Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия рекомбинантного низкоаффинного Fc рецептора иммуноглобулина Е человека в ESCHERICHIA COLI и клетках млекопитающих

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия рекомбинантного низкоаффинного Fc рецептора иммуноглобулина Е человека в ESCHERICHIA COLI и клетках млекопитающих"

г; . ол

АО "БИОТЕХНОЛОГИЯ"

i Ч Ц\Р ^J ''-

\ О HAI ■ ИНСТИТУТ БИОТЕХНОЛОГИИ

На правах рукописи

КАЙГОРОДОВ

Владимир Анатольевич

ЭКСПРЕССИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО НИЗКОАФФИННОГО

Fe РЕЦЕПТОРА ИММУНОГЛОБУЛИНА Е ЧЕЛОВЕКА В ESCHERICHIA COLI И В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ.

03.00.03.- Молекулярная биология

Автореферат диссертации яа соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1S96

Работа выполнена в Ла'о-^раюрни ко Биотехнологии.

-;уляр-1си биоигсполопт ¿шлнть.

Научлын рЗ'ковод!ггель:

доктор биологических наук,

профессор

Р.Г. Василов.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А.Г.Габибов, ИМБ РАН.

доктор биологических наук Л. П. Алексеев, Институт Иммунологии

Ведущая организации:

Инспггут Биоорганической химии • -юч.М.М.Шекяюша и Ю< А. Овчинникова.

Защита состоится "Ф4^/^^ 1996 г. в // час на заседании« . диссертационного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии имени В.А.Энгельгардта РАН по адресу: .

117984, г. Москва, ул. Вавилова, д.32. .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

А.М.Крицын.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Широкая распространенность аллергических заболеваний обуславливает актуальность изучения механизмов регуляции биосшггеза иммуноглобулина Е (^Е) - ключевого компонента реакций пшерчувствительностн немедленного типа. Одной- нз молекул, влияющих на уровень биосшггеза ^Е является ннзкоаффинный рецептор Рс-фрагмента 1§Е человека (РсЕШ!) Фе^реззе С., а1„ 1992). Некоторые моноклональные антитела к-РсЕШ! способны супресслровать продукцию 1дЕ (ВаппеГоу J.-Y., еЬ а!., 1990). Такой же активностью, обладает и один нз фрагментов этого рецептора (Байаи М., еЬ а1., 1992). Кроме того, сообщалось о способности фрагментов FcER.II влиять на рост и процессы дифференцировки различных субпопуляций клеток крови в том числе и на развитие лейкозных клонов Ше^резэе С., е1 а!., 1992). Однако, труднодоступность природного белка чрезвычайно усложняет изучение структуры и функций этого рецептора, поэтому механизмы, лежащие в основе описанных феноменов, остаются невыясненными. Интенсивное исследование структуры и биологических свойств FcER.II требует разработки способов его получения в необходимом количестве. Получение рекомбинанпшх препаратов различных молекул иммунной системы является одним из подходов к изучению их строения и функциональной роли в организме и, кроме того, это единственный путь получения достаточного для целей науки и медицины количества: этого препарата, необходимого для разработки новых, методов диагностики и лечения. Целью данной работы было изучеиие возможности эффективной экспрессии кДНК низкоаффинного Рс-рецептора ^Е человека (СБ23) в прокариотических и в животных клетках.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. 1.Разработка системы для экспрессии ^Е-связывающего фактора (5СБ23) человека в клетках Е.еоН. 2. Изучение экспрессии РсЕШ1/СБ23 в различных клеточных линиях. 3. Экспрессия рекомбннантного СБ23 и его фрагментов в клетках млекопитающих.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

В данной работе описаны различные системы для экспрессии кДНК низкоаффинного Рс-рецепгора ^Е человека (СБ23) и его биологически активных фрагментов- иС023). Впервые получен рекомбинантный препарат бС023 в виде гибридного белка в клетках Е.соН с достаточно большим выходом (около 10-15% от суммарного клеточного белка ) и разработан метод его выделения и очистки. Данный препарат может быть использован для получения

моноклональных акпг. ,л и разработки диагиостикумоа. Клонированная ранее в нашей лаборатории кДНК была использована для получения высокоспецифичного зонда, с помощью которого выявлен полиморфизм хромосомного гена РсЕКП в ряде клеточных линнй человека. Впервые показано, что отсутствие поверхностной экспрессии FcER.II в одной из исследованных клеточных линий связало с делецией геномных последовательностей, кодирующих рецептор. Впервые' в клетках мышиной миеломы X63.Ag8.653 экспрессирована мембранная Ь-форма человеческого СБ23 и получена экспрессия рекомбинантного 29кДа фрагмента СБ23 в виде секретируемого белка. Различные варианты рекомбинантного С023 необходимы для изучения механизмов регуляции биосинтеза ^Е и ряда других биологических процессов, а также для конструирования на их основе аналогов с измененной физиологической активностью, которые могут иметь потенциальное клиническое применение в терапии ряда патологических состояний иммунной системы, в частности, при лечении аллергических заболеваний.

ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Способ экспрессии ^Е-связывающего фактора (эСБ23) человека в клетках Е.соН, структура полученного рекомбинантного продукта.

2. Полиморфизм гена РсЕЯЦ в геноме различных клеточных линий человека.

3. Способ экспрессии различных форм СБ23'человека в клетках мышиной миеломы X63.Ag8.653.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ: Результаты работы доложены на XV конгрессе Европейской академии аллергологии и клинической иммунологии (Париж, 1992), на ежегодном собрании Европеской академии аллергологии и клинической иммунологии ( Роттердам, 1993).

ПУБЛИКАЦИИ: По материалам диссертации, опубликовано 6 печатных работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ: Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 123 работы. Диссертация изложена на 104 страницах, содержит 17 рисунков и 5 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Низкоаффинный Fc-рецептор иммуноглобулина Е человека (FcERll или CD23), представляет собой 45 кДа трансмембраннын одноцепочсчиый гликопротеин второго типа, состоящий из 321 аминокислотного остатка. Выявлены две формы мембранной молекулы, которые отличаются 7/6 N-концевыми амгаюклслотными остатками: а-форма (NHj-Met-Glu-GIu-Gly-Gln-Tyr-Ser) и b-форма (NH2-Met-Asn-Pro-Pro-Ser-Gln) Этот белок обнаруживается на самых разных клетках иммунной системы, с поверхности которых он постоянно высвобождается в виде так называемых растворимых фрагментов, сохраняющих способность связывать IgE и называемых поэтому IgE-связывающими факторами (IgE-BF) или растворимым CD23 (sCD23). Сначала CD23 расщепляется в области аминокислотных остатков Gln-81 или Leu-102 с образованием промежуточных 37кДа и ЗЗкДа фрагментов, дальнейшее расщепление которых в области Met-150 приводит к образованию стабильной 25кДа молекулы. Расщепление CD23 происходит главным образом на клеточной поверхности вероятно путем автопротеолиза. К настоящему времени для CD23 и его растворимых фрагментов описано множество функций. На моноцитах/макрофагах, тромбоцитах и эозинофилах FcERll участвует в IgE-зависимых цитотоксических реакциях, а также в процессах, вызывающих выделение этими клетками медиаторов и цитокинов. На B-клетках, FcERll опосредует lgE-зависимую презентацию антигена Т-лимфоцитам, и, кроме того, • регулирует активацию и дифференцировку B-лимфоцитов в иммундглобулин-продуцирующие клетки. Растворимый CD23 (IgE-Bf) являемся многофункциональной молекулой, которая оказывает влияние на синтез IgE ш vitro, на пролиферацию Т-клеток, ингибирует миграцию моноцитов, а Совместно с ИЛ-1 способствует дифференцировке ранта ткмотггов и миелоидиых предшественников. Кроме того, этот белок предотвращает апоптоз (самоуничтожение) B-лимфоцитов зародышевых центров. В одной из последних работ обнаружено, что обработка туникамкшшом (ингибитор N-гликозилирования) клеток, несущих на поверхности CD23, приводит .к. образованию 16кДа IgE-BF, обладающего ярко выраженной lgE-супрессирующей активностью. Общепринятые представления о структуре CD23 схематически показаны на рисунке 1.

Рвсуиок i. Предполагаемая структура CD23.

Стрелки - сайты протеолитического расщепления, ведущего к образованию IgE-связывающих факторов указанной М.ш.

1.ЭКСПРЕССИЯ IgE-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ФАКТОРА (sCD23) ЧЕЛОВЕКА В КЛЕТКАХ ESCHERICHIA СОЦ.

Для получения рекомбинантного препарата CD23 была использована ранее клонированная нами кДНК, кодирующая полную аминокислотную после--довательность CD23. Методом полимеразной цегаюй реакции из нее была получена кДНК не содержащая нетранслируемых областей, которые, как известно, могут оказывать влияние на стабильность как- генетической конструкции, так и соответствующей мРНК. Эта кДНК на расстоянии 50 пар оснований от начала 25 кДа IgE-BF содержит уникальный сайт Hind III, который и был использован для получения фрагмента гена, кодирующего растворимый CD23. Этот фрагмент был клонирован в экспрессионную плазмиду pBT-IL-3-10. Ранге данная конструкция была использовала для получения гибридного белка ИЛ-3-10 с очень высоким уровнем экспрессии.

pBT-L-5C!)23 —0-fOmi.H ^

[>nr-sCD23 —10Щ-1 rhsjat'gI сптГУ*-pBT-lL3-sCD23-Ш0И1<ВЯЗЛТ-С| IL4 I »CI >23 )->

Рисунок 2. Схемы конструкций использованных для экспрессии sCD23. Ptac - промотор, О - операторный участок связывания lae-penpeccopa, RBS -сайт связывания рибосом гена белка 10 фага Т7, ATG - стартовый кодсн, OmpF - фрагмент гена OmpF содержащий"5-нетранслируемую последовательность и лидерный пептид белка OmpF Hxoli, IL3 - фрагмент (177п.о.) гена ИЛЗ человека, ori pBR322 - начало репликации,

Клонирование фрагмента CD23 по внутреннему сайту HindIII позволило соединить последовательность CD23 с последовательностью интерлейкина 3 (ИЛ-3) с сохранением рамки считывания без дополнительных манипуляций. Встроенный фрагмент кодирует С-концевую часть CD23, начиная с Glu-133 и включает в себя 25 кДа IgE-BF, который начинается с Met-150. Таким образом, полученная конструкция кодирует гибридный полипелтид IL-3-sCD23, состоящий из 62 аминокислотных остатков Ы-концевого домена ИЛ-3 и 188 остатков С-концевого домена CD23. Полученной плазмидой pBT-IL-3-sCD23 (схема представлена на рис.2) трансформировали клетки E.coli JM 109 и исследозали уровень экспрессии рекомбинатггного белка в условиях репрессии и дерепрессии tac-промотора. Культуру клеток выращивали- при 37°С в среде LB до А500 = 1 ед, шщуцировали продукцию добавлением ИПТГ и производили отбор проб через различные промежутки времени. Уровень продукции

рекомбннаптного белка анализировали методом электрофореза в ПАЛГ в присутствии ДСН. Результаты представлены на рнс.З.

кДа

94.0 67.0

'43.0 30.0

20.1 14.4

Рисунок.. 3. Электрофореграмма суммарного клеточного белка' штамма E.coli JM109 (pBT-IL-3-sCD23).

1 - штамм JM109 без плазмиды (контрольный препарат); 2 - JM109 (pBT-IL-3-sCD23) до кндукцик; 3 - через ЗОмин. после добавления ИПТГ; 4 - через 1 час; 5 - через 2 часа; 6 - через 3 часа; 7 - через 4 часа.

Из рисунка видно, что в процессе инкубации наблюдается появление двух продуктов с молекулярным весом около 32 кДа и 24 кДа, причем на более ранних стадиях инкубации преимущественно образуется полипеппш большего размера, но к четвертому часу инкубации их соотношение становится практически равным, а суммарное количество достигает 20-25% от общего содержания белка.

Для идентификации рекомбинактного продукта использовали аффинко очищенные поликлональные кроличьи антитела к химически синтезированному пептиду из N-концевой области 25кДа IgE-BF. Данный пептид (от Gly-178 до Glu-195) был выбран с помощью компьютерной программы для предсказания антигенных детерминант белковой молекулы по ее аминокислотной последовательности разработанной П.Жилкиньш (НПО "Вектор").

Испольэоватю антнсыворотки к пептиду связано с отсутствием коммерческих антител необходимой специфичности реагирующих' с денатур;|рор:ш11ым CD23. Результаты иммуноблотпшга бактериальны:-. лнзатов привед'-ны на рисунке 4,Д.

Рисунок 4. Иммуноблоттинг.

А - лизат клеток; JM109 (PBT-IL-3-sCD23); Б - лизат клеток JM109 (pBT-IL-J-10), взятый в качестве контроля на специфичность антител, ^ (. па электрофореграмме лнзата в области 28кДа хорошо заметен гибридный белок ИЛ-3-10 ); 1 - блот проявле1шый амидовым черным; 2 - блот проявленный антителам к пептидному фрагменту CD23; 3 - блот проявленный нормальной сывороткой кролика.

Хорошо заметно, что антитела к пептиду выявляют в грубом лизате клеток только рекомбтгантный белок (дорожка 2), причем одинаково сильно взаимодействуют с обеими полосами, тогда как нормальная кроличья сыворотка, взаимодействуя с рядом бактериальных белков (дорожка 3), не реагирует с рекомбтггнтным продуктом. В качестве контроля на специфичность связывания антител (рис.4,Б) использовался тот же штамм Е.соН, несущий аналогичную- зкспрессионную плазмиду, в которую вместо фрагмента гена CD23 клонирован ген ИЛ-10. Определение N-концевой аминокислотной последовательности показало, что оба продукта имеот на N-конце одинаковую структуру N-Met-Ala-Pro-Met-Thr-Gln, полностью совпадающую с аминоко:гцегой последовательностью ИЛ-3.

Интересно стх ^пгть, что молекулярная масса гибридного белка рассчитанная, как сумма аминокислотных остатков, составляет 28 кДа, тогда как на электрофореграмме рекомбинантньш продукт обнаруживается в виде двух полос с кажущимися молекулярными массами около 32 и 24 кДа. Исходя из предположения об аномальной подвижности белка, что вполне может иметь место, например, из-за повышенного содержания в нем пролина (8% от общего числа аминокислотных остатков), мы считаем, что верхняя полоса (32кДа) соответствует полноразмерному гибридному белку, тогда как нижняя полоса (24кДа), скорее всего, является продуктом протеолиза, причем сайт протеолитического расщепления по всей видимости расположен в С-концевой части молекулы. Это явление представляет значительный интерес, поскольку описан вариант зСЮ23 образующийся при обработке эукариотических клеток ингибитором гликозилирования (туникамицин), у которого отсутствует С-концевой фрагмент примерно такого же размера. Аномальная подвижность гибридного белка по всей видимости связана именно с С023, поскольку подвижность гибридного белка 11.-3-10 в тех же условиях вполне соответствует расчетной величине.

На основании предположения, что гибридный белок формирует тельца •' включения, мы использовали ■ следующий метод очистки препарата.' Клетки разрушали в присутствии лизодима и деэоксихолевой кислоты и разделяли лмзат центрифугированием - Анализ супернатанта и осадка показал, что весь рекомбинантньш белок находится в нерастворимой форме (рис.5, дорожки 1,2,3). Для дополнительной очистки осадок последовательно промывали растворами с возрастающей концентрацией гуа»:идин-НС1 (от 1 до 3 М). Потери рекомбтшпкого продукта при такой схеме составляли менее 20 %, а содержание белковых примесей по данным электрофореза снижалось до 10% (рис.5, дорожки 4-9).

Солюбилизацию телец включения осуществляли путем растворения осадка в 6 М гуанидин-НС1, забуференном 0.1М трис-НС1 рН 9.0 с 0.2М дитио-трейтола при 37°С- Предполагается, что при данных условиях весь белок находится в полностью денатур]грованном виде. Для ренатурации рекомбинантного продукта полученный раствор кгдленно в течение 1 часа разбавляли буфером, сскр.кащим 1 М гу анилин-НО до конечной концентрации гуаиидин-НС! 1.33 ¿1. Далее диалнзовали в течении ночк проти:

кДа

ЖРШР

- 94.0

- 67.0

- 43.0

- 30.0

- 20.1 - 14.4

Рисунок 5. Выделение рекомбинантного препарата из из клеток E.coh JM109 (pBT-IL-3-sCD23).

1 - электрофореграмма исходного лизата; 2 и 3 - супернатант и осадок •исходного' лизата, йидно," что практически весь рехомбинантнын белок находится в осадке; 4 и 5 - супернатант и осадок рекомбинантного препарата промытого буфером с~ 1М-1уанидин-С1; 6 и 7 - супернатант и осадок препарата промытого буфером с 2М 1уанидин-С1; 8 и 9 - супернатапг и осадок препарата промытого буфером с ЗМ гуанидин-С1.

3 объемов буфера с 0.5М 1уанидин-НС1, при этом концентрация туанидин-НС! медленно снижалась до 0.7М. Попытки ускорить процесс ренатурации образца путем разбавления или диализа против меньших концентраций гуанидин-НС1 приводили к выпадению в осадок до 90% рекомбинантного продукта. Далее в течение 4ч проводился диализ против 6 объемов 0.3 М гуанидин-HCl и ¡¡счерпывающий диализ против 150 мМ NaCl, забуференного 10 мМ трис-HCI с рН 8.0. В процессе ренатурации происходила дополнительная очистка препарата, но при этом около 25 % белка соосаждалось с примесями. На последней стадии очистки препарат представлял собой раствор белка с общим содержанием рекомбинантного продукта более 90%. Результаты электрофореза

1 2 3 Fl f

Ii i

IV" j;

1Г '

кДа

- 94.0

- 67.0 -43.0

- 30.0

•20.1

•ил

L.Z-:

Рисунок 6. Анализ выделенного из клеток E.coli JM109 (pBT-lL-3-sCD23) рекомбинантного препарата.

1 - электрофореграмма; 2 - блот проявленный антителами к пептидному фрагменту CD23; 3 - блот проявленный нормальной сывороткой кролика.

и иммуноблоттинга выделенного препарата представлены на рис.6. Из рисунка видно, что препарат (дорожка 1) представляет собой смесь двух полипептидов с молекулярными массами о.коло 24 и 32 кДа в примерно равном количестве.. Оба полипептнда связываются со специфическими кроличьими антителами к пептидному фрагменту sCD23 (дорожка 2), тогда как нормальная сыворотка кролика (дорожка 3) с препаратом не реагирует.

Следует отметить, что предпринятые нами попытки получения прямой экспрессии зрелого белка sCD23 (25 кДа) оказались неудачными. Ген sCD23 был клонирован в плазмиду pBTIL-З под контролем tac-промотора и RBS белка 10 фага Т7, а также в плазмиду pBT-hEGF в виде "гибрида" с геном лидерной последовательности белка OmpF. Первый вариант (pBT-sCD23) должен был обеспечить экспрессию белка в цитоплазму, второй (pBT-L-sCD23) - в периплазму клеток E.coli. Однако в обоих случаях мы не смогли обнаружить рекомбинантного продукта в штаммах E.coli, несущих эти рекомбинаитные плазмнды. По-видимому, в цитоплазме E.coli белок sCD23 подвергается интенсивному протсолизу, а при продукции в периплазму оказывает токсическое действие, чти приводит к лизису клеток E.coli при индукции его биосинтеза. Схемы получанных плазмид прадп явлены па рис.:"

Таким образом, иами разработана система для экспрессии sCD23 человека в клетках E.coli' в виде гибридного белка с аминоконцевым доменом человеческого IL3 и с выходом около 10-15% от общего клеточного белка. Рекомбннантный продукт представлен двумя полипентидамн с молекулярной массой около 24 и 32 кДа. Иммунологический анализ и определение N-концевой аминокислотной последовательности данных полипептидов свидетельствуют о том, что белок с молекулярной массой 24 кДа является продуктом протеолиза полноразмерного (32 кДа) гибридного белка. Полученный препарат может быть использован для получения моноклональных антител и разработки тест-систем на sCD23. Модификация конструкции, путем создания в гибридном белке сайта для высокоспецифической протеазы, позволит получать различные фрагменты CD23 без дополнительных последовательностей и разработать для них способ восстановления нативной структуры белка.

2. ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА FcERIl/CD23 В РАЗЛИЧНЫХ ЛИНИЯХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА.

В отличие от клеточных линий, полученных путем трансформации вирусом Этптейн-Барр in vitro, аналогичные клеточные линии трансформированные этим же вирусом in vivo (так'называемые лимфомы Беркита) практически не зкспрессируют' FcERII. Таким образом, данные лимфомы являются весьма интересным объектом в плане изучения биологической активности CD23 и процессов регуляции экспрессии этой молекулы. Для изучения этого феномена нами было проведено рестриктное картирование гена рецептора в различных клеточных лшотях. В качестве зонда использовалась биотинилированная кДНК CD23, полученная с помощью фотоактивируемого производного биотина, химическая формула которого приведена на рисунке 7.

фотоактнвируемая линкер остаток

группа биотина

О

о

Рисунок 7. Структурная формула фатсбистина.

Подбор условий биотинилнрования проводили с использованием рекомбинантнои плаэмнды р12Ш (р13С19, содержащая кДНК СЬ23) путем подбора оптимального весового соотношения компонентов и условий облучения. Полученные препараты проверяли путем нанесения на нитроцелюлозные фильтры и последующей детекции коньюгатом авидин - полимерная пероксидаза. Образцы ДНК с максимальной степенью биотшшлирования проверяли методом дот гибр1Ш!зация, используя в , качестве зондов. Чувствительность детекции достигала 50 пг в точке. Замена коньюгата стретавидин-полизчерная пероксидаза на конъюгат авндин-щелочная фосфатаза позволила повысить чувствительность детекции до 1 пг ДНК клона р121Е1 на точку, что соответствует результатам, полученным в других лабораториях и является достаточным для детекции однокошшного гена рецептора в геноме человека.

Поверхностную экспрессию СП23 изучали в четырех В-клеточных линиях ЯРМ18866, Баи<31, Катала, На^ и одной промиеломоноцитарной линии 13937 иммунофлюоресц ситными методами с помощью проточного цитофлуориметра РЛСБсап и разлзякых моноклональных антител к С023 (МНМ6, Ьеи20, 1Ш50). Результаты приведены в таблице 1. Они полностью совпадают с опубликованным! данными. • • • •

Таблица 1. Поверхностная экспрессия СБ23 в различных клеточных линиях

человека.

№ Клеточная Экспрессия CD23 Примечания

линия лит. дан. опыт

1 RPMI8866 + + В-клеточная трансф. in vitro вирусом ЭБ

2 U937 + + промиеломоно-цитарная. Вирус ЭБ (-)

3 Raj! +/- ? В-кл. лимфома. Беркита. Вирус ЭБ (+)

4 Daudi - то же, вирус ЭБ (+)

5 Namalva - . то же, вирус ЭБ (-) "

Анализ геномной ДНК вышеперечисленных ¡снеточных линий с использованием биоилпимровянной кДНК СР23 в ¡сачестве зонда проводили путем

картирования участков расщепляемых эндонуклеазами рестрикции. Для этого выделяли из клеток геномную ДНК, аликвоты которой обрабатывали эндонуклеазамн рестрикции ЕсоШ или ВашН1. Полученные смеси фрагментов разделяли электрофорезом в агарозном геле, переносили на нейлоновую мембрану и гибридизовали с биотинилированной кДНК С023 . В качестве маркеров молекулярной массы использовали биотинилированные фрагменты фага X, расщепленного ресгриктазой НтсПП. Полученные результаты схемапгчески представлены на рисунке 8.

ЕсоИ ВатН!

6 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

23130 - — — —

9416 6 557 - — — — — -

4 361 - • - • — - —.

2322 2027 —

Рисунок 8. Гибридизация по Саузерну геномной ДНК различных клеточных линий с биотинилированным зондом (схема)

1. ЯРМ18866 2. 1)937 3. Яа^ 4. №та1уа 5. Баий 6. Маркеры молекулярной массы (Х/Шос1 III). '

Ранее, Сатер с соавт. провели сравнительный ресгрикционный анализ ДНК из плаценты человека и из линии 11РМ18866 с помощью радиоактивно меченой кДНК С023 и рестриктаз ЕсоШ, ВатН1 и РбИ. В результате был обнаружен некоторый полиморфизм длины рестрикпгых фрагментов, образующихся под действием эндонуклеазы РгЫ. Структура геномного гена РсЕШ1 в клеточной линии ЯРМ1885б, выявленная нами, полностью совпадает с данными этих исследователей. ■

Дополнительиая высокомолекулярная полоса (30 т.п.о.) в наших результатах может быть артефактом, связанным с условиями электорофорсза или неполной рестрикцией. В остальных клеточных линиях нами был обнаружен некоторый полиморфизм рестриктных фрагментов, образующихся под действием EcoRI. Фрагмент ДНК размером 20 тыс. п.о., гибркдизующпйся с кДНК FcERII детектировался во всех меточных линиях (искл." Daudi). Однако при расщеплении ДНК из линий U937 и Namalva образовывалось два и' один дополнительный фрагмент соответственно (см. рис.8). Не исключено, что образование этих фрагментов является следствием возникновения в результате спонтанных мутаций дополнительных сайтов рестрикции EcoRI в одном из аллелей гена CD23 в этих линиях клеток. С другой стороны, особенности самого фермента EcoRI (например "звездная" активность), которые проявляются при длительных инкубааиях, также ;-:ог\~г привести к появлению дополнительных рестриктных фрагментов. Количество фрагментов гена FcERII, образующихся под действием BamUI у всех линий (искл.Daudi) одинаково. Однако размер их варьирует, что может быть связано со вставками или делениями ДНК как в соответствующих участках самого гена, так и в прилегающих областях. В геномной ДНК линии Dandi нам не удалось обнаружить каких-либо последовательностей, габридизующихся с кДНК CD23. Принимая во внимание хорошо известное обстоятельство, что клетки таких линий никогда не обладают нормальным диплоидным кариотипом, этот факт легко объяснить потерей данной линией 19 хромосомы или делецией ее соответствующего участка.

Таким образом, проведенное изучение поверхностной экспрессии FcERII и структуры гена этого рецептора в различных клеточных линиях позволяет

с"

сделать заключение о том, что отсутствие поверхностной экспрессии в одном из исследованных случаев - лини: Daudi вызвано потерей геномных последовательностей, кодирующих этот гликопротеин.

3. ЭКСПРЕССИЯ МЕМБРАННОЙ b-ФОРМЫ И 29кДа ФРАГМЕНТА CD23 ЧЕЛОВЕКА В КЛЕТКАХ МЫШИНОЙ МИЕЛОМЫ X63.Ag8.653.

Разработка системы экспрессии -'.ДНК CD23 в животных клетках связана с работами по направленному мутагенезу молекулы с целью ее структурно-

функционального исследования. Для С023 показано, что углеводная часть молекулы оказывает существенное влияние на ее функциональную активность, поэтому очевидна, что белок полученный в бактериях, дрожжах, а также в клетках насекомых не будет обладать полным спектром биологической активности нативного С023. Таким образом в данном случае наиболее адекватным подходом к получению рекомбннантных препаратов, предназначенных для функциональных исследований, является использование систем экспрессии на базе животных клеток.

Ранее С023 экспрессировали в векторах на основе вируса 5\М0 в С05-клетках, а также в СНО-клетках с использованием системы коамплификашш с геном дигидрофолат-редуктазы' при селекции на метотрексате. Однако полученные уровни синтеза вполне сопоставимы с естественным невысоким уровнем экспрессии этого белка в клеточкой линии КРМ18866, что серьезно осложняет выделение и очистку рекомбннантных продуктов. С другой стороны, для работ по изучению функционирования мембранных форм С023 высокий

ч

уровень синтеза рекомбинантного белка не нужен, однако необходимым требованием к системе экспрессии является использование клеточных линий, которые могут быть стабильно трансформированы и имеют отношение к иммунной системе млекопитающих (в силу зависимости биолопгческих свойств молекулы от типа гликозилирования).

В данной работе был использован многокотшный эписомный вектор ВМСМео (рис.9) на основе вируса бычьей папилломы и клеточная линия мышиной миеломы X63.Ag8.653. Эта система ранее с успехом применялась для стабильной высокоэффективной экспрессии ряда интерлейкинов мыши и человека.

Для создания экспресснруюших конструкций была использована ранее клонированная полноразмерная кДНК С023а. Известно, что нетранслируемыс последовательности могут оказывать очень существенное влияние на стабильность мРНК и уровень трансляции, однако данное обстоятельство не учитывалось в работах других лабораторий. Поэтому, используя кДНК СБ23а в качестве матрицы, методом полимеразной цепной реакции с неполностью комплементарными праймерами была получена кДНК С023Ь, которая практически не содержит нетранслируемых участков и несет на концах сайты ХЬо1. Внутри этой кДНК имеется уникальный сайт В^Ш, совпадающий с

- IS -

«DNA . cDNA

Рисунок 9. Структура вектора BMGNeo.

BPV69%.- фрагмент генома вируса BPV, МТр - мышиный.металлотионеиновый промотор, NeoR - маркер устойчивости к неомлцину из Тпб E.coli под контролем промотора гена тимидии киназы, AmpR - маркер устойчивости к ампициллину, poly (А) - сигнал полиаденилирования гена ß-глобина кролика, mtroa - второй интрои .гена ß- глобина кролика, human ß-globin - часть гена ß-глобина человека, ori pBR322 - начало репликации, HindIII, Xbal, Sali, Xhol, BamHI - сайты расщепления эндонуклеазами рестрикции.

началом фрагмента кодирующего 29кДа sCD23. Это обстоятельство было использовано при создании гибридной молекулы состоящей из последовательности кодирующей лидерный пептид интерлейкина 2 и последовательности кодирующей 29кДа sCD23. Такая конструкция обеспечивает получение прямой экспрессии фрагментов CD23 в секретируемом виде. Далее кДНК CD23b и IL2-sCD23 были клонированы по сайту Xhol в вектор BMGNeo, в результате чего были получены экспрессирующие гглазмлды BMGNeo-CD23b и BMGNeo-IL2-sCD23. Общая схема работы показана на рис.10.

XI». I

и

кД11К-«С[Ша

С

пцрш.с) I ■ х1«>1

ВС) |

Гк7

1' Т1

,-1-,

У_Гк,И!К зСР23Ь |—Т НМГЛ«»'

I'--- I CH2.il.

ХЫ Х1*>1

I ВВ1И

лидерный т К1ам№

игптил /и

5-ГП -| кДНК ЗСР23 (29»Да) |-3'

1

Х1.о|

5-1 и I к ДНК »СОН (29кДа) 1—3' ВМ(;К«ч.-|1--|и.5<-|)2|

ХЬо! '' Х1.Ы

Рисунок 10. Схема получения кДНК для мембранной Ь-формы С023 и создание конструкции для экспресин 29кДа бСВ23 в секретнруемом виде.

Трансформацию клеток X63.Ag8.653 проводили кальций-фосфатным или ДЭАЭ-декстранов-ым методом с последующим отбором стабильных клонов в присутствии антибиотика .0418. На рисунке 11 представлены результаты иммуноблоттинта. клеточного лизата и культурального супсрнатанта полученных клеточных линий. > Как видно из рисунка, поликлональные кроличьи антитела к пептидному фрагменту СБ23 выявляют полосу размером около 45кДа как в лизате клеточных мембран линии ЯРМ18866 конститутивно экспрессирующей С023, так и в полученной нами линии Х-63-СБ23Ь. Лизат контрольной линии Х-63-Ыео, полученной путем трансформации клеток исходной плазмидой ВМСИео, с антителами не реагирует. Полосу размером около 29кДа антитела выявляют как в супернатанте клеток Ш37 для которых характерно образование именно 29кДа зС023, так и в супернатанте полученной нами линии Х-63-5СС23, при этом они не взаимодействуют с контрольным сулернатантом' Х-63-Мео. ' . . .

Для дальнейшей идентификации клонов были использованы мышиные моноклональные антитела НБ50, узнающие нативную структуру СЭ23. Результаты иммунофлюоресцентного анализа клеток Х-63-С023Ь в сравнении с Х-63-Ыео показаны на рисунке 12.

1 2 3 4 5 6 7 8 кДа

Рисунок 11. Иммуноблотпшг. ^

1 - лизат клеток ЕР М18866 с кроличьими антителами к пептидному фрагменту СБ23 (г-анти-СБ23); 2 - супернатант культуры клеток 11937 с г-анти-С023; 3,4 - лизат Х-63-СБ23Ь с г-анги-(Л)23 и с нормальной сывороткой кролика соответственно; 5,6 - супернатант культуры клеток Х-63-зС023 с г-анти-СБ23 и с нормальной сывороткой кролика соответственно; 7,8 - лизат и супернатант культуры клеток Х-63-Кео с г-анхиСБ23.

О

Рисунок 12. Реакция прямой иммунофлюоресценции с моноклональными антителами 1ГО50 мечеными флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ). А - Х-63-С023Ь; Б - Х-бЗ-Ыео (отрицательный контроль).

Следует отметить, что были проведены также эксперименты по экспрессии в данной системе CD23a с использованием как полноразмерной, так и не содержащей нетранслируемых областей кДНК. Были получены стабильные трансформированные линии, которые содержали плазмиду со вставкой в неизмененном виде, что было показано экстракцией плазмидной ДНК по Хирту с последующей трансформацией клеток E.coli, выделением плазмидной ДНК, и идентификацией ее структуры при помощи набора эндонуклеаз рестрикции. Однако экспрессию белка CD23 в полученных линиях клеток обнаружить не удалось. Известно, что у мышей существует только одна мембранная форма FcERII, гомологичная CD23a человека. Не исключено, что а-форма CD23 человека обладает какой-то существенной для клеток мышиной миеломы физиологической активностью, которая приводит к отбору непродуцирующих клонов.

Таким образом, с использованием системы экспресии, состоящей из эписомного вектора BMGNeo на основе вируса бычьей папилломы и клеточной линии мышиной миеломы X63.Ag8.653 нами получены стабильные клеточные линии экспрессирующие рекомбинантную мембранную b-форму CD23 (Х-63-CD23b) и рекомбинантный 29кДа фрагмент CD23 в виде секретируемого белка (X-63-SCD23). ' • "

ВЫВОДЫ.

1. Разработана эффективная система экспрессии sCD23 человека в клетках Escherichia coli.

2. Получен очищенный рекомбинантный препарат sCD23 человека.

3. Выявлен структурный ..полиморфизм гена' .FcERII в некоторых клеточных линиях человека. .

4. Показано, что отсутствие, мембранной экспрессии ! FcERII в одной из исследованных линий клеток - Daudi вызвано потерей последовательностей, кодирующих рецептор, в геноме клеток этой линии.

5. Показано, что клетки мышиной миеломы. X63.Ag8,653 могут • быть' использованы для экспрессии CD23 человека как в мембранной форме так в виде секретируемых фрагментов с лидершлм пептидом интерлейкина 2.

Сгаюок работ опубликованных по теме диссертации;

1. Кайгородов В.А., Пивнюк В. И.,- Кондратьева И.А., Василов Р.Г. . Рестрикционное - картирование гена CD23 человека из клеточных линий RPMI8866, U937, Raji, Daudi, Namalva. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 16. Биология. 1993. N.3. с. 54-57.

2. Кайгородов В.А., Пивнюк В.И., Кондратьева И.А., Василов Р.Г. Получение мьшшной миеломы, устойчивой к антибиотику G418. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 16. Биология. 1995. N.1. с. 62-65.

3. Кайгородов В.А., Птицын Л.Р., Пивнюк В.И., Кондратьева И.А., Альтман И.Б., Василов Р.Г. Экспрессия IgE-связывающего фактора (sCD23) человека в клетках Escherichia coli. / / Бюл. эксперим. биол. и мед. 1996. N.5 с. 26-31.

4. Пивнюк В.И., Фадеев М.О., Кайгородов В.А., Василов Р.Г. Клонирование и экспрессия гена CD23 антигена - регуляторного фактора аллергии. // Тез. докл. III Всероссийской планово-отчетной конференции.. "Генная и клеточная инженерия", Пущино-на-Оке, Ноябрь-декабрь 1992г. с. 31.

5. Vasilov R.G., Kaigorodov V.A., Pivnjuk V.I., Tsitsikov E.N. Study of CD23 gene expression in different systems using biotinylated CD23 probe. // Abstr. of the XVth Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology. Paris, France, 10-15 May, 1992, p. 277.

6. Pivnjuk V.I., Kaigorodov V.A., Tsitsikov E.N., Vasilov R.G, Establishment of mouse cell line wich constitutively express human low affinity IgE receptor/CD23. // Abstr. of the Annual Meeting of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology. Rotterdam, The Netherlands, 12-15 • September, 1993. p. 317.