Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые модели транскрипции: Скачкообразное движение РНК-полимеразы в ходе элонгации и терминации транскрипции

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Новые модели транскрипции: Скачкообразное движение РНК-полимеразы в ходе элонгации и терминации транскрипции"

РГб од

1 4 МАЙ 1335

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

НУДЛЕР Евгений Александрович

НОВЫЕ МОДЕЛИ ТРАНСКРИПЦИИ: СКАЧКООБРАЗНОЕ ДВИЖЕНИЕ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ В ХОДЕ ЭЛОНГАЦИИ И ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ

(Специальность 03.00.03 - Молекулярная биология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1995

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН (Москва) и Институте здравоохранения (Нью-Йорк).

Научные руководители:

Ведущая организация: Кардиологический научный центр. Научно-исследовательский институт кардиологии им. А.Л. Мясникова.

Защита состоится 23 мая 1995 года в'' часов на заседании Специализированного совета Д Государственном научно-

исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-ый Дорожный проезд, дом 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГосНИИгенетика. Автореферат разослан_апреля 1995 г.

доктор биологических наук, профессор

кандитат биологических наук

В.Г. Никифоров М.В. Кашлев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук кандитат биологических наук

Р.С. Шакулов Л.И. Патрушев

Ученый секретарь Специализированного совета кандитат биологических наук \

В.И. Щербакова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

В настоящее время происходит радикальный пересмотр представлений о механизмах элонгациии и терминации транскрипции.

Согласно классической модели во время элонгации молекула РНК-юлимеразы Е.coli закрывает -30 п.н. ДНК-матрицы, при этом 17-18 п.н. в ДНК эасплетены. Растущий конец РНК комплементарно спарен с матричной нитью ДНК, формируя протяженный РНК-ДНК гетеродуплекс, который определяет стабильность тройного комплекса. Исключая возможность конформационных вменений в элонгационном комплексе, авторы классической модели считают, <то присоеденение каждого последующего нуклеотида к З'-концу РНК сопровождается монотонным движением фермента по матице. В рамках этой подели объясняется механизм факторнезависимой терминации. После фохождения РНК-полимеразой специальной последовательности с центральной симметрией в РНК-продукте возникает вторичная структура -«шпилька», приводящая к разрушению части РНК-ДНК гибрида. Оставшаяся теть гибрида, содержащая З'-концевую олиго-1)-последоватэльность в РНК, 1егко плавится ввиду относительной нестабильности rU-dA -пар. Это приводит к высвобождению РНК-продукта из комплекса (Yager и von Hippel , 1987,1991).

Результаты исследований последних лет поставили под сомнение саждое из утверждений традиционной модели. Ключевыми стали работы , 1емонстрирующие характерное изменение параметров тройного комплекса в ¡ависимости от его положения на матрице. Открытие и изучение феномена ждорибонуклеазной активности тройного комплекса, данные РНК-азного £>утпринта, а также подробное изучение свойств различных р-независимых ■ерминаторов указывают на то, что основную роль в удержании РНК в тройном (омплексе играет не протяженный РНК-ДНК гетеродуплекс, а белок-1уклеиновые взаимодействия (Chamberlin , 1994).

Разработка и применение новых экспериментальных систем, юзволяющих следить за конформационным состоянием молекулы РНК-юлимеразы во время элонгации и терминации транскрипции, дали бы юзможность понять реальные механизмы, лежащие в основе этих процессов.

Цель работы и задачи исследования.

Целью работы являлось построение структурно-функциональной модели )лонгации и р-независимой терминации транскрипции РНК-полимеразы E.coli.

В работе ставились следующие задачи: 1) создать эффективную жепериментальную систему in vitro для выявления и подробного биохимического анализа интермедиатов элонгации и терминации

транскрипции. Для создания такой системы было необходимо : а) отработать метод «шагания», т.е. научиться получать серии гомогенных тройных комплексов на любом желаемом участке ДНК-матрицы, используя иммобилизованный на твёрдом носителе фермент РНК-полимеразы; б) сконструировать оптимальные ДНК-матрицы для выполнения реакции «шагания» . 2) с помощью методов РНК и ДНК футпринта охарактеризовать структурно-функциональные элементы молекулы РНК-полимеразы в разных элонгационных комплексах.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Настоящая работа представляет собой систематизированный биохимический анализ структуры тройного комплекса РНК-полимеразы E.coli во время элонгации и терминации транскрипции.

На основе представленных в работе экспериментальных данных предложена модель, описывающая неравномерный характер движения молекулы РНК-полимеразы по ДНК-матрице. Согласно этой модели, во время элонгации, молекула фермента находится в двух альтернативных конформационных состояниях, напряжённом и релаксированном. Релаксированное состояние не обнаруживает несоответствий между поступательным движением по матрице и ростом РНК-продукта. Напряженное состояние возникает в ответ на специфические сигналы, закодированные в ДНК, и характеризуется временным прекращением движения молекулы фермента, в то время как синтез РНК продолжается. В результате создается гипотетическое напряжение, приводящее к прыжку передней границы молекулы РНК-полимеразы вперёд сразу на несколько нуклетидов и переходу в релаксированное состояние.

В работе также показано, что переход из напряжённого состояния в релаксированное есть неотъемлемый элемент действия р-независимых терминационных сигналов.

Предлагаемая модель элонгации является, по-видимому, универсальной для эукариотических и прокариотических РНК-полимераз. Возможно, что с её помощью удасться понять молекулярные механизмы регуляции транскрипции, основанные на взаимодействии с ферментом во время синтеза РНК.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 108 страницах машинописного текста и содержит 12 рисунков и 3 таблицы. Библиография включает в себя 107 названий, в том числе 4 русских и 103 иностранных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Структурно-функциональный анализ интермедиатов

элонгации транскрипции

1.1. Технология получения гомогенных элонгационных комплексов с использованием иммобилизованного Фермента РНК-полимеразы.

Введение методами генной инженерии нескольких последовательных остатков гистидина на С- или Ы-конец белка позволяет иммобилизовать белок на сорбенте, содержащем ионы никеля (НосИиН и сотр.. 1987). Недавно этот метод был успешно применен для иммобилизации функциональной РНК-полимеразы с удлиненной р -субъедичицей, несущей на С-конце шесть гистидиновых остатков (КаБЫеу и сотр., 1993). Все биохимические операции с таким ферментом могут быть выполнены в тверцоазазной системе, что позволяет быстро менять любые компоненты реакционной смеси путем повторения процедуры отмывок. Меняя комбинации рибонуклеотидов |имея, по крайней мере, один исключённым из реакции) , можно шаг за шагом осуществлять транскрипционную реакцию в соответствии с последовательностью ДНК-матрицы. Такой метод «шагания», будучи оптимизирован для конкретной экспеоиментальной системы, позволяет получать индивидульные тройные комплексы практически на любом расстоянии от места старта транскрипции.

Используя этот метод, удалось охарактеризовать значительное число гомогенных тройных комплексов на нескольких родственных ДНК-матрицах.

1.2. Система анализа параметров отдельного элонгационного комплекса.

Для характеристики любого изолированного тройного элонгационного

комплекса (далее обозначаются - ТК) был применен ряд стандаотных биохимических процедур. Это позволило выделить и картировать следующие функциональные элементы ТК: 1) 3-конец РНК-продукта. Этот параметр (обозначается - 3', рис.1 А) определяется длиной транскрипта. Он известен с самого начала, т.к. в процессе реакции «шагания» вдоль известной последовательности фермент был остановлен в выбранном месте. 2) Передняя граница тройного комплекса (обозначается - П). Чтобы установить этот параметр был использован 3'->5' экзонуклеазный футпринт нематричной цепи ДНК (рис.1 А). Домен, формирующий переднюю границу, на схеме изображен в виде цилиндра. 3) Положение каталитического центра фермента (обозначается - К, рис.1 А). Как правило, каталитический центр находится

вместе с З'-концом РНК-продукта, однако, в определенном случае (буде-обсуждаться ниже) предполагается физическое расстояние между этим1> двумя элементами, поэтому введены разные обозначения (К и 3'). 4] Состояние РНК в комплексе детектируется, используя недавно открытый фактор раскуса йгеВ (ВогикИоу и сотр.,1993). Этот фактор индуцирует специфическое разрезание транскрипта в элонгационном комплексе (рис.1 Б). После того как произошел раскус, 5'-концевая часть РНК остается связанной с ферментом, определяя тем самым сайт прочного связывания транскилта (СПС), тогда как З'-концевой фрагмент РНК немедленно диссоциирует из комплекса, освобождая сайт слабого связывания (ССС). Таким образом, место раскуса отражает распределение проксимальной части транскрипта между сильным и слабым сайтами связывания (ВогиМоУ е! а!., 1993). В то же время, раскус генерирует новый З'-конец РНК, который может быть элонгирован в присутствии субстратов.

З'-П

5' РНК

Рис.1. Схема, демонстрирующая элементы элонгационного комплекса и способы их определения.

4.3-

Необходимо также отметить, что чувствительность комплекса к вгеВ сама по себе является дискриминирующим фактором. Комплексы, в которых сайт слабого связывания свободен, сравнительно устойчивы к раскусу.

Зная координаты всех четырех функциональных элементов ТК, можно определить относительные расстояния между ними, беря за единицу измерения один нуклеотид.

1.3. Определение характера движения РНК-полимеразы во время элонгации с помощью экзонуклеакзного ДНК-футпринтинга.

На рисунке 2 представлен эксперимент, устанавливающий расстояние между 3' концом транскрипта и передней границей фермента (3'~П) для серии эпонгационных комплексов, остановленных на участке матрицы от позиции +47 до +60, считая от точки +1 начала транскрипции. Авторадиограмма демонстрирует картирование передней границы с помощью экзонуклеазы III. Цифры над дорожками указывают длину транскриптов, обозначая позиции 3'-концевого основания РНК в комплексах. Видно, что движение РНК-полимеразы от +47 до +53 монотонно. Присоединение каждого отдельного нуклеотида к РНК сопровождается перемещением передней границы фермента на один нуклеотид относительно ДНК, так что расстояние между П и 3' остается постоянным и равняется 18 нуклеотидам (см. таблицу в левой части рисунка). Однако, начиная с позиции +53, движение передней границы

Рис.2. Движение РНК-полимеразы через участок матрицы от +47 до +60 положения. Авторадиограмма электрофоретической картины защиты 5'- згр-меченой нематричной нити ДНК в тройных комплексах (TK) от расщепления экзонуклеазой III. В левой части рисунка изображена ДНК-последовательность, в пределах которой картированы продукты экзонуклеазного расщепления. Результаты картирования представлены в таблице яркими цифрами («П» -колонка). Соответствующие длины РНК-транскриптов указаны в «3'» - колонке, а также над дорожками. Здесь и далее, приведенные значения длин, как для РНК так и для ДНК, выражены относительно +1-точки старта транскрипции.

3' П

ДНК

вперед прекращается, тогда как рост РНК продолжается. В позиции +56 видно даже смещение П на 2 нуклеотида назад, так что у +56 ТК значение 3'~П становится равным всего 12 нуклеотидам. От +56 до +57 транскрипт удлинися на один нуклеотид, при этом наблюдался прыжок передней границы сразу на 7 нуклеотидов. В результате, восстановилось прежнее значение 3'~П - 18 нуклеотидов. Такой тип движения РНК-полимеразы был назван скачкообразным. Далее, от позиции +57 до +60 РНК-полимераза продолжала двигаться монотонно в полном соответствии с ростом цепи РНК . Таким образом, на участке от +47 до +60 элонгирующий фермент переключился с одного типа движения на другой и обратно.

1.4. Определение состояния РНК в элонгационных комплексах.

Для дальнейшего анализа были выбраны +52-ТК и +56-ТК в качестве модельных элонгационных комплексов, отражающих монотонный и скачкообразный типы движения РНК-полимеразы соответственно . Рисунок 3 демонстрирует эксперимент , в котором фактор раскуса GreB использовался в качестве пробы на состояние РНК в этих комплексах. Верхняя панель показывает положение передней границы до и после обработки GreB, нижняя -длину РНК транскрипта. Видно, что два комплекса сильно отличаются по чувствительности к GreB: +52-ТК устойчив к умеоенным концентрациям GreB (до 1,5 GreB молекул на комплекс), тогда как на порядок меньшей дозы фактора достаточно, чтобы укоротить транскрипт +56-ТК на 4 нуклеотида (нижняя панель). В результате разрезания передняя граница +56-ТК сместилась на два нуклеотида вперед (верхняя панель) так, что ее положение совпало с П для +52-ТК. а значение З'-П стало 18 нуклеотидов.

В присутствии высоких доз GreB (более 6.0 GreB молекул на комплекс) оба комплекса, исходный +52-ТК и +52-ТК, полученный из +56-ТК, ведут себя схожим образом. РНК постепенно укорачивается с З'-конца на 1 - 2 нуклеотида, что сопровождается синхронным движением передней границы назад.

Существование двух уровней чувствительности к GreB было интерпретировано как отражение двух разных феноменов: в одном случае раскус индуцирует внутремолекулярную перестройку в тройном комплексе (рис. 1 Б), в другом - приводит к обратному движению РНК-полимеразы.

На основе приведенных экспериментальных данных были выделены два типа элонгационных комплексов. К первому типу относились комплексы, характеризующие монотонный тип движения. 3'~П параметр для них равен 18 нуклеотидам, они относительно устойчивы к GreB и, следовательно, не содержат РНК в сайте слабого связывания. Такие комплексы были названы

»релаксированными». Комплексы, относящиеся ко второму топу, имеют значение 3'~П <18. Они чувствительны к вгеВ, содержат РНК б сайте слабого связывания и формируются во время скачкообразного движения. Комплексы с такими характеристиками были названы «напряженными». Причины выбора терминов «релаксированный» и «напряженный» будут обсуждены ниже.

Рис.3. Раскус РНК в элонгационных комплексах +52-ТК и +56-ТК. В верхней

части рисунка, для каждого из комплексов указано молярное соотношение - вгеВ фактор/РНК-полимераза . Нижняя панель показывает длину 5'-з^Р-меченого транскрипта в комплексе до и после обработки ОгеВ. Верхняя панель представляет результаты экзонуклеазнго аэутпринта обработанных втеВ комплексов.

Таблица 1 суммирует данные о 26 элонгационных комплексах, полученных на отдельной ДНК-матрице. Для каждого из них были установлены параметры: П. 3' , Р (место раскуса), 3'~П и Р~3', а также относительная чувствительность к ОгеВ. Из таблицы видно, что на определенном участке ДНК длиной 60 нуклеотидов РНК-полимераза три раза находится в фазе монотонного движения ( +32 - +52, +57 - +67 и +75 - +80) и три раза в фазе скачкообразного движения ( +20 - +30, +53 - +56 и +70 - +73 ).

Таблица 1. Относительные параметры элонгационных комплексов, полученных на матрице 1.

т п т п чувствитель- тип

-3 " ность к йгеВ 0 комплекса

20 39 19 -/+ но. релакс.

23 39 16 ++ н.о. напряж.

25 39 14 ++ и.о. напряж.

27' 39 12 ++ н.о. напряж.

30 48 18 -/+ 1-2 релакс.

32 50 18 1-2 релакс.

35 53 18 -/+ 1-2 релакс.

36 54 18 -/+ 1-2 релакс.

40 58 18 - 0 • релакс.

44 62 18 - 0 релакс.

47 65 18 - 0 релакс.

50 68 18 -/+ 1- 2 релакс.

51 69 18 -/+ 1- 2 релакс.

52 70 18 -/+ 1- 2 релакс

53 71 18 1- 2 релакс

54 70 16 ++ 2 напряж.

56" 68 12 ++ 4 напряж.

57 75 18 -¡л 1-2 релакс.

58 76 18 -/+ 1-2 релакс.

59 77 18 - 0 релакс.

60 78 18 - 0 релакс.

67 86 19 -/+ 1-2 релакс.

70 89 19 - 0 репакс.

73 89 16 ++ 2 напряж.

75 93 18 -/+ 1-2 релакс.

80 98 18 -/+ 1-2 релакс.

-скачок

монотонное движение

>

—скачок

монотонное движение

>

-<—скачок

монотонное движение

Определения параметров даны в тексте. Напряженные комплексы выделены ярким шрифтом. Звездочкой отмечены комплексы, склонные к спонтанной инактивации. Различие между ++ и +/- уровнями чувствительности к вгеВ примерно в 200 раз. Устойчивость комплекса к любым количествам вгеВ обозначена минусом.Схема в правой части таблицы интерпретирует данные в виде альтернативных фаз движения. Обозначение «н.о.» показывает, что данный параметр не определен достоверно.

1.5. Выяснение роли последовательности ДНК в детерминировании характера элонгации.

Какова природа сигнала, определяющего «выбор» молекулы РНК-

полимеразы между релаксированным и напряженным состояниями во время элонгации? Чтобы ответить на этот вопрос, реакция «шагания» была выполнена параллельно на двух родственных транскрипционных матрицах, отличающихся по последовательности начиная с позиции +75. Результаты этого эксперимента представлены на рисунке 4. На первой (стандартной) матрице РНК-полимераза движется через участок +70 - +80 скачкообразно (рис.4, левая панель). Комплексы, остановленные в позициях +70 и +73,имеют одно и тоже положение передней границы. При переходе из +73 в +75 передняя граница прыгает сразу на четыре нуклеотида. Таким образом, +73-ТК должен быть в напряженном состоянии. Однако, на второй матрице передняя граница РНК-полимеразы движется через этот же участок монотонно, в соответствии с ростом РНК (рис.4, правая панель). Значит, +73-ТК в данном случае оказывается релаксированным. Анализ РНК этих комплексов подтверждает сделанные заключения: +73-ТК, полученный на первой матрице.

3' | П

Матрица 1

37 60

67 ¡70[7 3

75

З'.П

Матрица 2

JK 47 57 60 67

t Г

70

73! 75

ДНК

Рис.4. Эффект изменения последовательности ДНК после позиции 75 на кон-срормацию +73-ТК. Авторадиограммы демонстрируют защиту ДНК от экзонукпеазы II! в комплексах, полученных на двух разных матрицах. С левой стороны от каждой авторадиограммы изображена последовательность ДНК, в пределах которой картированы продукты экзонуклеазного расщепления. Завершающая часть участка, идентичного у матриц 1 и 2. выделена ярким шрифтом.

оказался более чем в 100 раз чувствительнее к вгеВ раскусу, чем+73-ТК на второй матрице. Пои этом оба +73-ТК имеют РНК-транскрипты идентичной последовательности.

Таблица 2 суммирует данные сравнительного анализа элонгационных комплексов, принадлежащих двум матрицам.

Таблица 2. Эффект изменения последовательности ДНК на параметры элонгационных комплексов, полученных в районе +47 - +75.

3' П З'-П чувствительность к GreB тип комплекса

i: 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2

47 47 5757 60 60 67 67 70 70 73 73 75 75

65 65 75 75 78 78 86 86 89 89 89 92 93 93

18 18 18 18 18 18 19 19 19 19 16 19 18 18

-/+

-/+

-/+ -/+

++

-/+

релакс.

релакс.

релакс.

релакс.

релакс.

напряж.

релакс.

релакс. релакс. релакс. релакс. релакс. релакс. релакс.

На основе этих данных был сделан вывод, что сигнал, определяющий конформационное состояние РНК-полимеразы. локализован в ДНК, в еще непротранскрибированном районе.

1.7. Изучение свойств спонтанно инактивирующихся элонгационных комплексов.

В процессе исследования было замечено следующее интересное обстоятельство: последний комплекс на каждом участке скачкообразного движения проявлял склонность к спонтанной инактивации в стандартных условиях. Примером может служить +56-ТК на рисунке 2: часть сигнала радиоактивности, соответствующего +56-ТК, остается во всех последующих дорожках, т.е. определенная фракция этого комплекса теряет способность удлинять РНК при добавлении субстратов. Такие инактивированные тройные комплексы продолжают быть полностью стабильными (т.е. не диссоциируют в процессе длительной инкубации). Следуя установленной терминологии (Arndt К. and Chamberlin М., 1990), они были названы тупиковыми элонгационными комплексами (ТЭК). ТЭК проявляет все свойства напряженного комплекса. Он имеет такое же положение передней границы, что и исходный активный напряженный комплекс, и так же чувствителен к низким концентрациям GreB. Раскус приводит к высвобождению З'-инкремента из сайта слабого связывания

А

время| о

(л

(мин)

Рис.5. (А) Временная кинетика спонтанной инактивации злонгационных комплексов. Комплексы, полученные на участке от +20 до +30 положения, инкубировались при 37°С в течении указанного времени в отсутствии рибонуклеозидтрифосфатов (НТФ). Затем недостающие субстраты были добавлены к каждому из комплексов до конечной концентрации 50иМ и реакция чейза велась в течении 5 минут. Комбинации НТФ для каждого комплекса были подобраны так, чтобы удлинение РНК при чейзе не превышало нескольких нуклеотидов. (Б) Схема изображает предполагаемую структурную перестройку, приводящую к инактивации напряженного элонгационного комплекса.

и формированию нового З'-конца (данные не приведены). Образующийся в результате раскуса тройной комплекс оказывается полностью активным. Эксперименты, представленные на рисунке 5, демонстрируют кинетику образования тупиковых комплексов в фазе скачкообразного движения, +20+27. За одно и тоже время +23-ТК инактивировался всего на 10%, +25-ТК - на 50%, а +27-ТК на 80%, т.е. инактивация постепенно усиливается к концу фазы. Но, как только РНК-полимераза переключилась на монотонный тип движения (в положении +30, см. таблицу1), процесс инактивации полностью прекратился. На основе этих наблюдений был сделан вывод о наличии гипотетического напряженного состояния, которое характеризует РНК-полимеразу во время прохождения фазы скачкообразного движения. Чем ближе комплекс подходит к концу фазы, тем напряженнее он становится. Остановка фермента в напряженном состоянии ведет к постепенному снятию напряжения за счет потери активности.

Схема к рисунку 5 иллюстрирует вероятный ход событий в процессе инактивации напряженного комплекса. Соеденив каталитический центр пружиной с доменом, формирующим переднюю границу, мы тем самым вводим элемент напряжения. Так как во время фазы скачкообразного движения передний домен неподвижен, а каталитический центр должен перемещаться, сопровождая растущий конец РНК, происходит сокращение пружины. Во время движения, накопленное таким образом напряжение, реализуется в прыжке переднего домена вперед. Однако, остановка РНК-полимеразы, очевидно, исключает эту возможность релаксации. Остается альтернативный вариант: каталитический центр теряет З'-конец РНК и под действием пружины смещается назад - комплекс инактивируется. Существование такого фактора как йгеВ позволяет РНК-полимеразе выйти из тупикового состояния посредством генерирования нового З'-конца РНК, доступного для каталитического центра.

1.8. Модель дискретной элонгации транскрипции.

Модель, основанная на выше изложенных экспериментальных данных, представляет молекулу РНК-полимеразы как гибкую молекулярную машину, способную находиться в разных конформационных состояниях во время элонгации транскрипции. Предпочтительное релаксированное состояние сменяется напряженным, как только фермент встречает соответствующий сигнал на своем пути. Предполагается, что конформационный переход осуществляется в результате временного «зацепления» ДНК-связывающего домена на определенных последовательностях ДНК. В таких случаях

подвижный каталитический центр заполняет сайт слабого связывания транскрипта, поэтому синтез РНК не прекращается. Этот процесс сопровождается ростом внутримолекулярного напряжения. Когда напряжение становится достаточно большим, происходит прыжок ДНК-связывающего домена вперед. Сайт прочного связывания транскрипта жестко связан с ДНК-связывающим доменом, поэтому в результате прыжка новосинтезированная РНК транслоцируется в этот сайт (рис.9 А).

Данная модель согласуется с гипотезой, впервые сформулированной М. Чемберленом (Chamberlin,1994), что заполнение и «разгрузка» сайта слабого связывания РНК и прыжок передней границы являются отражением одного и того же процесса. В то же время, результаты этой работы противоречат ключевому постулату модели Чемберлена, что скачкообразное движение есть собственно механизм элонгации. Скорее, это лишь случайное событие, диктуемое сигналами в ДНК. В отсутствии таковых сигналов элонгация протекает монотонно.

Феномен образования тупиковых комплексов во время элонгации in vitro был описан и для эукариотической РНК-полимеразы II. Как и в случае РНК-полимеразы Е.соИ , спонтанно инактивированные комплексы характеризовались высокой чувствительностью к фактору раскуса, обработка которым приводила к вырезанию З'-инкремента и активировала комплекс (Gu и сотр.,1993). Было также показано, что раскус не приводит к сдвигу передней границы назад. Прямая корреляция между свойствами про- и эукариотических РНК-полимераз во время синтеза РНК может означать, что обсуждаемый в данной работе механизм элонгации является универсальным.

Необходимо также отметить, что все выводы, сделанные в работе, базируются на анализе остановленных комплексов, тогда как кинетическая картина элонгации, возможно, более сложная. Указание на то, что свойства движущейся через точку X молекулы РНК-полимеразы могут отличаться от свойств этой же молекулы, остановленной в точке X, основано на результатах изучения действия фактора терминации Ale фага Т4 (Kashlev и сотр., 1993). Ale вызывает эффективную терминацию транскрипции, только в том случае, если РНК-полимераза элонгирует в присутствии высокой конценрации рибонуклеотидов, то есть, когда скорость движения фермента по матрице максимальна. При низкой концентрации субстратов, когда элонгация сопряжена с частыми паузами, эффект Ale частично или полностью супрессируется. Если остановить РНК-полимеразу, а затем в присутствии Ale дать ей возможность возобновить быструю элонгацию (добавить в реакционную смесь недостающие субстраты в высокой концентрации), то сайты действия

фактора, расположенные в нескольких нуклеотидах впереди от места остановки, исчезнут. Эти данные указывают на то, что даже кратковременная остановка движения молекулы РНК-полимеразы приводит к структурной перестройке, делающей эту молекулу временно некомпетентной к действию Ale (Kashlev и сотр., 1993).

Глава 2. Изучение природы факторнезависимых терминационных сигналов на примере tRZ-терминатора фага

До настоящего времени остается загадкой каким образом чрезвычайно стабильный элонгационный комплекс диссоциирует на составные части в ответ на специфические сигналы, закодированные в ДНК. Терминационный сигнал состоит из специальной последовательности с центральной симметрией, сразу за которой следуют несколько Т подряд. В результате транскрипции этого участка в РНК формируется вторичная структура «шпилька», необходимая для терминации. Согласно классической модели элонгации/терминации наличие шпильки в сочетании с олиго-U приводит к разрушению РНК-ДНК гетеродуплекса, который определят стабильность тройного комплекса при элонгации. Таким образом, терминация рассматривается как термодинамический процесс, в котором сама молекула РНК-полимеразь1 играет лишь пассивную роль. Однако, ряд наблюдений последних лет (Chamberlin, 1994), а также результаты настоящей работы противоречат классической модели.

2.1. Получение и биохимический анализ тройных комплексов в районе tR2-TepMHHaTOpa. Определение компетентного к терминации состояния РНК-полимеразы.

Система «шагания» дает уникальную возможность получать и анализировать тройные комплексы, остановленные непосредственно в районе терминатора. С этой целью была сконструирована ДНК-матрица (матрица 1), гда на расстоянии 80 п.н. от старта транскрипции находилась последовательность 1Н2-терминатора фага Олиго-Т элемент tR2-терминатора, находящийся между +98 и +106 положениями на матрице, прерывается одним А в положении +103 (рис. 6 А), что позволяет останавливать РНК-полимеразу в пределах этого участка. На рисунке 6 (А) представлен эксперимент, в котором комплексы, остановленные в начале (+97-ТК), в середине (+102-ТК) и ^ конце олиго-Т (+106-ТК) были исследованы по двум параметрам: стабильность ( способность удерживать РНК в процессе

промывки сорбента) и чувствительность к фактору раскуса СгеВ. +97-ТК был стабилен (дорожка 2) и устойчив к умеренным дозам бгвВ (дорожка 3) . При добавлении в реакционную смесь трех нуклеозидтрифосфатов, АТФ, УТФ и ЦТФ, часть +97-ТК образовала терминированные продукты в позициях +104 и + 105, и часть удлинила РНК до 110 нуклеотидов (дорожка 4). +102-ТК оказался крайне чувствителен к вгеВ. В результате реакции раскуса транскрипт укоротился на 5 нуклеотидов с З'-конца (дорожка 7). Чейз +102-ТК в присутствии АТФ, УТФ и ЦТФ привел к образованию тех же продуктов, что и в случае +97-ТК (дорожка 8). В результате процедуры отмывки сигналы радиоактивной РНК, соответствующие длине 104,105 и 106 нуклеотидов, практически исчезли (дорожка 10), т.е. транскрипты, полученные в реакции «шагания» до +106 положения диссоциировали из комплексов. Небольшая фракция недиссоци-ированной РНК оказалась чувствительной к СгеВ (104, 105 и 106-нуклеотидные транскрипты в результате раскуса стали длиной 97 нуклеотидов) и неспособной удлиняться при добавлении субстратов (дорожки: 11, 12). Следовательно, эта РНК принадлежала тупиковым комплексам, сформированным на точках терминации. Наконец, +110-ТК, остановленный за терминатором (дорожки: 8 -12) был полностью стабилен и устойчив к СгеВ.

На основе этих данных +97-ТК и +110-ТК были классифицированы как релаксированные комплексы, +102-ТК - как напряженный, тогда как +104-ТК -+106-ТК не могли быть проанализированы из-за нестабильности.

Эти выводы были подтверждены картированием передней границы РНК-полимеразы в комплексах +95 - +106 с помощью экзонуклеазного ДНК-футпринтинга. Как видно из рисунка 6 (Б) передняя граница двигалась монотонно, на расстоянии 18 нуклеотидов от растущего конца РНК (дорожки: 1, 2) пока фермент не достиг начала олиго-Т (+97) . Далее , при формировании + 102-ТК, передняя граница не двигалась вперед (дорожка 3), а даже сместилась на два нуклеотида назад, так что 3'~П параметр в этом случае стал равным всего 11 нуклеотидам (см. таблицу в левой части рисунка). Сигнал от передней границы +106-ТК не был получен, что является следствием терминации и диссоциации ксмллекса ДНК-фермент (дорожка 4).

На основе этих экспериментов был сделан вывод, что при прохождении через последовательность терминатора РНК-полимераза входит в фазу скачкообразного движения, которая совпадает с началом транскрипции олиго-Т-элемента. Таким образом, рост напряжения, сопутствующий скачкообразному движению, предшествует акту терминации.

А

Матрица 1

ТК 97 102 106 110

отмывка -1 - - + - + - +

йгеВ + -

НТФ Ц

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

110106102-

с

Т К и

1 »» и

и и и

и и

УСЗиССЙСА

фОСАСЭСС

€2)

сэ

с

С2>

РНК

Б ГПШ

97 95,102

115113-

95 97 102 106

ДНК

Рис.6. «Прохождение» элонгационного комплекса через 1В2-терминатор.

(А) Авторадиограмма демонстрирует транскрипты в четырех иммобилизованных комплексах до (дорожки: 1. 5, 9, 13) и после (дорожки: 2, 6, 10, 14) процедуры отмывки сорбента. Отмытые комплексы были обработаны . йгеВ или чейзированы в присутствтуказанных нуклеозидтрифосфатов. Последовательность РНК ИЗг-терминатора представлена в левой части рисунка. Точки терминации в положениях 104,105 и 106 отмечены стрелками. (Б) Экзонуклеазный ДНК-футпринт элонгационных комплексов, остановленных в районе 1В2-терминатора. Результаты картирования продуктов экзонуклеазного расщепления представлены в таблице.

В каком состоянии находится тройной комплекс в момент терминации: остается ли он максимально напряженным, или релаксация есть событие, предворяющее терминацию? Чтобы ответить на этот вопрос необходимо было

выполнить анализ терминирующего комплекса.

Для того, чтобы остановить транскрипцию непосредственно на природной точке терминации (+104 или +105 положение), был использован сайтспецифичный ДНК-связывающий белок, блокирующий движение РНК-полимеразы. Этот белок, EcoR1(Q-111), представляет собой мутантный фермент рестриктной эндонуклеазы EcoR1, который прочно связывается со своим сайтом на ДНК, но не способен осуществить эндонуклеолитический разрыв (Wright и сотр., 1989). Сайт для EcoR1 был расположен таким образом (матрица 4), чтобы связанный EcoR1(Q-111) блокировал синтез РНК строго на точке терминации. Как видно из рисунка 9 А. в отсутствии блока терминация транскрипции осуществляется в позициях +104, +105 (дорожка 1). На обоих сайтах РНК диссоциирует из иммобилизованных комплексов, поскольку в результате процедуры отмывки соответствующие сигналы радиоактивности исчезают (дорожка 2). EcoR1(Q-111) препятствовал удлинению РНК более чем на 104 нуклеотида (дорожка 3). Центральным наблюдением являлось то, что из блокированного на точке терминации комплекса высвобождения транскрипта не происходило (дорожка 4). +104-ТК оставался стабильным в течение продолжительного времени, несмотря на то, что содержал все необходимые для терминации элементы: РНК-шпильку и З'-олиго-и-последовательность. При этом блокированный комплекс находился в напряженном состоянии, поскольку оказался крайне чувствительным к GreB раскусу (дорожка 5).

EcoR1(Q-111) мог быть полностью удален посредством кратковременного повышения ионной силы в пробе. Такая процедура приводила к немедленной диссоциации основной части +104-ТК (дорожка 6). Оставшаяся в комплексе РНК оказывалась чувствительной к GreB (дорожка 7) и не удлинялась при добавлении субстратов, что свидельствовало о принадлежности ее тупиковому комплексу.

На основе этих данных было сделано предположение, что EcoR1(Q-111) препятствует диссоциации терминационного комплекса, предотвращая прыжок переднего домена, т.е. запрещая релаксацию (рис.7, Б). Чтобы прямо проверить эту гипотезу необходимо было установить параметры +104-ТК терминирующего комплекса после удаления EcoRi(Q-111)-6noKa. Анализ +104-ТК в реальном времени мог быть выполнен только при условии снижения скорости его терминации. С этой целью, терминаторная РНК-шпилька была дестабилизирована посредством включения в ее ствол остатков инозина вместо гуанозина. В таких условиях, блокированный +104-ТК был полностью стабилен и крайне чувствителен к GreB. В результате же кратковременного увеличения ионной силы в пробе, удаляющей EcoR1(Q-111), +104-ТК

становился устойчив к низким дозам вгеВ и, следовательно, релаксировал.

Суммируя результаты экспериментов с использованием ЕсоЯ1(0-111). можно заключить, что релаксация напряженного комплекса на точке терминации и его диссоциация - это связанные процессы.

А

Матрица 3

Есот (0-111)] +

отмывка I — - ! + + ! - +

КС1 - отмывка ! - I + *

вгеВ - — — — + I — +

~Г105ь. 1 104*" 97 — 1 2 з I 4 5 | 6 | 7

в —

блокированный комплекс

о-сьооооооо

ЕсоЯ1(0)

Рис.7. Эффект блокирования транскрипции на точке терминации. Матрица 3 содержит ЕсоЯ1 рестрикционный сайт на расстоянии 15 п.н. впереди + 104 положения. (А) Авторадиограмма представляет РНК-продукты, синтезированные в отсутствии или в присутствии ЕсоЯ1(0-111). К комплексу. содержащему меченный ЗО-нт.-РНК-транскрипт, были добавлены 250 цМ НТФ. После 5 минут реакции чейза комплекс был отмыт стандартным буфером и обработан вгеВ и 700тМ КС1 (последовательность операций указана на рисунке). (Б)Схема блокированного напряженного комплекса. Есот (0-1 п) (черный цилиндр) препятствует релаксации, предотвращая прыжок переднего домена.

2.2. Выяснение роли каждого из элементов терминатора в отдельности.

С целью определения роли РНК-шпильки и олиго-Т-лсследовательноста в индуцировании напряжения в районе терминатора были сконструированы транскрипционные матрицы, содержащие каждый из этмх элементов в отдельности. Когда «шагание» было выполнено на матрице, где последовательность, кодирующая РНК-шпильку была удалена (матрица 2), наблюдалось скачкообразное движение РНК-полимеразы через олиго-Т с теми же параметрами, что и в случае интактного (Я2-терми«атора (матрица 1. см.рис.6). На матрице 3 удлинение транскрипта от +75 да +80 (соответствует +97 - +102 на матрице 1) сопровождалось сдвигом передней границы назад на два нуклеотида так, что параметр 3~П становился раенкм 11 нуклеотидам. +84-ТК (соответствует +106-ТК на матрице 1) имеет П~3*=18. что отражает релаксацию и прыжок передней границы. Эти наблюдения подтверждены тем. что +80-ТК был чувсвителен к ЭгеВ, а +75-ТК и ^34-ТК - относительно устойчивы к действию фактора.

Таким образом. РНК-шпилька не принимает участия в определении характера движения фермента через терминатор.

Матрица 4

тк 101 Ю5 108

время (мин 20 5 20 | 20 5 20 20 5 20

НТФ - + + + + - + +

158-1 106 "Н а \ а *— э бсасссс азисазэа «а свйЗвйИ

Рис.8. Дестабилизационный эффект РНК-шпильки на элонгационный комплекс Матрица 4 была получена на основе матрицы 1 делетированием олиго-Т. Новая последовательность указана в левой части рисунка. Комлексы. остановленные в позициях 101, 105 и 108, инкубировались в стандартных условиях 5 или 20 минут перед добавлением к ним НТ©.

Замена олиго-Т на G-C богатую последовательность (матрица 4) привела к тому, что в интервале от +97 до +110 РНК-полимераза стала двигаться монотонно. Все тройные комплексы, остановленные на этом участке сохраняли значение 3~П = 18 и были устойчивы к GreB. Вместе с тем оказалось, что РНК-шпилька в отсутствие олиго-Т способна вызывать дестабилизацию тройного комплекса, остановленного в восьми нуклеотидах за основанием шпильки (соответствует точке терминации на матрице1). Рисунок 8 иллюстрирует этот результат. Видно, что увеличивающаяся с течением времени фракция +105-ТК становится неактивной (дорожки: 4 - 6), тогда как соседние комплексы остаются полностью активными. Контрольные эксперементы показали, что инактивация +105-ТК сопровождается диссоциацией РНК, а нарушение структуры шпильки с помощью инозина предотвращает этот процесс.

На основе приведенных данных был сделан вывод, что для осуществления эффективной терминации необходимо, чтобы одновременно совершались два события: релаксация напряженного тройного комплекса, достигшего точки терминации, и формирование РНК-шпильки за 7 - 9 нукпеотидов от точки терминации.

2.3. Модель спакторнезависимой терминации транскрипции.

Рисунок 9 (Б) иллюстрирует предлагаемый в работе механизм терминации. Согласно описанной выше модели дискретной элонгации транскрипции РНК-транскрипт распределен в тройном комплексе между сайтом прочного связывания (СПС) и сайтом слабого связывания (ССС). Во время фазы скачкообразного движения происходит заполнение ССС, и комплекс становится напряженным. Последующая релаксация сопровождается транслокацией РНК через СПС (рис.9). Предполагается, что в этот момент контакты, удерживающие РНК в СПС, нарушаются, и комплекс теряет на короткое время стабильность. В связи с этим постулируется существование еще одного сайта связывания, ответственного за удержание РНК в момент транслокации (РНК-стабилизирующий сайт, РСС). Также постулируется, что РСС специфичен к однонитевой РНК. Таким образом, в отсутствие РНК-шпильки релаксация не приводит к диссоциации РНК из комплекса, поскольку транскрипт остается связанным в РСС. С другой стороны, РНК-шпилька, оказываясь в РСС в результате монотонного движения фермента, не вызывает эффективной терминации, поскольку ее дестабилизационный эффект компенсируется взаимодействиями транскрипта в СПС. Только одновременное нарушение белок-РНК взаимодействий в СПС и РСС сайтах в результате транслокации РНКхи формирования РНК-шпильки приводит к эффективной терминации.

П-3'=18

релакси- \ДД/| рованный V </ У|

напряженный

П-3'=18

релакси- КАЛ/ рованный |

' ^Аэ-ооо-оо-о

рсс /г/у

релакси- |\/\/\/ рованный '

терминационный 'ХАЛ/'' (релаксированный) I

■О

V

Рис.9. Скачкообразный цикл элонгационного комплекса, двигающегося чесез участок ДНК. который не кодирует (А) или кодирует (Б) терминационный сигнал . Определения элементов комплекса даны в тексте. В скобках изображен гипотетический коротко-живущий интермедиат.

-22-ВЫ ВОДЫ

1. Показано, что в ходе элонгации большую часть своего пути по ДНК-матрице РНК-полимераза проходит в релаксированном состоянии, при котором перемещение передней границы фермента происходит синхронно с наращиванием цепи РНК. а элонгационный комплекс относительно устойчив к действию ОгеВ-фактора. Однако, на определенных участках матрицы молекула РНК-полимеразы переходит в напряженное состояние. В этом состоянии продолжается наращивание цепи РНК. но прекращается поступательное движение передней границы фермента. В результате расстояние между 3'-концом РНК и передней границей фермента сокращается, и элонгационный комплекс становится высокочувствительным к действию СгеВ-фактора. Переход из напряженного в релаксированное состояние сопровождается скачкообразным перемещением передней границы фермента сразу на несколько нуклеотидов вперед.

3. Мутационный анализ показал, что определенные последовательности ДНК, находясь в еще нетранскрибированной области вблизи растущего конца РНК, ответственны за переход элонгационного комплекса из релаксированчого в напряженное состояние.

4. Показано, что процесс спонтанной инактивации элонгационных комплексов является следствием их напряженного состояния.

5. Показано, что олиго-Т-последовательность - обязательный элемент любого р-независимого терминатора - является сигналом к росту напряжения в элонгационном комплексе. Причем точка релаксации напряженного комплекса в точности совпадает с сайтом терминации. Предотвращение релаксации напряженного элонгационного комплекса на точке терминации полностью подавляет терминацию. Этот результат является прямым свидетельством против традиционной модели, описывающей структуру терминационного комплекса и механизм р-независимой терминации.

6. Показано, что РНК-шпилька, являющаяся ключевым элементом р-независимого терминатора, способна в отсутствие олиго-Т вызывать медленную терминацию релаксированного элонгационного комплекса, остановленного на расстоянии 7 • 9 нуклеотидов от ее основания, т.е. в том же месте, где обычно происходит терминации.

\

СПИСОК РАБОТ,

*

опубликованных автором по теме диссертации:

1. Kashlev, М., Nudler, Е., Goldfarb, A., White. Т., Kutter, Е. (1993). Bacteriophage Т4 Ale protein: a transcription termination factor sensing local modification of DNA. Cell, 75: 147-154.

2. Nudler, E., Goldfarb, A., Kashlev, M. (1994). Discontinuous mechanism of transcription elongation. Science, 265: 793 - 796.

3. Nudler, E.. Kashiev, M., Nikiforov.V., Goldfarb, A. (1995). Coupling between transcription termination and RNA polymerase inchworming. Cell, принято к печати.