Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и функциональная характеристика нового рефептора окситцин/вазопрессионового семейства (мезотоцинового ) из мочевого пузыря жабы Bufo marinus

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и функциональная характеристика нового рефептора окситцин/вазопрессионового семейства (мезотоцинового ) из мочевого пузыря жабы Bufo marinus"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ им.И.М.СЕЧЕНОВА

На правах рукописи УДК: 577.171 .G: 577.212.3

ГЕТМАНОВА Елена Викторовна

КЛОНИРОВАНИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОГО

РЕЦЕПТОРА ОКСИТОЦИН/ВАЗОПРЕССИНОВОГО СЕМЕЙСТВА (МЕЗОТОЦИНОВОГО) ИЗ МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ ЖАБЫ Bufo marlnus

Специальность 03.00.04- Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1996

РГ6 ОД

Работа выполнена Б группе профессора Ф.Фаренгольца в Институте биофизики им.Макса Планка (Франкфурт на Майне, Германия).

Научный руководитель -

кандидат биологических наук Р.Г.Парнова

Официальные оппоненты -

член-корреспондент РАМН В.С.Гайцхоки

доктор биологических наук, профессор М.Н.Перцева

Ведущее учреждение • Институт Цитологии РАН

Защита состоится 'ЯО'Ц/РлЛ 1996 года в' // часов на заседании Диссертационного совета К002.89.01 в Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН.

Адрес института: 194223, Санкт-Петербург, пр. М.Тореза, 44.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ИЭФиБ им.И.М.Сеченова РАН.

Автореферат разослан" -МОЯ 1996 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук /)Ч1Л Л.В.Зуева

^//л.в.з

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. К настоящему времени обнаружено большое разнообразие вазопрессин- и окситоцин-подобных гормонов у разных представителей животного мира: около 13 - у позвоночных и 5 - у беспозвоночных (Asher, 1993). Все они имеют сходную структуру из 9 аминокислот, причем различия в аминокислотных заменах в положениях 3 и S определяют принадлежность пептидных гормонов к вазопрессиновому или окситоциновому ряду и различие их функций в организме. Аргинин-вазотоцин встречается от круглоротых до птиц и сменяется на вазопрес-сины у млекопитающих, появляясь впервые у сумчатых (Mahlmann et а!, 1994). В окситоциновом ряду гормонов самые низшие представители позвоночных - хрящевые рыбы - имеют множество окситоцин-подобных пептидов, что, как предполагают, связано с отсутствием жестких селективных ограничений в функции гормона и молекуле его рецептора (Chauvet et al, 1994). Изотоцин костистых рыб сменяется у двоякодышащих рыб и амфибий на мезотоцин, который сохраняет эволюционную стабильность вплоть до окситоцина млекопитающих (Chauvet et al, 1995).

Вазопрессин-подобные гормоны играют большую роль в осморегу-ляции (Наточин и др., 19S9), вазопрессорных эффектах (Malvin, 1993). в регуляции гликогенолиза (Ade ot al, 1995), секреции стероидных (Iwamuro ot al, 1993) и кортикотропных (Tonon et al, 1986) гормонов, a окситоцин-подобные - в процессах размножения (Boyd, 1994). Кроме того, и те, и другие обладают рядом эффектов, регулируемых ЦНС (влияние на локомоторную активность (Boyd, 1991), дыхательные и сердечно-сосудистые эффекты (Chiu. Lee, 1992), регуляций секреции эндолимфы (Ferrary et al, 1991) и др.).

Гормоны секретируются в нейронах гипоталамуса и высвобождаются из их аксонов в нейрогипофизе под действием различных физиологических сигналов. Они циркулируют в крови и связываются со специфическими рецепторами в разных тканях. 3 типа вазопрессиновых и 1 тип ок-ситоцинового рецепторов млекопитающих клонированы к настоящему времени: \Л, (Morel et al, 1992; Thibonnier et al, 1994), Vu (Sugimoto et al, 1994), V2 аргинин-вазопрессиновые (Lolait et al, 1992; Birntv mer et al, 1992; Ufer et al. 1995), V? лизин-вазопресеиновый (Gorbulev et al, 1993) и окситоциновые (Kimura et al, 1992; Gorbulev et al, 1993; Rozen et al, 1995) рецепторы. Окситоцинсвые рецепторы, как и вазолрессиновые рецепторы

Vi типа, действуют через инозиттрифосфат/кальциевую систему вторичных посредников, а V2 рецепторы - через активацию аденилатциклазы. Все они принадлежат к G-белок-связывающим рецепторам. Становление функций гормонов у млекопитающих тесно связано с изменением структуры гормона в ряду организмов и коэволюцией гормон-рецепторного комплекса.

Амфибии представляют особый интерес в изучении эволюционного развития двух семейств нейрогипофизарных гормонов. Выход амфибий из воды на сушу в процессе онтогенеза, а также появление в ходе эволюции амфибий полуводных и наземных форм, приводит к перестройке системы осморегуляции организма. Возможность существования амфибий в новых условиях может быть связана с появлением новых нейрогипофизарных гормонов (например, мезотоцина) и специфических к ним рецепторов, взаимодействующих с различными эффекторными системами.

Клонированные к настоящему времени аргонин-вазотоциновый (Mahlmann et al, 1994) и изотоциновый (Hausmann et al, 1995) рецепторы костистых рыб являются, очевидно, эволюционными предшественниками вазопрессин- и окситоцин-подобных рецепторов других позвоночных. Изучение и клонирование таких рецепторов у амфибий открывает путь к пониманию эволюции функций вазопрессин- и окситоцин-подобных гормонов при смене условий существования.

Мочевой пузырь амфибий в течение многих лет является классическим объектом исследования действия нейрогипофизарных гормонов в механизмах осморегуляции. К настоящему времени биохимическими методами показано наличие Vi-подобных рецепторов на эпителиальных клетках мочевого пузыря жабы, связанных с активацией аденилатциклазы и участвующих в процессе осморегуляции (Uchiyama, 1994; Lyall et al, 1994). Кроме того, предполагают существование других типов рецепторов, связанных, возможно, с другой системой вторичных посредников и оказывающих модулирующее действие на осморегулятормые процессы. Однако, до сих пор не были клонированы рецепторы нейрогипофизарных гормонов у амфибий, что позволило бы установить структуру и свойства рецепторов и подойти к пониманию их функциональной роли.

Различие и структуре гормонов разных позвоночных обусловливает особенности структуры связывающего центра рецептора. Поэтому сравнение последовательностей разных рецепторов позволит подойти к иден-

тификации участка связывания гормона на молекуле рецептора и к определению его специфичности к тем или иным лигандам.

В связи с этим была проведена работа по клонированию оксито-цин/вазопрессин-подобного рецептора из мочевого пузыря жабы Bufo marínus и исследование его функциональных свойств. Цель и задачи исследования. Целью работы было клонирование оксито-цин/вазопрессин-подобного рецептора из мочевого пузыря жабы Bufo marínus и исследование его функциональной характеристики. Соответственно, были поставлены следующие задачи:

1. Клонировать кДНК окситоцин/вазопрессин-подобного рецептора из мочевого пузыря жабы.

2. Изучить его сродство к различным агонистам и антагонистам нейрогипофизарных гормонов.

3. Изучить систему вторичных посредников, через которую работает клонированный рецептор.

4. Изучить экспрессию мРНК рецептора в разных тканях жабы. Научная новизна работы. Впервые была клонирована кДНК рецептора окситоцин/вазопрессинового семейства из мочевого пузыря жабы. Сравнение аминокислотных последовательностей клонированного рецептора с другими представителями окситоцин/вазопрессинового семейства показало, что клонированный рецептор относится к окситоциновому подсемейству. В экспериментах по функциональной характеристике клонированного рецептора было выявлено его наибольшее сродство к мезотоци-ну. Было показано, что связывание мезотоцинового рецептора с лигандом стимулирует активацию фосфолипазы С. Экспрессия мРНК рецептора была обнаружена а мочевом пузыре, почке, мозгу и скелетных мышцах жабы. Клонирование мезотоцинового рецептора позволило охарактеризовать эволюционное развитие окситоцин-подобных рецепторов при переходе от водных организмов к наземным: от изотоцинового рецептора рыб к окситоциновому рецептору млекопитющих.

Практическое значение работы. Нейрогипофизарные гормоны - аргинин-вазотоцин и мезотоцин - участвуют в регуляции различных процессов, в частности, процесса размножения, у птиц. Клонирование мвзс. оцинового рецептора и характеристика его фармакологических свойств позволяет приблизиться к пониманию регуляции размножения у домашней птицы, что может иметь большое значение для птицеводства.

Апробация работы. Результаты, полученные в настоящей работе, были доложены на конференции Fall Meeting/Gesellschaft fur Biologische Chemie (Вюрцбург, 1994) и на заседании секции молекулярных основ эволюции функций ИЭФиБ им.И.М.Сеченова (Санкт-Петербург, 1996). Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на /5"?страницах, содержит 23 рисунков, 2 таблицы и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, который включает в себя £/{ литературных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследования была выбрана американская жаба Bufo marinus, замороженные ткани которой были получены от доктора П.Эггена из Медицинского Центра (Нью-Йорк, США).

Стандартные методы работы с ДНК (электрофорез ДНК; выделение фрагментов ДНК из геля; выделение плазмидной ДНК; осаждение ДНК; очистку ДНК фенолом и хлороформ/изоамиловым спиртом; лигирование, клонирование фрагментов ДНК в плазмиды) проводили согласно протоколам Maniatis et al, 1982 и Palmiter, 1974. Компетентные клетки E.coli для трансформации подготавливали СаС1гметодом (Mandel & Higa, 1970 и Dagert & Ehrlich, 1974) и трансформацию ДНК проводили согласно протоколу Maniatis et al, 1982. Отбор рекомбинантных клонов проводили на среде с ампициллином и на агаре с Х-галактозой и изопропил-ß-D-тиогалактопиранозидом (ИПТГ).

Тотальную РНК из тканей жабы выделяли методом Chomczynski & Sacchi, 1Э87. мРНК из мочевого пузыря жабы выделяли на колонке с оли-го(дТ)-и,еллюлозой. кДНК синтезировали, используя олиго(дТ)и-,а прай-мер, и фракционировали в агароэном геле. Синтез кДНК проводили согласно протоколу Gibco 8RL на мРНК из мочевого пузыря жабы, как матрице. Фикцию молекул кДНК размером 1,3 - 7 кб лигировали с EcoRI/Xhol вдаптс1>«|ии и клонировали в EcoRI сайт фага Àgt10. Упаковку фага проводили согласно протоколу Stratagene с Gigapackll-набором. Концентрацию фагов определяли с E.coí¡ СбООЛЛА-клетками. Часть библиотеки кДНК скринирооапи с помощью моченых кДНК окситоцинового и V¿ вазо-прсссинового рецепторов свиньи. ДНК фагв выделяли согласно Current

Protocols. Сиквенирование проводили с помощью кита Сиквеназа 2.0 (USB) по методу остановки синтеза цепи (Tabor & Richardson, 1987). Для сиквенирования использовали стандартные праймеры (прямой V, обратный), комплементарные ДНК плазмиды, и специфические олигонуклеоти-ды к последовательности кДНК рецептора. Поиск 5'- и альтернативного 3'- конца гена нового рецептора проводили с помощью быстрой амплификации концов кДНК (Frohman et al, 1S90) и обратной полимеразной цепной реакции в модификации Towner & Gartner, 1992. В качестве матрицы использовали мРНК из мочевого пузыря жабы. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили по следующей схеме: 94°С 1 мин, 48°С 1 мин, 72°С 1 мин, 30 циклов. Перенос ДНК и РНК на фильтр Hybcnd-N (Сазерн- и Но-зерн-блоттинг), гибридизацию фильтра с радиоактивными зондами осуществляли согласно протоколу Amersham. Для гибридизации подготавливали радиоактивный зонд методом ник-трансляции согласно протоколу Amersham. Этапы конструирования и скрининга библиотеки кДНК, большинство реакций ПЦР и часть сиквенирования были выполнены совместно с доктором Горбулевым В.Г. и доктором Ахундовой A.A.

Трансфекцию COSM6 клеток вектором экспрессии эукзриот pSG5 (Green et al, 1988), содержащим кДНК клонированного рецептора, осуществляли ДЭАЭ-декстрановым методом (Seed, Aruffo, 19S7). Мембраны COSM6 клеток выделяли, ках описано ранее (Gorbulev et al, 1993) и концентрацию белка в мембранах определяли методом Bradford et al, 19СЗ. Связывание мембран с [3Н]-аргинин-вазотоцином проводили, как описано ранее (Gorbulev et al, 1993). Эксперименты по связыванию анализировали с помощью программы Ligand (Munson, 1983). Синтез кРНК для экспрессии в ооцитах Xenopus laavis проводили согласно протоколу Stratagsne. Электрофорез РНК осуществляли в денатурирующих условиях (Kroczek & Siebert. 1990). 50 нг кРНК инъецировали в ооциты и после инкубации в течение 72 ч мембранные токи при действии лиганда измеряли 2-х микроэлектродным методом (Meysrhof et al, 1988). Активность аденилат-циклаэы изучали на мембранах COSM6 клеток, трансформированных кДНК нового рецептора, с помощью радио-иммунного набора для определения цАМФ (Amersham).

Для изучения экспрессии мРНК рецептора в различных тканях жабы синтезировали кДНК на тотальной РНК (5 цг), выделенной из различных тканей жабы, и проводили полимеразную цепную реакцию с праймерами,

специфичными к последовательности мезотоцинового рецептора в следующем режиме: 94°С 30 сек, 52°С 1 мин, 72°С 1,5 мин, 20 циклов. Геномную ДНК из почки жабы выделяли согласно Current Protocols и поли-меразную цепную реакцию на геномной ДНК со специфическими прайме-рами проводили в следующем режиме: 94°С 3 мин, 52°С 1 мин, 72°С 2 мин, 25 циклов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Кпонирооание рецептора из окситоцин/ вазопрессинового семейства из мочевого пузыря жабы. На первом этапе клонирования получили библиотеку хДНК из мочевого пузыря жабы Bufo marinus. После двух этапов скрининга был обнаружен один положительный клон размером 2,3 кб, представляющий ссбой З'-область кДНК рецептора, сходного с рецепторами окситоцин/вазопрессинового семейства. Однако 5'-конец рецептора получить не удалось. Повторный скрининг библиотеки не дал положительного результата. Для обнаружения недостающего 5'-конца кДНК рецептора применяли методы быстрой амплификации 5'-концов кДНК и обратной лолимеразной цепной реакции. С помощью этих подходов был получен дополнительный фрагмент кДНК нового рецептора, который содержал недостающий 5-конец кодирующего района и 50 п.н. нетрансли-руемой 5'-области кДНК рецептора. Дополнительную полимеразную цоп-Hyii реакцию проводили для получения целого 5'-фрагмента кДНК, который затем литровали с ДНК последовательностью положительного клона, полученного при скрининге библиотеки.

Для подтверждения того, что все найденные фрагменты были расположены на одной молекуле, была проведена полимеразная цепная реакция на тотальной мРНК из мочевого пузыря жабы, как матрице, с двумя прайморами, которые были синтезированы к 5'- и 3'- некодирующим районам найденной кДНК рецептора. Было показано, что ранее клонированные части кДНК (продукт обратной лолимеразной цепной реакции, продукт быстрой амплификации 5'-концов кДНК и VOTIO кДНК) расположены на одно., и той жо молекуле.

Анализ аминокислотной последовательности клонированного рецептора показал наличие 7 гидрофобных районов, типичных для 7 тринсмембранных доменов G-белок-сея.чывающих рецепторов. Однако, в то чремя, как первые Ь долленов были гомологичны соответствующим до-

менам рецепторов окситоцин/вазолрессинового семейства, седьмой домен не имел никакой гомологии не только с представителями окситоцин/ вазопрессинового семейства рецепторов, но и ни с одним белком из Swiss Protein базы данных. Сравнение последовательности клонированного рецептора с последовательностями V2 вазопрессиновых рецепторов крысы и человека покззало, что гомология прерывается на аминокислоте в позиции 306. Это место границы зкзона и интрона в генах V2 вазопрес-синовых рецепторов человека и крысы (Seibold et al, 1992; Firsov et al, 1994). Таким образом, последовательность, следующая за GIU306 в новом клонированном рецепторе может представлять собой интрон несплайси-рованной мРНК, либо продукт альтернативного сплайсинга. Функциональная характеристика клонированного рецептора с необычным седьмым трансмембранным доменсм. кДНК нового рецептора клонировали в экспрессионный вектор эукариот pSG5 и осуществляли трансфекцию в COSM6 клетки. Связывание рецептора с мечеными ли-гандами [3Н]-аргинин-вазопрессином и [3Н]-окситоцином проводили с мембранами, выделенными из COSM6 клеток, трансформированных КДНК нового рецептора. Сродство нового рецептора к обоим лигандам было значительно более низким по сравнению с окситоциновым рецептором свиньи (Gorbulevat al, 1993), взятым в качестве положительного контроля. Отчетливой стимуляции системы вторичных посредников при действии на рецептор различных лигандов не обнаружили. Мезотоцин, гидрин 1, гидрин 2, изотоцин, окситоцин и аргинин-вазопрессин в концентрации 10"8 М не вызывали активации аденилйтциклазы на мембранах клеток, трансформированных кДНК нового рецептора. В случае аргинин-вазотоцина наблюдали слабую стимуляцию образования цАМФ (30%), однако, значительный разброс данных не позволяет считать эти результаты достоверными. После инъекции кРНК рецептора в ооциты Xenopus laevis не наблюдали индуцированных гормонами Сз2*-зависимых мембранных токов по сравнению с положительным контролем (окситоциновым рецептором свиньи), что свидетельствовало об отсутствии аетиаации фосфолипазы С. Вполне вероятно, что изменение 7-го трансмембранного домена и С-конца рецептора (в частности - отсутствие сайтов пальмити-лирозания в карбоксильном конце) приводит к тому, что рецептор не может правильно встроиться (или вообще не встраивается) в мембрану. В

связи с этим конформация всей молекулы рецептора и участка связывания лиганда изменяется.

Клонирование функционального рецептора окситоцин/ вазопресси-вового семейства из мочевого пузыря жабы. В связи с тем, что клонированный рецептор оказался нефункциональным, что, возможно, было связано с большим отличием области его 7-го трансмембранного домена от аналогичной области других рецепторов из этого семейства, предприняли попытку найти альтернативный З'-конец рецептора с помощью быстрой амплификации З'-концов кДНК. В результате анализа обнаружили клон, содержащий фрагмент, имеющий большую степень гомологии с другими представителями семейства окситоцин/вазопрессиновых рецепторов и представляющий собой 3'- конец кДНК рецептора. Этот фрагмент перекрывался с клонированной ранее последовательностью на 335 пн. Новый З'-конец кДНК рецептора лигировали с 5'-концом кДНК рецептора, используя уникальный сайт рестрикции Bpu1102l.

Последовательность клонированного рецептора. Получанную кДНК нового рецептора полностью сиквенировали (рис.1). «ДНК рецептора имеет открытую рамку считывания для 389 аминокислот, содержит 50 пн в 5'-нетранслируемой области, 1167 пн, соответствующих кодирующему району к 180 г,н З'-нетранслируемой области с сигналом полиадеиилиро-вания (ААТААА) за 17 пн от поли(А)-конца. Как и все остальные белки семейства окситоцин/вазопрессиновых рецепторов, нооый рецептор имеет 7 гидрофобных участков, соответствующих 7-ми трансмембранным доменам G-белок-связывающих рецепторов, N-конец, С-конец, три внутриклеточные и три внеклеточные петли (рис.2).

Клонированный рецептор содержит такие же консервативные участки, как и остальные представители окситоцин/вазопрессинового семейства: в том числе уникальную последовательность из 7-ми аминокислот (FQVLPQL (Фен-Глн-Вал-Лей-Про-Глн-Лей)) на конце 2-го трансмембранного домена, которая обнаружена у всех окситоцин/вазопрессиновых рацаптопоа. В то время, как в первой экстрацеллюлярной петле все другие рец,..,горы имеют последовательность GPD (Гли-Про-Асп), в клонированном рецепторе происходит замена Гли на Ала (APD). В 6-ом трансяйеморанном домене новый рецептор содержит Тре (в последовательности Цкс-Трп-Тре/Про-Фен-Фен), что является характерным для всех охситоциновых рацег,торов.

1 MBOX,CLHLDC8SL»M6eNVW8tNIH

* *

7в СЛаАЛССЛСАХП'СС^и^ОСАСХУ^*!*^

2« QHHSSHftTRDPbK R Н I В V А К V X V Г V L A L I * *

1в4 стогтссто<хчгсто<клооаААСАТСт(7гатсст

35 LFLALAOH I СУ L L Q I YIMRHKB8 R Н 1 ГГМ

2Р1 АА£>САССТОАЯСАТ7 ССАДАТСТ ЭОТООТТ ОС ААТ СТТССА/^^ТЧ>СТТ ССТСАОСТСАТ СТ ОООАСАТСАСС7ГТ СА/ЗОТ1"СТ АТОСГ 94 KHLSIADLVVAirQ_V__L_Р QLIHDITPRFYA

ЭЗв ССАаАСТГТОвТТТОСАООТТО^СЛСТГГАССТ-ЭСАООТОСТ

113 PDLVCR LVTYLQVVQHFA 8 TYWLI.L_W__B_L D

425 АЯОТОСТТООССАТ СТ QTCAACCATT GAOCÍTCTCTGCACAOGUUJATCAQACTOTQT СТ АТОТССТСТРСАССТООАТССТ СЖ7ТТТТ 142 RCLA1 CQPI.R8X.HRP. 8DCVY V L Г Т IT I_I В Т

51Э СТТСТСАОО^СССССЛАЛ^ОТСАТСТТСТСССТСА

171 LLBTPQTVIF8L TBVOXOVYDCRAD Т X Q Р

еоо Т ОООСХЭСССАААОССТАСАТСАССТООАТААСССТООСТ ОТ СТАСАТСАТСССАОТЛАТОХГССГТЛОТЭТСГОСТ ATvTOGCTT АГТ 200 * О Р К А Y I TWITLA.VYI I PVMIL8VCTOt. 1

087 АЗСТАСАЛаАТСТМСАа*АСАТСа»гСТаААаАСТ

229 8 У К I W Q Н I RLKTVClSNLRLflTflRRATLa

• ♦ О • Я

774 АДО<?ТСА(К1АОТСГГСАДОСТСАТСТССААООСТ АААХТССООАСТОТОААШ^ТСАССТТСА ТСАТ АОТ ЯСТООСТТАСАГТОТСТОС

2Ъв RV88VRLI 8KAKIRTVK ИТГ11УЬАУГ У С • •

в«1 ТОаАСООССГГСТТСТГОТТССАОАТаТГкТГСАаТ

aa 7 w т у у т_f v q ы я svwdphppkía a l г j г а м ь

♦

948 СТОСОЗАОССТ ОААСАОСТ GCTGT ААССССТ^МАТСТАЛАТОСТСТТСАССООТ САССТСТТССАССТАССТОСТАСАААОСТТССТС 31 в г. о 8LH» с с к р w i y м i, гтаньгноььовгх.

юзе тостоггссосссасл'АССталАСччссслхкл^^

34 5 CCBARY Lr. TQQQOODI.8A8RKBHe8TFVL • •

1122 А<7ГСЭСАА£ЭДЛТСААЭТСАЗДА0АЭСА?САСССА0ССАТССАСА0СвТ0АА< "I

374 8RKB88QK8XTQP8TA

• ■ •

1217 Г.СЛ0 - • ' Лг А 'АГ т?>, Г7Т7 J ТТ7 АТЛОСС* А/ GCAw ГТТ^ТГ Г7' .Т" АО > ЛТТ АГГСТйА',.ЛСТТТТ' Т ГТТ*~; L!ГИ .7

] V0 ТААЛ"'¿A I i'V«AT^TT'^iATi. 7 АТ\.ТТ'Г ЛА1АААТ"ААААААААЛ

Рис.1. Нуклеотидная последовательность кДНК клонированного роцолтора из мочевого пузыря жабы Bufo marínus и его аминокислотная последовательность. Трзнсмембранныо домоны подчеркнуты. Возможные участки М-гликозилиров&ния обозначены - * ; фосфорилирования протеинкиназой С (Тре/Сер-Х-Арг/Лиэ) -цАМФ- и цГМФ- зависимыми протеинкиназами (Арг-Х-Сер/Тре) - ■ ; каэеинкинаэсй II (Тро/Сер-ХХ-Асп/Глу) - ♦ .

Другой консервативный участок - последовательность во второй экстрацеллюлярной петле (Про-Трп-Гли). Во 2-ой зкстрацеллголярной петле находится еще один консервативный участок - DCWA (Асл-Цис-Трп-Ала), при зтом в клонированном рецептора происходит замена Трп на Apr (DCRA) (у рыбы вазотоциновый и изотоциновый рецепторы меют Гли вместо Ала). Все эти последовательности консервативны только s семействе нонапептидных рецепторов и конфсрмация этих участков, возможно, играет большую роль в формировании сайта связывания лиганда.

Рис.2. Схема расположения в мембран* клонированного рецептора жабы

(построенная на основе анализа участков гидрофобное™ в аминокислотной последовательности рецептора).

Функциональная характеристика клонированного рецептора. кДНК нового рецептора переклонировали в экслрессионный вектор эукариот рЭС5 и его использовали для трансфекции в СОвМв клетки.

{ЗНЬАрГ-МЭОТОЦИМ (ИМ)

Рис.3. Кривая насыщения связывания [^-аргинин-ваэотоцииа с мембранами СОБМб клеток, трансформированных «ДНК клонированного рецептора. Во вставке представлен график Скэтчарда.

После 72 часов инкубации выделяли мембраны и проводили эксперименты по связыванию. Мембраны С05М6 клеток, трансформированных кДНК нового рецептора, связывали [3Н]-аргмнин-вазотоцин в зависимости от дозы меченого лиганда. Константа диссоциации связывания составляла 2,49 нМ, а число участков связывания (Змакс) - 2.65 пмоль/мг белка (рис.3).

Эксперименты по ингибированию связывания [3Н]-зргинин-ваэотоцина с мембранами проводили в присутствии различных немеченых лигандов (табл.).

Табл. Ингибирование связывания [3Н]-аргинин-вазотоцина с мембранами СОБМО клеток, трансформированных кДНК клонированного рецептора, различными нойрогипофизарными гормонами.

В середине представлены аминокислотные последовательности гормонов (С - ами-дированные остатки глицина). Величины (С, определены в экспериментах по ингибиро-ванию связывания [3Н]-артнин-еазотоцина (рис.4), п-число экспериментов.

Гормоны Аминокислотные последовательности Ки(нМ)

Мезотоцин СУЮИСРХС* 0.63+0.24 (п=4)

Арг-еаэотоцин 1.33+0.11 (п=3)

Окситоцин СУЮИСРХЯ* 1.29+0.27 (п=4)

Арг-газопрессин СУЕ^СР!«;* 10.21+0 87 (п=3)

Гидрин 1 споясрясакя 118.07+10.7 (п=2)

Изотоцин СУ1БЫСР1в* 137.41+10.8 (п=4)

Гидрин 2 сУ1С>ис?1«;о 183.77+7.94 (п=3)

Из всех исследованных лигандов мезотоцин обладал наибольшей вытесняющей способностью при связывании с рецептором. Очевидно, что клонированный рецептор высокоспецифичен, и мезотоцин является его природным гормоном. В связи с этим новый рецептор был классифицирован, как мазотоциновый. Мезотоцин в 2 раза более эффективна вытесняет [3Н]-аргинин-вазотоцин при связывании с рецептором, чем окситоцин млекопитающих, хотя эти гормоны отличаются всего лишь одной заменой в положении 8: лейцина (окситоцин) на изопейцин (мезотоцин). Окситоци-

новый рецептор человека, например, не различает окситоцин и мезото-цин (мозотоцин и окситоцин в этом случае, в отличие от мезотоцинового рецептора, обладают одинаковой ингибирующей активностью: ¡Сео=1 ,76*109 М и 1С5о=1,86*10"э М, соответственно). Возможно, это является следствием различий последовательностей мезотоцинового рецептора жабы и окситоцинового рецептора человека в районах 2-ой и 3-ей экстрацеллюлярных петель, которые формируют участок связывания гормона на рецепторе. Аминокислотные замены, обнаруженные во второй экстрацаллюлярной петле мезотоцинового рецептора могут быть связаны с эволюционными изменениями, обеспечившими этому рецептору большее сродство к гормону мезотоцину по сравнению с изотоцином рыб. Основное значение в этом отношении имеет замена триптофана на аргинин, т.к. этот участок чрезвычайно важен для связывания гормона.

.Ы-и.

-И -10 -в -8 -7 -г -5

1оу[М| (неиячвный лига ид)

• Мьзатоцин д Окситсцм*

* Гидрим 2 ^ Арг-млопрвсси* » Арт-м.тотоцчи о Изотоцин

п Гидрин 1

Рис.4. Мигрирование связывания (3Н]-аргинин-вазотоцина (104 М) с мембранами СОЗМб клоюк, трлнсформироплнмых кДНК мезотоцинового рецептора жабы, немечеными нойрогипофизарныади гормонами. Приведенные данные продггааля-ют среднее двух параллельны* значений из 3 или -1 экспериментов

Аргинин-вазотоцин связывается'с мезотоциновым рецептором жабы всего в 2 раза хуже, чем мезотоцин, поэтому, очевидно, многие эффекты эр-гинин-вазотоцина у амфибий можно объяснить его действием нг> мезотоциновым рецептор. Способность аргинин-вазопрессина вытеснять [ЭН]-аргинин-вазотоцин при связывании с рецептором несколько меньше, чем у немеченых окситоцина и аргинин-вазотоцина. Наиболее низкой ингиби-рующей активностью обладают лиганды, имеющие добавочные аминокислоты на С-конце (гидрин 1 и гидрин 2), а также изотоцин, который имеет замену на серии в положении 4.

На принадлежность клонированного рецептора к рецепторам окси-тоцинового подсемейства указывает тот факт, что антагонист окситоци-нового рецептора млекопитающих

вазотоцин (DTA) вытесняет [3Н]-аргинин-вазотоцин при связывании с мезотоциновым рецептором с большей эффективностью (1Сбо= 1,28*10"® М), чем непептидный антагонист V2 вазопрессиновых рецепторов ОРС-31260 (^50=1*10"® М). Антагонист Vi вазопрессинового рецептора (СН:)5 КТирОМе/Ар^-вазопрессин также обладает значительной активностью (1050=3,21*10"® М).

Изучение системы вторичных посредников, связанной с мезотоциновым рецептором. Для выяснения связи мезотоцинового рецептора с активацией аденилатциклазы измеряли активность этого фермента при действии различных гормонов (рис.5). Эксперименты проводили с мембранами COSM6 клеток, трансформированных кДНК мезотоцинового рецептора. В ходе экспериментов не обнаружили увеличения количества цАМФ в ответ на действие мезотоцина до концентрации 10"® М, хотя изо-протеренол (10"? М) вызывал увеличение образования цАМФ в 3,4 раза.

В 3-ей внутриклеточной петле мезотоцинового рецептора расположены консервативные последовательности (RLKT и KIR), которые встречаются у всех известных \Л. и \Ль вазопрессиновых, окситоциновых и изо-тоцинового рецепторов. Эти последовательности, как предполагают, необходимы для связывания со специфическими G-белками, которые участвуют в активации фосфолипазы С. Ооциты Xonopus laevis в течение многих лет используются для экспрессии различных G-бепок-связь'пзющих рецепторов (Wleyerhof et al, 1988; Klmura et at, 1992; Sugimoto et al, 1994).

300 -

250 -

| 200 •

6 ' * 150 -

У

Г

Рис.5. Измерение активности аденилатциклазы а мембранах СОБМ8 клеток, трансформированных кДНК мезотоцинового рецептора жабы, при действии гормона мезотоцина. Количество цАМФ в отсутствие гормона принято за 100%. В качестве положительного контроля активации аденилатциклазы использовали изопро-теренол (10"т М) - агонист р-адренергических рецепторов.

Было показано, что в ооцитах, инъецированных мРНК рецепторов, связанных с активацией фосфолипазы С, под действием агонистов стимулируется высвобождение инозиттрифосфатов и ионов Са!\ что приводит к появлению хлоридных мембранных токов через Са2,-зависимые СГ-каналы в плазматической мембране (МопаЛу е{ а1, 1989). Регистрация этих токов служит тестом для измерения активности фосфолипазы С. Для проверки способности мезотоцинового рецептора действовать через ино-зиттрифосфатную систему вторичных посредников и стимулировать выброс внутриклеточного Са2* проводили экспрессию рецептора в ооцитах Хвпориз 1аву1$. кРНК мезотоцинового рецептора инъецировали в ооциты и измерения проводили через 72 часа. При этом регистрировали мембранные токи, идущие через мембрану ооцита, находящегося в буфере, в который добавляли различные лиганды.

МЕЗОТОЦИН (10-ЗМ) + МЕЗОТОЦИН(Ю*еМ) V2 антагонист (Ю^М)

МЕЗОТОЦИН (Ю-8М) + МЕЗОТОЦИН (W^M) + ОТ антагонист (10*М) \Л антагонист (1О^М)

1 мин

5

1 мин

г

100 «А

100 НА

Рис.8. Стимуляция Са*-зависимого мембранного тока з ооцитах Х«пориа JaaWe, инъецированных кРНК мезстоцинового рецептора яабы, при аппликации мвэо-тоцин». (10"* М) (А) и мезотоцина в присутствии антагонистов (10"* М): OTA (Б), ОРС-31280 (В) м (CHjJafTир(0ма),]арп1н1<н-ва9спроссина (Г).

Появление мембранных токов обнаружили в течение 1 минуты после добавления Ю"* М мезотоцина (рис.бА). Этот физиологический ответ был дозо-зависимым. Окситоцин и аргинин-вазотоцин обладали сходным эффектом, а эффект аргинин-вазопрессина был несколько меньше. Повторная аппликация гормона не вызывала ответа. Изотоцин, гидрин 1 и гмдрин 2 были в 3 раза менее активны, чем мезотоцин и окситоцин в тех же концентрациях. Контрольные ооциты (неинъецированные) не отвечали на аппликацию гормонов. Таким образом, было показано, что мезотоци-новый рецептор, как и другие рецепторы окситоцинового подсемейства, связан с инозиттрифоссЬаткой системой вторичного ответа.

Антагонист окситоцинового рецептора млекопитающих ЭТА в концентрации 10"6 М полностью ингибировал ответ, вызванный 10"8 М мозо-тоцином (рис.6Б), а Уг ваэопрессиновый антагонист ОРС-31260 не имел эффекта (рис.бВ). С другой стороны, антагонист \Л вазопрессинового рецептора ((СН2)5[(ТирОМэ)г]Арг8-вазопрессин) также уменьшал ответ на мазотоцим (рис.бГ). Данные по экспрессии мезотоцинового рецептора в ооцитах Хвпориз Шеуя хорошо согласуются с результатами радиоли-гандного связывания.

В экспериментах на изолирозанном мочевом пузыре амфибий было показано, что вазопрессин-подобные гормоны стимулируют обратное всасывание воды путем взаимодействия с рецепторами \/г типа и активации аденилатциклазы (11с1иугта, 1994). Однако, отсутствие активации аденилатциклазы и стимуляция Са2*-ззаисимых мембранных токов при экспрессии в ооцитах при связывании гормонов с мезотоциноаым рецептором указывают на то, что мззотоциновый рецептор не отвечает за антидиуретический эффект у амфибий. Кроме того, специфичность различных лигандов к мезотоциновому рецептору отличается от связывающей активности тех же лигандов с гидроосмотическим \/2 - подобным (вазото-циноаым) рецептором из мочевого пузыря жабы. Например, гидрин 2, наиболее активный пептид в увеличении содной проницаемости в мочевом пузыре, обладает лишь очень слабым сродством к мезотоциновому рецептору.

С другой стороны, было обнаружено, что аргинин-вэзопресслн стимулирует распад фосфоиноэитидов в мочевом пузыре амфибий, что, как (¡читают, связано с модулирующим действием гормона на обратное вса-сызагке воды (Натсчин и др., 1989). При активации инозиттрифосфатного

ответа в мочевом пузыре лягушки стимулируется синтез простаглаьдинов Е и арахидоновой кислоты, которые вызывают снижение гидроосмотической реакции на аргинин-вазопрессин (Рагпоуа, Р^боу, 1991; Порнова и др., 1994). VI антагонисты блокируют действие гормонов на накопление инозитолфосфатов (Уопо, Эайтига, 1989) и увеличивают вазопрессин-стимулируемый ответ на мочевом пузыре лягушки в низких концентрациях (^осЫп, 5(1акЬта1оуа, 1992; ОопсЪагеузкауа е! а1, 1995), что, вероятно, можно объяснить его действием на рецепторы, отличные от \/г - подобных рецепторов, связанных с активацией аденилатциклазы.

Антагонист VI вазопрессиновых рецепторов млекопитающих имеет значительную специфичность к мезотоциновому рецептору и ингибирует Са2*-зависимыа мембранные токи, вызываемые гормонами при экспрессии мезотоцинового рецептора в ооцитах. Можно предположить, что эффекты нейрогипофизарных гормонов на мочевом пузыре амфибий, связанные с активацией фосфолипазы С, - это результат взаимодействия гормонов с мезотоциновым рецептором. Очевидно, это взаимодействие может играть некоторую роль в модуляции гидроосмотического эффекта. Хотя и нельзя исключать возможности наличия в мочевом пузыре амфибий и других типов рецепторов, подобных V! вазопрессиновым рецепторам млекопитающих и также связанных с активацией инозиттрифосфат-ной сигнальной системой.

Различие в экспрессии мРНК мезотоцинового рецептора в разных тканях жабы. Методом Нозерн-блоттинга показали присутствие транскрипта гена мезотоцинового рецептора размером 3,9 кб в мРНК почек и мышц. Слабый ответ наблюдали и в мозгу жабы. Используя ревертазную полимеразную цепную реакцию, показали наличие мРНК мезотоцинового рецептора не только в мочевом пузыре (где ответ был самым сильным), но и в почках и (в меньшей степени) в мышцах и мозгу (рис.7).

Таким образом, с помощью двух независимых методов выявили наличие экспрессии мРНК мезотоцинового рецептопа в мочевом пузыре, почках, скелетных мышцах и мозгу жабы. В эи днях взаимодействие гормона с рецептором может приводить к разнообразным эффектам. В клубочках почки амфибий обнаружен рецептор, связанный с активацией фос.?* -липазы С и подобный \/1Ь рецептору млекопитающих (Аттаг «1 а1, 1394). Показано, что меяотоцин обладает диуретическим эффектом в почке амфибий, но не связан с процессами рвабсорбции воды в собира-

тольных трубках (НаЛог^ет, БиГОег, 1990). Возможно, диуретический эффект мезотоцина в почке обусловлен его связыванием с мезотоцино-вым рецептором клубочка, что приводит к увеличению фильтрации.

к.ЦНК мРНК

Рис.7. Характеристика экспрессии мРНК мезотоцинового рецептора в различных тканях жабы Bufo marlnus методом ровертазной ПЦР. Электрофорез ПЦР проб в геле (1% агароза) и Сазерн-блоттинг с меченым специфическим олигонуилеотидом. Первые 6 проб - предстазляют реакцию ПЦР на кДНК, как матрице; пробы 7 -12 - ПЦР на мРНК. Слева указан размер фрагмента ПЦР.

Тот факт, что мезотоцин обладает свойствами окситоцина, указывает на то, что его действие может быть вовлечено в функции размножения у амфибий. При этом регуляция полевого поведения может осуществляться и при взаимодействии с меэотоциновыми рецепторами мозга. Специфичные рецепторы, обладающие значительным сродством к мезо-тоцину и артонин-вазотоцину, были обнаружены в районах мозга, отвечающих за контроль полового поведения, у амфибий (Tripp, Moore, 1933). Изучение обпасти предполагаемого интрона в гене мезотоцинового рацоптора жабы. То, что в мочевом пузыре жабы сначала была обнаружена молекула мРНК рецептора с необычным районом 7-го транемзм-бранного домона, позволило предположить, что в данном случае может имить место отсутствие сплайсинга или альтернативный сплайсинг молекулы РНК, приводящий к появлению нефункционального рецептора. И с-

ходя из этого, заключили, что в этой области расположен интрон, обнаруженный также в генах других представителей окситоцин/ вазопрессино-вого семейства рецепторов. В связи с этим проводили поли.-.'оразную цепную реакцию на геномной ДНК жабы с двумя специфическими прай-мерами, расположенными по краям предполагаемого интрона. Однако, полученный в ходе экспериментов фрагмент имел тот же. молекулярный вес, что и фрагмент, полученный в полимеразной цепной реакции с теми же праймерами из кДНК. Таким образом, наличие интрона в данной области спорно, либо он - небольшого размера (менее 30 пн). Поэтому объяснить появление молекулы с большим чужеродным З'-концом (> 1 кб), не имеющим никакой гомологии с последовательностью рецептора, нельзя, основываясь на гипотезе альтернативного сплайсинга. Образование молекул мРНК мезотоцинового рецептора различной длины может происходить при наличие в геноме нескольких сайтов полиаденилирования. Возможно, при синтезе кДНК с мРНК большой длины молекула мРНК образует шпильку, захватывающую область 7-го трансмембранного домена; чго приводит к образованию молекулы кДНК с измененным З'-концом. Данное предположение требует дальнейших исследований на геномной ДНК жабы.

Сравнение аминокислотной последовательности клонированного рецептора с последовательностями других представителей оксито-цин/вазопрессинового семейства показало, что новый рецептор имеет самую большую степень гомологии с окситоциновыми рецепторами млекопитающих (70%) и с изотоциновым рецептором рыб (66%). Меньшую степень гомологии он имеет с ваэотоциновым рецептором рыб (52%), с вазопрессиновыми рецепторами млекопитающих VI типа (47%), с вазо-прессиновыми рецепторами млекопитающих типа (38%) и с конопрес-синовым рецептором моллюска (/.утпава г(адпаНэ) (уапКез1егеп, 1995) (36%). На основании сравнительного анализа аминокислотных последовательностей было построено эволюционное древо, представленное на рис.8.

Очевидно, что клонированный рецептор входит а подсемейство ок-ситоциновых рецепторов наряду с окситоциновыми рецепторами млеко-питк« 'цих и изотоциновым рецептором рыб.

С

жМТР кйтр чОТР сОТР рИТР чУ1вР

чУЦР рВТР кУ2Р

сУгР бV2P 18КР

Рис.Б. Филогенетическое древо рецепторов номапептидных гормонов (согласно иРйМА методу): мезотсцинового рецептора жабы (жМТР), окситоциновых рецепторов крысы (кОТР), свиньи (сОТР) и человека (чОТР); изотоцинового рецептора рыб (рИТР); У« вазопрассинового рецептора человека (ч''У>йР); VI, вазопресси-Н05ЫХ рецепторов крысы (к\Л,Р) и человека (чУ„Р); вазотоцинового рецептора рыб (рВТР); \/2 вазопрессиновых рецепторов крысы (кУ2Р), человека (чУгР) и быка (б\/гР) и лизин-конопрессинового рецептора улитки (ЬБКР). Структура древа и длина вотввй характеризуют эволюционное родство рецепторов.

Другое подсемейство окситоцин/вагопрессиновых рецепторов составляют оазопрессиновые рецепторы \А„ и типов и вазотоцинозый рецептор рыб, а третью группу образуют вазопрессиновые рецепторы Ур. типа. Конопрессиновый рецептор улитки обладает наименьшей гомологией со всеми остальными рецепторами этого семейства. Очевидно, ген рецептора моллюсков отделился рано в процессе эволюции перед разделением генов других пептидных рецепторов. Разделение на скситоцин-и вазопрессин-подобные рецепторы произошло, вероятно, у предков круглоротых перед отделением хрящевых рыб. На основании различия аминокислотных последовательностей окситоцин-подобных рецепторов можно сделать вывод, что изотоциновый рецептор костистых рыб является предшественником всех остальных рецепторов окситоциновогс типа. Изотоциновый и меэотоциновый рецепторы разделились в процессе эво-

люции в результате дупликации гена - предшественника до разделения меэотоцинового рецептора и окситоциновых рецепторов млекопитающих.

Появление мсзотоцина и его рецептора у амфибий может свидетельствовать о связи этого гормона с приспособлением организма к наземным условиям существования.

ВЫВОДЫ

1. Из мочевого пузыря жабы Bufo marinus была клонирована последовательность кДНК рецептора, относящегося к окситоцин/вазопрессиновому семейству. кДНК клонированного рецептора содержит консервативные последовательности, характерные для всех известных представителей этого семейства.

2. Установленная амкнокислотнал последовательность нового рецептора имеет наибольшую степень гомология с рецепторами окситоцина млекопитающих (70%) и изотоцина костистых рыб (66%), что позволяет отнес;и его в группу окситоцинового подсемейства.

3. По своим фармакологическим свойствам клонированный рецептор при его экспрессии в клетках млекопитающих является высокоаффинным. Мезотоцин (К,=0,63 нМ), аргинин-вазотоцин (K«=1,38 нМ) и окситоцин (К„=1,29 нМ) вытесняют [3Н]-аргинин-вазотоцин с участка связывания рецептора с большой эффективностью. Очевидно, мезотоцин явтется природным лигандом клонированного рецептора, а сам рецептор может быть классифицирован, как мезотоциновый.

4. Связывания мезотоцина с его рецептором не вызывает активации аде-нилатциклазы, но стимулирует появление Сг^-зависимых мембранных токов при экспрессии рецептора а ооцитах Xenopus laovis. Этот эффект блокируется антагонистами окситоцинового и Vi вазопрэссинового рецепторов млекопитающих. Очевидно, действие мезотоцинового рецептора осуществляется через инозиттрифосфатную/кальциевую сигнальную систему.

5. мРНК мезотоцинового рецептора экспрессирувтся в мочевом пузыре, почке, скелетных мышцах и мозгу жабы, что свидетельствует о возможной ф^циональной роли мезотоцина в этих тканях.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Akhundova A., Gorbulev V., Getmanova Е„ Eggena P., Fahrenholz F. (1994) The cloning of an amphibian receptor from the vasopressin/oxytocin family. Biol.Chem.Hoppe-Seylor, V.375, Sp.Suppl. (Abstr.Fall Meeting/Gesellschaft fur Biol.Chem., Wurzburg, Sep.19-21,1994), p. 27.

2. Гетманова E.B., Ахундова А., Горбулез В.Г.,. Фаренгольц Ф. (1995) Функциональная характеристика клонированного рецептора вазотоцино-вого типа из мочевого пузыря жабы Bufo marinus. 'Физиология почки и водно-солевого обмена". Симп., посвящ. 100-летию А.Г.Гинецинского, Новосибирск, 13-15 июня 1995 г., Тез.докл., с. 21.

3. Akhundova A., Getmanova Е., Gorbulev V., Carnazzi Е., Eggena P., Fahrenholz F. (1996) Cloning and functional characterization of the amphibian mesotocin receptor, a member of the oxytocin/vasopressin receptor superfamily. Eur.J.Biochem., V.237, N3, 759-767.