Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые биологически активные аналоги полиаминов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Новые биологически активные аналоги полиаминов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

Г

ГРИГОРЕНКО Николай Александрович

НОВЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ АНАЛОГИ ПОЛИАМИНОВ

03.00.03 - Молекулярная биология 02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ОБЯЗ/ " -- щ \

БЕС I г *

Москва 2005

Работа выполнена в Лаборатории химического и биологического анализа биополимеров и клеток Института молекулярной биология им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук.

Научный руководитель: кандидат химических наук А.Р. Хомутов

Официальные оппоненты: доктор химических наук A.A. Формановский, ведущий научный сотрудник Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

доктор биологических наук А.И. Глухов, заведующий Лабораторией молекулярной биологии Московского научно-исследовательского института медицинской экологии Департамента здравоохранения г.Москвы

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-химической

биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится «_»_2005 г. в_часов на заседании

диссертационного Совета Д 002.235.01 по присуждению ученой степени доктора наук в

Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта по адресу. 199911, Москва, ул.

Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН (199911,

Москва, ул. Вавилова, д. 32)

Автореферат разослан «__»_2005 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат химических наук

А.М. Крицын

1ШГ

Список использованных сокращений

ODC-орпитиндекарбоксилаза;

AdoMetDC - 5,-аденозилметиоииндекарбоксилаза;

SMO - сперминоксидаза;

SSAT - спермидин/спермип-Лг' -ацетилтрансфераза; РАО - полиаминоксидаза; AdoMet - ^-аденозилметионин;

dcAdoMet - декарбоксилированный 5-аденозилметионин;

Put - путресцин (1,4-диаминобутан);

Spd - спермидин (1,8-диамино-4-азаоктан);

Spm - спермин (1,12-диамино-4,9-диазадодекан);

aMeSpd - a-метилспермидин (1,8-диамино-5-азанонан);

aMeSpm - a-метилспермин (1,12-диамино-4,9-диазатридекан);

a,a'-Me2Spm - а,а'-бмс-метилспермин (2,13-диамино-5,10-диазатетрадекан);

Л^-AcSpm -ТУ'-ацетилспермин (N1 -ацетил-1,12-диамино-4,9-диазадодекан);

SpmTrien - сперминотриен (1,12-диамино-3,6,9-триазадодекан);

/V'-AcSpmTrien - jV'-ацетилсперминотриен (Л^1-ацетил-1,12-диамино-3,6,9-триазадодекан);

A^-AcSpmTrien - Л^2-ацетилсперминотриен (Л^-ацетил-1,12-диамино-3,6,9-триазадодекан);

бнс-EtSpmTrien - У,Лг'2-бис-этилсперминотриен (3,6,9,12,16-пентаазаоктадекан);

Вое - юретя-бутилоксикарбонил;

Cbz - бензилоксикарбонил;

Ns - о/няо-нитрофенилсульфонил;

Ms - метансульфонил;

THF - тетрагидрофуран;

DMF - диметилформамид;

DMSO - диметилсульфоксид.

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИКЛМПТЕКА

Актуальность проблемы. Биогенные полиамины спермин, спермидин и их предшественник путресцин присутствуют в значительных количествах в животных клетках всех типов и необходимы для их нормального роста.

При физиологическом значении рН полиамины существуют в форме поликатиопов Спермидин и спермин взаимодействуют с ДНК, РНК и нуклеопротеидами, служат регуляторами активности топоизомераз, рестриктаз, а также ферментов биосинтеза ДНК и РНК, а спермидин, являясь субстратом дезоксигипузинсинтетазы, необходим для модификации фактора инициации трансляции eIF-5 А, присутствующего у всех эукариот. Кроме того, полиамины участвуют в регуляции транспорта Саг+ митохондриями, являются модуляторами NMDA рецептора и эффекторами транспорта К+. Недавно было показано, что полиамины регулируют процесс полимеризации тубулина и участвуют в процессах апоптоза. Разнообразие и жизненная важность клеточных функций позволяют рассматривать спермин и спермидин в качестве низкомолекулярных регуляторов клеточного метаболизма.

Аналоги спермидииа и спермина являются одним из основных инструментов исследования ферментов метаболизма и клеточных функций полиаминов. Соответственно, направленное создание новых биологически активных производных полиаминов, изучение их взаимодействий с ферментами метаболизма спермидииа и спермина, а также биологических эффектов этих соединений на уровне культуры клеток и целостного организма представляется весьма актуальным.

Целью работы являлись разработка удобных способов получения а-метилированных аналогов полиаминов н их неизвестных ранее оптических изомеров; исследование биологических эффектов этих метаболически устойчивых производных биогенных полиаминов на фоне дефицита спермина и спермидииа; создание зарядодефицитного аналога спермина нового типа и изучение его взаимодействия с ДНК.

Научная новизна. Разработаны удобные схемы синтеза а-метилированных производных полиаминов и их неизвестных ранее оптических изомеров, позволяющие получать эти соединения с высокими выходами из доступных исходных веществ.

Показано, что введение метальной группы в a-положение молекул полиаминов достаточно для обеспечения метаболической устойчивости а-метилспермидина, но не а-ме-тилспермина и а,а'-димегилспермина. Все <х-метилированные производные полиаминов способны in vivo выполнять жизненно важные функции их природных прототипов.

Предложен новый подход к созданию зарядодефицитных по центральному фрагменту аналогов спермина, заключающийся в сокращении расстояния между вторичными аминогруппами до двух метиленовых звеньев. Реализация этого алгоритма привела к

1,12-диамино-3,6,9-триазадодекану - неизвестному ранее аналогу спермина На примере конденсации ДНК показана возможность регуляции конденсирующей способности 1,12-диа-мино-3,6,9-триазадодекана путем изменения рН среды, а также введением в систему ионов Си2+, так как этот аналог обладает еще и хорошими комплексообразующими свойствами по отношению к ионам Си2+.

Практическая ценность работы. Разработаны удобные схемы синтеза а-метилиро-ванных производных полиаминов, позволяющие получать рацематы этих ранее малодоступных соединений в количествах, достаточных для проведения экспериментов с лабораторными животными. Результаты исследования метаболической устойчивости и биологических эффектов а-метилполиаминов in vivo могут представлять интерес для расширения возможностей полиаминотерапии.

Синтезированы неизвестные ранее оптические изомеры а-метилированных производных полиаминов, которые являются ценным инструментом исследования ферментов метаболизма и клеточных функций биогенных полиаминов.

Предложенный в настоящей работе подход к конструированию оригинального зарядодефицитного аналога спермина может быть полезен для получения производных других биохимически значимых соединений полиаминной природы. Выраженные комплексообразукяцие свойства аналога по отношению к ионам Си2+ открывают новые возможности для регулирования биологических эффектов полиаминов

Апробация работы. Отдельные части работы докладывались на VII Международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003 г.), International Conference for Young Scientists and Ph.D. Students on Molecular Biology and Genetics, (Киев, Украина, 2003 г.), VII Международной Энгельгардтовской конференции (Суздаль, 2004 г.), IX Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей.

г Объем диссертации. Диссертация изложена на_стр. машинописного i екста и

состоит из введения, обзора литературы, обсуждения полученных результатов,

экспериментальной части и выводов. Материал иллюстрирован_таблицами,_

рисунками и_схемами. Список цитированной литературы включает_наименования.

Введение.

Система метаболизма полиаминов включает в себя несколько ферментов (Рис. 1), ключевыми из которых на путях биосинтеза являются декарбоксилазы орнитина (СЮС) и

трансфераза (БвАТ). Биосинтез и деградация этих трех короткоживущих ферментов легко индуцируются в ответ на изменения внутриклеточной концентрации полиаминов.

Ряс. 1. Система метаболизма полиаминов. ODC-орнитиндекарбоксилаза; AdoMetDC-S-аденозилметионинде-

карбоксилаза, SMO-сперминоксидаза; ЗвАТ-спермидин/спермин-Д^-апетилтрансфераза; РАО-полиаминокси-даза; AdoMet-S-адешяилметионин; dcAdoMet-декарбоксилированный 5-аденозшшетионин.

По сравнению с нормальными, опухолевые клетки имеют повышенный уровень полиаминов. Кроме того, полиамины необходимы для размножения паразитов, например, малярийного плазмодия, и вирусов, например HIV. Поэтому при изучении метаболизма полиаминов большое внимание традиционно уделяется разработке подходов к истощению внутриклеточного пула Spd и Spm. Наиболее эффективным способом достижения этого является многократная активация (супериндукция) SSAT, скорость определяющего фермента катаболизма полиаминов, химическими, или генно-инженерными способами (см. обзоры: Casero R.A & WosterPM, J.Med.Chem. 2001,44. Jarme J, etal, Eur.J.Biochem., 2004,271, 877). Снижение внутриклеточной концентрации Spm и Spd приводит к ингибированию роста клеток. Являются ли наблюдаемые эффекты прямым следствием дефицита Spm и Spd, или они вызваны отдаленными полиамин-независимыми последствиями индукции SSAT до сих пор не было известно. Для выяснения этого необходимы вещества, восстанавливающие рост клеток с супериндуцированной SSAT. Экзогенные Spm и Spd быстро утилизируются и поэтому неэффективны, а аналоги полиаминов, обладающие таким свойством, в литературе не описаны.

S-аденозилметионина (AdoMetDC), а на путях катаболизма - спермидин/спермин-JV1-ацетил-

Спермин

Значение подобных веществ велико еще и потому, что регуляция биохимических процессов подразумевает не только возможность вызывать необходимый ответ клетки или организма, но и наличие способов обращать эффект, в том числе и с помощью химических соединений. Это позволяет оценить избирательность исходного воздействия и свидетельствует об адекватности наших представлений о том или ином метаболическом процессе.

Синтез биологически активных рацемических а-метилполиаминов.

Ингибирование ключевого фермента биосинтеза полиаминов - ODC - приводит к истощению пула Spd и Put и торможению роста клеток. Этот эффект полностью обращается в результате прибавления в среду как Spd и Spm, так и их а-метильных производных (Рис. 2) (Lakanen J.R., et al., J.Med.Chem., 1992, 35, 724).

Рис. 2. а-Метильные аналоги полиаминов.

Однако активация катаболизма полиаминов в результате индукции SSAT приводит к истощению внутриклеточного пула не Put/Spd, a Spm/Spd, поэтому a priori неочевидно, будут ли а-метилполиамины, устойчивые к действию SSAT, поддерживать рост клеток с супериндуцированной SSAT, а также устранять в этих условиях патологические последствия дефицита полиаминов in vivo. Тем не менее, учитывая, что oMeSpd, aMeSpm и a,a'-Me2Spm выполняют многие функции природных полиаминов in vitro (Varnado В L, et al., Bioorg.Chem., 2000,28, 395; Byers TL., et al, Biochem.J., 1994, 303,363), можно предположить, что они окажутся хорошими биохимическими эквивалентами Spd и Spm in vitro и in vivo также и на фоне активации SSAT.

Описанные в литературе методы синтеза aMeSpd, aMeSpm и а,а'-Ме28рт позволяют получать эти соединения в количестве нескольких десятков миллиграммов с низким суммарным выходом {Lahmen J.R, et al., J.Med.Chem., 1992, 35, 724). Проблемы с растворимостью ключевых промежуточных соединений, а также трудоемкие процедуры выделения и очистки на последних стадиях синтеза являются существенными недостатками этих способов получения а-метилполиаминов. Соответственно, необходимо было разработать альтернативные схемы синтеза, позволяющие получать aMeSpd, aMeSpm и

н

a-MeSpm

a,a'-Me2Spm с высокими суммарными выходами в количествах, необходимых для проведения экспериментов с лабораторными животными.

Одним из основных методов создания C-N-связи в синтезе полиаминов является алкилирование сульфамидов, реже - избытка амина соответствующим алкилгалогенидом (см обзор: Kuksa V, et a!, Synthesis, 2000, 9, 1189). По сравнению с аминоалкилгалогенидами аминоспирты, как правило, более доступны. Поэтому в пастоящей работе для построения скелета аналогов полиаминов было использовано алкилирование аминов метансульфонатами соответствующих ^-защищенных аминоспиртов.

Схема 1

СЬгШ ^ ОМз (Па)

^ аМеврё (IV)

I- 1лА1Н/ГНТ7Д; И- СЬг-С1/Н20МаНС03; Ш- М5-С1/Е13Ш:Н2С12; /»- Н2М(СН2)4МН/ГНР, у- Н2/Р<1/МеОН/АсОН; VI- НСШеОН.

Основным интермедиатом в синтезе аМеврё (ГУ) (Схема 1), является Ы-СЬт-Ъ-аминобутанол (II), который был получен восстановлением 1ЛА1Н4 коммерчески доступного этилового эфира 3-аминомасляной кислоты и последующим Л^-карбобепзоксилированием аминоспирта (I) по Шоттен-Бауману. Ключевой стадией синтеза являлось алкилирование 1,4-диаминобутана метансульфонатом (11а), которое проводили при 0°С, что позволило уменьшить количество минорных побочных продуктов, трудно отделяемых от Л'-СЬг-аМеврс! (III) хроматографией на силикагеле. Защитную группу удаляли каталитическим гидрированием над Рс1-чернью и целевой, легко кристаллизующийся из водного спирта, тригидрохлорид аМеЯрё (IV) был получен с выходом 43%, считая на этиловый эфир 3-аминомасляной кислоты.

Для построения скелета аМеврт полиаминную цепь последовательно наращивали, алкилируя соответствующие аминокомпоненты мезилатами ЛГ-защшценных аминоспиртов (Схема 2). Исходным соединением служил Л'-СЪг-З-аминобутанол, который мезилировали и мезилат вводили в реакцию с избытком 4-аминобутанола, что приводило к аминоспирту (V). Вторичную аминогруппу в соединении (V) карбобензоксилировали, полностью ^-защищенный аминоспирт (VI) вновь мезилировали и обрабатывали избытком 1,3-диаминопропана, что приводило к дизащищенному о-метилспермину (УП).

Схема 2

hit.

CbzHN' ^ "OH CbzHN (П)

CbzHN

.OH JO.

CbzHN

(V)

vi,vii

N

I

Cbz

(VI)

H,N

.OH At

ЧНС1

aMeSpm (VIII)

i- Мз-С1/Е»5№СН2С12; й- Н2К(СН2)4ОН/ЮТ; Ш- СЬг-С1/Н20/МаНС03, ¡V- Н2Ы(СН2)3Ш/ГНК; V- Н2/Р<1; v/-НСШеОН.

После удаления защитных групп аМеЭрт (VIII) был выделен в виде хорошо кристаллизующегося тетрагидрохлорида с суммарным выходом 41%, считая на ДО-СЪг-З-аминобутанол (II).

Описанная вьппе линейная стратегия синтеза малоэффективна для получения оца'-МегЭрт. Симметрия молекулы целевого соединения позволила осуществить конвергентный синтез (Схема 3), ключевой стадией которого являлось алкилирование А'-СЬг-З-аминобутилбромидом (IX) бис-Кэ производного 1,4-диаминобутана (X).

Схема 3

H,N„

CbtHN'

NH2

JL

NHNs-i

(X)

(II)

1Щ

OH " CbzHN' v "Br (IX)

NH2* 4IIC1

a,a'-Me2Spm (ХП)

i- Ns-Cl/Et3N/CH2CI2; U- Ms-Cl/Et3N/CH2Cl2; ill- LiBr/THF; tv- DMF/K2C03; PhSH/DMF/K2C03; vl- H2/Pd; vll-HCl/MeOH.

Взаимодействием Put с NsCl в присутствии EtjN получали бмс-сульфамид (X), который плохо растворим в большинстве органических растворителей, за исключением DMF и DMSO. Для получения бромида (IX) мезилат спирта (П) обрабатывали избытком LiBr в THF и бромид (IX) без дополнительной очистки вводили в реакцию с сульфамидом (X) в DMF в присутствии К2СО3 (алкилирование соединения (X) мезилатом (11а) или тозилатом спирта (П) приводит к искомому продукту лишь с низким выходом). Обработка тиофенолом промежуточного бис-Ns производного приводила к соединению (XI), Cbz-группы в котором удаляли каталитическим гидрированием над Pd-чернью и a^'-Me^Sprn (ХП) выделяли в виде тетрагидрохлорида с суммарным выходом 57%, считая на iV-Cbz-3-аминобутанол (II).

Синтезированные aMeSpd, aMeSpm и a,a'-Me2Spm по данным ВЭЖХ в стандартных условиях анализа полиаминов (Hyvonen Т., et al, J.Chromatogr., 1992, 574.17) имели чистоту более 99.5%.

Метаболическая устойчивость и биологическая активность а-метилированных производных полиаминов.1

Активация катаболизма полиаминов в результате супериндукции спермидин/спермин-jV'-ацетилтрансферазы (SSAT) у SSAT-трангеиных крыс приводит к истощению пула Spd и Spra преимущественно в поджелудочной железе и печени. При этом развивается острый некротизирукяций панкреатит, который вызывает гибель животных в течение нескольких суток (Alhonen L, et al, PNAS USA, 2000,92, 8290) До сих пор не было известно способов обеспечения функциональной целостности поджелудочной железы на фоне активации SSAT у SSAT-трансгенных крыс.

Оказалось, что введение aMeSpd за несколько часов до индукции SSAT полностью предотвращает развитие панкреатита. Более того, введение aMeSpd или a,a'-Me2Spm уже в процессе развития SSAT-зависимого панкреатита сильно замедляло развитие воспаления и предотвращало раннюю смертность животных, которая в отсутствие аналогов достигала 66% в первые 48 часов и практически 100 % через 72 часа. Таким образом, именно дефицит полиаминов является причиной развития панкреатита у SSAT-трансгенных крыс, а aMeSpd и a,a'-Me2Spm действительно являются биохимическими эквивалентами Spd и Spm in vivo.

Изучение взаимодействия a-метильных производных полиаминов с гомогенатами печени крыс показало, что aMeSpd в этих условиях не деградирует, в то время как aMeSpm расщепляется с образованием Spd и aMeSpd, а a,a'-Me2Spm - с образованием aMeSpd Эти результаты свидетельствуют о существовании альтернативного пути катаболизма Spm, проходящего без участия SSAT (a-метшшолиамины не являются субстратами SSAT). По-видимому, деградация Spm и его метальных аналогов осуществляется недавно открытой сперминоксидазой (SMO). Оказалось, что этот фермент действительно расщепляет aMeSpm и a.a'-Me^Spm in vitro. При этом введение a-метильного заместителя в молекулу субстрата увеличивает Км aMeSpm примерно в 3 раза, а Vm„ уменьшается практически на порядок по сравнению со Spm. В случае a.a'-Me^Spm различия кинетичеких параметров еще более выражены, однако этого оказывается недостаточно для обеспечения катаболической стабильности метальных производных Spm in vivo.

1 Данные любезно предоставлены A. Jarvinen и Dr. Т. A. Keinanen, A I. Virtanen Institute for Molecular Sciences, University of Kuopio, Finland.

Синтез оптических изомеров а-метильных производных полиаминов.

Оптические изомеры известных хиральных аналогов полиаминов обладают разной биологической активностью. Так, среди диастереомеров 2,1О-дигидрокси-Л^1 fl11 -диэтил-нор-спермина и 2,10-дигидрокси-Лг1-цикл01фопилметил-Лг'1-э1'ил-нор-спермйна лишь один диастереомер каждого из веществ оказался супериндуктором SSAT (Bergeron RJ, etal, J Med.Chem., 2001,44,2451). Можно ожидать, что и стереоизомеры а-метилполиаминов будут по-разному узнаваться ферментами метаболизма полиаминов и проявлять различную биологическую активность.

Использование разработанных нами схем синтеза рацемических а-метильных производных Spm и Spd для получения соответствующих стереоизомеров требует (й)- и (S)-изомеров 3-аминобутанола. Известно несколько способов построения 3-аминобутанового фрагмента определенной конфигурации, однако они, как правило, за исключением ферментативного разделения рацемических эфиров, амидов и ацильных производных 3-ами-номасляной кислоты на энантиомеры (Sanchez V.M, et al., Tetrahedron Asymm., 1997, 8, 37), не позволяют достичь энантиомерной чистоты более 95% (Wanner КТ„ et al., Tetrahedron, 1991,4Z, 1895).

Принципиально иная стратегия син 1еза состоит в использовании доступных энантиомерно чистых веществ. Несмотря на известную ограниченность этого подхода, он хорошо работает, если структура целевого соединения не слишком сложна, как, например, в случае а-метилполиаминов.

Схема 4

h2N1-oh— B0cHNi^0MsJL BmHA-CNJV BocHN,X^NH2-V

(*)-(XIV) (Л)-(XVI)

0$)-(XV) (Sy (XVII)

BOCHN^— g Ns ^ BOCHN'^N'^-^1 ^ -N^*3HCI

(Яу (XVIII) W- (XX) Ы(УГ). (XXII)

CS>(XIX) (Sy (XXI) (Sy (XXIII)

/- Boc20/Et3N/CHCl3; //- MsCl/Et,N/CH2Cl2; III- NaCN/DMSO, 40'C; h-- UA1H,/Et20, -5"C, v- NsCVEtjN/CHjCb, O'C; vl- PhtN(CH2)4№,C03/DMF, v«-PhSH/K,C03/DMF; viil- N3H4/EtOH, 80'C; ix- HCl/MeOH

Для построения 3-аминобутанового фрагмента требуемой конфигурации использовали легкодоступные энантиомеры 2-аминопропанола (Схема 4), углеродный скелет которых удлиняли на 1 атом алкилированием цианид-иона мезилатом ^-защищенного

аланинола (Т.еЪтоп Ь, е! а1,Шеа.СИет , 1999, 42, 4749). Нитрилы (XIV) и (XV) восстанавливали 1ЛАШ4 в эфире при -5°С, что без рацемизации приводило к аминам (XVI) и (XVII), которые превращали в о-нитрофенилсульфонильные (N5) производные (XVIII) и (XIX). Сульфамиды (XVIII) и (XIX) служили универсальными хиральпыми блоками для синтеза всех оптических изомеров а-метилполиаминов.

Для получения энантиомеров аМеЯрс! соединения (ХМП) и (XIX) алкилировали Л'-(4-йодбутил)фталимидом в ИМР в присутствие поташа (Схема 4). Алкилирование мезилатом 4-Л^-Вос-аминобутанола не позволяет получить искомый продукт, по всей видимости, из-за внутримолекулярной циклизации, приводящей к ЛЧВос-пирролидину. Последующее удаление №-групп приводило к дизащищенным аМеврс! (XX) и (XXI), которые очищали хроматографией на силикагеле. Целевые (Я)- и (5)- изомеры аМеврё были выделены после удаления защитных групп в виде тригидрохлоридов с суммарными выходами 43% и 45%, соответственно, считая на 2-аминопропанол.

Для получения (К)- и (ф-аМеврт (Схема 5) сульфамиды (XVIII) и (XIX) обрабатывали избытком 1-бром-4-хлорбутаиа в ОМР в присутствии поташа. Полученные хлориды превращали в иодиды (XXIV) и (XXV), которые вводили в реакцию с избытком 1,3-диаминопропана, при этом наблюдалось незначительное (около 3 %) образование о-нит-рофенил-1,3-диаминопропана в результате активированного нуклеофильного замещения сульфамидной группы под действием диаминопропана.

Схема 5

Н Nk

(Ry (XVIII) (*> (XXIV)

№-(XIX) (5>(XXV)

ш

н .... iv,v i н

BocHN ^ HN^v^^N^NHj'«!

Ns Н

(Ку (XXVI) a-MeSnm (*>-(XXVIII)

(i> (XXVII) a Me!,pm (Sy (XXIX)

i- BitCH2)4CWC2COj/DMF; й- Ш/ацетон, Д; Ui- H2N(CH3)3NH2iTHF; iv- PhSH/EtjN/DMF, 40°C; v- НС1/ЕЮН

Кроме того, диамины (XXVI) и (XXVII) оказались неустойчивы при хранении, вероятно также из-за внутри- или межмолекулярного замещения сульфамидной группы. Эти наблюдения вполне согласуются с тем, что Ns-группа легко удаляется под действием алкил-и арилсульфид-апионов, нуклеофильность которых значительно выше, чем у аминогруппы. Защитные группы в соединениях (XXVI) и (XXVII) удаляли "one pot" последовательной обработкой тиофенолом в DMF в присутствии EtjN и затем раствором НС1 в абсолютном

этаноле. Последующая перекристаллизация из ЦО-МеОН-ЕЮН приводила к целевым тетрагидрохлоридам (R)- и (5)-aMeSpm (XXVIII) и (XXIX) с суммарными выходами 32 и 33%, считая на 2-амижшропанол.

Молекула a,a'-Me2Spm симметрична и поэтому существуют лишь три диастереомера - (R-Я), (S,S) и (ЯД). Для получения (R,R)- и (S£)~ изомеров a,a'-Me2Spm сульфамиды (XVIII) и (XIX), вводили в реакцию со стехиометрическим количеством дииодбутана (Схема 6) и затем "one-pot" удаляли Ns-группы. Следует отметить, что следы не вступивших в реакцию соединений (XVIII) и (XIX) послс денозилирования превращались в Вос-амины (XVI) и (XVII), которые плохо отделялись хроматографией от ди-Вос-нроизводных (XXX) и (XXXI). Поэтому перед удалением Ns-rpyim к реакционной смеси прибавляли бензилбромид (10 мольн. %) для алкилирования не вошедших в реакцию с дииодбутаном нозилатов (XVIII) и (XIX). Такая последовательность операций позволяла легко выделять в чистом виде ди-Вос-производные (XXX) и (XXXI).

Схема 6

BocHN

•to

BocHN

(К)- (XVIII) (5)- (XIX)

&

(*)-(хх iv)

BocHN

H,N

H (RJiy (XXX) (ЗД- (XXXI) (ЯД)- (ХХХП)

NHBoc

NH,*4HCJ

(Я,ку (ХХХП1) а,а"-Ме28рш (ад- (XXXIV) (ад- (хххло

/- 1(СН2)41/К2СОуТ)МР; й- РЬ8Н/К2С03/0МР; Ш- (Х1Х)/К2СОзЯ>МР; (V- НС1/ЕЮН.

После удаления Вос-групп целевые (Л,Л)- и (ЗД-а,а'-Мс28рт (XXXIII) и (XXXIV) получали в виде теграгидрохлоридов с суммарными выходами 42 и 46 %, соответственно, считая на 2-аминопропанол.

Мио-форму о.а'-МегЗрш получали из иодида (XXIV), который обрабатывали стехиометрическим количеством сульфамида (XIX). По окончании реакции прибавляли бензилбромид (10 мольн. %), №-группы удаляли обработкой тиофенолом и (ДД-ди-Вос-с^а'-Мегврт (ХХХП) выделяли хроматографией на силикагеле. Вос-группы удаляли действием НС1 в этаноле и целевой (ЯД)-а,а'-Ме28рт (XXXV) получали в виде тетрагидрохлорида с суммарным выходом 40 %, считая на 2-аминопропанол

Таким образом, были синтезированы все оптические изомеры а-метильных производных полиаминов. Эти вещества будут полезны для изучения ферментов метаболизма и клеточных функций Spd и Spm, а также для выяснения, какие именно изомеры а-метильных аналогов полиаминов являются биохимическими эквивалентами Spd и Spm.

Синтез нового изостерного эарядодефицитного аналога спермина и его производных.

Биологические эффекты полиаминов определяются геометрией молекулы, обеспечивающей необходимое пространственное расположение аминогрупп и степенью их протонирования. Большая часть работ по изучению зависимости биологической активности полиаминов от их строения посвящена исследованию структурных аналогов спермина и спермидина, включая производные с различными заместителями при концевых атомах азота (iCasero R.A. & Woster P.M, J.Med.Chem., 2001,44,1; Frydman В. & Valasinas A, Exp.Opin.Ther.Patents, 1999, 9,1055). Исследования вклада заряда аминогрупп Spm/Spd в биологические эффекты полиаминов не столь многочисленны. Полезным инструментом в подобных работах являются зарядодефицитные аналоги полиаминов, а рациональным подходом к созданию таких веществ является понижение основности аминогрупп при минимальном искажении геометрии молекулы, что, однако, существенно ограничивает число возможных аналогов.

Для снижения основности аминогрупп были синтезированы аналоги спермина с пиридиниевым циклом, встроенным в его скелет (Bergeron R.J., et al, J.Med.Chem., 1988, 3L 1183), а также 2,2-, 6,6- и 7,7-дифторспермидины (Bâillon J„ et al., EurJ.Biochem., 1988,176. 237) и изучена их биологическая активность. Для получения изостерных зарядодефицитных аналогов спермидина (Хомутов А.Р. и Хомутов P.M., Биоорган, химия, 1989, 15, 698) и спермина (KhomutovA.R., et al, Tetrahedron, 1996, 52,13751) их концевые НгЖИз-группы заменяли на аминооксигруппу (H2NO-), имеющую рКл ~ 5. Эти соединения оказались эффекторами ферментов метаболизма полиаминов, проникали в клетки различных типов, обладали сравнительно низкой цитотоксичностыо и регулируемой катаболической устойчивостью (Hyvonen T., et al., Life Sci., 1995, 56. 349; Eloranta Т.О., et al., J.Biochem. (Tokyo), 1990,108. 593). Известны также оксааналог Spd, диоксааналог Spm (Lin P KT, et al., Tetrahedron Lett., 1994, 35, 3605) и оксааналог Spm (Хомутов А.Р. и соавт, Биоорган, химия, 2005, 31,206), в которых центральный НКСНг-фрагмент заменен на HNO-rpyimy, однако их биологическая активность практически не исследована.

В настоящей работе предложен и реализован оригинальный подход к созданию нового зарядодефицитного аналога Spm и его производных, состоящий в сокращении расстояния между вторичными аминогруппами до 2-х метиленовых звеньев (Рис. ЗА) При этом спермидиновый фрагмент молекулы Spm заменяется изостерным ему триэтилентетраминовым, в котором основность двух вторичных аминогрупп существенно понижена (рКй (JV3, JV6) < 7). Присутствие в молекуле сразу трех этилендиаминовых фрагментов дает начало уникальной для биохимии полиаминов способности к комплексообразованию с ионами переходных металлов (Рис. ЗБ).

© |Э JJ2 NH - -2+

Spm е 3

©

SpmTrien H_,N

NH

Б.

Рис. 3. Новый изостерный зарядодефицитный аналог врш А Преобладающие ионные формы при рН 7 3 Б Строение комплекса ЭртТпеп с ионами Си1*.

Следует отметить, что ни врт, ни его известные аналоги не обладают подобным спектром свойств. Соответственно, ЭртТлеп может быть использован в качестве регулятора активности ферментов метаболизма полиаминов; для изучения особенностей активного транспорта врт в клетки; для исследования взаимодействий полиаминов с нуклеиновыми кислотами. При этом можно ожидать, что биологические эффекты БртТпеп будут рН- и Сиг+-зависимыми.

Выбранная нами стратегия синтеза вртТпеп состояла в последовательном наращивании полиаминной цепи путем алкилирования аминокомпонент мезплатами соответствующих спиртов.

Схема 7

CbzHN

i,li

ОН * CbzHN

(XXXVI)

i,n>

CbzHN

Cbz

v,vi

H,N

CbzHN

N H

N

i

Cbz (XXXVIII)

H

(XXXIX)

N H

SpmTrien (XL)

„NH,*5HC1

/- MsCl/Et3N/CH2Cl2; »/- II2NCH2CH2NHCH2CH2OfiTHP; Ш- CbzC 1/NaHCO j/THF/H20; Ы- H2NCH2CH2NH2/THF; v- H2/Pd/AcOH/MeOH; v/- НСШеОН

Первый способ синтеза предусматривает построение полиаминной цепи, начиная с Сз-фрагмента (Схема 7). Исходным соединением служил JV-Cbz-3-аминопропанол (XXXVI), который обрабатывали Ms-Cl, и получившийся мезилат без выделения вводили в реакцию с избытком Лг-(2-аминоэтил)аминоэтанола в THF. Соединение (XXXVII) после очистки колоночной хроматографией на силикагеле все еще содержало в качестве трудноотделяемой примеси некоторое количество продукта алкилирования Лг-(2-аминоэтил)амипоэтанола по вторичной аминогруппе. Вторичные аминогруппы в соединении (XXXVII) защищали и после хроматографии на силикагеле получали чистый mpuc-Cbz-аминоспирт (XXXVIII). Его превращали в мезилат, который без выделения обрабатывали избытком этилендиамина. После очистки и удаления защитных групп выделяли SpmTrien (XL) в виде пентагидрохлорида.

Второй путь синтеза SpmTrien предусматривает построение полиаминной цепи, начиная с Сг-фрагмента, что позволяет избежать неоднозначно протекающей стадии алкилирования первичной аминогруппы в присутствии незащищенной вторичной (Схема 8).

Схема S

Cbz Cbz

N I ^ N 11>Щ N .ОН ft"1 "-^ОН -- CbzHN ^ ^ OH CbzHN ^^ N ^^ --

(XLI) (XLII) (XLIII)cbz

<P>Z H H H

Cb* (XLIV) SpmTrien (XL)

i- CbzCl/NaHC03/THF/H20; й- MsCl/Et3N/CH2CI2> Ш- H2NCH2CH20ftTHF, iv- H2NCH2CH2CH2NH2miF; v-Hî/Pd/AcOH/MeOH; W- HCl/MeOH

Методически этот путь аналогичен первому и также представляет собой пятистадийный процесс. Однако выделение и очистка промежуточных соединений менее трудоемки. Суммарный выход SpmTrien (XL) в обоих случаях составлял около 20%.

Конденсация ДНК под действием SpmTrien.1

Взаимодействие с ДНК является одной из основных клеточных функций Spm и Spd. Конденсация ДНК представляет собой одну из простейших моделей для оценки эффективности взаимодействия полиаминов с нуклеиновыми кислотами. Процесс конденсации ДНК сопровождается появлением оптической плотности при X > 320 нм из-за рассеяния падающего УФ-излучения на формирующихся компактных частицах (рис. 4). Способность полиаминов конденсировать ДНК зависит от количества положительных

Совместно с д.б.н. С Г Скуридияым, ИМБ им.В.А. Энгельгардта РАН.

зарядов в молекуле и уменьшается в ряду пентамин > теграмин > триамин (Saminathan М, et al, Biochemistry, 1999, 38,3821).

SpmTrien представляет собой изостерный зарядодефицитный аналог Spm, так как основность внутренних аминогрупп SpmTrien понижена (рКа (JV3, JV6) < 7), что приводит к недостаточному, по сравнению со Spm, протонированию центрального фрагмента молекулы при физиологическом рН (см рис. ЗА).

Рис. 4. Конденсация ДНК под действием Spm при рН 6 8 (Л ДНК -20 мкМ/мл в 0 005 М Na-фосфггном буфере, рН 6.8; (2) то же, что (Л + 2.84 №5 М Spm, (3) то же, что (1) + 5 67-Ю'5 М Spm, (4) то же, что (Л + 7.08-10'5 М Spm; (5 то же, то (Л + 8.4910's М Spm; (i) то же, что (Л + 9.90 10"5 М Spm.

В то же время в области слабокислых рН степень

протонирования SpmTrien соответствует таковой для Spm. Поэтому мы провели

сравнительное исследование ДНК-конденсирующих свойств Spd, Spm и SpmTrien в

нейтральной и слабокислой среде, используя в качестве критерия активности концентрацию

полиамина, начиная с которой А34о быстро растет с увеличением концентрации полиамина

(Рис. 5).

При рН 6.8 концентрации Spm и SpmTrien, при которых начинается процесс

конденсации, отличаются более, чем в 2,5 раза (25 и 67 мкМ, соответственно), тогда как

действующая концентрация Spd, который подобно SpmTrien является трикатионом при

данном рН, составляет уже 420 мкМ (Рис. 5). Однако при рН 5.5 эффективные концентрации

Spm и SpmTrien практически совпадают (22 и 24 мкМ, соответственно), а в случае Spd

снижение рН с 6.8 до

5.5 приводят к

уменьшению таковой

лишь до 300 мкМ.

Рис. 5. Зависимость конденсации ДНК (А340) от концентрации Spd, Spm и SpmTrien при разных рН. (1) - Spm, рН 6.8, (2) - SpmTrien, рН 6.8; (5) - Spd, рН 6 8;(0-Spm, рН 5.5, (5) - SpmTrien, рН 5.5; (б) - Spd, рН 5 5.

«О 10 »250 ^00 »50 400 450 с ..............

Таким образом, по-видимому, при рН 5.5 происходит протонирование четвертой аминогруппы 8ртТпеп, которая включается в процесс конденсации ДНК Следует отметить, что при рН 6 8 конденсирующая способность трижды протонированного ЗршТпеп намного

превосходит таковую для трикатиона врё. Наблюдаемые отличия обусловлены или геометрией молекулы (расстоянием между положительными зарядами), или же участием непротонированных вторичных аминогрупп вртТпеп во взаимодействии с ДНК, возможно, и в результате образования системы водородных связей.

ДНК, сконденсированная под действием Брш или Эре!, вновь растворяется при добавлении гепарина - полианиона, который эффективно извлекает полиамины из комплекса с ДНК, а УФ - спектры исходной ДНК и комплексов ДНК - Брш и ДНК - Эре! после обработки гепарином идентичны (С.Г. Скуридин, неопубликованные данные).

Поскольку вртТпеп является хорошим хелатором Си2+, то введение в систему этих ионов должно вызывать гепарин-подобные эффекты, благодаря образованию прочного комплекса Си2+-8ртТпеп. Сравнение УФ-спектров исходной ДНК и ДНК, сконденсированной под действием 1.94-10"5 М вртТлеп при рН 5.2 (Рис. 6а, кривые 1 и 7, соответственно) с УФ-спектром конденсированной ДНК после прибавления 1.95-10'5 СиСЬ (мольное соотношение вртТлеп - Си2+ 1:1) показывает, что в присутствии ионов Си2+ происходит растворение компактной формы ДНК (Рис. 66, кривые 2-6), тогда как в случае 8рт ионы Си2+ не вызывают подобного эффекта.

В отличие от гепарин-зависимой деконденсадии ДНК, в случае ионов Си2+ величина Агво уменьшается лишь незначительно, что обусловлено заметным поглощением комплекса (Си-8ртТпеп)2+ при 260 нм (Рис. 66, кривая 7). Сами по себе ионы Си2+ в концентрациях до 2-10'5 М не вызывают изменений УФ - спектра растворов ДНК.

Рис. 6. Конденсация ДНК под действием БргаТпеп (а) и деконденсация в присутствие ионов Си2+ (6). (я): (!)

А, од 0£<

ДНК - 20 мкг/мл в 0.005 М №-Ас буфере, рН 5.2; (2) то же, что (/) + 3.24-10"6 М вртТНеп; (3) то же, что (!) + 6.48-104 М вртТпеп; (4) то же, что (/) + 9.71 • 10"6 М вртТпеп; (5) то же, что (/) + 1.29-10"' М вртТнеп; (6) то же, что (1) + 1.62-10"3 М

БртТпеп; (7) то же, что (!) +

1.94-10"5 М БрюТпеп. (6): (!) ДНК -20 мкг/мл в 0.005 М Ка-Ас буфере, рН 5.2 + 1 94-Ю"5 М вртТпеп, (2) то же, что (!) + 4.96-10"6 М СиС12; (3) то же, что (У) + 9.88-10-6 М СиС12; (4) то же, что (1) + 1.47-10"5 М

СиСЬ, (5) то же, что (1) + 1.95-10'5 М СиС12, (б) то же, что (!) + 2 43 10' 3 М СиС12; (7) 1 94-10'5 М БршТпеп

5 М СиС12; (7) 1 94-10'5 +1.95 10'5 МСиС12.

Таким образом, наличие у вртТпеп хороших комплексообразующих свойств

позволяет регулировать его конденсирующую активность не только при помощи рН, но и

путем введения в систему ионов Си2+, что не характерно ни для одного из известных аналогов Spm.

Известно, что Spm эффективно защищает ДНК от свободнорадикальных повреждений в условиях реакции Фентона (На Н.С., et al. BBRC, 1998,244,298), что обусловлено его непосредственным взаимодействием со свободными радикалами (На Н. С., et al, PNAS, 1998, 95,11140). Оказалось, что SpmTrien, являясь изостерным аналогом Spm, уже в концентрации 25 мкМ (мольное соотношение SpmTrien-Cu2+ 1.25:1) эффективно предотвращает деградацию ДНК pUC19 (Рис. 7, дорожка J), а увеличение его концентрации вдвое лишь незначительно улучшает ингибирование (дорожка 6).

Рис. 7. Гель-электрофорез в 0.7% агарозном геле

продуктов деградации суперскрученной ДНК pUC 19, образующихся под действием Н202/Си24. Дорожки: (1) pUC19, (2) pUC19 + PBS, 60 мин, 37°С, (3) то же, что (2) +20 мкМ CuCI2 + 30 мкМ Н202,60 мин, 37°С; (4) то же, что (3) + 1 мМ Spm; (5) то же, что (3) + 25 мкМ SpmTrien; (6) то же, что (3) + 50 мкМ SpmTrien. КФ, ЛФ и СФ - кольцевая, линейная и суперскрученная формы ДНК, соответственно.

При концентрации SpmTrien 25 мкМ содержание в реакционной смеси кольцевой формы

ДНК заметно меньше, чем в случае 1 мМ Spm (дорожки 4 и 5). Наблюдаемые отличия

защитных свойств Spm и SpmTrien, по-вцдимому, не обусловлены особенностями

взаимодействия этих соединений с ДНК или различной реакционной способностью по

отношению к свободным радикалам. Наиболее вероятным объяснением является

образование устойчивого комплекса между ионами Си2+ и SpmTrien, что уменьшает

эффективность образования свободных радикалов в системе Си2+/Н202.

Ацетильные и бис-этильиое производные SpmTrien.

Хорошо изученный классический путь катаболизма Spm является двухстадийным процессом. Одна из первичных аминогрупп молекулы Spm сначала ацетилируется под действием SSAT и затем образовавшийся А^-ацетилспермин расщепляется под действием флавин-зависимой полиаминоксидазы (РАО). SpmTrien является изостером Spm и, по-видимому, он будет эффективно связываться в активном центре SSAT и, вероятно, окажется субстратом этого фермента. Однако, в отличие от Spm, молекула SpmTrien несимметрична, и a priori невозможно предсказать направление реакции ацетилирования (N1- или N12-). Соответственно, для идентификации продуктов клеточного метаболизма SpmTrien необходимо было синтезировать его N1- и М12-ацетильные производные.

В то же время, М- и А^-АсЭртТпеп'ы являются изостерными аналогами Л^-Асврт, который является субстратом РАО, и, следовательно, эти производные вртТлеп могли бы обладать высоким сродством к ферменту (Рис. 8).

® © РАО В о

РАО

Н2 Н2

Лг-АйртТНеп

РАО

^.Шз

Рис. 8. Протонирование ацетильных производных врш и ЭртТп'еп при физиологическом рН.

Молекула Л^'-АсвртТпеп трижды протонирована и по распределению заряда ближе к Л^'-АсЯрт - природному субстрату РАО, по сравнению с Л^-АсЯртТлеп, который имеет лишь два положительных заряда. Однако расстояние от ацетилированной аминогруппы до расщепляемой под действием РАО связи у Л^-АсвртТпеп на одну метияеновую группу меньше, чем у Л^-Асврт и Л^-АсЗртТпеп. Таким образом, сравнение субстратных свойств Л^1- и Л^-АсЗртТпеп и .У'-АсЗрт в полиамипоксидазной реакции даст новую информацию о вкладе нротонирования внутренней аминогруппы субстрата в его узнавание и о возможности образования ацетаминоуксусного альдегида из Л^-АсвртТнеп.

Схема 9

СЬгШ

СЬяНЫ

(XXXIX)

N

I

СЬг

СЬг

I

(ХЛУ)

N

I

СЬг

СЬгШ

*4НС1

(ХЬУ1)

л'-АсвртТиеп (ХЬУ11)

/- о-САСОЩСНО/ТНР;в- СЬ7.-С1ЯНН/Н20/ЫаНС03, Ш- МеОШ2/ТНР/НгО; ;Ч>- Ас-С1/Е13КАГНР; к-Н2/Р<1/МеОН/АсОН; »<- НО/МеОН.

Оба ацетильных производных вртТпеп были получены из промежуточных соединений в синтезе самого вртТпеп. Так, тУ'-АсЯртТпеп был приготовлен (Схема 9) из трижды защищенного БртТпеп (XXXIX). Для селективной защиты вторичной аминогруппы в присутствии первичной последнюю превращали в салицилиденовое производное, затем

вторичную аминогруппу карбобензоксилировали и салицилиденовую защиту удаляли действием 0-метиллидроксиламота в нейтральной среде.

Амин (ХЬУ) ацетилировали и защитные группы в соединении (ХЬУ1) удаляли

тетрагидрохлорида с суммарным выходом 51%, считая на соединение (XXXIX).

Подходящим исходным для синтеза ^-АсвршТпеп (Схема 10) являлся трижды защищенный аминоспирт (ХЬП)

/- Ms-Cl/Et3N/CH2CI2, н- H2N(CHü)jNHAc/THF, Ш- H2/Pd/MeOH/AcOH, <v- HCI/MeOH.

Спирт (XLII) превращали в мезилат, который обрабатывали избытком .У-ацетил-1,3-диаминопропана. Защитные группы удаляли каталитическим гидрированием и получали ,V12-AcSpmTrien (L) в виде тетрагидрохлорида с выходом 58%, считая на спирт (XLII).

Таким образом, были синтезированы два неизвестных ранее ладно-ацетильных производных SpmTrien, представляющих интерес для исследования SSAT и РАО.

Терминально быс-алкилированные аналоги полиаминов являются одним из основных инструментов исследования системы метаболизма полиаминов и, кроме того, имеют хорошие перспективы клинического применения. Тем не менее, механизмы их действия на молекулярном уровне в большинстве случаев до сих пор неизвестны. Влияние геометрии молекулы на биологические эффекты бнс-алкилполиаминов подробно исследовалось на протяжении последних 15 лет (см. обзоры: Casero R.A, et al., J.Med.Chem., 2001,44,1; Frydman В., et al., Exp.Opin.Ther.Patents, 1999, 9,1055), но вклад зарядовой составляющей в биологическую активность практически не изучен.

Описан единственный зарядодефицитный аналог биоалкилспермина - Nlftn-6uc-(2,2,2-трифторэтил)-1,12-диамино-4,9-диазадодекан:

каталитическим гидрированием. Целевой .V'-AcSpmTrien (XLVII) выделяли в виде

Схема 10

Cbz

Cbz

iV^-AcSpmTrien (L)

Трифторэтильные заместители сильно понижают основность концевых аминогрупп, которые не протонируются при физиологическом рН (Bergeron R.J, et al, J Med.Chem., 1995,38, 2278). Однако бнс-алкильные производные полиаминов с пониженной основностью вторичных амипогрупл полиаминной цепи не были описаны.

Исходным соединением для получения бкс-EtSpmTrien служил JV-этиламиноэтанол (Схема 11). Его карбобензоксилировали и спирт (LI) превращали в мезилат, который без выделения вводили в реакцию с избытком Л^-(2-аминоэтил)аминоэтанола. Диаминоспирт (LII), содержащий небольшое количество изомерного продукта алкилирования Дг-(2-амипо-этил)аминоэтанола по вторичной аминогруппе, вновь карбобензоксилировали. При этом целевое mpuc-Cbz производное (ЫП) легко отделялось хроматографией на силикагеле от побочного продукта реакции алкилирования, содержащего две Cbz-группы.

Схема 11

Н

8 Г,

(LIV)

/- СЬг-О/ТНР/НгСШаНСО;, Я- М5-С1/Е13М/СН2С12; Ш- Н2МСН2СН2Ь'НСН2СН2ОНТНР; ¡V- (ШОЛда; V-Н2/Р<ШеОН/АсОН; VI- НСШеОН; V«- СНгСНСМСвН«; М- Ь!А1Н,.

Для построения Сз фрагмента молекулы бме^8ртТпеп был использован Лг-этил-1,3-диаминопронан (ЬГУ), полученный цианэтилированием этиламина с последующим восстановлением нитрила 1ЛА1Н4. Защищенный аминоспирт (ЫП) превращали в мезилат, который обрабатывали избытком ЛГ-этил-1,3-диаминопропана (ЬГУ). Наряду с целевым соединением линейного строения (ЬУ) образовывалось некоторое количество продукта алкилирования ЛГ-этил-1,3-диаминопропана по вторичной аминогруппе, который плохо отделялся хроматографией. Для удаления этой примеси сырой диамин (ЬУ) обрабатывали 0.2 экв салицилового альдегида, что приводило к образованию устойчивого основания Шиффа по первичной аминогруппе примеси, которое затем легко отделялось

хроматографией от целевого соединения (LV). После удаления защитных групп каталитическим гидрированием быс-EtSpmTrien (LVI) получали в виде пентагидрохлорида с суммарным выходом 8%, считая на JV-этиламиноэтанол.

Таким образом, на основе скелета SpmTrien был получен первый зарядодефицитный по центральному фрагменту аналог бис-этилспермина - 5uc-EtSpmTrien.

Выводы:

1. А) Предложены удобные схемы синтеза биологически активных рацемических сс-метил-спермидина, а-метилспермина и а,а'-диметилспермина, позволяющие получать эти соединения в количествах, достаточных для проведения экспериментов на лабораторных животных.

Б) Исходя из (R)- и (5)-аланинолов, синтезированы неизвестные ранее (R)- и (5)-ос-метил-спермидины, (Л)- и (5)-а-метилспермины, (Д,/?)-, (S.S)- и (R,S)-a,a'-диметилспермины.

2. а-Метилполиамины способны выполнять ключевые функции спермидина и спермина т vivo в условиях многократной индукции спермидин/спермин-Л^-ацетилтрансферазы, при этом а-метильный заместитель обеспечивает катаболическую стабильность а-метилспер-мидина, но не а-метилспермина и а,а'-диметилспермина.

3. Предложен новый подход к созданию зарядодефицитных аналогов спермина, состоящий в сокращении расстояния между аминогруппами до двух метиденовых звеньев и синтезирован неизвестный ранее изостерный аналог спермина - 1,12-диамино-3,6,9-триа-задодекан. Наличие триэтилентетраминового фрагмента приводит к выраженным комплексообразующим свойствам по отношению к иопам Си2+.

4. А) Для исследования особенностей спермидин/спермин-Лг'-ацетилтрансферазной и полиаминоксидазной реакций синтезированы неизвестные ранее Л^-ацегил-1,12-диами-но-3,б,9-триазадодекан и Лг'2-ацетил-1,12-диамино-3,6,9-триазадодекан, представляющие собой продукты ферментативного ацетилирования 1,12-диамино-3,6,9-триазадодекана и являющиеся изостерными зарядодефицитными аналогами JV'-ацетилспермина -природного субстрата полиаминоксидазы.

Б) Показано, что способность 1,12-диамино-3,б,9-триазадодекана конденсировать ДНК зависит от рН среды и от присутствия ионов переходных металлов. Такая комбинация свойств не характерна ни для одного из известных аналогов спермина. В) Установлено, что 1,12-диамино-3,6,9-триазадодекан ~ в 100 раз эффективнее, чем изостерный ему спермин, защищает ДНК от повреждений свободными радикалами в условиях реакции Фентона.

Основное содержание работы отражено в следующих публикациях:

1. Григоренко Н.А., Вепсалайнен Й., Ярвинен А., Кейнанен Т.А., Алхонен Л., Янне Ю., Крицьш A.M., Хомутов А.Р. "Новый синтез а-метилспермидина." // Биоорган. Химия,

2004, т. 30, № 4, с. 441-445.

2. Григоренко Н.А., Вепсалайнен Й., Ярвинен А., Кейнанен Т.А., Алхонен Л., Янне Ю., Хомутов А.Р. "Новый синтез а-метил и а,а'-диметилспермина." // Биоорган. Химия,

2005, т. 31, №2, с. 200-205.

3. Jarvinen A., Grigorenko N., Khomutov A.R., Hyvonen М.Т., Uimari A., Vepsalainen J., Sincrvirta R., Keinanen T.A., Vujcic S., Alhonen L., Porter C.W., Janne J. "Metabolic Stability of a-Methylated Polyamine Derivatives and Their Use as Substitutes for the Natural Polyamines" // J. Biol. Chem., 2005, v. 280, № 8, p. 6595-6601.

4. Хомутов A.P., Григоренко H.A., Скуридин С.Г., Демин А.В., Вепсалайнен Й., Касеро Р.А., Уостер П.М. "Зарядодефицитный аналог спермина с комплексообразующими свойствами" // Биоорган. Химия, 2005, т. 31, № 3, с. 301-307.

5. Grigorenko N.A., Vepsalainen J.J., Jarvinen A., Keinanen Т.А., Alhonen L., Janne J., Khomutov A.R. "Synthesis of R- and S- isomers of 1-methylspermidine" // Mendeleev Commun. 2005, № 4, p. 142-143.

4

»i

Напечатано с готового оригинал-макета ►

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 06.10.2005 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 609. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

rriD rytl/KWH IJJUnA

2006-4 17527

i 19843

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Григоренко, Николай Александрович

Список использованных сокращений.

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Методы избирательной защиты первичных и вторичных аминогрупп в полиаминах.

2.2. Синтез полиаминов и их аналогов.

2.2.1. Методы алкилирования.

2.2.2. Методы восстановления.

2.2.3. Присоединение по Михаэлю.

2.2.4. Реакция Мицунобу.

2.2.5. Твердофазный синтез полиаминов.

2.3. Регуляция активности ферментов катаболизма полиаминов.

2.3.1. Спермидин/спермин-УУ'-ацетилтрансфераза.

2.3.2. Полиаминоксидаза.

3. Результаты и обсуждение.....

3.1. Метаболически устойчивые аналоги полиаминов.

3.1.1. Синтез рацемических а-метилполиаминов.

3.1.2. Получение ^-ацетил-а-метилспермидина.

3.1.3. Оптические изомеры а-метилполиаминов.

3.2. Новый изостерный зарядодефицитный аналог спермина (SpmTrien).

3.2.1. Дизайн структуры SpmTrien и его биохимически значимых производных.

3.2.2. Синтез SpmTrien.

3.2.3. Синтез ацетильных производных SpmTrien.

3.2.4. Синтез бис-этил SpmTrien.

3.3. Исследование субстратных свойств а-метилполиаминов по отношению к ферментам катаболизма полиаминов in vitro.

3.4. Биологические эффекты и метаболизм а-метилполиаминов in vivo.

3.5. Взаимодействие SpmTrien с ДНК в модельных системах.

3.5.1. Конденсация ДНК под действием SpmTrien.

3.5.2. Комплексообразующие свойства SpmTrien.

4. Экспериментальная часть.....

4.1. Синтез аналогов полиаминов.

4.1.1. Синтезы рацемических aMeSpd, aMeSpm, a,a'-Me2Spm и Ac-aMeSpd.

4.1.2. Синтезы оптических изомеров aMeSpd, aMeSpm и a,a'-Me2Spm.

4.1.3. Синтезы SpmTrien, его бис-этильного и моно-ацетильных производных.

4.2. Защита ДНК от свободно-радикальных повреждений при помощи SpmTrien.

4.3. Взаимодействие SpmTrien с молекулярными конструкциями ДНК.

4.4. Конденсация ДНК под действием SpmTrien в нейтральной и слабокислой среде.

5. Выводы —.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новые биологически активные аналоги полиаминов"

Биогенные полиамины - спермин, спермидин и их предшественник путресцин присутствуют в значительных количествах в животных клетках всех типов и необходимы для их нормального роста. При физиологическом значении рН полиамины существуют в форме поликатионов. Спермидин и спермин взаимодействуют с ДНК, РНК и нуклеопротеидами, служат регуляторами активности топоизомераз, рестриктаз, а также ферментов биосинтеза ДНК и РНК, а спермидин, являясь субстратом дезоксигипузинсинтетазы, необходим для модификации фактора инициации трансляции е1Р-5А, присутствующего у всех эукариот. Кроме того, полиамины участвуют в регуляции транспорта Са2+ митохондриями, являются модуляторами ЫМОА рецептора и эффекторами транспорта К+. Недавно было показано, что полиамины регулируют процесс полимеризации тубулина и участвуют в процессах апоптоза. Разнообразие и жизненная важность клеточных функций позволяют рассматривать спермин и спермидин в качестве низкомолекулярных регуляторов клеточного метаболизма. Вместе с тем, системы метаболизма и активного транспорта, а также функции полиаминов на молекулярном уровне изучены недостаточно.

Одной из отличительных особенностей опухолевых клеток по сравнению с нормальными, является повышенное содержание в них полиаминов. Соответственно, специфические ингибиторы биосинтеза спермидина и спермина и индукторы ферментов их катаболизма обладают выраженной противоопухолевой активностью [1,2]. Кроме того, истощение внутриклеточного пула полиаминов замедляет размножение паразитов, например, малярийного плазмодия и вирусов, в том числе и вируса иммунодефицита человека, что является ещё одним фактором, подчёркивающим актуальность исследований в этой области.

Исторически первые работы в области химического регулирования метаболизма полиаминов были направлены на создание ингибиторов ферментов биосинтеза спермидина и спермина. Впоследствии оказалось, что этого недостаточно для полного истощения пула полиаминов в клетке, поскольку клетки оснащены системами активного транспорта путресцина, спермидина и спермина. Поэтому в последние годы центр тяжести исследований сместился в сторону активации катаболизма полиаминов, ключевым ферментом которого является спермидин/спермин-Д/'1-ацетилтрансфераза (SSAT). Были найдены вещества (в основном, терминально быс-алкилированные производные спермидина, спермина и их гомологов), способные вызывать повышение клеточной активности SSAT в десятки и даже сотни раз, что приводит к резкому понижению внутриклеточной концентрации полиаминов. В этом случае транспортируемые в клетку из внешней среды спермидин и спермин быстро утилизируются и потому не способны поддерживать рост.

Однако является ли наблюдаемое замедление роста клеток следствием дефицита спермина и спермидина, либо оно вызвано отдаленными полиамин-независимыми последствиями индукции SSAT, до сих пор не было известно. Для решения этого вопроса необходимо найти способ поддержания жизнеспособности клеток с индуцированной SSAT, например, с помощью метаболически устойчивых аналогов полиаминов, способных выполнять основные клеточные функции спермидина и спермина. В общем смысле, значение подобных веществ велико еще и потому, что регуляция биохимических процессов подразумевает не только возможности вызывать необходимый ответ клетки или организма, но и наличие способов обращать эффект, в том числе и с помощью химических соединений. Это позволяет оценить избирательность исходного воздействия и свидетельствует об адекватности наших представлений о том или ином биохимическом процессе.

Все клетки оснащены системой активного транспорта полиаминов, которая, по всей видимости, играет важную роль в регуляции гомеостаза полиаминов in vivo. Однако её локализация, строение и механизм переноса путресцина, спермидина и спермина через клеточную мембрану до сих пор окончательно не установлены. Возможности использования радиоактивно меченых полиаминов для изучения кинетических характеристик их транспорта, механизма ингибирования их переноса по принципу обратной связи, потоков обмена между внутри и внеклеточным пулами полиаминов, а также процессов распределения экзогенных полиаминов в отдельных органах и тканях сильно ограничены из-за их достаточно быстрого взаимопревращения в клетке. Данное ограничение может быть устранено с использованием метаболически устойчивых миметиков полиаминов, аналогично тому, как это было сделано при изучении систем активного транспорта глюкозы и a-аминокислот с введением в практику метаболически стабильных З-О-метил-О-глкжозы и а-метилаланина, соответственно. Таким образом, метаболически устойчивые миметики полиаминов могут стать полезным инструментом исследования системы активного транспорта путресцина, спермидина и спермина.

Соответственно, первой задачей данной работы была разработка удобных способов получения ранее малодоступных рацемических а-метилполиаминов, о которых известно, что они являются плохими субстратами SSAT и способны выполнять некоторые функции полиаминов in vitro. Синтез неизвестных ранее оптических изомеров а-метилполиаминов и изучение возможностей их использования в качестве метаболически устойчивых миметиков спермидина и спермина in vitro и in vivo являлся второй задачей настоящей работы.

Биологические эффекты полиаминов и их аналогов определяются геометрией молекулы и положительным зарядом протонированных аминогрупп. В то время как зависимость биологических эффектов аналогов спермина и спермидина от их строения исследовалась весьма подробно, вклад зарядовой составляющей остается малоизученным. Заряд о дефицитные аналоги полиаминов оказались полезным инструментом в подобных исследованиях.

Рациональным подходом к созданию веществ этого типа является понижение основности аминогрупп при минимальном искажении геометрии молекулы. Учитывая данное ограничение, существует не много способов конструирования таких структур. Поэтому третьей задачей настоящей работы являлся дизайн и синтез оригинального заря до дефицитного аналога Брт и его биохимически значимых производных.

2. Обзор литературы.

Полиамины и их аналоги имеют, как правило, достаточно простую структуру, тем не менее, их синтез весьма сложен и трудоёмок. Это связано с монотонностью структуры целевых соединений и с необходимостью избирательной функционализации первичных и вторичных аминогрупп в одной молекуле. Кроме того, высокая полярность конечных и многих промежуточных соединений создаёт дополнительные проблемы при их выделении и очистке. Однако в связи с перспективностью использования аналогов полиаминов для лечения различных заболеваний, в том числе и для химиотерапии рака, за последние 20 лет были разработаны эффективные подходы к получению разнообразных соединений полиаминной природы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Григоренко, Николай Александрович

5. Выводы

1. А) Предложены удобные схемы синтеза биологически активных рацемических а-метилспермидина, а-метилспермина и а,сс'-диметилспермина, позволяющие получать эти соединения в количествах, достаточных для проведения экспериментов на лабораторных животных.

Б) Исходя из (R)- и (5)-аланинолов, синтезированы неизвестные ранее (R)- и (5)-а-метилспермидины, (R)- и (5)-а-метилспермины, (R,R)-, (5,S)- и (Л,5)-а,а'-диметилспермины.

2. а-Метилполиамины способны выполнять ключевые функции спермидина и спермина in vivo в условиях многократной индукции спермидин/спермин-ЛГ1-ацетилтрансферазы, при этом а-метильный заместитель обеспечивает катаболическую стабильность а-метилспермидина, но не а-метилспермина и а,а'-диметилспермина.

3. Предложен новый подход к созданию зарядодефицитных аналогов спермина, состоящий в сокращении расстояния между аминогруппами до двух метиленовых звеньев и синтезирован неизвестный ранее изостерный аналог спермина - 1,12-диамино-3,6,9-триазадодекан. Наличие триэтилентетраминового фрагмента приводит к выраженным комплексообразующим свойствам по отношению к ионам Си2+.

4. А) Для исследования особенностей спермидин/спермин-А^-ацетилтрансферазной и полиаминоксидазной реакций синтезированы неизвестные ранееЛг'-ацетил-1,12-диамино-3,6,9-триазадодекан и А/^-ацетил-^П-диамино-ЗДЭ-триазадодекан, представляющие собой продукты ферментативного ацетилирования 1,12-диамино-3,6,9-триазадодекана и являющиеся изостерными зарядодефицитными аналогами Л^-ацетилспермина - природного субстрата полиаминоксидазы.

Б) Показано, что способность 1,12-диамино-3,6,9-триазадодекана конденсировать ДНК зависит от рН среды и от присутствия ионов переходных металлов. Такая комбинация свойств не характерна ни для одного из известных аналогов спермина. В) Установлено, что 1,12-диамино-3,6,9-триазадодекан ~ в 100 раз эффективнее, чем изостерный ему спермин, защищает ДНК от повреждений свободными радикалами в условиях реакции Фентона.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Григоренко, Николай Александрович, Москва

1. Casero R.A., Woster P.M. II Terminally alkylated polyamine analogues as chemotherapeutic agents. J. Med. Chenu 2001. V. 44. P. 1-26.

2. Seller N. II Thirty years of polyamine-related approaches to cancer therapy. Retrospect and prospect. Part 1. Selective enzyme inhibitors. Curr. Drug Targets 2003. V. 4. P. 537-564.

3. O^Sullivan M.C., Zhou Q. II Novel polyamine derivatives as potent competitive inhibitors of Trypanosoma cruzi trypanothione reductase. Bioorg. Med. Chem. Lett 1995. V. 5. P. 1957-1960.

4. Khomutov A.R., Shvetsov A.S., Vepsalainen J.J., KritzynA.M. //Novel acid-free cleavage of N-(2-hydroxyarylidene) protected amines. Tetrahedron Lett. 2001. V. 42. P. 2887-2889.

5. Bergeron R.J., Garlich J.R., Stolowich N.J. II Reagents for the stepwise functionalization of spermidine, homospermidine, and bis(3-aminopropyl)amine. J. Org. Chem. 1984. V. 49. P. 29973001.

6. Favre-Reguillon A., Segat-Dioury F., Nait-Bouda L., Cosma C., Siaugue J.-M., FoosJ., Guy A. IIA Highly Chemoselective Protection and Activation of Primary Amines in Polyamine. Synlett 2000. V. 6. P. 868-870.

7. Tice C.M., Ganem B. II The chemistry of naturally occurring polyamines. 6. Efficient syntheses of N1- and N8-acetylspermidine. J. Org. Chem. 1983. V. 48. P. 2106-2108.

8. Nagarajan S„ Ganem B. II Chemistry of naturally occurring polyamines. 9. Synthesis of spermidine and spermine photoaffinity labeling reagents. J. Org. Chem. 1985. V. 50. P. 5735-5737.

9. Ramiandrasoa F., Milat M. IIA new regioselective synthesis of N1- and N8-monoacylated spermidines. Tetrahedron Lett. 1989. V. 30. P. 1365-1368.

10. Jasys V.J., Kelbaugh P.R., Nason DM., Phillips D., Saccomano N.A., StrohJ.G., Volkmann R.A. II The total synthesis of argiotoxins 636, 659 and 673. Tetrahedron Lett. 1988. V. 29. P. 6223-6226.

11. Edwards M.L., Prakash N.J., Stemerick D.M., Sunkara S.P., Bitonti A.J., Davis G.F., Dumont J.A., Bey P. // Polyamine analogs with antitumor activity. J. Med. Chem. 1990. V. 33. P. 1369-1375.

12. Carboni B., BenalilA., Vaulter M. II Aliphatic amino azides as key building blocks for efficient polyamine syntheses. /. Org. Chem. 1993. V. 58. P. 3736-3741.

13. Bergeron R.J., Muller R., Bussenius J., McManis J.S., Merriman R.L., Smith R.E., Yao H., Weimar W.R. II Synthesis and Evaluation of Hydroxylated Polyamine Analogues as Antiproliferatives. J. Med. Chem. 2000. V. 43. P. 224-235.

14. Casara P., Danzin C., Metcalf B., Jung M. II Stereospecific synthesis of (2R,5R)-hept-6-yne-2,5-diamine: a potent and selective enzyme-activated irreversible inhibitor of ornithine decarboxylase (ODC). J. Chem. Soc. 1985. P. 2201-2207.

15. Lakanen J.R., Coward J.K., PeggA.E. II alpha-Methyl polyamines: metabolically stable spermidine and spermine mimics capable of supporting growth in cells depleted of polyamines. J. Med. Chem. 1992. V. 35. P. 724-734.

16. Israel M„ Zoll E.C., Muhammad N., Modest E.J. II Synthesis and antitumor evaluation of the presumed cytotoxic metabolites of spermine and N,N'-bis(3-aminopropyl)nonane-l,9-diamine. J. Med. Chem. 1973. V. 16. P. 1-5.

17. Edwards M.L., Stemerick D.M., Bitonti A.J., Dumont J.A., McCann P.P., Bey P., Sjoerdsma A. II Antimalarial polyamine analogs. J. Med. Chem. 1991. V. 34. P. 569-574.

18. Levchine I., Pajan P., Borloo M„ Bollaert W„ HaemersA. II An Efficient Synthesis of Selectively Functionalized Spermidine. Synthesis 1994. V. 1. P. 37-39.

19. Nagarajan S., Ganem B. II Chemistry of naturally occurring polyamines. 10. Nonmetabolizable derivatives of spermine and spermidine. J. Org. Chern. 1986. V. 51. P. 4856-4861.

20. Nagarajan S., Ganem B. II Chemistry of naturally occurring polyamines. 11. Unsaturated spermidine and spermine derivatives. J. Org. Chem. 1987. V. 52. P. 5044-5046.

21. Edwards M.L., Snyder R.D., Stemerick D.M. II Synthesis and DNA-binding properties of polyamine analogs. J. Med. Chem. 1991. V. 34. P. 2414-2420.

22. Golding B.T., O * Sullivan M.C., Smith L.L. II Convenient routes to alkyl-substituted polyamines. Tetrahedron Lett. 1988. V. 29. P. 6651-6654.

23. Bergeron R.J., McManis J.S., Weimar W.R., Schreir K.M., Gao F., Wu Q„ Ortiz-Ocasio J., Vinson J.R.T., Luchetta G.R., Porter C. II The role of charge in polyamine analog recognition. J. Med. Chem. 1995. V. 38. P. 2278-2285.

24. Hughes D.L. II In: Organic Reactions-, Wiley: New York. 1992. V. 42. P. 335.

25. Edwards M.L., Stemerick D.M., McCarthy J.R. II Stereospecific synthesis of secondary amines by the Mitsunobu reaction. Tetrahedron Lett. 1990. V. 31. P. 3417-3420.

26. Karigiannis G., Mamos P., Balayiannis G„ Katsoulis I., Papaioannou D. II Simple Fragment Syntheses of All Four Isomers of the Spermine Alkaloid Kukoamine. Tetrahedron Lett. 1998. V. 39. P. 5117-5120.

27. Byk G., Frederic M., Scherman D. II One Pot Synthesis of Unsymmetrically Functional ¡zed Polyamines by a Solid Phase Strategy Starting from their Symmetrical Polyamine Counterparts. Tetrahedron Lett 1997. V. 38. P. 3219-3221.

28. McCann P.P., PeggA.E. // Ornithine decarboxylase as an enzyme target for therapy. Pharmac. Ther. 1992. V. 54. P. 195-215.

29. Pegg A.E., McCann P.P. II S-Adenosylmethionine decarboxylase as an enzyme target for therapy. Pharmac. Ther. 1992. V. 56. P. 359-377.

30. PeggA.E., Poulin R., Coward J.K. II Use of aminopropyltransferase inhibitors and of non-metabolizable analogs to study polyamine regulation and function. Int. J. Biochem. Cell Biol. 1995. V. 27. P. 425-442.

31. Persson L., PeggA.E. II Studies of the induction of spermidine/spermine vV'-acetyltransferase using a specific antiserum. J. Biol. Chem. 1984. V. 259. P. 12364-12367.

32. Libby P.R., Ganis B., Bergeron R.J., Porter C. W. // Characterization of human spermidine/spermine N'-acetyltransferase purified from cultured melanoma cells. Arch. Biochem. Biophys. 1991. V. 284. P. 238-244.

33. Delia Ragione F., PeggA.E. II Studies of the specificity and kinetics of rat liver spermidine/spermine iV'-acetyltransferase. Biochem. J. 1983. V. 213. P. 701-706.

34. Lu L., Berkey K.A., Casero Jr, R.A. II RGFGIGS is an amino acid sequence required for acetyl coenzyme A binding and activity of human spermidine/spermine W'-acetyltransferase. J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 18920-18924.

35. Coleman C.S., Huang H., Pegg, A.E. II Structure and critical residues at the active site of spermidine/spermine-iV'-acetyltransferase. Biochem. J. 1996. V. 316. P. 697-701.

36. Wallace H. M., Ball D.E., Coleman C.S. II In Polyamines in the Gastrointestinal Tract; Kluwer Academic Publishers: Dordrecht. 1992. P. 8-9.

37. Wallace H.M., Mackarel A.J. II Regulation of polyamine acetylation and efflux in human cancer cells. Biochem. Soc. Trans. 1998. V. 26. P. 571-575.

38. Coleman C.S., Wallace H.M. II Polyamine excretion from human cancer cells. Biochem. Soc. Trans. 1990. V. 18. P. 1228-1229.

39. Casero Jr, R.A., Celano P., Ervin S.J., Applegren N.B., Wiest L., PeggA.E. II Isolation and characterization of a cDNA clone that codes for human spermidine/spermine Af'-acetyltransferase. J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 10-14.

40. Coleman C.S., PeggA.E. II Proteasomal degradation of spermidine/spermine JV'-acetyltransferase requires the carboxyl-terminal glutamic acid residues. J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 12164— 12169.

41. Coleman C.S., Chau V., PeggA.E. // Identification of a novel polyamineacetylase. FASEB Proc. 2001. abstr. A169.

42. Matsui I., PeggA.E. II Increase in acetylation of spermidine in rat liver extracts brought about by treatment with carbon tetrachloride. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1980. V. 92. P. 1009-1015.

43. PeggA.E., Erwin B.G., Persson L. // Induction of spermidine/spermine Nl -acety 1 trans ferase by methylglyoxal bis(guanylhydrazone). Biochim. Biophys. Acta 1985. V. 842. P. 111-118.

44. Wallace H.M., Nuttall M.E., Robinson F.C. II Acetylation of spermidine and methylglyoxal bis(guanylhydrazone) in baby-hamster kidney cells (BHK-21/C13). Biochem. J. 1988. V. 253. P. 223-227.

45. Matsui I., PeggA.E. // Effect of inhibitors of protein synthesis on rat liver spermidine JV1-acetyltransferase. Biochim. Biophys. Acta 1981. V. 675. P. 373-378.

46. Casero Jr, R.A., PeggA.E. // Spermidine/spermine A^-acetyltransferase the turning point in polyamine metabolism. FASEB J. 1993. V. 7. P. 653-661.

47. Fogel-Petrovic M„ ShappellN.W., Bergeron R.J., Porter C.W. II Polyamine and polyamine analog regulation of spermidine/spermine Nx -acety Itransferase in MALME-3M human melanoma cells. J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 19118-19125.

48. Wang Y., Devereux W., Stewart T.M., Casero Jr, R.A. II Characterization of the interaction between the transcription factors human polyamine modulated factor (PMF-1) and NF-E2-related factor 2

49. Nrf-2) in the transcriptional regulation of the spermidine/spermine //-acety transferase (SSAT) gene. Biochem. J. 2001. V. 355. P. 45-49.

50. Erwin B.G., Persson L., PeggA.E. // Differential inhibition of histone and polyamine acetylases by multisubstrate analogs. Biochemistry 1984. V. 23. P. 4250-4255.

51. Libby P.R., Porter C.W. II Inhibition of enzymes of polyamine back-conversion by pentamidine and berenil. Biochem. Pharmacol. 1992. V. 44. P. 830-832.

52. Libby P.R., Munson B.R., Fiel R.J., Poter C. W. II Cationic porphyrin derivatives as inhibitors of polyamine catabolism. Biochem. Pharm. 1995. V. 50. P. 1527-1530.

53. Janrte J., Alhonen L., Pietila M, Keinanen T.A. II Genetic approaches to the cellular functions ofpolyamines in mammals. Eur. J. Biochem. 2004. V. 271. P. 877-894.

54. Chen Y., Kramer D.L., Jell J., Vujcic S., Porter C. W. II Small interfering RNA suppression of polyamine analog-induced spermidine/spermine-A^'-acetyltransferase. Mol. Pharmacol. 2003. V. 64. 1153-1159.

55. Alhonen L., Parkkinen J.J., Keinanen T., Sinervirta R., Herzig K.H., Janne J. II Activation of polyamine catabolism in transgenic rats induces acute pancreatitis. Proc. Natl Acad. Sci. USA 2000. V. 97. P. 8290-8295.

56. Rosenthal S.M., Tabor C. W. // The pharmacology of spermine and spermidine. Distribution and excretion. /. Pharmacol. Exp. Ther. 1956. V. 116. P. 131-138.

57. Loser C., Folsch U.R., Cleffmann U., Nustede R., Crenzfeldt W. 11 Role of ornithine decarboxylase and polyamines in camostate (Foy-305)-induced pancreatic growth in rats. Digestion 1989. V. 43. P. 98-112.

58. Alhonen L., Rasanen T.L., Sinervirta R., Parkkinen J.J., Korhonen V.P., Pietila M., Janne J. II Polyamines are required for the initiation of rat liver regeneration. Biochem. J. 2002. V. 362. P. 149-153.

59. Kaasinen K., Koistinaho J., Alhonen L, Janne J. II Overexpression of spermidine/spermine Nl-acetyltransferase in transgenic mice protects the animals from kainate-induced toxicity. Eur. J. Neurosci. 2000. V. 12. P. 540-548.

60. Kaasinen S.K., Grohn O.H., Keinanen T.A., Alhonen L., Janne J. II Overexpression of spermidine/spermine iV'-acetytransferase elevates the threshold to pentylenetetrazol-induced seizure activity in transgenic mice. 2003. Exp. Neurol. V. 183. P. 645-652.

61. Holtta E. II Oxidation of spermidine and spermine in rat liver: purification and properties of polyamine oxidase. Biochemistry 1977. V. 16. P. 91-100.

62. Lindsay G.S., Wallace H.M. U Changes in polyamine catabolism in HL-60 human promyelogenous leukaemic cells in response to etoposide-induced apoptosis. Biochem. J. 1999. V. 337. P. 83-87.

63. Lamond S., Wallace H.M. II Polyamine oxidase activity and growth in human cancer cells. Biochenu Soc. Trans. 1994. V. 22. P. 126-128.

64. Wang Y., Devereux W., Woster P.M., Stewart T.M., Hacker A., CaseroJr, R.A. H Cloning and characterization of a human polyamine oxidase that fs inducible by polyamine analogue exposure. Cancer Res. 2001. V. 61. P. 5370-5373.

65. Vujcic S., Diegelman P., Bacchi C.J., Kramer D.L., Porter C. W. II Identification and characterization of a novel flavin-containing spermine oxidase of mammalian cell origin. Biochem. J. 2002. V. 367. P. 665-675.

66. Vujcic S., Liang P., Diegelman P., Kramer D.L., Porter C.W. II Genomic identification and biochemical characterization of the mammalian polyamine oxidase involved in polyamine back-conversion. Biochem. J. 2003. V. 370. P. 19-28.

67. Murray-Stewart T„ Wang Y., Devereux W., CaseroJr, R.A. II Cloning and characterization of multiple human polyamine oxidase splice variants that code for isoenzymes with different biochemical characteristics. Biochem. J. 2002. V. 368. P. 673-677.

68. Bolkenius F.N., SeilerN. II Acetyl derivatives as intermediates in polyamine catabolism. Int. J. Biochem. 1981. V. 13. P. 287-292.

69. Bey P., Bolkenius F.N., Seiler N., Casara. P. II N-(2,3-Butadienyl)-l,4-butanediamine derivatives: potent irreversible inactivators of mammalian polyamine oxidase. J. Med. Chem. 1985. V. 28. P. 12.

70. SeilerN., Sarhan S„ Grauffel C„ Jones R., Knodgen B„ Moulinoux J.P. II Endogenous and exogenous polyamines in support of tumor growth. Cancer Res. 1990. V. 50. P. 5077-5083.

71. Bolkenius F.N., Bey P., SeilerN. II Specific inhibition of polyamine oxidase in vivo is a method for the elucidation of its physiological role. Biochim. Biophys. Acta 1985. V. 838. P. 69-76.

72. Sarhan S., Quemener V., Moulinoux J. P., Knodgen B., SeilerN. II On the degradation and elimination of spermine by the vertebrate organism. Int. J. Biochem. 1991. V. 23. P. 617-626.

73. Dai H., Kramer D.L., Murti K.G., Porter C.W., Cleveland J.L. II The polyamine oxidase inhibitor MDL-72,527 selectively induces apoptosis of transformed hematopoietic cells through lysosomotropic effects. Cancer Res. 1999. V. 59. P. 4944-4954.

74. Duranton B., Holl V., Schneider Y., Carnesecchi S., Gosse F., Raul F., Seiler N. // Cytotoxic effects of the polyamine oxidase inactivator MDL 72527 to two human colon carcinoma cell lines SW480 and SW620. Cell Biol. Toxicol. 2002. V. 18. P. 381-396.

75. Kramer D.L. // In: Polyamines in Cancer: Basic Mechanisms and Clinical Applications-, R.G. Landes/Springer: New York. 1996. P. 151-189.

76. Wang Y., Murray-Stewart T., Devereux W., Hacker A., Frydman B., Woster P.M., Casero Jr, R.A. II Properties of purified recombinant human polyamine oxidase, PAOhl/SMO. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. V. 304. P. 605-611.

77. Porter C. W., Sufrin J.R. II Interference with polyamine biosynthesis and/or function by analogs of polyamines or methionine as a potential anticancer chemotherapeutic strategy. Anticancer Res. 1986. V. 6. P. 525-542.

78. Frydman B., Valasinas A. II Polyamine-based chemotherapy of cancer. Exp. Opin. Ther. Patents. 1999. V. 9. P. 1055-1068.

79. Seiler N. II Thirty years of polyamine-related approaches to cancer therapy. Retrospect and prospect. Part 2. Structural analogues and derivatives. Curr. Drug Targets 2003. V. 4. P. 565-585.

80. Ha H.C., Woster P.M., Yager J.D., Casero Jr, R.A. II The role of polyamine catabolism in polyamine analogue-induced programmed cell death. Proc. Natl Acad. ScL USA 1997. V. 94. P. 11557-11562.

81. Nagarajan S., Ganem B., PeggA.E. II Studies of non-metabolizable polyamines that support growth of SV-3T3 cells depleted of natural polyamines by exposure to alpha-difluoromethylornithine. Biochem J. 1988. V. 254. P. 373-378.

82. Ask A., Persson L., Seller N., Heby O. II Antileukemic effects of non-metabolizable derivatives of spermidine and spermine. Cancer Lett. 1993. V. 69. P. 33-38.

83. Varnado B.L., Voci L.M., Meyer L.M., Coward J.K. // Circular dichroism and NMR studies of metabolically stablealpha-methylpolyamines: spectral comparison with naturally occurring polyamines. Bioorg. Chem. 2000. V. 28. P. 395-408.

84. Renault J., Lebranchu M., Anne Lecat A., Uriac P. II Solid-phase combinatorial synthesis of polyamine derivatives using aminoalcohol building blocks. Tetrahedron Lett. 2001. V. 42. P. 66556658.

85. Khomutov A.R., Vepsalainen J.J., Shvetsov A.S., Hyvonen T., Keinanen T.A., Pustobaev V.N., Eloranta T.O., Khomutov R.M. 11 Synthesis of hydroxylamine analogues of polyamines. Tetrahedron 1996. V. 52. P. 13751-13766.

86. Hyvonen T., Keinanen T.A., Khomutov A.R., Khomutov R.M., Eloranta T.O. II Monitoring of the uptake and metabolism of aminooxy analogues of polyamines in cultured cells by high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. 1992. V. 574. P. 17-21.

87. Bergeron R.J., Mutter R„ Huang G„ McManis J.S., Algee S.E., Yao H„ Weimar W.R., WiegandJ. II Synthesis and evaluation of hydroxylated polyamine analogues as antiproliferatives. J. Med. Chem. 2001. V. 44. P. 2451-2459.

88. Jauristi E.; Escalante J.; Lamatach B.; Seebach D. II Enantioselective synthesis of beta-amino acids. Preparation of the like stereoisomers of 2-methyl- and 2-benzyl-3-aminobutanoic acid. J. Org. Chenu 1992. V. 67. P. 2396-2398.

89. Estermann H., Seebach D. II Diastereoselektive Alkylierung von 3-Aminobutansaure in der 2-Stellung. Helv. ChinuActa 1988. V. 71. P. 1824-1839.

90. Furukawa M., Okawara T., Terawaki Y. II Studies on application of amino acid as medicinal agent. Reaction of amino acid ester with difunctional Grignard reagent. Chem. Pharm. Bull. 1977. V. 25. P.1319-1325.

91. Davies S.G., Ichihara O. II Asymmetric synthesis of/?-beta-amino butanoic acid and S-beta-tyrosine: homochiral lithium amide equivalents for Michael additions to alpha,beta-unsaturated esters. Tetrahedron: Asymmetry 1991. V. 2. P. 183-186.

92. Amoroso R., Cardillo G., Sabatino P., Tomasini C„ Trere A. II Lewis acid-promoted 1,4-addition to chiral imide derivatives in the synthesis of .beta.-amino acids. J. Org. Chem. 1993. V. 58. P. 5615-5619.

93. Mataunaga H., Sakamaki T., Nagaoka H., Yamada Y. II Enantioselective synthesis of (R)- and (S> 4-(methoxycarbonyl)-methyl.-2-azetidinones from D-glyceraldehyde acetonide. Tetrahedron Lett. 1983. V. 24. P. 3009-3012.

94. Liwschitz Y, Singeman A. 11 An asymmetric synthesis of Af-benzyl-D- aspartic acid. J. Chem. Soc. (C) 1966. P. 1200-1202.

95. GedeyS., LiljebladA., Fulop F., Kanerva L.T. II Sequential resolution of ethyl 3-aminobutyrate with carboxylic acid esters by Candida Antarctica lipase B. Tetrahedron: Asymmetry 1999. V. 10. P. 2573-2581.

96. Wang Y.-F., Izawa T., Kobayashi S„ Ohno M. II Stereocontrolled synthesis of (+)-negamycin from an acyclic homoallylamine by 1,3-asymmetric induction. J. Am. Chem. Soc. 1982. V. 104. P. 64656466.

97. Kozikowski A.P., Chen Y.-Y. II Intramolecular nitrile oxide cycloaddition (INOC) reactions in the indole series. Total synthesis of racemic and optically active paliclavine and 5-epi-paliclavine. J. Org. Chem. 1981. V. 46. P. 5248-5250.

98. Yamamoto Y., Komatsu T., Maruyama K. II Enantiodivergent 1,2- and 1,3-asymmetric induction in alpha- and beta-alkoxyimines via metal tuning and stereodifferentiation. /. Chem. Soc., Chem. Commun. 1985. P. 814-815.

99. Mukaiyama T. II In: Organic Reactions; Wiley: New York. 1982. V. 28. Chapter 3.

100. Wanner K.T., Hoefner G. // Chelat- und nicht-chelat-kontrollierte reduktionen von beta-amido-ketonen: Synthese nicht-racemischer 1,3-aminoalkohole mit pyrrolidinstruktur. Tetrahedron 1991. V. 47. P. 1895-1910.

101. Tramontini M. II Stereoselective synthesis of diastereomeric amino alcohols from chiral aminocarbonyl compounds by reduction or by addition of organometallic reagents. Synthesis 1982. P. 605-644.

102. Kokotos G. IIA convenient one-pot conversion of //-protected amino acids and peptides into alcohols. Synthesis 1990. P. 299-301.

103. Kulkarni Y.S. II Serine derivatives in organic synthesis. Aldrichimica Acta 1999. V. 32. P. 18-27.

104. Jejford C.W, Wang J. II An enantiospecific synthesis of beta-amino acids. Tetrahedron Lett. 1993. V. 34. P. 1111-1114.

105. Bergeron R.J., Neims A.H., McManisJ.S., Hawthorne T.R., Vinson J.R., Bortell R., Ingeno M.J. И Synthetic polyamine analogs as antineoplastics. J. Med. Chem. 1988. V. 31. P. 1183-1190.

106. Baillon J., Mamont P.S., Wagner J., Gerhart F., Lux P. II Fluorinated analogues of spermidine as substrates of spermine synthase. Eur. J. Biochem. 1988. V. 176. P. 237-242.

107. Хомутов A.P., Хомутов P.M. II Синтез аминооксианалогов путресцина и спермидина. Биоорган, химия 1989. Т. 15. С. 698-703.

108. Хомутов А.Р., Швецов А.С., Вепсалайнен Й„ Крамер Д. Л., Хивонен Т., Кейнанен Т.А., Эпоранта Т.О., Портер К.У., Хомутов P.M. II Новые аминооксианалоги биогенных полиаминов. Биоорган, химия 1996. Т. 22. С. 557-559.

109. Hyvonen Т., Keinanen Т.А., Khomutov A.R., Khomutov R.M., Eloranta Т.О. И Aminooxy analogues of spermidine evidence the divergent role of the charged amino nitrogens in the cellular physiology of spermidine. LifeSci. 1995. V. 56. P. 349-360.

110. Eloranta T.O., Khomutov A.R., Khomutov R.M., Hyvonen T. II Aminooxy analogues of spermidine as inhibitors of spermine synthase and substrates of hepatic polyamine acetylating activity. J. Biochem. (Tokyo). 1990. V. 108. P. 593-598.

111. Lin P.K.T., Maguire N.M., Brown DM. II Synthesis of novel oxa-isosteres of spermidine and spermine. Tetrahedron Lett. 1994. V. 35. P. 3605-3608.

112. Dixon H.B.F. 11 In: Orphan diseases and orphan drugs', Manchester University Press: Manchester. 1986. P. 23-32.

113. Tanabe R., Kobayashi M, Sugawara M, Iseki K., Miyazaki K. II Uptake mechanism of trientine by rat intestinal brush-border membrane vesicles. J. Pharm. Pharmacol 1996. V. 48. P. 517-521.

114. Schwarzenbach G. II Metallkomplexe mit Polyaminen III: Mit Triathylen-tetramin = trien. Helv. Chim. Acta. 1950. V. 33. P. 974-985.

115. Dixon H.B.F., Gibbs K„ Walshe J.M. II Preparation of triethylenetetramine dihydrochloride for the treatment of Wilson's disease. Lancet 1972. i. P. 853-854.

116. Tabor H„ Tabor C. W. II In Methods in Enzymology, Academic Press: New York. 1983. V. 94. P. 420-421.

117. Halangk W. 11 Trypsin activity is not involved in premature, intrapancreatic trypsinogen activation. Am. J. PhysioL Gastrointest. Liver Physiol 2002. V. 282. P. 367-374.

118. На Н.С., Yager J.D., Woster P.A., Casero Jr, R.A. И Structural specificity of polyamines and polyamine analogs in the protection of DNA from strand breaks induced by reactive oxygen species. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. V. 244. P. 298-303.

119. На H.C., Sirisoma N.S., Kuppusamy P., ZweierJ.L., Woster P.M., Casero Jr, R.A. II The natural polyamine spermine functions directly as a free radical scavenger. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998. V. 95. P.11140-11143.

120. Евдокимов Ю.М., Соляное В.К, Нечипуренко Ю.Д., Скуридин С.Г., Захаров М.А., Спенер Ф., Палумбо М. II Молекулярные конструкции с регулируемыми свойствами на основе двуспиральных нуклеиновых кислот. Молекулярная биология 2003. Т. 37. С. 340-355.

121. Stark P.A., Thrall B.D., Meadows G.G., Abdel-Monem М.М. И Synthesis and evaluation of novel spermidine derivatives as targeted cancer chemotherapeutic agents. J. Med. Chem. 1992. V. 35. P. 4264-4269.

122. Maniatis Т., SambrookJ., Fritsch E.F. И In: Molecular cloning: a laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989. P. 1.33-1.38, P. 1.40-1.44.

123. Салянов В.И., Кац Е.И., Евдокимов Ю.М. И Молекулярный дизайн на основе полирибо-нуклеотидов, фиксированных в структуре жидкокристаллической дисперсии и "сшитых" полимерными хелатными мостиками. Молекулярная биология 2000. Т. 34. С. 661-668.

124. Van Tamelen Е.Е., Brenner J.Е. II Structure of the anhydrobromonitrocamphanes. J. Am. Chem. Soc. 1957. V. 79. P. 3839-3846.