Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование фрагмента кДНК, кодирующего лиганд-связывающий домен рецептора липопротеинов низкой плотности человека, в экспрессионных плазмидных векторах Escherichia coli, и анализ продуктов экспрессии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Клонирование фрагмента кДНК, кодирующего лиганд-связывающий домен рецептора липопротеинов низкой плотности человека, в экспрессионных плазмидных векторах Escherichia coli, и анализ продуктов экспрессии"

РГБ ОД

î п г-:.п

На правах рукописи

Рунова Ольга Леонидовна

КЛОНИРОВАНИЕ ФРАГМЕНТА кДНК, КОДИРУЮЩЕГО ЛИГАНД-СВЯЗЫВАЮЩИЙ ДОМЕН РЕЦЕПТОРА ЛИПОПРОТЕИНОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ ЧЕЛОВЕКА, В ЭКСИРЕССИОННЫХ ШАЗМИДНЫХ ВЕКТОРАХ ESChliRICHfA COU, И АНАЛИЗ ПРОДУКТОВ ЭКСПРЕССИИ.

Специальность: 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Сан кт-Г1етербу р г 1999

Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН (директор - академик £. И.-Ткаченко)

Научный руководитель:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор В. С. Гайцхоки Официальные оппоненты:

доэтор биологических наук, профессор Н. В. Томилин доктор биологических наук А. П. Перевозчиков

Ведущее научное учреждение - Центральный научно-исследовательский рентгено-радиологичесхий институт МЗ РФ.

Защита диссертации состоится « 1999 г. в « » часов на заседании

диссертационного совета К 001.23.01 при Научно-исследовательском институте экспериментальной медициныРАМН по адресу: 193376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, д. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ РАМН (по адресу: Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, д. 12).

Аатореферат разослан

к

Ученый секретарь

диссертационного советаК 001.23.01

доктор биологических наук О. Г. Куликова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАИОГЫ

Актуальность проблемы.

Изучение структурно-функциональных отношений а мультидоменных белках клеточной поверхности, функционирующих как рецепторы специфических белковых или иных лигандов и участвующих либо в переносе веществ между клетками и внеклеточными пространствами, либо в передаче сигналов от внеклеточных лигандов, является одной из центральных проблем современной молекулярной медицины. Среди рецепторов, интернализирующих связанные лиганды, наиболее изучен рецептор липопротеиков низкой плотности (РЛНП). Прогресс в исследовании РЛНП связан прежде всего с классическими работами Голдштейна и Брауна (Brown, Goldstein, 1976, 1986; Goldstein, Brown, 1989), которые впервые описали РЛНП и показали, что одно из наиболее распространенных аутосомно-доминантных заболеваний человека - семейная гиперхолесгеринемия обусловлена мутациями в гене РЛНП с гетерогенными биохимическими проявлениями (количественный дефицит РЛНП, нарушение его лиганд-связывающей активности, блоки интерналиэации комплекса РЛНП-лиганд и реутилизации РЛНП с его возвращением на поверхность клетки). В дальнейшем эти авторы и их сотрудники (Yamamoto et а)., 1984) осуществили клонирование кДНК, кодирующей РЛНП, определили ее нуклеотидную последовательность и исследовали экзошшо-интронную структуру гена РЛНП. На основании этих данных в разных странах, в том числе, в России, проведено изучение нарушений структуры мутантных аллелей гена РЛНП у больных с семейной гиперхолесгеринемией (Мандельштам и др., I995aj6, Chakir et al., 1998; Mandelshtam et al„ 1998), которое продемонстрировало множественность и гетерогенность этих мутаций (к настоящему времени описано более 300 мутаций гена РЛНП (Hobbs et al., 1992; Varret et al., 1997), в России - 8 мутаций). В то же время все представления о пространственной и мультидоменной структуре РЛНП основаны лишь на предсказаниях, базирующихся на сведениях об аминокислотной последовательности этого белка, и лишь в последние годы появились сообщения о прямом анализе трехмерных структур относительно коротких фрагментов РЛНП (цистеин-богатых повторов внеклеточного доиена), изолированных в виде рекомбинантных белков - продуктов экспрессии соответствующих плазмид в клетках Escherichia coli (Bieri et al., 1995; Daly et al., 1995a,6, Blacklow, Kim, 1996, Fass et al, 1997). В связи с этим мы предприняли попытку получить рекомбинантный белок со структурой и активностью полноразмерного лиганд-связывающего домена РЛНП человека. Актуальность этой темы исследования обусловлена следующими соображениями: 1) для оценки общей функциональной активности РЛНП необходимы сведения о трехмерной структуре полноразмерного лиганд-связывающего домена; 2) наличие индивидуального белка - лиганд-связывающего домена РЛНП имеет

существенное значение дня выяснения функциональных последствий мутационных аминокислотных замен и делений в этой домене; 3) на основе рекомбинантного— лиганд-связывающего домена РЛНП может быть создана простая бесклеточная тест-система для изучения структурных аномалий JlHll-частиц и их белковых компонентов, нарушающих их связывание с РЛНП, 4) лиганд-связывагощий домен РЛНП в перспективе может найти применение в качестве специфического твердофазного сорбента для элиминации ЛНП из крови больных с различными формами гиперхолестеринемии. Наряду с этими конкретными направлениями использования лиганд-связывающего домена РЛНП в научных исследованиях и в практической медицине, его получение в виде рекомбинантного белка должно способствовать решению общей проблемы так называемых растворимых рецепторов, представляющих собой внеклеточные (как правило, N-концевые) фрагменты мембранных рецепторов и функционирующих как антагонисты мембранных рецепторов, которые конкурируют с ними за высокоаффинное связывание лигандов (Tomida et al., 1994, Han et ai., 1994). Механизмы образования таких растворимых рецепторов in vivo могут быть разнообразными (ограниченный протеолиз со "слущиванием" внеклеточных фрагментов рецептора в среду, инициация транскрипции с альтернативных промоторов, альтернативный сплайсинг npe-мРНК, сдвиги рамки считывания с ранней терминацией, экспрессия неаллельных генов, кодирующих растворимые рецепторы и др.), Рекомбинангные лиганд-связывающие домены различных поверхностных рецепторов используются для анализа структурной организации комплексов рецептор-лиганд. В отдельных работах показано, что в среде культивирования клеток и в биологических жидкостях человека содержится белок, соответствующий по размерам и по последовательности аминокислот лиганд-связывающему домену РЛНП и обладающий антивирусной активностью (Fischer et al., 1993). В связи о этими соображениями получение в препаративных количествах рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП человека должно способствовать как дальнейшему исследованию природного растворимого РЛНП, так и созданию высокоснецифических способов модулирования активности мембранного РЛНП в культурах клеток и в многоклеточном организме.

Дели и задачи исследования.

Основной целью работы было конструирование векторных плазмид, кодирующих лигавд-связывающий домен РЛНП и изучение его иммунохимичсской специфичности и функциональной активности. Для достижения этой цели были поставлены следующие этапные задачи исследования:

1. Конструирование экспрессионных плазмид, кодирующих лиганд-связывающнй домен РЛНП, на основе векторов серий pUliX и рЕТ и плазмиды pLDLR-3, содержащей полнораэмерную кДНК РЛНП.

2. Оптимизация экспрессии этих рекомбинантных ДНК в бактериальных клетках.

3. Разработка процедур выделения рекомбинактного лиганд-свюывающего домена РЛНН в виде гомогенного белка.

4. Получение антител к рекомбинантным белкам и изучение их специфичности н перекрестных взаимодействий с РЛНП клеток человека.

5. Оптимизация процедур восстановления-денатурации и рефолдннга для получения функционально активного рекомбииантного белка, обладающего ЛНЯ-

- связывающей активностью.

Научная новизна работы.

Впервые выделен и охарактеризован полноразмерный лиганд-связывающий домен РЛНП человека - продукт экспрессии соответствующего фрагмента кДНК РЛНП в плазмидных векторах Е. coli. Разработаны препаративные методы выделения этого белка в гомогенном виде. В результате процедур восстановления-денатурации и последующего рефолдинга рекомбииантного лиганд-связьшающего домена РЛНП достигнуто реконструирование его специфической кальций-зависимой ЛНП-связывающей активности.

Практическая значимость работы.

Полученные антитела к рекомбинантному лиганд-связывающему домену РЛНП перекрестно реагируют с природным РЛНН клеток человека и могут использоваться для его иммунохимичсской детекции в реакции иммуноблотинга и количественного определения. Лиганд-связывающий домен РЛНП, обладающий специфической ЛНП-свяэывающей активностью, в перспективе может найти применение для создания тест-системы определения аномальных ЛНП в крови человека и для специфической элиминации ЛНП из крови больных с различными формами гиперхолестеринемии.

С'иовные положения, выносимые на защиту:

1. Сконструированы плазмидные экспрессионные векторы, направляющие высокоэффективный синтез рекомбииантного лиганд-связывающего домена РЛНП человека в клетках Escherichia coli.

2. Рекомбинантный лиганд-связывающий домен РЛНП препаративно выделен в виде электрофорегически гомогенного белка.

3. Получены антитела к двум формам этого рекомбииантного белка (слитого с ß-галактозидазой и индивидуального), дающие перекрестную иммунологическую реакцию с природным РЛНП мембран клеток человека.

4. Для получения функционального активного рекомбннантного лиганд-спязывающего__

домена РЛШ1, синтезируемого в клетках lischerichia coli, необходимо его восстановление, денатурация и последующий рефолдинг путем медленного диализа против кальций-содержащих буферных растворов. При этом происходит реконструкция специфической кальций-зависимой ЛНП-связывающен активности, первоначально не определяемой для исходного рекомбинантного белка.

Апробация работы.

Материалы диссертации представлены на конференции молодых физиологов и биохимиков России, Санкт-Петербург, 1995 г,; на симпозиуме, посвященном 110-летию со дня рождения академика Н.Н.Аничкова, 21-23 ноября 1995 г., Санкт-Петербург; на Втором Съезде Биохимического общества Российской Академии Наук, Москва, 19-23 мая 1997 г., на 1-ой медико-биологической конференции молодых ученых Санкт-Петербурга, 17-19 ноября 1997 г.; на международном симпозиуме "Protein Structure, Stability and Fclding, Fondamental and Médical Aspects", Москва, 22-26 июня 1998 г.; на конференции молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины", посвященной 240-летиго ММА им. И.М.Сеченова, Москва, 1998 г.; на международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", 21-25 сентября 1998 г., Пущино. Основные положения работы отражены в материалах этих конференций и в двух журнальных статьях.

Структура диссертации.

Диссертация изложена наТ^траницах и содержит; введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов и выводы. Работа иллюстрирована 2£рисунками. Список литературы содержит названий работ на русском и английском языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы штаммы coli DH5a и BL21. Штамм DH5a генотипа supE44 Д1ас U169 (ф80 lacZ ДМ15) hsdR17 recAl cndAl gyrA96 thi-1 relAl использован для трансформации исходными и гибридными плазмидами. Штамм BL21 (DE3) pLysS (F-ompTrB-mB-) использован в качестве хозяина для трансляционных векторов рЕТ. Штаммы coli выращивали на среде LB (Luria - Bertani) (Маниатис и др., 1984). Плотная питательная среда содержала 1,5% агара, среда для хранения культур - 0,7% агара в LB среде. Антибиотики: ампициллин (Ар), хлорамфеникол (Cm) добавляли по мере необходимости в среду роста в концентрациях 100 мкг/мл и ЗОмкг/мл соответственно.

В качестве векторных гшазмид для встраивания кДНК лиганд-связывающего домена рецептора ЛНП человека и его экспрессии использовали плазмиды Е. coli:

pUEX2 (Bressan, Stanley, 1989) и pHT22b(+) (рЕ'Г System Manual, 1993). Исходным материалом служила плазмвда pLDLR-3, содержащая полноразмерную кДНК рецептора.

Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса (Birnboim, Doly, 1979, Promega protocols and applications guide, 1990). Выделенные плазмидные ДНК анализировали электрофорезом в агарозном геле (Маниатис и др., 1984). Трансформацию Е. coli плазмидной ДНК проводили методом с применением хлорида кальция (Mandel, Higa, 1970; Dagert, Ehrlich, 1979). Для идентификации фрагментов ДНК, содержащих клонированные последовательности, проводили гибридизацию на мембранах "Hybond-N" (Amersham, Англия). Перепечатку бактериальных колоний на мембраны и фиксацию бактериальной ДНК осуществляли методом, описанным G runstein, Hogness (1975) в модификации Маниатиса и др. (1984). Перенос фрагментов ДНК из агарозных гелей проводили по Southern (1975) с использованием щелочных буферов для переноса (Reed, Mann, 1985), Зондом для гибридизации служил 1,1 т.п.н. -Pstl-фрагмент плазмвды pLDLR-3, использованный и при клонировании, который был очищен электрофорезом в легкоплавкой агарозе (Маниатис и др., 1984). ДНК-зонд метили [«-"PJdCTP со статистическим праймированием, с использованием набора реактивоз фирмы Amersham. Удельная активность зонда составляла более Ш'имп/мин/мкг ДНК. Гибридизацию на нитроделлюлозных фильтрах с ДНК бактериальных колоний или с перенесенными фрагментами ДНК из геля производили модифицированным методом Саузерна (Маниатис и др., 1984).

I Слитый с ß-галактозидазой рекомбингнтный белок в виде телец включения получали из клеток Е. colt, трансформированных рекомбинантной плазмидой pUEXL45, методом, описанным Sambrook et al., (1989). Рекомбинантный лиганд-связывающий домен в виде индивидуального белка был очищен из клеток штамма, содержащего рекомбинантную плазмиду p£TL33, методом аффинной хроматографии на His-Bind смоле (рЕТ System Manual, 1993).

Определение концентрации белка в пробах проводили по методу Lowry et al., (1951). Элекгрофоретическое разделение белков осуществляли в 7,5% полиакриламидном геле (ПАЛГ), содержащем 0,1% додецилсульфата натрия (SDS) (Laemmii, 1970). Электроперенос белков из ПААГ на нитроцеллюлозный фильтр (BIORAD, США) проводили полусухим методом (Burnette, 1981; Kyhse-Anderson, 1984). Процедуры иммуноблоттинга и лигандного блотгинга проводили согласно оригинальным методам Beisiegel et al. (1982), Daniel et al. (1983), соответственно. Для детекции иммунного ответа использовали "вторые" антитела к иммуноглобулинам кролика или мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, (Amersham, Англия, Институт вакцин и сывороток, Санкт-Петербург). ЛНП человека, выделенные из

плазмы крови доноров методом ультрацелтрифугированйя; а также кроличьи антитела к аполипопротеину В были получены и любезно предоставлены сотрудниками отдела биохимии НИИЭМ РАМН, Санкт-Петербург. Моноклональные антитела к РЛНП человека lgG-C7 приобретены у фирмы Amersham, Англия.

Атптела к рекомбинантному лиганд-связываюхцему домену РЛНП человека получали путем иммунизации кроликов: 1) препаратом слитого рекомбинантного белка, вырезанного из ПААГ; 2) рскомбинаптным белком, очищенным на аффинной колонке; 3) вырезанной из ПААГ белковой зоной, соответствующей аффинно очищенному рекомбинантному белку. Антиген вводили внугрикожно по 200 - 300 мкг белка с полным адмовантом Фрейнда. Иммуноглобулины высаливали сульфатом аммония из антисывороток иммунизированных животных (Харбоу, Ингнльд, 1977).

РЛНП человека получали из лизатов культивируемых фибробластов человека (Beisiegel et al., 1982). В работе была использована культура фибробластов линии НТ-1080, первично полученная из фибросаркомы человека и предоставленная банком клеточных культур Института цитологии РАН, Санкт-Петербург. Для культивирования клеток использовали среду ДМ ЕМ, эмбриональную сыворотку теленка и пластиковые флаконы для клеточных культур фирмы Flow Laboratories, Англия.

Денатурацию-рефолдинг рекомбинантного аффинно очищенного белка проводили, используя метод медленного диализа (Maeda et al., 1995,1996). Для оценхи связывающей активности рекомбинантного белка был разработан иммунохимический тест на микроячеечных планшетах. В лунках 96-ячеечного иммунологического планшета (Flow Laboratories, Англия) сорбировали аффинно очищенный рекомбинакгный белок - 1 мкг на ячейку в 50 мМ трис-HCl буфере, содержащем 90 мМ MaCi, 2 мМ СаСЬ, рН 8,0 при 4° С в течение ночи. Для уменьшения неспецифического связывания ячейки планшета насыщали 0,05% Tween-20 в рабочем буфере, и все последующие инкубации и отмывки проводили в этом же растворе. Далее последовательно проводили инкубации, с ЛНП человека (20 мкг/мл), с антителами кролика к аполипопротеину В (3 мкг/мл) и со "вторыми" антителами к иммуноглобулинам кролика, конъюгированными с пероксидазой хрена (Amersham, Англия) в разведении 1:1000. Хромогенным субстратом пероксидазной реакции служил орто-фенилендиамии в присутствии 0,03% Н2О2. Интенсивность окраски измеряли при 492 нм на ридере типа "Мультнскан".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

С целью получения рекомбинантного белка, был клонирован фрагмент кДНК, кодирующий лиганд-связывающий домен РЛНП, в экспрессионных векторах Е. соИ, позволяющих получить рекомбинантный полипептид в составе слитого или практически индивидуального белха. Исходным материалом послужила плазмида

pLDLR-З, содержащая полноразмерную кДНК рецептора ЛН11. Для клонирования был избран фрагмент кДНК, кодирующий весь тот участок РЛНП, мутации в котором влияют на связывание лиганда, а именно весь первый домен и повтор А второго домена рецептора. Данные мутационного анализа указывают на то, что отсутствие повтора А второго домена РЛН11 приводит к резкому снижению лиганд-связывающей способности. Рекомбинантный белок, слитый с ß-галактозидазой кишечной палочки, был получен клонированием фрагмента хДНК (нуклеотиды 63 - 1093 кДНК РЛНП, нумерация по Yamamoto et al., 1984) в, экспрсссиоином векторе pUEX2. Вектор был выбран так, чтобы сохранить при клонировании рамку считывания. Обязательность создания данной конструкции была связана с необходимостью получения антител к РЛНП с высоким титром для характеристики природного рецептора и индивидуального рекомбинантного белка. Расчетная молекулярная масса слитого рекомбинантного белка - 160 кДа превышает молекулярные массы белков Е. coli, включая ß-галактозидазу - 116 кДа, что дает возможность легко отделить его от примеси бактериальных белков с помощью электрофореза в ПААГ с SDS и использовать для иммунизации животных.

Система векторов pUEX позволяет проводить клонирование в любом штамме К coli при практически нулевом базовом уровне экспрессии рекомбинантного белка, так как транскрипция находится под контролем высокорегулируеиого промотора pL бактериофага X. При росте культуры активность промотора подавлена термолабильным С1 репрессором, кодируемым той же иультикопийной плазмидой. При повышении температуры с 32° С до 42° С репрессор инактивируется и начинается синтез рекомбинантного белка, наибольший выход которого достигается после1 проведения температурной индукции в течение часа.

Фрагмент кДНК, кодирующий лиганд-связывающий домен РЛНП, был вырезан из плазмиды pI_.DLR.-3 с помощью рестриктазы Pstl и вставлен в уникальный Pstl сайт плазмиды pUEX2. 1'екомбинанты были отобраны методом гибридизационной селекции. Ориентация вставки в экспрессионном векторе определялась с помощью расщепления ДНК рекомбинантных плазмид из нескольких клонов рестрикгазой EcoRl. Клоны, дававшие при расщеплении фрагмент длиной 0,8 т.п.и., были отобраны для анализа экспрессии рекомбинантного белка. После индукции синтеза рекомбинантного белка обнаруживался продукт с расчетной молекулярной массой, что свидетельствовало о сохранении рамки считывания. Поэтому этап секвенирования концов вставки был опущен.

Экспрессия белка осуществлялась в том же штамме К. coli - DH5ot, который использовали и для клонирования. Рекомбинантная плазмида была названа pUEXL45. Рост культуры проходил при 32° С до середины логарифмической фазы (Ада = 0,5),

индукция синтеза исследуемого белка проводилась при 42° С, время индукции - I нас было определено оптимальным. Для исследования продукта экспрессии пробы ультразвуковых лизатов индуцированных клеток подвергались электрофорезу в 7,5% ПААГ с SDS. Б качестве контроля использовались клетки штамма DH5apUHX2, продуцирующие бактериальную ß-галактозидазу без эукариотического фрагмента (рис.1). Слитый рекомбинантный белок формировал в клетках Е. coli нерастворимые тельца включения, в которых он представлен в агрегированном состоянии. Тельца включения можно было наблюдать в цитоплазме индуцированнх клеток при световой микроскопии в фазовом контрасте в виде плотных гранул. Увеличение хЗОО использовалось для предварительного просмотра культур. Для надежной оценки полноты индукции было использовано увеличение х1250.

С целью получения препарата, обогащенного слитым белком, был применен метод выделения и растворения телец включения путем мягкого лизиса дезоксихолатом натрия с последующей обработкой тритоном Х-100. Полученный таким образом рекомбинантный лиганд-связывающий домен РЛНП после электрофореза в SDS ПААГ использовался для иммунизации кроликов.

Для продукции лиганд-связывающего домена РЛНП в виде индивидуального белка соответствующий фрагмент кДНК (нуклеотиды 61 - 1096 кДНК РЛНП) был клонирован в экспрессионном векторе рВТ22Ь(+). Этот вектор содержит ряд последовательностей, облегчающих работу с рекомбннантным белком. Первая кодирует лидерную зону белка pelB, направляющую рекомбинантный белок- продукт в периплазму Е. coli. Вторая обеспечивает создание на С-конце белка His-Tag: кластера из шести последовательных гисшдинивых остатков, используемого для очистки рекомбинантното полипептида на колонке с иммобилизованными ионами T\iu

Фрагмент кДНК для клонирования был получен путем амплификации in vitro с помощью двух праймеров git и gl2. В 5' праймер gil при синтезе был искусственно введен сайг для рестриктазы Hindlll, а в 3' праймер gl2 - сайг для Xhol. Праймеры были спланированы таким образом, чтобы при клонировании амплифицированного фрагмента в векторе рЕТ сохранялась рамка считывания как с 5'-, так и с 3'- концов клонированного фрагмента, Только 15 нуклеотидов каждого из праймеров комплементарны последовательностям гена РЛНП, поэтому при амплификации фрагмента для клонирования путем нолимеразной цепной реакции был использован следующий температурный профиль в течение 30 циклов: денатурация - 95° С, 1минута; отжиг праймеров - 45° С, I минута, элонгация - 72" С, 1 минута при исходной денатурации матрицы в течение 5 минут. Рекомбинанты отбирались в штамме DH5a, но без этапа гибридизационной селекции. Рекомбинантная плазмида была названа рЕТЬЗЗ. Отобранные рестрикционным анализом плазмиды нескольких независимых

кДа 200-

1169268-

Рис. 1. Индукция синтеза рекомбинантного белка в клетках Е. coli, несущих плазмиды. Элсктрофоретичсское разделение белков в 7,5% ПААГ с 0,1% SDS:

1 -лизат индуцированных клеток

DH5a PueXL45;

2 - лизат не индуцированных клеток

DH5a pUEXL45;

3 - лизат индуцированных клеток

DH5a pUEX2;

4 - лизат не индуцированных клеток

DH5apUEX2.

12 3 4

кДа . Рис. 2. Очистка рекомбинантного

лиганд-связывающего домена РЛНП из культуральной среды клеток штамма-продуцента рЕТЬЗЗ па !■■* ,\Р аффинной колонке с

45-

. . иммобилизованными ионами Ni2+.

»„^ , -им WteSf «# Электрофорез в 7,5% ПААГ с 0,1 %

• сп.ч-

SDS:

24 - l - фракция белков, не связавшихся на

123456789 10

колонке;

2 - 6 - фракции белков,

неспецифичсски связавшихся на колонке, полученные при последовательном промывани связывающим и промывающим буферами;

7 - 10 - фракции белка, полученные при промывании элюирующим буфером.

клонов использовались для трансформации экспрессионных штаммов ВЬ21(ОЕЗ)рЬуз5 и ВЬ21(ОЕЗ), отличающихся уровнем базальной экспрессии. Индукция проводилась добавлением к логарифмически растущей культуре (А™ = 0,6) изопропил-р-тио-О-галактопиранозида (ИГ1ТГ) до конечной концентрации 1 мМ с последующей инкубацией в течение 2,5 - 3 часов при интенсивной аэрации.

Очистка рекомбинантного белка осуществлялась с помощью смолы Н1$-Вшс1 с иммобилизованными ионами никеля, эффективно связывающей белки, содержащие кластеры гистидиновых остатков. В результате одностадийной аффинной хроматографии на этой смоле рекомбинантный лиганд-связывающий домен РЛНП был очищен из грубого клеточного лизата и культуральной среды штамма-продуцента. Степень чистоты исследуемого белка, очищенного из клеток, которая оценивалась по результатам электрофореза в 7,5% Г1ААГ с вОБ и иммуноблоттинга, составила 80%, 10 -15% приходилось на долю бактериальных белков с молекулярной массой 48 кДа и 54 кДА, соочищаемых на смоле Шэ-ВМ. Рекомбинантный белок, очищенный из культуральной среды, по результатам тех же экспериментов не содержал примесных бактериальных белков (рис.2).

Положительная иммунохимическая реакция аффишю очищенного белка с антителами к слитому белку и. моноклональными антителами к РЛНП 1&0-С7 в иммуноблоттинге, а также наличие олигогистидиновой последовательности на карбоксигерминальном конце, однозначно свидетельствовали об успешном клонировании и получении желаемого продукта.

Секреция существенной доли рекомбинантного белка в среду культивирования и отсутствие в цитоплазме видимых телец включения позволяли предположить, что белок находится в растворимом состоянии. Однако, электрофорез в ПААГ с в нередуцирующих условиях с последующим иммуноблоттингом выявлял разнообразие конформационных и мультимерных форм белка, образующихся, по-видимому, за счет многочисленных дисульфидных связей и состоящих из молекул рекомбинантного белка, о чем свидетельствуют результаты тех же экспериментов, но в редуцирующих условиях. Электрофоретическая подвижность соочищаемых на аффинной колонке бактериальных белков существенно не изменялась при изменении условий эксперимента.

Аффинно очищенный рекомбинантный белок также был использован в качестве антигена для получения антител к лигаед-связывающему домену РЛНП. Антитела, полученные к двум рекомбинантным белкам (слитому и практически индивидуальному), обладали сходной специфичностью и перекрестно взаимодействовали с обоими белками. Однако, они реагировали и с бактериальными белками, включая р-галакгозидазу и соочищаемые с рекомбинантным белком из

клеток па Iiis-Tag колонке бактериальные белки. После истощения против лизатов Л. coli антитела взаимодействовали только с белком, соответствующим лиганд-связывающему домену рецептора ЛШ1 (рис.3).

Полученные антитела выявляли в лизатах иммортализованных фибробластов человека одну и ту же преобладающую зону, близкую по молекулярной массе к полноразмериому РЛНГ1, Однако, антитела к слитому белку выявляли и более высокомолекулярные белки, возможно, белки родственные рецептору ЛНП - продукты генов мультигенного семейства гена РЛНП (рис.4).

Для определения функциональной активности рекомбинантного белка был использован метод лигандного блоттинга, а также иммунохимическое исследование связывания изучаемого белка с ЛНП на микроячеечных иммунологических планшетах. В экспериментах по связыванию рекомбинантного белка сорбированными на планшете Л1Ш были получены следующие результаты: 1. Аффинно очищенный рекомбинантный белок связывался с липопротеинами сильнее, чем контроль - аффинно очищенная ß-галактозидаза из сходного штамма-продуцента. 2. Связывание в обоих случаях усиливалось добавлением ЭДТА в среду инкубации. 3. Рекомбинантный домен, в отличие от природного РЛНП, связывал также модифицированные циклогександионом лилопрогеины.

Полученные результаты не соответствуют данным о свойствах природного рецептора ЛНП (Daniel et al., 1983; Catomeris et al., 1994), a именно, взаимодействие с лигандом полноразмерного РЛНП эукариот является кальций-зависимым и подавляется ЭДТА, хелатирующим ионы двухвалентных металлов. В основе этих противоречий лежит некорректная сборка рекомбинантного лиганд-связываюхцего домена РЛНП в клетках К coli, выраженная в многообразии конформационных и мультнмерных форм белка. Поэтому была предпринята попытка корректной сборки белка in vitro. С этой целью были проведены эксперименты по рефолдиигу аффинно очищенного рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП, зкспрессируемого в штамме рЕТЬЗЗ. Учитывая особенности структуры исследуемого рекомбинантного белка, были подобраны условия денатурации, восстановления и рефолдинга с использованием метода медленного диализа. Эффективность рефолдинга проверялась ранее разработанным и модифицированным для данных экспериментов иммунохимическим тестом на лиганд-связывакнцую активность в микроячеечных планшетах. Положительный результат был получен в экспериментах на рекомбинантном белке, аффинно очищенном из культуральной среды (рчс.5).

Проведенное исследование показало, что электрофоретически гомогенный рекомбинантный белок, выделенный из культуральной среды, после денатурации, восстановления и рефолдинга в присутствии ионов Ca2*, способен высоко эффективно

200-

14 м 1 2 3

кДа В

4 5 6

1 [(

№

1 2

Рис. 3. Взаимодействие антител к рекомбинантному лиганд-связывающему домену РЛНП в иммуноблоттинге:

A, Б - с белками ультразвуковых лизатов индуцированных клеток штаммов-продуцентов риЕХ2 и р№ХЬ45;

B, Г - с аффинно очищенными белками из клеток и культуральной среды штамма-продуцента рЕТХЗЗ. Электрофорез в 7,5% ПААГ с 0,1% БОБ.

А - антитела к рекомбинантному белку, слитому с р-галактозидазой; Б - антитела к рекомбинантному белку, слитому с Р-галактозидазой, истощенные против белков индуцированных клеток штамма-продуцента рЩХ2; 1,5- белок неиндуцированных клеток штамма-продуцента рШХЬ45;

2, 6 - белок индуцированных клеток

штамма-продуцента р11ЕХЬ45;

3, 4 - белок индуцированных клеток

штамма-продуцента риЕХ2.

В - антитела к индивидуальному рекомбинантному белку; Г - антитела к индивидуальному рекомбинантному белку, истощенные против белков клеточного лизата штамма ВЬ21рЬуз5;

1 - рекомбинантный белок из

клеток штамма рЕТЬЗЗ;

2 - рекомбинантный белок из

культуральной среды.

кДа -200

- 116 -92

-68

Рис. 4. Идентификация РЛНП в белках клеточных лиэатов культуры фибробластов HT 1080 с помощью антител к рекомбинагп ному лиганд-спязывающсму домену РЛНП методом иммуноблоттинга. Электрофорез в 7,5% ПААГ с 0,1% SDS.

1 - антитела к слитому белку;

2 - антитела к индивидуальному белку;

3 - окраска амидо-чериым (на общий

белок;

4 - маркеры молекулярного веса.

-и J

с1 ÏÎ I »

ML U

Рис. 5. Исследование электрофоретической подвижности рекомбинантного лигаид-связывающего домена РЛНП, аффинно очищенного из культуральной среды штамма-продуцента рЕТЬЗЗ, в процессе денатурации-рефолдинга. Электрофорез в 7,5% ПААГ с 0,1% БОБ; иммуноблотгинг.

1 - белок после рефолдинга в отсутствие

тиол-редуцирующих агентов;

2 — белок после рефолдинга в присутствии

тиол-редуцирующих агентов;

3 - исходный аффинно очищенный белок в

присутствии тиол-редуцирующих агентов;

4 - исходный аффинно очищенный белок в

отсутствие тиол-редуцирующих агентов.

взаимодействовать с ЛНП. Связывающая активность белка после рефолдиига возрастала в 15 раз, была кальций-зависимой и подавлялась в присутствии ЭДТА в 3,5 раза. В том случае, когда процесс денатурации, восстановления и рефолдиига проводился в отсутствие ионов Са2*, связывание возрастало в 1,8 раза, а подавлялось ЭДТА в 2,5 раза (рис.б). Таким образом, только после рефолдиига был получен функционально активный рекомбинантный белок со свойствами, характерными для природного полноразмерного рецептора ЛНП.

Рис. 6. Анализ ЛНП-связывающей активности аффинно очищенного рекомбинантного белка из культуральной среды штамма-продуцента рЕТЬЗЗ.

1 - до рефолдиига

2 - после рефолдиига в присутствии ионов Са2+

3 - после рефолдиига в отсутствие ионов Са2+

4 - аффинно очищенные белки из культуральной среды штамма В1.21р1,у88

Рекомбинантный диганд-связывающий домен РЛНП, выделенный из клеток штамма-продуцента, не был использован в этой серии экспериментов, так как содержал белки £. coli, активно связывающие ЛНП по результату лигандлого блоттинга. Для выяснения характера взаимодействия бактериальных белков с ЛНП человека, из клеток штамма Е. coli BL21pLysS, не содержащего рекомбинантную ДНК, кодирующую диганд-связывающий домен РЛНП, на His-Tag колонке была выделена фракция белков. При элсктрофоретическом исследовании эти аффинно очищенные белки формировали в SDS ПААГ две мажорные зоны 48 кДа и 54 кДа (рис.7). В лигандном блотгинге с ЛНП человека только 48 кДа белок давал положительный ответ. При сравнении связывающей активности в иммунохимическом тесте на микроячеечном планшете аффинно очищенных белков из клеток штамма-продуцента (рЕТЬЗЗ) и штамма-хозяина - BL21pLysS было обнаружено: 1) аффинно очищенные белки Е. coli в концентрации, сопоставимой с концентрацией примеси бактериальных

А492

□ связывание в присутствии ионов кальция В связывание в присутствии ЭДТА

кЛа Т-тГч 11 »1 и 1ГТГЧГ~Г Рис. 7. Электрофорстическое Да исследование белков

3 , ''М ,

исследование белков ультразвукового лизата клеток штамма ВЬ21р1ул8 в процессе 68- »•ч.вЁ1*™» ' 1 ' 1 { аффинной хроматографии на смоле

с иммобилизованными ионами М7*

| Электрофорез в 7,5% ПААГ с 0,1% " » 1 I ЯОЯ:

■» '';'ч ' '' ' " л^ I 1 - фракция белков, не связавшихся 24- В^Ш^4 " ' '.*" ' на колонке;

1'"' '• 2 - 6 - фракции белков,

' неспецифически связавшихся на

1 1 3 4 5 67 8910 колонке, полученные при

последовательном промьгоани связывающим и промывающим буферами; 7 - Ю - фракции белков, связавшихся на колонке, полученные при промывании элюирующим буфером.

, А 492 1200

1 2 3

Й связывание з присутствии ионов кальция Всвязываню в присутствии ЭДГА

Рис. 8. Сравнительный анализ ЛНП-связывающей активности аффинно очищенного рекомбинантного белка из клеток штамма-продуцента рЕТЬЗЗ и аффинно очищенных белков из клеток штамма В1Л1рЬу8&

1 - белок из клеток штамма-

продуцеита рЕТХЗЗ;

2 - белок из клеток штамма

Ви1р1.)к8 (0,1 мкг);

3 - белок из клеток штамма

ВЬ21рЬу53(1 мкг).

белков в пробах аффинно очищенного рекомбинантного белка, связывали ЛНП так же эффективно, как и рекомбинангный белок; 2) в равных концентрациях белки-К-coli связывали ЛНП приблизительно в 5 раз эффективнее чем рекомбинангный белок; 3) взаимодействие аффинно очищенных бактериальных белков с ЛНП носило кальций-зависимый характер, так как подавлялось в присутствии ЭДТА (рис.8). Несомненно, что такое активное взаимодействие с Л1Ш соочищаемых бактериальных белков может экранировать активность рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП, аффинно очищенного из клеток. Все попытки очистить внутриклеточный рекомбинангный белок от примеси бактериального 48 кДа- белка были неэффективны.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В двух зкспрессионных векторах кишечной палочки был клонирован фрагмент кДНК РЛНП, кодирующий его N-концевой лиганд-связывающий домен и часть второго домена, то есть весь сегмент, необходимый, по данным мутационного анализа, для связывания ЛНП к частиц, содержащих апоЕ.

Первая конструкция позволила нам получить этот домен в составе белка, слитого с бактериальной ß-галактозидазой. Этот белок легко отделялся от других белков кишечной палочки при денатурирующем электрофорезе в ПААГ с SDS и был использован для иммунизации кроликов. Данная система характеризуется высокой продукцией рекомбинантного белка, экономичностью температурной индукции и простотой получения рекомбинантного белка через нерастворимые тельца включения. Вместе с тем рекомбинантный белок не мог быть охарактеризован функционально, так как он откладывался в составе телец включения в нерастворимом состоянии и для всех последующих экспериментов должен был быть подвергнут солюбилизадии и дополнительной очистке от многочисленных примесей. В этой связи следует отмстить, что большой проблемой в получении корректно собранного белка лиганд-связывающего домена является корректное формирование специфических дисульфидных связей между многочисленными цистеиновыми остатками. Многие данные о мутациях, либо затрагивающих цистеиновые остатки, либо нарушающих расстояние между ними в полипептидной цепи РЛНП, указывают на то, что при отсутствии нативной структуры дисульфидных мостиков белок оказывается нефункциональным (Daniel et al., 1983). В связи с восстановительными свойствами цитоплазмы К coli в ней нет условий для образования дисульфидных связей, Кроме того, правильная укладка белка при наличии слитой с ним ß-галактозидазы представлялась малореальной.

Поэтому мы также получили лиганд-связывающий домен РЛНП в виде практически индивидуального растворимого белка в беспротсазном штамме /-,'. coli BL21(DE3), Рекомбинангный белок, содержащий на N-конце бактериальную лидерную

последовательность, направлялся в периплазму и частично секретировался в культуральную среду. Наличие на С-конце этого белка гексагистидиновой последовательности позволило очистить его с помощью одноступенчатой аффинной хроматографии на смоле с фиксированными ионами никеля (Шя-Вшс!) Очищенный белок характеризовался многообразием конформационных и мультимерных форм, образованных одним типом молекул за счет межмолекулярных дисульфидных связей. Очищенный из клеточных лизатов рекомбинантный белок содержал 10 -15% примесей бактериальных белков, в то время как очищенный из культуральной среды был электрофорегически гомогенным. Аффинно очищенный белок из клеток и из культуральной среды реагировал с антителами к слитому белку и с моноклональными антителами 1цС-С7 к первому цистеин-богатому повтору РЛНП, что подтверждает природу полученного белка.

Рекомбинантный белок обладал слабо выраженной лиганд-связывающей способностью, которая увеличивалась после денатурации-рефолдинга белка, проведенного на электрофорегически чистом белке из культуральной среды. При медленных способах рефслдинга и только в присутствии хлорида кальция в буфере рефолдинга, был получен продукт, который специфически связывал липопротеины на иммунологических микроячеечных планшетах, а именно, после рефолдинга рекомбинантный белок связывал ЛНП в присутствии ионов кальция примерно в 3,5 раза эффективнее, чем в присутствии ЭДТА. Таким образом, был получен рекомбинантный белок с такой же специфичностью связывания ЛНП человека, как у природного РЛНП клеток человека. В том случае, когда рефолдинг проводился в отсутствие ионов кальция, специфическая кальций-зависимая лиганд-связывающая активность рекомбинантного белка незначительно изменялась по сравнению с исходным белкой до рефолдинга. Тем самым было продемонстрировано, что присутствие ионов кальция необходимо для воспроизведения пространственной укладки, специфичной для природного белка. Присутствие в пробах афинноочищенного внутриклеточного рекомбинантного белка примесей бактериального 48 кДа - белка, активно связывающего ЛНП, не позволило использовать его для получения функционально активного лиганд-связывающего домена методом рефолдинга. Обнаруженный факт активного взаимодействия бактериального белка с ЛНП, безусловно, представляет существенный интерес и предполагает дополнительное исследование.

Позитивным результатом проделанной работы, несомненно, является получение высокоаффинных антител, которые выявляют РЛНП в лизатах клеток человека и могут быть использованы даже с большим успехом, чем коммерческие моноклональные антитела ^0-С7.

В последнее время предприняты попытки клонировать отдельные цистеин-богатые повторы лиганд-связывающего домена РЛНП в кишечной палочке (Daly et al., 1995 а, б; Blacklow, Kim, 1996) с целью установления структуры белка. Отдельные цистеик-богатые повторы после рефолдинга давали гомогенные продукты, что сделало возможным изучение их структуры (Fass et al., 1997). Однако, вряд ли возможна экстраполяция полученных данных об отдельных повторах на домен в целом, К тому же, эти опыты не смогут привести к получению функционально активного продукта. В этой связи следует отметить работу группы профессора Атти (Dirlam et al., 1998), получившей функционально активный лиганд-связывающий домен PJ1HI1 в системе бакуловирус-клеггки насекомого. Данная система обладает полным набором эукариотических шаперонов и системами N- и О-гликозилирования, по крайней мере первое из которых происходит по лиганд-связывающему домену РЛНП. Несмотря на то, что ранними работами было показано, что отсутствие N-связанных Сахаров приводит лишь к незначительному снижению удельной активности белка по отношению к лиганду (Filipovic, 1989), а O-саязанные сахара влияют главным образом лишь на стабильность белка (Kozarsky et al., 1988), возможно, что роль последних недооценивалась.

Полученный рекомбинактный лиганд-связыаающий домен РЛНП отличается по некоторым характеристикам от природного белка, тем не менее прокариотическая система не должна быть исключена из круга внимания, так как только она сможет обеспечить высокий выход этого рекомбинашного белка, достаточный для его многоцелевого использования. Например, иммобилизованный функциональный лиганд-связывающий домен рецептора ЛНП может быть использован для измерения уровня субфракций ЛНП и аполипопротеинов В и Е в клинике, для оценки количества этих аполипопротеинов, способных метаболизироваться в организме с участием рецептора ЛНП, для определения у больных мутационных дефектов в этих апопротеинах. Рекомбшшггный лиганд-связывающий домен может применяться как специфический антагонист природного РЛНП плазматических мембран в экспериментах, а также как препарат для элиминации ЛНП из крови больных. Несомненно, что для использования в этих целях рехомбинантного лиганд-связывающего домена, выделенного из Е. coli, необходимы дополнительные исследования.

иьшоды.

1. На основе экспрессионных векторов р1)ЕХ2 и рЕТ22Ь(+) сконструированы рекомбинантные плазииды, направляющие высокоэффективный синтез рекомбинантного лкганд-связывающего домена РЛНП человека в клетках Е. coli в

виде слитого с ß-галактозидазой белка - pUEXL45 и индивидуального белка -pETL33.

2. Рекомбинантный лиганд-связывающий домен РЛНП выделен в виде индивидуального электрофоретически гомогенного белка.

3. Получены антитела к двум формам рекомбинантного белка (слитого с бактериальной ß-галактозидазой и индивидуального), дающие иммунологическую реакцию с природным РЛШ1 плазматических мембран клеток человека.

4. Пространственная укладка рекомбинантного домена РЛНП в клетках Е. coli отличается от конформации природного белка.

5. Получен функционально активный индивидуальный белок рекомбинантного домена РЛНП путем его денатурации-рефолдинга методом медленного диализа против буфера, содержащего ионы кальция..

6. В клетках Е. coli впервые обнаружен белок с молекулярной массой 48 кДа, обладающий эффективной кальций-зависимой ЛНП-связывающей активностью.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ НО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Мандельштам MIO., Новикова М.А., Рунова О.Л. Клонирование фрагмента кДНК, кодирующего лиганд-связывающий домен рецептора липопротеинов низкой плотности человека, в экспресснонных ллазмидных векторах кишечной палочки // Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций. Материалы конференции молодых физиологов и биохимиков России. Санкт-Петербург, 1995, -с. 122.

2. Рунова О.Л., Мандельштам М.Ю., Голубков В.И., Гайцхоки B.C. Использование бактериальной экспрессионной системы для синтеза лиганд-связывающего домена рецептора липопротеинов низкой плотности человека // Тез. докл. симпозиума, посвященного 110-летию со дня рождения академика Н.Н.Аничкова, 21-23 ноября 1995 г.,Санкт-Петербург-Санкт-Петербург, 1995, - с.89,

3. Mandelshtam M.Ju., Runova O.L., Golubkov V.l., Gaitskhoki V S.. Characterization of a recombinant human low density lipoprotein receptor ligand-binding domain from Escherichia coli // 66th European Atherosclerosis Society Congress,Florence, Italy, July 1317, 1996, - Abstract book, - p.73.

4. Голубков В.И., Мандельштам М.Ю., Рунова О.Л., Гайцхоки B.C. Получение и характеристика рекомбинантного лиганд-связывающего домена рецептора липопротеинов низкой плотности человека // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, Т. 123, N 2,1997,-с. 184- 187.

5. Рунова О.Л., Мандельштам М.Ю., Голубков В.И., Суконина B E., Денисенко А.Д., Гайцхоки B.C. Экспрессия фрагмента кДНК, кодирующего лиганд-связывающий

домен рецептора липопротеинов низкой плотности человека, в клетках Escherichia coli. //Биохимия, 1997, Т.62, N 8, - с. 1037 - 1044.

6. Мандельштам М.Ю., Рунова О.Л., Голубков В.И., Суконина В.Е., Денисенко А.Д., Гайцхоки B.C. Экспрессия кДНК лиганд-связывающего домена рецептора липопротеинов низкой плотности человека в двух штаммах кишечной палочки. В: Материалы Второго Съезда Биохимического общества Российской Академии Наук, Москва, 19-23 мая 1997, Тезисы стендовых сообщений, Часть 1, Пущино, 1997, -с. 151 - 152.

7. Мандельштам М.Ю., Рунова О.Л., Силина И.А., Новикова М.А., Суконина U.E. Продукция генно-инженерного лиганд-связывающего домена рецептора

. липопротеинов низкой плотности человека в кишечной палочке. - Мат. 1-ой медико-биологической конференции молодых ученых Санкт-Петербурга, 17-19 ноября 1997 года, Санкт-Петербург, 1997, - с.48.

8. Mandelshtam, M.Ju., Runova, O.L., Golubkov, V.l., Sukonina V.E., IJcniscnko A.D., Gaitskhoki, V.S. Human low-density lipoprotein receptor iigand-binding domain expressed in Escherichia coli forms compact, but misfolded globules. In; International Symposium "Protein Structure, Stability and Folding. Fundamental and Medical Aspects ", Moscow, Russia, June 22-26, 1998, Book of Program and Abstracts, ONT1 PNC RAN, Puschino, 1998,-p, 188.

9. Мандельштам М.Ю., Рунова О.Л., Суконина В.Е. Экспрессия кДНК лиганд-связывающего домена рецептора липопрпотеинов низкой плотности человека в ккшечнои палочке. В: Материалы конференции молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины", посвященной 240-летию ММА им. И.М.Сеченова, Москва, 1998, - с.39.

10. Мандельштам М.Ю., Голубков В.И., Рунова О.Л., Захарова Ф.М., Шур Ю.А., Суконина В.Е., Денисенко А.Д., Гайцхоки B.C. Молекулярно-генетические подходы к изучению структуры и функции лиганд-связывающего домена рецептора липопротеинов низкой плотности человека. В: Международная конференция "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", 21-25 сентября 1998 г., Пущино, Тезисы докладов, Пущино,1998, - с,150 - 152.

Работа поддержана грантами РФФИ (№94-04-12266-а и №97-04-48887), программ "Приоритетные направления генетики" (№07/96) и "Национальные приоритеты в медицине и здравоохранении" ("Атеросклероз", №584), грантом Совета поддержки "Ведущие научные школы России" (Ла96-15-97742).

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рунова, Ольга Леонидовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика рецептора ЛНП.

1.2. Мультидоменная структура рецептора ЛНП.

1.3. Структурно-функциональная организация лиганд-связывающего домена рецептора ЛНП.

1.4. Структура гена РЛНП.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Штаммы Е. coli, питательные среды, условия роста.

2.2. Плазмидные векторы.

2.3. Выделение плазмидной ДНК.

2.4. Трансформация E.coli.

2.5. Гибридизация.

2.6. Очистка рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП, слитого с ß-галактозидазой.

2.7. рЕТ система.

2.7.1. Индукция DE3 лизогенов.

2.7.2. Получение клеточного экстракта и белков культуральной среды для хроматографии на смоле His-Bind.

2.7.3. Подготовка смолы His-Bind и аффинная хроматография.

2.8. Культивирование фибробластов человека линии НТ-1080 и получение клеточных лизатов.

2.9. Получение антител к рекомбинантному лиганд-связывающему домену

РЛН человека.

2.10. Денатурация и рефолдинг рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП.

2.11. Оценка лиганд-связывающей активности рекомбинантного белка в иммунохимическом тесте на микроячеечных планшетах.

2.12. Визуализация РЛНП в белках клеточных лизатов и рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП (с помощью и ммуноблоттинга и лигандного блоттинга).

2.12.1. Иммуноблоттинг.

2.12.2. Лигандный блоттинг.

2.13. Аналитические методы.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Клонирование фрагмента кДНК рецептора ЛНП в векторах серии pUEX.

3.2. Выделение рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП в виде слитого белка.

3.3. Клонирование фрагмента кДНК рецептора ЛНП в векторах серии рЕТ.

3.4. Выделение лиганд-связывающего домена рецептора ЛНП в виде рекомбинантного индивидуального белка.

3.5. Характеристика антител к рекомбинантному лиганд-связывающему домену рецептора ЛНП.

3.6. Анализ функциональной активности рекомбинантного лиганд-связывающего домена рецептора ЛНП.

3.7. Исследование взаимодействия белков Escherichia coli с ЛНП человека.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. 93 ВЫВОДЫ. 97 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клонирование фрагмента кДНК, кодирующего лиганд-связывающий домен рецептора липопротеинов низкой плотности человека, в экспрессионных плазмидных векторах Escherichia coli, и анализ продуктов экспрессии"

Актуальность проблемы.

Изучение структурно-функциональных отношений в мультидоменных белках клеточной поверхности, функционирующих как рецепторы специфических белковых или иных лигандов и участвующих либо в переносе веществ между клетками и внеклеточными пространствами, либо в передаче сигналов от внеклеточных лигандов, является одной из центральных проблем современной молекулярной медицины. Среди рецепторов, интернализирующих связанные лиганды, наиболее изучен рецептор липопротеинов низкой плотности (РЛНП). Прогресс в исследовании РЛНП связан, прежде всего, с классическими работами Голдштейна и Брауна (Brown, Goldstein, 1976, 1986; Goldstein, Brown, 1989), которые впервые описали РЛНП и показали, что одно из наиболее распространенных аутосомно-доминантных заболеваний человека - семейная гиперхолестеринемия обусловлена мутациями в гене РЛНП с гетерогенными биохимическими проявлениями (количественный дефицит РЛНП, нарушение его лиганд-связывающей активности, блоки интернализации комплекса РЛНП-лиганд и реутилизации РЛНП с его возвращением на поверхность клетки). В дальнейшем эти авторы и их сотрудники (Yamamoto et al., 1984) осуществили клонирование кДНК, кодирующей РЛНП, определили ее нуклеотидную последовательность и исследовали экзонно-интронную структуру гена РЛНП. На основании этих данных в разных странах, в том числе, в России, проведено изучение нарушений структуры мутантных аллелей гена РЛНП у больных с семейной гиперхолестеринемией (Мандельштам и др., 1995а, б, 1998; Chakir et al., 1998а, б; Mandelshtam et al., 1998), которое продемонстрировало множественность и гетерогенность этих мутаций (к настоящему времени описано более 300 мутаций гена РЛНП (Hobbs et al., 1992; Varret et al., 1997), в России - 8 мутаций). В то же время все представления о пространственной и мультидоменной структуре РЛНП основаны лишь на предсказаниях, базирующихся на сведениях об аминокислотной последовательности этого белка, и лишь в последние годы появились сообщения о прямом анализе трехмерных структур относительно коротких фрагментов РЛНП (цистеин-богатых повторов внеклеточного домена), изолированных в виде рекомбинантных белков - продуктов экспрессии соответствующих плазмид в клетках Escherichia coli (Bieri et al., 1995; Daly et al., 1995a,6; Blacklow, Kim, 1996; Fass et al., 1997). В связи с этим мы предприняли попытку получить рекомбинантный белок со структурой и активностью полноразмерного лиганд-связывающего домена РЛНП человека. Актуальность этой темы исследования обусловлена следующими соображениями: 1) для оценки общей функциональной активности РЛНП необходимы сведения о трехмерной структуре полноразмерного лиганд-связывающего домена; 2) наличие индивидуального белка -лиганд-связывающего домена РЛНП имеет существенное значение для выяснения функциональных последствий мутационных аминокислотных замен и делеций в этом домене; 3) на основе рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП может быть создана простая бесклеточная тест-система для изучения структурных аномалий ЛНП-частиц и их белковых компонентов, нарушающих их связывание с РЛНП; 4) лиганд-связывающий домен РЛНП в перспективе может найти применение в качестве специфического твердофазного сорбента для элиминации ЛНП из крови больных с различными формами гиперхолестеринемии. Наряду с этими конкретными направлениями использования лиганд-связывающего домена РЛНП в научных исследованиях и в практической медицине, его получение в виде рекомбинантного белка должно способствовать решению общей проблемы так называемых растворимых рецепторов, представляющих собой внеклеточные (как правило, N-концевые) фрагменты мембранных рецепторов и функционирующих как антагонисты мембранных рецепторов, которые конкурируют с ними за высокоаффинное связывание лигандов (Tomida et al., 1994; Han et al., 1994). Механизмы образования таких растворимых рецепторов in vivo могут быть разнообразными (ограниченный протеолиз со "слущиванием" внеклеточных фрагментов рецептора в среду, инициация транскрипции с альтернативных промоторов, альтернативный сплайсинг пре-мРНК, сдвиги рамки считывания с ранней терминацией, экспрессия неаллельных генов, кодирующих растворимые рецепторы и др.). Рекомбинантные лиганд-связывающие домены различных поверхностных рецепторов используются для анализа структурной организации комплексов рецептор-лиганд. В отдельных работах показано, что в среде культивирования клеток и в биологических жидкостях человека содержится белок, соответствующий по размерам и по последовательности аминокислот лиганд-связывающему домену РЛНП и обладающий антивирусной активностью (Fischer et al., 1993). В связи с этими соображениями получение в препаративных количествах рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП человека должно способствовать как дальнейшему исследованию природного растворимого РЛНП, так и созданию высокоспецифических способов модулирования активности мембранного РЛНП в культурах клеток и в многоклеточном организме.

Цели и задачи исследования.

Основной целью работы было конструирование векторных плазмид, кодирующих лиганд-связывающий домен РЛНП и изучение его иммунохимической специфичности и функциональной активности. Для достижения этой цели были поставлены следующие этапные задачи исследования:

1. Конструирование экспрессионных плазмид, кодирующих лиганд-связывающий домен РЛНП, на основе векторов серий pUEX и рЕТ и плазмиды pLDLR-З, содержащей полноразмерную кДНК РЛНП.

2. Оптимизация экспрессии этих рекомбинантных ДНК в бактериальных клетках.

3. Разработка процедур выделения рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП в виде гомогенного белка.

4. Получение антител к рекомбинантным белкам и изучение их специфичности и перекрестных взаимодействий с РЛНП клеток человека.

5. Оптимизация процедур восстановления-денатурации и рефолдинга для получения функционально активного рекомбинантного белка, обладающего ЛНП-связывающей активностью.

Научная новизна работы.

Впервые выделен и охарактеризован полноразмерный лиганд-связывающий домен РЛНП человека - продукт экспрессии соответствующего фрагмента кДНК РЛНП в плазмидных векторах Е. coli. Разработаны препаративные методы выделения этого белка в гомогенном виде. В результате процедур восстановления-денатурации и последующего рефолдинга рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП достигнуто реконструирование его специфической кальций-зависимой ЛНП-связывающей активности.

Практическая значимость работы.

Полученные антитела к рекомбинантному лиганд-связывающему домену РЛНП перекрестно реагируют с природным РЛНП клеток человека и могут использоваться для его иммунохимической детекции в реакции иммуноблоттинга и количественного определения. Лиганд-связывающий домен РЛНП, обладающий специфической ЛНП-связывающей активностью, в перспективе может найти применение для создания тест-системы определения аномальных ЛНП в крови человека и для специфической элиминации ЛНП из крови больных с различными формами гиперхолестеринемии. 9

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Сконструированы плазмидные экспрессионные векторы, направляющие высокоэффективный синтез рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП человека в клетках Escherichia coli.

2. Рекомбинантный лиганд-связывающий домен РЛНП препаративно выделен в виде электрофоретически гомогенного белка.

3. Получены антитела к двум формам этого рекомбинантного белка (слитого с ß-галактозидазой и индивидуального), дающие перекрестную иммунологическую реакцию с природным РЛНП мембран клеток человека.

4. Для получения функционального активного рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП, синтезируемого в клетках Escherichia coli, необходимо его восстановление, денатурация и последующий рефолдинг путем медленного диализа против кальций-содержащих буферных растворов. При этом происходит реконструкция специфической кальций-зависимой ЛНП-связывающей активности, первоначально не определяемой для исходного рекомбинантного белка.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Рунова, Ольга Леонидовна

ВЫВОДЫ.

1. На основе экспрессионных векторов pUEX2 и рЕТ22Ь(+) сконструированы рекомбинантные плазмиды, направляющие высокоэффективный синтез рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП человека в клетках Е. coli в виде слитого с ß-галактозидазой белка - pUEXL45 и индивидуального белка - рЕТЬЗЗ.

2. Рекомбинантный лиганд-связывающий домен РЛНП выделен в виде индивидуального электрофоретически гомогенного белка.

3. Получены антитела к двум формам рекомбинантного белка (слитого с бактериальной ß-галактозидазой и индивидуального), дающие иммунологическую реакцию с природным РЛНП плазматических мембран клеток человека.

4. Пространственная укладка рекомбинантного домена РЛНП в клетках Е. coli отличается от конформации природного белка.

5. Получен функционально активный индивидуальный белок рекомбинантного домена РЛНП путем его денатурации-рефолдинга методом медленного диализа против буфера, содержащего ионы кальция.

6. В клетках Е. coli впервые обнаружен белок с молекулярной массой 48 кДа, обладающий эффективной кальций-зависимой ЛНП-связывающей активностью.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рунова, Ольга Леонидовна, Санкт-Петербург

1. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Липиды, липопротеиды и атеросклероз. СПб: Питер Пресс, 1995.-304 с.

2. Мандельштам М,Ю., Голубков В.И., Шур Ю.А., Липовецкий Б.М., Гайцхоки B.C. Новая мутация 347 delGCC в гене рецептора липопротеинов низкой плотности человека. // Биоорганическая химия. 1998. - Т. 24, №10. - с. 797 - 800.

3. Мандельштам М,Ю., Липовецкий Б.М., Шварцман А.Л., Гайцхоки B.C. Мультиэкзонная делеция в гене рецептора липопротеинов низкой плотности человека, как причина семейной гиперхолестеринемии. // Генетика. 1995а. - Т. 31, №2. - с. 259 - 263.

4. Мандельштам М,Ю., Липовецкий Б.М., Шварцман А.Л., Гайцхоки B.C. Молекулярная гетерогенность семейной гиперхолестеринемии в популяции жителей Санкт-Петербурга. // Генетика. 19956. - Т. 31, № 4. - с. 521 - 527.

5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Пер. с англ., М.: Мир, 1984. - 480 с.

6. Харбоу Н., Ингильд А. Иммунизация, выделение иммуноглобулинов, определение титра антител. В кн.: Руководство по количественному иммуноэлектрофорезу, VI. Получение антисывороток (ред. Н.Аксельсен, И.Крелль, Б.Вееке).М.: Мир, 1977. - с.200 - 205.

7. Basu S.K., Goldstein J.L., Brown M.S. Characterization of the low density lipoprotein receptor in membranes prepared from humann fibroblasts // J. Biol. Chem. 1978. - vol. 253. - p. 3852 -3856.

8. Beisiegel U., Schneider W.J., Brown M.S., Goldstein J.L. Immunoblot analysis of low density lipoprotein receptors in fibroblasts from subjects with familial hypercholesterolemia // J. Biol. Chem. 1982. - vol.257, N21. -p.13150- 13156.

9. Bieri S., Djordjevic J.T., Daly N.L. et al. Disulfide bridges of a cystein-rich repeat of the LDL receptor ligand-binding domain // Biochemistry. 1995. - vol.34. - p. 13059 - 13065.

10. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant Plasmid DNA // Nucl. Acid Res. 1979. - vol.7, N6. - p.l513 - 1524.

11. Blacklow S.C., Kim P.S. Protein folding and calcium binding defects arising from familial hypercholesterolemia mutations of the LDL receptor // Nature Structural biology. 1996. -vol.3, N9. - p.758 - 762.

12. Bressan G.M., Stanley K.K. pUEX, a bacterial expression vector related to pEX with universal host specificity // Nucl. Acids Res. 1987. - vol.15, N23. - p.10056.

13. Brown M.S., Anderson R.G.W., Goldstein J.L. Recycling receptors: the round-trip itinerary of migrant membrane proteins // Cell. 1983. - vol. 32. - p. 663 - 667.

14. Brown M.S., Goldstein J.L. Receptor-mediated control of cholesterol metabolism // Science. -1976. -vol.191, -p.150- 154.

15. Brown M.S., Goldstein J.L. How LDL receptors influence cholesterol and atherosclerosis // Sci. Amer. 1984. - vol. 251. - p. 58 - 66.

16. Brown M.S., Goldstein J.L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis // Science. 1986. - vol.232, N4746. - p.34 - 47.

17. Brown M.S., Herz J., Goldstein J.L. Calcium cages, acid baths and recycling receptors // Nature. 1997. - vol.388. - p.629, 630.

18. Catomeris P., Thibert R. J., Draisey T.F. Low-density lipoprotein binding assay using the calf adrenocortical low-density lipoprotein receptor. // Clinical Biochemistry. — 1994. vol. 27, N4. -p. 249-257.

19. Chen W.-J., Goldstein J.L., Brown M.S. NPXY, a sequence often found in cytoplasmic tails is required for coated pitmediated internalization of the low density lipoprotein receptor // J. Biol. Chem. 1990. - vol.265, N6. - p.3116 - 3123.

20. Cummings R.D., Kornfeld S., Schneider WJ. et al. Biosynthesis of the N- and O-linked oligosaccharides of the low density lipoprotein receptor // J. Biol. Chem. 1983. - vol.258. -p.15261 - 15273.

21. Dagert V., Ehrlich S.D. Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells // Gene. 1979. - vol.6, N1. - p.23 - 28.

22. Daly N.L., Djordjevic J.T., Kroon P.A., Smith R. Three-dimensional structure of the second cysteine-rich repeat from the human low-density lipoprotein receptor // Biochemistry. 1995a. -vol.34.-p. 14474- 14481.

23. Daly N.L., Scanion M.J., Djordjevic J.T. et al. Three-dimensional structure of a cysteine-rich repeat from the low-density lipoprotein receptor // Procced. Natl. Acad. Sei. USA 19956. -vol.92. - p.6334 - 6338.

24. Daniel T.O., Schneider W.J., Goldstein J.L., Brown M.S. Visualization of lipoprotein receptors by ligand blotting // J. Biol. Chem. 1983. - vol.258, N7. - p.4606 - 4611.

25. Davis C.G., van Driel I.R., Russell D.W. et al. The low density lipoprotein receptor. Identification of aminoacids in cytoplasmic domain required for rapid endocytosis // J. Biol. Chem. 1987a. - vol.262, N9. - p.4075 - 4082.

26. Davis C.G., Elhammer A.,Russell D.W. et al. Deletion of clustered O-linked carbohydrates does not impair function of low density lipoprotein receptor in transfected fibroblasts // J. Biol. Chem. 1986a. - vol.261, N6. - p.2828 - 2838.

27. Davis C.G., Goldstein J.L., Suedhof T.C. et al. Acid-dependent ligand dissociation and recycling of LDL receptor mediated by growth factor homology region // Nature. 19876. -vol.326, N6115. - p.760 - 765.

28. Davis C.G., Lehrman M.A., Russell D.W. et al. The J.D. mutation in familial hypercholesterolemia: aminoacid substitution in cytoplasmic domain impedes internalization of LDL receptors // Cell. 19866. - vol.45, N1. - p. 15 - 24.

29. Esser V., Limbird L.E., Brown M.S. t al. Mutational analysis of the ligand-binding domain of the low density lipoprotein receptor // J. Biol. Chem. 1988. - vol.263, N26. - p.13282 - 13290.

30. Fass D., Blacklow S.C., Kim P.S., Berger J.M. Molecular basis of familial hypercholesterolemia from structure of LDL receptor module // Nature. 1997. - vol.388. -p.691 -693.

31. Filipovic I. Effect of inhibiting N-glycosylation on the stability and binding activity of the low density lipoprotein receptor // J. Biol. Chem. 1989. - vol.264, N15. - p.8815 - 8820.

32. Fisher D.G., Tal N., Novick D., Barak S., Rubinstein M. An antiviral soluble form of the LDL receptor inducedby interferon. // Science. 1993. - vol. 262, N5131. - p. 250 - 253.

33. Gilbert W. Genes-in-piece revisited // Science. 1985. - vol. 228, N4701. - p. 823 - 824.

34. Goldstein J.L., Anderson R.G.W., Brown M.S. Coated pits, coated vesicles and receptor-mediated endocytosis // Nature. 1979. - vol. 279. - p. 679 - 685.

35. Goldstein J.L., Basu S.K., Brown M.S. Receptor-mediated endocytosis of LDL in cultured cells // Meth. Enzymol. 1983. - vol. 98. - p. 241 - 260.

36. Goldstein J.L., Brown M.S. The low-density lipoprotein pathway and its relation to atherosclerosis // Ann. Rev. Biochem. 1977. - vol. 46. - p. 897 - 930.

37. Goldstein J.L., Brown M.S. The LDL-receptor and the regulation of cellular cholesterol metabolism // J. Cell Biochem. 1985. - suppl., N3. - p.131 -137.

38. Goldstein J.L., Brown M.S. Familial hypercholesterolemia // In: The Metabolic Basis of Inherited Deseases / Eds. C.R.Scriver, A.L.Beaudet, W.S.Sly, D.Valle. N.Y., McGraw Hill, 6th Edn.- 1989.-p.1215 1250.

39. Grunstein M., Hogness D. Colony hybridization: a method for the isolation of cloned DNAs, that contain a specific gene // Proceed. Natl. Acad. Sei. USA 1975. - vol.72, N10. - p.3961 -3965.

40. Han J., Mathison J.C., Ulevich R. J., Tobias P. Lipopolysacharide (LPS) binding protein, truncated at Ile-197, binds LPS but does not transfer LPS to CD14. // J. Biol. Chem. 1994. -vol.269, N 11. -p. 8172-8175.

41. Herz J., Willnow T.E. Functions of the LDL receptor gene family // Ann. N.Y. Acad. Sei. -1994.-vol.737.-p.14-19.

42. Hobbs H.H., Brown M.S., Goldstein J.L. Molecular Genetics of the LDL Receptor Gene in Familial Hypercholesterolemia // Human Mutation. 1992. - vol.1. - p.445-466.

43. Hobbs H.H., Lehrman M.A., Yamamoto T., Russell D.W. Polymorphism and evolution of Alu sequences in the human low density lipoprotein receptor gene // Proceed. Natl. Acad. Sei. USA 1985. - vol.82, N22. - p.7651 - 7655.

44. Hobbs H.H., Russell D.W., Brown M.S., Goldstein J.L. The LDL receptor locus in familial hypercholesterolemia: mutational analysis of a membrane protein // Annu. Rev. Genet. 1990. -vol.24.-p. 133 - 170.

45. Kingsley D.M., Kozarskey K.F., Hobbie L., Krieger M. Reversible defects in O-linked glycosylation and LDL receptor expression in a UDP-Gal/UDP-GalNAc 4-epimerase deficient mutant // Cell. 1986. - vol.44. - p.749 - 759.

46. Knott T.J., Rail S.C., Innerarity T.L. et al. Human apolipoprotein B: structure of carboxylterminal domains, sites of gene expression, and chromosomal localization // Science. -1985.-vol.230.-p.37-43.

47. Kozarsky K.F., Kingsley D.M., Krieger M. Use of a mutant cell line to study the kinetics and function of O-linked glycosylation of low density lipoprotein receptors // Proceed. Natl. Acad. Sei. USA. 1988. - vol.85, N12. - p.4535 - 4539.

48. Kyhse-Anderson J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from Polyacrylamide to nitrocellulose. // J. Biochem. And Biophys. Meth. 1984. - vol. 10. - p. 203 - 209.

49. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. - vol.227, N5259. - p.680 - 685.

50. Lehrman M.A., Goldstein J.L., Russell D.W., Brown M.S. Duplication of seven exones in LDL receptor gene caused by Alu-Alu recombination in a subject with familial hypercholesterolemia // Cell. 1987a. - vol.48, N5. - p.827 - 835.

51. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. -1951. vol.193, N1. - p.265 - 275.

52. Maeda Y., Koga H., Yamada H. et al. Effective renaturation of reduced lysozyme by gentle removal of urea // Protein Engng.- 1995. vol.8, N2. - p.201 - 205.

53. Maeda Y., Ueda T., Imoto T. Effective renaturation of denatured and reduced immunoglobulin G in vitro without assistance of chaperone // Protein Engng. 1996. - vol.9, N1. - p.95 - 100.

54. Mahley R.W. Apolipoprotein E: cholesterol transport protein with expanding role in cell biology // Science. 1988. - vol. 240. - p. 622 - 630.

55. Mahley R.W., Innerarity T.L. Lipoprotein receptors and cholesterol homeostasis // Biochim. Biophys. Acta. 1983. - vol.737. - p. 197 - 222.

56. Mahley R.W., Innerarity T.L., Rail S.C., Weisgraber K.H. Plasma lipoproteins: apolipoprotein structure and function // J. Lipid Res. 1984. - vol. 25. - p. 1277 - 1294.

57. Mandel M., Higa A. Calcium deendent bacteriophage DNA infection. // J. Mol. Biol. 1970. -vol. 53.-p. 154.

58. PCR technology. Principles and applications for DNA amplification. Ed. Erlich H. A. Stocktons New York and Mc Milan London, 1989. p. 7 - 16.73. pET system manual 3rd edition. Novagen, 1993. Medison, USA.

59. Promega protocols and applications guide. Promega, 1990. p.40,41. - Medison, USA.

60. Reed K.C., Mann D.A. Rapid transfer of DNA from agarose gels to nylon membranes // Nucl. Acid Res. 1985. - vol.13, N20. - p.7207 - 7221.

61. Russell D.W., Brown M.S., Goldstein J.L. Different combinations of cysteine-rich repeats mediate binding of low density lipoprotein receptor to two different proteins // J. Biol. Chem. -1989. vol.264, N36. - p.21682 - 21688.

62. Russell D.W., Schneider W.J., Yamamoto T. et al. Domain map of the LDL receptor sequence homology with the epidermal growth factor precursor // Cell. 1984. - vol.37. - p.577 - 585.

63. Russell D.W., Yamamoto T., Schneider W.J. et al. cDNA cloning of the bovine low density lipoprotein receptor: feed-back regulation of a receptor mRNA // Proceed. Natl. Acad. Sei. USA 1983. - vol.80, N24. - p.7501 - 7505.

64. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. - c.

65. Schneider W.J. The low density lipoprotein receptor // Biochim. Biophys. Acta. 1989. -vol.988.-p.303 -317.

66. Schneider W.J., Basu S.K., McPhaul M.J. et al. Solubilization of the low density lipoprotein receptor // Proceed. Natl. Acad. Sei. USA 1979. - vol.76. - p.5577 - 5581.

67. Schneider W.J., Beisiegel U., Goldstein J.L., Brown M.S. Purification of the low density lipoprotein receptor, an acidic glycoprotein of 164.000 molecular weight // J. Biol. Chem. -1982. vol.257. - p.2664 - 2673.

68. Schneider W.J., Goldstein J.L., Brown M.S. Partial purification and characterization of the low density lipoprotein receptor from bovine adrenal cortex // J. Biol. Chem. 1980. - vol.255. -p.11442- 11447.

69. Schneider W.J., Slaughter C.J., Goldstein J.L. et al. Use of anti-peptide antibodies to demonstrate external orientation of NH2-terminus of the LDL receptor in the plasma membrane of fibroblasts // J. Cell Biol. 1983. - vol.97. - p.1635 - 1640.

70. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975. - vol.98, N3. - p.503 - 517.

71. Suedhof T.C., Goldstein J.L., Brown M.S., Russell D.W. The LDL receptor gene: a mosaic of exons shared with different proteins // Science. 1985a. - vol.228, N4701. - p.815 - 822.

72. Suedhof T.C., Russell D.W., Goldstein J.L. et al. Cassette of eight exons shared by genes for LDL receptor and IGF precursor // Science. 19856. - vol.228, N4701. - p.893 - 895.

73. Tolleshaug H., Goldstein J.L., Schneider W.J., Brown M.S. Posttranslational processing of the LDL receptor and its genetic disruption in familial hypercholesterolemia // Cell. 1982. -vol.30.-p.715-724.

74. Tomida M., Yamamoto-Yamaguchi Y., Hozum M. Three different cDNAs encoding mouse D-factor/LIF receptor. // J. Biochem. 1994. - vol. 115. - p. 557 - 562.

75. Varret M., Rabes J.P., Collod-Beroud G. et al. Software and database for the analysis ofmutations in the human LDL receptor gene // Nucl. Acids Res. 1997. - vol. 25. - p. 172 -180.

76. Weisgraber K.H., Innerarity T.L., Mahley R.W. Role of the lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts // J. Biol. Chem. 1978. - vol.253. - p.9053 - 9062.

77. Yamamoto T., Bishop R.W., Brown M.S. et al. Deletion in cysteine-rich region of LDL receptor impedes transport to cell surface in WHHR rabbit // Nature. 1986. - vol.232, N4755. -p.1230- 1237.

78. Yamamoto T., Davis C.G., Brown M.S. et al. The human LDL receptor: a cysteine-rich protein with multiple Alu sequences in its mRNA // Cell. 1984. - vol.39, N1. - p.27 - 38.108