Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые подходы к разработке препаратов на основе лактобактерий для лечения дисбактериозов кишечника

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Новые подходы к разработке препаратов на основе лактобактерий для лечения дисбактериозов кишечника"

рга од

РдЙЙКШеР^Шо здравоохранения российской федерации российский государственный медицинский университет

На правах рукописи УДК 616.98:579.864

СМЕЯНОВ Владимир Владиславович

НОВЫЕ ПОДХОДЫ К РАЗРАБОТКЕ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ЛАКТОБАКТЕРИЙ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДИСБАКТЕРИОЗОВ КИШЕЧНИКА

03.00.07 — микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1993

Работа выполнена в Российском Государственном медицинском Университете.

Н а у ч п ы и руководитель: доктор медицинских наук, профессор В. М. Коршунов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В. Г. Лиходед, доктор биологических наук, профессор Л. П. Блинкова

Ведущая организация — Государственный научный центр по антибиотикам.

Защита диссертации состоится « . . . »...... 1993 г.

в ..... часов на заседании специализированного ученого

Совета № 6 К 084.14.05 Российского Государственного медицинского университета по адресу: 117869, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ. Автореферат разослан « . . . »......1993 г.

Ученый секретарь специализированного ученого совета, кандидат медицинских наук Т. Н. Клушина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы,

Дисбактериозы кишечника продолжают оставаться одной из важных проблем современной медицины, что связано как с увеличением числа этиологических факторов (применение антибиотиков, инфек-цнонние заболевания, ионизирующее излучение, стрессовые перегрузки и др.1, так н с недостаточной эффективностью существующих терапевтических средств (Гончарова Г.И. с соавт., 1989; Ван дер Ваая Д., 1892; Шteuoka Т.. 1G69I.

В связи с этим, до настоящего времени остается актуальной задача разработки методов поиска штаммов микроорганизмов-представителей индигенной микрофлоры кишечника, в частности лактобактериа, перспективных для создания на их основе высокоэффективных бактерийных препаратов-эубиотиков (Коршунов D.M. с соавт., 1905; Холодова H.H. .1990; Clmteau N. et al., 1995).

Перспективным подходом, позволяющий с одноп стороны определять биологическио свойства микроорганизмов во озаиыодепствии с-организмом хозяина и, с другой стороны, проводить отбор штампов лактобактерия, обладавших высокой колонизирующей способностью и антагонистической активностью в условиях in vivo, является применение безмикробних животных а комплексе с гнотобнологической технологией (Интиэаров М.М., 1966; Барэашка-Попова С.Н., 1990; Ефимов Б.А. с соавт., 1992; Prater R., 19681.

Известно, что индигенные лактобактерии являются естественными стимуляторами иммунной системы макроорганивма (Мальцева H.H. с соавт.,1992; Регаligan С., 19001. Однако, до настоящего времени при создании препаратов-эубиотиков не учитывается возможность выраженных различий иммунотропных свойств различных птаммов лак-

тобактерий и не исследуется их воздействие на иммунологические п раметры.

Широкая распространенность бактериоцин-опосредованных конкурентных взаимоотношений среди лактобактерия (Klaenhammer T.R., 1906) указывает на необходимость исследования участия бактериоциногении в регуляции состава микробиоценоза кишечника с цель» создания препаратов-эубиотиков, не оказывавших повреждающего действия на индигенную лактофлору, и не подверженных влияние бактериоцмнов собственных лактобактерия кишечника хозяина.

Таким образом, поиск перспективных штаммов лактобактерия с учетом способности эффективно колонизировать кишечный тракт макроорганизма и выраженно ингибировать рост и размножение услоыю-пагогенных микроорганизмов целесообразно проводить методами ln vivo с использованием гнотобиологических моделей. При этом необходимо принимать во внимание возможность бактериоцин-опосредованных конкурентных взаимоотношений экзогенных лактобактерия с индигенной л^ктофлорой и выраженность иммуномо-дулируюш^х свойств отбираемых штаммов лактобактерия.

Цель исследования.

Изучение бактериоцин-опосредованных взаимодействия лактобактерия, их иммуномодулируюшей, антагонистической активности и колонизирующей способности с использованием гнотоОиотехнологических методов ln vivo в применении к создании новых препаратов эубиотиков.

Задачи исследования.

1. Провести сравнительное исследование биологических свой-

ств различных штаммов лактобактерия методами In vitro и In vivo.

2. Изучить иммуномодулирующие свойства различных аггаммов L.acidophilus.

3. Изучить конкурентные взаимоотношения между лактобактери-ями методами In vitro.

4. Исследовать бактериоцин-опосредованные взаимоотношения лактобактерия in vivo с использованием лактацин F-продуцента L.acidophilus 11088.

3. Изучить влияние бактериоциногении и чувствительности к бактериоцинам на лечебные свойства лактобактерия при экспериментальном постлучевоы дисбактеркозе кишечника.

Научная новизна.

Впервые установлено, что Оактериоцин-продуцируюшиц штамм лактобактерия способен эффективно вытеснять чувствительный штамм лактобактерия из кишечника экспериментальных животных: определено, что различные штаммы L.acidophilus проявляют выраженные отличия в иммуномодулирусмая активности. Показано, что точное определение параметров антагонистической активности н колонизирующей способности лактобактерия возможно только на моделях In vivo с использованием гнотобиотехнологии. Установлено, что применение штамма L.acidophilus 22, непродуцируюпвго и нечувствительного к бактериоцинам, увеличивает показатели выживаемости тотально облученных мыоея.

Научная и практическая ценность.

На основании полученных экспериментальных- данных предложено использовать при создании препар&тов-эубиотиков на основе лактобактерия такие критерии, как степень выраженности иммуностимулирующая активности, способность к продукции и чувствитель-

пость к бактериоцинам. Показано, что определяющими при изучении антагонистической активности и приживляемости лактобактерии, должны бить методы ln vivo с использованием гнотобиологическоя технологии.

Предложено использовать штамм L.acidophllUB 22, обладающий естественной полирезистентностью к антибиотикам, способностью колонизировать кишечный тракт, не продуцирующий бактериоцины и устоячивыя к их действию, а так*® оказывающий лечебный эффект при экспериментальном постлучевои дисбактериозе кишечника для создания на его основе нового бактерийного препарата-эубиотика.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены на заседании секции гнотобиологии Московского городского общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов им И.И. Мечникова в январе 1992 г. и на научной конференции кафедры микробиологии РГМУ в цае 1993 г.

Структура диссертации.

Диссертация малпсами на русской языке, на страницах ма-шинолмсн, состоит из введения, 4 глав, выводов и указателя литературы. Библиография включает источник, в той числе работ отечественных авторов и работ зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована таблицами , рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы и методы

Исследования проводили на мышах линии СВА и беспородных мышах обоего пола, массой 16-19 г. Общее количество животных -

D работе использованы 17 отаымов лактобактерип, выделенных из различных источников, б штаммов I.acidophilus, полученных от д-ра V.Bossart (Швепцария): итаиыы L.acidophilus 11066 с laf2-штами, прояуцируодап лактаиин F-продуцент), L.acidophilus 89 и L.delbrueclsii eubsp.lactia 4797 <lafB- лактации F -чувствительные штаммы), предоставленные проф. Т.П. Klaenhamnsr (США). Энте-робактерии, стафилококки, стрептококки, клостридии были выделены -из клинического материала (фекалия). Идентификацию микроорганизмов проводили с использованием биохимических систем API ("Apisystea", Франция >.

Тотально-деконташшнрованнык яавотных получали путей интра-гастрального введения антимикробного коктейля в течение б днеп (Синицина H.A., 1966), после чего животных помещали гнотобиоло-гмческнэ изоляторы ("1а Celben»", Франция) и вводили смесь антибиотиков gií9 в течение 2 дней.

Для изучения мынуноиодулирующзй активности препараты убитых L.acidophilus вводились интрагастрально и/или внутрибрюаш-но конвенциональные и тотально-деконтаыннированным мыкай. Количество Iß-продуцентов в lamina propria тонкол кишки определяли на парафинизированиых срезах пряиим иыиуиофлуоресцентным истодом с использованием кроличьих ФИПЫшченных антисывороток против иммуноглобулинов, мыши. Результаты представляли как процент стимуляции (Мартынов А.И. с соавт., 19011. Степень активации перитонеальных макрофагов определяли по уровне индуцированной опсонизированным зимозанок лсминоязависныод хемилюминесценцни, регистрируемой на хемилюммнометре LKB -1231 (Швеция). Результаты представляли как индекс стимуляции (HC) (Hashimoto 3.,'19641.

Антагонистическою активность лактобактерип in vitro по отно-

- е -

шению к условно-патогенным микроорганизмам определялась на плотных питательных средах методом Schllllnger Н. and Lücke F.K. (1059).

Антагонистическую активность лактобактерий In vivo определи- • ли по способности вытеснять индикаторнол штамм Proteus mlrablllß PS-2 из кишечника тотально деконтаминированных мышея, содержащихся в условиях общей гнотобиологической изоляции <0ГБИ).

Адгезии лнктовнктерий на эритроцитах человека определяли развернутым методой по Брилису В.И.(1983), выражая адгезивную способность лактобактерий как индекс адгезии микроорганизмов (KAMI. Изучение адгезнвности лактобактерий на изолированных Фрагментах кишечника конвенциональных мышей проводили по методу Тарабриной Н.П. (1901) в применении к исследуемым штаммам^

Антибиотикочувствителышсть исследуемых лактобактерий определяли методом диффузии в агаре (метод дисков), и методом серийных двукратных разведения в плотной питательной среде (Навапви С.М., Фомина И.П., 1962).

Активность кислотообразоваиия при росте лактобактерий на среде МРС определяли титрояетраческим методом в динамике через 6-12-24-36-46-56-72 часа от начала культивирования. Результаты представляли в градусах Тернера <Т°НЛянная A.M., Гончарова Г.И. 1973).

Для изучения иезшнкробних вэаимоотновешш лактобактерий In vitro применялись метод агарового антагонизма по Schllllnger Н. ana Lücke F.K.<19B9i и метод.отсроченного антагонизма в модификации Murlana Р.И. and Klaenhamner Т.R.<19871 с использованием в качестве тест- и индикаторных штаммов изучаемых лактобактерий. Кроме того, определялась ингибируютая активность безклеточного культурального супернатанта (Murlana P.M. and Klaenhamroer T.B.,

10071.

При изучении приживляемости лактобактерия In vivo тотально деконтаминированные мыши, содержащиеся в условиях ОГБИ, в течение трех дней получали интрагастрально суспензию суточной культуры исследуемого ытаыма лактобактерия; на 1-е и на 2-е сутки после отмены препарата определось количество лактобактерия о тонком и толстом кишечнике и/или в фекалиях. Для изучения бак-ториоцин-опосредовалных взаимодействия лактобактерия In vivo, тотально деконтаминированные мыв», ионоассоциированные с индикаторным штаммом лактобактерип, получали однократно суспензию суточной культуры продуцента лактацина F L.acidophilus 11066. На следующий день проводили анализ состояния лактофлоры кишечника ыышп путом высева на сроду МРС с добавлением антибиотиков.

Для изучения влияния лактобактерип на выживаемость тотально облученных мыиеп квантами воСо на установке ГУБЭ-1200 D дозе Т Грея I вводили препараты суточной культуры лактобактерип а дозе 1,0 х10®ц.т./0.2 ил на 1, 3, D, 7, 9, 11, 13,13 день поело облучения. На протяжении 30 суток регистрировалась выживаемость иысип по дням, после окончания срока наблюдения определялась об-цая выживаемость и средняя продолжительность жизни мииэя.

Статистическую обработку полученных результатов проводили оби^прииятнми методпми (Атмлрин И.П., Поробьев Л.А., 1902; Губ-лер Е.В., 19YOI. Досюворпость различил между выборками определяли с использованием t-критормя Стьюдента или непараметрического U-критерия Уилкоксона-Ыанна-Уитнн. Для выяснения достоверности качественных различия использовался метод углового преобразования Фишера.

- 8 -

2. Основные результаты исследования. Кислотооорйэ.уйшйя активность изучаемых чггйккор

Наиболее активными кислотопродуцентами при учете абсолютных значения титруемой кислотности к 72 часам от начала культивирования были штаммы: L. deltruelkil subsp.lactle 4797 - кислотность составила 216,9±1,1 Т? L. acidophilus IHF-217,3±1,1 Т° L. plantarua 72 - 216,1±1,0 1°, L. fermentum 90T-s4 -204,4± 2,2 и L.acidophilus 11066 - 201,0*3,1 Т°; менее выражение закисляли культуральную среду и пггамыы I.acidophilus 69 1197,8±4,2 Т°>, L.acidophilus 01 <197,9*4,2) и L.helvetlcus J 1106,1*1,11. В наименьшей степени снижал рН среды отами L.acidophilus 06: кислотность по Тернеру к 72 часам составила только 133,3*2,2 Т°и штамм L. acidophilus 22 - 130,6*1,1 Т?

Цактто.ешшсть изудаеимх итамнов. лото^актерия ii йитисшинам

Установлено, что исследованные штаьшы проявляли высокую устойчивость к ристоммцину С SOS итамиов), к линкоиицину (40SI, к оксациллину (20S), к рифаипицину И02), к стрептомицину (69*), к фузидину (40t). Наиболее широкий спектром резистентности обладали иггамми L. plant arum 72 < устойчив к ристомнцниу, лиикоиицину, оксацилину, стрептомицину>, L.acidophilus 22 (к ристомм-шшу, оксацилину, стрептомицину), L.acidophilus INFIk линкоыя-цину, стрептомицину, фузидину) и L. fermentum 90 Т-С4 (к ристомк-цину, линкомицину, стрептомицину, фузидину). Выявленные у изучаемых лактобактерий качественные и количественные различия в спе» тре-антибиотикоустойчивости, позволили провести дифференциальны! микробиологический анализ индивидуальных штаммов в эксперимента) in vivo.

Антагонистическая активность лактобактерий in vitro я. In ylvo. ПЛ. отношению li условно-патогенным микроорганизмам. Все изучен-

нив штаммы лактобактерип обладали способностью ингибировать рост условно-патогенных микроорганизмов in vitro, проявляя, тем не иенее, выраженные различия, в том числе и внутривидовые, в степени и спектре действия. Наибольшую активность в данной тесто проявляли штаммы L.plantarum 72, L.acidophilus 22, L.acidophilus INF, L.acidophilus 01, L.acidophilus Об и L.helvetlcus J (Рис.11.

Рис.! Антагонистическая активность лактобактерий In vitro

R зоны задор¡кки роста, ш

ЕЕЗ Lrtaftftron 77 - Ш LocidepNha П

СЗ LccktofMut ег ШИЗ LMwttcu* J

При изучении антагонистическая активности штаммов L.plantaruo 72, L. acidophilus 22. L. acidophilus IMF, L,bf>lv*tlrim J в системе in vivo, установлено, что только птаым L.acidophilus INF приводил к выраженному снижению уровня P.nlrabllls РЗ-2 как а тонком, так и толстом кишечнике тоталь-но-деконтаминированных мышея до концентраций < Ю2К0Е/г. Штамм L.plantarum 72 снижал уровень протеев в тонком кивечнике и при-

водил к уменьшение частоты их высеваемости в толстом кишечник?. Штамм L.helvetlcus J, снижая уровень P.mirabilis PS-2 в тонкоц кишечнике до значений <102К0Е/г, не уменьшал количество индикаторных микроорганизмов в толстой кишечнике. Введение штамма L.acidophilus 22 приводило не влияло на уровень протеев как в тонком, так и толстом кишечнике «Рис. 2 1.

(

Рис.2 Ингибируюшап активность лактобактврий In vivo по отношению к P. mirabilis

lq(KOE/r исс/идуеиого материала) 10-

ШШ lomea додают ES толстил кишечник

При сравнении результатов определения антагонистической ак тивности изучав mux штаииоп лактобактерий, полученных методами In vitro и in vivo не обнаружено выраженного соответствия межд ними. Так, в условиях In vitro наиболее сильно ингибировал рост протеев uitaMM L.helvetlcus J, который не был способен эффективно подавлять P.nirabllls PS-2 In vivo. С другой стороны, штамм L.acidophilus INF, полностью элиминирующий протеев из к* юечника тотально деконтаминированных мышей, в тесте in vitro

проявлял меньшуо активность, чем штамм L.helveticus J. В качестве предварительного теста in vitro может быть использовано изучение кислотообразуошай активности лактобактерий: все штаммы, которые к 72-ум часам после начала инкубации закисляли среду до значения порядка 200 Т°и выше, в какой-то степени обладали способностьо ингибировать P.nlrabllls In vivo. Однако, только исследования In vivo с использованием безмикробных животных позволяют учесть все многообразие факторов, влияоших на исход межмикробных взаимодействия.

ИШ Фрагментов кииечнкка инвдя■ При изучении способности лактобактерий к адгезии на эритроцитах человека установлено, что Штаммы L.acidophilus INF, L.helveticus J, L.acidophilus 11060 и L.acidophilus 09 является неадгезивными в данном те^т* м<мавш5 адгезии составлял мекоо 1,70); шташгы L.acidophilus . t.fenaentuo 90 Т-С4, L.acidophilus 06, L.delbruochii виЬзр. lactls 4797 отнесены к низкоадтезизниы (НАМ от 1,76 до 2,49). Ытаыиы L. plantarua 72, L. acidophilus 01 проявляли наиболее высокие показатели адгезии к эритроцитам человека из исследованных штаммов (ИАМ был равен 2,3<3*0,21 и 2,72+0,25 соответственно ).

Установлено, что штамм L.acidophilus 72 крбме высокой адге-зивиости к эритроцитам, демонстрировал также наибольшую способность к взаимодвястоио с фрагментами кишечника мыюеп, адгезиру-ясь в количествах 0,00+0,20 на тонком кивечнике и 0,42±0,04 lgiKOC/ri на толстой кноочннкв. Однако, итак* L.acidophilus 01, проявлявмий сходные со штаммом L.acidophilus 72 показатели адгезии к эритроцитам, достоверно более слабо взаимодействовал с толстым (3,8Qt0,2l lg(КОЕ/г> и тонким (3.72*0,07 lg(K0E/r)

отделами кишечника. В то же время, неадгеэивный к эритроцитам штамм ¡..acidophilus 69 также как и штамм L.plantarun 72 выражение адгеэйровался на фрагментах тонкого 16,23±0.17 lg< КОЕ/г) и толстого (6,1б±0,25 lgl КОЕ/г) кишечника. Только штамм L.acidophilus 11060 проявлял низкие показатели адгезии как на фрагментах тонкого и толстого кишечника <0,Э6±0,04 lg<КОЕ/г) и 5,04*0,06 lg(КОЕ/г(соответственно), так и на эритроцитах человека. Таким образом, наблюдается несоответствие между показателя ми адгяаивности лпктобактерий, определяемых в различных тептах, что связано, по всей видимости, с отличиями рецепторного аппарата эритроцитов и эпителиоцитов кишечника. Вдмша различных штаммов лактобактеоия uü иммунологические п&-PWe.TPM коирешюнедьнык й T9TWH9 декоптЗ«инирд,ван,ць)Х ИШШЬ Пероралыюе введение всех исследованных штаммов L.acidophilus в дозе 1,0 х 10®в течении б дней приводило к достоверному увеличении количества Ig-продуцируюших клеток в lamina propria тонкой.кишки конвенциональных мышей <р<0,011 (Табл.11

Таблица 1. Влияние пероралышго введения различных штаммов L.acidophilus на уровень иммуноглобулинсинтезирующих клеток в lamina propria тонкой кишки конвенциональных мышея.

Штамм Кол-во иммуноглобулинсинтезируюших * стимуляции

клеток в 1 кв.ми lamina propria

Опыт 1:

01 3294 ± 79 146,8 ± 3,6*

02 2942 ± 77 131,1 ± 3,4*

03 3665 ± 134 163,3 ± 3,98

04 3143 ± 96 140,1 ± 4,5«

11 31в7 ± 92 142,0 1 4,1*

смесь штаммов 3463 ± 101 153,2 ± 4,5*

Контроль 2243 * 79 100,0 i 3,5*

Опит 2:

06 ЗСЗЗ ± 61 167,7 t 3,7*

ОТ 313Т * 94 143,9 t 4,3*

Ов 3316 * 74 132,2 t 3,4*

Контроль 2179 ± 62 100.0 1 2,6*

Однако, при этом наблюдались выраженные различия стимулируо-яия эффектов различных штампов. Наибольшая иммуностимулирующей способность» обладал штамм L.acidophilus 00, наименьшее действие оказывал штамм L.acidophilus 02 ,

Выраженность иннуиостиыулируюнгэго действия находилась в прямо проппрпипидяьмпи яляисммости от дозы вводимого препарата лактобактерий, что определено с использованием штамма L.acidophilus 11, проявляющем достаточно высокую активность в данном теста. Наиболее эффективной была доза 5х1010м.т.Лшшъ.

Более сложная зависимость эффекта от дозы препарата наблюдалась при изучении влияния шташла L.acidophilus 00 на люммнол-зависимую хемилюминесценцив перитонеалышх макрофагов: при использовании доз 3,0х10°и 5,0х10*м.т./мышь в сутки происходило достоверное увеличение (1С хемнлшинесценшши, При введении препарата в дозе 5х10?н.т%/ мышь отиочалось некоторое снижение ИС. Для изучения действия остальных втамков использовали субоптимальную дозу - Зх10вм.т./1шиь (Табл. 21.

Таблица 2. Влияние препаратов I.acidophilus на люминолзависииую хеиилюмшшеценцию перитоноольных иакрофагев

Препараты: доза 3x10 м.т./мышь, внутрибрюшинно

Индекс стимуляции хеиилюминисценции перитонеалышх макрофагов!ИС) Опыт(препарат) | Контроль*физ.р-р.I

Штамм 01 Штамм 02. Штамм 03 Штамм 04, Штамм Об Штамм 07 Штамм 06 смесь штаммов

4.399±0.320 1.71310.119 2.944±0.144 2 ,969±0.206 2.36*0.1640 4.026*0.262 4.73140.321 3.263tO.U9

2.766t0.204 3.033±0.743 1.60710.273 2.960tO.296 2.007i0.134 1.342tO ,001 1.632t0.247 1.63010.130

•-различия wejwiy опытной и контрольной группами достоверны! р«0.03» При введении в данной лозе штаммов L.acidophilus 01,03,06,

07 и 08 наблюдалось достоверное увеличение И.С. лсммнолэависи-

won хемилюминисценции перитонеальных макрофагов. В то зш время, штаммы L.acidophilus 02 и 04 не. обладали таким эффектом.

Изучение возможности стимуляции иммунитета у тотально де-контаминированных иышеп проводили в условиях ОГБИ для исключения контаминации кишечника животных экзогенными микроорганизмами. В результате этих экспериментов установлено, что как перо-ральное, так и парентеральное веедение L.acidophilus штамиов 01 и 06 (которые обладали способностью эффективно стимулировать изучаемые показатели у конвенциональных мышея! приводило к достоверному (р<0.01) увеличению количества 1г-синтезируюших клеток в lamina propria тонкой кишки. Однако, стимуляция хемилюмн-несценции макрофагов наблюдалась только при внутрибрюшинном введении L.acidophilus>06 и при пероральном введении L.acidophilus 00, что показывает не только различия иммуностимулирующей способности этих ип-нмион, но, нпимижни, и механизмов их действия (Табл. 31.

На проявление лактобактериями иимуномодулируюиих свойств оказывал влияние и микробиологический статус макроорганизиа. Так, ИС люминолзависимой хемилюыинисценции поритонеальных макрофагов конвенциональных мышей при внутрибрюшинном введении штаммов L.acidophilus 01 и Об был существенно выше, чей у тотально декотаминированных мышея (4.699*0.32 и 2.692*0.224 для штамма 01; 2.56*0.164 и 1.607*0.116 для штамма Об: р-0.01I. Аналогичная закономерность наблюдалась и при сравнении ИС ыэзду контрольными группами конвенциональных и тотально деконтаиннн-рованных мышея (2.399*0.18 и 1.772*0,16; соответственно, р-0.01). Штаммы L.acidophilus 01 и 00 вызывали значительно более выраженное (р<о,05> увеличение числа Ig-синтеэируюпих клеток в laaina propria у конвепционольних животных по сравнению с тотально-де-контаминированными: 3294*79 и 3013*74 для штамма 01; 3695*61 и

3124*61 для штамма Об; клеток в 1 кв.мм lamina propria. Межлу контрольными группами конвенциональных и тотально деконтамини-рованных мытоя достоверных различил выявлено не было.

Таблица 3. Влияние L.acidophilus на иммунологические параметры тотально деконтаминированных мышея, содержащиеся в усяопиях ОГБИ.

День пос- ИС хемилюми- Количество иммуноглобу-

Препарат ле окон- несценции линсннтеэирутких клеток

чания перитонеаль- __________

введения ных макрофа- Абсолютное £ стимуля-

препарата гов число/кв мм. ими

L.acidophilus 01 3 0,861 ±0.128 3013*94 137,1*4,3

(per os) 10 0,835*0.092 299Q*t 40 134,2i0,3

контроль 3 1,125*0.014 220t tl02 100,0*4.0

(физ, р-р) 10 1 ,042 ±0 .154 2234*09 100,0*3,9

L.acidophilus 01 3 2 ,692*0.224* 2500*103 122,1*5,1

(внутрибрюшииио > 10 2 ,002 *0.1 74 2314*69 114,7*3,1

Контроль 3 1 ,001tO.149 2053*73 100,0*3 ,6

(физ. р-р) 10 1,863 ±0.331 2193*02 100,0*3,7

L.acidophilus 09 3 1,720tO.149* 3124*01 142,4*3,7

( per овI 10 1 ,020 *0 .270 3131*02 142,2*2,0

Контроль 3 1,014*0.t47 2194*63 100,0*2,0

(физ. р-р. ♦ 10 1,072*0.134 2216*77 100,0t3,4

L.acidophilus 06 3 1,607t0.116 2043*97 125,7*4.6

< внутрибрюкинио1 10 - •• - -

Контроль!физиоло- 3 1 ,772*0 .080 2103*76 100,0*2,7

(фИЭ. р-р.1 10 - —'

• различия достоверны, р » 0,05

•• показатель т определялся

Меньшая ««ражынниить иммуностимулирующего эффекта, установленная у тоталыт-деконтаминиропанных мышея связан«, по всеп видимости, с нарушениями механизмов иммунорегуляции, вызванными введением больших доз антибиотиков (JelJasezewicz J. and Pulv»»rer С., 1986). Относительная нормализация исследуемых иммунологических параметров под депстяием изучаемых препаратов лакюбпктррич говорит о возможности их использования для стимуляции местного иммунитета при массированном применении антибиотики!».

Иеяыикпобныв пзаи но действия лакттктшШ Щ ¡¿lira- При изучении взаимного антагонизма на плотных питательных средах установлено, что изучаемые лактобактерии проявляют ингибирующие свойства друг по отношению к другу. Наиболее выраженной способностью подавлять рост индикаторных тгаыыов лактобактерии обладали штаммы L.acidophilus INF, L.helvetlcus J, L.plantarum 72, ншшеныаэй-игтамы L.acidophilus 22. Наиболее чувствительными к мнгибиции тест-штаммами лактобактерии оказались штаммы L.acidophilus С9 и L.delbrueckll subsp. lactls 4707 - их рост подавляли все исследование штаммы. Самый узкий спектр чувствительности имели вггаммы L.plantarum 72 «который ингибировался только лактацин-F продуцентом! и L.acidophilus 22.

Методом отсроченного антагонизма установлено, что продуцент лактацнна F L.acidophilus 11066 ннгибировал рост большинства изученных штаммов лактобактерий; нечувстсмтелыш были штаммы L.acidophilus 22, L.helvetlcus J й L.acidophilus ОКРис. 3».

Рис.3 Ингибииия лактобактерий laf-продуцонтом L.acidophilus 11088 In vitro

L.eoldophUu* (t L.Ooldophllui МГ

В то же время, все исследуемые штаммы проявляли способность инги-бировать laf" штаммы L.acidophilus 89 и L.delbrueckll subsp. laclls 479: наибольшую активность (сравнимую с активностью 1аГ*-итамма) демонстрировали^ как и в первом тесте, штаммы L.acidophilus INF, L.helvetlcus J, наименьшую - штаммы L.acidophilus 22, L.acIdophllus 01 и L.acidophilus Об (Рис. 41.

Рис.4 Ингибирующая способность лактобактермп по отношению к Iaf-чувствителъным штаммам

степень ингибииии, усл. ед.

ШШ сильиочувствнгвлшыя ¡ШИ слобочувстгмтвльиия L,d»lbru»cl(ll subtp. locll» 4707 L.acldophllu» S9

Кроме вггаммов L.acidophilus 69 и L.delbrueckll subsp.lactls 4797 (a priori чувствительных к лактацину F), только штамм L.plantarum 72 ингибировался стерильным культуральним суперна-тантом лактации F-продуцента штамма L.acidophilus U0Q3, что, по всея видимости, говорит о его специфической чувствительности к данному бактериоцину. Способностью подавлять рост сильночувствительного к лактаиину F штамма L.delbrueckll subsp.lactls осла-

■г

дал кроме супернатанта продуцента данного бактериоцина только

- 18 -

кулътуральнып супернатант пгтамма L.acidophilus INF.

В целом, по результатам трех тестов наименьшей чувствительностью к действию других лактобактерия, в том числе и к лактацин F-продуцента, а такхо наименьшей ингибируювюя способностью обладал ш<шы L. acidophilus 22. №амм L. plantar un 72 был чувствителен к лактацину F. Штамм L.acidophilus IHF способен наиболее выражанно подавлять рост других лактобактерия, в том числе и лактацин F-чувствительных штаммов.

Таким образом, проведенные in vitro эксперименты позволили установить присутствие конкурентных взаимоотношений, в том числе и опосредованных бактериоцинами среди изучаемых лактобактерия, ПРИМВПЯ?НОСТЬ. ti «ежмикробные взаимодействия ЛШРРИУГШЯ Ш vivo. Способность «колонизировать кишачныя тракт и исход мешик-робных взаимодействий лактобактерия in vivo определяются но только свойствами самих микроорганизмов, но и многими факторами, действующими со стороны макроорганизма. В связи с этим, нами было проведено изучение приживляемости и ыекыикробних взаимодействия лактобактерия In vivo на модели тотально декоктаыинк--рованних животных.

Установлено, что адгезивность In vitro не предопределяет приживляемость лактобактерия в кишечнике тотально деконтамини-рованных мышей. Тик, хотя штаммы L.acidophilus 69 (адгезивный к Фрагментам кишечника In vitro i и L.acidophilus 01 (адгезивный к эритроцитам) на первые сутки после отмены препаратов колонизировали кишечник в количествах 104- 10* КОЕ/г, однако, уже на следующие сутки они не выявлялись в количестве большем 10* КОЕ/г. так га как и низкоадгезивные in vitro итаммы L.delbrueckll subsp.lactls 4797 и L.acidophilus 06 (Рис.3 )

Рис.5 Приживляемость /шктобактерий в кишечника тотально деконтаминированных мышей

lg(KOE/r) исследуемого материала

яиЪ»р.1<1сЧ» Л797

ЕЕЩ 1-» сутхи L~J 2-е суткм

В то *зэ время, достаточно стабильные популяции а кишечнике тотально деконтаиннкрованных мыгаэй образовали как высокоадгезивный In vitro игами L.plantarua 72, так и низкоадгезивные штакиы L.acidophilic 11068 и L.acidophilus 22, что позволило провести изучение межмикробных взаимодействий in vivo между лактации F-продуцентом <L.acidophilus 110601, чувствительным In vitro к лактаиину Г иггаммом L.plantarum 72 и резистентным к лактацину F аггаммом L.acidophilus 22,

Установлено, что штамм L.plantarum 72, после трехкратного введения в дозе 1 .ОхЮ'м.т., колонизирует кишечник мытея в количестве 8,93±0,19 (lg КОЕ/г исследуемого материала!, После однократного введения 1аГ*-нгтамма L.acidophilus 11000 в лозе 1,0 xIO'Vt. уровень L.plantarum 72 на следупшие сутки понижался до значений < 4,0 Ив КОЕ/г», оставаясь в контрольной группе без

изменения (в,52±0,60 (lg КОЕ/г). Уровень штамма L.acidophilus 11006 в опытной группе животных через сутки после его введения составил 6,92±0,19 (1с КОЕ/г>. Этот штамм сам по себе колонизировал кишечник в количестве 7,73±0,26 и 6,63±0,25 <lg КОЕ/г) на первые и третьи сутки после отмены соответственно, т.е. в меньшей степени, чем штамм L.plantarum 72. Таким образом, дазиэ незначительная чувствительность штамма L.plantarum 72 к лактацину F, регистрируемая In vitro, приводила к его элиминации из кишечника мышей 1аГ~продуцентом, имевшим меньшую колонизирующую способность. С другой стороны штамм L.acidophilus 22, нечувствительный к лактацину F in vitro, не подвергался ингибируювэму действию 1аГ-продуцента In vivo: уровень L.acidophilus 22 у мышей опытной группу составил 4,64±0,37 (lg КОЕ/г), в контрольной 4,3б±0,29 (1с КОЕ/г). Уровень штамма L.acidophilus 11066 чорез сутки после его введения составил 7,76±0,31 (1с КОЕ/г) (Рис. 6).

Рис.6 Взаимодействие /юктобактерий в кишечнико тотально доконтаминированных мышой

ю

1д(КОЕ/г)

L.ocldopllu» 11088 L.plqntorum 72

Б23 l.plontanm 72 ■В 1«и<«мя» опнт

Iptoitewn П

контроль

L.acidophilus 11088 +| L.ocldophllut 22

CJTocMoittiü» 110« CD LacUofMM МОИ

/

Таким образом, наблюдалась способность экзогенного бактерн-оцин-продуцируюиего штамма лактобактерий после однократного введения янтрриять предсуп^гтиурэдя чувствительный к бактерио-цину штамм лактобактерий из кишечника тотально-деконтамшшро-ванных мышея, не оказывая влияния на уровень резистентного нггаима.

Влияние препаратор лактобактерий на выживаемость тотально облученных мышей. В результате проведенных экспериментов установлено, что laf*- штамп L.acidophilus 11068, так и laf3- штамм l.delbrueckll subsp. lactls 47Э7 че оказывают лечебного эффекта при экспериментальном постлучевом дисбактериозе кишечника, не увеличивая показателей выживаемости мышея по сравнению с контрольной группоп. Однако, в случае применения по аналогичной схема штамма L.acidophilus 22, наблюдалось достоверное увеличение средней продолжительности жизни мышей в опытной группе по сравнению с контрольной группой (12,13*1,26 и 7,33i0,59 суток соответсвенно) (р<0,01 I; в опытной группе к концу эксперимента выжило 12,53! мкнртй, в контрольной группе все животные погибли (Рис. 7).

Полученные результаты могут служить дополнительным подтверждением участия бактериоцинов в процессе взаимодействия экзогенных и индигенных лактобактерий. В качестве препаратов для лечения дисбактериозов кишечника должны использоваться такие штаммы лактобактерий, которые не являются продуцентами бактериоцинов и устойчивы к действию как можно большего числа бактериоцинов. Препараты с такими характеристиками не будут оказывать повреждающего действия на индигенный росток лактобактерий и, в свою очередь, будут устойчивы к действию бактериоцинов собственной лактофлоры кишечника больного.

Рис. 7 Влияние L.acidophilus 22 на -на выживаемость облученных мышей

X млиивсммости

100

ВО ;

во :

40 :

20 !

^ I / . . / 1 X 1 .т ¡Па»..........if..,,,!................- У

лни после облучения

в

ШШ Контроль НЭВ l.ocWophHm 22

Дайкым критериям удовлетворяет штамм L.acidophilus 22Г'MV6 позволяет рассматривать его как перспективный для создания нового препарата-эубиотика.

ВЫВОДЫ

1. Изучение антагонистической активности и колонизируете« способности лактобактерий в процессе отбора штаммов, перспективнь для создания препаратов эубиотиков целесообразно проводить метод« In vivo с использованием гнотобиологической модели.

2. На модели тотально деконтаминированных мышея в комплексе с гнотобиологической технологией установлено, что наибольшую антагонистическую активность по отношению к P.alrablls среди изученных штаммов лактобактерий In vivo проявляет штамм

L.acidophilus INF; способность» к колонизации кишечного тракта обладают штаммы L.acidophilus 22, L.acidophilus 72 и L.acidophilus 11068.

3. Штаммы L.acidophilus проявляют различную способность стимулировать образование Ig-продуцентов в lamina propria тонкой кишки и активировать перитонеальные макрофаги конвенциональных и тотально деконтаминированных мышея. В связи с этии, при отборе перииектииныл ни.шмон лактобактерия необходимо учитывать степень выраженности их иммуномодулируюших свойств.

4. Большинство из изученных штаммов лактобактерия чувствительны к ингибирующему действию лактацина F In vitro. Продуцент лактацина F аггамм L.acidophilus 11066 способен вытеснять чувствительный штамм L.plantarum 72 из кишечника ионоассоцииро-ванных мшкея.

3. Штаммы лактобактерия, применяемые для создания препаратов для лечения дисбактериоэов кишечника не должны продуцировать бактериоцины и долдаы быть резистентными к действию Оакте-риоцинов.

6. Биологические свойства штамма I.acidophilus 22 (широкий спектр антибиотикорезистентности, способность колонизировать кишечник экспериментальных животных, отсутствие продукции бакте-риоцинов и устойчивость к их действию) и оказываемый им лечебный эффект при экспериментальном постлучевом дисбактериоэе кишечника, позволяют рассматривать данный штамм как перспективный для создания нового препарата-эубиотика.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Влияние Lactobacillus acidophilus "Solco" на иммунологические показатели тотально-деконтаминированних мышея в условияк общей гнотобиологическоя изоляции, ТОЙ, 1992, N 11-12, с. 12-151 о соавт. с Н.Н. Мальцевой, V/.Bossart, В.М. Коршуновым).

2. Влияние препаратов L.acidophilus на иммунологические показатели конвенциональных и тотально декоитаминированных животных, Тезисы докл. XI научной конференции "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях", Челябинск, 1992, с. 96.( в соавт. с Боссарт В., Коркииой Л.Г.,о Коршуновым В.М.)

3. Сравнительная характеристика иымуномодулирующзя активности различных штаммов Lactobacillus acidophilus "Solco", 22.53)1, 1993 N 3, с. 31-93.IB соавт. с Н.Н.Мальцевой, W.Bossart, В.М. Коршуновым).

4. Experimental and Clinical Iiamunoaodulatlon Activity of Inactivated Lactobacillus Acidophilus "Solco" Preparations", Journal of Chenotherapy, 1993, 3 (euppl 1), p. 250-232. ( a cos с V.M. Korschunov, W. Boseart, B.V. Plnegln, E.A. Zueva, Л.Е. Shulzenko)

Подписано в печать 14/ ,93 Формат 60x84l/I6Печать офс. И-102 Объем ~ уч.-иэд.л. Т. 100 Зпкпэ . Бесплатно

Типография МИСИ им.В.В.Куйбышева