Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия рекомбинантного низкоаффинного Fc рецптора иммуноглобулина Е человека в Escherichiz Coli и в клетках млекопитающих

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия рекомбинантного низкоаффинного Fc рецптора иммуноглобулина Е человека в Escherichiz Coli и в клетках млекопитающих"

АО "БИОТЕХНОЛОГИЯ" ИНСТИТУТ БИОТЕХНОЛОГИИ

На правах рукописи

ЭКСПРЕССИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО НИЗКОАФФИННОГО

Fc РЕЦЕПТОРА ИММУНОГЛОБУЛИНА Е ЧЕЛОВЕКА В ESCHERICHIA COL1 И В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ.

03.00.03,- Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной биотехнологии Инспгтута Биотехнологии.

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор

Р.Г. Василов.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А.Г.Габибов, ИМБ РАН.

доктор биологических наук Л.П.Алексеев, Институт Иммунологии

Ведущая организация:

Инспггут Биоорганической химии им.М.М.Шемякина и-Ю.А.Овчинникова.

Защита состоится //" <?'</1996 г. в, час ка заседаншш диссертационного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии имени В.А.Экгельгардта РАН по адресу: И7984, г. Москва, ул. Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии РАН.

Автореферат разослан

'««4996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

А.М.Крицын.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Широкая распространенность аллергических заболеваний обуславливает актуальность изучения механизмов регуляции бяпешггеза иммуноглобулина Е ОдЕ) - ключевого компонента реакций гиперчувствктельности немедленного типа. Одной из молекул, влияющих на уровень биосинтеза !дЕ является низкоаффинный рецептор Рс-фрагмента 1§Е человека (РсЕШ1) Ше^реке С., еЬ а1., 1992). Некоторые моиоклоналыше антитела к.РсЕШ1 способны супресафовать продукцию 1дЕ (Бопре/оу Л.-У., еЬ а1., 1990). Такой же активностью обладает и один из фрагментов этого рецептора (БаЯаН М., е1 а]., 1992). Кроме того, сообщалось о способности фрагментов РсЕ1И1 влиять на рост и процессы дифференцировки различных субпопуляций клеток крови в том числе и на развитие лейкозных клонов Ше^реззе С., et а1., 1992), Однако, труднодоступность природного белка чрезвычайно усложняет изучение структуры и функций этого рецептора, поэтому механизмы, лежащие в основе описанных феноменов, остаются невыясненными. Интенсивное исследование структуры и биологических свойств FcER.II требует разработки способов его получения в необходимом количестве. Получение рекомбинантных препаратов различных молекул иммунной системы является одним из подходоз к изучению их строения и функциональной роли в организме" и, кроме того, это единственный путь получения достаточного для целей науки и медицины количества этого препарата, необходимого для разработки новых, методов диагностики и лечения. Целью данной работы было изучение возможности эффективной экспрессии кДНК низкоаффинного Рс-рецстггора ^Е человека- (СБ23) в прокариотичееккх и в животных клетках.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. 1.Разработка системы для экспрессии ^Е-связывающего фактора (зСБ23) человека в клетках ЕхоН. 2. Изучение экспрессии РсЕШ1/СБ23 в различных клеточных линиях. 3. Экспрессия рекомбинантного СБ23 и его фрагментов в клетках млекопитающих.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

В данной работе описаны различные системы для экспрессии кДНК низкоаффинного Рс-рецептора ^Е человека (СБ23) и его биологически активных фрагментов • (зС023). Впервые получен рекомбинантный препарат 5СБ23 в виде гибридного белка в клетках Е.соИ с достаточно большим выходом (около 10-15% от суммарного клеточного белка ) и разработан метод его выделения и очистки. Данный препарат может быть использован для получения

моноклональкых аштг. л и разработки диагностикумов. Клонированная ранее в нашей лаборатории кДНК была использована для получения высокоспецифичного зонда, с помощью которого выявлен полиморфизм хромосомного гена FcERII в ряде клеточных линий человека. Впервые показано, что отсутствие поверхностной экспрессии FcERII в одной из исследованных клеточных линий связано с делецией геномных последовательностей, кодирующих рецептор. Впервые - в клетках мышиной миеломы X63.Ag8.653 экспрессирована мембранная Ь-форма человеческого CD23 и получена экспрессия рекомбинантного 29кДа фрагмента CD23 в виде секретируемого белка. Различные варианты рекомбинантного CD23 необходимы для изучения механизмов регуляции биосинтеза IgE и ряда других биологических процессов, а также для конструирования на их основе аналогов с измененной физиологической активностью, которые могут иметь потенциальное клиническое применение в терапии ряда патологических состояний иммунной системы, в частности, при лечении аллергических заболеваний.

ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Способ экспрессии IgE-связывающего фактора (sCD23) человека в клетках E.coli, структура полученного рекомбинантного продукта.

2. Полим.орфизм гена FcERIJ в геноме различных клеточных линий человека.

3. Способ экспрессии различных форм CD23 человека в клетках мышиной миеломы X63.Ag8.6S3.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ: Результаты работы доложены на XV конгрессе Европейской академии аллергологии и клинической иммунологии (Париж, 1992), на ежегодной собрании Европеской академии аллергологии и клинической иммунологии ( Роттердам, 1993).

ПУБЛИКАЦИИ: По материалам диссертации, опубликовано 6 печатных работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ: Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 123 работы. Диссертация изложена на 104 страницах, содержит 17 рисунков и 5 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Ннзкоаффинньш Fc-рецептор иммуноглобулина Е человека (FcERIl ил» CD23), представляет собой 45 кДа трамсмембраннын одноцепочсчньт гликопротеин второго типа, состоящий из 321 аминокислотного остатка. Выявлены две формы мембранной молекулы, которые отличаются 7/6 N-концевымн аминокислотными остатками: а-форма (NHrMet-Glu-Glu-Gly-Gln-Tyr-Ser) и b-форма (NHj-Met-Asn-Pro-Pro-Ser-Gin) Этот белок обнаруживается из самых разных клетках иммунной системы, с поверхности которых он постоянно высвобождается в виде так называемых растворимых фрагментов, сохраняющих способность связывать IgE и называемых поэтому lgE-связывающими факторами (IgE-BF) или растворимым CD23 (sCD23). Сначала CD23 расщепляется в области аминокислотных остатков Gln-81 или Leu-102 с образованием промежуточных 37кДа и ЗЗкДа фрагментов, дальнейшее расщепление которых в области Met-150 приводит к образованию стабильной 25кДа молекулы. Расщепление CD23 происходит главным образом на клеточной поверхности вероятно путем автопротеолиза. К настоящему времени для CD23 и его растворимых фрагментов описано множество функций. На моноцитах/макрофагах, тромбоцитах и эозинофилах FcERIl участвует в IgE-зависимых цитотоксических реакциях, а также в процессах, вызывающих выделение этими клетками медиаторов и цитокмнов. На B-клетках, FcERIl опосредует lgE-зависимую презентацию антигена Т-лимфоцитам, и, кроме того, регулирует активацию и дифференцировку В-лимфоцктов в иммундглобулин-продуцирующие клетки. Растворимый CD23 (IgE-BF) является Многофункциональной молекулой, которая оказывает влияние на синтез IgE in vitro, на пролиферацию Т-клеток, ингибирует миграцию моноцитов, а совместно с ИЛ-1 способствует дифференцировке ранних тимоцитов и миелоидных предшественников. Кроме того, этот белок предотвращает апоптоз (самоуничтожение) B-лимфоцитов зародышевых центров. В одной из последних работ обнаружено, что обработка туникам mi ином (ингибитор N-гликозилирования) клеток, несущих на поверхности CD23, приводит .к. образованию 16кДа IgE-BF, обладающего ярко выраженной IgE-супрессирующей активностью. Общепринятые представления о структуре CD23 схематически показаны на рисунке 1.

Рисунок 1. Предполагаемая структура CD23.

Стрелки - сайты прогеолитаческого расщепления, ведущего к образованию IgE-связывающих факторов указанной М.ш.

1.ЭКСПРЕССИЯ IgE-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ФАКТОРА (sCD23) ЧЕЛОВЕКА В КЛЕТКАХ ESCHERICHIA COLI.

Для получения рекомбииантного препарата CD23 была использована ранее клонированная нами кДНК, кодирующая полную аминокислотную последовательность CD23. Методом полимеразной цепной реакции из нее была получена кДНК не содержащая нетраислируемых областей, которые, как известно, могут оказывать влияние на стабильность как генетической конструкции, так и соответствующей мРНК. Эта кДНК на расстоянии 50 пар оснований от начала 25 кДа IgE-BF содержит уникальный сайт Hind III, который и был использован для получения фрагмента гена, кодирующего растворимый CD23. Этот фрагмент был клонирован в экспрессионную плазмиду pBT-IL-3-lQ. Ранее данная конструкциял была использована для получения гибридного белка ЧЛ-3-10 с очень высоким уровнем экспрессии.

PBT-L-*C»23 —J3-ГогпрИ «<:m.t Ь-

,iiiT-sCD23 ■—¡оНса-ГШШлтс! СР£Г~1-»-

Рисунок 2. Схемы конструкций использованных для экспрессии sCD23. Plac - промотор, О - операторный участок связывания ]ас-репрессора, RBS -сайт связывания рибосом гена белка 10 фага Т7, AT G - стартовый кодрн, OmpF - фрагмент гена OmpF содержащий 5'-нетранслируемую последовательность и лидерный пептид белка OmpF E.coli, IL3 - фрагмент (177п.о.) гена ИЛЗ человека, ori pBR322 - начало репликации,

Клонирование фрагмента CD23 по внутретему сайту HindlII позволило соединить последовательность CD23 с последовательностью интерлейкина 3 (ИЛ-3) с сохранешгем рамки счшывания без дополнительных манипуляций. Встроешшй фрагмент кодирует С-кокцевую часть CD23, нач!шая с Glu-133 и включает в себя 25 кДа IgE-BF, который начинается с Met-150. Таким образом, полученная конструкция кодирует гибридный полипептид IL-3-sCD23, состоящий из 62 аминокислотных остатков N-концевого домена ИЛ-3 и 188 остатков С-концевого домена CD23. Полученной плазмидой pBT-IL-3-sCD23 (схема представлена на рис.^) трансформировали клетки E.coli JM 109 и нсследояали уровень экспрессии рекомбинантного белка в условиях репрессии и дерепрессии tac-промотора. Культуру клеток выращивали- при 37°С в среде LB до А500 = 1 ед, индуцировали продукцию добавлением ИПТГ и производили отбор проб через различные промежутки времени. Уровень продукции

рекомбинантного белка анализировали методом электрофореза в ПАЛГ в присутствии ДСН. Результаты представлены на рис.З.

кДа

1 2 3 4 5 6'7

Рисунок.. 3. Электрофореграмма суммарного клеточного белка' штамма E.coli JM109 (pBT-IL-3-sCD23).

1 - штамм JM109 без плазмиды (контрольный препарат); 2 - JM109 (pBT-lL-3-sCD23) до индукции; -3 - через ЗОмик. после добавления ИПТГ; 4 - через 1 час; 5 - через 2 часа; 6 - через 3 часа; 7 - через 4 часа.

Из рисунка видно, что в процессе инкубации наблюдается появление двух продуктов с молекулярным весом около 32 кДа и 24 кДа, причем на более ранних стадиях инкубации преимущественно образуется полнпептид большего размера, но к четвертому часу инкубации их соотношение становится практически равным, а суммарное количество достигает 20-25% от общего содержания белка.

Для идентификации рекомбинантного продукта использовали аффинно очищенные поликлональные кроличьи антитела к химически синтезированному пептиду из N-кокцевой области 25кДа IgE-BF. Данный пептид (от Gly-178 до Glu-195) был выбран с помощью компьютерной программы для предсказания антигенных детерминант белковой молекулы по ее аминокислотной последовательности разрабоштсн П.Жилкиныч (НПО "Вектор").

Использоваяие антнсыворотки к пептиду связано с отсутствием коммерческих антител необходимой специфичности реагирующих с денатурированным CD23. Результаты иммуноблоттг.нга бактериальных лнзатов лривед'-мы на рисунке 4.Л.

I-1 f-1

12 3 12 3

Рисунок 4. Иммуноблотгинг.

А - лизат клеток JM109 (pBT-IL-3-sCD23); Б - лнзат клеток JM109 (pBT-IL-3-10), взятый в качестве контроля на специфичность антител, ( на электрофореграмме лизата в области 28кДа хорошо заметен гибридный белок ИЛ-3-10 ); 1 - блот проявленный амидовым черным; 2 - блот проявленный антителами к пептидному фрагмент}' CD23; 3 - блот проявленный нормальной сывороткой кролика.-

Хорошо заметно, что антитела к пептиду выявляют в грубом лизате клеток только рекомбинантный белок (дорожка 2), причем одинаково сильно взаимодействуют с обеими полосами, тогда как нормальная кроличья сыворотки, взаимодействуя с рядом бактериальных белков (дорожка 3), не реагирует с рекомбинантным продуктом. В качестве контроля на специфичность связывания антител (рис.4,Б) использовался тот же штамм E.coli, несущий аналогичную" зкспрессионную плазмиду, в которую вместо фрагмента гена CD23 клонирован геи ИЛ-10. Определение Ы-кониевон аминокислотной последовательности показало, что оба продукта имеет на N-коице одинаковую структуру N-Met-Ala-Pro-Met-Thr-Gln, полностью совпадающую с аминокоггцерой последовательностью ИЛ-3.

Интересно отметить, что молекулярная, масса гибридного белка рассчитанная, как сумма аминокислотных остатков, составляет 28 кДа, тогда как на электрофореграмме рекомбинантньш продукт обнаруживается в виде двух полос с кажущимися молекулярными массами около 32 и 24 кДа. Исходя из предположения об аномальной подвижности белка, что вполне может иметь место, например, из-за повышенного содержания в нем пролина (8% от общего числа аминокислотных остатков), мы считаем, что верхняя полоса (32кДа) соответствует полноразмерному гибридному белку, тогда как нижняя полоса (24кДа), скорее всего, является продуктом протеолиза, причем сайт протеолитического расщепления по всей видимости расположен в С-концевой части молекулы. Это явление представляет значительный интерес, поскольку описан вариант зС023 образующийся при обработке эукариотических клеток ингибитором гликозилирования (туникамицин), у которого отсутствует С-концевой фрагмент примерно такого же размера. Аномальная подвижность гибридного белка по всей видимости связана именно с СВ23, поскольку подвижность гибридного белка 11.-3-10 в тех же условиях вполне соответствует расчетной величине.

На основании предположения, что гибридный белок формирует тельца ' * включения, мы использовали • следующий метод очистки препарата.' Клетки' разрушали в присутствии лизоцима и дезоксихолевой кислоты и разделяли лизат центрифугированием. Анализ супернатанта и осадка показал, что весь рекомбинантный белок находится в нерастворимой форме (рис.5, дорожки 1,2,3). Для 'дополнительной очистки осадок последовательно промывали растворами с возрастающей концентрацией гуачидин-НС1 (от 1 до 3 М). Потери рекомбинаткого продукта при такой схеме составляли менее 20 %, а содержание белковых примесей по данным электрофореза снижалось до 10% (рис.5, дорожки 4-9).

Солюбилизацию телец включения осуществляли путем растворения осадка в 6 М гуанидин-НС1, забуференном 0.1М трис-НС1 рН 9.0 с 0.2М дитио-трейтола при 37°С. Предполагается, что при данных условиях весь белок находится в полностью денатур1грованиом виде. Для ренатурации рекомбинантного продукта полученный раствор медленно в течение 1 часа разбавляли буфером, содержащим 1 М гушшдин-НС1 до конечной концентрации гуанидин-НС1 1.33 К. Далее диалнзоыклп в течении ночи I ,.отл_

кДа

•"•^•ij'l^L5 6 7 8

ч**} es*i MpJ : fef»

rrrt fSWl

йЙШИЛЙВЩ

■к Ш^^ЩШЙ

g mrfk^mm^.

94.0 67.0 43.0

30.0

20.1 14.4

Рисунок 5. Выделение рекомбинантного препарата из из клеток E.coli JM109 (pBT-IL-3-sCD23).

1 - электрофореграмма исходного лизата; 2 и 3 - супернатант и осадок 'исходного лизата, 'видно," что практически весь рекомбинантныи белок находится в осадке; 4 и 5 - супернатант и осадок рекомбинантного препарата промытого буфером С 1М-гуанидин-С1; 6 и 7 - супернатант и осадок препарата промытого буфером с 2М гуанидин-С1; 8 и 9 - супернатант и осадок препарата промытого буфером с ЗМ гуанидин-С1.

3 объемов буфера с 0.5М 1уанидин-НС1, при этом концентрация гуанидан-НС1

медленно снижалась до 0.7М. Попытки ускорить процесс ренатурации образца путем разбавления или диализа против меньших концентраций гуанщшн-НС1 приводили к выпадению в осадок до 90% рекомбинантного продукта. Далее в течение 4ч проводился диализ против 6 объемов 0.3 М гуанидин-HCl и исчерпывающий диализ против 150 мМ NaCI, забуференного 10 мМ трис-HCl с pH 8.0. В процессе ренатурации происходила дополнительная очистка препарата, по при этом около 25 % белка соосаждалссь с примесями. На последней стадии очистки препарат представлял собой раствор белка с общим содержанием рекомбинантного продукта более 90%. Результаты электрофореза

1 2 3 ЯН г:.

fc ■

: | : • г К-' К !•

Li:.

кДа

-94.0 -67.0 -43.0

- 30.0

•20.1 >14.4

Рисунок 6. Анализ выделенного из клеток E.coli JM109 (pBT-IL-3-sCD23) рекомбинантного препарата.

1 - электрофореграмма; 2 - блот проявленный антителами к пептидному фрагменту CD23; 3 - блот проявленный нормальной сывороткой кролика.

и иммуноблоттинга выделенного препарата представлены на рис.6. Из рисунка видно, что препарат (дорожка 1) представляет собой смесь двух полипептидов с молекулярными массами около 24 и 32 кДа в примерно равном количестве.. Оба полипептида связываются со специфическими кроличьими антителами к пептидному фрагменту sCD23 (дорожка 2), тогда как нормальная сыворотка кролика (дорожка 3) с препаратом не реагирует.

Следует отметить, что предпринятые нами попытки получения прямой экспрессии зрелого белка sCD23 (25 кДа) оказались неудачными. Ген sCD23 был клонирован в плазмиду pBTIL-З под контролем tac-промотора и RBS белка 10 фага Т7, а также в плазмиду pBT-hEGF в виде "гибрида" с геном лидерной последовательности белка OmpF. Первый вариант (pBT-sCD23) должен был обеспечить экспрессию белка в цитоплазму, второй (pBT-L-sCD23) - в периплазму клеток E.coli. Однако в обоих случаях" мы не смогли обнаружить рекомбинантного продукта в штаммах E.coli, несущих эти рекомбинантные плазмиды. По-видимому, в шгтоплазме E.coli белок sCD23 подвергается интенсивному протеолизу, а при продукции в периплазму оказывает токсическое действие, что приводит к лизису клеток E.coli при индукции его

г

биосинтеза. Схемы полученных "лаз.хщд представлены на рис.2.

Таким образом, нами разработана система для экспрессии sCD23 человека в клетках E.coli в виде гибридного белка с аминоконцевым доменом человеческого IL3 и с выходом около 10-15% от общего клеточного белка. Рекомбинантный продукт представлен двумя полипептидами с молекулярной массой около 24 и 32 кДа. Иммунологический анализ и определение N-концевой аминокислотной последовательности данных полипептидов свидетельствуют о том, что белок с молекулярной массой 24 кДа является продуктом протеолиза полноразмерного (32 кДа) гибридного белка. Полученный препарат может быть использован для получения моноклональных антител и разработки тест-систем да sCD23. Модификация конструкции, путем создания в гибридном белке сайта для высокоспецифической протеазы, позволит получать различные фрагменты CD23 без дополнительных последовательностей и разработать для них способ восстановления нативной структуры белка.

2. ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА FcERIl/CD23 В РАЗЛИЧНЫХ ЛИНИЯХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА.

В отличие от клеточных линий, полученных путем трансформации вирусом Эпштейн-Барр in vitro, аналогичные клеточные линю) трансформированные этим же вирусом in vivo (так называемые лимфомы Беркита) практически не экспрессируют' FcERli. Таким образом, данные лимфомы являются весьма интересным объектом в плане изучения биологической активности CD23 и процессов регуляции экспрессии этой молекулы. Для изучеши этого феномена нами было проведено рестриктное картирование гена рецептора в различных клеточных линиях. В качестве зонда использовалась биотинилированная кДНК CD23, полученная с помощью фотоактивируемого производного биотина, химическая формула которого приведена на рисунке 7.

фотоакпгеируемая группа

линкер

остаток биогоиа 0

N, W- У- т- с-щ

0

А* tV

/я

Рисунок 7. Структурная формула фотобиотина.

Подбор условий биотиннлирования проводили с использованием рекомбинангаой плазмиды р121Е1 (риС19, содержащая кДНК С023) путем подбора оптимального весового соотношения компонентов и условий облучения. Полученные препараты проверяли путем нанесения на нитроцелюлозные фильтры и последующей детекции коньюгатом авидин - полимерная пероксццаза. Образцы ДНК с максимальной степенью биотшшлирования проверяли методом дот гибридизации, используя в качестве зондов. Чувствительность детекции достигала 50 пг в точке. Замена коньюгата сгрептавидин-полимерная пероксидаза на конъюгат авидин-гцелочная фосфатаза позволила повысить чувствительность детекции до 1 пг ДНК клона р121Е1 на точку, что соответствует результатам, полученным в других лабораториях и является достаточным для детекции однокопийного гена рецептора в геноме человека.

Поверхностную экспрессию СБ23 изучали в четырех В-клеточных линиях ЯРМ18866, ОаисЦ, Катала, Иа^ и одной промиеломоношггарной линии 4937 иммунофлюоресцентными методами с помощью проточного цитофлуориметра РА СБ сап и различных моноклональных антител к С023 (МНМ6, Ьец20, Н050). Результаты приведены в таблице 1. Они полностью совпадают с опубликованными данными. - • - .

Таблица 1. Поверхностная экспрессия С023 в различных клеточных линиях

человека.

№ Клеточная Экспрессия CD23 Примечания

линия лит. дан. опыт

1 RPMI8866 + + В-клсточная трансф. in vitro вирусом ЭБ

2 U937 + + промиеломоно-цитарная. Вирус ЭБ (-)

3 Raji +/- ? В-кл. лимфома Беркита. Вирус ЭБ (+)

4 Daudi - то же, вирус ЭБ (+)

5 Namalva - . то же. вирус ЭБ (-) "

Анализ геномной ДНК вышеперечисленных клеточных линий с использованием бжяиншшрованиой кДНК СБ23 в качестве зонда проводили путем

картирования участков расщепляемых эндонуклеазами рестрикции. Для этого

выделяли из клеток геномную ДНК, аликвоты которой обрабатывали эндонуклеазами рестрикции ЕсоШ или ВашН1. Полученные смеси фрагментов разделяли ^электрофорезом б агарозном геле, переносили на нейлоновую мембрану и гибридизовали с биотюшлированной кДНК С023 . В качестве маркеров молекулярной массы использовали биотинилированные фрагменты фага X, расщепленного рестриктазой НшсИП. Полученные результаты схематически представлены на рисунке 8.

EcoRI BamHI

6 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

23130 - — — — —

9416 -

6 557 -

4361 - — —

2 322 2027 —

Рисунок 8. Гибридизация по Саузерну геномной ДНК различных клеточных линий с биотинилированным зондом (схема)

1. RPMI8866 2. U937 3. Raji 4. Namalva 5. Daudi 6. Маркеры молекулярной массы (X/Hind III).

Ранее, Сатер с со авт. провели сравнительный рестрикционный анализ ДНК из плаценты человека и из линии RPM18866 с помощью радиоактивно меченой кДНК CD23 и ресгриктаз. EcoRI, BamHi и Pstl, В результате был обнаружен некоторый полиморфизм длины рестриктных фрагментов, образующихся под действием эндонуклеазы Pstl. Структура геномного гена FcERll в клеточной линии RPMI8866, выявленная нами, полностью совпадает с данными этих исследователей..'

Дополнительная высокомолекулярная полоса (30 т.п.о.) в наших результатах может быть артефактом, связанным с условиями электорофореза или неполной рестрикцией. В остальных клеточных линиях нами был обнаружен некоторый полиморфизм рестриктных фрагментов, образующихся под действием ЕсоШ. Фрагмент ДНК размером 20 тыс. п.о., гибридизующийся с кДНК РсЕШ1 детектировался во всех клеточных линиях (искл. БаисЮ.

I

Однако при расщеплешш ДНК из линий 11937 и ЫагпаЬ-а образовывалось два и' одш! дополнительный фрагмент соответственно (см. рис.8). Не исключено, что образование этих фрагментов является следствием возникновения в результате спонтанных мутаций дополнительных сайтов рестрикции ЕсоК.1 в одном из аллелей гена СШЗ в этих линиях клеток. С другой стороны, особенности самого фермента ЕсоШ (например "звездная" активность), которые проявляются при длительных инкубациях, также могут привести к появлению дополнительных рестриктных фрагмиггов. Количество фрагментов гена РсЕГШ, образующихся под действием ВатШ у всех линий (искл.ОаисЮ одинаково. Однако размер их варьирует, что может быть связано со вставками или делециями ДНК как в соответствующих участках самого гена, так и в прилегающих областях. В геномной ДНК линии БаисВ нам не удалось обнаружить каких-либо последовательностей, гибридизующихся с кДНК СБ23. Принимая во внимание хорошо известное обстоятельство, что клетки таких линий никогда не обладают нормальным диплоидным кариотипом, этот факт легко объяснить потерей данной линией 19 хромосомы или делециёй ее соответствующего участка.

Таким образом, проведенное изучение поверхностной экспрессии FcER.Il и структуры гена этого рецептора в различных щеточных линиях позволяет

(Г

сделать заключение о том, что отсутствие поверхностной экспрессии в одном из исследованных случаев - линии БаисН вызвано потерей геномных последовательностей, кодирующих этот гликопротеин.

3." ЭКСПРЕССИЯ МЕМБРАННОЙ Ь-ФОРМЫ И 29кДа ФРАГМЕНТА СБ23 ЧЕЛОВЕКА В КЛЕТКАХ МЫШИНОЙ МИЕЛОМЫ X63.Ag8.653.

Разработка системы экспрессии кДНК С023 в животных клетках связана с работами по направленному мутагенезу молекулы с целью ее структурно-

функционалыюго исследования. Для С023 показано, что углеводная часть молекулы оказывает существенное влияние на ее функциональную активность, поэтому очевидно, что белок полученный в бактериях, дрожжах, а также в клетках насекомых не будет обладать полным спектром биологической активности нативного С023. Таким образом в данном случае наиболее адекватным подходом к получению рекомбинантных препаратов, предназначенных для функциональных исследований, является использование систем экспрессии на базе животных клеток.

Ранее СЭ23 экспрессировали в векторах на основе вируса 5\М0 в СОЭ-клетках, а также з СНО-клетках с использованием системы коамплификации с геном дигидрофолат-редуктазы' при селекции на метотрексате. Однако полученные уровни синтеза вполне сопоставимы с естественным невысоким уровнем экспрессии этого белка в клеточной линии Г1РМ18866, что серьезно осложняет выделение и очистку реком6ина1Ггных продуктов. С другой стороны, для работ по изучению функционирования мембранных форм СБ23 высокий уровень синтеза рекомбинантного белка не нужен, однако необходимым требованием к системе экспрессии является использование клеточных линий, которые могут быть стабильно трансформированы и имеют отношение к иммунной системе млекопитающих (в силу зависимости биологических свойсгв молекулы от типа гликозилирования). 4

В данной работе был использован многокопийный эписомный вектор ВМвМео (рис.9) на основе вируса бычьей папилломы и клеточная линия мышиной миеломы X63.Ag8.653. Эта система ранее с успехом применялась для стабильной высокоэффективной экспрессии ряда интерлейкинов мыши и человека.

Для создания экспрессирующих конструкций была использована ранее клонированная полноразмерная кДНК СБ23а. Известно, что нетранслируемые последовательности могут оказывать очень существенное влияние на стабильность мРНК и уровень трансляции, однако данное обстоятельство не учитывалось в работах других лабораторий. Поэтому, используя кДНК СШЗа в качестве матрицы, методом полимеразной цепной реакции с неполностью комплементарными пратерами была получена кДНК С023Ь, которая практически не содержит нетранслируемых участков и несет на концах сайты ХЬо1. Внутри этой кДНК имеется уникальный сайт 1^111, совпадающий с

- IS-

Рисунок 9. Структура вектора BMGNeo.

BPV69%.- фрагмент генома вируса BPV, МТр - мышиный.металлотиоиеиновый промотор, NeoR - маркер устойчивости к неомицину из Тпб E.coli под контролем промотора гена тимидин киназы, AmpR - маркер устойчивости к ампициллину, poly (А) - сигнал полиаденилирования гена ß-глобина кролика, intron - второй шггрон гена ß- глобина кролика, buman ß-globin - часть гена ß-глобина человека, orí pBR322 - начало репликации, HmdIJI, Xbal, Sali, Xhol, BamHI - сайты расщепления эндонуклеазами рестрикции.

началом фрагмента кодирующего 29кДа sCD23. Это обстоятельство было использовано при создании гибридной молекулы состоящей из последовательности кодирующей лидерный пептид интерлейкина 2 и последовательности кодирующей 29кДа.. sCD23. Такая конструкция обеспечивает получение прямой экспрессии фрагментов CD23 в секретируемом виде. Далее кДНК CD23b и IL2-SCD23 были клонированы по сайту Xhol в вектор BMGNeo, в результате чего были получены экспрессирующие плазмиды BMGHeo-CD23b и BMGNeo-IL2-sCD23. Общая схема работы показана на рис.10.

.V-{ кДНК ■■СШЛа______|-:Г

ПЦР(П.С)| ' XI,с,I

I -,

3-1 кДНК »СР23Ь Ь-Т 11МГЛ«,

('---[ спзяь

ХЬо! Х1ю|

I вяш

лидеркый 7 К1епоу

исшил 112

5-ГП -»- | кДНК зСР23 (29кДа) (-3'

! ! ' ХЬо| ■ I Х1ю|

5--1 I.1 кДНК 5СР23 (гЭкЛТУз-

I"- - ] |1_2-»ПШ

ХЬо1 Х1к»1 ^

Рисунок 10. Схема получения кДНК для мембранной Ь-формы СЭ23 и создание конструкции для экспреаш 29кДа 5СБ23 в секретируемом виде.

Трансформацию клеток X63.Ag8.653 проводили кальций-фосфатным или ДЭАЭ-декстрановым методом с последующим отбором стабильных клонов в присутствии антибиотшса .0418. На рисунке 11 представлены результаты иммуноблоттинга. клеточного лизата и культурального сулсрнатанта полученных клеточных линий. > Как видно из рисунка, поликлональные кроличьи антитела к пептидному фрагменту С023 выявляют полосу размером около 45кДа как в лизате клеточных мембран линии ЯРМ18866 конститутивно экспрессиругощей С023, так и в полученной нами линии Х-63-СП23Ь. Лизат контрольной линии Х-63-Ыео, полненной путем трансформации клеток исходной плазмидой ВМСЫео, с антителами не реагирует. Полосу размером около 29кДа антитела выявляют как в супернатанте клеток 11937 для которых характерно образование именно 29кДа $СП23, так и в супернатанте полученной нами линии Х-63-5СБ23, при этом они не взаимодействуют с контрольным супернатантом'Х-бЗ-Ыео.

Для дальнейшей идентификации клонов были использованы мышиные моноклональные антитела Н050, узнающие нативную структуру СЭ23. Результаты иммунофлюоресцентного анализа клеток Х-63-СВ23Ь в сравнении с Х-63-Ыео показаны на рисунке 12.

1 2 3 4 5 6 7 8

, IV г.? дет —« г

« >¿1

Ш

кДа

■ 94.0 • 67.0

43.0

30.0

20.1

14.4

Рисунок 11.'И'ммуноблоттинг. , :

1 - лизат клеток КРМ18866 с кроличьими антителами к пептидному фрагменту СБ23 (г-анти-СВ23); 2 - супернатант культуры клеток 1)937 с г-анти-С023; 3,4 - лизат Х-63-СБ23Ь с г-анти-СВ23 и с нормальной сывороткой кролика соответственно; 5,6 - супернатант культуры клеток Х-63-5С023 с г-анти-СБ23 и с нормальной сывороткой кролика соответственно; 7,8 - лизат и супернатант культуры клеток Х-63-Ыео с г-актиС023.

С

Рисунок 12. Реакция прямой иммунофлюоресценпии р моноклональными

антителами 1Ш50 мечеными флюоресцеинизоггиоцианатом <!фитц). А - Х-63-СВ23Ь; Б - Х-63-Ыео (отрицательный контроль).

Следует отметить, что были проведены также эксперименты по экспрессии в данной системе CD23a с использованием как полноразмерной, так и не содержащей нетранслируемых областей кДНК. Были получены стабильные трансформированные линии, которые содержали плазмиду со вставкой в неизмененном виде, что было показано экстракцией плазмидной ДНК по Хирту с последующей трансформацией клеток E.coli, выделением плазмидной ДНК, и идентификацией ее структуры при помощи набора эндонуклеаз рестрикции. Однако экспрессию белка CD23 в получетых линиях клеток обнаружить не удалось. Известно, что у мышей существует только одна мембранная форма FcERII, гомологичная CD23a человека. Не исключено, что а-форма CD23 человека обладает какой-то существенной для клеток мышиной миеломы физиологической активностью, которая приводит к отбору непродуцирующих клонов.

Таким образом, с использованием системы экспресии, состоящей из эписомного вектора BMGNeo на основе вируса бычьей папилломы и клеточной линии мышиной миеломы X63.Ag8.653 нами получены стабильные клеточные линии экспрессирующие рекомбинангную мембранную b-форму CD23 (Х-63-CD23b) и рекомбинантный 29кДа фрагмент CD23 в виде секретируемого белка (X-63-SCD23). '

ВЫВОДЫ.

1. Разработана эффективная система экспрессии sCD23 человека в клетках Escherichia coli.

2. Получен очищенный рекомбинантный препарат SCD23 человека.

3. Выявлен структурный полиморфизм гена FcERII в некоторых клеточных линиях человека.

4. Показано, что отсутствие мембранной экспрессии FcERII в одной из исследованных линий клеток - Daudi вызвано потерей последовательностей, кодирующих рецептор, в геноме клеток этой линии.

5. Показано, что клетки мышиной миеломы X63.Ag8.653 могут ■ быть использованы для экспрессии CD23 человека как в мембранной форме так в виде секретируемых фрагментов с лидерным пептидом интерлейкина 2.

Ciuicqk работ опубликованных по теме диссертации:

1. Кайгородов В.А., Пивнюк В.И.;- Кондратьева И.А., Василов Р.Г.

, Рестрнкционное • картирование гена CD23 человека из клеточных линий

^ - -

RPMI8866, U937, Raji, Daudi, Namalva. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 16. Биология. 1993. N.3. с. 54-57.

2. Кайгородов В.А., Пивнюк В.И., Кондратьева И.А., Василов Р.Г. Получение мышиной ми ел омы, устойчивой к антибиотику G418- // Вестн. Моск. Ун-та. Сер.16. Биология. 1995. N.1. с. 62-65.

3. Кайгородов В.А., Птицын Л.Р., Пивнюк В.И., Кондратьева И.А., Альтман И.Б., Василов Р.Г. Экспрессия IgE-связывающего фактора (sCD23) человека в клетках Escherichia coli. // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1996. N.5 с. 26-31.

4. Пившок В.И., Фадеев М.О., Кайгородов В.А., Василов Р.Г. Клонирование и экспрессия гена CD23 антигена - регуляторного фактора аллергии. // Тез. докл. III Всероссийской пларово-отчетной конференции.. . "Генная и клеточная инженерия", Пущино-на-Оке, Ноябрь-декабрь 1992г. с. 31.

5- Vasilov R.G., Kaigorodov V.A., Pivnjuk V.I., Tsitsikov Е.Ы. Study of CD23 gene expression in different systems using biotinylated CD23 probe. // Abstr. of the XVth Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology. Paris, France, 10-15 May, 1992, p. 277.

6. Pivnjuk V.I.,' Kaigorodov V.A., Tsitsikov E.N., Vasilov R.G, Establishment of mouse cell line wich constitutively express human low affinity IgE receptor/CD23. // Abstr. of the Annual Meeting of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology. Rotterdam, The Netherlands, 12-15 September, 1993. p. 317.