направленного мутагенеза.

Полученным плазмидным вектором pET-32a/FGF-2/C78S/C96S трансформировали бактериальный штамм Е. coli BL21(DE3). Экспрессию и очистку мутантного варианта FGF-2/C78S/C96S проводили по методике, разработанной для белка FGF-2 дикого типа. После разрушения клеток ночной культуры, слитный белок Trx/FGF-2/C78S/C96S очистили на Ni-NTA агарозе из общей фракции цитоплазматических белков. Очищенный белок расщепили рекомбинантной каталитической субъединицей энтеропептидазы человека, после чего целевой белок FGF-2/C78S/C96S очистили с помощью аффинной хроматографии на гепарин-сефарозе (Рис. 7).

Уровень экспрессии мутантного варианта FGF-2/C78S/C96S и бежа дикого типа практически не отличались (примерно 1 грамм с 1 литра культуры), однако, количество растворимого белка в цитоплазматической фракции выросло от 50 % (в случае дикого типа) до 75 % (Табл. 2).

кДа

66 45

31

<-ТпьТСР-2/ С788/С968

21 ' Щт __<-^-2/0788/0968

14 М Ж

123456789

Рис. 7. Очистка ЕСР-2/С785/С968 из растворимой фракции цитоплазматических белков. / - маркеры молекулярных масс, 2 - растворимая фракция цитоплазматических белков; 3-4 - слитный белок Тгх/РОР-2/С78$/С965 после очистки на Ы1-МТА; 5 Тгх/ИйР-2/С788/С965 после расщепления энтеропептидазой; 6 - не связанная с гепарин-сефарозой белковая фракция; 7-9 - фракции очищенного РСР-2/С788/С968.

Окончательные результаты из 5 независимых экспериментов показали, что выход очищенного мутантного варианта РвР-2/С788/С968 составляет примерно 120 мг из 1 л культуры клеток, что на 20 % больше, чем для белка дикого типа, экспрессированного и очищенного в аналогических условиях (Табл. 2).

Табл. 2. Ход очистки РОР-2/С785/С965 из 100 мл культуры клеток. Усредненные данные приведены из пяти независимых экспериментов.

Стадии очистки Количество белка, мг Выход от предыдущей стадии, %

Очищенный на №-ЫТА агарозе Тгх/РОР-2/С788/С968 53 ±7 100

Тгх/РОР-2/С788/С968 после диализа 44 ±5 81

Тгх/РОР-2/С788/С968 после расщепления Ь-НЕР 33 ±4 (16.5 мг РОР-2/С788/С968) 75

РОР-2/С788/С968 после очистки на гепарин-сефарозе 12 ±3 72

Известно, что в отсутствие восстановительных реагентов РОР-2 образует олигомеры. Анализ кристаллической структуры РСР-2 показал, что димеризация может происходить при участии поверхностных остатков цистеина 78 и 96, тогда как цистеины 25 и 92 недоступны. Анализ белковых проб на ДСИ-ПААГ в присутствии и в отсутствие (3-меркаптоэтанола показал, что препарат РйР-2 дикого типа содержал примерно 5-7 % димерных молекул, тогда как препарат мутантного варианта РОР-2/С788/С968 состоял только из мономеров (Рис. 8).

кДа

66.245.0 31.0

21.5 14.4-

РСР-2, димер

' мономер

1

Рис. 8. Наличие димерных молекул в препаратах РОР-2 и РСР-2/С788/С968. Пробы, содержавшие по 15 мкг белка, нагревали в течение 5 мин при 950 в присутствии и в отсутствие /3-меркаптоэтанола и анализировали в 12 % ДСН-ПААГ. I - маркеры молекулярных масс; 2-3 - РОР-2 с и без [3-меркаптоэтанола, соответственно; 4-5 — РОР-2!С7&3!С968 с и без /3-меркаптоэтанола, соответственно.

2.2. Биологическая активность мутантного варианта РС,¥-21С7№1С<)6&

Был проведен также сравнительный анализ биологической активности препаратов РСР-2 дикого типа и мутанта РОР-2/С788/С968 на фибробластах линии N1113X3 (Рис. 9). Оба препарата обладали практически одинаковой активностью.

0,70 0,65 0,60 Я 0.55

О 0,45

О

0.40 0,35 0,30

- Дикий ТИП

- Мутант

0,1 0,2 0.4 0,8 1,6 3,2 6.4 12,8

г11РОР-2, нг/мл

Рис. 9. Сравнение митогенной активности препаратов РОР-2 и РОР-2/С788/С968 на клетках ЫШЗТЗ фибробластов. Количество клеток в каждой лунке определили после инкубации с различными концентрациями РОР-2 в течение 48 часов.

Двукратная стимуляция роста клеток №НЗТЗ под действием Р0Р-2 и РОР-2/С785/С968 наблюдалась при концентрации 3,2 нг/мл, и Е050 (эффективная доза) составила 0,3 нг/мл.

Ранее было показано, что прямая экспрессия РОР-2 в разных штаммах бактерии позволяет получить примерно 1-5 мг белка из 1 л культуры клеток. Низкий выход белка отчасти обусловлен тем, что РйР-2 экспрессируется в бактериях в виде телец включения и плохо поддается ренатурации. Слитный белок глутатион-8-трансфераза/РОР-2 был

очищен из бактерий с выходом 20 мг из 1 л культуры клеток, однако активность этого препарата был значительно ниже по сравнению с природным РОР-2. Новый подход экспрессии РОР-2 в составе слитного белка Тгх/РОР-2 позволил получить высокий уровень экспрессии в растворимом виде, что сильно облегчает очистку белка.

Таким образом, разработанные нами в данном исследовании методики экспрессии и очистки рекомбинантного белка РОР-2 позволяют получить высокоочищенный, высокоактивный и стабильный препарат. Высокие выходы (примерно 100 мг из 1 л культуры клеток) и низкая стоимость препарата делают его доступным средством для доклинических и клинических испытаний.

3. Получение рекомбинантного препарата Т))Ш1-ЕО из клеток Е.соЧ 3.1. Экспрессия и очистка рекомбинантного белка ТрЫ1-ЕО

Синтез гена, кодирующего белок ТрЫ1-ЕО (аминокислотные остатки 4-136, 399 пар нуклеотидов), и его клонирование в плазмидный вектор рЕТ-32а были выполнены аналогичным образом, как и для гена белка РОР-2, что описано в Главе 1.1.

Для экспрессии слитного белка Тгх/ТрЯП-ЕО полученным плазмидным вектором рЕТ-32а/ТрЯ1!-ЕЕ> был трансформирован бактериальный штамм Е.соИ ВЬ21(ОЕЗ). Слитный белок экспрессировали, задав условия температуры роста 28 °С и время роста клеток 24 часа. Экспериментально подобрали оптимальную концентрацию индуктора Т7-промотора ИПТГ, которая составила 0.05 мМ (Рис. 10).

ИПТГ(мМ) 0.0 0.01 0.02 0.05 0.10 0.20 0.50 1.0

кДа

■ ■ ¡м ш 1«4 ы

¿¡ИМЙИ ^йкйЖЙ ^«ЙЛ

31 21

14

-Тгх/ТрШ1-ЕВ

12 345 6789

Рис. 10. Экспрессия белка ТгхЛ[^Ш1-ЕО при различных концентрациях ИПТГ. Пробы, содержащие по 10 мкл ночной культуры, анализировали на 12% ДСН-ПААГ. 1-маркеры молекулярных масс, 2-9 - клетки, трансформированные плазмиднойДНК рЕТ-32а/Т$К11-ЕО, индуцированные различными концентрациями ИПТГ.

В результате тщательного подбора условий экспрессии удалось получить как минимум 1 г слитного белка ТгхЯрЯН-ЕО из 1 л культуры клеток.

После разрушения клеток ночной культуры штамма ВЬ21(ОЕЗ)/рЕТ-32а/ТрЯП-ЕО слитный белок Тгх/ТрЯП-ЕО был очищен с помощью аффинной хроматографии из растворимой цитоплазматической фракции белков на №-№ГА-агарозе (Рис. 11). Ша

14 -

1 2 3 4 5

Рис. 11. Очистка слитного белка Trx/TßRII-ED на Ni-NTA агарозе. Пробы, содержащие по 10-15 мкг белка, анализировали на 15% ДСН-ПААГ. 1-10 мкл ночной культуры клеток; 2 — нерастворимая фракция белков, растворенная в 8 М мочевине; 3 -растворимая фракция цитоплазматических белков; 4 - белки, не связавшиеся с Ni-NTA агарозой; 5 чрращия белков элюированных с колонки 250 мМ имидазолом.

Надо отметить, что примерно 90% Trx/TßRII-ED с молекулярной массой 32.1 кДа (17 кДа тиоредоксин с линкерами и 15.1 кДа — TßRII-ED) - экспрессировалось в растворимой форме. Раннее было показано, что при прямой экспрессии Trx/TßRII-ED в штаммах E.coli белок полностью находился в нерастворимой форме в составе телец включения, что сильно затруднял его очистку и ренатурацию.

Очищенный слитный белок Trx/TßRII-ED расщепили рекомбинантной легкой цепью энтеропептидазы человека в течение примерно 16 часов при комнатной температуре при соотношении фермент-субстрат 1:100 ООО. Далее целевой белок TßRII-ED был очищен от несущего белка тиоредоксина на Ni-NTA-агарозе (Рис. 12).

Посчитанная молекулярная масса целевого белка TßRII-ED (4-136 аминокислотные остатки) составляет 15105.05 Да, однако очищенный TßRII-ED визуализируется в 15% ДСН-ПААГ как полоса, соответствующая 17 кДа, примерно на одном уровне с несущим белком тиоредоксином. При длительной расщепления происходит неспецифическое расщепление молекулы тиоредоксина энтеропептидазой после остатка аргинина 143 с образованием пептида с молекулярной массой 15.4 кДа (Рис. 12А, линии 2 и 5), как было описано ранее.

После переноса очищенного TßRII-ED на мембрану PVDF с помощью метода трансблоттинга, была определена N-концевая последовательность HVQKSVNN, что соответствует остаткам 4-11 TßRII-ED человека.

(А) к Da 66-

|В> к Da

6645 -

31 -

31 -

21 -

21 -

«-TßRII-ED

14 -

14 -6-

2 3

4

5

+ДТТ -дтт

Рис. 12. Очистка TßRII-ED после расщепления слитного белка Trx/TßRII-ED энтеропептидазой. Пробы, содержащие по 10-15 мкг белка, анализировали на 15% ДСН-ПЛАГ. (А) I - очищенный Trx/TßRII-ED до расщепления энтеропептидазой; 2-3 -Trx/TßRII-ED после расщепления энтеропептидазой; 4 - белок, не связавшийся с Ni-NTA агарозой (очищенный TßRII-ED); 5 - белок, элюированный с колонки 250 мМ имидазолом. (В) 500 нг очищенного белка TßRII-ED, визуализированного с помощью окрашивания нитратом серебра после приготовления проб в присутствии и отсутствии ДТТ (1,4-дитиотреитол).

Эксперименты показали, что выход очищенного белка TßRII-ED сильно зависит от процедуры ренатурации (Табл. 3). Только 0.81 мг TßRII-ED было в итоге получено из 87 мг слитного белка Trx/TßRII-ED (из 100 мл клеточной культуры), когда слитный белок не подвергался процедуре ренатурации. Сильное увеличение (более чем в 7 раз) выхода белка было достигнуто после того, как элюированный с колонки Ni-NTA агарозы Trx/TßRII-ED был подвергнут ренатурации, используя буферную систему с окисленным/восстановленным глутатионом. Белковый раствор Trx/TßRII-ED по каплям добавили в буфер, содержащий 75 мМ трис-гидрохлорид, 0.5 М L-аргинин (pH 8.0), окисленный и восстановленный глутатион в соотношении 1 к 50 (0.04 мМ и 0.2 мМ соответственно) и инкубировали при 10°С в течении 72 часов. Окончательная концентрация белка в буфере для ренатурации составила 0.15 мг/мл. В аналогичных условиях белок более эффективно ренатурировал, когда связанный с Ni-NTA агарозой Trx/TßRII-ED медленно перемешивали в растворе для ренатурации. Такой подход ренатурации позволило очистить 14 мг TßRII-ED из 100 мл культуры клеток (Табл. 3).

Получение функционально активного белка TßRII-ED, имеющего 12 остатков цистеинов, которые формируют 6 дисульфидных связей, в бактериальных экспрессирующих системах довольно трудная задача. Главная причина того, что в клетках E.coli продуцируются неактивные эукариотические белки, заключается в невозможности формирования правильных дисульфидных связей из-за редуцированного цитоплазматического окружения и отсутствия тиол-заменяющих факторов. Это часто приводит к продукции нефункциональных белков в виде телец включения, которые

требуют ренатурации in vitro. Было описано несколько экспериментов экспрессии TpRII-ED в E.coli, и во всех случаях целевой белок был очищен из телец включения после процедуры ренатурации. Выход очищенного белка всегда был низок (примерно 1-5 побелка с литра культуры клеток). В результате разработанной в данной работе методов ренатурации, выход целевого белка TpRII-ED составил 140 мг из 1 л культуры клеток, что в 50-100 раз больше, по сравнению со всеми описанными ранее работами, где были использованы различные экспрессионные системы.

Табл. 3. Количество очищенного белка ТрЯП-ЕО из 100 мл культуры клеток. Усредненные данные приведены из четырех независимых экспериментов.

Условия ренатурации Очистка Trx/TpRII-ED на Ni-NTA (мг) Очищенный TpRII-ED после расщепления Trx/TfiRII-ED (мг) Выход (%)

Без ренатурации 87±7 (40 мг TPRII-ED) 0.81±0.7 2.02

Ренатурация Trx/TpRII-ED в растворе 87 ±7 (40 мг TPRII-ED) 5.9±1.2 14.8

Ренатурация Trx/TpRII-ED, связанного с Ni-NTA агарозой 87±7 (40 мг TPRII-ED) 14.02±1.1 35.1

3.2. Исследование физико-химических свойств рекомбинаитиого ТрШЫШ.

С помощью метода ДСН-ПААГ и окрашивания нитратом серебра, а также НРЬС-хроматографии и масс-спектроскопии было показано, что выделенный препарат "Г[!Ш1-ЕО высокоочшцен и гомогенен (Рис. 12В, 13, 14).

Анализ препарата ТрЯН-ЕО методом масс-спектроскопии показал единичный пик 15105.39 Да, что на 12 Да выше, чем посчитанная молекулярная масса окисленной нативной формы ТРЬШ-ЕО, содержащей 4-136 аминокислотные остатки (15093.05 Да) (Рис. 13).

_ 3000

о <

i? 2000 со

d ф

а

1000 о

Рис. 13. MALD1-TOF Масс-спектр очищенного препарата TpRII-ED.

40001

Возможно, во время приготовления образцов для МЛЬ01-Т0Р маес-епектрометрии на матрице дигидрокснбеизойной кислоты и двукратного промывания образцов 5% муравьиной кислотой происходит восстановление всех 6 дисульфидных связей и масса белка увеличивается (15093.05 Да плюс 12 Да из-за 12 атомов водорода).

Гомогенность очищенного рекомбинантного белка была подтверждена методом НР1Х-хроматографии, когда при пропускании препарата ТрЯП-ЕО через колонку был зарегистрирован один единичный пик (Рис. 14).

8

7

ST 1 «

О Ю 20 ЗО 40

Time (mint

Рис. 14. IUPAC-обратнофазная хроматография TßRII-ED.

A ReproSil-Pur 300 С8, 3 мкм (Dr. Maisch Gmbh) колонка была использована и препарат TßRII-ED был элюирован линейным градиентом 10-55% ацетонитрила в водном растворе 0.1% ТФА. Фракции элюированного целевого белка детектировались по поглощению при длине волны 280 нм.

Анализ спектра кругового дихроизма очищенного препарата TßRII-ED показал, что в белке преобладают ß-структуры (53%). Содержание а-спиралей составляет 10 %, а 37 % белка имеет неупорядоченную структуру (Рис. 15).

1

0

"si

■ё -5 s

а

у

-10 -12

Рис. 15. Спектр кругового дихроизма белка TßRII-ED.

i i \

V l ■ \ i, \ ....... "/' ' ■ / /

i ..... ,

_J_I_I_1_1—

200 220 240

Wavelcngth |пш|

Эти результаты соответствуют приводимым в литературе данным для образцов TßRII-ED, полученных различными способами.

33. Исследование лигаид-свнзывающей активности TßRII-ED

Лиганд-связывающие свойства очищенного рекомбинантного препарата TßRII-ED (аминокислотные остатки 4-136) из Е. coli были сравнены с коммерчески доступным рекомбинантным препаратом TßRII-ED (полученный из клетках мышиной миеломы линии NSO, аминокислотные остатки 1-136), используя метод иммуноферментного анализа (ИФА) для TGF-ß.

Результаты иммуноферментного анализа (ELISA).показывали, что очищенный из E.coli препарат TßRII-ED демонстрировал сродство к лиганду TGF-ßl, сопоставимый с коммерческим препаратом TßRII-ED, экспрессируемый в клетках мышиной миеломы линии NSO (Рис. 16). В обоих случаях связывание TGF-ßl возросло при повышении концентрации иммобилизиванного рецептора TßRII-ED от 200 до 400 нг/мл и достиг насыщению при концентрации 1000 нг/мл. Эти данные указывают, что гликолизированная (из NSO клеток) и негликолизированная (из E.coli) формы TßRII-ED обладают схожими свойствами иммобилизации к пластиковым ячейкам.

Рекомбинантный TßRII-ED из E.coli Рекомбннаитный TßRII-ED из клеток NSO

TGFßl (нг/мл) ТС1ЧИ (яг/ил)

Рис. 16. Исследование лиганд-связывающей активности TflRII-ED с помощью метода иммуноферментного анализа. Растворимый рецептор TfiRJI-ED в концентрациях 0, 200, 400 и ¡000 нг/мл был иммобилизован на ячейках 96-луночного планшета. После отмывки и блокирования ячеек, TGF-(3l был добавлен в каждую ячейку. Связывание лиганда с рецептором определяли с помощью биотинилированных анти-TGF-pl антител (R&D Systems, США) с последующим добавлением стрептавидина, конъюгированной пероксидазы хрена. Кривые зависимости эффекта от дозы построили по поглощению субстрата пероксидазы хрена о-фенилендиамина (OPD) при 492 им. В неиммобилизированных с T/1RH-ED ячейках (контрольные) были детектированы значения поглощения 0.040-0.045 ОЕ.

Далее было показано, что лиганд-связывающая активность рекомбинантного белка ТрИГ-ЕО сильно зависел от способа его получения и очистки, в частности от наличия процедуры ренатурации. Было показано, что ренатурированный препарат ТрИ1-ЕО имеет существенно более высокое сродство к лиганду ТОР-Р1, чем препарат ГрКП-ЕЭ, очищенный без этапа ренатурации (Рис. 17). Таким образом, разработанная нами методика ренатурации не только существенно улучшает выход белка, но и значительно влияет на его лиганд-связывающую активность.

TVSF-beto 1 ng/ml

Рис. 17. Влияние процедуры ренатурации на лиганд-связывающие свойства TßRll-ED, проверенное методом иммуноферментного анализа. В качестве контроля использовали коммерческий рекомбинантный препарат TßRII-ED (из клеток NSO).

Очевидно, что наличие 12 цистеиновых остатков в молекуле TPRII-ED, которые образуют 6 дисульфидных связей, затрудняет процесс правильного сворачивания белка при экспрессии в штаммах E.coli, и дальнейшая очистка белка без процедуры ренатурации приводит к образованию неактивных растворимых молекул с неправильной вторичной структурой.

Надо отметить, что очищенный в данной работе препарат TßRII-ED сохранял стабильность в течение как минимум одного года без потери лиганд-связывающих свойств, при хранении как в лиофилизированном виде, так и в растворе при температуре 4 "С (Рис. 18).

Таким образом, разработанные в данном исследовании методики экспрессии, ренатурации и очистки рекомбинантного белка TßRII-ED позволяют получить высокоочищенный, биологически активный и стабильный препарат с высоким сродством к лиганду TGF-ß. Высокие выходы (примерно 140 мг из 1 л культуры клеток) очищенного препарата делают его доступным реагентом для доклинических и клинических испытаний.

0D 492 1

гП 1 г- I ■ TpRll-EO 09.04.2009 □ TPRII-EO 07.04.2010

0,5 ■ ■ 1 1 1

0.0 1.0 2 1 0 4 GF-P, нг 1т 0 8 0 16 0

Рис. 18. Тест на стабильность препарата T/3RJI-ED при помощи метода иммуноферментного анализа. Сравнение лиганд-связывающих свойств препаратов T(SRII-ED, очищенных в разные периоды: 07.04.2010 - свежевыделенный препарат; 07.04.2009 - препарат после хранения в растворе, содержащей 50 мМ фосфатного буфера (рН 7.5) и 150 мМ NaCl при 4"С; 09.04.2009 - лиофилизированный белок после хранения при -20°С.

Относительно дешевая процедура, высокая биологическая активность и значимые выходы получения белка TpRII-ED без N- и С-концевых тагов позволяют рассматривать рекомбинантный препарат как потенциальный реагент биомедицинского назначения для терапии рака и фиброзных заболеваний. Рекомбинантный TPRII-ED также может использоваться как средство диагностики для определения концентрации TGF-P в сыворотке или плазме крови человека при различных заболеваниях, используя метод иммуноферментиого анализа. В качестве альтернативного подхода, для удаления возникающих при раковых заболеваниях нежелательно высоких количеств TGF-p в крови, рекомбинантный TpRII-ED может быть иммобилизован на сорбент и использован для гемосорбции. Такой подход позволяет избежать побочных эффектов, вызванных внутривенным введением белковых препаратов. Адсорбционные колонки, заполненные сорбентом, который способен связывать латентную форму TGF-p, использовались для прямой гемосорбции у крыс с привитой гепатоцеллюлярной карциномой. Было показано, что единичная обработка не только снижала величину опухоли, но и существенно увеличивала выживаемость животных.

выводы

1. Получен штамм-продуцент Е. coli BL21(DE3)/pET-32a/FGF-2 для получения фактора роста фибробластов FGF-2 и его мутантного варианта FGF-2/C78S/C96S. Целевые белки экспрессировали в составе слитного белка с тиоредоксином.

2. Разработаны методы очистки, позволившие получить примерно 100 мг белка FGF-2 и 120 мг FGF-2/C78S/C96S из 1 литра культуры клеток.

3. Показано, что полученные препараты FGF-2 и FGF-2/C78S/C96S обладают одинаково высокой стабильностью и пролиферативной активностью по отношению к фибробластам мыши.

4. Получен штамм-продуцент Е. coli BL21(DE3)/pET-32a/TßRII-ED для экспресии лиганд-связывающего домена рецептора И типа цитокина TGFß в составе гибридного белка тиоредоксин/TßRII-ED.

5. Разработаны методы ренатурации и очистки, позволившие получить примерно 140 мг стабильного белка TßRIl-ED из 1 литра культуры клеток.

6. Показано, что полученный гомогенный препарат TßRII-ED имеет столь же высокую лиганд-связывающую активность по отношению к TGFß, как и аналогичный рецептор, полученный из клеток млекопитающих.

1. Гаспарян М.Э., Елистратов П.А.. Дризе Н.И., Нифонтова И.Н., Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Гиперэкспрессия в Escherichia Coli и очистка рекомбинантного основного фактора роста фибробластов человека (FGF-2), Биохимия, 2009; 74:272 - 277.

2. Gasparian М.Е., Elistratov Р.А.. Yakimov S.A., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P., An efficient method for expression in Escherichia coli and purification of the extracellular ligand binding domain of the human TGFp type H receptor, J. Biotechnol2010; 148:113-118.

Гаспарян М.Э., Елистратов П.А.. Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Рекомбинантная плазмидная ДНК рЕТ-32а, кодирующая ген лиганд-связывающего домена рецептора II типа трансформирующего фактора роста-ß человека (TßRII), штамм бактерий Escherichia coli - продуцент слитного белка тиоредоксин/TßRII и способ ренатурации и очистки целевого белка TßRII. Патентная заявка №2009148142, от 24.12.2009, ИБХ РАН. Решение о выдаче патента от 19.10.2010.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах

Патентная заявка

Тезисы конференций

1. Елистратов П.А., Повышение биологической активности основного фактора роста фибробластов FGF-2 путём введения мутаций в его ген. Первый студенческий симпозиум по биоинженерии. Москва, Россия. Тезисы докладов, 2006, с. 6 - 7.

2. Елистратов П.А., Экспрессия и очистка мутантного варианта рекомбинантного белка основного фактора роста фибробластов FGF-2. XIV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2007». Москва, Россия. Тезисы докладов, 2007, с. 17.

3. Elistratov Р.А.. Gasparian М.Е., Dolgikh D.A., A novel and effective method for expression and purification of type 11 transforming growth factor-B receptor. Slh International congress Biotechnology: state of the art and prospects of development. Moscow, Russia. Abstracts book, 2009, pp. 127-128.

4. Елистратов П.А.. Гаспарян М.Э., Долгих Д.А., Получение и исследование физико-химических свойств лиганд-связывающего домена типа II (TpR И) TGF-p (трансформирующего фактора роста Р). XXII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, Россия. Тезисы, 2010, стр. 35.

5. Gasparian М.Е., Elistratov Р.А.. Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P., A novel effective approach for overexpression in Escherichia coli and purification of recombinant proteins TRAIL, FGF-2 and TpRII, The second international symposium «Biopharma-2010: from science to industry». Yerevan, Armenia. Abstracts, 2010, pp.13 - 14.

Подписано в печать 16.02.2011 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1081 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Елистратов, Павел Алексеевич

Содержание

Список используемых сокращений

1. Введение

2. Цели и задачи работы

3. Литературный обзор

3.1. Общая характеристика факторов роста

3.2. Основной фактор роста фибробластов РОБ

3.2.1. Общая характеристика РОР

3.2.2. Взаимодействие РОР-2 с рецепторами

3.2.3. Изоформы РОР

3.2.4. Структура ТО¥~

3.2.5. Биологическая активность и функции РОР

3.3. Трансформирующий фактор роста (31 (ГСР-р1) и его рецептор типа II (ТРЯП)

3.3.1. Суперсемейство белков ТОР-Р

3.3.2. Структура ГСР-р

3.3.3. Рецепторы и механизмы внутриклеточных сигнальных путей

ТвР-Р

3.3.4. Биологическая активность и функции ТОР-р

3.4. Экспрессия и ренатурация рекомбинантных белков

3.4.1. Слитные рекомбинантные белки

3.4.2. Экспрессия рекомбинантных белков

3.4.3. Расщепление слитных белков

3.4.4. Ренатурация рекомбинантных белков

4. Материалы и методы

4.1. Материалы

4.2. Методы

4.2.1. Конструирование плазмидной ДНК

4.2.2. Сайт-направленный мутагенез

4.2.3. PIPES-трансформация, приготовление компетентных клеток E.coli штамма XL-1 Blue

4.2.4. Получение компетентных клеток E.coli BL21(DE3)

4.2.5. Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК

4.2.6. Выделение плазмидной ДНК

4.2.7. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле

4.2.8. Определение концентрации белка в растворе

4.2.9. Электрофоретический анализ белков в полиакриламидном

4.2.10. Экспрессия белка FGF-2 и его мутантного варианта и белка

TßRII

4.2.11. Очистка и расщепление белка FGF

4.2.12. Идентификация белков по N-концевой последовательности

4.2.13. Метод оценки жизнеспособности клеток с метилтиазолтетразолием (МТТ-тест)

4.2.14. Очистка, ренатурация и расщепление белка TßRII-ED

4.2.15. Очистка TßRII-ED с помощью метода обратнофазной HPLC хроматографии

4.2.16. MALDI-TOF масс-спектрометрия

4.2.17. Метод спектроскопии кругового дихроизма

4.2.18. !НЯМР -спектроскопия

4.2.19. Исследование связывания белка-рецептора TßRII-ED с лигандом TGF-ßl методом ELISA

5. Результаты и обсуждение

5.1. Синтез генов FGF-2 и TßRII-ED и клонирование их в экспрессионные векторы

5.2. Экспрессия слитного белка Trx/FGF2 в E.coli

5.3. Очистка слитного белка Trx/FGF

5.4. Расщепление слитного белка Trx/FGF-2 энтеропептидазой и очистка целевого белка FGF

5.5. Исследование физико-химических свойств полученного рекомбинантного белка FGF

5.6. Введение C78S и C96S мутаций в ген FGF-2 и получение экспрессирующего вектора pET32a/FGF-2/C78S/C96S

5.7. Экспрессия и очистка мутантного варианта FGF-2/C78S/C96S

5.8. Проверка биологической активности очищенного препарата FGF-2 и его мутантного варианта FGF-2/C78S/C96S на культуре клеток

5.9. Преимущества разработанной методики получения и очистки рекомбинантного FGF

5.10. Экспрессия слитного белка Trx/TßRII-ED в E.coli

5.11. Очистка и расщепление слитного белка Trx/TßRII-ED энтеропептидазой и очистка целевого белка TßRII-ED

5.12. Исследование физико-химических свойств полученного рекомбинантного белка TßRII-ED

5.13. Исследование связывания белка-рецептора TßRII-ED с лигандом TGF-ßl методом ELISA

5.14. Преимущества разработанной методики получения и очистки рекомбинантного белка-рецептора TßRII-ED

6. Выводы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Елистратов, Павел Алексеевич

6. Выводы

1. Получен штамм-продуцент Е. coli BL21(DE3)/pET-32a/FGF-2 для получения фактора роста фибробластов FGF-2 и его мутантного варианта FGF-2/C78S/C96S. Целевые белки экспрессировали в составе слитного белка с тиоредоксином.

2. Разработаны методы очистки, позволившие получить примерно 100 мг белка FGF-2 и 120 мг FGF-2/C78S/C96S из 1 литра культуры клеток.

3. Показано, что полученные препараты FGF-2 и FGF-2/C78S/C96S обладают одинаково высокой стабильностью и пролиферативной активностью по отношению к фибробластам мыши.

4. Получен штамм-продуцент Е. coli BL21(DE3)/pET-32a/TßMI-ED для экспресии лиганд-связывающего домена рецептора II типа цитокина TGFD в составе гибридного белка тиоредоксин/TßRII-EDD □

5. Разработаны методы ренатурации и очистки, позволившие получить примерно 140 мг стабильного белка TßRÜ-ED из 1 литра культуры клеток.

6. Показано, что полученный гомогенный препарат TßRII-ED имеет столь же высокую лиганд-связывающую активность по отношению к TGFß, как и аналогичный рецептор, полученный из клеток млекопитающих.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Елистратов, Павел Алексеевич, Москва

1. Allendorph G.P., Vale W.W., Choe S., Structure of the ternary signaling complex of a TGF-beta superfamily member, PNAS, 2006; 103: 7643 7648.

2. Avivi A., Yayon A., Givol D., A novel form of fibroblast growth factor receptor-3 using an alternative exon in the immunoglobulin domain-Ill, FEB S Lett., 1993; 330:249-252.

3. Baird A., Schubert D., Ling N., Guillemin R., Receptor- and heparin-binding domains of basic fibroblast growth factor, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988;85:2324 2328.

4. Barnett V.J., Moustakas A., Lin W., Wang X.-F., Lin H.Y., Galper J.B., Maas R.L., Cloning and Developmental Expression of the Chick Type II and Type III TGFP Receptors, Developmental Dynamics, 1994; 199: 12 -27.

5. Basilico C., Moscatelli D., The FGF family of. growth factors and oncogenes, Adv. Cancer Res., 1992; 59: 115 165.

6. Beck L.S., Deguzman L., Lee W.P., TGF-beta 1 accelerates wound healing: reversal of steroid-impaired healing in rats and rabbits, Growth Factors, 1991; 5: 295-304.

7. Beck L.S., Deguzman L., Lee W.P., Rapid publication, TGFbeta 1 induces bone closure of skull defects, J. Bone Miner. Res., 1991; 6: 1257 1265. (II)

8. Bikfalvi A., Significance of angiogenesis in tumour progression and metastasis, Eur. J. Cancer, 1995; 31A: 1101 1104.

9. Bikfalvi A., Klein S., Pintucci G., Rifkin D.B., Biological roles of Fibroblast growth factor-2, Endocr. Rev. 1997; 18: 26 45.

10. Blobe G.C., Schiemann W.P., Lodish H.F., Role of transforming growth factor beta in human disease, N. Engl. J. Med., 2000; 342 (18): 1350 1358.

11. Blottner D., Wolf N., Lachmund A., Flanders K.C., Unsicker K., TGF-beta rescues target-deprived preganglionic sympathetic neurons in the spinal cord, Eur. J. Neurosci., 1996; 8: 202 210.

12. Bocharov E.V., Korzhnev D.M., Blommers M.J., Arvinte T., Orekhov V.Y., Billeter M., Arseniev A.S., Dynamics-modulated biological activity of transforming growth factor beta3, Journal of Biological Chemistry, 2002; 277: 46273-46279.

13. Boesen C.C., Radaev S., Motyka S.A., Patamawenu A., Sun P.D., The 1.1 A° Crystal Structure of Human TGF-p Type II Receptor Ligand Binding Domain, Structure, 2002; 10: 913 919.

14. Bohlen P., Baird A., Esch F., Ling N., Gospodarowicz D., Isolation and partial molecular characterization of pituitary fibroblast growth factor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984; 81: 5364 5368.

15. Brown M.A., Zhao Q., Baker K.A., Naik C., Chen C., Pukac L., Singh M., Tsareva T., Parice Y., Mahoney A., Crystal structure of BMP-9 and functional interactions with pro-region and receptors, Journal of Biological Chemistry, 2005; 280:25111-25118.

16. Burrus L.W., Zuber M.E., Lueddecke B.A., Olwin B.B., Identification of a cysteine-rich receptor for fibroblast growth factors, Mol. Cell Biol., 1992; 12: 5600 5609.

17. Cao D., Ashfaq R., Goggins M.G., Hruban R.H., Kern S.E., Iacobuzio-Donahue C.A., Differential expression of multiple genes in association with MADH4/DPC4/SMAD4 inactivation in pancreatic cancer, Int. J. Clin. Exp., 2008; 1:510-517.

18. Casadaban M.J., Martinez-Arias A., Shapira S.K., Chou J., p-galactosidase gene fusion for analyzing gene expression in Escherichia coli and yeast, Methods Enzymol., 1983; 100: 293-308.

19. Cavallo M.G., Rozzilli P., Thorpe R., Cytokines and autoimmunity, Clin. Exp. Immunol., 1994; 96 (1): 1 7.

20. Chen C.H., Poucher S.M., Lu J., Henry P.D., Fibroblast growth factor 2: from laboratory evidence to clinical application, Curr. Vase. Pharmacol, 2004; 2: 33-43.

21. Chin D., Boyle G.M., Parsons P.G., Coman W.B., What is transforming growth factor-beta (TGF-p)?, The British Association of Plastic Surgeons, 2004; 57:215-221.

22. Clark D.A., Coker R., Transforming growth factor-beta (TGF-p), The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 1998; 30: 293 298.

23. Dell K.R., Williams L.T., A novel form of fibroblast growth factor receptor 2. Alternative splicing of the third immunoglobulin-like domain confers ligand binding specificity, J. Biol. Chem., 1992; 267: 21225 21229.

24. Dennis P., Saksela O., Harpel P., Rifkin D.B., a2-macroglobulin is a binding protein for basic fibroblast growth factor, J. Biol. Chem., 1989; 264: 7210 -7216.

25. Dennler S., Goumans M.-J., ten Dijke P., Transforming growth factor p signal transduction, Journal of Leukocyte Biology, 2002; 71: 731 740.

26. Derynck R., Miyazono M., TGF-p and the TGF-P family, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2008; vol. 50: 29 44.

27. Derynck R., Zhang Y., Intracellular signalling. The Mad way to do it, Current Biol., 1996; 63: 1226-1229.

28. Eswarakumar V.P., Lax I., Schlessinger J., Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine & Growth Factor Reviews. 2005; 16: 139 — 149.

29. Emori Y., Yasuoka A., Saigo K., Identification of four FGF receptor genes in Medeka fish (Oryzies latipes), FEBS Lett., 1994; 314: 176 178.

30. Ensoli B., Sgadari C., Barillari G., Monini P., The fibroblast growth factors. In The Cytokine Handbook. Academic Press, 2003; 748 781.

31. Ericksson A.E., Cousens L.S., Weaver L.H., Matthews B.W., Three dimensional structure of human basic fibroblast growth factor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991; 88: 3441 -3445.

32. Estape D., Van den Heuvel J., Riñas U., Susceptibility towards intramolecular disulphide-bond formation affects conformational stability and folding of human basic fibroblast growth factor, Biochem. J., 1998; 335: 343 -349.

33. Faham S., Hileman R.E., Fromm J.R., Linhardt R.J., Rees D.C., Heparin structure and interactions with basic Fibroblast growth factor, Science 1996; 271: 1116-1120.

34. Faler J.B., Macsata R.A., Plummer D., Mishra L., Sidawy A.N., Transforming Growth Factor-P and Wound Healing, Perspectives in Vascular Surgery and Endovascular Therapy, 2006; 18: 5 — 62.

35. Feige J.J., Baird A., Basic fibroblast growth factor is a substrate for protein phosphorylation and is phosphorylated by capillary endothelial cells in culture, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989; 86: 3174 3178.

36. Finklestein S.P., Plomaritoglou A., Growth factors, Head Trauma: Basic, Preclinical, and Clinical Directions, 2001; 165 187.

37. Flamme I., Risau W., Induction of vasculogenesis and hema-topoiesis in vitro. Development, 1992; 116: 435 -439.

38. Flanders K.C., Burmester J.K. Medical applications of transforming growth factor-beta, Clin. Med. Res., 2003; 1: 13 -20.

39. Fox G.M., Schiffer S.G., Rohde M.F., Tsai L.B., Banks A.R., Arakawa Т., Production, biological activity, and structure of recombinant basic fibroblast growth factor and an analog with cysteine replaced by serine, J. Biol. Chem., 1988; 263: 18452-18458.

40. Gabrilove J., White K., Rahman Т., Wilson E.L., Stem cell factor and basic fibroblast growth factor are synergistic in augmenting committed myeloid progenitor cell growth, Blood, 1994; 83: 907- 910.

41. Gao G., Goldfarb M., Heparin can activate a receptor tyrosine, kinase, EMBO J., 1995; 14: 2183-2190.

42. Garke G., Deckwer W.D.j Anspach F.B., Preparative two-step purification of recombinant human basic fibroblast growth factor from high-cell-density cultivation of Escherichia coli, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl., 2000; 737: 25-38.

43. Gasparian M.E., Ostapchenko V.G., Schulga A.A., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P., Expression, purification, and characterization of human enteropeptidase catalytic subunit in Escherichia coli, Protein Expr. Purif., 2003; 31(1): 133-139.

44. Geng Z.M., Zheng J.B., Zhang X.X., Tao J., Wang L., Role of transforming growth factor-beta signaling pathway in pathogenesis of benign biliary stricture, World J. Gastroenterol., 2008; 14: 4949 4954.

45. Gilbert E., Del Gatto F., Champion-Arnaud P., Gesnel M.C., Breathnach R., Control of BEK and K-SAM splice sites in alternative splicing of the fibroblast growth factor receptor 2 pre-mRNA, Mol. Cell Biol., 1993; 13: 5461 5468.

46. Gilbert F.S., Developmental Biology, Eighth Edition, 2006; Chapter 6, Cell-cell communication in development.

47. Gilboa L., Wells R.G., Lodish H.F., Henis Y.I., Oligomeric structure of type I and type II TGF-b receptors: Homo-dimers form in the ER and persist at the plasma membrane, J. Cell Biol., 1998; 140: 767 777.

48. Gospodarowicz D., Purification of a Fibroblast growth factor from bovine ituitaiy, J. Biol. Chem. 1975; 250: 2515 2520.i

49. Gospodarowicz D., Baird A., Cheng J., Lui G.M., Esch F., Bohlen P., Isolation of fibroblast growth factor from bovine adrenal gland: physicochemical and biological characterization, Endocrinology, 1986; 118: 82 90.

50. Gospodarowicz D., Neufeld G., Schweigerer L. Fibroblast growth factor, Mol. Cell Endocrinol., 1986; 46: 187 204. (II)

51. Goumans M.J., Valdimarsdottir G., Itoh S., Lebrin F., Larsson J., Mummery C., Karlsson S., ten Dijke P., Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling, Mol. Cell., 2003; 12(4): 817-828.

52. Greenwald J., Groppe J., Gray P., Waiter E., Kwiatkowski W., Vale W., Choe S., The BMP7/ActRII extracellular domain complex provides new insightsinto the cooperative nature of receptor assembly, Molecular Cell, 2003; 11: 605 -617.

53. Greenwald J., M.E. Vega, G.P. Allendorph, W.H. Fischer, W. Vale, S. Choe, A flexible activin explains the membrane-dependent cooperative assembly of TGF-beta family receptors, Molecular Cell, 2004; 15: 485 489.

54. Griffith D.L., Keck P.C., Sampath T.K., Rueger D.C., W.D. Carlson, Three-dimensional structure of recombinant human osteogenic protein 1: structural paradigm for the transforming growth factor beta superfamily, PNAS, 1996; 93: 878-883.

55. Halaban R., Fan B., Ahn J., Funasaka Y., Gitay-Goren H., Neufeld G., Growth factors, receptor kinase and protein tyrosine phosphatase in normal and malignant melanocytes, J. Immunopathol, 1992; 12: 154 -161 and 121: 505 514.

56. Hanahan D., Weinberg R.A., The hallmarks of cancer, Cell, 2000; 100: 5770.

57. Harrington A.E., Morris-Triggs S.A., Ruotolo B.T., Robinson C.V., Ohnuma S., Hyvonen M., Structural basis for the inhibition of activin signaling by follistain, EMBO Journal, 2006; 25: 1035 1045.

58. Hart P.J., Deep S., Taylor A.B., Shu Z., Hinck C.S., Hinck A.P., Crystal structure of the human TbetaR2 ectodomain-TGF-beta3 complex, Nature Structural Biology, 2002; 9: 203 208.

59. Hayes S., Chawla A., Corvera S., TGF beta receptor internalization into EEA1-enriched early endosomes: role in signaling to Smad2, J. Cell Biol., 2002; 158(7): 1239-1249.

60. He W.W., Gustafson M.L., Hirobe S., Donahoe P.K., Developmental expression of four novel serine/threonine kinase receptors homologous to the activin/transforming growth factor-beta type II receptor family, Dev. Dyn., 1993; 196(2): 133 142.

61. Heldin C.-H., Miyazono K., ten Dijke P., TGF-P signalling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins, Nature, 1999; 390(4): 465 471.

62. Henis Y.I., Moustakas A., Lin H.Y., Lodish H.F., The types II and in transforming growth factor-b receptors form homo-oligomers, J. Cell Biol., 1994; 126: 139-154.

63. Jaye M., Schlessinger J., Dionne C.j Fibroblast growth factor receptor for acidic and basic fibroblast growth factors, Biochim. Biophys. Acta, 1992; 1135: 185-199.

64. Kan M., Wang F., Xu J., Crabb J.W., Hou J., McKeehan W.-L., An essential heparin-binding domain in the fibroblast growth factor receptor kinase, Science, 1993; 259:1918-1921.

65. Kang, J.S., Liu C., Derynck R., New regulatory mechanisms of TGF-p receptor function, Trends Cell Biol., 2009; 198: 385 394.

66. Kirsch T., Sebald W., Dreyer M.K., Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex, Nature Structural Biology, 2000; 7: 492 496.

67. Klagsbrun M., Baird A., A dual receptor system is required for basic fibroblast growth factor activity, Cell, 1991; 67:229 231.

68. Kondo S., Isobe K., Ishiguro N., Nakashima I., Miura T., Transforming growth factor-pl enhances the generation of allospecific cytotoxic T-lymphocytes, Immunology, 1993; 79: 459 464.

69. Kretzschmar M., Doody J., Massague J., Opposing BMP and EGF signalling pathways converge on the TGF-beta family mediator Smadl, Nature, 1997; 389: 618-622.

70. Kretschmer A., Moepert K.5 Dames S., Sternberger M., Kaufmann J., Klippel A., Differential regulation of TGF-beta signaling through Smad2, Smad3 and Smad4, Oncogene, 2003; 22: 6748 6763.

71. Maina C.V., Riggs P.D., Grandea A.G., Slatko B.E., Moran L.S.,

72. Tagliamonte J.A., McReynolds L.A., di Guan C., An Escherichia coli vector toexpress and purify foreign proteins by fusion to and separation from maltose-binding protein, Gene, 1988; 74: 365 373.

73. Massague J., TGF-fUn cancer, Cell, 2008; 134: 215 230.

74. Massague, J., TGF-p signal transduction, Annu. Rev. Biochem., 1998; 67: 753-791.

75. Massague J., Cheifetz S., Laiho M., Transforming growth factor-beta, Cancer Surv., 1992; 12: 81 103.

76. Massague J., Wotton D., Transcriptional control by the TGF-beta/Smad signaling system, Embo. J., 2000; 19: 1745 1754.

77. McKeehan W.-L., Hou J., Adams P., Wang F., Yan G.C., Kan M., Heparin-binding fibroblast growth factors and prostate cancer, Adv. Exp. Med. Biol., 1993; 330: 203-213.

78. Mitchell H., Choudhury A., Pagano R.E., Leof E.B., Ligand-dependent and independent transforming growth factor-beta receptor recycling regulated by clathrin-mediated endocytosis and Rabll, Mol. Biol. Cell, 2004; 15(9): 4166 -4178.

79. Mitraki A., King J., Protein folding intermediates and inclusion body formation, Biotechnology, 1989; 7: 690 697.

80. Mittl P.R.E., Priestle J.P., Cox, D.A., Mcmaster G., Cerletti N., Grutter M.G., The crystal structure of TGF-J33 and comparison to TGF-P2: implications for receptor binding, Protein Sci., 1996; 5: 1261-1271.

81. MourskaiaA.A., Dong Z., Ng S., Banville M., Zwaagstra J.C., O'Connor-McCourt M:D., Siegel P.M., Transforming growth factor-betal is the predominant isoform required for breast cancer cell outgrowth in bone, Oncogene 2009; 28: 1005- 1015.

82. Moustakas A., Lin H.Y., Henis Y.I., Plamondon J., O'Connor-McCourt M.D., Lodish H.F., The transforming growth factor b receptors types I, II, and III form hetero-oligomeric complexes in the presence of ligand, J. Biol. Chem., 1993; 268:22215-22218.

83. Moyen Y., Kan M., Sao G.H., McKehan W.L., Sato J.D., Bifunctional e€ects of transforming growth factor-p (TGF-p) on endothelial cell growth correlate with phenotypes of TGF-P binding sites, Exp. Cell Res., 1990; 191: 229 -304.

84. Murphy S.J., Doré J.J., Edens M., Coffey R:J., Barnard J.A., Mitchell' H., Wilkes M., Leof E.B., Differential trafficking of transforming growth factor-beta receptors'and ligand in polarized epithelial cells, Mol. Biol: Cell; 2004; 15(6): 2853-2862.

85. Nagaraj N.S., Datta P.K., Targeting the transforming growth factor-beta signaling pathway in human cancer, Expert Opin. Investig. Drugs, 2010; 19: 77 , 91.

86. Nakao A., Imamura T.5 Souchelnytskyi S., Kawabata M., Ishisaki A., Oeda E., Tamaki K., Hanai J., Heldin C.H., Miyazono K., ten Dijke P., TGF-beta receptor-mediated signalling through Smad2; Smad3 and Smad4, EMBO J., 1997; 16(17): 5353 -5362.

87. Nickel J., Kotzsch A., Sebald W., Mueller T.D., A single residue of GDF-5 defines binding specificity to BMP" receptor IB, Journal- of Molecular Biology, 2005;349:933-947.

88. Nugent M.A., Iozzo R.V., Fibroblast growth factor. The InternationalJournal of Biochemistry & Cell Biology 2000; 32: 115 120:

89. O'Kane S., Ferguson M.W., Transforming' growth; factor beta and wound healing, Int. J: Biochem. Cell Biol.', 1997; 29: 63 78.

90. Ohnishi' S., Takano K., Amyloid fibrils from1 the viewpoint of protein folding, Cell Mol. Life Sci:, 2003; 61(5): 511 524.

91. Olwin B.B., Rapraeger A.C., Repression of myogenic differen-tiation by aFGF, bFGF, and k-FGF is dependent on cellular heparan sulfate, J. Cell Biol., 1992; 118: 631-639.

92. Ornitz D:M., Herr A.B., Nilsson M., Westman J., Svahn C-M., Waksman G., FGF binding and FGF receptor activation by synthetic heparan-derived di- and trisaccharides, Science, 1995; 268: 432 436.

93. Ornitz D.M., Itoh N., Fibroblast growth factors, Genome Biol., 2001; 2: 130.

94. Ornitz D.M., Leder P., Ligand specificity and heparin depen-dence of fibroblast growth factor receptor -1 and -3, J. Biol. Chem., 1992; 267: 16305 -16311.

95. Ornitz D.M., Xu J., Colvin J.S., McEwen D.G., MacArthur C.A., Coulier F., Gao G., Goldfarb M., Receptor specificity of the fibroblast growth factor family, J Biol. Chem., 1996; 271: 15292 15297.

96. Ornitz D.M., Yayon A., Flanagan J.G., Svahn C.M., Levi E., Leder P., Heparin is required for cell-free binding of basic fibroblast growth factor to a soluble receptor and for mitogenesis in whole cells, Mol. Cell Biol., 1992; 12: 240 -247.(11)

97. Parekh T., Saxena B., Reibman J., Cronstein B.N., Gold L.I., Neutrophil Chemotaxis in response to TGF-ß isoforms (TGF-ß 1, TGF-ß2, TGF-ß3) is mediated by fibronectin, J. Immunol., 1994; 152: 2456 2466.

98. Pinkas J., Teicher B.A., TGF-ß in cancer and as a therapeutic target, Biochem. Pharmacol., 2006; 72: 523 529.

99. Prehn J.H., Peruche B., Unsicker K., Krieglstein J., Isoformspecific effects of transforming growth factors-beta on degeneration of primary neuronal cultures induced by cytotoxic hypoxia or glutamate, J. Neurochem., 1993; 60: 1665 -1672.

100. Presta M., Rusnati M., Maier J.A., Ragnotti G., Purification of basic fibroblast growth factor in the rat brain: identification of a Mr 22,000 immunoreactive form, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1988; 155: 1161 -1172.

101. Presta M., Statuto M., Rusnati M., Dell'Era P., Ragnotti G., Characterization of a Mr 25,000 basic fibroblast growth factor form in the adult, regenerating, and fetal rat liver, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1989; 164: 1182-1189.

102. Provencher S.W., Contin a General-Purpose»Constrained Regularization Program»for Inverting' Noisy Linear Algebraic and- Integral-Equations,. Сотр. Phys. Commun., 1982; 27: 213 - 227, 229 - 242.

103. Rapraeger A.C., Krufka A., Olwin B.B., Requirement of heparan sulfate for bFGF-mediated fibroblast growtband myoblast differ-entiation, Science, 1991; 252: 1705-1708.

104. Ranganathan P., Agrawal A., Bhushan R., Chavalmane A.K., Reddy Kalathur R.K., Takahashi Т., Kondaiah P., Expression profiling of genes regulated by TGF-beta: Differential regulation in normal and tumour cells, BMC Genomics, 2007; 8: 98.

105. Roberts A.B., Frolik C.A., Anzano M.A., Sporn M.B., Transforming growth factors from neoplastic and nonneoplastic tissues, Fed. Proc., 1983; 42: 2621 -2626.

106. Roghani M., Mansukhani A., DeU'EraP:, Bellosta P.', Basilico C., Rifkin D.B., Moscatelli D., Heparin increases the affinity of basic fibroblast growth factor for its receptor but is not required, for binding, J. Biol. Chem., 1994; 269: 22156-22162.

107. Rosenberg R.D., Shworak N.W., Liu J., Zhang L., Heparan Sulfate Proteoglycans of the Cardiovascular System., J. Clin. Invest., 1997; 99: 2062 -2070.

108. Sannes P.L., Burch K.K., Khosla J., Immunohistochemical localization of epidermal growth factor and acidic and basic fibroblast growth factor in postnatal developing and adult lung, Am. J. Res. Cell. MoL Biol., 1992; 7: 230 237.

109. Schein C.H., Production of soluble recombinant proteins in bacteria, Biotechnology, 1989; 7: 1141 1149.

110. Scheufler C., Sebald' W., Hulsmeyer Mi, Crystal^ structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 A, resolution, Journal' of Biological1 Chemistry,-1999; 287: 103-115.

111. Schlunegger M:P., Grutter M.G., An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 angstrom resolution of human transforming growth factor-p2, Nature, 1992; 358: 430 -434.

112. Schulz M.W., Chamberlain C.G., de Iongh R.U., McAvoy J.W., Acidic and basic FGF in ocular media and lens: implications for lens polarity and growth patterns, Development, 1993; 118: 117 126.

113. Shaw M., Foreman D.M., Ferguson M.W., Neutralization of TGF-(31 and TGF-p2 or exogenous, addition of TGF-03 to cutaneous rat wound reduces scarring, J. Cell Sci., 1995; 108: 985 1002'.

114. Sheng Z., Chang' S.B., Chirico W.J., Expression' and purification of a biologically active basic fibroblast growth factor fusion protein, Prot. Expr. and Purif., 2003; 27(2): 267 271.

115. Shimasaki S., Moore R.K., Otsuka F., Erickson G.F., The bone morphogenetic protein system in mammalian reproduction, Endocrine Reviews, 2004; 25:72-101.

116. Slack J.M.W., Darlington B.G., Heath J.K., Godsave G., Heparin-binding growth factors as agents of mesoderm induction in early Xenopus embryo, Nature, 1987; 326: 197-200.

117. Smith D.B., Johnson» K.S., Single-step purification* of polypeptides expressed ins Escherichia. coli\ as fusions with* glutathione S-transferase, Gene, 1988; 67:31 -40:

118. Sorensen V., Nilsen T., Wiedlocha A., Functional diversity of FGF-2 isoforms by intracellular sorting; BioEssays, 2006; 28: 504 514. '

119. Sporn M.B., Roberts* A.B., Transforming growth factor-beta: recent progress and,new challenges, J. Cell Biol., 1992; 119: 1017 1021.

120. Stader J:A., Silhavy T.J., Engineering Escherichia- coli to- secrete heterologous gene products, Methods in Enzymol, 1990; 165: 166.- 187.

121. Steegmaier M., Levinovitz A., Isenmann S., Borges E., Lenter M., Kocher P., Kleuser B., Vestweber D., The E-selectin-ligand* ESL-1 is a variant of a receptor for fibroblast growth factor, Nature, 1994; 373: 615 620.

122. Steinbrech D.S., Mehrara B.J., Rowe N.M., Gene expression of TGF-beta, TGF-beta receptor, and extracellular matrix proteins during membranous bone healing in rats, Plast. Reconstr. Surg., 2000; 105: 2028 2038.

123. Stockwell B.R., Schreiber S.L., Probing the role of homomeric and heteromeric receptor interactions in TGF-beta signaling using small molecule dimerizers, Curr. Biol., 1998; 8: 761 770.

124. Stormo G.D., Schneider T.D., Gold L., Characterization of translation initiation sites in E. coli, Nucl. Acids Res., 1982; 10: 2971 2996.

125. Streuli C.H., Schmidhauser C., Kobrin M., Bissell M.J., Derynck R., Extracellular matrix regulates expression of the TGF-betal gene, J. Cell Biol., 1993; 120: 253-260.

126. Sun P.D., Davies D.R., The cysteine-knot growth- factor superfamily, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct, 1995; 24: 269 291.

127. Sun D., Piez K.A., Ogawa Y., Davies D.R., Crystal structure of TGF-p2: an unusual fold for the superfamily, Science, 1992; 257: 369 373.

128. Taipale J., Saharinen J., Keski-Oja J., Extracellular matrix associated transforming growth factor-beta: role in cancer cell growth and invasion, Adv. Cancer Res., 1998; 75: 87-134.

129. Taylor E.P., FGF-2-FGFR-Heparin (2:2:2) Complex, The University of Michigan, 2005.

130. Thompson' L.D., Pantoliano M.W., Springer B.A., Energetic characterization of the basic fibroblast growth factor-heparin interaction: identification of the heparin binding domain, Biochemistry 1994; 33: 3831 3840.

131. Thompson S.A., The disulfide structure of bovine pituitary basic fibroblast growth factor, J. Biol. Chem., 1992; 267: 2269 2273.

132. Thompson T.B., Woodruff T.K., Jardetzky T.S., Structures of an ActRIIB:activin A complex reveal a novel binding mode for TGF-beta ligand-receptor interactions, EMBO Journal, 2003; 22: 1555 1566.

133. Tsuboi R., Rifkin D.B., Recombinant bFGF stimulates wound healing in healing-impaired db/db mice, J. Exp. Med., 1990; 172: 245 251.

134. Vilgrain I., Baird A., Phosphorylation of basic fibroblast growth factor by a protein kinase associated with the outer surface of a target cell, Mol. Endocrinol., 1991; 5: 1003-1012.

135. Vilgrain I., Gonzales A.M., Baird A., Phosphorylation of basic fibroblast growth factor (FGF-2) in the nuclei of SK-Hep-1 cells, FEBS Lett., 1993; 331: 228-232.

136. Wang J., Hong A., Ren J.-S., Sun F.-Y., Shi Y.-J., Liu K., Xie Q.-L., Dai Y., Li Z.-Y., Chen Y., Biochemical properties of C78SC96S rhFGF-2: A doublepoint-mutated rhFGF-2 increases obviously its activity, Journal of Biotechnology, 2006; 121: 442 447.

137. Wang F., Kan M., Xu J., Yan G., McKeehan W.-L., Ligand specific structural domains in the fibroblast growth'factor receptor, J. Biol. Chem., 1995; 270: 1022-1030.

138. Wang X.F., Lin H.Y., Ng-Eaton E., Downward'J., Lodish H:F., Weinberg R.A., Expression cloning and characterization of the TGF-beta type III receptor, Cell, 1991; 67(4): 797-805.

139. Wang H.,- Song K., Krebs- T.L., Yang J., Danielpour D., Smad7 is inactivated through a direct physical interaction with the LIM protein Hic-5/ARA55, Oncogene, 2008; 27: 6791 6805.

140. Weis-Garcia F., Massague J., Complementation, between kinase-defective and activation-defective TGF-beta receptors reveals a novel form of receptor cooperativity essential for signaling, EMBO J., 1996; 15: 276 289.

141. Wells R.G., Gilboa L., Sun Y., Liu X., Henis Y.I., Lodish H.F., Transforming growth factor-beta induces formation of a dithiothreitol-resistant type I/Type Ilreceptor complex in live cells, J. Biol. Chem:,1999; 274: 5716 -5722.

142. Westall F.C., Rubin R., Gospodarowicz D., Brain-derived fibroblast growth factor: a study of its inactivation, Life Sci., 1983; 33: 2425 2429.

143. Wharton K., Derynck R., TGFbeta family signaling: novel insights in development and disease, Development, 2009; 136: 3691 3697.

144. Wrana J.L., Attisano L., Carcamo J., Zentella A., Doody J., Laiho M., Wang X.-F., Massague J., TGF-I signals through a heteromeric protein kinase receptor complex, Cell, 1992; 71: 1003 1014.

145. Wrana J.L., Attisano L., Wieser R., Ventura F., Massague J., Mechanism of activation of the TGF-beta receptor, Nature, 1994; 370(6488): 341-347.

146. Wu M.Y., Hill G.S., TGF-p superfamily signaling in embryonic development and homeostasis, Dev. Cell, 2009; 16: 329 343.

147. Yamashita H., ten Dijke P., Franzen P., Miyazono K.,. Heldin G.H., Formation of hetero-oligomeric complexes of type Is and type II receptors for transforming growth'factor-beta, J. Biol. Chem;, 1994; 269(31): 20172-20178.

148. Yan X., Liu Z;, Chen Y., Regulation of TGF-beta signaling by Smad7, Acta. Biochim. Biophys. Sin-., 2009; 41: 263 272.

149. Yayon A., Klagsbrun M., Esko J.D., Leder P., Ornitz D.M., Cell surface heparin-like molecules are required for binding of basic fibroblast growth factor to its high affinity receptor, Cell 1991; 64: 841 848.

150. Zacchigna S., Lambrechts D., Carmeliet P., Neurovascular signalling defects in neurodegeneration, Nature Reviews Neuroscience, 2008; 9: 169 181.

151. Zhu X., Komiya H., Chirino A., Faham S., Fox G.M., Arakawa T., Hsu B.T., Rees D.C., Three-dimensional structure of acidic and basic fibroblast growth factors. Science 1991; 251: 90 93.

152. Zhu H.-J., Sizeland A.M., Extracellular Domain of the Transforming Growth Factor-beta receptor negatively regulates ligand-independent receptor activation, J. Biol. Chem., 1999; 274: 29220 29227.

153. Zimmer Y., Givol D., Yayon A., Multiple structural elements determine ligand binding of fibroblast growth factor receptors. Evidence that both Ig domain 2 and 3 define receptor specificity, J. Biol. Chem., 1993; 268: 7899 7903.