Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые подходы к химическому регулированию метаболизма биогенных аминов спермина и спермидина

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Новые подходы к химическому регулированию метаболизма биогенных аминов спермина и спермидина"

Хомутов Алексей Радиевич

НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ХИМИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ МЕТАБОЛИЗМА БИОГЕННЫХ АМИНОВ СПЕРМИНА И СПЕРМИДИНА

03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

1 о НОЯ 2011

Москва 2011

005001408

Работа выполнена в Лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных соединений Учреждения Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Официальные оппоненты:

чл.-корр. РАН, проф., д.х.н. Е.С.Северин чл.-корр. РАН, проф., д.х.н., В.И.Цетлин

проф., д.х.н., С.Н.Михайлов

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской Академии наук

Зашита диссертации состоится « ^Ч» /У_2011 г. в часов на заседании

диссертационного Совета Д 002.235.01 при Учреждении Российской академии наук

Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан

2011 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат химических наук

Актуальность проблемы. Биогенные полиамины спермин (Spm), спермидин (Spd) и их предшественник путресцин (Put) присутствуют в клетках всех типов в цМ-тМ концентрациях и жизненно необходимы для их нормального роста. Высокое внутриклеточное содержание Spm и Spd определяет разнообразие их клеточных фун кций, многие из которых остаются все еще малоизученными, что обеспечивает поступательное развитие этой области биохимии (см.обзор: Casero R.A. & Pegg А.Е. In: Polyamines: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, 720. 3-35. Springer Science+Business Media, LLC. 2011). При физиологическом значении pH полиамины сущгствуют в форме поликатионов. Spd и Spm взаимодействуют с ДНК, РНК и нуклеопротеидами, служат регуляторами активности топоизомераз, рестриктаз, а также ферментов биосинтеза ДНК и РНК. Полиамины участвуют в регуляции транспорта Са2+ митохондриями, являются модуляторами NMDA рецептора и эффекторами транспорта К+, а также регулируют процесс полимеризации тубулина. Spd служит единственным донором аминобутильного остатка, необходимого для посттрансляционной модификации (превращение остатка лизина в гипузин - Л^-(4-амино-2-оксибутил)-/,-лизин) фактора инициации трансляции eIF-5A, жизненно необходимого для всех эукариот. Наконец, Spd входит в состав трипанотиона - важнейшего метаболита протозойных паразитов.

Аналоги Spm и Spd являются одним из основных инструментов исследования ферментов метаболизма и клеточных функций полиаминов. Соответственно, направленное создание новых биологически активных производных полиаминов, расширение семейства весьма немногочисленных функционально-активных миметиков частично взаимозаменяемых Spm и Spd, изучение взаимодействия этих аналогов с ферментами метаболизма полиаминов, а также их активности на уровне культуры клеток и in vivo представляется вполне актуальным.

Целью работы являлось: (/)- разработка удобных способов получения системы неизвестных ранее С-метилированных аналогов Spd, //-ацетил-Spd и Spm; (и)- синтез неописанных ранее оптических изомеров а-метилполиаминов; (ш)- создание нового типа зарядодефи-цитного аналога Spm (SpmTrien) на основе триэтилентетрамина, а также ацетильных и бис-этильных производных SpmTrien; (ív)- получение оригинальных биологически активных гид-роксиламин содержащих аналогов Spm и агматина (последнее потребовало создания нового метода гуанидилирования аминооксигруппы); (v)- исследование взаимодействия С-метилированных аналогов полиаминов и SpmTrien с ДНК; (vi)- изучение взаимодействия синтезированных вещгств с ферментами метаболизма полиаминов, а также активности этих веществ в культуре клеток и in vivo.

Научная новизна. Разработаны удобные схемы синтеза системы неизвестных ранее С-метилированных аналогов Spd, Spm и yV'-auercw-Spd, позволяющие получать эти соединения с высокими выходами из доступных исходных вещгств и в количествах, необходимых для проведения экспериментов in vivo. Получены неизвестные ранее оптические изомеры а-метилполиаминов и Л'-ацетал-a-MeSpd. Синтезирован оригинальный зарядодефицитный аналог Spm - SpmTrien и его биохимически-значимые производные. Разработаны удобные

схемы синтеза аминоокси- и окса-аналогов Spm, а также бисубстратных ингибиторов спермин/спермидин-Л''-ацетилтрансферазы (SSAT) на основе аминоокси аналогов Spd и Spm. Впервые показано, что трифлат ди-Вос-гуанидина количественно гуанидилирует аминооксигруппу, что позволило получить ряд функционально-замещенных алкоксигуани-динов, включая и неизвестные ранее гидроксиламин-содержашие аналоги агматина.

Исследовано взаимодействие синтезированных С-метилированных производных Spd и Spm с ферментами метаболизма полиаминов, их влияние на антизим-зависимые пути регуляции гомеостаза полиаминов, а также способность аналогов восстанавливать рост клеток с истошснным пулом полиаминов. Оказалось, что биохимические свойства аналогов определяются положением метальной группы. Введение метальной группы в a-положение обеспечивает катаболическую устойчивость а-метилепермидина (a-MeSpd), но не а-метилепермина (a-MeSpm). Показано, что среди аналогов этого типа лишь у-метилепермидин (y-MeSpd) является функционально-активным метаболически устойчивым миметиком спермидина (у-MeSpd не является субстратом ни SSAT, ни сперминсинтазы, но способен восстанавливать рост клеток с истощзнным пулом полиаминов), что открывает новые возможности для исследования клеточных функций катаболически неустойчивых и легко взаимопревращаю шихся Spm и Spd. Найдено, что Р-метилспермидин (P-MeSpd), в отличие от подавляющего большинства аналогов Spd и остальных С-метилированных производных Spd, практически не индуцирует биосинтез антизима - небольшого белка блокирующего проникновение полиаминов в клетку, а также вызывающего диссоциацию орнитиндекарбоксилазы на субъединицы и осуществляющего их доставку в 26S протеосомы. Использование хиральных аналогов а-ме-тилированных полиаминов позволило впервые показать, что сперминоксидаза, дезоксигипу-зинсинтаза и ацетилполиаминооксидаза (АРАО), природные субстраты которых ахиральны, обладают стереоспецифичностью и найти изяшцый способ регулирования стереоспецифич-ности АРАО. Установлено, что a-метилполиамины способны выполнять жизненно важные функции их природных прототипов в культуре нормальных и опухолевых клеток, а также и in vivo, предотвращая развитие острого панкреатита у SSAT-трансгенных крыс и стимулируя регенерацию печени после частичной гепатэкгомии в условиях дефицита Spm и Spd.

Таким образом, впервые показано, что введение метальной группы в заданное положение полиаминного скелета и изменение конфигурации хирального центра позволяют тонко регулировать биохимические свойства аналогов полиаминов. Подобным образом построенные производные и аналоги представляют собой ценные инструменты исследования клеточных функций и метаболизма Spm и Spd in vitro и in vivo.

Практическая ценность работы. Повышенное содержание Spm и Spd в опухолевых клетках, жизненная необходимость полиаминов для развития возбудителей малярии, сонной болезни и лейшманиоза, а также наблюдаемые нарушения метаболизма полиаминов у больных панкреатитом и диабетом формируют прикладную составляющую исследований клеточных функций Spm и Spd и поиска новых регуляторов их метаболизма. Правомерность подоб-

4

ного подхода подтверждается успешным использованием а,а-дифторметилорнитина (DFMO) для лечения поздних стадий сонной болезни (Burri С.С. & Brun R. 2003. Parasitol. Res. 90, S49-S52) и противоопухолевой активностью терминально ЛуУ'-быс-апкилированных производных полиаминов, являющихся супериидукгорами SSAT (см.обзор: Casero R.A. & Marton L.J. 2007. Nat.Rev.Drug Discov. 6,373-390).

В настоящей работе впервые показано, что a-MeSpd способен предотвращать развитие острого панкреатита у SSAT-трансгенных крыс, возникающего в ответ на активацию фермента. Найдено, что активно транспортируемый в L.donovani 1-гуанидиноокси-З-аминопропан (GAPА), в отличие от других ингибиторов орнитандекарбоксилазы, эффективно препятствует размножению резистентных к сурьма-содержашим препаратам форм паразита, что открывает новые возможности для практической полиаминотерапии лейшманиоза.

Апробация работы. Отдельные части работы докладывались на: Polyamine Gordon Research Conference (Connecticut College, New London, CT, USA, June 2001); International Conference devoted to 100-year anniversary of Acad. A.E.Braunstein (Moscow, Russia, May 2002); International Conference on Biogenic Amines (Trento, Italy, June 2002); Biogenic Amines COST 922: Health implications of dietary amines (Trento, Italy, May 2004); The IX Spring Meeting of Synthetic Chemistry (Kuopio, Finland, June 2006); 1st International Conference on the Role of Polyamines and Their Analogs in Cancer and Other Diseases (Tivoli, Italy, September 2006); Biochemical Society COST Action 922: Health Implications of Dietary Amines (Aberdeen, Scotland, UK, October 2006); COST B22 Expert Meeting "Polyamines and Parasites" (Stockholm, Sweden, September 2007); International Conference "Polyamine: Forty Years of Mammalian Ornithine Decarboxylase" (Kuopio, Finland, June 2008); XI International Congress on Amino Acids, Peptides and Proteins (Vienna, Austria, August 2009); 2nd International Conference'on the Role of Polyamines and Their Analogs in Cancer and Other Diseases (Tivoli, Italy, December

2010); Polyamine Gordon Research Conference (Waterville Valley, New Hampshire, USA, June

2011); International Conference "Biogenic Amines 2011. Biochemical, Physiological and Clinical Perspectives" (Trento, Italy, September 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 36 статей.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на_стр. машинописного

текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части и выводов. Материал иллюстрирован_таблицами,_рисунками и

_схемами. Список цитированной литературы включает_наименований.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантами РФФИ: 03-04-49080, 06-0449638, 08-04-91317-ИНД, 08-04-91777-АФ, 09-04-01272, 10-04-92661-Инд; а также Федеральной целевой программой "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" (Госконтракг № 02.740.11.5134 от 09 марта 2010 г.) и Программой президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология"

Система метаболизма полиаминов включает в себя несколько ферментов (Рис. 1), скорость определяющими из которых на путях биосинтеза являются декарбоксилазы орнитина (СЮС) и 5'-адснозилметионина (АёоМеЮС), а на путях катаболизма - спермидин/спермин-УУ'-ацетилтрансфераза (ЗБАТ). Биосинтез и дефадация этих трех короткоживуших ферментов тонко регулируется на многих уровнях, в том числе и в ответ на изменения внутриклеточной концентрации полиаминов. Повышение содержания спермина (Эргп) и спермидина (Эре!) вызывает +1 сдвиг рамки считывания мРНК антизима (АЪ), что приводит к образованию функционального активного белка, который блокирует проникновение полиаминов в клетку, а также, связываясь с ОГЭС, вызывает диссоциацию фермента на субъединицы и осуществляет их доставку в 265 протеосомы. Повышение концентрации Брш и Эре! вызывает продуктивный сплайсинг мРНК ББАТ, что, вместе с А2-зависимыми механизмами регуляции, является одним из основных способов поддержания гомеостаза полиаминов в клетке.

Рис.1. Метаболизм полиаминов. ODC - орнитандекарбоксилаза; AdoMetDC - S-аденозилметиониндекарбок-силаза; SSAT - спермидин/спермин-^'-ацеталтрансфераза; АРАО- ацеталполиаминоксидаза; SMO-спермин-оксидаза; SpdSy-спермидинсинтаза; SpmSy - сперминсинтаза; AZ-антизим; AZI- ингибитор антазима.

Учитывая, что опухолевые клетки имеют повышенный уровень полиаминов по сравнению с нормальными, а также необходимость полиаминов для размножения болезнетворных трипаносоматидов (Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei gambiense, Leishmania donovani и т.п.) и то, что Spm и Spd входят в состав оболочки многих вирусов, в биохимии полиаминов большое внимание традиционно уделяется разработке подходов к истощгнию внутриклеточного пула Spd и Spm, приводящего к ингибированию роста клеток.

6

Соответственно были созданы разнообразные специфические ингибиторы ферментов биосинтеза полиаминов (см. обзоры: Wallace Н.М. & Fraser A.V. 2004. Amino Acids, 26, 353365; Seiler N. 2003. Curr.Drug Targets, 4, 537-564). В культуре клеток экзогенные Spm и Spd полностью обращают эффекты ингибиторов ферментов биосинтеза полиаминов, что подтверждает избирательность исходного воздействия на систему. Однако наиболее эффективным способом снижения уровня полиаминов in vitro и in vivo оказалась супериндукция SSAT - скорость определяющего фермента катаболизма полиаминов (см. обзоры: Casero R.A. & Woster P.M. 2009. J.Med.Chem., 52, 4551-4573; Casero R.A. & Marton L.J. 2007. Nat.Rev.Drug Discov. 6, 373-390). Так как в условиях супериндукции SSAT экзогенные Spm и Spd быстро катаболизируют и поэтому неэффективны, то оставалось неясным, обусловлены ли наблюдаемые эффекты только снижением уровней Spm/Spd в результате супериндукции SSAT или же они прямо не связаны с изменением содержания полиаминов в соответствующих органах и тканях. Для ответа на этот важнейший для биохимии полиаминов вопрос необходимо было создать систему катаболически устойчивых аналогов Spm и Spd, способных выполнять основные клеточные функции полиаминов. В общем смысле, значение подобных вешеств велико посскольку регуляция биохимических процессов подразумевает не только возможность вызывать необходимый ответ клетки или организма, но и способы обращгния эффекта, используя в том числе и химические соединения. Это позволяет оценить избирательность исходного воздействия и свидетельствует об адекватности наших представлений о исследуемом биохимическом процессе.

Изучение клеточных функций полиаминов на молекулярном уровне осложнено частичной взаимозаменяемостью и легкостью взаимопревращений Spm и Spd. Поэтому в этих исследованиях широко используются мугантные микроорганизмы и клетки (Cohen S.S. A guide to the polyamines. New York: Oxford University Press. 1998), а также трансгенные животные (см. обзор: Janne J., et aL 2004. Eur.J.Biochem., 271. 877-894), что позволяет активировать или «выключать» заданные ферменты метаболизма полиаминов и регуляторные механизмы, ответственные за поддержание гомеостаза полиаминов. Относительно простым решением, хорошо дополняющим существующие подходы и позволяющим дискриминировать клеточные эффекты Spm и Spd, может быть истощение внутриклеточного пула полиаминов и использование для обращения эффекта функционально активных миметиков Spm и Spd не способных к взаимопревращениям. Однако соединения с подобным комплексом свойств, равно как и функционально-активные аналоги Spm и Spd не индуцирующие биосинтез AZ, до настоящего времени не были известны.

Совокупность этих обстоятельств привела к необходимости синтеза системы неизвестных ранее С-метилированных аналогов Spm и Spd, включая их оптические изомеры,

и исследованию их взаимодействия с ферментами метаболизма полиаминов, а также эффектов в культуре клеток и in vivo, предполагая, что конкретные биохимические свойства аналогов будут определяться не только протонированным при физиологическом рН скелетом молекулы полиамина, но и положением метальной группы, а также и конфигурацией возникающего хирального центра. Результаты этих исследований представлены в первой части диссертационной работы.

Биохимические свойства Spm и Spd в значительной степени определяются правильным расположением аминогрупп, протонированных при физиологическом значении рН. Однако, вклад зарядовой составляющгй, по сравнению со структурным фактором в активность полиаминов малоисследован. Рациональным подходом для изучения вклада протонирования аминогрупп в функционирование полиаминов является констуирование изостерных "зарядодефицитных" аналогов, в которых рКа одной или двух аминогрупп понижена на несколько порядков по сравнению с аминогруппами Spm и Spd. Соответственно, во второй части настоящгй работы предложен и реализован оригинальный принцип конструирования "зарядодефицитных"аналогов Spm, заключающийся в замене Spd-фрагмента молекулы на изостерный ему триэтилентетраминовый. Сокращгние расстояния между вторичными аминогруппами, до двух метиленовых звеньев, приводит к снижению их основности. Аминооксианалоги Spm и Spd (Khomutov A.R., et aL 1996. Tetrahedron, 52, 13751-13766) принадлежат к другому типу "зарядодефицитных" аналогов полиаминов. Используя эти аналоги, которые, как и все О-заметенные гидроксиламины, являются карбонильными реагентами, были получены оригинальные «бисубстратные» ингибиторы SSAT, хорошо моделирующие промежуточный комплекс Ас-СоА-полиамин. Результаты этих исследований также представлены во второй части данной работы.

Успешное применение химических регуляторов метаболизма во многом определяется возможностью создания форм, активно транспортируемых в клетки. Попытка решения этой проблемы на примере 1-аминоокси-З-аминопропана (АРА), одного из наиболее эффективных ингибиторов орнитиндекарбоксилазы (ODC), действующгго на изолированный фермент в пМ концентрация, привела к 1-гуанидиноокси-З-аминопропану (GAPA), что стало возможным после того как нами был найден удобный метод гуанидинилирования аминооксигруппы. GAPA активно проникал в амастиготы L.donovani и был эффективен, в отличие от других ингибиторов ODC, и по отношению к солюсурмин-устойчивых формам паразита. Результаты этих исследований представлены в третьей части диссертационной работы.

Синтез рацемическиха-метилированных производных спермидина, Л^-ацетилспермвдина и спермина

Ингибирование О DC, ключевого фермента биосинтеза полиаминов, приводит к исто-щгнию пула Spd/Put и торможению роста клеток. Известно, что внесение в культуральную среду как Spd и Spm, так и их а-метилированных производных полностью восстанавливает

рост таких клеток (Lakanen J.R., et aL 1992. J.Med.Chem., " ' 35, 724-734). Однако активация катаболизма полиаминов в

результате индукции SSAT приводит к истощению внутри-h2n' "N' ^ * клеточного пула не Put/Spd, a Spm/Spd, поэтому a priori

Рис.2. ct-Метилированные аналоги полиаминов.

,nh2

a,a'-Me2Spm I не вполне очевидно, будут ли a-метилполиамины устойчивые к действию SSAT, поддерживать рост клеток с супериндуцированной SSAT, а также устранять в этих условиях патологические последствия дефицита полиаминов in vivo.

Описанные в литературе методы синтеза a-MeSpd, a-MeSpm и a,a'-Me2Spm позволяют получать эти соединения в количестве нескольких десятков миллиграммов с низким суммарным выходом (Lakanen J.R., et al. 1992. J.MedChem., 35, 724-734). Проблемы с растворимостью ключевых промежуточных соединений, а также трудоемкие процедуры выделения и очистки на последних стадиях синтеза, делают нецелесообразным воспроизведение и, тем более, масштабирование этих методик получения а-метилполиаминов. Соответственно, необходимо было разработать альтернативные схемы синтеза, позволяющие получать a-MeSpd, a-MeSpm и a,a'-Me2Spm с высокими суммарными выходами в количествах, необходимых для проведения экспериментов с лабораторными животными.

Среди разнообразных методов создания C-N-связи, используемых для получения поли-лиаминов (см. обзор: Kuksa V., et al. 2000. Synthesis, 9, 1189-1207), в настояцвй работе для построения скелета аналогов полиаминов было использовано алкилирование избытка амина ме-тансульфонатами соответствующих А'-защищенных аминоспиртов (Схема 1). Основным ин-термедиатом в синтезе a-MeSpd является JV-Cbz-3-аминобуганол (3), который был получен восстановлением L1AIH4 коммерчески доступного этилового эфира 3-аминомасляной кислоты (1) и последующим Л'-карбобензоксилированием аминоспирта (2). Ключевой стадией синтеза

Схема 1

(1) Et R f»1 Cbz (S) H L

,,£2:R=R,=H ♦_

»Ci Rlcbz! rI'ms [Ac-«-MeSPd) 6f* H. (5)

(i> LiAUit/THF/Д; (ii)- CbzCl/THF/H20/NaHC03; (ш> MsCl/Et3N/CH2Cl2; (/v)- H2N(CH2)4NH2/THF; (v)- (/) H2/Pd/AcOH/MeOH; (2) HCI/MeOH; (vi> (/) Boc20; (2) H2/Pd; (3) AcCVEl,N/THF; (V) HCl/MeOH.

являлось алкилирование 1,4-диаминобутана метансульфонатом (4), которое проводили при 0°С, что позволило уменьшить количество минорных побочных продуктов, трудно отделяемых от A'-Cbz-a-MeSpd (5) хроматографией на силикагеле. Защитную группу удаляли каталитическим гидрированием над Pd-чернью и целевой легко кристаллизующийся из водного спирта трихлоргидрат a-MeSpd был получен с суммарным выходом 43%, считая на (1).

Для построения скелета a-MeSpm полиаминную цепь последовательно наращивали алкилируя соответствующие амины мезилатами ÍV-защищенных аминоспиртов (Схема 2), в целом, аналогично описанному выше для a-MeSpd, что позволило получить целевой а-MeSpm в виде хорошо кристаллизующегося тетрахлор гидрата с выходом 41%, считая на (4).

Схема 2

(4) -L — -[^Д на С)

Cbz R2 /íf-6: Rj=R3=H Cbz Cbz ,¿7:R2=Cbz,R3=H "'^8: R2=Cbz, R3=Ms

(i> H2N(CH2),,OH/THF; (¡i> CbzCI/THF/H20/NaHC03; (íii>- MsCVB3N/CH2C12; (¡v)- H2N(CH2),NH2/THF; (v>- (/) H2/Pd/AcOH/MeOH; (2) HCl/MeOH.

Описанная выше линейная стратегия малоэффективна для получения a.a'-KfeSpm. Симметрия молекулы целевого соединения позволила осуществить конвергентный синтез (Схема 3), ключевой стадией которого являлось алкилирование быс-о-нитрофенилсульфо-нильного (Ns) производного 1,4-диаминобутана (11) A'-Cbz-З-амшюбугилбромидом (10) и целевой a,a'-Me2Spm был получен в виде тетрахлоргидрата с суммарным выходом 57%, считая на (4).

Схема 3

[a,g--Me2Spm ) 57%, на (4)

R Cbz H (11)

¡C 4: R=Cbz, R,=OMs МО: R=Cbz, R,=Br

(i> LiBr/THF; (ii> (/) NsNH(CH2)4NHNs/DMF/K2COj; (2) PhSH/DMF/K2C03; (iiiy (/) H2/Pd/AcOH/MeOH; (2) HCl/MeOH.

Синтезированные такими способами a-MeSpd, a-MeSpm и a,a'-Mc2Spm по данным ВЭЖХ в стандартных условиях анализа полиаминов (Hyvonen Т., et al. 1992. J.Chromatogr., 574, 17-21) имели чистоту более 99.5%.

Активность рацемических a-метилированных аналогов Spd и Spm in vivo

Активация катаболизма полиаминов в результате супериндукции SSAT нетоксичными дозами солеи Zn2+ и диэтил-но/т-Spm (индуктор SSAT) у SSAT-трансгенных крыс приво-

CoBMec-mo c Prof. J.Janne, Prof. LA lh on en, Dr. T.Keinanen h Dr. A.Jarvinen (A.I.Virtanen Institute for Molecular Sciences, University of Eeastera Finland, Kuopio, Finland).

дит к истощению пула Spd и Spm, наиболее выраженному в поджелудочной железе и печени, и развитию острого некротизируюшгго панкреатита, который вызывает 100% гибель животных в течение 72 ч (Alhonen L., et al 2000. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 9Т, 8290-8295). К моменту начала настоящего исследования не было известно способов обеспечения функциональной целостности поджелудочной железы на фоне активации SSAT.

Оказалось, что даже однократное введение a-MeSpd (50 мг/кг) SSAT-трансгенным крысам до индукции фермента полностью предотвращало развитие острого панкреатита. Более того, введение крысам a-MeSpd илиа.а'-МегЗрш через 6 ч после индукции фермента существенно снижает тяжесть заболевания и исключает смертность животных как минимум в течение 14 сут (выживаемость составляет 100% в случае a-MeSpd и 90% в случае a,a'-Mc2Spm). Соответственно, именно дефицит полиаминов, по-видимому, является причиной развития панкреатита у SSAT-трансгенных крыс. Следует отметить, что в поджелудочной железе a,a'-Me2Spm эффективно (~ на 35% за 48 ч) расцеплялся до a-MeSpd, что свидетельствует о его катаболической неустойчивости in vivo.

Известно, что одним из факторов инициации острого панкреатита является активация трипсиногена, однако молекулярные механизмы этого процесса окончательно не установлены (Halangk W., et al_2002. Am.J.PhysiolGastrointest.Liver Physiol, 282, 367-374). При обработке солями Zn2+ изолированных ацинарных клеток поджелудочной железы SSAT-трансгенных крыс наблюдается быстрое снижение внутриклеточной концентрации полиаминов в результате индукции SSAT и существенное повышение активности трипсиногена. Предварительное введение животным a,a'-Me2Spm блокирует активацию трипсиногена в ацинарных клетках, что свидетельствует о возможном участии полиаминов в процессах регуляции активности клеточных протеаз.

Следует отметить, что и на других лабораторных моделях развитие панкреатита сопровождается активацией катаболизма полиаминов в поджелудочной железе, приводящгй к истопению пула Spm и Spd. Подобные изменения были отмечены у немногочисленных обследованных пациентов, страдающих острым или хроническим панкреатитом. Поскольку набор вешеств, используемых для терапии острого панкреатита весьма ограничен, можно предположить, что катаболически устойчивые аналоги Spm и Spd представляют определенный интерес и для практической медицины.

Регенерация печени крыс после частичной гепатекгомии была одним из первых примеров, на котором in vivo удалось показать необходимость полиаминов для нормального роста животных клеток (Janne J. 1967. Acta Physiol.Scand Suppl, 300. 1-71). На ранних стадиях регенерации наблюдается увеличение концентрации Put и некоторое снижение уровня Spd, а количество Spm практически не изменяется. У SSAT-трансгенных крыс частичная гепатэкго-мия сопровождается резким снижением уровня Spd (Alhonen L., et aL 2002. Biochem.J., 362. 149-153), по-видимому, из-за самопроизвольной индукции SSAT в результате операционно-

го вмешательства. У таких крыс способность печени к регенерации восстанавливается лишь через 3 сут, когда за счет высокой активности О DC уровень Spd в печени вновь достигает предоперационного значения. Введение SSAT-трансгенным крысам o-MeSpd перед операцией снимает блок регенерации печени, что указывает на важность полиаминов для нормального протекания регенерационных процессов. Таким образом, казалось, что именно Spd а не Spm необходим для обеспечения процессов регенерации печени крыс. Однако, введение a,a'-Me2SpmSSAT-TpaHcreHHbiM крысам перед частичной гепатэкгомией показало, что этот аналог Spm столь же эффективен, как и a-MeSpd. Превращгние a,a'-Me2Spm в a-MeSpd в печени, в отличие от поджелудочной железы, происходит лишь в незначительной степени и концентрация a-MeSpd, образовавшегося из a,a'-Me;Spm, оказывается намного ниже необходимой для инициации регенерации. Таким образом, в данном случае Spm и Spd взаимозаменяемы. Исследование влияния (R,R)- и (5',5)-диастсреомеров a,a'-Me2Spm (синтез и биохимические свойства диастереомеров описаны в следующих разделах) на способность печени SSAT-трансгенных крыс к регенерации после частичной гепатэкгомии показало, что оба диастереомера одинаково эффективны, т.е. стереоконфигурация аналога несущественна.

Таким образом впервые был найден способ обращения последствий супериндукции SSAT in vivo, позволяющий предотвращать развитие острого панкреатита у SSAT-трансген-ных крыс и показано, что a-MeSpd и a.a'-MeiSpm представляют собой функционально-активные миметики Spd и Spm, соответственно. Полученные данные о метаболизме рацемических форм этих аналогов свидетельствовали о необходимости получения индивидуальных изомеров и диастереоизомеров и детального изучения их взаимодействия с ферментами биосинтеза и катаболима полиаминов.

Синтез оптических изомерова-метилированных полиаминов

Молекулы a-метилполиамшюв хиральны, а оптические изомеры известных хираль-ных аналогов полиаминов обладают разной биологической активностью. Так, среди изомеров 2,10-дигидpoкcи-./V, Д"-диэтилнорспермина и 2,10-дигидрокси-Л'1-циклопропилметил-Л^'-этилнорспермина лишь один диастереомер каждого из веществ оказался супериндукго-ром SSAT (Bergeron R.J., et al 2001. J.Med.Chem., 44, 2451-2459). Можно ожидать, что и сте-реоизомеры а-метилполиаминов будут по-разному узнаваться клеточными полиамин-связы-ваюшими сайтами и проявлять различную биологическую активность.

Учитывая, что структура целевых а-метилполиаминов не слишком сложна, рациональ-нальным подходом представлялось использование коммерчески доступных энантиомерио чистых исходных соединений. Поэтому для построения 3-аминобутанового фрагмента требуемой конфигурации использовали энантиомеры 2-аминопропанола (12), углеродный скелет которых удлиняли на 1 атом алкилированием цианид-иона мезилатом Л'-Вос аланинола (14), что приводило к нитрилу (15). Нитрилы (15) восстанавливали LiAlH» в эфире при -5'С, что

12

без рацемизации приводило к аминам, которые превращали в о-нитрофенилсульфонильные (N8) производные (16), служившие универсальными хиральными блоками для синтеза всех оптических изомеров а-метилполиаминов (Схема 4). Для получения энантиомеров а-Ме8рс1 соединения (16) алкилировали Л'-(4-йодбугил)-фгалимидом, что приводило к полностью защищенному триамину (17). Удаление №-групп приводило к дизащищенным а-МеБрс!, которые очишали хроматографией на силикагеле. После удаления Вое- и фгалильной защитных групп целевые (Л)- и (.!>)- изомеры а-Ме5рс1 были выделены в виде трихлоргидратов с суммарными выходами 43% и 45%, считая на (12а) и (12 Ь), соответственно.

Схема 4

нЛ-0^ — ^ нм^мн ^ _

^ ¿ос Вое № Вое № \ [(Я)-а-Ме5рс1 |

12а: (КУ. (15а,Ь) (16а,Ь) "" 117а'Ь> 43%, на (12а)

12а: (/?)-; R=R,=h1 12b: (S)-; R=R,=hJ) / 13a,Ь: R= Boc, R,= H^(7 14a,b: R= Boc, R

_ ( N-Ac-(R)-g-IVIoSpcl ] 43%, на (12a) ( (S)-g-MeSpd )

= Ms) " [ W-Ac-(S)-q-MeSpt) ) 43%, на (12b) 45%, на (12b)

(i> Boc20/B3N/CHCl3; (iî> MsC1/B3N/CH2C12; (Ш)- NaCN/DMSO, 40'C; (iv)- (I) LiAlH,/B20, -5T; (2) NsCl/B3N/CH2Cl2, 0°C; (v>- PhtN(CH2)jI/K2C03/DMF; (w> (/) PhSH/K2C03/DMF; (2) N2H,/BOHM; (3) -HCl/MeOH; (wï)- (!) HCl/MeOH; (2) AcCl/B3N/THF; (j) PhSH/K2C03/DMF; (4) N2R,/BOHM; (S) HCl/MeOH.

Для получения (R)- и (S)-a-MeSpm сульфамиды (16) обрабатывали избытком 1-бром-4-хлорбутана в DMF в присутствие поташа (Схема 5). Полученные хлориды превращали в иодиды (18), которые вводили в реакцию с избытком 1,3-диаминопропана и соединения (19) очишали колоночной хроматографией на силикагеле. Следует отметить, что диамины (19) оказались неустойчивы при хранении, вероятно из-за внутри- или межмолекулярного заме-ивния сульфамидной группы. Эти наблюдения вполне согласуются с тем, что Ns-группа легко удаляется под действием алкил- и арилсульфид-анионов, нуклеофильность которых значительно выше чем у аминогруппы. Защитные группы в соединениях (19) удаляли последовательной обработкой тиофенолом в DMF и затем раствором НС1в абс.этаноле. Последующая перекристаллизация из НгО-МеОН-ЕЮН приводила к целевым тетрахлоргидратам (R)- и (.S')-a-MeSpm с суммарными выходами 32% и 33%, считая на (12а) и (12Ь), соответственно.

Схема J (W-q-MeSpm)

' ^ ^"Ч. ^n. -N^ .NHî 32%, на (12a)

-LJI.I M ^ 1 -I Ikl ------------— ------'2 -». 1 I '

(16а,Ь)

(19а,Ь)

[ (S)-g-MeSpm ] 33%, на (12Ь)

(<> (!) Cl(CH2)4Br/DMF/K2C03; (2) NaI/(CH3)2CO; (ii> H2N(CH2)3NH2/THF; (iii)- (1) PhSH/K2C03/DMF; (2) HCl/ВОН.

Молекула a,a'-Me2Spm симметрична и поэтому сущгствуют лишь три диастереомера - (R,R), (S,S) и (RS). Для получения (R,R)- и (S,S)- изомеров a,a'-Me2Spm сульфамиды (16) вводили в реакцию со стехиометрическим количеством дииодбутана и затем "one-pot" удаля-

ли №-группы (Схема 6). При этом следы не вошедших в реакцию соединений (16) после де-нозилирования превращались в соответствующие (Д)- и (Б)-изомеры Ыг-(трет-бутилоксикар-бонил)-1,3-диаминобутана, которые плохо отделялись хроматографией от ди-Вос-производ-ных (20). Поэтому перед удалением №-групп к реакционной смеси прибавляли бензилбромид (10 мольн. %) для алкилирования не вошедших в реакцию с дийодбуганом нозилатов (16). Такая последовательность операций позволяла легко выделять в чистом виде ди-Вос-производ-ные (20). После удаления Вос-групп целевые и (^^-ад'-МегЭрт получали в видетет-рахлоргидратов с суммарными выходами 42% и 46 %, считая на (12а) и (12Ь), соответственно

Схема б

(16а,Ь) |(*Я)-"-а'-Мег3рт |42%-на (12а)

Вое н 20а: (ЯК) ((5,5)-ц,а'-Ме2Зрт ) 46%, на (12Ь)

20Ь: (Я,в) 20с: (Я,в)

(16a) JU 20с:: (R,sj [(ff,s)4i,a'-iuie2sim~) 40%, на (12b)

(<> (/) I(CH2)4I/K2C03/DMF; (2) PhSH/K2C03/DMF; (ii> nb^COj/DMF; (2) PhSH/K2C03/DMF; (ш> HCI/EtOH.

Мезо-форму a,a'-Me2Spm получали из иодида (18Ь), который обрабатывали стехио-метрическим количеством сульфамида (16а) (Схема 6) аналогично описанному выше для (R,R)- и (.ЗД-диастереолмеров и (/?,5)-ди-Вос-а,а'-Ме25рт (20с) выделяли хроматографией на силикагеле. Вос-группы удаляли действием НС1 в абс.этаноле и целевой (R,S)-a,a'-Me2Spm получали в виде тетрахлоргидрата с суммарным выходом 40 %, считая на (12Ь).

Синтезированные такими способами неописанные ранее изомеры a-MeSpd и a-MeSpm, а также диастереомеры а.а'-МегЭрт по данным ВЭЖХ в стандартных условиях анализа полиаминов (Hyvonen Т., et al 1992. J.Chromatoer.. 574. 17-21) имели чистоту более 99.5%.

Взаимодействие оптических изомеров а-метилированных аналогов Spm и Spd с ферментами метаболизма полиаминов и клетками

Spm, Spd и их N1-ацетильные производные представляют собой ахиральные молекулы и до начала наших исследований в литературе отсутствовали какие-либо данные о стереоспе-цифичности ферментов их метаболизма. Вместе с тем, исходя из обших соображений, а также основываясь на различиях в активности хиральных аналогов дезоксиспергуалина (Lebre-ton L., et aL 1999. J.Med.Chem., 42, 4749-4763) и гидроксилированных производных диэтил-нср-спермина (Bergeron R.J., et al. 2001. J.Med.Chem., 44, 2451-2459), можно было предположить существование скрытой стереоспецифичности соответствующих ферментов. Если это предположение справедливо, то использование оптических изомеров а-метилированных аналогов Spm и Spd открывает неизвестные ранее подходы к тонкому регулированию акгивнос-

Сопмсстно с Prof. J.Janne, Prof. LAIhonen, Prof J.Vepsalainen, Dr. T.Keinanen, Dr. M.Hyvonen и Dr. AJarvinen (A.l.Virtanen Institute for Molecular Sciences and Department of Biosciences, University of Eeastem Finland, Kuopio, Finland).

Субстрат К„ *„,

ти ферментов метаболизма полиаминов и, что не менее важно, новые возможности прецизионного воздействия на гомеостаз полиаминов в клетке.

Уже первые эксперименты показали, что флавин-зависимая ацетилполиаминооксида-за (АРАО) предпочтительно окисляет (й)-изомер N-Ac-a-MeSpd (Табл. 1).Таким образом, впервые было показано, что АРАО, природными субстратами которой служат ахиральные

/И-Ac-Spd и iV'-Ac-Spm, обладает скрытой сте-рсоспецифичностью.

№-AC-Spd 14.0 цМ 8.5 S'1 607,143 M"'s' _ - , _ . j А ,, .

Табл. 1. Окисление расщепление yv-Ac-Spd и томе-

(Ю-Ac-a-McSpd 95.0 рМ 9.0 s ' 94,737 M'г' ров /V-Ac-a-MeS pd под действием (АРАО).

(S)-Ac-a-MeSpd 170.0 цМ 1.2 s"' 7,059 MV Известно, что АРАО способна в присутствии

ароматических альдегидов эффективно окислять и неацетилированный Spd (Holtta Е. 1977. Biochemistry, HS, 91-100). Механизм этой реакции не исследован, а первоначальное предположение о промежуточном образовании в растворе оснований Шиффа (Holtta Е. 1977. Biochemistry, 16, 91-100) представляется маловероятным при проведении реакции в 0.1 M глициновом буфере, а также, учитывая что взаимодействие ароматических альдегидов с 1,3-диаминопропанами приводит к достаточно сложной смеси продуктов, включая и циклические структуры (Metzler С.M., et al. 1980. J.Am.Chem. Soc., 102, 6075-6082). Оказалось, что бензальдегид (ВА) катализирует растепление преимущественно (Ä)-a-MeSpd, а в присутствии пиридоксаля (PL) субстратом оказывается уже (S)-изомер (Табл. 2). Напротив, 4-пиридинальдегад (4-Py-Ald) не способен осуществлять стерео-контроль реакции и одинаково эффективен как в случае (Л)-, так и (5)-изомеров a-MeSpd.

Табл. 2. Окислительное расщепление Spd и изомеров a-MeSpd АРАО. в присутствии бенз-альдепща (ВА), пиридоксаля (PL) и 4-пири-динальдегнда (4-Py-Ald). Таким образом, при помоши ахиральных ароматических альдегидов нам впервые удалось найти изящный способ регуляции стереоспецифичности АРАО, позво-ляюий избирательно окислять аналоги субстрата только (R)- или только (^-конфигурации, что весьма необычно не только для фпавин-зависимых оксидаз, но и для энзимологии в целом.

Недавно в животных клетках была обнаружена сперминоксидаза (SMO) - новый фла-вин-зависимый фермент, окисляющий Spm в Spd без предварительного М'-ацетилирования (Wang Y., et al. 2001. Cancer Res., 61, 5370-5373). Так как родственная флавин-зависимая АРАО обладает скрытой стереоспецифичностью (см.вышг), то мы исследовали взаимодействие (R,Ry и (.ЗД-диастереомеров a,a'-Me2Spm с рекомбинантной SMO. Оказалось, что суб-

15

Субстрат КИ ^cal

Spd + 5 mM ВА 9.4 рМ 0.85 s' 79,000 M's-'

+ б тМ 4-Py-Ald 37 рМ 0.31 S"' 8,400 M'S''

+ Б mM PL 25 цМ 0.49 s-' 20,000 M-'s-'

(R)-a-MeSpd + 6 тМ ВА 14 цМ 0.68 s-' 34,000 M-' S'1

+ 6 тМ 4-Py-Ald 65 цМ 0.18s-' 1,600 M-'S-'

+ 5mMPL 31 цМ 0.01 S'1 1,700 M'S-'

(S)-a-MeSpd + 6 тМ ВА 14 цМ 0.06 S-' 4,300 M-'s-'

+ 5 тМ 4-Py-Ald 44 цМ 0.09 s-' 2,000 M'S-'

+ S тМ PL 6.1 цМ 0.24 s-' 47,000 M-'s-'

сгратными свойствами обладал лишь (5',5)-а,а'-Ме28рт, а эффективность его расщепления была даже несколько выше, чем у Эрш (Табл. 3). Таким образом, нам впервые удалось пока-казать, что БМО, как и АРАО, обладает скрытой стереосиецифичностью. При этом, АРАО

предпочтительно расщепляет (Д)-Л'-Ас-а-Ме8рс1, а субстратом ЭМО, напротив, служит лишь (З^-оца'-МегБрт.

Табл. 3. Окислт-ельное расщепление диасте[номеров а,а'-Мез5рш сперминоксидазой.

Субстрат км Кс „ж.,

Spm 8.0 цМ 11.4 S'1 1,426,300 Щ-'г1

(S,S)-<x,ce'-Ms2Spm 2.0 цМ 6.96 S'1 2,980,000 M 's"' (R,R)-a,a'-Me2Spm 6.1 цМ 0.04 S'1 6,667 M'1S'1

Аминокислота гипузин (Л'Е-(4-амино-2-оксибутил)-1-лизин), входящая в состав высококонсервативного участка фактора инициации трансляции elF5A, присутствующего у всех эукариот, представляет собой одно из наиболее известных и метаболически-значимых кова-лентных производных Put (см. обзор: Park М.Н. 2006. J.Biochem.(Tokyo), 139. 161-169). Так как немодифицированный elF5A неактивен, то не всегда возможно однозначно определить, связано ли замедление роста клеток, вызванное снижением внутриклеточной концентрации Spd (единственный донор амипобугильного фрагмента), только с нарушением биосинтеза ги-пузина или имеет другие полиамин-зависимые причины. Располагая системой изомеров а-MeSpd и диастереомеров ад'-МегБрш, мы попытались дискриминировать гипузин-опосре-дованное ингибирование роста клеток и последствия, прямо не связанные с нарушением биосинтеза гипузина. Оказалось, что (R)- и (5^-изомеры a-MeSpd, а также и все три диастереоме-ра a,a'-Me2Spm, в равной степени способны поддерживать рост клеток DU145 в течение первых 6 суг инкубации с DFMO (Рис. 3). Однако, при более продолжительном времени ин-

гибирования ODC снижение внутриклеточной концентрации Spd становится критическим.

1.2

I '■<> "] 0.8

8. 'з

5 0.«

I

■

6

9 сут И12 сут

Рнс. 3. Изомеры a-MeSpd и диастереомеры a ,ot' -Me2Spd по-разному поддерживают рос i клеток DU145 с истощенным пулом Spd и Put. Клетки DU145 выращивали в присутствии 5 шМ DFMO в течение 3, 6, 9, или 12 дней без добавления a-MeSpd/ a,a'-Me2Spm (контроль), или в присутствии аналогов (100 |дМ). D, DFMO; R, (rt)-a-MeSpd; S, (S')-a-MeSpd; RR, (R,R)-a,a'-Me2Spm; SS, (S',S)-a,a'-Me2Spm; RS, (/¡,S)-a,a'-Me2Spm

d+r d*s *rr ths.s D+R,s Из исследованных аналогов лишь (¿O-a-MeSpd

Контр. О

и, в меньшей степени, (.ЗД-а.а'-МегЗрт, который частично катаболизировал до (51-a-MeSpd, эффективно поддерживали рост клеток. Эти результаты прямо указывают на существование двух независимых причин замедления роста клеток, вызываемых истощением пула 8рс1.

Неспособность (Л)-a-MeSpd поддерживать рост клеток ОШ45 при инкубации с ОРМО более 6 сут привела к необходимости исследования субстратных свойств (Д)- и (бензомеров a-MeSpd в дезоксигипузинсинтазной реакции, которая является скорость-опреде-ляюшей стадией биосинтеза гипузинилированного еШ5А (Рис. 4). Субстратные свойства изо-

меров оценивали по образованию гомоспермидина, который в отсутствии eIF5A возникает при инкубации дезоксигипузинсинтазы (DHS) со Spd или его аналогами в присутствии альтернативного акцептора аминобутильного фрагмента - [l4C]-Pul.

Рис. 4. Образования дезокси) мп\ шнил -el15Л н гомоспермидина в дезоксигнпузинсинтазной реакции (по данным работы: Park J-R, et al. 2003. (CHJMH, J.Biol.Chem., 278, 32683-32691)

NH2(CH2)3NH^ |-vNADH

"/k

ilF6A„

Lys' NADhU

NAD'

NADH-^ NAD*

elFSA^

Донором аминобутильного фрагмента в де-зоксигипузинсинтазной реакции оказался лишь (5)-a-MeSpd, т.е. впервые было обна-дезоксигипузишш-eiFSA Гомоспермидип ружено, что дезоксигипузинсинтаза облада-

ет скрытой стереоспецифичностью (Рис. 5). Это свойство фермента позволило при помоши (й)- и (5)-изомеров a-MeSpd показать, что сначала замедление роста клеток определяется дефицитом собственно полиаминов, а гипузин-опосредованные эффекты начинают проявляться существенно позднее.

s?

Я

i

-*- 3

tu s

S 2

со

О

S 1

cl

Ю л

О о

|Ю цМ Ш25цМ

R/S-MeSpd R-MeSpd S-MeSpd Spd

Рис. 5. Субстратные свойства сте|)еонтомров a-MeSpd в дезокснгнпузинсннтазной реакции.

Реакционная смесь (50 р!) содержала 0.2 M Gly-NaOH буфер (рН, 9.5), 50 pg BSA, 1 гаМ DTT, 1 mCi [|,!q-Put (100 mCi/mmol), 1 mM NAD, 10 рМ и 25 pM Spd или 10 рМ и 25 рМ изомеров MeSpd и 1.0 pg рекомбинантной DHS человека.

Системе активного транспорта Spm и Spd

отводится важное место в поддержании гомеостаза полиаминов. Поэтому были исследованы особенности транспорта хиральных аналогов Spm и Spd в клетки DU145. Оказалось, что содержание изомеров a-MeSpd и диастереомеров a,a'-Me2Spm в клетках было сопоставимо с содержанием Spm и Spd, что указывало на активный транспорт аналогов (данные не приведены). Однако изомеры a-MeSpd и диастереомеры a,a'-Me2Spm по-разному конкурировали за транспорт со Spd и Spm, а наименее эффективными оказались (S)-a-MeSpd и (S,S)-a,a'-Me2Spm (Рис. 6).

Рис. 6. Транспорт ст|)ерео-SPm изомеров MeSpd (а) и Rae Me2Spm (b) в клетки

RR DU145. Клетки инкубиро-=355 вали в течение 10 мин с 10 RS pM [,4q-Spd (а) или 10 рМ [,4C]-Spm (b) в присутствии 1, 10 или 100 рМ исследуемого стереоизомера. R, (/Í)-a-MeSpd; S, (í)-a-MeSpd; RR, (7í,/?)-a,a'-Me2Spm; SS, (S,S)-a,a'-Me2Spm; RS, (R,S) -a,a'-Me2Spm

Таким образом, система транспорта полиаминов обладает стереоспецифичностью, что позво-

10 100 Аналоги (рМ)

1 10 100 Аналогиям)

ляет регулировать доступность их аналогов, изменяя конфигурацию хирального центра.

Одним из важнейших регуляторов внутриклеточного содержания полиаминов является небольшой белок антизим (А2), биосинтез которого индуцируется в ответ на повышение концентрации полиаминов в клетке (5рт и Эре! вызывают +1 сдвиг рамки считывания мРНК А2., приводящий к образованию активного белка). АЪ связывается с ОЕ)С, вызывая диссоциацию фермента на субъединицы, которые не обладают декарбоксилазной активностью, что приводит к снижению активности ОЭС в клетке. Однако эффекты диастереомеров а,а'-МегЭрш значительно отличались, а (5',5)-а,а'-Ме28рт по своей активности превосходил даже

ОРМО (Табл. 4).

Контроль (R,R)-a, a'-MejSpm

(S,SJ-a,a'-Me2Spm (R,S)-a,a'-Me2Spm DFMO

Активность ODC (pmol/hna И ДИК)

5.99 ±0.46

1.58 ±0.03

0.05 ± 0.00 0.92 ±0.09 0.17±0.04

Активность SSAT (pniitl.'II) mil) nit fig ДНК)

11.5 ± 1.5 12.4± 0.1

24.0 ± 2.3

14.6 ±0.7 10.7± 1.0

Табл. 4. Влияние диаст(:|)еомеров a,a'-Me2S pm (100 pM) на активности ODC и SSAT через 72 ч инкубации клеток DU145 с аналогами Spm.

Таким образом, изменяя конфигурацию хирального центра a-MeSpd (данные не приведены) и a,a'-Me2Spm, удается регулировать активность ODC в клетке, по-видимому, через AZ-опосредованные механизмы.

Известно, что помимо диссоциации ODC на субъединицы AZ ингибирует и транспорт полиаминов в клетки. Поэтому был исследован транспорт изомеров a-MeSpd и a,a'-Me2Spm в присутствии и отсутствии СНХ (ингибитор биосинтеза белка в клетке). Оказалось, что ин-

гибирование биосинтеза AZ сильнее всего сказывается на накоплении (5,iy)-a,a'-Me2Spm и (5)-a-MeSpd (Рис. 7), т.е. именно тех изомеров, которые наиболее эффективно снижают активность ODC в клетке (Табл. 4). Таким образом,

Рис. 7. Влияние биосинтеза AZ на транспорт сте|)еоизомеров MeSpd и Me2Spm в клетки DUI45. Клетки инкубировали с или без СНХ (10 ng/ml) в течение 1 ч, а затем в присутствии аналогов (100 цМ) еще в течение 2 ч. R, (fl)-a-MeSpd; S, (S)-a-MeSpd; RR, (R,R)-R S RR SS RS «.«'-M^Spm; SS, (S^)-a,a'-Me2Spm; RS, (R,S)-a,a'-Me2Spm. ■■ с chx czi без енх используя оптические изомеры Spm и Spd удалось оригинальным образом воздействовать на процессы биосинтеза AZ. Вместе с тем, следует отметить, что молекулярные механизмы стереоконтроля +1 сдвига рамки считывания мРНК AZ изомерами Spd и Spm остаются неясными, как и эффекты собственно Spm и Spd также не имеющие однозначной интерпретации (Kurain L., et al. 2011. Nature, £77, 490-494).

Синтез рацемических Р-,у- ию-метилированных аналогов спермидина, /У'-ацетилспермидина и спермина

Неизвестные ранее изомеры а-метилированных полиаминов, впервые синтезированные в ходе выполнения настоящего исследования, оказались ценным инструментом исследо-

вания клеточных функций Spm и Spd, ферментов их метаболизма и регуляторных механизмов, ответственных за поддержание гомеостаза полиаминов в клетке. Оказалось, что конфигурация а-углеродного атома "is a hot point of polyamine molecule". Вместе с тем, вопрос о существовании других критических точек в молекулах Spm и Spd, существенных для корректного узнавания и функционирования полиаминов в клетке, оставался открытым. Более

0 того, учитывая раз-

HjN'^T^N---P-MeSpd Л/'-Ас-р-MeSpd НООбраЗИв ВНугрИ-

1 I н он I , н

y-MeSpd JLJ^J^^^nh, N..Ac^UeSpd клеточных превращений Spd и Spm,

NHJ Af'-Ac-o-MeSpd

Рис. 8. Новые С-мети-I „ „ . „ . линованные аналоги b p,p-Me2Spd Spd, /V1 -Ac-S pd и S pin.

равно как и множественность их клеточных функций, представляется вполне обоснованным использовать не только а-метилиро-ванные аналоги, а систему С-метилированных производных (Рис. 8), предполагая, что биохи-миические свойства таких аналогов будут определяться не только трипротонированным при физиологическом рН скелетом Spd, но и положением метильной группы. Эти соединения, несмотря на кажущуюся механистичность перемещения метильной группы по полиаминово-му скелету, позволили получить ряд неожиданных и значимых для биохимии Spm и Spd результатов (см. следующий раздел).

Для получения P-MeSpd и y-MeSpd удобным представлялось использование восстановления нитрилов (22а) и (22Ь), которые были получены присоединением Put к метакрило-нитрилу (21а) и кротононитрилу (21Ь) (Схема 7). Однако, восстановление нитрилов водородом над Ni-Ренея или РЮг проходило неоднозначно и сопровождалось образованием набора минорных побочных продуктов, трудно отделяемых от целевых MeSpd's хроматографией на силикагеле. Тем не менее, этим способом (З-MeSpd и y-MeSpd были синтезированы в виде хорошо кристаллизующихся трихлоргидратов с суммарными выходами 16% и 32%, считая на метакрилонитрил и кротононитрил, соответственно.

Схема 7

76%, на 21а (через 22а) 32%, на 21Ь (через 22Ь) 27%, на 21а (через 23а) 45%, на 21Ь (через 23Ь)

N _L. ( p-MoSpd ) [y-MsSpd

RÎ

21a: R^CHa, R2=H 22a: R,=CH3. R2=H 2 21b:R,=H.R2=CH3 22b: R,=H, R2=CH3

(N1-Ac-p-MeSpd]

N /V. 23.4%, на (21a)

23a:HRl=CH,R2=HR2 I^-Acy-MeSpd )

23b: R,=H, R2=CH3 39%, на (21b)

i- NH2(CH2)4NH2/BOH/20°C->90°C; ii- H2/Ni-Raney/BOH; iii- Boc20/THF; <V- LiAlH4/B20/-5°C; v- HCl/BOH.

Для упрешения этих синтезов нитрилы (22а) и (22Ь) были превращены в соответствующие ди-Вос-производные, которые гладко и с хорошим выходом восстанавливались LiAIH4 в эфире при -5°С до ди-Вос-аминов (23а) и (23Ь). Последующее удаление защитных групп привело к искомым трихлоргидратам p-MeSpd и y-MeSpd с суммарными выходами 27% и 45%, считая на (21а) и (21Ь), соответственно.

Промежуточные ди-Вос-амины (23а) и (23Ь) были использованы в качестве исходных соединений в синтезах V-ацетильных производных р- и y-MeSpd (Схема 7). Последовательное ацетилирование свободной аминогруппы и удаление Вос-защитных групп привели к дихлоргидрату N'-Ac-p-MeSpd с выходом 23.4% и дихлоргидрату Nl-Ac-y-MeSpd с выходом 39%, считая на (21а) и (21Ь), соответственно.

Учитывая трудности, возникшие при выделении продуктов восстановления нитрилов (22а) и (22Ь) водородом над>}ьРенея или РЮ2, для получения P,P'-Me2Spm был приготовлен йи-Вос-динитрил (26). Однако этот динитрил не растворялся в эфире, а проведение восстановления LiAlH4 в THF при -5°С сопровождалось побочным элиминированием. Соответственно, после удаления Вос-зашитных групп и кристаллизации были получены в примерно равных количествах хорошо кристаллизующийся тетрахлоргидрат p,p'-Me2Spm с суммарным выходом 3.5%, считая на метакрилонитрил, и трихлоргидрат P-MeSpd (Схема 8). Для получения y,y'-Me2Spm было использовано восстановление динитрила (24Ь) водородом над РЮ2 (Схема 8), т.к. восстановление ди-Вос-производного динитрила (24b) LiAlRt в THF при -5°С привело лишь к следовым количествам искомого ди-Вос-диамина. Как и в случае синтеза y-MeSpd (см.выше) наблюдалось образованием спектра побочных продуктов, трудно отделяемых от y.y'-MeiSpm хроматографией на силикагеле. Тем не менее, медленно смокаюший на воздухе тетрахлоргидрат у,y'-Me2Spm удалось получить с выходом 11.7%, считая на (21а).

Схема 8

Ri R2 ^ R]

——— 1 T,7'-Mo2Spm ) 11.7%, на (21b)

21a: R,=CH3, R2=H 21b: R,=H. R2=CH3

R, H R2

24a: R,=CH3. R2=H 24b: R,=H, R2=CH3

Boc R, Boc R,

р.р'-МегБрт )

Й, Вое 3-5%. на (21а)

I- ЫН2(СН2)4МН2/20°С-'90оС; <7- Н2/РКУВОН; Ш- Вос20/ТНР; (у- Ш1Н4/Й20/-5°С; v- НС1/ЙОН.

ю-MeSpd и a,ш-Me2Spd сначала были синтезированы исходя из З-аминобуганола-1 (2) (Схема 9). Ключевым интермедиатом этих 12-ти стадийных синтезов был Вос-нозилат (28), который алкилировали 3-(М-бензилоксикарбонил)амино-1-бромпропаном для получения (29а), являющегося предшественником о-Мс5рд, или 3-(М-бензилоксикарбонил)амино-1-бромбутаном для получения (29 Ь)- предшественника a,и-Me2Spd (Схема 9). Последующее

HN 0 -► HN

i i i R R, Boc

N IW

,r 2: R=R,=H

..> 26: R=Boc, R2=H __,_.

"v 27: R=Boc, R2=Ms [o-MeSpd ] 31%, на (27) [u,a-Me2Spd j 12.2%, на (2)

i- Boc20/THF; ii- MsCl/B3N/CH2Cl2; iii- NaCN/DMSO; iV- LiA 1H4/Ei20/-5°C; v- NsCl/CH2CI2/El3N; vi-1. CbzNH(CH2)3Br/DMF/K2C03/45°C для 28a; 2. CbzNHCH(CH3XCH2)2Br/DMF/K2C03/45°C для 28b; v/7- PhSH/DMF/K2C03; viil-1. Hci/EtOH; 2. H2/Pd/AcOH/MeOH; 3. 1. HCI/BOH.

удаление защитных групп гладко приводило к целевым хорошо кристаллизующимся три-хлоргидратам co-MeSpd и a.co-NfeSpd с суммарными выходами 31%, считая на метансуль-фонат (27) и 12.2%, считая на аминоспирт (2), соответственно.

Впоследствии (Схема 10), для упрощения синтеза co-MeSpd мы использовали апкили-

Схема 10

Ri «2 «1 Rz R< [ р-MeSpd ] 41%, на (30a)

"TV"? -ГЛ Й 'HTNH2 " (P.P-Me2Spd ) 38%, на (30a)

П H R

R R3 Cbz п K

i

(к-MeSpd ) 34.5%, на

' 30а: R=R,=R2=R3=H, n=2 33: R,=R2=R4=H, R5=CH3, n=2. m=1

30b: R=R2=R3=H, R,=CH3, n=2 34: R,=R2=H, R4=R5=CH3, n=2. m=1 I y.MeSpd l Чз%% (30c)

,30c: R=R,=R3=H, R2=CH3, n=1 35: Ri=CH3, R2=R4=R5=H, n=2, m=1 u-'

"31a: R=Cbz, R1=R2=R3=H, n=2 36:6R1=R4=R5=H, R2=CH3, n=1, m=2

31b: R=Cbz, R,=CH3, R2=R3=H, n-2 _31c: R=Cbz, R1=R3=H, R2=CH3, n=1 32a: R=Cbz, R,=R2=H, R3=OMs, n=2 32b: R=Cbz, R,=CH3l R2=H, R3=OMs, n=2 L32c: R=Cbz, R,=H, R2=CH3. R3=OMs, n=1

/-СЬгС1/Н20/№НС03; /7-М5С1/В3№ СН2С12; Ш-1. ЫН2СН2СН(СН3)СН2ЫН2 дня p-MeSpd; 2. ЫН2СН2С(СН3)2СН2ЫН2 для p,P-Me2Spd; 3. ЫН2(СН2)3ЫН2ЯНР для co-MeSpd; 4. Ш2(СН2)4ЫН2/ТНР для y-MeSpd; /у- Н2/Ра/МеОН/АсОН; /- НС1/ВОН.

рование диаминов мезилатами /У-зашищенных спиртов. Этим методом в 4 стадии были получены также p-MeSpd, p,p-Me2Spd и y-MeSpd с суммарными выходами 41%, 38% и 23%, считая на (30а) и (30с), соответственно. Выход co-MeSpd составил 34.5%, считая на (30 Ь).

Промежуточный СЬг-диамин (35) был использован в качестве исходного соединения при получении iV1-Ac-o)-MeSpd (Схема 11). Для дискриминации первичной и вторичной аминогрупп было использовано превращение первичной аминогруппы в салицилиденовое производное, которое после введения Вос-зашиты по вторичной аминогруппе, было превращено в первичный амин (36а) обработкой СНзОЫНг-основанием. Ацетилирование первичной аминогруппы и последовательное удаление Вое- и СЬг-защитных групп привели к целевому Лг'-Ac-й)-MeSpd с выходом 46%, считая на (35).

Схема 11

I Н I ¡1Ш I 1 С /V, V, V/ /-\

——- -► [ Л<1-Ас-<о-МоЗра | 46%, на (35)

СЬг (35) СЬг (36а>

(-о-СбН4(ОН)СНО/ТНР; и- Вос20/ТНР; ш-МеОШ2/ТНН; IV- АсС1/В3№ТНР; V- Н2М/АсОН/МеОН; VI- НС1/ВОН

21

Таким образом, семейство а-метилированных аналогов 8рт и Эре! было дополнено неизвестными ранее Р-, у-, со- и а.са-МегЗрд, М1-ацетильными производными р-, у- ив-МеЭр^ атакже Р,Р'-Ме28рти у.у'-МегБрт.

Взаимодействие С-метилированных аналогов Spd с ферментами метаболизма полиаминов и клетками

На первом этапе мы исследовали взаимодействие р-MeSpd, y-MeSpd, ю-MeSpd и а,со-

Me2Spd со SSAT в сравнении с a-MeSpd и Spd. Как и следовало ожидать, co-MeSpd, подобно

описанному ранее to,co-Me2Spd (Nagarajan S., et aL 1988. Biochem.J., 254. 373-378), оказался

хорошим субстратом фермента, a a,co-Me2Spd не ацетилировался как и a-MeSpd (Табл. 5).

Удивительно, но Р-MeSpd, в отличие от a-MeSpd и описанного ранее p,p-Me2Spd, имеющего

I....... """ ' "* ' " ......у ( две метильные группы при p-углеродном атоме,

(Субстрат К„(цМ) , „ ™> „„,. 1

' ....... ......(^moi/min/mgssAiLj оказался неплохим субстратом SSAT с близким

Spd 151 + 15 4.28 ±0.13

Spd значением Км, но заметно сниженным, по

a-MeSpd не ацетилируется

P-Mespd 132 + 7 0.77 ±0.01 сравнению со Spd значением VmiK.

y-MeSpd не ацетилируется (К, «52 ± 18 рМ) Табл. 5. Взаимодействие С-метилированных аналогов ш-MeSpd 78 ±3 7.35 ±0.10 Spd с SSAT.

p,p-Me:Spd не ацетилируется Таким образом, уменьшение количества замес-

тителей кардинально влияет на субстратные свойства аналога. Оказалось, что перемещение метильной группы еие на одно положение, приводя нее к y-MeSpd, вновь лишает аналог субстратных свойств в SSAT-реакции (Табл. 5). Такие, на первый взгляд, парадоксальные зависимости субстратных свойств от положения и количества метальных групп хорошо согласуются с данными рентгено-структурных исследований комплекса фермента с коньюгатом Spm и СоА, моделирующим бисубстратный комплекс (Hegde S.S., et al. 2007. Biochemistry, 46, 7187-7195), а также бинарным комплексом SH-CoA - Spm (Montemayor E.J. & Hoffman D.W. 2008. Biochemistry, 47,9145-9153) и отражают особенности узнавания полиаминов SSAT.

В предыдущем разделе было показано, что Л'-Ac-a-MeSpd является хорошим субстратом АРАО, а в присутствии ароматических альдегидов АР АО эффективно расщепляла и собственно a-MeSpd. Поэтому мы исследовали возможность окислительного расцепления С-метилированных MeSpd's под действием АРАО в присутствии бензальдегида, который по данным (Holtta Е. 1977. Biochemistry, _16, 91-100) является самым активным из исследованных альдегидов. Оказалось, что бензальдегид эффективно стимулирует катализируемое АРАО расщепление всех синтезированных аналогов за исключением y-MeSpd, в котором метальная группа находится при атоме углерода, образующгго расщепляемую в ходе поли-

' Совместно с Prof. J.Janne, Prof. LAlhonen, Prof. J.Vepsalainen, Dr. T.Keinancn и Dr. M .Нуvonen (A.I.Virtanen Institute for Molecular Sciences and Department of Biosciences, University of Eeastern Finland, Kuopio, Finland), a также Dr. H.M.Park (National Institute of Health, Bethesda, MD, USA).

22

аминооксидазной реакции связь со вторичной аминогруппой (Рис. 9). Соответственно, этот участок субстрата должен быть высоко комплементарен активному центру фермента и наличие метальной группы в у-положении Spd может привести к непродуктивному связыванию этого аналога или затруднить отрыв протона, являющийся движущей силой окислительного

расщепления, приводящего к образованию промежуточного основания Шиффа.

Рис. 9. Взаимодействие С-метипированных аналогов Spd с АРАО в присутствии или без 5 тМ бензальдегида (В А).

Таким образом, y-MeSpd не является субстратом ни АРАО, ни SSAT и представляет собой новый катаболически устойчивый аналог Spd.

Следует особо отметить, что P-MeSpd достаточно эффективно расщеплялся АРАО и в отсутствии бензальдегида (Рис. 9), что совершенно не характерно для этого фермента, учитывая известные данные о его субстратной специфичности (см.обзор: Casero R.A. & Pegg А.Е. 2009. Biochem.J., 421, 323-338). В присутствии же бензальдегида, субстратные свойства |3-MeSpd намного превосходили таковые для Spd в аналогичных условиях (Рис. 9). Таким образом, перемешая метальную группу по скелету спермидина, удается получать как катаболически устойчивые производные (y-MeSpd), так и усиливать способность аналога к окислительному расцеплению ((5-MeSpd), то есть появляются неизвестные ранее возможности для регуляции метаболизма полиаминов.

На следующем этапе был исследован транспорт синтезированных аналогов Spd в клетки DU145. Все производные узнавались системой транспорта в качестве Spd (Рис. 10) и конкурировали за транспорт с [14C]-Spd, однако лишь (5-MeSpd был столь же эффективен как и "холодный" Spd, тогда как остальные С-метилированные производные оказались несколько менее активными.

СП Spd ЕШа-MeSpd ЕЗЭ p-MeSpd ШШ y-MeSpd a5-MeSpd ЯЯ a,m-Me¿5pd

10 100 Аналоги (цМ)

Рис. 10. Транспорт С-метилированных аналогов Spd в клетки 011145. Клетки инкубировали в течение 10 мин с 10 рМ [I4C]-Spd в присутствии 1, 10 или 100 рМ исследуемыхапалогов.

Проникнув в клетку С-метилированные производные Spd могут превращаться в соответствующие аналоги 8рт. Из литературы известно, что гeл^-Me2Spd's, несущие

две метальные группы при одном атоме углерода (Т^ага]ап 8., е! а! 1988. ВюсИет.Х, 254, 373-378), не являются субстратами 8рт-синтазы. Уменьшение количества метальных групп, как и в случае 58АТ (см.выше), кардинально сказывается на субстратных свойствах аналогов В клетках 011145 a-MeSpd, p-MeSpd и <в-MeSpd метаболизировали до соответствующих про-

(pmol/pg ДНК)

24 ч AG + a-MeSpd 264 ±12 37 ±2 301 ±14

AG + p-MeSpd 133 ±4 67±13 200± 17

AG + 7-MeSpd 181 ±5 n.d. 181 ±5

AG + ш-MeSpd 257 ±5 n.d. 257 ±5

72 ч AG + a-MeSpd 311 ±76 60 ±S 371 ±84

AG + p-MeSpd 134 ±6 80 i 7 214± 13

AG + y-MeSpd 176 ±3 n.d. 176 ±3

AG + m-MeSpd 332 ±14 43 ±3 375 ±17

изводных Spm (Табл. 6), но этого не наблюдалось в клетках дефицитных по Spm-синтазе (данные не приведены). Следует отметить, что a-MeSpm и P-MeSpm образовывались уже

--------------...,—_.,„„„------ —_„_„ .„_ после 24 ч инкубации клеток с соответ-

i Время Субстрат MeSpd MeSpm MeSpd + MeSpm:

сгвуюшими аналогами Spd, тогда как 6-MeSpm, возникающий из co-MeSpd детектировался лишь после 48 ч инкубации аналога с клетками. Табл. 6. Биосинтез С-метилированных аналогов Spm в клетках DU145. Клетки выращивали в присутствии С-метилированных аналогов Spd (100 рМ) и I itiM аминогуанидина (AG), ингибитора сывороточныхаминооксидаз, предотвращающего неспецифическую токсичность аналогов.

Удивительно, что y-MeSpd не метаболизировал в клетках DU145 до y-MeSpm даже после 72 ч инкубации клеток с аналогом (Табл.6), что прямо указывает на существование высокой комплементарности между соответствующим участком активного центра Spm-синтазы и центральным фрагментом молекулы Spd, обеспечивающим продуктивное связывание субстрата и его аналогов в активном центре фермента. Таким образом, y-MeSpd представляет собой новый метаболически устойчивый аналог Spd, а перемещение метальной группы по скелету Spd позволяет регулировать субстратные свойства С-метилированных производных Spd в Spm-синтазной реакции, что не описано ни для одного из известных аналогов Spd.

Сбалансированная работа ферментов синтеза и деградации полиаминов наряду с системой активного транспорта Spm и Spd, являются основными факторами, позволяющими поддерживать необходимую концентрацию полиаминов в клетке. Активность, биосинтез и деградация ферментов метаболизма полиаминов зависят от многих факторов, в том числе и от внутриклеточного содержания Spm и Spd. Поэтому было изучено влияние С-метилированных аналогов Spd на активность ключевых ферментов метаболизма полиаминов. Наиболее выраженные эффекты наблюдались в случае ODC - скорость-л имитирующего фермента на

путях биосинтеза полиаминов (Табл. 7). Оказалось, что P-MeSpd, в противоположность всем остальным метил-производным, практически не снижал активность ODC ни после 24 ч, ни после 72 ч инкубации клеток с аналогом. Такие

Табл.7. Влияние С-метилированных аналогов Spd (100 fi.M) на активность ODC в клетках DU145. Клетки выращивали в присутствии 1 mM AG

необычные свойства p-MeSpd привели к необходимости оценить концентрационную и временную зависимости эффекта. Оказалось, что в случае 4-х ч инкубации клеток DU145 с 10 цМ P-MeSpd активность ODC практически не изменялась, тогда как для a-MeSpd она составляла ~30%, для co-MeSpd ~40%, а для y-MeSpd-

Время Субстрат Активность ÓDCl jpmqlftmMAHiqj

24 ч AG 29.3 ±1.4

AG + a-MeSpd 4.3 ± 0.3

AG + p-MeSpd 21.7 ±1.4

AG + r-MeSpd 8.8 ±0.3

AG + u-MeSpd 4.7 ±0.5

72 ч AG 7.5 ± 0.9

AG + a-MeSpd 3.5 ± 0.1

AG + p-MeSpd 9.1 ± 0.3

AG + r-MeSpd 5.4 ± 0.4

AG + m-MeSpd 3.8 ±0.3

около 50% от активности СЮС в контрольных клетках (Рис. 11). Подобная зависимость активности аналога от положения метальной группы явля-юо^ X. I 1?5).м ется уникальной и связана, скорее всего, с низкой эффек-

тивностью индукции р-МеЭрй биосинтеза АX, что совершенно не характерно для функционально-активных ми-метиков полиаминов, и открывает спектр новых возможностей для регулирования метаболизма полиаминов.

Рис. 11. Влияние С-метилированных аналогов в р(1 на активность ООС в клетках I) 1145. Клетаи инкубировали с 10, 25, 50 Контр а р У И или 100 рМ аналогов и 1 тМ Айв течение4 ч.

На следующем этапе был исследован транспорт С-метилированных аналогов Эрё в обработанные и необработанные СНХ (ингибитор биосинтеза белка) клетки ОШ45. Оказалось, что в отсутствии АХ все аналоги, за исключением р-МеБрё, накапливались в клетке эффективнее, чем в клетках синтезирующих в ответ на повышение концентрации аналогов полиаминов дополнительные количества АХ. Последне препятствует проникновению экзогенных

полиаминов в клетки и способствует поддержанию гомео-стаза Брт и Брё (Рис. 12). В случае Э-МеБрё различий между обработанными и необработанными СНХ клетками не

Рис. 12. Влияние на транспорт С-метнлнрованных аналогов в¡и] в клетки 011145. Клетки инкубировали 2 ч с СНХ {10 рц/тЬ}, или без СНХ, а затем еще 4 ч с аналогами 5рс1 (100 рМ).

наблюдалось (Рис. 12). Эти данные косвенно свидетельст-а р у <в вуют о том, что этот аналог, в отличие от других С-метилированных производных Брё, не способен или весьма слабо индуцирует биосинтез АХ в клетках ОШ45.

Способность С-метилированных производных Брс! индуцировать биосинтез АХ, подобно природным полиаминам и большинству их синтетических аналогов, была оценена ис-д „ пользуя антитела к КЪ. Оказалось, что количество АX зави-

а.

сит от положения метальной группы в структуре аналога. (3-Меврё слабо индуцировал биосинтез АХ, у-МеБрс! был несколько активнее, но действовал слабее чем остальные С-ме-тилированные производные Эре! и контрольные ОЕЫЗрт и ОЕврт (Рис. 13А). Пониженная способность Р-Ме5рс1 инду-

е 5. га м ЙЮ

£ га г 5 а ® о ш ш ^ ^ 5

кг.

АсГш

В

□ □ «Г

2 Я ЧИ м

III!

О. й

■о га ¡2

в §

щ 3 о

3 в" $

Ас„п -

Рис. 13. Влияние С-метилированных аналогов Бр(1 на биосинтез Клетки инкубировали 4 ч с исследуемыми аналогами (100 цМ) без Мв132 (А) или в присутствии 25 рМ ингибитора (В). Аликвоту суммарной белковой фракции (50 анализировали электрофорезом в 12 % ЗОБ-полиакриламидном геле и визуализировали иммуноблотингом с антителами кА2.

цировать биосинтез № была подтверждена и в эксперимен-25

тах с МС132, ингибитором протеосом-опосредованной деградации белков. В присутствии Мв132 количество Аг существенно увеличивалось после добавления в среду любого из С-метилированных производных МеЗрё, за исключением р-МеБрс! (Рис 14В). Возможность регулировать экспрессию КЪ простым перемещением метальной группы вдоль скелета 8рс1 является совершенно неожиданной, уникальной и не имеющей аналогий в литературе, так как все исследованные функционально-активные аналоги Эрт и Эрё вызывают +1 сдвиг рамки считывания мРНК КЪ и индуцируют его биосинтез (см.обзор: КаЬапа С. 2009. Cell.lvlol.Life 66,2479-2488).

На заключительном этапе была исследована способность С-метилированных аналогов Эре! восстанавливать рост клеток ОШ45 с истощенным пулом полиаминов (18 суг инкубации с 5 тМ ОИМО) (Рис. 14). Из литературы известно, что даже гам-МегЗрсГз способны поддерживать рост клеток с острым дефицитом полиаминов, возникающим в результате инкубации

с БРМО в течение 3 сут, т.е. в условиях когда еще не затрагиваются процессы ги-пузинилирования е1Р5А

Рис. 14. Способность С-мети-лнрованных аналогов в рс1 (100 рМ) подде|»кивать рост клеток 01Л45 с истощенным в результате инкубации с П ГМ() (5 тМ) пулом полнамннов. (А) - в присутствии 1 тМ АО; (В) - без 1 тМ АО

(Nagarajan Б., е1 а\. 1988. Biochem.J., 254, 373-378). Соответственно и С-метилированные аналоги Брс!, представляющие собой более тонкий инструмент исследования, в 100 рМ концентрации в примерно равной степени восстанавливали рост клеток подобно 100 рМ Эре! (Рис. 14). Таким образом, у-Ме8рс1 может рассматриваться как новый метаболически устойчивый функционально-активный миметик Эрё, что делает его ценным инструментом исследования, позволяющим, в том числе, раздельно изучать клеточные функции врт и Брс! в условиях острого дефицита полиаминов.

Вместе с тем, в условиях хронического дефицита полиаминов, приводящего к "недоги-пузинилированию"е1Р5А (инкубация клеток с БРМО от 12 сут и более), активности аналогов сильно отличались и лишь а- и (З-МеБрё были способны восстанавливать рост клеток (Рис. 14) Поэтому были исследованы субстратные свойства аналогов в ОНБ-рсакции (Рис. 15). Оказалось, что ю-МвЭрд не является субстратом ОНБ, тогда как три других аналога были донорами аминобугильного остатка, хотя их субстратные свойства и ухудшались при перемещении метальной группы от а- к у-углеродному атому Брё. В случае (Л)- и (5)-изомеров а-МеБрс! (см. пред.раздел) и со-Ме5р<1 (см.выше) наблюдалась прямая корреляция между субстратными

□ 3 сут 0 6 сут М 12 сут ■ 18 сут

ИЮрМ »25 рМ

свойствами аналогов в ОШ-реакции и способностью преодолевать хронический дефицит полиаминов в клетке, вызванный инкубацией с клеток с БРМО от 12 сут и более (Рис. 15). Однако в случае у-МеБрс! зависимости оказались более сложными и поэтому возникла необходимость прямо оценить количество гипузинилированного е1Р5А, возникающего в клетках дефицитных по Эре! и выращенных в присутствии С-метилированных аналогов Эрс1. Оказалось, что в этом

Рис. 15. Субстратные свойства С-метилированных аналогов ^[н! в дезокенгипузиненнтазной реакции. Условия реакции см. в подписи к Рис. 5. а-МсЗр<1 рмезро !-МеЗра «ИЛеЗрс!

случае в клетках 011145 из у-Меарё не образуется гипу-зинилированный е1Р5А (Рис. 16), что может быть обусловлено отсутствием у проникающего в клетку изомера у-МеЭрё субстратных свойств в БИБ реакции.

*Ав__-АС

а> о

1 г I

I = I

£ >

< а. I

■п ^ г

■я о 9

о г

2- = ?

г. о 2

8 г ё

< О. X

Рис. 16. Влияние С-метилнрованных аналогов Бр(1 на 1 ш IV! и нити рои и и не е1Р5 V в каетках с истощенным пулом Яр(1. Клетки Ои 145 выращивали в присутствии ОРМО (5 гпМ) и аналогов Ур<] (100 рМ) в течение 9 сут с 3 гпМ А в, или без А в. Гипузинилированный е1Р5А (р1, 5.37) негипузинилированный еШЭА (р! 5.25) и ацетилированную форму негипузинилированного е1Р5А (р1, 5.1) разделяли двумерным электрофорезом и белки визуализировали, используя антитела к е1Р5А.

Таким образом, использование системы неизвест-вестных ранее С-метилированных аналогов полиаминов открывает неожиданные возможности для прецизионного воздействия на метаболизм полиаминов, а различия в биохимических свойствах аналогов Брга и Брё определяются как положением метильной группы, так и конфигурацией а-углеродного атома. Таким образом, ферменты метаболизма Бри и Брс1, А2-зависимая система регуляции гомеостаза полиаминов и система транспорта полиаминов имеют не только «электростатические», но и дополнительные, различающиеся между собой, структурные критерии узнавания Брш и Эре!, используя которые оказывается возможным создавать новые избирательно действующие структуры и исследовать клеточные функции легко взаимопреврашаюшихся и частично взаимозаменяемых Эргп и Бр<1

ОРМО" н-МеЗрс!

ОРМО» Р-МеЭрс!

СРМО-» Яр«!

Синтез 8ртТпен - нового изостерного зарядодефицитного аналога 8рш и его биохимически значимых производных

Биологические эффекты полиаминов определяются геометрией молекулы, обеспечивающей необходимое пространственное расположение аминогрупп и степенью их протони-

рования. Большая часть работ по изучению зависимости биологической активности полиаминов от их строения посвящена изучению структурных аналогов Spm и Spd, включая производные с различными заместителями при концевых атомах азота (см.обзоры: Casero R.A. & Woster P.M. 2009. J.Med.Chem., 52, 4551-4573; Casero R.A. & Marton L.J. 2007. Nat.Rev. Drug Discov. 6, 373-390). Исследования вклада заряда аминогрупп Spm/Spd в биологические эффекты полиаминов не столь многочисленны. В подобных работах полезным инструментом являются зарядодефицитные аналоги полиаминов, а рациональным подходом к созданию таких веществ является понижение основности аминогрупп при минимальном искажении геометрии молекулы, что, однако, существенно ограничивает число возможных аналогов.

В настоящей работе предложен и реализован оригинальный подход к созданию ново-г.....-«-т.. --------—-----_------------- го зарядодефицитного аналога Spm,

рК,1 рКа2 рК,3 рКа4 рК„5

Spd 8.2 9.8 10.9

3.3 6.6 9.1 9.7

Spm 1 SpmTrien 3 3

7.9 8.9 10.0 10.8

6.3 8.6 9.5 10.3

состояшии в сокращении расстояния между вторичными аминогруппами до 2-х метиленовых звеньев, что существенно понижает основность вторичных аминогрупп аналога по сравнению со Spm (Табл. 8).

Табл.8. Основность аминогрупп Spd, Trien, Spm и SpmTrien.

Использование |5Ы-ЯМР спектроскопии для определения микроскопических констант диссоциации показало существование равновесия между трипротонированными формами SpmTrien в интервале рН 6.6-8.5 с протоном, делокализованным между тремя вторичными аминогруппами (Рис. 17). Это свойство может оказаться весьма полезным для обеспечения продуктивного взаимодействия SpmTrien с полиамин-связываюшими сайтами, т.к. аналог

способен трансформироваться в ионную форму, комплементарную участку связывания. Замена Spd

n-l h¿n • n.íl - nh¡

..3

Hsy • nha

4

V 7 7 г

nh • nh» nh nh n-li

s s s s

r¡ —- hn —и;-! 4 i¡

<> <> 7 г

*nh2 ^jh vlm ^h NI'

Рис. 17. Зависимость хим. сдвига атомов азота от значения рН в ЯМР спеетрах БртТпеп

фрагмента молекулы Брт изосгер-ным ему триэтилентетраминовым приводит к появлению в молекуле ЗртТпеп сразу трех этилендиами-новых фрагментов, что дает начало уникальной для биохимии по-

11 рн лиаминов способности к комплек-

сообразованию с ионами переходных металлов (Рис. 18). Известно, что триэтилентетрамин

28

(Trien) образует очень прочный комплекс с ионами Си2* [рАГШ5 20.4 при pH 14 и 14.2 при pH 7 (Schwarzenbach G. 1950. Helv.Chem.Acta 33, 974-985)] и для комплекса SpmTrien с

ионами Си2+ можно ожидать близких значений констант диссоциации.

/—V

Рис. 18. Структуры комплексов Trien HSpmTrien с ионамн Си*

Trien-Cu2+ SpmTrien-Cu Следует отметить, что ни Spm, ни его известные анало-

ги не обладают подобными комплексообразуюшими свойствами. Соответственно, SpmTrien может быть использован в качестве регулятора активности ферментов метаболизма полиаминов, для изучения особенностей активного транспорта Spm в клетки и исследования взаимодействий полиаминов с нуклеиновыми кислотами. При этом биологические эффекты SpmTrien могут быть как рН-, так и С и2*-зависимыми.

Выбранная нами стратегия синтеза SpmTrien состояла в последовательном нарашнва-нии полиаминной цепи путем алкилирования соответствующих аминов мезилатами //-заши-икнных аминоспиртов. Первый способ синтеза предусматривает построение полиаминной цепи, начиная с С-3 фрагмента (Схема 12). Исходным соединением служил 3-аминопропа-нол-1 (37), который Л^-карбобензоксилировали, превращали в соответствующий мезилат и

Схема 12

Rj Cbz R5

i i i t i

R R, Cbz R2 R3

,/-37:R=R,=H ((-40: R2=R3=H (-43: R4=H, SpmTrien] 20%, на (38;

У 38: R=Cbz, R,=H ..Ï41: R2=Cbz, R3=H R,=nh7 R.=H п7п7/

"4.39: R=Cbz, R,=Ms " 4.42: R2=Cbz, R3=Ms w ^45: R4=Cbz, R5=Ac—!—.. [ A>'-Ac-SpmTrien|

51%, на (43)

i- CbzCI/NaHC03/THF/H20; ii- MsCl/a3N/CH2Cl2; lit- H2NCH2CH2NHCH2CH2OH/THF; iv- H2NCH2CH2NH2/THF; v- l. o-QH,(OH)CHO/THF; 2. /-; 3. Me0NH2/THF/H20; w- AcCVEtjN/THF; w7-H2/Pd/AcOH/MeOH; ии-НСТМеОН

затем без выделения вводили в реакцию с избытком Л'-(2-аминоэтил)-аминоэтанола в THF. Соединение (40) выделяли колоночной хроматографией на силикагеле, но оно содержало в качестве трудно отделяемой примеси небольшое количество продукта алкилирования N-(2-аминоэтил)аминоэтанола по вторичной аминогруппе. Вторичные аминогруппы в соединении

(40) защищали и после хроматографии на силикагеле получали чистый отрис-СЬг-аминоспирт

(41). Его превращали в мезилат, который без выделения обрабатывали избытком этиленди-амина, что приводило к mpuc-Cbz-диамину (43), из которого получали пентахлоргидрат SpmTrien с выходом 20%, считая на jV-Cbz-амшюспирт (38) и тетрахлоргидрат iV'-AcSpmTricn с выходом 51%, считая на соединение (43).

Второй путь синтеза SpmTrien предусматривает построение полиаминной цепи, начиная с С-2 фрагмента (Схема 13), что позволяет избежать неоднозначно протекающгй стадии алкилирования первичной аминогруппы в присутствии незащищенной вторичной. Методически этот путь аналогичен первому и представляет собой семистадийный процесс. Однако

R R;

■2

,r 46: R=Rt=R2=H ¡r 49: R3=R4=H (SpmTrien) 20%, на (46)

..>47: R=R,=Cbz. R2=H >50: R3=Cbz, R4=H vii v w ,-( -

"4.48: R=Rt=Cbz, R2=Ms " ^51: R3=Cbz, R4=Ms—11— [ A>"-Ac-SpmTrien) 58%, на (50)

i- CbzCl/NaHC03/THF/H20; U- MsCl/EtjN/CH2Cl2; Ш- H2NCH2CH2OH/THF; iv- H2NCH2CH2CH2NH2/THF; v-H2/Pd/AcOH/MeOH; vi- HCI/MeOH; vil- H2N(CH2)jNHAc/THF.

выделение и очистка промежуточных соединений менее трудоемки. Суммарный выход SpmTrien составил 20%, считая на Л'-(аминоэтил)аминоэтанол, a A^-AcSpmTrien был получен в виде тетрахлоргидрата с выходом 58%, считая на mpuc-Cbz-аминоспирт (50).

Таким образом, были синтезированы неизвестные ранее SpmTrien и два его моно-ацетильных производных, представляющих интерес для исследования SSAT и АРАО.

Терминально бмс-алкилированные аналоги полиаминов являются одним из основных инструментов исследования системы метаболизма полиаминов и, кроме того, имеют определенные перспективы клинического применения (см.обзор: Casero RA. & Marton L.J. 2007. Nat.Rev.Drug Discov. 6, 373-390. Тем не менее, механизмы их действия на молекулярном уровне в большинстве случаев до сих пор неизвестны. Влияние геометрии молекулы на биологические эффекты бнс-алкилполиаминов подробно исследовалось на протяжении последних 15 лет (см.обзоры: Casero RA. & Woster P.M. 2009. J.Med.Chem., 52, 4551-4573; Casero R.A. & Woster P.M. 2001. J.Med.Chem., 44, 1-26), но вклад зарядовой составляющей в биологическую активность практически не изучен.

Для получения неизвестного ранее зарядодефицитного /v'',<Vl2-Et2SpmTr¡en нами был использован А-этиламиноэтанол, который карбобензоксилировали, спирт (53) превращали в мезилат и без очистки вводили в реакцию с избытком Л'-(2-аминоэтил)аминоэтапола (Схема 14). Диаминоспирт (55), содержащий небольшое количество изомерного продукта алкилиро-вания А'-(2-аминоэтил)аминоэтанола по вторичной аминогруппе, вновь карбобензоксилировали. При этом целевое трис-Cbz производное (56) легко отделялось хроматографией на си-ликагеле от побочного продукта реакции алкилирования, содержащего две Cbz-группы. Защищенный аминоспирт (56) превращали в мезилат (57), который обрабатывали избытком N-этил-1,3-диаминопропана. Наряду с целевым соединением линейного строения (58) образовывалось некоторое количество продукта алкилирования Л'-эти л-1,3 - ди ам и н оп ро п ai i а по вторичной аминогруппе, который плохо отделялся хроматографией. Поэтому сырой диамин (58) обрабатывали ~20 мольн. % салицилового альдегида, что приводило к образованию устойчивого основания Шиффа по первичной аминогруппе примеси, которое легко отделялось хроматографией от основного продукта (58). После удаления Cbz-зашитных групп Et2-SpmTrien был получен в виде пентахлоргидрата с суммарным выходом 8%, считая на (52).

я

N R

52: R=R,=H

'->53: R=Cbz, R,=H "V54: R=Cbz, R-,=Ms

¡ с 55: R2=R3=H ..^56: R2=Cbz, R3=H "^57: R2=Cbz, R3=Ms

N12-Et2SpmTr¡en 8%, на (S2)

I- СЬгО/ТНР/НгО/НаНСОз; ¡7- М5СТН3№СН2С12; Ш- Н2ЫСН2СН2ЫНСН2СН2ОН/Т11Р; Ы- С2Н5ЫН(СН2)зШ2/ТНР; у-Н2/Ра/МеОН/АсОН: VI- НО/МеОН.

Таким образом, на основе скелета 8рпзТг1еп был получен первый зарядодефицитный по центральному фрагменту аналог бис-этилспермина - Л'' ,./У12-Е12-5ртТпеп.

Взаимодействие SpmTrien и его производных с ферментами метаболизма полиаминов и клетками

Триэтилентетрамин (Trien), является эффективным хелатором ионов Си2+ (Рис. 18) и используется в практической медицине для лечения болезни Вильсона (Dixon H.B.F., et al. 1972. Lancet, pp. 853-854), обусловленной нарушением обмена меди в организме. В последние годы показана перспективность Trien для снижения гипертрофии левого желудочка, характерной для поздних стадий диабета II типа (Cooper G.J., et al. 2004. Diabetes, 53, 25012508; Cooper G.J., et al. 2009. Diabetologia, 52, 715-722). В настоящее время Trien находится на II стадии клинических испытаний (Lu J,, et al. 2010 J.Clin.Pharmacol., 50, 647-658). Метаболизм Trien детально исследуется, но участие системы транспорта полиаминов в доставке Trien в клетки, равно как и участие ферментов метаболизма полиаминов во внутриклеточных трансформациях Trien, не рассматривалось, несмотря на то, что Trien является изостерным, хотя и зарядодефицитным, аналогом Spd (Табл. 8). Поэтому в этой части работы мы исследовали взаимодействие Тгкп и SpmTrien с ферментами метаболизма п олиаминов и клеточные эффекты этих аналогов. Оказалось, что Trien и SpmTrien, несмотря на структурное соответствие Spd и Spm, не конкурируют с

S100-

о

о.

Í 80-о

X

н 60> 40 20

5S

§100-а i 80-о

S 60

s?

^ 40. а. «? 20

1

Ыш

Е а.

1Л 20-

Аналоги (10 цМ)

Аналоги (10 цМ)

Аналоги (10 цМ)

полиаминами за проникновение в клетки DU145 и, скорее всего, попадают в клетки не используя систему транспорта полиаминов (Рис. 19).

Рис. 19. Конкуренция Trien, SpmTrien и yv'^V^-^-SpmTrien с полиаминами в

■ Spm SpmTrien

CD Spd СИ Trien ЕШЛГ.ЛГ-Et,SPMTrien

процессе транспорта в клетки ОВД 45.

Таким образом, "правильное прото-нирование" аналога оказывается критичным для его узнавания системой активного транс-

* Совместно с Prof. J.Jamie, Prof. LAlhonen, Prof. J. Vepsalainen, Dr. T.Keinanen, Dr. M.Hyvonen и Dr. J.Weisell (A.I.Virtanen Institute for Molecular Sciences and Department of Biosciences, University of Eeastem Finland, Kuopio, Fin land).

порта полиаминов.

Известными метаболитами Trien являются W'-Ac-Trien и iV',A:íi-Ac2-Trien, которые вместе с Trien были обнаружены в моче людей принимавших это лекарственное средство (Lu J., et aL 2007. Drug Metab.Dispos., 35,221-227). Учитывая структурные сходства Trien и Spd, а также SpmTrien и Spm мы исследовали взаимодействие этих аналогов с SSAT (Табл. 10). Оказалось, что Trien и SpmTrien являются субстратами этого фермента, но худшими чем Spd, а каждый из продуктов моно-ацетилирования SpmTrien, подобно Л'1-Ac-Trieп, в свою очередь

Г

Субстрат ки (Нм) V™, (pmol/mirVrng SSAT)

• - оказался плохим субстратом SSAT. Таким

SpmTrien 106±в 1.17±0.02

ЛГ-Ac-SpmTrien 250±18 0.44 ±0.01

W12-Ac-SpmTrien 435±Э0 1.18±0.03

Trien 176±8 1.3710.02

Spd 151 ±15 8.85 ±0.5

образом, SSAT может рассматриваться в качестве одного из ферментов ответственных за ацетилирование Trien in vivo.

Табл.10. Взаимодействие Trien, SpmTrien и его л/зно-ацетильных производных с SSAT.

Инкубация клеток DU145 с SpmTrien и Trien и анализ пула полиаминов показали, что люио-ацетильное производное (А''-Ас-SpmTrien) возникает лишь из первого аналога, a Trien в клетках DU145 заметно не метаболизирует (Табл. 11) Возможно это связано с тем, что уровень SpmTrien и его метаболитов в клетках почти в 10 раз выше чем содержание Trien и количество jV'-Ac-Trien оказывается ниже детекгируемо-

■ ч го уровня. Следует особо Лолиты] J

отметить, что SpmTrien метаболизирует в клетке и до Trien, причем коли-

4417*19±0Ь

_Put Spd Spm ЛГАс-Spd Аналог

(pmol/pg ДНК)

Клетки DU145 U ±5 277 ±37 245 ±37 n.d.

+ Spd n.d. 294 ±11 174 ±í 11±2

♦ Spm n.d. 142 ±10 273 ±26 n.d.

+ Trien 27±$ 206 ±20 263 ±14 n.d. SS±14

* SpmTrien 6±1 88 ±4 38 ±2 40*3 475±38

+ W.W'-EtjSpmTrien 19±1 166 ±20 197 ±6 1512 642±77

+ DENSpm n.d. 25 ±5 36 ±8 29±17 921±100

Табл.11. Метаболизм Trien и SpmTrien в клетках DU145. Влияние аналогов на содержание полиаминов в клетках

SpmTrien метаболизирует до *Tricn и W-Ac-SpmTrien ЧвСТВО ПОСЛеДНвГО, ВОЗ-

никаюшего из SpmTrien (концентрация в среде 50 рМ), сравнимо с количеством Trien, проникающего в клетку в результате инкубации с 50 рМ аналога (Табл. 11). Образование Trien в клетке происходит, по-видимому, через A'l2-Ac-SpmTricn, который под действием АРАО превращается в Trien. Поэтому из двух л<оно-ацетильных производных SpmTrien (SSAT, оказывается, не способна дискриминировать аминопропильный и аминоэтильный концы молекулы SpmTrien) в клетке детектируется лишь jV'-Ac-SpmTrien, не являющийся субстратом АРАО. Таким образом, SpmTrien, накапливается в клетках почти в 10 раз эффективнее Trien, что, учитывая высокую прочность комплексов SpmTrien-Cu2+, может представлять интерес и для практической терапии.

SpmTrien, Trien и A'',,Vl2-Et2-SpmTrien по-разному влияют на внутриклеточное содержание полиаминов в клетках DU145 (Табл. 11). Если Trien и N[,N[2-Et2-SpmTrien, в особен-

ности первый, малоактивны, то SpmTrien эффективно снижал внутриклеточный уровень полиаминов, активируя ферменты их катаболизма (образование значительных количеств N'-AcSpd) и подавляя систему их биосинтеза (сильное снижение уровня Put). Наблюдаемые изменения в активностях ODC, AdoMetDC и SSAT в клетке подтверждали эти предположение (Табл. 12). Следует отметить, что Ai',iVl2-Et2-SpmTrien и DENSpm примерно одинаково индуцируют продуктивный сплайсинг пре-мРНК SSAT (данные не приведены). При этом зарядодефицитный A^/V^-Eti-SpmTrien, в отличие от изостерного ему DENSpm, не был индуктором SSAT, по-видимому из-за невозможности правильного связывания с С-концевой последовательностью фермента, что стабилизирует белок, снижая скорость его протеолиза.

Табл.12. Влияние полнаминов, DENSpm и заря-додефицитных аналогов Spm на активность ферментов метаболизма Spm и Spd клетках DU145.

Концентрация полиаминов и их аналогов - 50 рМ. Клетки выращивали в присутствии 1 mM AG.

ODC AdoMetDC SSAT

(pmol/pg ДНК)

Контроль 88 ±9 236 ± 29 138 ±21

Spd 10 ± 1 179 ±3 117 ± 2

Spm 13±3 108+9 132 ±14

Trien 77 ±15 241 ± 21 140 ± 22

SpmTrien 3±0 52 ±3 236 ±1

N\N"-Et2SpmTrien 53 i 0 166±16 178 ±8

DENSpm 0.5 ±0.1. 17 ± 3 22019 ±3659

Вызываемое SpmTrien снижение активности ODC оказалось AZ-опосредован-ным. Из всех аналогов транспорт SpmTrien в большей степени зависел от уровня AZ в клетке: обработка клеток СНХ (ингибитор биосинтеза белка) приводила к резкому увеличению содержания SpmTrien, тогда как эффекты СНХ на транспорт N',N12-Et2-SpmTrien и Trien были слабо выраженными (Рис. 20). Оказалось, что SpmTrien способен подобно природным полиаминам и их аналогам индуцировать

+ 1 сдвиг рамки считывания мРНК AZ, что необхо-

ы

g к е димо для биосинтеза активного белка. Соответст-

S ¡c Е | м

I I ш íu ш венно, количества синтезирующегося в клетке AZ,

<: £ i/i m я о

в ответ на инкубацию с аналогами сильно отличались и SpmTrien оказался наиболее активным индуктором (Рис. 20). Таким образом, сокращение расстояния между аминогруппами до двух метиле-новых звеньев в случае Trien (изостер Spd) приводит к тому, что аналог, все еще являясь субстратом SSAT, перестает узнаваться клеткой как Spd: (;') Trien не использует систему транспорта полиаминов для проникновения в клетку, (и) Trien не влияет на пул полиаминов в клетке и на активности со-

ш

Trim SpmTrien DENSpm NV^'-Et,-SpmTrien

Рис. 20. Влияние Trien, SpmTrien и /V ,yV -Et2-SpmTrien на биосинтез AZ (а). Зависимость транспорта аналогов от уровня AZ в клетках DL1145 (Ь). (а) Клетки инкубировали 4 ч с исследуемыми аналогами (50 рМ); аликвоту суммарной белковой фракции (50 |ig) анализировали электрофорезом в 12% SDS-полиакриламидном геле и визуализировали при помощи антител к AZ. (Ь) Клетки инкубировали 1 ч с СНХ (10 pg/mL), или без СНХ, а затем еще 4 ч с Trien, SpmTrien, и DENSpm(50 цМ).

ответствуюших ферментов метаболизма, (ш) Trien не индуцирует ни биосинтез AZ, (rv) ни продуктивный сплайсинг пре-мРНК SSAT. Препрапвние Trien в SpmTrien приводит к зарядодефицитному изостеру Spm, который по большинству биохимических параметров, за исключением механизма проникновения в клетку, может считаться полиамином. Учитывая, что внутриклеточное содержание SpmTrien почти в 10 раз выше чем содержание Trien, а также возможность биосинтеза Trien из SpmTrien и низкую токсичность аналога для клеток, можно предположить, что SpmTrien представляет собой не только интересный инструмент исследования метаболизма и клеточных функций полиаминов, но и не лишен некоторой практической значимости.

Взаимодействие с ДНК является одной из основных клеточных функций Spm и Spd. Конденсация ДНК, сопровождающаяся появлением оптической плотности при X > 320 им из-за рассеяния падающего УФ-излучения на формирующихся компактных частицах, представляет собой одну из простейших моделей для оценки эффективности взаимодействия полиаминов с ДНК. Способность полиаминов конденсировать ДНК зависит от количества положительных зарядов в молекуле и уменьшается в ряду пентамин > тетрамин > триамин (SaminathanM., et al, 1999. Biochemistry, 38, 3821-3830).

Основность внутренних аминогрупп SpmTrien понижена, что приводит к недостаточному, по сравнению со Spm, протонированию центрального фрагмента молекулы при физиологическом рН (см. Табл. 8). В то же время в области слабокислых рН степень протонирования SpmTrien соответствует ионному состоянию Spm В связи с этим мы провели исследование ДНК-конденсируюших свойств Spd, Spm и SpmTrien при нейтральных и слабокислых рН, используя в качестве критерия концентрацию полиамина (с,ф), начиная с которой А340 быстро растет с увеличением концентрации полиамина (Рис. 21). При рН 6.8 Скр Spm и SpmTrien отличаются более, чем в 2,5 раза (25 и 67 рМ, соответственно), a c^, Spd, который подобно SpmTrien является трикатионом при данном рН, составляет уже 420 цМ (Рис. 21). Однако при

Конденсация ДНК под действием SpmTrien

рН 5.5 скр Spm и SpmTrien прак-

ЭО 35 40 45 и (3) - Spd, рН 6.8; (4) - Spm, рН 5.5; (5)

! тически совпадают (22 и 24 рМ,

Рис. 21. Зависимость конденсации ДНК (а340) от концентрации Spd, Spm и SpmTrien при разных рН. (/)

- Spm, рН 6.8; (2) - SpmTrien, рН 6.8;

соответственно), а Скр Spd ока-

зывается равной 300 цМ.

СКПСПШ^НЗЬ №10'

SpmTrien, рН 5.5; (í) - Spd, рН 5.5.

Совместно с дб.н. С.Г. Скуридиным, ИМБим.В.А. Энгельгардта РАН.

34

Таким образом, при рН 5.5 в процесс конденсации включается четвертая протонированная аминогруппа ЭртТНеп, что подтверждает правомерность рассмотрения его в качестве заря-додефицитного аналога Эрш при нейтральном рН. Следует особо отметить, что при рН 6.8 конденсирующая способность трижды протонированного БртТпсп намного превосходит таковую для трикатиона Брс! Наблюдаемые отличия обусловлены или геометрией молекулы (расстоянием между положительными зарядами), или же участием непротонированных вторичных аминогрупп БртТпеп во взаимодействии с ДНК, возможно, и в результате образования системы водородных связей.

Известно, что ДНК, сконденсированная под действием 5рт или БртТгсп, вновь растворяется при добавлении гепарина - полианиона, который эффективно извлекает полиамины из комплекса с ДНК (С.Г. Скуридин, неопубликованные данные). Поскольку БртТпеп является хорошим хелатором Си2+, то введение в систему солей меди должно вызывать гепа-риноподобные эффекты благодаря образованию прочного комплекса Си2+-8ршТг1еп. Сравнение УФ-спсктров исходной ДНК и ДНК, сконденсированной под действием 19.4 рМ БртТпсп при рН 5.2 (Рис. 22а, кривые 1 и 7) с УФ-спекгром конденсированной ДНК после

формы ДНК (Рис. 226, кривые 2-6), тогда как в случае ДНК сконденсированной под действием Брт, ионы Си2+ не вызывают подобного эффекта (данные не приведены). В отличие от гепарин-зависимой деконденсации ДНК (УФ-спекгры исходной ДНК и комплексов ДИК-Эрт и ДНК-8ртТпеп после обработки гепарином идентичны), в случае ионов Си2+ величина Агг.о уменьшается лишь незначительно, что обусловлено заметным поглощением комплекса (Си*5ртТгк:п)2+ при 260 нм (Рис. 226, кривая 7). Сами по себе ионы Си2+ в концентрациях до 2.0 рМ не вызывают изменений УФ-спекгра растворов ДНК.

Таким образом, наличие у БртТпеп хороших комплексообразуюших свойств позволяет регулировать его конденсирующую активность не только при помощи рН, но и вводя в систему ионы Си2+, что неизвестно ни для одного из аналогов Брит

прибавления 19.5 рМ СиС12 показы-

Рис. 22. Конденсация ДНК под действием БртТпеп (а) и декоцденсация в присутствии ионов Си" (б). (а): (/) ДНК - 20 р§/т1 в 5 тМ Ыа-Ас буфере, рН 5.2; (2) - (/) + 324 рМ БршТпеп; (3) - (/) + 6.48-рМ БртТпеп; (V) - (/) + 9.71-рМ БршТпел; (5) - (/) + 12.9 рМ БртТпеп; (<5) - (/) + 16.2рМ БртТпеп; (7) - (/) + 19.4-дМ ЗртТпеп. (6): (/) ДНК - 20 р§/т! в 5 тМ Ыа-Ас буфере, рН 5.2 + 19.4 рМ ЗртТпеп; (2) - (/) + 4.96-цМ СиС12; (3) -(!) + 9.88-рМ СиС12; (•/)•(/) + 14.7-рМ СиС12; (5)-(1) + 19.5-рМ СиС12; (б) - (/) + 24.3рМ СиС12; (7) 19.4 цМ БртТпеп + 19.5- рМ СиС12.

вает, что в присутствии ионов Си2

происходит растворение компактной

Новые ингибиторы спермин/спермидин /V'-ацетилтрансферазы на основе стабильных аналогов бисубстратного комплекса, возникающего в ходе ферментативной реакции

Одной из традиционных задач химической энзимологии полиаминов является разработка методов истощения внутриклеточного пула Spm и Spd, что вполне естественно, учитывая повышенное содержание полиаминов в опухолевых клетках. Соответственно, были найдены эффективные индукторы SSAT, ключевого фермента катаболизма полиаминов, однако набор ингибиторов SSAT, в отличие от ODC и AdoMetDC, весьма ограничен. Развитие молекулярной биологии полиаминов показало, что полиамин-зависимый сплайсинг пре-мРНК SSAT играет важную роль в регуляции активности фермента, а следовательно и уровня Spm и SpdB клетке (Hyvonen М.Т., et aL 2006. RNA,_12, 1569-1582). Поскольку избирательные ингибиторы SSAT являются удобным инструментом исследования активных и неактивных форм фермента, в том числе и методами рентгеноструктурного анализа, представлялось целесообразным расширить существующий набор ингибиторов.

Механизм SSAT-реакции не предусматривает промежуточного образования ацетили-рованного фермента - происходит прямой перенос ацетильной группы Ас-СоА на полиамин. Поэтому для ингибирования фермента ранее использовались конъюгаты HS-CoA со Spm или Spd, в которых HS-CoA и полиамин были соединены при помоши ацетатного линкера (Рис. 23). Синтезированные производные симметричных полиаминов ингибировали изолированный фермент с 1С so 0.5-5.0 цМ в зависимости от строения полиаминного фрагмента (Ervin B.G., et aL 1984. Biochemistry, 23,4250-4255), а для получения конъюгатов SH-CoA, а также

R-NA-^coa a R^-k^coA а н н СН3

Стабнльный аналог переходного Переходное состояние ацетил- Стабильны й аналог переходного состояния с ацетатным линкером трансферазной реакции состояния с оксимным линкером

Рис.23. Моделирование переходного состояния бисубстратного комппекса, возникающего в ходе SSAT-реакции, с помощью конъюгатов СоА-полиамин с ацетатным и ацетоновым линкерами.

Д-пантотеина, избирательно по Л'1- или Л®-положениям Spd позднее был разработан достаточно сложный многостадийный синтез (Roblot G. et al. 1993. Tetrahedron, 29,6381-6398).

Располагая набором аминооксианалогов Spm и Spd (Khomutov A.R. et aL 1996. Tetrahedron, 52, 13751-13766), которые представляют собой не только зарядодефицитные изостер-ные аналоги полиаминов (рКа II2NO-группы ~ 3.5), но являются еще и классическими карбонильными реагентами, естественным представлялось использовать различия в реакционной способности H2NO- и IhN-rpynn для получения конъюгатов СоА-полиамин. На первой стадии разработанного нами простого двухстадийного синтеза HS-CoA или D-пантотеин алки-лировали хлорацетоном в слабощелочной среде (Схема 15). Полученный кетон без выделе-

ния вводили в реакцию с соответствующим аминооксианалогом 5рт или Эре!, что приводило к целевым соединениям с выходами, близкими к количественным.

Схема 15.

О СН3 О ..........СН3

НЭ-СоА -^СоА^^^СНз—СоА^^Чг0"!* (Рап1-Э-)2 рап^^ЧнГ^ Рап1'3^Ч|'% (59) (60)-(63) (64) (65)-(68)

60 и 65: (4= -СН2СН2МН(СН2)4МН2 61 и 66: Р= -СН2СН2СН2МН(СН2)3МН2

62 и 67: -СН2СН2МН(СН2)3МН2 63 и 68: (4= -СН2СН21\1Н(СН2)4МН(СН2)3Ш2

ина

о о сн, он он т Я 9 9Н»

Н5-СоА=нз^.Л—„ N"4^ РаШ-БН = А^ —

н н • сн, (| м ¡г-—--1 н н д сн,

ОН 0 0 >|_ |/ он

I - С1СН2С0Ш3/СН,С№Н20/ЫаНС0з/№2С0з; И - RONH2; Ш - DTT/Et0H/H20

Как следует из данных Табл. 13, наиболее активным оказалось соединение (61), моделирующее аддукт по А"8-положению Spd, тогда как соединение (60), моделирующее //-замещенный Spd, было не столь эффективно (значения IC50 получены при 4.5 рМ концентрации Ас-СоА в субстратной смеси). Соединение (61) было в 22 раза активнее кетона (59), действовавшего хуже любого из СоА-содержаших конъюгатов. Подобная зависимость действия от строения подтверждает вклад полиаминного фрагмента в эффективность торможения SSAT. Вклад аденозинового фрагмента СоА в ингибирование фермента был определяющим, что следует из низкой активности (IC50 > 100 дМ) пантотеиновых производных имевших (данные не приведены). Подобная зависимость активности от строения ингибитора a priori была не. .... . .........., очевидной, т.к. известно, что в случае сукцинил-

Ингибитор SSAT 1С«, 1

... ... . СоА-ацетоацетаттрансферазы пантотеновая часть

з Л (59) 22 цМ „

^ сн, субстрата вносит значительный вклад в эффек-

(60' 6иМ тивность связывания субстрата (Fierke С.А. &

сн, Нн . „ Jencks W.P. 1986. J.BioLChem.. 261,7603-7606)1 сод8->м-°^й---NH> (61) 11

Табл. 13. Ингибирование (ic50) SSAT коньюгагами СоА-17цМ SH и/>-пантотеинас аминооксианалогами полиаминов.

Celt ^N -------- (»2)

сн, н Таким образом, был получен набор новых

(63) 5цМ f ^

н аналогов бисубстратного комплекса SSAT-реакции

на основе CoA-SH и £>-пантотеина и показано, что активность соединений (61), (63) и (60)

сравнима с таковой для лучших из известных ингибиторов SSAT.

Синтез и биологическая активность функционально-замещенных алкоксигуанцдинов

Наиболее известным алкоксигуанидином является аминокислота канаванин (а-амино-у-гуанидинооксимасляная кислота), широко представленная в растениях семейства бобовых, а у семян Dioclea megacarpa на эту аминокислоту приходится 13% всего связанного азота

(Rosenthal G.A. et aL 1977. Science, 196. 658-660). Тем не менее, удобных способов получения алкоксигуанидинов, в том числе и канаванина, практически не существует. Известно лишь, что обработка защищенного производного каналина S-метилизоиюмочевиной при 20°С в течение 72 ч приводит к канаванину с выходом 10% (Rosenthal G.A. et al. 1983. Anal.Biochem., 133.277-282), a 5 ч кипячение с цианамидом в спирте позволяет получить канаванин с выходом 70% (Frankel М., et aL 1963. J.Chem.Soc., 3127-3130). Предполагая использовать функци-онально-замещгнные алкоксигуанидины в качестве инструмента исследования метаболизма полиаминов, мы были вынуждены сначала найти удобный метод синтеза этих малодоступных соединений.

В настоящей работе для получения гуанидинооксиалканов впервые был использован трифлат ди-Вос-гуанидина, который быстро и практически количественно превращает алифатические амины в соответствующие гуанидины (Feichtinger К., et aL 1998. J.Org.Chem., 1998, 63, 3804-3805). Однако О-замещенные гидроксиламины существенно менее нуклео-фильны по сравнению с соответствующими алифатическими аминами и поэтому мы сначала исследовали взаимодействие трифлата ди-Вос-гуанидина с модельным О-бензилгидроксил-амином. Оказалось, что ди-Вос-производное бензилоксигуанидина образуется с практически количественным выходом, но реакция протекает существенно медленнее (Рис. 24), чем в случае бензиламина. Величина константы скорости реакции второго порядка (мольные соотношения О-бензилгидроксиламина и трифлата ди-Вос-гуанидина), определенная с использова-зованием 'Н-ЯМР составила 2.66-10'2 л/моль/мин (ti/2 75 мин при 37°С).

100 £80 ?60 540 ¿¡20

NBoc и

■Л н

iP^^O- ! BOOHN^NHSOjCFj ^^О'у

,N___NHBoc

п

NBoc

Рис.24. Кинетика гуанидмнилироваиия 0-бензнлгидрок-

—"-1-1-1 силамина (0.3 М) трифлатом ди-Вос-гуанвдина (0.3 М) в

0 4 8 12 16 20 24 присутствии (0.3 М) в СИСЬ при 37°С.

На следующем этапе работы в реакцию с трифлатом ди-Вос-гуанидина были введены некоторые функционально-замешенные эфиры гидрок-силамина (Схема 16), гуанидилирование которых удается осуществить с высоким выходом несмотря на наличие в радикале меркапто- и гидроксильных групп, а также экзоциклической аминогруппы аденозина.

Схема 16

Гс Гс Л*

—> * Г^нЛнВос — РОНЫ ЫНВос ^Жож^цЛ

-сн(сн3)сн3 V—/

-сн2сн2сн2сн2зн он он

Таким образом, был найден эффективный способ гуанидилирования аминооксигруппы, позволяющий получать целевые гидроксиламин-содержашие аналоги А§пг

о'™*

Адт вАРА КвРв АО-Адт

Рис.25. Агматин и его гвдроксиламин-содермсащие аналоги.

Исходным соединением в синтезах АО-А§ш, в АРА и ЫОРО (Рис. 25) служил 1-эток-сиэтилиденаминоокси-3-аминопропан (69) (Схема 17). Гуанидинилирование его свободной аминогруппы трифлатом ди-Вос-гуанидина позволило получить ди-Вос-производное (69) с выходом близким к количественному. Последующге удаление защитных групп действием НС1/ЕЮН привело к медленно смокающему на воздухе дихлоргидрату AO-Agm, который был переведен в хорошо кристаллизующийся дитозилат (выход 75.5%, считая на (69)).

Схема 17

_!!• ( NGPG] 54%, на (69)

NBoo

Н Н (73) Me И»

-о

Мв | н ц

— -i!- [75^)75.5%, на (69)

(69) (70) NBoo

III,IV

NBoc

' Н у у Н _

— Г^Ш] 48.7%, на (69) (71) Н Н (72) -

i- (BocNH)2C=NTf7BjN/CH2Cl2/20°C; Н- НС1//-РЮН/Н20; ш- CbzO/QjN/THF; ív- HCl/B0H/H20; v- (BocNH)2ONTf7Et3N/CHCh/37°C; vi- HBr/AcOH.

Следует отметить, что AO-Agm является изостерным зарядодефицитным аналогом Agm и образует, подобно другим О-замешенным гидроксиламинам, стабильные оксимы с альдегидами и кетонами, включая PLP, который служит коферментом ArgDC. Так как ами-нооксианалоги субстратов пируват- и PLP-зависимых ферментов метаболизма аминокислот являются их эффективными ингибиторами, то следует ожидать высокой активности AO-Agm по отношению к ArgDC.

При получении GAPA свободную аминогруппу соединения (69) сначала карбобензок-силировали, а затем удаляли этоксиэтилиденовую защиту, что приводило к гидроксиламину (71) (Схема 17). Гуанидинилирование аминооксигруппы трифлатом ди-Вос-гуанидина позволило получить с высоким выходом соединение (72), что после одновременного удаления Вое- и Cbz-защитных групп привело к кристаллическому дибром гидрату GAPA (выход 48.7%, на (69)). Мы реализовали несколько схем получения NGPG, наиболее удачной из которых является синтез, исходящий из 1-аминоокси-З-аминопропана, свободные амино- и аминоокси-группы которого гуанидилировали 1.9 экв. трифлата ди Вос-гуанидина при 37°С (Схема 17). Соединение (73) очипали колоночной хроматографией на силикагеле, и после удаления Вое-защитных групп получали дибромшдрат NGPG (выход 54%, на (69)).

Основность гуанидиноокси-фрагмента GAPA и NGPG имеет значение для правильно-

го использования этих аналогов в биохимии полиаминов. Значения рКа аминооксигруппы

NH Hi

GAPA н

V NH NGPQ Hee

\

\

««78

PH

Рнс.26. Основность пщрокснламин-содержащих аналогов Agm.

AO-Agm (рКа 4.05) и гуанидинооксигрупп GAPA (рКа 6.7) и NGPG (pKa 6.9) были определены при помощи 'Н-ЯМР спектроскопии (Рис. 26). Таким образом, GAPA, являясь изостером Agm (рКа 9.6 и 12.5), по основности ближе к Put и, скорее всего, будет активно переноситься в клетки, используя, подобно Agm, систему транспорта Put.

Влияние GAPA на размножение Leishmania donovam

Полиамины играют важную роль и в жизненном цикле протозойных паразитов, например Plasmodium falciparum, Leishmania donovam, Trypanosoma brucei gambiense, вызывающих весьма распространенные в тропиках и субтропиках заболевания - малярию, лейшма-ниоз и сонную болезнь, соответственно (см.обзор: Heby О., et al 2007. Amino Acids, 33, 359366). В последние годы возникли формы L.donovani, устойчивые к противолейшманиозным препаратам, в том числе и к широко используемому Солюсурьмину®, что делает весьма актуальным поиск метаболических мишеней, перспективных для создания новых средств борьбы с лейшманиозом (см.обзор: Croft S.L., et al. 2006. Clin.Microbiol.Rev., J_9, 111-126). Одной из таких мишеней являются ферменты биосинтеза полиаминов, что обусловлено необходимостью Put и Spd как таковых для размножения паразитов, а также и тем, что Spd входит в состав трипанотиопа (Try, //1,Л^-б«с(глугатионил)спермидин), выполняют:го многочисленные функции по зашите паразита от неблагоприятных внешних воздействий. Одна из сложностей практического применения ингибиторов биосинтеза Spd для лечения протозойных инфекций состоит в том, что Spd жизненно необходим и для клеток хозяина. Тем не менее, а-дифгорметилорнитин (DFMO), ингибитор ODC, используется для лечения поздних стадий сонной болезни, вызываемой Tripanosoma brucei gambiense (Burri C.C. & Brun R. 2003. Para-sitoLRes., 90, S49-S52).

Совместно с Prof. R.Madhubala (J.Nehru University, New Delhi, India), Prof LPersson (University of Lund, Sweden), Prof. S.Al-Karadaghi (University of Lund, Sweden) и Prof. O.Heby (University of Umea, Sweden).

40

Среди многочисленных ингибиторов ODC одним из наиболее эффективных является 1-аминоокси-З-аминопрпан (АРА), действующий на изолированный фермент в пМ концентрациях и специфически подавляющий рост нормальных и опухолевых клеток (Hyvoven Т., et aL 1988. J.Biol.Chem., 263, 11138-11144; Persson L., et al. 1989. Biochem.J., 257, 929-931; Stanek J., et al. 1992. J.Med.Chem., 35, 1339-1344; Milovic V., et al. 2001. Biochem..Pharmacol., 61, 199-206). Оказалось, что АРА высокоактивен и по отношению L.donovani и P.falciparum, подавляя их размножение в рМ концентрациях и снижая уровни Put, Spd и Try у паразитов.

Таким образом, в этих системах АРА был намного активнее DFMO, классического ингибитора ODC (Табл. 14).

Табл. 14. АРА эффективно ингибирует размножение P.falciparum и амастигот L.donovani и изолированную СШСэтих паразитов.

Размножение и L.donovani и P.falciparum, полностью восстанавливается после добавления в среду Put/Spd, что указывает на специфичность действия ингибитора (данные не приведены).

Высокая активность АРА по отношению ODC L.donovani и P.falciparum стимулировала рентгеноструктурные структурные исследования E-I комплекса. АРА правильно связывается в активном центре фермента (протонированная при физииологическом рН аминогруппа ингибитора выполняет якорные функции), что как и при связывании субстрата приводит к разрыву С^-двойной связи внутреннего альдимина, образованного карбонильной группой

? ^ кофермента и аминогруп-

NH H CHF, NH,

IC„(|1M)

ODC L.donovani 0.001 70 —

L.donovani 5.0 9.0 50

ODC P.falciparum 0.0027 — 87.6

P.falciparum 1.0 >500 1250

У4 1 rV,i

пой Ьуз69. Пиридиновьй цикл поворачивается и карбонильная фуппа РЬР оказывается сближенной с аминооксигруппой ингибитора (Рис. 27). Однако, в этом случае, в отличие от

* Рнс.27. Структура комплекса ODC и АРА (разрешение 1.9А)

комплексов пиридоксаль-

5'-фосфат зависимых аспартатаминотрансферазы с аминооксиуксусной кислотой (Markovic-Housley Z., et al. 1996. Eur.J.Biochem., 236, 1025-1032), трансаминазы у-аминомасляной кислоты с аминооксиуксусной кислотой (Liu W., et al. 2004. Biochemistry, 43, 10896-10905) и 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат синтазы с аминооксианалогом декарбоксилированного S-аденозилметионина (Capitani G., et al. 2003. Biochim.Biophys.Acta, 1647, 55-60), образования

оксима фермента не наблюдалось, а карбонильная- и аминоокси-группы оказывались «замороженными» на расстоянии ~ 3Á, что соответствует длине водородной связи. Таким образом, в данном случае комплекс О DC-АР А кристаллизуется в кон формации, которая не реализуется в растворе, где происходит образование оксима фермента. Из литературы известно, что кристаллическая структура не всех комплексов ODC-DFMO соответствует строению образующегося в растворе ковалентного аддукга ингибитора с ферментом.

Успех применения специфических ингибиторов для практической терапии во многом определяется возможностью создания их активно-транспортируемых форм. Однако, такие ингибиторы ODC как DFMO и АРА, весьма активные in vitro по отношению к L.donovani и P.falciparum, пассивно проникают в паразиты. Поэтому в заключительной части настояпвго исследования мы попытались создать активно-транспортируемую форму АРА, превратив его в GAP А, который представляет собой зарядодефицитный (рКа 6.71, см. Рис. 26) изостерный аналог агматина. Так как агматин активно проникает в животные клетки используя Put транспортер, то можно было предположить, что и GAPA сможет проникать в клетки, используя систему транспорта Put.

Сопоставление активностей АРА и GAPA по отношению к изолированной О DC (10"9 М и 6-10"6 М, соответственно) и амастиготам L.donovani (5 цМ и 9 цМ, соответственно) свидетельствует, что GAPA, скорее всего, активно проникает в паразит и, следовательно, может считаться первым активно-транспортируемым ингибитором ODC. Возможность внутриклеточной трансформации GAPA в АРА (Рис. 28) определяется наличием в клетке низкоспеци-другие фичных уреидогидролаз. Известно,

мишени?

is, i что многие аргиназы способны прев

I

nh2 ^

GAPA

н

§

Í

pKa=G.71 Клеточная

Уреидо-

GAPA ращать канаванин в каналин, а неко-

2 i АРА

1 Рис. 28. Возможные механизмы действия

I

GAPA.

стенка цМ ингибитор ПМ ингибитор

ODC ODC

торые из них способны даже расцеплять Agm до Put (Dabir S., etaL 2005. Int.J.BioLSci., i, 114-122). Кроме того, макрофаги, в которых локализована L.donovani, обладают агматиназной активностью (Sastre М, et al. 1998. Biochem.J., 330. 1405-1409). Проникнув в L.donovani, GAPA подобно АРА вызывает снижение уровня Put и Spd (Табл.15) а экзогенные Put и/или Spd полностью нейтрализуют эффекты ингибитора (данные не приведены), что свидетельствует о связи биохимической мишени GAPA с метаболизмом полиаминов.

Однако GAPA, в отличие от АРА, мало влияет на уровень трипанотиона в L.donovani

' ■ -- - ----- ----- pul™...... .............. (Табл.15). Таким образом, наблю-

« .........nmoUmfl белка . nmol/mg белка «mol/I* dl.. Даемая картина, ПО-ВИДИМОМу, не

L.donovanl 14.1+2.3 40.0 ±7.0 45.9 ±7.0

Табл. 15. Влияние GAPA и АРА на Ldonovani* 40рМ GAPA 3.S±1.1 29.4±3.5 39.4±1.8 уровень полиаминов и трипанотиона

L.donovani+ 40 рМ АРА 3.9 ±1.8 24.3 ±2.9 9.4 ±2.1 СГУ) У промастигот L.donovani.

может быть описана только в терминах ингибирования ODC под действием GAPA или в результате ее расщепления до АРА (Рис. 28), а взаимосвязь уровень Spd - уровень трипаноти-она у L.donovani может иметь достаточно сложный характер.

Другим принципиальным отличием GAPA от АРА и DFMO является его высокая эффективность по отношению к формам L.donovani, резистентным к сурьмасодержашим (SAG) препаратам (Табл. 16). Следует отметить, что устойчивость к этим препаратам сопровожда-

- - • 1 ется повышенной активность

Promastigotes Amastigotes ä

..........• '' ' ферментов биосинтеза Spd, в

sag ара gapa sag ара gapa

|Сю(мМ) первую очередь ODC, что, по-

Wildtype Ldonovanl 57±0.9 42±8.0 3i±7.0 15±6.0 5±2.0 9±1.0 ВИДИМОМУ, И Снижает эффективность АРА и DFMO.

R-1 (SAG-resistant) 128±3.3 >400 3±1.2" 62±1.4 >200 18 ШГ

Табл. 16. Влияние SAG, АРА и GAPA GE-1 (SAG-resistant) 164±5.1 >400 8 ±1.4' >95 >200 з±0.Г на SAG-резистенгные (R-1 и GE-1) НОН2С-(СНОН)2-CHOv 0/0СН-(СНОНЬ-СНгОН клинические „золять. Ldonovanl.

SAG: -ooc-cHo'Sb''Hoo-coo- ,2Na+ Таким образом, нельзя исклю-

чить, что GAPA имеет еше одну метаболическую мишень, отличную от ODC. Нечто подобное наблюдалось ранее при сравнении эффектов DFMO и АРА на рост мицелия фитопато-генного гриба Pyr.oryzae. Оба ингибитора ODC снижали содержание Put и замедляли рост мицелия, который восстанавливался при внесении в среду Put. Однако, АРА, действуя, в отличие от DFMO, еше и на ранние этапы биосинтеза меланина, вызывал обесцвечивание мицелия, окраска которого восстанавливалась после добавления Put (Хомутов А.Р., и др. 1989. Биоорган.Химия, 15, 706-709).

Превращение АРА в GAPA привело к активно проникающему в L.donovani ингибитору ODC, который, в отличие от АРА, оказался эффективен по отношению к SAG-усойчивым формам паразита. Эти приципиальные отличия в действии АРА и GAPA должны стимулировать детальное изучение механизма действия последнего, поскольку возможность существования у GAPA биологической мишени отличной от ODC, может быть уникальной для этого паразита и представлять интерес для избирательного воздействия на L.donovani.

Выводы

1. Разработан новый подход к превращениям спермина (5рт) и спермидина (Брс!) в их биологически-активные производные, заключающийся в создании системы новых С-.«о//о-метилированных аналогов Spd, врш и Д''-Ас-5рё, для получения которых были разработаны оригинальные схемы синтезов. Ключевые соединения получены в количествах, достаточных для проведения испытаний на лабораторных животных.

2. Впервые показано, что биохимические свойства С-жоно-метилированных аналогов 5рт и Spd зависят от положения метальной группы. Перемещение последней кардинально

43

сказывается на взаимодействии аналогов с ферментами метаболизма полиаминов, что позволило получить метаболически устойчивое производное Spd - y-MeSpd или, наоборот - индуцировать катаболическую нестабильность (p-MeSpd). Это открывает спектр новых возможностей для исследования клеточных функций Spm и Spd, которые легко взаимопреврашаются и частично взаимозаменяемы. Найдено, что P-MeSpd, в отличие от подавляющего большинства аналогов Spd и остальных С-метилированных производных Spd, слабо индуцирует биосинтез регуляторного белка антизима, что делает P-MeSpd уникальным инструментом исследования важнейших для клетки антизим-зависимых путей поддержания гомеостаза полиаминов.

3. При помощи катаболически устойчивого a-MeSpd впервые удалось обратить последствия супериндукции спермип/спермидин-Л'|-ацетилтрансферазы (SSAT) in vitro и in vivo и предотвратить развитие острого панкреатита, вызываемого активацией катаболизма полиаминов у SSAT-трансгенных крыс.

4. Введение метильной группы в молекулы Spm и Spd приводит к возникновению хиральных центров, что открывает возможность осуществлять регуляцию биохимических свойств таких аналогов полиаминов не только посредством перемещения метильной группы, но и на более тонком уровне, изменяя конфигурацию хирапьного центра. С этой целью, были разработаны удобные методы синтеза и получены не описанные ранее (Л)- и (ф-изомеры a-MeSpd и a-MeSpm, (RRj-, (S,S)- и (RS)-диастереомеры a,a'-Me2Spm, а также (/?)- и (5)-изомеры A^-Ac-a-McSpd.

5. Впервые показано, что ферменты метаболизма полиаминов - сперминоксидаза, дезоксигипузинсинтаза и ацетилполиаминооксидаза, природные субстраты которых ахиральны, обладают скрытой стереоспецифичностью. Найден оригинальный способ регулирования стереоспецифичности ацетилполиаминооксидазы. Установлено, что система активного транспорта полиаминов по-разному узнает стереоизомеры a-метилированных полиаминов в качестве Spm и Spd. Способность изомеров a-MeSpd и диастереомеров a,a'-Me2Spm по-разному индуцировать +1 сдвиг рамки считывания мРНК антизима, приводящий к биосинтезу активного белка, а также продуктивный сплайсинг мРНК SSAT открывают новые возможности воздействия на ключевые регуляторные механизмы, ответственные за поддержание гомеостаза полиаминов в клетке.

6. Предложен новый подход к созданию зарядодефицитных аналогов Spm, состоящий в сокращении расстояния между аминогруппами до двух метиленовых звеньев, и синтезированы неизвестные ранее 1,12-диамино-3,6,9-триазадодекан (SpmTrien) и его

биохимически-значимые производные. Наличие триэтилентетраминового фрагмента делает SpmTrien эффективным хелатором ионов Си2+, что позволяет регулировать конденсированное состояние ДНК, вызываемое SpmTrien, не только варьируя pH, но и при помоши ионов Си2+, что не характерно ни для одного из известных аналогов Spm

7. На основании анализа взаимодействия SpmTrien и триэтилентетрамина (Trien) с ферментами катаболизма полиаминов и эффектов, вызываемых этими аналогами в культуре клеток, показано, что SpmTrien способен выполнять многие клеточные функции Spm, тогда как Trien, изостерный Spd, не является функционально активным миметиком Spd. Установлено, что концентрация эффективно хелатирующего ионы Си SpmTrien в клетках оказывается почти в 10 раз выше, чем Trien, и что SpmTrien частично метаболизирует в клетке до Trien Последний, благодаря образованию прочных комплексов с ионам Си2+, используется для лечения болезни Вильсона.

8. Предложен способ превращения 1-аминоокси-З-аминопропана, специфического ингибитора орнитиндекарбоксилазы (скорость-определяюший фермент биосинтеза полиаминов), в 1-гуанидиноокси-З-аминопропан GAPA - активно-транспортируемый ингибитор/проингибитор этого фермента. Показано, что GAPA эффективно ингибирует размножение Leishmania donovani, в том числе и формы, резистентные к широко используемым в практической терапии лейшманиоза сурьмасодержашим препаратам.

9. Для получения биологически-активного GAPA и других функционально-замешенных апкоксигуанидинов с выходом, близким к количественному, предложен новый обший способ превращения О-замененных гидроксиламинов в ранее малодоступные алкоксигуанидины.

Заключение

В ходе выполнения настоящей работы был осуществлен дизайн и синтез новых химических регуляторов метаболизма полиаминов, которые показали себя ценными инструментами исследований in vitro и in vivo. С их помошью были получены оригинальные и значимые для биохимии и молекулярной биологии полиаминов результаты. Созданные нами подходы и алгоритмы дают определенный импульс развитию области и формируют хороший плацдарм для дальнейших плодотворных научных интервенций.

Основное содержание работы отражено в следующих публикациях:

1. Khomutov A.R.. Svetsov A.S., Vepsalainen J.J., Kritzyn A.M. "Novel acid-free cleavage оfN-(2-hydroxyarylidene)protected amines". Tetrahedron Lett, 42(15), 2887-2889 (2001).

2. Ruiz-Chica A.J., Khomutov A.R.. Medina M. A., Sanchez-Jimenez F., Ramirez F.J. "Interaction of DNA with an aminooxy analogue of spermidine - an FT-IR and FT-Raman approach". J.Mol.Structure. 565-566,253-258 (2001).

3. Turchanowa L, Shvetsov A.S., Demin A.V., Khomutov A.R.. Wallace H.M., Stein J., Milovic V. 'Insufficiently charged isosterie analogue of spermine: interaction with polyamine uptake, and effect on Caco-2 cell growth". Biochem.Pharmacology, v. 64, No 4, p. 649-655 (2002).

4. Rasanen T.L., Alhonen L., Sinervirta R., Keinanen Т., Herzig K-H., Suppola S., Khomutov A.R.. Vepsalainen J., Janne J. "A polyamine analogue prevents acute pancreatitis and restores early liver regeneration in transgenic rats with activated polyamine catabolism". J.BioI.Chem., 277(42), 39867-39872 (2002).

5. Хомутов A.P.. "Ингибирование ферментов биосинтеза полиаминов субстратоподобными О-замепенными гидроксиламинами". Биохимия, 67(10), 1403-1412 (2002).

6. Григоренко H.A., Вепсалайнен Й., Ярвинен А., Кейнанен Т.А., Алхонен Л., Янне Ю., Крицьш A.M., Хомутов А.Р. "Новый синтез а-мелилспермидина". Биоорган.химия, 30(4), 441-445 (2004).

7. Jarvinen A., Grigorenko N., Khomutov A.R.. Hyvonen М.Т., Uimari A., Vepsalainen J., Sinervirta R., Keinanen T.A., Vujcic S., Alhonen L., Porter C.W., Janne J. "Metabolic stability of alpha-methylated polyamine derivatives and their use as substitutes for the natural polyamines". J.BioI.Chem., 280(8). 6595-601 (2005).

8. Григоренко H.A., Вепсалайнен Й., Ярвинен А., Кейнанен Т.А., Алхонен Л., Янне Ю., Хомутов А.Р. "Новый синтез а-метил- и а,а'-диметилспермина". Биоорган.химия, 31.(2), 200-205 (2005).

9. Хомутов А.Р.. Симонян А.Р., Вепсалайнен Й., Кейнанен Т.А., Алхонен Л., Янне Ю. "Новые оксааналоги спермина". Биоорган.химия, 3J_(2), 206-212 (2005).

10. Хомутов А.Р.. Григоренко H.A., Демин A.B., Вепсалайнен Й., Касеро P.A., Уостер П.М. "Зарядодефицитный аналог спермина с комплексообразуюшими свойствами" Биоорган.химия, 31,(3), 303-311 (2005).

11. Grigorenko N.A., Vepsalainen J., Jarvinen A., Keinanen T.A., Alhonen L., Janne J., Khomutov A.R. 'Synthesis of (/?)- and (S)-isomers of 1-methylspermidine" Mendeleev Commun., 15.(4). 142-143 (2005).

12. DasGupta R., Krause-Ihle Т., Bergmann В., Muller I.B., Khomutov A.R.. Muller S„ Walter R.D., Luersen K. '3-Aminooxy- 1-aminopropane and derivatives have an antiproliferative effect on cultured Plasmodium falciparum by decreasing intracellular polyamine concentrations". Antimicrob.Agents Chemother., 49(7), 2857-2864 (2005).

13. Симонян A.P., Григоренко H.A., Вепсалайнен Й., Хомутов А.Р. "Новые зарядодефицитные аналоги агматина". Биоорган.химия, 31(6), 645-650 (2005).

14. Jarvinen A.J., Cerrada-Gimenez М., Grigorenko N.A., Khomutov A.R.. Vepsalainen J.J., Sinervirta R.M., Keinanen T.A., Alhonen L.I., Janne J.E. "a-Methyl polyamines: efficient

synthesis and tolerance studies in vivo and in vitro. First evidence for dormant stereospecificity ofpolyamine oxidase". J.Med.Chem., 49(2), 399-406 (2006).

15. Jarvinen A., Keinanen Т.Д., Grigorenko N., Khomutov A.R., Uimari A., Vepsalainen J., Narvanen A., Alhonen L., Janne J. "Guide molecule-driven stereospecific degradation of a-methylpolyamines by polyamine oxidase". J.Biol.Chem., 281(8), 4589-4595 (2006).

16. Hyvonen M.T., Herzig K-H., Sinervirta R, Albrecht E., Nordback I., Sand J., Keinanen T.A., Vepsalainen J., Grigorenko N., Khomutov A.R.. Kluger В., Janne J., Alhonen L. "Activated polyamine catabolism in acute pancreatitis - methylated polyamine analogues prevent tripsinogen activation and pancreatitis-associated mortality". Am.J.Pathol., 168(1), 115-122 (2006).

17. Симонян A.P., Вепсалайнен Й., Хомутов А.Р. "Аминооксианапоги спермина и их моноацетильные производные." Биоорган.химия, 32(6), 643-650 (2006).

18. Singh S., Mukheijee A., Khomutov A.R., Persson L., Heby О., Chatterjee M„ Madhubala R. "Antileishmanial effect of 3-aminooxy-l-aminopropane is due to polyamine depletion". Antimicrob Agents Chemother. Д(2), 528-534 (2007).

19. Khomutov A.R.. Grigorenko N.A., Skuridin S.G. "Novel approach to design isosteric charge-deficient analogue of spermine and its biochemical important derivatives". Bioche m.Soc.Trans., 35(2), 369-373 (2007).

20. Grillo M.A., Battaglia V., Colombatto S., Rossi C.A., Simonian A.R., Salvi M., Khomutov A., Toninello A. "Inhibition of agmatine transport in liver mitochondria by new charge-deficient agmatine analogues". Biochem.Soc.Trans., 35(2), 401-404 (2007).

21. Grigorenko N.A., Khomutov A.R., Keinanen T.A., Jarvinen A., Alhonen L., Janne J., Vepsalainen J. "Synthesis of novel optical isomers of a-methylpolyamines". Tetrahedron, 63(10), 2257-2262 (2007).

22. Keinanen T.A., Jarvinen A., Uimari A., Vepsalainen J., Khomutov A.R., Grigorenko N.A., Hyvonen M.T., Cerrada-Gimenez M., Alhonen L., Janne J. "o-Methylated polyamines as potential drugs and experimental tools in enzymology" Mini Rev.Med.Chem., 7(8), 813-820 (2007).

23. Dufe V.T., Ingner D., Heby O., Khomutov A.R.. Persson L., Al-Karadaghi S. "A structural insight into the inhibition of human and Leishmania donovani ornithine decarboxylase by 3-aminooxy-l-aminopropane" Biochem.J., 405(2). 261-268 (2007).

24. Hyvonen M.T., KeinanenT.A., Cerrada-Gimenez M., Sinervirta R., Grigorenko N., Khomutov A.R., Vepsalainen J., Alhonen L., Janne J. "Role of hypusinated eukaryotic translation initiation factor 5A in polyamine depletion-induced cytostasis". J.Biol.Chem., 282(48), 3470034706 (2007).

25. Simonian A.. Khomutov A.. Hyvonen Т., Grigorenko N., Keinanen Т., Vepsalainen J., Alhonen L., Janne J. " Novel CoA-polyamine conjugates for effective inhibition of spermine/spermidine-jV'-acetyltransferase." Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 26(10), 1245-1248 (2007).

26. Merentie M., Uimari A., Pietila M., Sinervirta R., Keinanen T.A., Vepsalainen J., Khomutov A., Grigorenko N., Herzig K-H., Janne J., Alhonen L. "Oxidative stress and inflammation in the pathogenesis ofactivated polyamine catabolism-induced acute pancreatitis". Amino Acids, 33(2), 323-330 (2007).

27. Singh S., Jhingran A., Sharma A., Simonian A.R, Soininen P., Vepsalainen J., Khomutov A.R.. Madhubala R "Novel agmatine analogue, gamma-guanidinooxypropylamine (GAPA) efficiently inhibits prolifereation of Leishmania donovani by depletion of intracellular polyamine levels". Biochem.Biophys.Res.Commun., 375(1), 168-172 (2008).

28. Хомутов A.P.. Кейнанен T.A., Григоренко H.A., Хивонен M.T., Умари А., Пиетила М., Серрада-Хименес М., Симонян А.Р., Хомутов М.А., Вепсалайнен Й., Алхонен Л., Янне Ю. "Метилированные аналоги биогенных полиаминов спермина и спремидина как инструмент исследования клеточных функций полиаминов и ферментов их метаболизма". Молекулярная биология, 43(2), 274-285 (2009).

29. Hyvonen М.Т., Howard М.Т., Anderson С.В., Grigorenko N., Khomutov A. R,. Vepsalainen J., Alhonen L., Janne J., Keinanen T.A. "Divergent regulation of the key enzymes of polyamine metabolism by chiral alpha-methylated polyamine analogs". Biochem.J., 422(2). 321-328 (2009).

30. Nayveltl., HyvönenM.T., Alhonen L„ Pandya I., Thomas T„ Khomutov A.R.. Vepsäläinen J., Patel R, Keinänen T.A., Thomas T.J. "DNA condensation by chiral a-methylated polyamine analogues and protection of cellular DNA from oxidative damage" Biomacro molecules, Д(1), 97-105 (2010).

31. Weisell J., Hyvönen M.T., Vepsalainen J., Alhonen L., Keinänen T.A., Khomutov A.R., Soininen P. "Novel isosteric charge-deficient spermine analogue - l,12-diamino-3,6,9-triazadodecane: Synthesis, pKa measurement and biological activity". Amino Acids, 38(2), 501-507(2010).

32. Vuohelainen S., Pirinen E., Cerrada-Gimenez M., Keinanen T.A., Uimari A., Pietila M., Khomutov A.R.. Janne J., Alhonen L. "Spermidine is indispensable in differentiation of 3T3-L1 fibroblasts to adipocytes" J.Cell Mol.Med., J4(6B), 1683-1692 (2010).

33. Weisell J., Hyvönen M.T., Häkkinen M.R., Grigorenko N.A., Pietilä M., Lampinen A., Kochetkov S.N., Alhonen L., Vepsäläinen J., Keinänen T.A., Khomutov A.R. "Synthesis and biological characterization of novel charge-deficient spermine analogs". J.Med.Che m., 53(15), 5738-5748 (2010).

34. Khomutov A.R.. Weisell J, Khomutov M.A., Grigorenko N.A., Simonian A.R, Häkkinen M.R., Keinänen T.A., Hyvönen M.T., Alhonen L., Kochetkov S.N., Vepsäläinen J. "Methylated polyamines as research tools". In: Polyamines: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. (A.E.Pegg & RA.Casero, Eds.) vol 720, Ch.29, pp. 449-461. Springer Science+Business Media, LLC (2011).

35. Hyvönen M.T., KeinänenT.A., Khomutov M., Simonian A., Weisell J., Kochetkov S.N., Vepsäläinen J., Alhonen L., Khomutov A.R. "The use of novel C-methylated spermidine derivatives to investigate the regulation of polyamine metabolism". J.MedChem., 54(13), 4611-4618(2011).

36. Hyvönen M.T., Keinänen T.A., Khomutov M., Simonian A., Vepsäläinen J., Park J.H., Khomutov A.R.. Alhonen L., Park M.H. "Effects of novel C-methylated spermidine analogs on cell growth via hyp us ¡nation of eukaryotic translation initiation factor 5A". Amino Acids -(2011), Aug.23 [Epub ahead of print].

Заказ № 82-р Подписано в печать 19.10.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л.2,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 )) www.cfr.ru ; е-таП:info@cfr.ru

Содержание диссертации, доктора химических наук, Хомутов, Алексей Радиевич

I 1. ВВЕДЕНИЕ 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Методы избирательной защиты первичных и вторичных аминогрупп

J Синтез полиаминов и их аналогов в растворе

Твердофазный синтез полиаминов и их аналогов

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 40 > Метаболически устойчивые аналоги полиаминов

Синтез рацемических а-метилполиаминов и ÍV8 -ацетил-а-метилспермидина 43 I Катаболическая устойчивость рацемических а-метилполиаминов и их исполь зование для исследования функций спермина и спермидина in vitro и in vivo Биологические эффекты и метаболизм рацемических а-метилполиаминов in vivo Синтез оптических изомеров а-метилполиаминов и АГ-ацетил-а-метилспермидина 55 ■ Взаимодействие оптических изомеров a-метилированных аналогов спермина и спермидина с ферментами метаболизма полиаминов и клетками 61 Синтез рацемических ß-, у- и ю-метилированных аналогов спермидина, Л^-ацетил-спермидина и спермина 69 Взаимодействие С-метилированных аналогов спермидина с ферментами метаболизма полиаминов и клетками 74 Синтез SpmTrien - нового изостерного зарядодефицитного аналога спермина и его биохимически значимых производных 87 Взаимодействие SpmTrien с ДНК 95 Взаимодействие SpmTrien и его производных с ферментами метаболизма полиаминов и клетками 100 Гидроксиамин-содержащие аналоги спермина и их производные 106 Новые ингибиторы спермин/спермидин /И-ацетилтрансферазы на основе стабиль- * ных аналогов бисубстратного комплекса, возникающего в ходе ферментативной реакции 110 Синтез окса-аналогов спермина 113 Определение рКа гидроксиламин-содержацих аналогов спермина 117 Синтез и биологически-активных функционально-замещенных алкоксигуанидинов 117 Í Влияние 1 -гуанидиноокси-3 -аминопропана на размножение Leishmania donovani

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 127 Синтез a-метилированных аналогов спермина, спермидина и их стереоизомеров t Синтез С-метилированных аналогов спермина, спермидина и их производных Синтез SpmTrien и его биохимически-значимых производных

I Взаимодействие SpmTrien с ДНК

I Синтез гидроксиламин-содержащих аналогов спермина и их производных

Синтез "бисубстратных" ингибиторов спермин/спермидин Л^-ацетилтрансферазы

Синтез окса-аналогов спермина

I Синтез функционально-замещенных алкоксигуанидинов Синтез аминооксианалогов агматина

5. ВЫВОДЫ 208 i 6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Хомутов, Алексей Радиевич

Выводы

1. Разработан новый подход к превращениям спермина (Spm) и спермидина (Spd) в их биологически-активные производные, заключающийся в создании системы новых С-лгоно-метилированных аналогов Spd, Spm и JV'-Ac-Spd, для получения которых были разработаны оригинальные схемы синтезов. Ключевые соединения получены в количествах, достаточных для проведения испытаний на лабораторных животных.

2. Впервые показано, что биохимические свойства СЧмоно-метилированных аналогов Spm и Spd зависят от положения метальной группы. Перемещение последней кардинально сказывается на взаимодействии аналогов с ферментами метаболизма полиаминов, что позволило получить метаболически устойчивое производное Spd - y-MeSpd или, наоборот - индуцировать катаболическую нестабильность (P-MeSpd). Это открывает спектр новых возможностей для исследования клеточных функций Spm и Spd, которые легко взаимопревращаются и частично взаимозаменяемы. Найдено, что P-MeSpd, в отличие от подавляющего большинства аналогов'Spd и остальных С-метилированных производных Spd, слабо индуцирует биосинтез регуляторного белка антизима, что делает P-MeSpd уникальным инструментом исследования важнейших для клетки антизим-зависимых путей поддержания гомеостаза полиаминов.

3. При помощи катаболически устойчивого a-MeSpd впервые удалось обратить последствия супериндукции спермин/спермидин-У'-ацетилтрансферазы (SSAT) in vitro и in vivo и предотвратить развитие острого панкреатита, вызываемого активацией катаболизма полиаминов у SSAT-трансгенных крыс.

4. Введение метальной группы в молекулы Spm и Spd приводит к возникновению хиральных центров, что открывает возможность осуществлять регуляцию . биохимических свойств таких аналогов полиаминов не только посредством перемещения метальной группы, но и на более тонком уровне, изменяя конфигурацию хирального центра. С этой целью, были разработаны удобные методы синтеза и получены не описанные ранее (R)- и (5)-изомеры a-MeSpd и a-MeSpm, (R,R)-, (S,S)- и (R,S)-диастереомеры a,a'-Me2Spm, а также (R)- и (¿^-изомеры A^-Ac-a-MeSpd.

5. Впервые показано, что ферменты метаболизма полиаминов - сперминоксидаза, дезоксигипузинсинтаза и ацетилполиаминооксидаза, природные субстраты которых ахиральны, обладают скрытой стереоспецифичностью. Найден оригинальный способ регулирования стереоспецифичности ацетилполиаминооксидазы. Установлено, что система активного транспорта полиаминов по-разному узнает стереоизомеры a-метилированных полиаминов в качестве Spm и Spd. Способность изомеров a-MeSpd и диастереомеров a,a'-Me2Spm по-разному индуцировать +1 сдвиг рамки- считывания мРНК антизима, приводящий к биосинтезу активного белка, а также продуктивный сплайсинг мРНК SSAT открывают новые возможности воздействия на ключевые

Г » \ ' I * I регуляторные механизмы, ответственные за поддержание гомеостаза полиаминов в клетке.

I llf

6. Предложен новый подход к созданию зарядодефицитных аналогов Spm, состоящий В'< ¡ сокращении расстояния между аминогруппами до двух метиленовых звеньев, и син

• • М'1 тезированы неизвестные ранее 1,12-диамино-3,6,9-триазадодекан (SpmTrien) и его • j i ( биохимически-значимые производные. Наличие триэтилентетраминового фрагмента делает SpmTrien эффективным хелатором ионов Си2+, что позволяет регулировать конденсированное состояние ДНК, вызываемое SpmTrien, не только варьируя рН, но и. при помощи ионов Си2+, что не характерно ни для одного из известных аналогов Spm.

7. На основании анализа взаимодействия SpmTrien и триэтилентетрамина (Trien) с ферментами- катаболизма полиамИнов и эффектов, ,вызываемых этими аналогами в культуре клеток, показано, что SpmTrien способен, выполнять многие клеточные функции Spm, тогда как Trien, изостерный Spd, не является функционально активным миметиком Spd. Установлено, что концентрация эффективно хелатирующего ионы Си2+

SpmTrien в клетках оказывается почти в 10 раз выше, чем Trien, и что SpmTrien частично метаболизирует в клетке до Trien. Последний, благодаря образованию прочных комплексов с ионам

Си, используется для лечения болезни Вильсона.

8. Предложен способ превращения 1-аминоокси-З-аминопропана, специфического ингибитора орнитиндекарбоксилазы (скорость-определяющий фермент биосинтеза полиаминов), в 1-гуанидиноокси-З-аминопропан GAPA — активно-транспортируемый ингибитор/проингибитор этого фермента. Показано, что GAPA эффективно ингибирует размножение Leishmania donovani, в том числе и формы, резистентные к широко используемым в практической терапии лейшманиоза сурьмасодержащим препаратам.

9. Для получения биологически-активного GAPA и других функционально-замещенных алкоксигуанидинов с выходом, близким к количественному, предложен новый общий способ превращения О-замещенных гидроксиламинов в ранее малодоступные алкоксигуанидины.

Заключение

В ходе выполнения настоящей работы был осуществлен дизайн и синтез новых химических регуляторов метаболизма полиаминов, которые показали себя ценными инструментами исследований in vitro и in vivo. С их помощью были получены оригинальные и значимые для биохимии и молекулярной биологии полиаминов результаты. Созданные нами подходы и алгоритмы дают определенный импульс развитию области и формируют хороший плацдарм для дальнейших плодотворных научных интервенций.

Библиография Диссертация по биологии, доктора химических наук, Хомутов, Алексей Радиевич, Москва

1. Cohen S.S. 1998. A guide to thepolyamines. N.Y.: Oxford Univers. Press, pp.1-565.

2. Pegg A.E., Casero R.A., Jr. "Current status of the polyamine research field". In: Polyamines: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. (A.E.Pegg & R.A.Casero, Eds.) vol. 720, Ch.l, pp. 3-35. Springer Science+Business Media, LLC (2011).

3. Wallace H.M. "Targeting polyamine metabolism: a viable therapeutic/preventative solution•.-»П-tfor cancer ?" ExpertOpin.Pharmacother., 8,2109-2116 (2007).

4. Seiler N., Raul F. "Polyamines and apoptosis". Cell.Mol.Med., 9, 623-642 (2005).

5. Matthews H.R. "Polyamines, chromatin structure and transcription". BioEssays, 15, 561-5671993).

6. На H.C., Sirisoma N.S., Kuppusamy P., Zweier J.L., Woster P.M., Casero R.A. Jr. "The natural polyamine spermine functions directly as' a free radical scavenger". Proc.Natl. Acad.Sci.USA, 95,11140-11143 (1998).

7. На H.C., Yager J.D., Woster P.A., Casero R.A. Jr. "Structural specificity of polyamines and polyamine analogs in the protection of DNA from strand breaks induced by reactive oxygen species". Biochem.Biophys.Res.Commun., 244,298-303 (1998).

8. Rom E., Kahana C. "Polyamines regulate the expression of ornithine decarboxylase anti-zyme in vitro by inducing ribosomal frame-shifting". Proc.NatLAcad.Sci.USA, 91, 3959-39631994).

9. Kurian L., Palanimurugan R., Godderz D., Dohmen R.J. "Polyamine sensing by nascent ornithine decarboxylase antizyme stimulates decoding of its mRNA". Nature, All, 490-494 (2011).

10. Hayashi S., Murakami Y., Matsufuji S. "Ornithine decarboxylase antizyme: a novel type of regulatory protein". Trends BiochenuSci., 21, 27-30 (1996).

11. Bakhanashvili M., Novitsky E., Levy I., Rahav G. "The fidelity of DNA synthesis by human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase increases in the presence of plyamines". FEES Lett., 579, 143 5-1440 (2005).i t<

12. Salvi M., Toninello A. "Effects of polyamines on mitochondrial Ca2+ transport". Biochinu BiophysActa., 1661,113-124 (2004).

13. Berger M.L., Noe Ch.R. "Polyamine regulation of the NMDA receptor complex as a target ini drug development". Curr.TopicsMed.Chem., 3, 51-64 (2002).

14. Nichols C.G., Lopatin A.N. "Inward rectifier potassium channels". Annu.Rev.Physiol., 59, 171-191 (1997).•VI

15. Park M.H. "The post-translational synthesis of a polyamine-derived amino acid, hypusine, in the eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A)". J.Biochem,(Tokyo), 139, 161-169 (2006).

16. Heby O., Persson L., Rentala M. "Targeting the polyamine biosynthetic enzymes: a promii <sing approach to therapy of African sleeping sickness, Chagas' disease and leishmaniasis". Amino Acids, 33, 359-366 (2007).nn-v

17. Rash L.D., Hodgson W.C. "Pharmacology and biochemistry of spider venoms". Toxicon., 40,i •225.254 (2002).

18. Cohen S.S. 1998. A guide to the polyamines. N.Y.: Oxford University Press, pp. 44-52.i «"«pi

19. Lentini A., Mattioli P., Provenzano B., Abbruzzese A., Caraglia M., Beninati S. "Role of the11

20. FAD-dependent polyamine oxidase in the selective formation of NlJ^-bis-(gamma-glutamyl)spermidine protein cross-links". BiochenuSoc.Trans., 35, 396-400 (2007).

21. Kahana C. "Antizyme and antizyme inhibitor, a regulatory tango". Cell.Mol.Life Sci., 66, 2479-2488 (2009).

22. Seiler N. "Thirty years of polyamine-related approaches to cancer therapy. Retrospect and• \,i pprospect. Part 1. Selective enzyme inhibitors". Curr.Drug Targets., 4, 537-564 (2003).1. Ml »

23. Wallace H.M., Fraser A.V., Hughes A. "A perspective of polyamine metabolism". BiochenuJ., 376,1-14 (2003).llli'lfpV

24. Wallace H.M., Fraser A.V. "Inhibitors of polyamine metabolism: Review article". Amino Acids, 26, 353-365 (2004).

25. Casero R.A., Woster P.M. "Terminally alkylated polyamine analogues as chemotherapeu-tic1. V;- ri Vagents". J.Med.Chenu, 44, 1-26 (2001).

26. Seiler N. "Thirty years of polyamine-related approaches to cancer therapy. Retrospect and prospect. Part 2. Structural analogues and derivatives".Curr.Drug Targets., 4, 565-585 (2003).

27. Casero R.A., Woster P.M. "Recent advances in the development of polyamine analogues as antitumor agents". J.Med.Chenu, 52,4551-4573 (2009).

28. Casero R.A., Marton L.J. "Targeting polyamine metabolism and function in cancer and other- »r^ Ihyperproliferative diseases". Nat.Rev.Drug Discov., 6, 373-390 (2007).•I .»c ' '

29. Frydman B., Valasinas A. Polyamine-based chemotherapy of cancer. Exp.Opin.Ther. Patents, 9, 1055-1068 (1999).

30. Janne J., Alhonen L., Pietila M., Keinanen T.A. "Genetic approaches to the cellular functionstoiof polyamines in mammals". Eur.J.Biochenu, 271, 877-894 (2004).t« •

31. Alhonen L., Parkkinen J.J., Keinanen T., Sinervirta R., Herzig K.H., Janne J. "Activation of polyamine catabolism in transgenic rats induces acute pancreatitis". Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 97, 8290-8295 (2000).

32. Ervin B.G., Persson L., Pegg, A.E. "Differential inhibition of histone and polyamine acetylases by multisubstrate analogues". Biochemistry, 23,4250-4255 (1984).

33. Hegde S.S., Chandler J., Vetting M.W., Yu M., Blanchard J.B. "Mechanistic and structural analysis of human spermidine/spermine Nl -acetyltransferase". Biochemistry, 46, 7187-7195 (2007).

34. Chattopadhyay M.K., Tabor C.W., Tabor H. "Polyamines are not required for aerobic growth of Escherichia coli: preparation of a strain with deletions in all of the genes for polyamine biosynthesis". J.Bacteriol., 191 5549-5552 (2009).

35. Khomutov A.R., Shvetsov A.S., Vepsalainen J.J., Kritzyn A.M. "Novel acid-free cleavage of .V-(2-hydroxyarylidene) protected amines". Tetrahedron Lett., 42,2887-2889 (2001).

36. Bergeron R.J., Garlich J.R., Stolowich N.J. "Reagents for the stepwise functionalization of spermidine, homospermidine, and Mv-(3-aminopropyl)amine". J.Org.Chem., 49, 2997-30011984).

37. Favre-Reguillon A., Segat-Dioury F., Nait-Bouda L., Cosma C., Siaugue J.-M., Foos J., Guy A. "A highly chemoselective protection and activation of primary amines in poly-amine". Syn.Lett., 6, 868-870 (2000).

38. Tice C.M., Ganem B. "The chemistry of' naturally occurring polyamines. 6. Efficient syntheses of iV1- and vV8-acetylspermidine". J.Org.Chem., 48,2106-2108 (1983).

39. Nagarajan S., Ganem B. "Chemistry of naturally occurring polyamines. 9. Synthesis of spermidine and spermine photoaffinity. labeling reagents". J.Org.Chem., 50, 5735-57371985).

40. Ramiandrasoa F., Milat M. "A new regioselective synthesis of Nl- and A^-monoacylated spermidines". Tetrahedron Lett., 30,1365-1368 (1989).

41. Jasys V.J., Kelbaugh P.R., Nason D.M., Phillips D., Saccomano N.A., Stroh J.G., Volk-mann R.A. "The total synthesis of argiotoxins 636, 659 and 673". Tetrahedron Lett., 29, 6223-6226 (1988).

42. Brand G., Hosseini M.W., Ruppert R. "Cyclopolyamines: Synthesis of cyclospermidines and cyclospermines, analogues of spermidine and spermine". Tetrahedron Lett., 35, 8609-8612 (1994).

43. Krakowiak K.E., Bradshaw J.S. "Thermal removal of Boc-protecting groups during prepa•M ,»V» *ration of open-chain polyamines". Synth.Commun., 2JL, 3999-4004 (1996).cp.Cht"

44. Iwata M., Kuzuhara H. "Efficient synthetic method for differentially protected naturally1. Milesoccurring acyclic polyamines". Bull.Chem.Pharm.Jpn., 62,1102-1106 (1989).

45. Bergeron R.J., Weimar W.R., Wu Q., Feng Y., McManis J.S. "Polyamine analogue regulation of NMDA MK-801 binding: a structure-activity study". J.Med.Chem., 39, 5257-52661.m.V1996).t<v,v;'

46. Bergeron R.J., Feng Y., Weimar W.R., McManis J.S., Dimova H., Porter C.W., Raisler B., Phanstiel O. "A comparison of structure-activity relationships between spermidine andspermine analogue antineoplastics". J.Med.Chem., 40,1475-1494 (1997).i ! |l

47. Saab N.H., West E.E., Bieszk N.C., Preuss C.V., Mank A.R., Casero R.A.,Jr., Woster P.M.vll'

48. Synthesis and evaluation of unsymmetrically substituted polyamine analogues as modulators of human spermidine/spermine-//1-acetyltransferase (SSAT) and as potential antitumor agents". J.Med.Chem., 36, 2998-3004 (1993).

49. Thoo Lin P.K., Kuksa V.A., Maguire N.M. "The synthesis of oxa-analogues and homologuesof naturally occurring polyamines" Synthesis, 859-866 (1998).216

50. Kuksa V.A., Pavlov V.A., Thoo Lin P.K. "Novel oxa-spermine homologues: Synthesis and cytotoxic properties." Bioorg.Med.Chem., 10, 691-697'(2'002).59. Ns-2

51. Григоренко H.A., Вепсалайнен Й., Ярвинен А., Кейнанен Т.А., Алхонен JL, Янне Ю., Хомутов А.Р. "Новый синтез а-мелил- и а,а'-диметилспермина". Биоорган.химия, 31, 200-205 (2005).•

52. Jarvinen A.J., Cerrada-Gimenez М., Grigorenko N.A., Khomutov A.R., Vepsalainen J.J.,ч чпкч .

53. Hyvonen M.T., KeinanenT.A., Khomutov M., Simonian A., Weisell J., Kochetkov S.N.,h'

54. Vepsalainen J., Alhonen L., Khomutov A.R. "The use of novel C-methylated spermidinei7 fi/c

55. Kaur N., Delcros J-G., Martin В., Phanstiel О. IV "Synthesis and biological evaluation of dihydromotuporamine derivatives in cells containing active polyamine transporters". J.Med.Chenu, 48, 3832-3839 (2005).n^c o:

56. Wang C., Delcros J-G., Cannon L., Konate F., Carias H., Biggerstaff J., Gardner R.A., Otto1. MietpJ

57. Phanstiel О. IV "Defining the molecular requirements for the selective delivery of polyamine conjugates into cells containing active polyamine transporters". J.Med.Chem., 46, 5129-5138 (2003).

58. Edwards M.L., Prakash N.J., Stemerick D.M., Sunkara S.P., Bitonti A.J., Davis G.F., Dumont J.A., Bey P. "Polyamine analogs with antitumor activity". J. Med.Chem., 33 , 1369-1375 (1990).

59. Carboni В., Benalil A., Vaulter M. "Aliphatic amino azides as key building blocks for efficient polyamine syntheses". J.Org.Chenu, 58, 3736-3741 (1993).

60. Bergeron R.J., Muller R., Bussenius J., McManis J.S., Merriman R.L., Smith R.E., Yao H., Weimar W.R. "Synthesis and evaluation of hydroxylated polyamine analogues as antiproliferatives". J.Med.Chenu, 43, 224-235 (2000).

61. Casara P., Danzin C., Metcalf В., Jung M. "Stereospecific synthesis of (2/?,5i?)-hept-6-yne-2,5-diamine: a potent and selective enzyme-activated irreversible inhibitor of ornithinedecarboxylase (ODC)". J.ChetmSoc2201-2207 (1985).1. Mr

62. Lakanen J.R., Coward J.K., Pegg A.E. "alpha-Methyl polyamines: metabolically stableи I'ltn1spermidine and spermine mimics capable of supporting growth in cells depleted of polyamines". J.Med.Chenu, 35, 724-734 (1992).• f If),

63. Israel M., Zoll E.C., Muhammad N., Modest E.J. "Synthesis and antitumor evaluation-of the presumed cytotoxic metabolites of spermine and iV,7V-Z)M--(3-aminopropyl)nonane-1,9-diamine". J.Med.Chem16, 1-5 (1973).

64. Edwards M.L., Stemerick D.M., Bitonti A.J., Dumont J.A., McCann P.P., Bey P., Sjoerdsma- i-nr'1

65. A. "Antimalarial polyamine analogs". J.Med.Chenu, 34, 569-574 (1991).

66. Edwards M.L., Prakash N.J., Stemerick D.M., Sunkara S.P., Bitonti A.J., Davis G.F., Dumont•« ■ u

67. J.A., Bey P. "Polyamine analogs with antitumor activity". J.Med.Che т. 33 , 1369-1375 (1990).

68. Levchine I., Pajan P., Borloo M., Bollaert W., Haemers A. "An efficient synthesis ofselectively fimctionalized spermidine". Synthesis, J, 37-39 (1994).t ~ %

69. Хомутов A.P., Хомутов P.M. "Синтез аминооксианалогов путресцина и сперми-дина".v i

70. Биоорган.хшшя, 15, 698-703 (1989). .

71. Хомутов P.M., Денисова Г.Ф., Хомутов А.Р., Белостоцкая К.М., Шлосман Р.Б., Артамонова Е.Ю. "Аминоксипропиламин эффективный ингибитор орнитиндекарбоксилазы in vitro и in vivo". Биоорган.хшшя, П, 1574-1576 (1985).

72. Milovic V., Turchanowa L., Khomutov A.R., Khomutov R.M., Caspary W.F., Stein J. "Hydroxylamine-containing inhibitors of polyamine biosynthesis and impairment of colonpcancer cell growth". BiochenuPharmacology, 6!, 199-206 (2001).v< '

73. Hyvonen T., Khomutov A.R., Khomutov R.M., LapinjokLS., Eloranta T.O. "Uptake of 3h"-fin',labelled l-aminooxy-3-aminopropane by baby hamster kidney cells". J.Biochem.(Tokyo),r !107, 817-820 (1990).

74. Bok Lee Y., Folk J.E. "Branched-chain and unsaturated 1,7-diaminoheptane derivatives asi ■deoxyhypusine synthase inhibitors". Bioorg.Med.Chem., 6, 253-270 (1998).

75. Nagarajan S., Ganem B. "Chemistry of naturally occurring polyamines. 10. Nonmetabo-lizable derivatives of spermine and spermidine". J.Org.Chem5i, 4856-4861 (1986).

76. Nagarajan S., Ganem B. "Chemistry of naturally occurring polyamines. 11. Unsaturated spermidine and spermine derivatives". J.Org.Chem52, 5044-5046 (1987).

77. Edwards M.L., Snyder R.D., Stemerick D.M. "Synthesis and DNA-binding properties of polyamine analogs". J.Med.Chem., 34, 2414-2420 (1991).

78. Golding B.T., O'Sullivan M.C., Smith L.L. "Convenient routes to alkyl-substituted polyr'"amines". Tetrahedron Lett., 29, 6651-6654 (1988).

79. Bergeron R.J., McManis J.S., Weimar W.R., Schreir K.M., Gao F., Wu Q., Ortiz-Ocasio J., Vinson J.R.T., Luchetta G.R., Porter C. "The role of charge in polyamine analog recognition". J.Med.Chenu, 38,2278-2285 (1995).

80. Jasys V.J., Kelbaugh P.R., Nason D.M., Phillips D., Rosnack K.J., Saccomano N.A., Stroh'

81. J.G., Volkmann R.A. "Isolation, structure elucidation, and synthesis of novel hydroxyl-amine-containing polyamines from the venom, of the Agelenopsis aperta spider". J.Amer.ChenuSoc., U2, 6696-6704 (1990).

82. Verlinden B.K., Niemand J., Snyman J., Sharma S.K., Beattie R.J., Woster P.M., Birkholtz Lr/>-. .

83. M. "Discovery of noel alkylated (bis)urea and (bis(thiourea) polyamine analogues with potent antimalarial activities". J.Med.Chenu, 54, 6624-6623 (2011).

84. Hughes D.L. "The Mitsunobu Reaction" In: Organic Reactions; Wiley: New York. 1992. V. 42. P. 335.

85. Edwards M.L., Stemerick D.M., McCarthy J.R. "Stereospecific synthesis of secondary amines by the Mitsunobu reaction". Tetrahedron Lett., 31, 3417-3420 (1990).n

86. Kan T., Fukuyama T. "Ns strategies: a highly versatile synthetic method for amines" ChenuCommun., 4, 353-359 (2004).

87. Olsen C.A., Witt M., Jaroszewski J.W., Franzyk H.' "Solid-phase synthesis of rigid acyl-polyamines using temporary N-4,4'-dimethoxytrityl protection in the presence of trityl linkers" J.Org.Chem., 69, 6149-6152 (2004).

88. Barlos K., Gatos D., Schafer W. "Synthesis of prothymosin a (ProTa) a protein consis-ting of 109 amino acid residues" Angew.Chem.Int.Edit., 30, 590-593 (1991).

89. Kan T., Kobayashi H., Fukuyama T. "Highly versatile synthesis of polyamines by Ns-strategy"So'on a novel trityl chloride resin" Syn.Lett., 8,1338-1340 (2002).1 IM'M1

90. Nash I.A., Bycroft B.W., Chan W.C. "Dde A selective primary amine protecting group: A facile solid phase synthetic approach to polyamine conjugates" Tetrahedron Lett., 37, 26252628 (1996).vi. 5<)(<

91. Chhabra S.R., Khan A.N., Bycroft B.W. "Solid-phase synthesis of symmetrical and•Л 111unsymmetrical polyamine analogues of philanthotoxins using a Dde-linker" Tetrahedron Lett.,4X, 1095-1098(2000).4l\(

92. Chhabra S.R., Khan A.N., Bycroft B.W. "Solid-phase synthesis of polyamines using a Ddelinker: philanthotoxin-4.3.3 via an on-resin Mitsunobu reaction" Tetrahedron Lett., 41, 1099-1102(2000).

93. Byk G., Frederic M., Scherman D. "One pot synthesis of unsymmetrically fimctionalized• ЩІ- ■polyamines by a solid phase strategy starting from their symmetrical polyamine counterparts". Tetrahedron Lett, 38, 3219-3221 (1997).

94. Manov N., Bienz S. "A new approach in the solid-phase synthesis of polyamine deriva-tives: construction of polyamine backbones from the center" Tetrahedron, 57, 7893-7898 (2001)

95. Manov N., Tzouros M., Chesnov S., Bigler L., Bienz S. "Solid-phase synthesis of poly-amine spider toxins and correlation with the natural products by HPLC-MS/MS" Helv.Chim.Acta, 85, 2827-2846 (2002).

96. Picard S., Le Roch M., Renault J., Uriac P. "Parallel supported synthesis of polyamine-imidazole conjugates" Org.Lett., 6,4711-4714 (2004). .

97. Paikoff S.J., Wilson T.E., Cho C.Y., Schultz P.G. "The solid phase synthesis of JV-alkyl-carbamate oligomers" Tetrahedron Lett., 37, 5653-5656 (1996).

98. Bi X., Lopez C., Bacchi C.J., Rattendi D., Woster P.M. " Novel alkylpolyaminoguanidines and alkylpolyaminobiguanides with potent antitrypanosomal activity". Bioorg. Med.Lett.Chem., 16,3229-3232 (2006).

99. Ostresh J.M., Schoner C.C., Hamashin V.T., Nefzi A., Meyer J.P., Houghten R.A. "Solidihc

100. Phase Synthesis of Trisubstituted Bicyclic Guanidines via Cyclization of Reduced vV-Acylated Dipeptides"/.Org.Chem., 63, 8622-8623 (1998).t

101. Dubowchik G.M., Firestone R.A. "A lipophilic polyamino-bolaamphiphile designed to1. V i> r<• dissipate pH gradients across a bilayer membrane: Synthesis and proton transport" Tetrahedron Lett., 37, 6465-6468 (1996).1. N'

102. Yu Y., Ostresh J.M., Houghten R.A. Biopolymers, 71, 307-311 (2003).

103. Schaffert D., Badgujar N., Wagner E. "Novel Fmoc-polyamino acids for solid-phase synthesis of defined polyamidoamines". Org.Lett., 13, 1586-1589 (2011).

104. Hakkinen M.R., Hyvonen M.T., Auriola S., Casero R.A. Jr, Vepsalainen J., Khomutov A.R., Alhonen L., Keinanen T.A. "Metabolism of iV-alkylated spermine analogues by polyamine and spermine oxidases". Amino Acids, 38, 369-381 (2010).

105. Ha H.C., Woster P.M., Yager J.D., Casero Jr, R.A. "The role of polyamine catabolism in polyamine analogue-induced programmed cell death". Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 94, 1155711562 (1997).• I 222-I? it ''■»•iv)

106. Nagarajan S., Ganem B., Pegg A.E. "Studies of non-metabolizable polyamines that support growth of SV-3T3 cells depleted of natural polyamines by exposure to alpha-difluoro-methylornithine". BiochenuJ., 254, 373-378 (1988).l ir" I

107. Ask A., Persson L., Seiler N., Heby O. "Antileukemic effects of non-metabolizable• i,derivatives of spermidine and spermine". Cancer Lett., 69, 33-38 (1993).• f 'a

108. Varnado B.L., Voci L.M., Meyer L.M., Coward J.K. "Circular dichroism and NMR studies of metabolically stable alpha-methylpolyamines: spectral comparison with naturally occur-ring1. N ,polyamines. Bioorg.Cliem., 28, 395-408 (2000).••tor

109. Nayvelt I., Hyvonen M.T., Alhonen L., Pandya I., Thomas T., Khomutov A.R., Vepsalainen J., Patel R., Keinanen T.A., Thomas T.J. "DNA condensation by chiral a-methylated polyamine analogues and protection of cellular DNA from oxidative damage".' J V

110. Biomacromolecules, JJ, 97-105 (2010).

111. Renault J., Lebranchu M., Anne Lecat A., Uriac P. ''Solid-phase combinatorial synthesis of polyamine derivatives using aminoalcohol building blocks". Tetrahedron Lett., 42, 6655-6658(2001). ,

112. Григоренко H.A., Вепсалайнен Й., Ярвинен А., Кейнанен Т.А., Алхонен JI., Янне Ю., Крицьш A.M., Хомутов А.Р. "Новый синтез а-мелилспермидина". Биоорган.химия, 30, 441-445 (2004).

113. Григоренко Н.А., Вепсалайнен Й., Ярвинен А., Кейнанен Т.А., Алхонен Л., Янне Ю., Хомутов А.Р. "Новый синтез а-мелил- и а,а'-диметилспермина". Биоорган.химия, 31, 200-205 (2005).

114. Rasanen T.L., Alhonen L., Sinervirta R., Keinanen Т., Herzig K-H., Suppola S., Khomutov■ pi.

115. A.R., Vepsalainen J., Janne J. "A polyamine analogue prevents acute pancreatitis and restores early liver regeneration in transgenic rats with activated polyamine catabolism". J.BioLChem., 277, 39867-39872 (2002).

116. Halangk W. "Trypsin activity is not involved in premature, intrapancreatic trypsinogenjactivation". Am. J.Physiol. Gastrointest.Liver Physiol., 282. 367-374 (2002).

117. Hyvonen M.T., Herzig K-H., Sinervirta R., Albrecht E., Nordback I., Sand J., Keinanen T.A.,ч »

118. Alhonen L., Rasanen T.L., Sinervirta R., Parkkinen J.J., Korhonen V.P., Pietila M., Janne J. "Polyamines are required for the initiation of rat liver regeneration". Biochem.J., 362. 149-153(2002).

119. Bergeron R.J., Muller R., Huang G., McManis J.S., Algee S.E., Yao H., Weimar W.R.,•. I

120. Wiegand J. "Synthesis and evaluation of hydroxylated polyamine analogues as antiproliferatives". J.Med.Chem., 44,2451-2459 (2001).

121. Jauristi E.; Escalante J.; Lamatach B.; Seebach D. "Enantioselective synthesis of beta-amino acids. 2. Preparation of the like stereoisomers of 2-methyl- and 2-benzyl-3-amino-butanoic acid. J.Org.Chenu, 67,2396-2398 (1992).

122. Estermann H., Seebach D. "Diastereoselektive alkylierung von 3-aminobutansaure in der 2-stellung. Helv.ChinuActa, 71,1824-1839 (1988).

123. Furukawa M., Okawara T., Terawaki Y. "Studies on application of amino acid as medici-nal agent. II. Reaction of amino acid ester with difunctional Grignard reagent". Chem.Pharm.Bull., 25, 1319-1325 (1977).

124. Davies S.G., Ichihara O. "Asymmetric synthesis of R-(i-ammo butanoic acid and S-p-ty1. Mp.rosine: Homochiral lithium amide equivalents for Michael additions to a,p-unsaturated esters. Tetrahedron Asymnu, 2,183-186 (1991).

125. Amoroso R., Cardillo G., Sabatino P., Tomasini C., Trere A. "Lewis acid-promoted 1,4-addition to chiral imide derivatives in the synthesis of beta-amino acids". J.Org.Chem, 58, 5615-5619(1993).11 n

126. Mataunaga H., Sakamaki T., Nagaoka H., Yamada Y. "Enantioselective synthesis of (R)- and (iS)-4-(methoxycarbonyl)-methyl.-2-azetidinones from £)-glyceraldehyde acetonide". Tetrahedron Lett. 24, 3009-3012 (1983).

127. Liwschitz Y., Singeman A. "An asymmetric synthesis of jV-benzyl-D- aspartic acid". J.Chem.Soc.(C), 1200-1202 (1966).

128. Gedey S., Liljeblad A., Fulop F., Kanerva L.T. "Sequential resolution of ethyl 3-aminobutyrate with carboxylic acid esters by Candida antarctica B lipase" Tetrahedron: Asymmetry, 10^2573-2581,(1999).

129. Wang, Y.-F., Izawa T., Kobayashi S., Ohno M. "Stereocontrolled synthesis of (+)-negamy-cin from an acyclic homoallylamine by 1,3-asymmetric induction". JjS.rn.Chem.Soc. 104. 64656466 (1982).

130. Kozikowski A.P., Chen Y.-Y. "Intramolecular nitrile oxide cycloaddition (INOC) reactions in the indole series. 2. Total synthesis of racemic and optically active paliclavine and 5-epi-paliclavine". J.Org.Chem. 46, 5248-5250 (1981).

131. Yamamoto Y., Komatsu T., Maruyama K. "Enantiodivergent 1,2- and 1,3-asymmetric1. IT'induction in a- and 13-alkoxyimines via metal tuning and stereodifferentiation". /.Chem.Soc.Chem.Commun. 814-815 (1985).

132. Mukaiyama T. "In Organic Reactions-, Wiley: New York", 28, Chapter 3. (1982).

133. Wanner K.T., Hoefher G. "Chelat- und nicht-chelat-kontrollierte reduktionen von P-amido-ketonen: Synthese nicht-racemischer 1,3-aminoalkohole mit pyrrolidinstruktur". Tetrahedron, 47, 1895-1910 (1991).

134. Tramontini M. "Stereoselective synthesis of diastereomeric amino alcohols from chiral aminocarbonyl compounds by reduction or by addition of organometallic reagents". Synthesis. 605-644 (1982).n',*

135. Kokotos G. "A Convenient one-pot conversion of iV-protected amino acids and peptides intoi *»alcohols". Synthesis, 299-301 (1990).

136. Kulkarni Y.S. "Serine derivatives in organic chemistry" Aldrichimica Acta, 32, 18-27 (1999).

137. Jefford C.W., Wang J. "An enantiospecific synthesis of P-amino acids". Tetrahedron Lett.i34, 1111-1114(1993).

138. Holtta, E. "Oxidation of spermidine and spermine in rat liver: purification and properties of polyamine oxidase". Biochemistry, 16, 91-100 (1977).

139. Metzler C.M., Cahill A., Metzler D.E. "Equilibriums and absorption spectra of SchifF bases". JAm.Chem.Soc., 102, 6075-6082 (1980).

140. Wang Y., Devereux W., Woster P.M., Stewart T.M., Hacker A., Casero R.A. Jr. "Cloning andt'V? "characterization of a human polyamine oxidase that is inducible by polyamine analogue exposure". Cancer Res., 61, 5370-5373 (2001).1. Ultill

141. Murray-Stewart T., Wang Y., Devereux W., Casero R.A. "Cloning and characterization of multiple human polyamine oxidase splice variants that code for isoenzymes with different biochemical characteristics". BiochenuJ., 368, 673-677 (2002).

142. Vujcic S., Diegelman P., Bacchi C.J., Kramer D.L., Porter C.W. "Identification and1 \ scharacterization of a novel flavin-containing spermine oxidase of mammalian cell origin". BiochenuJ., 367, 665-675 (2002).

143. Cervelli M., Polticelli F., Federico R., Mariottini P. "Heterologous expression and characterization of mouse spermine oxidase". J.BioLChem., 278. 5271-5276 (2003).* t

144. Park J.H., Wolff E.C., Folk J.E., Park M.H. "Reversal of the deoxyhypusine synthesis1»reaction. Generation of spermidine or homospermidine from deoxyhypusine by deoxyhypusine synthase''. J.Biol.Chem., 278, 32683-32691 (2003).

145. Kahana C. "Regulation of cellular polyamine levels and cellular proliferation by antizyme and antizyme inhibitor". Essays Biochem., 46. 47-61 (2009).

146. Palanimurugan R., Scheel H., Hofmann K., Dohmen RJ. "Polyamines regulate their synthesis by inducing expression and blocking degradation of ODC antizyme". EMBO.J., 23, 48574867 (2004).

147. Mitchell J.L., Leyser A., Holtorff M.S., Bates J.S., Frydman B., Valasinas A.L., Reddy V.K., Marton L.J. "Antizyme induction by polyamine analogues as a factor of cell growth1. W ,inhibition". Biochem J., 366, 663-671 (2002).• *:

148. Bewley M.C, Graziano V., Jiang J., Matz E., Studier F.W., Pegg A.E., Coleman C.S.,1. Ofy

149. Flanagan J.M. "Structures of wild-type and mutant human spermidine/spermine Nx-acetyl-transferase, a potential therapeutic drug target". Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 103. 2063-2068 (2006).i f r « .

150. Montemayor E.J., Hoffman D.W. "The crystal structure of spermidine/spermine Nl-acetyl-transferase in complex with spermine provides insights into substrate binding and catalysis". Biochemistry, 47,9145-9153 (2008). 'чіт)"

151. Casero R.A., Pegg A.E. Polyamine catabolism and disease.Biochem.J., 421, 323-338 (2009).. « v*

152. Bergeron R.J., MeManis J.S., Weimar W.R., Schreier K.M., Gao F., Wu Q., Ortiz-Ocasio J., Luchetta G.R., Porter C.W., Vinson J.R.T. "The role of charge in polyamine analogue recognition". J.Med.Chenu 38, 2278-2285 (1995).

153. Baillon J., Mamont P.S., Wagner J., Gerhart F., Lux P. "Fluorinated analogues of spermi-dine as substrates of spermine synthase". Eur.J.Biochem. 176.237-242 (1988).

154. Хомутов A.P., Швецов A.C., Вепсалайнен Й., Крамер Д.Л., Хивонен Т., Кейнанен Т.А.,- X I

155. Элоранта Т.О., Портер К.У., Хомутов P.M. "Новые аминоокси-аналоги биогенныхіполиаминов". Биоорган.хпмия. 22, 557-559 (1996).

156. Hyvonen Т., Keinanen Т.A., Khomutov A.R., Khomutov R.M., Eloranta Т.О. "Aminooxy• м-.analogues of spermidine evidence the divergent role of the charged amino nitrogens in the cellular-physiology of spermidine". Life.Sci. 56, 349-360 (1995).

157. Eloranta Т.О., Khomutov A.R., Khomutov RIM., Hyvonen T. "Aminooxy analogues ofhii',';1spermidine as inhibitors of spermine synthase and substrates of hepatic polyamine acetylating activity". J.Biochenu(Tokyo). 108, 593-598 (1990). '

158. Lin P.K.T., Maguire N.M., Brown D.M. Synthesis of novel oxa-isosteres of spermidine and spermine. Tetrahedron.Lett. 35, 3605-3608 (1994). ,.

159. Schwarzenbach G. "Metallkomplexe mit Polyaminen IIL.Mit Triathylen-tetramin = trien". Helv.Chim.Acta. 33, 974-985 (1950).

160. Dixon H.B.F., Gibbs K., Walshe J.M. "Preparation of triethylenetetramine dihydrochloride for the treatment of Wilson's disease". Lancet. 853-854.(1972).

161. Stark P.A., Thrall B.D., Meadows G.G., Abdel-Monen M.M. "Synthesis and evaluation ofnovel spermidine derivatives as targeted cancer chemotherapeutic agents". J.Med.Chenu, 35,'!!4264-4269(1992)

162. Tabor H., Tabor C.W. "Synthesis of acetylated derivatives of polyamines" In: Methods in

163. Enzymology (Eds: H.Tabor & C.W.Tabor), 94,420-422. Academic Press, New York. 1983.1 і' '•mm

164. Doughty R.N., Baker J.R. "Regeneration of the heart in diabetes by selective copper chelation". Diabetes, 53,2501-2508 (2004).

165. Clin.Pharmacol., 50, 647-658 (2010).

166. Lu J., Gong D., Choong S.Y. , Xu H., Chan Y-K. , Chen X., Fitzpatrick S., Glyn-Jones S.,inn

167. Хомутов P.M., Завалова JT.JI., Сырку В.И., Артамонова Е.Ю., Хомутов А.Р. "Эффективный ингибитор декарбоксилазы 5-аденозилметионина". Биорган.химия, 9, 130-131 (1983).

168. Артамонова Е.Ю., Хомутов А.Р., Завалова Л.Л., Хомутов P.M. "Необратимое торможение декарбоксилазы 5-аденозилметионина аминооксианалогами продукта ферментативной реакции". Биоорган.химия, 12,206-212 (1986).

169. Хомутов P.M., Денисова Г.Ф., Хомутов А.Р., Белостоцкая К.М., Шлосман Р.Б.,1. J 'it j

170. Артамонова Е.Ю. "Аминоксипропиламин эффективный ингибитор орнитин декарбоксилазы in vitro и in vivo". Биоорган.химия, Ц, 1574-1576 (1985).

171. Хомутов А.Р., "Ингибирование ферментов- биосинтеза полиаминов субстратопо-добными О-замещенными гидроксиламинами". Биохимия, 67, 1403-1412 (2002).•о: <

172. Kramer D.L., Khomutov R.M., Bukin Yu.V., Khomutov A.R., Porter C.W. "Cellularуcharacterization of a new irreversible inhibitor of S-adenosylmethionine decarboxylase and its- iii

173. USe in determining the relative abilities of individual polyamines to sustain growth and1 iviability of L1210 cells". BiochenuJ., 259, 325-331 (1989).

174. Antelli R., Stjernborg L., Khomutov A.R., Khomutov R.M., Persson L. "Regulation of S4 :adenosylmethionine decarboxylase in L1210 leukemia cells. Studies using an irreversible• I'ni'finhibitor of the enzyme". Eur.J.Biochenu, 196, 551-556 (1991).

175. Хомутов A.P., Джавахия В.Г., Воинова T.M., Ермолинский Б.С., Хомутов P.M. "Аминооксианалог путресцина ингибирует поликетидный путь биосинтеза природных соединений". Биоорган.химия, 15, 706-709 (1989).

176. Roblot G., Wylde R., Martin A., Parello J. "Regioselective synthesis of inhibitors of histone acetyl transferase covalently linking spermidine to the s-terminus of coenzyme a and fragments".Tetrahedron, 29, 6381-6398 (1993).

177. Fierke С.A., Jencks W.P. "Two functional domains of coenzyme A activate catalysis by coenzyme A transferase. Pantetheine and adenosine 3'-phosphate 5-diphosphate". J.BioLChem., 261, 7603-7606 (1986).

178. Хомутов A.P., Кейнанен T.A., Григоренко H.A., Хивонен М.Т., Умари А., Пиетила М., Серрада-Хименес М., Симонян А.Р., Хомутов М.А., Вепсалайнен Й., Алхонен Л., Янне

179. Ю. "Метилированные аналоги биогенных полиаминов спермина и спремидина какинструмент исследования клеточных функций полиаминов и ферментов их метаболизма". Молекулярная биология, 43,274-285 (2009).

180. Wang Y., Murray-Stewart Т., Devereux W., Hacker A., Frydman В., Woster P.M., Casero, R.A. "Properties of purified recombinant human polyamine oxidase PAOhl/SMO". Biochem.Biophys.Res. Commun., 304, 605-611 (2003).-i «с

181. Rosenthal G.A., Downum K.R., Mattler J.E. "Radiochemical synthesis of L-guanidine-oxy-l4C.canavanine". AnaLBiochem., 133, 277-282 (1983).

182. M. Frankel, Y. Knobler and G. Zvilichovsky. "Synthesis of D,L-canavanine". J.ClienuSoc., 3127-3130(1963).

183. Feichtinger K., Christoph Zapf C., Sings H.L., Goodman M. "Diprotected triflylguani-dines:мм

184. A new class of guanidinylation reagents". J.Org.Chem., 63, 3804-3805 (1998).

185. Croft S.L., Sundar S., Fairlamb A.H. "Drug resistance in leishmaniasis". Clin.Microbiol. Rev., 19, 111-126(2006).

186. Burri C.C., Brun R. "Eflornithine for the treatment of human african trypanosomiassis". Parasitol.Res. 90,49-52 (2003). , .

187. Persson L., Khomutov A.R., Khomutov R.M. "Feedback regulation of S-adenosylmethio-nine decarboxylase synthesis". BiocheiruJ., 257, 929-931 (1989).

188. Stanek J., Frei J., Mett H., Schneider P., Regenass U. "2-substituted 3-(aminooxy)propan-amines as inhibitors of ornithine decarboxylase: synthesis and biological activity". J.Med.Chem„ 35, 1339-1344 (1992).

189. Singh S., Mukherjee A., Khomutov A.R., Persson L., Heby O., Chatteijee M., Madhubala R. "Antileishmanial effect of 3-aminooxy-l-aminopropane is due to polyamine depletion". Antimicrob.Agents Chemother., 51, 528-534 (2007).

190. Dufe V.T., Ingner D., Heby O., Khomutov A.R., Persson L., Al-Karadaghi S. "A structural insight into the inhibition of human and Leishmania donovani ornithine decarboxylase by 3-aminooxy-l-aminopropane". BiochenuJ., 405, 261-268 (2007).1

191. Liu W., Peterson P.E., Carter R.J., Zhou X., Langston J.A., Fisher A.J., Toney M.D. "Crystal structures of unbound and aminooxyacetate-bound Escherichia coli gamma-aminobutyrate aminotransferase". Biochemistry, 43, 10896-10905 (2004).

192. Dabir S., Dabir P., Somvanshi B. "Purification, properties and alternate substrate specificitiesiof arginase from two different sources: Vigna catjang cotyledon and buffalo liver".j1.tJ.Biol.Sci., 1,114-122 (2005).

193. Sastre M., Galea E., Feinstein D., Reis D.J., Regunathan S. "Metabolism of agmatine in macrophages: modulation by lipopolysaccharide and inhibitory cytokines". BiochenuJ., 330, 1405-1409 (1998).

194. Elderfield R.C., Claflin E.F., Mertel H.E., McCurdy O.L.,"Mitch R.T., Ver Nooy C.D., Wark

195. B.H., Wempen I.M. "Further syntheses of primaquine analogs". J.Am.ChenuSoc., 77, 48194822 (1955).

196. Титц Л.Ф., Айхер Т. "Препаративная органическая химия. Реактивы и синтезы вг,чпрактикуме по органической химии и научно-исследовательской лаборатории". М.Мир. 1999.

197. Хомутов P.M., Северин Е.С., Гнучев Н.В., Деревянко Т.Я. "Синтез некоторых О-за-мещенных гидроксиламинов". // Изв. АН СССР. Сер. хим., 1820-1823 (1967).

198. Хомутов P.M. "Синтез 0-замещенных гидроксиламинов" Журн.общ.хим., 31., 19921995 (1961).

199. Хомутов А.Р., Хомутов P.M. "Серусодержащие гидроксиламины для ингибирования ферментов и модификации нуклеиновых кислот". Биоорган.химия, 12, 1662-1674 (1986).

200. Bauer L., Suresh K.S. "£-©-(Aminooxy)alkyl.isothiuronium salts, со,со'-6w(aminooxy)al1!kanes and related compounds". J.Org.Chem., 28,1604-1608 (1963).

201. Maniatis Т., Sambrook J., Fritsch E.F. "Molecular cloning: A laboratory тапиаГ. Cold Spring Harbor; New York.: Cold Spring Harbor Lab.Press, 1989, p. 1.33-1.38, p. 1.40-1.44.

202. Marmur J. "A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms". J.MoLBiol., 3,208-216 (1961).

203. Органические растворители. Москва. Изд.Ин.Лит. 1958 г.218. van Tamelen Е.Е., Brenner J.E. "Structure of the anhydrobromonitrocamphanes". J.Am.ChenuSoc., 79, 3839-3843 (1957).

204. Lee Y.B., Park M.H., Folk J.E. "Diamine and triamine analogs and derivatives as inhibitors of deoxyhypusine synthase: synthesis and biological activity". J.Med.Chenu, 38> 3053-3061 (1995).