Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые методы определения метаболитов триптофана в тромбоцитах и плазме крови человека для лабораторной диагностики депрессивных расстройств

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Новые методы определения метаболитов триптофана в тромбоцитах и плазме крови человека для лабораторной диагностики депрессивных расстройств"

На правах рукописи

Шилов Юрий Евгеньевич

НОВЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТАБОЛИТОВ ТРИПТОФАНА В ТРОМБОЦИТАХ И ПЛАЗМЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ДЕПРЕССИВНЫХ РАССТРОЙСТВ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

12 иЪ

Москва-2014

005559105

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр психического здоровья» Российской академии медицинских наук.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Клюшник Татьяна Павловна Научный консультант:

кандидат химических наук Безруков Михаил Васильевич

Официальные оппоненты:

Морозов Сергей Георгиевич, доктор медицинских наук, профессор, член-корресиондент РАН, заведующий лабораторией общей и перинатальной нейроиммунопатологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии».

Выборных Дмитрий Эдуардович, доктор медицинских наук, руководитель Группы по изучению психических расстройств при заболеваниях системы крови Федерального государственного бюджетного учреждения «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Ведущая организация:

Федеральное государствешюе бюджетное учреждение «Федеральный медицинский | исследовательский центр психиатрии и наркологии» Министерства здравоохранения 1 Российской Федерации.

Защита состоится « у » М^кЖУ $ 2015 г. в ¿М^на заседании диссертационного совета Д 208.135.02 при ФГБУ «Гематологический научный центр» МЗ РФ по адресу: 125167, г. Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Гематологический научный центр» МЗ РФ

цсшр Ш 1 М' л

Автореферат разослан В» ШЩЛг 015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук // Буланов Андрей Юльевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Проблема аффективных расстройств и, в первую очередь, депрессий является одной из приоритетных проблем современной психиатрии и медицины в целом. Это связано с высокой распространенностью депрессивных расстройств среди населения, а также сложностями диагностик« и лечения этих заболеваний, что вытекает ш недостаточной изученности и гетерогенности этиологии и патогенеза депрессивных расстройств. Эпидемиологические исследования показывают, что выявляемость депрессивных расстройств значительно возросла за последние 10-15 лет (ВОЗ, 2001; Wittchen H.U. et al., 2010). По некоторым данным, депрессивными расстройствами, страдают около 6% мужчин и 18% женщин (Blazer D.G. et al., 2000; Wiltchen H.U. et al., 2010), причем, в перзую очередь, лица молодого и среднего возраста. Исследования социальных последствий депрессивных расстройств показывают, что депрессии приводят к ограничению социальной активности и трудоспособности (Kessler R.C. et al., 1998), в связи с чем трудно недооценить социальную значимость этих заболеваний. Кроме того, низкая эффективность лечения депрессивных расстройств может приводить к трагическим последствиям -суицидам. Все вышесказанное обуславливает особую актуальность исследования депрессивных расстройств, включая изучение патогенеза, а также разработку более эффективных методов диагностики и лечения.

Этиопатогенез депрессивных расстройств сложен и до конца не изучен. Он включает в себя нарушения в метаболических и рецепторных системах мозга, в иммунной и нейроэндокринной системах; нарушение взаимодействия этих систем между собой, воздействие психоэмоционального стресса и неблагоприятных факторов окружающей среды, таких как инфекции, которые реализуются при наличии определенной генетической уязвимости. Так, в патогенез депрессивных расстройств в той или иной степени вовлечет,] гиперактивация глутаматной нейротрансмиссии, гипофункция норадреналиновон и серотониновой систем мозга, нарушения нейротрансмиссии дофамина, у-аминомасляной кислоты, ацетилхолина, дефицит нейротрофических факторов. Кроме того, показано, что важную роль в патогенезе депрессивных расстройств играет активация системных воспалительных процессов (Bonaccorso S. et al., 2002; Schlepers ОJ. et al., 2005; Thoraas A.J., et al., 2005; Raison C.L. et al., 2011). Одним из возможных факторов хронификации заболевай™ и возникновения разнообразных когнитивных нарушений являются атрофические и нейродегенеративные изменения в головном мозге пациентов с депрессивными расстройствами. Эти изменения заключаются, в частности, в апоптозе нейронов и глиальных клеток мозга, что приводит к необратимому нарушению нейрональных и нейро-пгаалыплх взаимодействий. Следствием этого может являться

3

достоверное уменьшение у пациентов с депрессией объема гиплокампа (McKinnon М.С. et al., 2009; Savitz J. et al., 2014) - части лимбической системы головного мозга, участвующей в формировании эмоций и консолидации памяти.

Важную роль в патогенезе эндогенных психических заболеваний играют метаболиты незаменимой аминокислоты триптофана, такие как серотонин, кинуренин, 3-гидроксикинуренин, хинолиновая и кинуреновая кислоты. Серотонин, главный метаболит метоксииндольного пути метаболизма триптофана, играет роль важного нейромедиатора и нейромодулятора в центральной нервной системе. Гипофункция серотониновой системы мозга, в том числе снижение уровня серотонина в мозге, уже более 50 лет считается центральным патогенетическим фактором депрессии. Уровень серотонина в мозге может быть достаточно точно оценен по его концентрации в спинномозговой жидкости, однако это требует высоко инвазивной и болезненной процедуры пунктирования пациента. Поэтому для оценки уровня серотонина в мозге чаще используются альтернативные методы. Так, согласно ряду исследований, тромбоциты крови являются удобной экстрацеребральной моделью для изучения состояния центральных серотонинергических нейронов (Pletscher А. et al., 1980). В этих клетках присутствуют элементы серотониновой системы, фармакологически идентичные таковым в центральных нейронах: серотониновые рецепторы, система обратного захвата серотонина, система его везикуляции, хранения, высвобождения и метаболизма. Кроме того, почти весь серотонин крови депонирован в электронно-плотных гранулах тромбоцитов. Была выявлена высоко достоверная корреляция содержания серотонина в тромбоцитах и СМЖ. При этом содержание серотонина в плазме плохо коррелировало с его содержанием в СМЖ. (Audhya Т. et al., 2012).

В ряде работ была показана высокая диагностическая и прогностическая значимость измерения уровня тромбоцитарного серотонина у пациентов с депрессивными расстройствами. Так, например, одни исследования выявили низкий уровень тромбоцитарного серотонина у больных депрессией, по сравнению со здоровыми добровольцами (Muck-Seler D. et al., 2004; Ruljancic N. et al., 2011; Quintana J. et al., 1992), а другие исследования показали, что мониторировакие уровня тромбоцитарного серотонина в первые дни и недели лечения антидепрессантами может помочь в прогнозировании успешности терапии и раннем выявлении резистентности к лечению (Castrogiovanni Р. et al., 2003; Maurer-Spurej Е. et al., 2007). Одним из объяснений гипофункции серотониновой системы мозга при депрессивных расстройствах может служить наблюдающаяся у пациентов активация кинуренинового пути метаболизма триптофана, приводящая к снижению в мозге уровня триптофана, предшественника серотонина. Поскольку активация кинуренинового пути, осуществляемая провоспалительными цитокинами, кортизолом

("гормоном стресса") и липополисахаридами клеточных стенок бактерий, приводит к повышенному образованию нейротоксических метаболитов кииуренинового пути, таких как З-гидроксикинуренин и хинолиновая кислота, эта гипотеза объясняет связь между депрессией, воспалением, психоэмоциональным стрессом и нейродегенеративными процессами. А тот факт, что хинолиновая кислота является эндогенным агонистом глутаматных NMDA рецепторов, может объяснить гиперфункцию глутаматергической системы мозга при депрессивных расстройствах. Кроме того, в ряде работ была показана высокая диагностическая и прогностическая значимость измерения уровня кинуренина и З-гидроксикинурепина в плазме пациентов с депрессивными расстройствами (Orlikov А.В. et at., 1994; Sublette М.Е. et al., 2011; Maes М. et al., 2012; Zhu H. et al., 2013).

Описанные в литературе методы количественного определения тромбоцитарного серотонина, а также кинуренина и 3-гидроксикинуренина в плазме крови имеют ряд методических ограничений, затрудняющих их использование в широкой клинической практике. Одни методы включают сложную и плохо масштабируемую процедуру пробоподготовки. Другие не обладают достаточной чувствительностью и поэтому требуют больших объемов образца или использования химической модификации аналитов. Третьи не обеспечивают химической сохранности аналитов во время анализа и при хранении образцов, в связи с чем обладают низкой точностью и воспроизводимостью. Исследователи, ставящие перед собой цель разработки метода определения 3-гидроксикинуренина, сталкиваются с проблемами, связанными с его склонностью к быстрому окислению в присутствии кислорода (Tsentalovich У.Р. et а!., 2008). Поэтому в связи с низкой стабильностью 3-гидроксикинуренина, при разработке методов его количественного определения необходим поиск подходящих способов его стабилизации.

В связи с вышеизложенным, разработка новых, пригодных для клинической практики методов количественного определения тромбоцитарного серотонина, а также кинуренина и 3-гидроксикинуренина плазмы крови является несомненно актуальной задачей.

Цель работы. Разработать точные и высокочувствительные методы определения метаболитов метоксииндолыюго и кинуренинового путей метаболизма триптофана, пригодные для клинико-лабораторных исследований.

Задачи работы

1. Разработать метод количественного определения серотонина в тромбоцитах крови человека с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием флуориметрической детекции, пригодный для рутинной клинической практики.

2. Апробировать метод количественного определения серотонина в тромбоцитах крови человека на группе здоровых добровольцев и группе пациентов с эндогенными депрессивными расстройствами.

3. Разработать метод количественного определения кинуренина в плазме крови с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической детекцией, пригодный для рутинной клинической практики.

4. Апробировать метод количественного определения кинуренина в плазме крови на группе пациентов с эндогенными депрессивными расстройствами.

5. Разработать способ повышения химической стабильности 3-гидроксикинуренина в образцах плазмы крови в условиях пробоподготовки и анализа

6. Разработать метод детекции метаболитов триптофана в плазме крови в виде их алкиловых эфиров с помощью МАЫЛ-ТОР масс-спектрометрии.

Научная новизна

Впервые предложен метод определения содержания серотонина в тромбоцитах на основе ВЭЖХ с флуориметрической детекцией.

Использован новый способ пробоподготовки при определении тромбоцитарного серотонина, отличающийся от предложенных в литературе способов тем, что экстракция серотонина из осадка тромбоцитов проводится путем замораживания/оттаивания водной суспензии тромбоцитов. Данный способ экстракции серотонина удобен в условиях клинической лаборатории и не требует работы с вредными для здоровья реактивами.

Были подобраны оптимальные условия для осаждения белков при пробоподготовке плазмы крови для определения кинуренина, обеспечивающие его дополнительную стабилизацию и повышение выхода для анализа с помощью ВЭЖХ-МС.

Впервые предложен способ повышения стабильности 3-гидроксикинуренина в образцах плазмы крови путем получения его алкиловых эфиров.

Впервые показана принципиальная возможность определения 3-гидроксикинуренина, кинуренина и триптофана в виде их алкиловых эфиров с помощью масс-спектрометрии.

Практическая значимость работы

В работе разработаны высокочувствительные методы количественного определения тромбоцитарного серотонина и кинуренина в плазме крови, пригодные как для научных исследований, так и для рутинной клинико-лабораторной практики.

Основные положения, выносимые на защиту ]. Разработан новый метод количественного определения серотонина в тромбоцитах с

использованием ВЭЖХ с флуориметрической детекцией, включающий в себя

модифицированный способ пробоподготовки.

6

2. Выявлены достоверные различия уровня тромбоиитариого серототша у пациентов с депрессивными расстройствами и здоровых добровольцев.

3. Разработан новый метод количественного определения кинуренина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спекгрометрической детекцией в плазме крови.

4. Разработанный метод количественного определения кинуренина в плазме крови с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической детекцией апробирован на пациентах с эндогенными депрессивными расстройствами.

5. Разработан новый способ повышения стабильности 3-гидроксикинуренина в условиях пробоподготовки и анализа, заключающийся в получении его алкиловых эфиров.

6. Разработан метод детекции 3-гидроксикинуренина, кинуренина и триптофана в виде их алкиловых эфиров с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии в плазме крови.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были представлены на IV Международной интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2013); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Междисциплинарный подход в понимании и лечении психических расстройств: миф или реальность?» (Санкт-Петербург, 2014); Научной конференции молодых ученых, посвященной 110—летию со дня рождения A.B. Снежневекого (Москва, 2014). Публикации

По материалам диссертации опубликованы 2 печатных работы в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации, и 3 тезисов в сборниках конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 124 страницах, состоит из следующих разделов: введение; обзор литературы; материалы и методы; результаты и обсуждение; выводы; список литературы, включающий 270 литературных источников, из них 10 отечественных и 270 иностранных. Диссертация проиллюстрирована 7 таблицами и 19 рисунками.

Диссертационная работа выполнена в научной лаборатории нейроиммунологии (зав. д.м.н., профессор Т.П. Клюшник) ФГБУ «Научный центр психического здоровья» Российской академии медицинских наук.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы Реактивы н растворители

Серотоиин гидрохлорид с чистотой не менее 99% (Acros Organice, США), L-кинуренин сульфат с чистотой не менее 99%, З-Гидрокси-D.L-KHny ренин, L-триптофан, бикарбонат аммония, лимонная кислота, Ка2ЭДТЛ дигидрат, монофосфат аммония, азид натрия, муравьиная кислота, трифторуксусная кислота, гептафтормасляная кислота, 2,5-дигидроксибензойная кислота, /7-толуолсульфохлорид, метанол, пропанол, изопропанол (все Sigma, США), ацетонитрил (Sigma, США; Merck, Германия; Scharlau, Испания), этилацетат, пиридин, уксусная кислота, эфир диэтиловый, иодистый калий, перманганат калия, соляная кислота (все хч или чда), крахмал картофельный растворимый для нефелометрии (Реахим, Россия), деионизированная вода с сопротивлением 18 МОм/см, получаемая с помощью установки Simplicity UV System фирмы или Milli Q (Millipore, Франция). Для получения плазмы крови использовали вакутейнеры Vacuette Premium К3ЭДТА (Greiner Bio-one, Австрия)

Оборудование

Определение концентрации серотонина в образцах проводили на жидкостном хроматографе System GOLD (Beckman Coulter, США) с флуориметрическим детектором FP-2020+ (JASCO, Япония), насосом 128 с двумя аналитическими головками по 10 мл, инжектором Rheodine 7725Í и аналитической колонкой с С18 обращенной фазой Ultrasphere XL ODS (70 мм х 4,5 мм, Змкм) (Beckman Coulter, США). Сбор и обработку данных осуществляли с использованием программного обеспечения 32 KARAT (Beckman Coulter, США).

Для центифугирования вакутейнеров с К3ЭДТА и кровью и получения плазмы крови, обогащенной тромбоцитами (ПОТ) использовали центрифугу СМ6М (ELMI, Латвия). Для осаждения тромбоцитов ПОТ и для осаждения разрушенных тромбоцитов использовали центрифугу Allegra Х-300 (Beckman Coulter, США). Для в стряхивания тромбоцитов использовали орбитальный шейкер со скоростью встряхивания 600 оборотов в минуту и амплитудой встряхивания от 3 мм.

Для подсчёта тромбоцитов в цельной крови и ПОТ, использовали гематологический анализатор KX-21N (Sysmex, Япония). Коэффициент вариации метода составлял от 4 до 10%. Дегазацию растворителей для ВЭЖХ проводили с использованием мембранного вакуумного насоса KNF Laboport (модель № 820.3 AN18, Weigand International, Германия) в вакууме при перемешивании на магнитной мешалке.

Определение концентрации кинуренина в образцах проводили на жидкостном хроматографе Agilent 1200 Series LC (США), включающем дегазатор, бинарный насос,

автосамплер, термостат колонок, квадрупольный масс-сгшктрометр Agilent 6410-2К Triple Quad LC-MS(QQQ) (США) с использованием метода ионизации электроспреем (источник ESI). Для генерирования азота особой чистоты использовали установку N¡troFlow®Lab (Parker Filtration, Нидерланды). Хроматографическое разделение осуществляли на колонке ZORBAX Eclipse XDB-C18 (Agilent, США) (150 * 4,6 мм; 5 мкм) с предколонкой Zorbax SB-C18 (12.5мм х 4,6мм, 5 мкм). Сбор и обработку данных осуществляли с использованием программного обеспечения Agilent MassHunter В.01.04.

Для пробоподготовки и анализа метаболитов триптофана в виде алкиловых эфиров использовали следующее оборудование: MALDI-TOF масс-спектрометр UltraflexII BRUKER (Германия), оснащенный УФ лазером (Nd), лиофилизатор фирмы VirTis, центрифуга AllegraX-300 (Beckman Coulter, США), термостат, колбонагреватель.

Для тонкослойной хроматографии использовали камеру дм ТСХ (Camag, Швейцария), IíTPLC пластинки Silica Gel 60 F254 на стеклянной подложке (Merck, Германия).

Исследуемые пациенты и добровольцы

Апробация методов определения тромбоцитарного серотонина и кинуренина в плазме крови проводилась на пациентах, госпитализированных в отдел по изучению эндогенных психических расстройств и аффективных состояний ФГБУ «НЦГО» РАМН (руководитель - академик PAM1I A.C. Титанов). Критериями включения пациентов в исследование служили наличие острого или затяжного депрессивного приступа в рамках эндогенного аффективного психоза в традиционном понимании, приводившего больных к необходимости госпитализации в психиатрический стационар; необходимость проведения больным активной и интенсивной психофармакотерапии; информироватюе согласие пациента на участие в исследовании; соблюдение современных норм биомедицинской этики при обследовании больных. Критериями исключения являлись: клинические и лабораторные признаки острого инфекционного или вирусного заболевания, выявленного в течение 1 - 2 месяцев, предшествующих обследованию, а также аллергических заболеваний; признаки зависимости от психоактивных веществ в анамнезе. Состояние пациентов определялось наличием эндогенной депрессии, что отвечало критериям рубрик F31.3, F31.4, F32.1, F32.2, F33.1, F33.2 по Международной классификации болезней.

Апробация метода определения тромбоцитарного серотонина проводилась на группе пациентов и контрольной группе. Первая группа включала 30 пациентов (17 женщин, 13 мужчин) в возрасте 20-61 года (средний возраст 35 лет). Контрольную группу составили 10 здоровых добровольцев (5 женщин, 5 мужчин), соответствующие по возрасту и полу группе пациентов. Их обследование проводилось в рамках диспансеризации в ФГБУ «НЦПЗ» РАМН. Апробация метода определения кинуренина в плазме крови проводилась

на группе пациентов (14 человек: 8 женщин, 6 мужчин) в возрасте 21-57 года (средний возраст 36 лет).

Забор крови и получение плазмы Забор крови из вены производили натощак в вакутейнер Vacuette Premiurn фирмы Greiner Bio-one (Австрия), содержащий раствор К3ЭДТА. ПОТ для определения тромбоцитарного серотонина получали центрифугированием крови при 200*g в течение 10 минут. Плазму для определения кинуренина получали центрифугированием крови при 1300xg в течение 15 минут при 4 °С и хранили до анализа при температуре минус 20 °С.

Метод определения серотонина в тромбоцитах крови человека Пробоподготовка

ПОТ получали по процедуре, описанной выше. Сразу после центрифугирования 400 мкл ПОТ переливали в пластиковую пробирку Eppendorf. Для получения осадка тромбоцитов ПОТ центрифугировали при 6000xg в течение 40 мин при 4 °С, после чего декантировали супернатант. Выделение серотонина из тромбоцитов осуществляли с помощью процедуры замораживания/оттаивания водной суспензии тромбоцитов: к осадку тромбоцитов, находящемуся в пластиковой пробирке, добавляли 400 мкл дистиллированной воды, охлажденной до 4±2 °С, после чего разбивали тромбоциты на шейкере в течение 0,5 мин и замораживали пробирку с пробой при минус 80 °С. Затем не i раньше, чем через 1 час, размораживали и центрифугировали при 6000 xg в течение 20 мин при 4°С. Из полученного супернатанта отбирали 20 мкл и проводили аналитическую хроматографию на колонке с Ci8 обращенной фазой.

Хроматографический анализ Высокоэффективную жидкостную хроматографию проводили на хроматографе фирмы Beckman Coulter (США) с конфигурацией, описанной выше. Детектирование флуоресценции серотонина осуществляли при длине волны поглощения 300 нм и длине волны испускания 330 нм, при коэффициенте усиления (Gain) 100 и ширине спектральной линии 18 им. При хроматографии в качестве буфера А использовали растворенные в 1л воды с сопротивлением 18 МОм/см 12,16 ммоль лимонной кислоты; 11,70 ммоль монофосфата аммония; 1,11 ммоль динатриевой соли ЭДТА (дигидрат); 11,61 ммоль бикарбоната аммония и 1,54 ммоль азида натрия (рН4,05 - 4,20). В качестве буфера Б использовали смесь 200 частей ацетонитрила и 20 частей воды (v:v). Буфер Б дегазировали в течение 2-3 минут. Хроматографию водных экстрактов тромбоцитов, содержащих серотонин, проводили изократическим элюированием со скоростью потока 1,5 мл/мин 4% буфера Б в буфере А в течение 2,5 мин; далее колонку отмывали от примесей линейным градиентом от 4% до 70 % буфера Б от 2,5 до 3 минут; от 3 до 5 минуты колонку

промывали 70% буфера Б; затем от 5 до 10,5 минуты колонку переуравновешивали 4% буфера Б. Время удерживания серотонина составляло 1,90 ± 0,25 минут.

Построение калибровочной кривой Основой для количественного определения серотонина служили калибровочные зависимости. Для построения калибровочной кривой готовили модельные растворы гадрохлорида серотонина в 5% ацетонитриле с концентрациями в пересчете на свободный серотонин: 8,8; 17,6; 88,1; 176,3 и 352,5 нг/мл. Дальнейший хроматографический анализ модельных растворов проводился, как описано выше. Каждая проба анализировалась три раза. Калибровоч1гый график строили по результатам ВЭЖХ анализа на основе измерений площади хроматографических пиков с использованием функции Area программы 32 KARAT (Beckman Coulter, США).

Метод определения кинурешша в плазме крови человека Пробоподготовка

К 200 мкл плазмы крови добавляли 20 мкл Н;0 и 400 мкл метанола, содержащего 0,2% муравьиной кислоты и 0,05% трифторуксусной кислоты (в качестве источников протонов, а также для повышения стабильности кинурешша). После перемешивания и центрифугирования в течение 5 мин при 3000*g супернатант объемом 200 мкл переносили в аналитические виалы и 5 мкл инжектировали в хроматограф. Все работы по пробоподготовке велись на холоде (использовали лёд, t=0°C).

Условия хроматографии Хроматографическое разделите осуществляли на колонке с С]8 обращенной фазой с предколонкой. Состав подвижной фазы: смесь ацетонитрила и воды (80:20, v/v). Элюирование производилось в изократическом режиме. Скорость подвижной фазы составляла 0,6 мл/мин; объем инжектируемой пробы - 5 мкл; температура термостата колонки 30 °С. Время удерживания кинурешша в данных условиях составило 2,77±0.02 мин.

Масс-спектрометрическая детекция Детектирование кинурешша проводилось с использованием иошоации электрораспылением (ESI) при положительной полярности работы источника в режиме мониторинга заданных масс (MRM - multiple reaction monitoring). Детектор фиксировал MRM-переходы (m/z 209,0 -+ 192,1; m/z 209,0 146,1). В таблице 1 представлены условия масс-спектрометрического детектирования кинуренина.

Построение калибровочной кривой Основой для количественного определения серотонина служили калибровочные зависимости. Для построения калибровочной кривой готовили модельные растворы

сульфата кинуренина в плазме крови здорового добровольца путем добавления к 200 мкл плазмы 20 мкл водного раствора сульфата кинуренина соответствующих концентраций для достижения следующих итоговых концентраций вносимого кинуренина в образце: 21,2; 42,5; 85,0; 170,0; 339,9; 679,8 нг/мл (в пересчете на свободный кинуренин). Дальнейшая процедура пробоподготсвки с последующим анализом проводилась, как описано выше. Калибровочную кривую строили по результатам анализа на основе измерений площади хроматографических пиков с учетом вычета площади пиков эндогенного кинуренина, содержащегося в плазме крови добровольца.

Таблица 1. Условия масс-спектро метрического детектирования кинуренина.

Ионизация ESI (ионизация электрораспылением)

Режим Positive (положительная ионизация)

Тип сканирования MRM (режим детектирования заданных масс)

Параметры ионизации Расход газа N2 — 7 л/мин Температура газа - 350°С Давление небулайзера- 30 psi

Параметры фрагментации Fragmentor (энергия фрагментатора) = 100В Collision Energy (энергия столкновений) = 5В, 15В

Молекулярный ион [М+Н]+ m/z = 209.0

Дочерние ионы m/z= 146.1; 192.1

Программное обеспечение Agilent MassHunter B.01.04.

Метод синтеза алкиловых зфиров метаболитов триптофана

Метиловые, пропшювые и изобутиловые эфиры 3-0,Ь-гидроксикину ренина, кинуренина и триптофана получали путем их обработки раствором НС1 в соответствующем абсолютным спирте (метиловом, пропиловом, изобутиловом). Реакция проходила в течение 2 часов при 68° С. Затем реакционную смесь упаривали в вакууме досуха и характеризовали с помощью ТСХ и МА1Л31-ТОР масс-спектрометрии.

Получение растворов НС1 в абсолютных спиртах Безводный раствор НС1 в спиртах, необходимый для синтеза соответствующих алкиловых эфиров, получали по реакции соответствующего абсолютного спирта (метанол, пропанол или изобутанол) (10 мл) с р-толуолсульфохлоридом (10 г) при 35° С для метанола и 45° С для пропадала и изобутанола в течение суток с последующей перегонкой. Растворы имели молярность от 2 до 4,7 М, определяемую титрованием КОН. Полученные растворы при хранении при минус 80° С обладали высокой стабильностью. Концентрация НС1 существенно не изменялась в течение месяца.

ТСХ алкиловых эфнров метаболитов триптофана

Для характеристики полученных производных использовали тонкослойную хромато1рафию на пластинках с силикагелем па стеклянной подложке. Состав подобранной нами подвижной фазы: этилацетат:пиридин:уксусная кислота:сода:эфир (5:5:1:3:4, по объемам). Пятна веществ характеризовали по фактору удерживания Rf (retention factor), который равен отношению расстояния, прошедшего веществом от линии старта, к расстоянию, прошедшему за то же время растворителем от линии старта. Пятна веществ проявляли хлором и крахмал иодидом. Для этого сначала хлорировали пластинку путем ее помещения в герметичную камеру с хлором на 1 минуту. Затем тщательно продували хлор с пластинки, после чего опускали ее на несколько секунд в водный раствор, содержащий 1% йодистого калия, 1% крахмала и 1% азида натрия. Вещества проявляются в виде пятен синего цвета.

Получение хлора для проявления: хлор получали в герметичной камере добавлением соляной кислоты (1—2 мл) к перманганату калия.

Получение реагента для проявления: 20 мл водной суспензии, содержащей 3 г иодида калия, 3 г крахмала, а также 3 г азида натрия для предотвращения бактериального зарастания, добавляли при перемешивании к 270 мл дистшшрованной воды доведенной до кипения. После полного расгворения крахмала оставляли при комнатной температуре до остывания. Получали прозрачный раствор, готовый к использованию. Раствор оставался пригодным к использованию несколько месяцев.

MALDI-TOF масс-спектрометрия алкиловых эфиров метаболитов триптофана

Подготовка стандартных образцов для анализа проводилась следующим образом: 0,5 мг вещества растворяли в 200 мкл ацетонитрила, на мишени смешивали по 0,5 мкл раствора образца и раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (Sigma, США) (30 мг/мл в 20% водном ацетонитриле с 0.5% ТФУ). Полученную смесь высушивали на воздухе. Масс спектры были получены на MALDI-TOF масс-спектрометре UltraflexII BRUKER (Германия), оснащешюм УФ лазером (Nd) в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона; точность измеренных моноизотопных [М+Н]4 составляет 0,1 Да.

MALDI-TOF масе-спетрометрическая детекция триптофана, кинуреннна и З-гидрокснкннуренина в плазме крови Пробоподготовка

К 100 ц1 плазмы крови добавляли 400 ц1 смеси следующего состава: AcN/MetOH (80:20, v. v), 0,25% гептафтормасляной кислоты. Затем образен перемешивали на вортексе в течение 1 мин и центрифугировали 10 мин при 10000xg при 4° С. Получившийся супернатант переносили в стеклянный пузырек, охлаждали до минус 80° С, после чего

i 13

высушивали 12 часов на лиофилизаторе до получения сухого остатка. К полученному сухому остатку добавляли 2 мл раствора НС1 в абсолютном изобутаноле, и проводили реакцию получения изобуткловых эфиров в течение 2 ч при 68° С. Затем охлаждали реакционную смесь до минус 80° С высушивали 12 часов на лиофилизаторе до получения сухого остатка.

Масс-спсктрометрический анализ Экстракт плазмы крови, прошедший обработку НС1 в изобутаноле и лиофилизацию, растворяли в 200 мкл ацетонитрила. На мишени смешивали по 0,5 мкл раствора образца и раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (30 мг/мл в 20% водном ацетонитриле с 0,5 % ТФУ). Полученную смесь высушивали на воздухе. Масс спектры были получены на MALDI-TOF масс-спектрометре в условиях, описанных выше для синтезированных стандартов.

Статистическая обработка

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программных пакетов «Statistica 10» и «Microsoft Excel 2007». Вычисляли средние арифметические значения, стандартные отклонения, уравнения регрессионной зависимости, t-критерий Стыодента для независимых выборок.

Результаты исследования

Разработка метода определения серотонина в тромбоцитах крови человека

Оптимизация пробоподготовки В процессе разработки метода были оптимизированы параметры получения тромбоцитов из ПОТ и извлечения серотонина из тромбоцитов. Выбор антикоагулянта К3ЭДТА для получения ПОТ сделали на основе анализа литературных данных, которые говорят о лучшей стабильности тромбоцитов при использовании К3ЭДТА и о предпочтительности использования этого антикоагулянта для измерения содержания серотонина в плазме и тромбоцитах (Middclkoop С.М. et al., 1993). Помимо выбора антикоагулянта, важное значение имеет выбор параметров центрифугирования при осаждении тромбоцитов из ПОТ. Для получения осадка тромбоцитов ПОТ центрифугировали при 6000xg в течение 40 мин при 4 °С, после чего декантировали супернатант. Данные параметры центрифугирования являются оптимальными, поскольку обеспечивают наилучшую сохранность тромбоцитов, более эффективное осаждение и, следовательно, более высокий выход серотонина для анализа. Для контроля метода после центрифугирования в супернатанте определяли содержание серотонина при помощи ВЭЖХ. Содержание серотонина в супернатанте было ниже предела детекции.

Выделение серотопипа из тромбоцитов осуществляли с помощью процедуры замораживания/оттаивания водной суспензии тромбоцитов. Данный способ выделения серотонина из тромбоцитов был применен впервые. Он имеет преимущества по сравнению с описанными в литературе способами (обработка раствором хлорной кислоты или ультразвуком), поскольку более удобен в условиях клинической лаборатории и не требует работы с вредными для здоровья реактивами. Полноту экстракции серотонина из тромбоцитов оценивали, анализируя содержание серотонина в «тенях» тромбоцитов после экстракции, а также путем сравнения уровня тромбоцитарного серотонина после однократной и повторной процедуры замораживания/оттаивания. Содержание серотонина в «тенях» тромбоцитов было ниже предела детекции метода. Концентрации тромбоцитарного серотонина после однократной и повторной процедуры замораживания/оттаивания практически не отличались.

Хроматографический анализ При разработке метода определения тромбоцитарного серотонина был произведен подбор условий хроматографии (состав элюирующих буферов и скорость эгаоирования), обеспечивающих выделение отдельного пика серотонина, не пересекающегося с пиками примесей (рис. 1). Время удерживания серотонина составляло 1,90 ± 0,25 минут и не изменялось после проведения более 1000 определений серотонина. Примеси, которые могут содержаться в использованной воде или образце экстракта тромбоцитов, элюировались с временами удерживания 0,45 - 0,6 мин и 4,7 - 6,8 мин и, таким образом, не мешали определению серотонина.

В работе впервые был использован флуориметрический детектор для определения серотонина в тромбоцитах с помощью ВЭЖХ, хотя его использование для определения серотонина в плазме описано в литературе. Флуориметрический детектор обладает высокой чувствительностью, селективностью, простотой в использовании и сравнительной доступностью, что, несомненно, делает его удобным для рутинных клипико-лабораторных исследований.

Калибровочная кривая Полученная калибровочная кривая (рис.2) описывается уравнением: у=11379 х х -19966, где у - площадь хроматографического пика в относительных единицах, х - концентрация серотонина в нг/мл. Калибровочная кривая является линейной во всей области концентраций серотонина от 8,8 до 352,6 нг/мл, в которой производится определение серотонина в тромбоцитах. Линейность демонстрируется коэффициентом достоверности аппроксимации 1^=0,9996.

Вещество

[5НТ], лг-'кя

Серотошш

1.908

775865

76.5»

Рисунок 1. Хроматснрамма экстракта серотонина, выделенного из тромбоцитов крови добровольца. Время удерживания серотонина составлет 1.908 мин. I, отн. ед. -интенсивность флуоресценции; X, мин. - время удерживания; 8 - площадь хроматографического пика; [5НТ], нг/мл - концентрация серотонина.

= 1Ш9х- 19966 Я2 = 0,9996

50 ЮС 150 200 250 300 350 400

Концентрация серотонина, нг/мл

Рисунок 2. Калибровочная кривая (зависимость концентрации серотонина от величины площади хроматографических пиков).

Предел количественного определения (ЬО(2) серотонина в 3% ацетонитриле составил 8,8 нг/мл, при значениях правильности и точности менее 20% (точность 11,3%, правильность 16,3%). Правильность (отличие расчетной концентрации он номинальной, выраженное в процентах) и точность (СУ, коэффициент вариации) для каждого уровня на калибровочной кривой находились в приемлемых диапазонах (меньше 15%; меньше 20% для ШС>) (табл. 2). Для пересчета концентрации серотонина в нмоль/мл необходимо

поделить полученное значение X на молекулярный вес серотонина: 176,2. Уровень тромбоцитарного серотонина выражали в нмоль/10 тромбоцитов.

Таблица 2. Экспериментальные данные, использованные для построения калибровочной кривой для серотонина.

С, нг/мл в, отн. ед. Точность, % Правильность, %

8,8 101445 11,3 16,3

17,6 202125 6,4 5,2

88,1 959411 2,8 7,8

176,3 1938476 4,2 7,9

352,5 4019324 3,5 5,1

С — концентрация серотонина (нг/мл); $ - площадь хроматографического пика (отн. ед.); точность - коэффициент вариации (СУ) для значения 5 (отношение стандартного отклонения к среднему арифметическому, выраженное в процентах); правильность -отличие расчетной конърнтрации от номинальной, выраженное в процентах.

Апробация метода определения серотонина в тромбоцитах крови человека

Апробация метода проведена на образцах крови, полученных от пациентов с депрессивными расстройствами, а также от здоровых добровольцев. Среднее содержание тромбоцитарного серотонина у пациентов (N=30) составило 1,39±0,73 нмоль/109 тромбоцитов, а в группе здоровых добровольцев (N=10) 3,84±1,04 нмоль/109 тромбоцитов; 1=8,25; р<0,001; что означает высокодостовериую разницу между группами, оцененную по Т-тесту для независимых переменных. Таким образом, выявлены достоверные различия уровня тромбоцитарного серотонина в группе пациентов с депрессивными расстройствами и в группе здоровых добровольцев. Описанные в литературе нормальные значения концентраций тромбоцитарного серотонина в нмоль/109 тромбоцитов находятся в следующих интервалах: для новорожденных 1,67 ± 0,74; для детей 4,09±1,04; для взрослых 3,87±0,87; для пожилых 2,57±1,12 (ПасЬатс Е. с\ а1, 1990). Полученные нами нормальные значения концентраций тромбоцитарного серотонина для взрослых добровольцев согласуются с литературными данными, что так же иллюстрирует применимость разработанного метода.

Разработка метода определения кинуреннна в плазме крови Подбор условий пробоподготовки Были подобраны оптимальные условия для осаждения белков при пробоподготовке плазмы крови для определения кинуренина, обеспечивающие его дополнительную стабилизацию повышение выхода для анализа с помощью ВЭЖХ-МС. Степень извлечения

17

кинуренина, измеренная для концентрации вносимого в плазму кинуренина 340 нг/мл, составила 68%.

Оптимизации масс-спектрометрического детектирования При разработке метода были оптимизированы условия MC детекции, позволяющие определять концентрацию кинуренина с высокой чувствительностью и специфичностью. Детектирование кинуренина проводилось с использованием ионизации электрораспылением (ESI) - способа ионизации, типичного для анализа таких полярных соединений как аминокислоты, к которым относится кинуренин. Определение вещества проводили при положительной полярности работы источника в режиме мониторинга заданных масс (MRM - multiple reaction monitoring). Режим MRM обеспечивает эффективность в отсекании фона и, как следствие, значительно снижает предел определения. Массы материнского и дочернего ионов определяли в режиме сканирования масс (рис. 3, 4, 5). В качестве дочерних ионов для MRM-детекции выбраны ион с m/z = 146.1, и m/z = 192.1, как демонстрирующие максимальный отклик. Параметры работы детектора подбирались для достижения максимального выхода MRM (209.0—► ¡46.1 и 209—>192.1). В этих условиях достигнута оптимальная чувствительность количественного определения кинуренина (0,1 мкмоль/'л).

п

200 202 204 200 203 210 212 214 216 21S 220 222 224 22S 225 230

tu/z (отношение массы к заряду)

Рисунок 3. Масс-спектр стандартного раствора кинуренина, полученный в режиме сканирования с установленным диапазоном детекции 200 — 230 m/z. Зарегистрирован максимальный отклик сигнала масс-спектрометрического детектора для m/z=209.0, соответствующий родительскому иону кинуренина.

Сигнал в ЧИД.1Я

от«£гра,

соотв

Cmi=¿OS.CO), <n¿yicn:yei

160 170 180 1Е0 ЙК miz (огношенне массы te заряд)')

Рисунок 4. Масс-спектр стандартного раствора кинуренина, полученный в режиме сканирования после фрагментации исходного иона кинуренина (энергия столкновений 15В). Отсутствие сигнала в части спектра, соответствующей родительскому иону (m/z = 209), свидетельствует о полной фрагментации.

¡ j 192. 00QC

j 1461 : OOGQ

ft : м Л

i 100 105 11G 115 120 125 130 135 140 145 150 155 1R0 1 55 170 1 75 ISO 1S5 IDO 1S5 200

н

Ц m/z (отношение массы к заряду)

Рисунок 5. Масс-спектр стандартного раствора кинуренина, полученный в режиме сканирования после фрагментации исходного иона кинуренина (энергия столкновений 5В).

Подбор условий хроматографии Был произведен подбор условий хроматографии (состав подвижной фазы, скорость элюирования, температура) для достижения максимального отклика кинуренина и приемлемого времени элюирования.

На рисунке 6 представлена типичная МЫМ масс-хромато1-рамма образца плазмы пациента. Пик кинуренина (1уд = 2,77) симметричный, отвечает гауссову распределению, без признаков размывания и раздвоения.

Рисунок 6. Масс-хроматограмма, полученная в режиме МЯМ 209.0—>192.1; 209.0—»146.1 при анализе образца плазмы крови пациента, в котором было определено содержание кинуренина в концентрации 3,11 мкмоль/л.

Калибровочная кривая Полученная калибровочная кривая описывается уравнением у = 7,915 х х + 891,61 (где у - площадь хроматографического пика в относительных единицах; х - концентрация кинуренина, нг/мл) (рис. 7). Для пересчета концентрации кинуренина в мкмоль/л необходимо поделить полученное значение X на молекулярный вес кинуренина - 208,22.

Линейность калибровочной кривой в диапазоне концентраций 21,24 - 679.81 нг/мл кинуренина демонстрируется коэффициентом достоверности аппроксимации 112=0,999. Правильность (отличие расчетной концентрации от номинальной, выраженное в процентах) и точность (СУ, коэффициент вариации) для каждого уровня на калибровочной кривой находились в приемлемых диапазонах (меньше 15%; меньше 20% для ЬОС>). Предел количественного определения (ЬОС)) для кинуренина составил 0,1 мкмоль/л (21,2 нг/мл кинуренина) при значениях правильности и точности менее 20% (точность 3,7%; правильность 18,9%) (табл. 3).

Концентрация кинуренина, нг/мл

Рисунок 7. Калибровочная кривая (зависимость концентрации кинуренина от величины площади масе-хроматографических пиков).

Таблица 3. Экспериментальные данные, использованные для построения калибровочной кривой для кинуренина.

С, нг/мл S, отн. ед. Точность, % Правильность, %

21,2 1026,2 3,7 18,9

42,5 1206,5 8,2 5,9

85,0 1587,5 7,8 3,7

170,0 2336,4 1,1 7,5

339,9 3496,9 8,2 3,2

679,8 6289,5 9,2 0,3

S - площадь хроматографического пика; С - концентрация кинуренина; точность -коэффициент вариации (CV) для значения S (отношение стандартного отклонения к среднему арифметическому, выраженное в процентах); правильность — отличие расчетной концентрации от номинальной, выраженное в процентах.

Апробация метода определения кинуренина в плазме крови

Апробация метода проведена на 14 образцах крови, полученных от пациентов с депрессивными расстройствами. Средняя концентрация кинуренина в плазме пациентов составила 1.63±0.54 мкмоль/л, что хорошо соотносится с литературными данными (Myint A.M. el al., 2007; Midttun О. et al., 2009). Диапазон полученных значений концентрации кинуренина составляет от 1,02 мкмоль/л до 3,11 мкмоль/л. Полученные результаты

свидетельствуют о гетерогенности группы обследованных пациентов по концентрации кинуренина в плазме крови, что требует дальнейших исследований.

Характеристика алкиловых эфиров метаболитов триптофана

Нами были нодобраны условия (температура и время реакции, способ синтеза) и произведен синтез алкиловых эфиров метаболитов триптофана. Синтез алкиловых (метиловых, нропиловых, изобутиловых) эфиров 3-гидроксикинуренина проводился с целью повышения его стабильности в условиях пробоподготовки и анализа, а также при длительном хранении образцов путем защиты карбоксильной группы 3-гидроксикинуренина и протонирования аминогрупп. Полученные эфиры использовались в качестве стандартов для разработки аналитического метода. Синтез алкиловых (метиловых, пропиловых, изобутиловых) эфиров триптофана и кинуренина проводился с целью получения стандартов для разработки метода одновременного количественного определения триптофана, кинуренина и З-гидроксикинуренина в виде их алкиловых эфиров. Синтезированные соединения были охарактеризованы с помощью ТСХ и MALDI-TOF масс-спектрометрии. Анализ методом тонкослойной хроматографии синтезированных алкиловых эфиров показал, что метиловые, пропиловые и изобутиловые эфиры получаются с количественными выходами или близкими к количественным (рис. 8). После проведения синтеза в реакционной смеси пятна 3-гидроксикинуренина на пластинке для ТСХ не было обнаружено. Структура полученных эфиров подтверждалась масс-спектрометрически на MALDI-TOF масс-спектрометре. На масс-спектрах вышеуказанных алкиловых эфиров имелись высокоинтенсивные сигналы молекулярных ионов [М+Н] с незначительной фрагментацией. В таблице 4 приведены основные хроматографические (Rr) и масс-спектрометрические (значение redi, молекулярного иона) характеристики

синтезированных эфиров метаболитов триптофана.

' < • :

Рисунок 8. Тонкослойная хроматограмма кинуренина (дорожка №1) и пропилового эфира кинуренина (дорожка №2) в системе этилацетат:пиридин: уксусная кислота:вода:эфир (5:5:1:3:4, \lvl\l\l\) после проявления хлором и крахмал иодидом.

22

Таблица 4. Основные хроматографические (Rf) и масс-спектрометрические (значение m/z молекулярного иона) характеристики синтезированных эфиров метаболитов триптофана.

Вещество Rr* m/z молекулярного иона, [М+Н]+ Ожидаемое m/z молекулярного иона, [М+Н]+

Триптофан (ТЛР) 0.58 - -

Кинуренин (КУК) 0.52 - -

3-гидроксикинуренин (3-НК) 0.51 - -

ТИР метиловый эфир 0.76 219.056 219.113

ТКР пропиловый эфир 0.83 247.237 247.145

ТКР изобутиловый эфир 0.85 261.178 261.160

КУЫ метиловый эфир 0.73 223.123 223.108

КУЫ пропиловый эфир 0.82 251.175 251.139

КТО изобутиловый эфир 0.87 265.190 265.155

3-ПК метиловый эфир 0.7 239.090 239.103

3-НК пропиловый эфир 0.8 267.198 267.134

3-НК изобутиловый эфир 0.9 281.147 281.150

* Хроматографическая система - Этилацетат: Пиридин: Уксусная кислота: Вода: Диэтиловый эфир (5:5:1:3:4, по объемам)

МАЬШ-ТОР масс-спетрометрическая детекция З-гидроксикинуренина, кинуренина и триптофана в плазме крови

Пробоподготовку и МАЬ01-ТОР масс-спектрометрический анализ триптофана, кинуренина и 3-гидроксикинуренина в виде их изобутиловых эфиров проводили как описано в главе «Материалы и методы». На рисунке 9 приведен МАЬШ-ТОР масс-спектр изобутиловых эфиров триптофана, кинуренина и 3-гидроксикинуренина в плазме крови человека. На приведенном масс-спектре отчетливо видны высокоинтенсивные пики молекулярных ионов изобутиловых эфиров. Наличие пика молекулярного иона изобутилового эфира 3-гидроксикинуренина ([М+Н]+=281.171) дополнительно свидетельствует о его стабильности в условиях анализа, что указывает на принципиальную возможность разработки метода его количественного определения масс-спектрометрическими методами, а также на высокую чувствительность анализа, учитывая объем анализируемого образца 0,5 мкл и наномолярные концентрации 3-гидроксикинуренина в плазме крови.

Рисунок 9. MALDI-TOF масс-спектр изобутиловых эфиров триптофана (1, [М+Н]'=261.231), кинуренина (2, |М+Н]+=265.215) и 3-гидроксикинуренина (3, [М+Н]+=281.171) в плазме крови человека (объем нанесения: эквивалент 0,5 мкл плазмы крови).

Полученные нами алкиловые зфиры могут быть анализированы не только с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии, недостатками которой является дороговизна оборудования и сложность количественного определения, но также с помощью ВЭЖХ с масс-спкектрометрической детекцией. Так, в литературе описан ряд методов количественного определения аминокислот в виде алкиловых эфиров с помощью ВЭЖХ-МС (Rashed M.S. et al., 1997; Harder U. et al., 2011). Авторы отмечают высокую чувствительность масс-спектрометрического определения аминокислот в виде эфиров за счет повышения их сродства к протону и, соответственно, более эффективной ионизации, что позволяет использовать для анализа минимальный объем образца и делает эти методы перспективным для клинического скрининга, в том числе, скрининга новорожденных. Особенно стоит отметить опубликованный совсем недавно метод определения хиполиновой кислоты в сыворотке крови в виде ее дибутилового эфира с помощью ВЭЖХ-МС, обладающий очень высокой чувствительностью и требующей минимальное количество образца (Meinitzer A. et al., 2014). Стоит также упомянуть, что точность и воспроизводимость метода можно повысить за счет использования в качестве внутренних стандартов гомологичных эфиров соответствующих метаболитов триптофана ввиду их

сходных физико-химических свойств. В связи с вышеизложенным, в наших дальнейших исследованиях предполагается применение данного подхода для разработки метода одновременного количественного определения 3-гидроксикинуренина, кинуренина и триптофана в плазме крови в виде их алкиловых эфиров с помощью ВЭЖХ с масс-спектрометрической детекцией. Таким образом, полученные нами алкиловые эфиры кинуренина, 3-гидроксикинуренина и триптофана могут быть использованы для МА1ДЭ1-ГОР масс-спетрометрической детекции этих метаболитов, но также являются первым шагом в разработке нового метода их количественного определения в плазме крови с помощью ВЭЖХ-МС.

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый метод количествешюго определения серотонина в тромбоцитах крови человека с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрической детекцией, пригодный для использования в клинической практике. Предел количественного определения серотонина (Ш(?) - 8,8 нг/мл. Оптимизирован способ пробоподготовки, способствующий химической сохранности серотонина, а также обеспечивающий максимальную целостность тромбоцитов при осаждении, что предотвращает потерю серотонина для анализа, в связи с его выходом в плазму.

2. Разработанный метод количественного определения серотонина в тромбоцитах крови апробирован на группе здоровых добровольцев и группе пациентов с эндогенными депрессивными расстройствами. Средний уровень тромбоцитарного серотонина у пациентов составил 1,39±0,73 нмоль/109 тромбоцитов, что достоверно ниже среднего уровня тромбоцитарного серотонина у здоровых добровольцев, который составил 3,84±1,04 нмоль/109 тромбоцитов (р<0,001).

3. Разработан новый метод количествешюго определения кинуренина в плазме крови с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической детекцией, пригодный для использования в клинической практике. Предел количественного определения кинуренина (ЬО<3) - 21,24 нг/мл.

4. Разработанный метод количествешюго определения кинуренина в плазме крови апробирован на группе пациентов с эндогенными депрессивными расстройствами. Средний уровень кинуренина в плазме крови пациентов составил 1.63±0.54 мкмоль/л. Выявлена гетерогенность группы по концентрации кинуренина в плазме крови; диапазон полученных значений: от 1,03 мкмоль/л до 3,10 мкмоль/л кинуренина.

5. Для повышения стабильности 3-гидроксикинуренина в образцах плазмы крови в условиях пробоподготовки и анализа был разработан подход, заключающийся в защите его карбоксильной группы путем получения алкиловых эфиров, которые были охарактеризованы тонкослойной хроматографией и МА1Л31-ТОР масс-спектрометрией.

Подтверждена их стабильность в условиях масс-спектрометрического анализа и показана принципиальная возможность детекции З-гидроксикинуренина в виде его алкиловых эфиров в плазме крови человека.

6. Синтезированы и охарактеризованы алкиловые эфиры триптофана, кинуренина и 3-гидроксикинуренина, которые могут быть использованы для дальнейшей разработки метода одновременного количественного определения этих метаболитов в плазме крови методом ВЭЖХ с масс-спектрометрической детекцией.

7. Совокупность разработанных методов определения метаболитов триптофана составляет методическую основу для изучения нарушений метаболизма триптофана при эндогенных депрессивных расстройствах, а также при других психических и соматических заболеваниях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шилов Ю.Е.. Безруков М.В. Кинуренины в патогенезе эндогенных психических заболеваний // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2013. - № 1. - С. 35 -41.

2. Безруков М.В., Шилов Ю.Е., Шестакова Н.В., Клюшник Т.П. Биологическая оценка выраженности депрессии - новый метод определения концентрации тромбоцитарного серотонина // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. - 2014. - Т. 114, №8. -С. 52-58.

3. Шилов Ю.Е.. Безруков М.В., Клюшник Т.П. Масс-спектрометрический метод определения содержания триптофана и его метаболитов // Материалы IV Международной Интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии». -Казань, 2013. -Т. 2. - С. 159 - 163.

4. Безруков М.В., Шилов Ю.Е.. Бархатова А.Н., Клюшник Т.П. Количественное определение тромбоцитарного серотонина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии: применение в психиатрической практике // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Междисциплинарный подход в понимании и лечении психических расстройств: миф или реальность?». - Санкт-Петербург, 2014. - С. 13 - 15.

5. Баймеева Н.В, Шилов Ю.Е.. Мирошниченко И.И., Клюшник Т.П. Количественное определение кинуренина методом тандемной хроматомасс-спектрометрии для применения в психиатрической практике II Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Междисциплинарный подход в понимании и лечении психических расстройств: миф или реальность?» — Санкт-Петербург, 2014. - С. 12-13.

6. Шилов Ю.Е., Баймеева Н.В., Безруков М.В., Клюшник Т.П. Разработка новых методов определения метаболитов триптофана для клинической практики // Психиатрия. — 2014. -№3. - С. 73 - 74. Принято в печать.

Подписано в печать:

21.01.2015

Заказ № 10495 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru