Новые инфекционные агенты - Метапневмовирус и Бокавирус человека

Козулина, Ирина Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Новые инфекционные агенты - Метапневмовирус и Бокавирус человека
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Новые инфекционные агенты - Метапневмовирус и Бокавирус человека"

004600642

На правах рукописи

КОЗУЛИНА ИРИНА СЕРГЕЕВНА

НОВЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ АГЕНТЫ -МЕТАПНЕВМОВИРУС И БОКАВИРУС ЧЕЛОВЕКА

03.02.02 - вирусология 14.01.09- инфекционные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертацвн на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

8 АПР 2010

Москва-2010

004600642

Работа выполнена в Учреждении РАМН НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН ГОУ ВПО РГМУ им. Н. И. Пирогова Росздрава

Научные руководители:

кандидат биологических наук Исаева Елена Ивановна

Заслуженный врач РФ, доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН

Самсыгана Галниа Андреевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук доктор медицинских наук, профессор

Иванова Валерия Тимофеевна Селькова Евгения Петровна

Ведущее Учреждение:

Учреждение РАМН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Защита диссертации состоится <х(> 2010 г. в 12 час. на заседании

Диссертационного Совета Д.001.020.01 при'Учреждении РАМН НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН по адресу: 123098 Москва, ул. Гамалеи, д. 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

Автореферат диссертации разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук Е. И. Бурцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) имеют наибольший удельный вес в структуре всей инфекционной патологии, поэтому расшифровка их этиологии является одной из актуальных проблем ВОЗ [Селькова Е. П. 2001; Защитников А. Л. 2007; Самсыгина Г. А. 2008; Покровский В. И. 2009]. В России ежегодно регистрируется 27,3-41,2 млн больных ОРВИ, из них 45-60% - дети. Так, за первое полугодие 2009 г заболеваемость ОРВИ составила 10366,9 на 100 тысяч населения [Онищенко Г. Г. 2009].

ОРВИ остаются неконтролируемыми инфекциями, что связано с широким спектром возбудителей, высокой контагиозностью, отсутствием для большинства из них вакцино-профилактики, а также формирующейся резистентностью к лекарственным препаратам [Львов Д. К. 2008; Селькова Е. П. 2008; Самсыгина Г. А. 2008].

К известным возбудителям ОРВИ относятся вирусы гриппа, парагриппа, респираторно-синцитиачьный (HRSV), адено-, рино-, энтеро- и реовирусы. Однако перечисленные инфекционные агенты не исчерпывают всей этиологии ОРВИ. До недавнего времени, несмотря на обширные диагностические исследования, существенная часть инфекций органов дыхания оставалась нерасшифрованной [Liolios L, 2001; Kokso-Koivisto J. 2002]. В течение последних лет были идентифицированы новые, ранее неизвестные возбудители респираторных инфекций [Broor S. 2008; Sloots Т. Р. 2008], к числу которых относятся Метапневмовирус (Human Metapneumovirus, HMPV) и Бокавирус человека (Human Bocavirus, HBoV).

Вирусы впервые были выделены в носоглоточных смывах у детей с острыми респираторными заболеваниями (ОРЗ) неясной этиологии в Нидерландах и Швеции [Van den Hoogen В. G 2001; Allander T. 2005]. Впоследствии они были обнаружены у людей всех возрастов на всех континентах Земли. В настоящее время многие зарубежные исследователи рассматривают HMPV и HBoV высокозначимыми вирусными патогенами в структуре детской заболеваемости ОРВИ с поражением нижних дыхательных путей (ДП) [Landry M. 2008; Hengst M. 2008; Cilla G. 2008; Esposito S. 2008; Cilla G. 2009; Garcia M. 2009]. Вместе с тем HMPV способен проникать в ЦНС с развитием тяжелых энцефалитов [Schildgen О. 2005]. О способности HBoV вызывать системную инфекцию свидетельствуют данные по обнаружению ДНК HBoV в крови, кале, моче и жидкости из среднего уха [Lindner J. 2008].

Ретроспективные серологические исследования сывороток крови, полученных от больных ОРЗ, позволили установить, что HBoV циркулирует в популяции людей, по крайней мере, более 10 [Zhao L. Q. 2009], a HMPV - более 50 лет [Мажуль Л. А. 2007]. Причины столь позднего открытия этих вирусов связаны с длительностью периода развития инфекции и отсутствием цитопатического эффекта (ЦПЭ) в большинстве чувствительных к HMPV клеточных культур [Hamelin M. Е. 2004; Lin F. 2008; Dijkman Я. 2009; Maranich A, 2009].

Эпидемиологические и клинические исследования новых инфекций в нашей стране только начинаются [Швец Е. Ю. 2009; Евсеева Е. Л. 2009].

В связи с этим актуальной является проблема определения эпидемиологических особенностей циркуляции новых вирусов, нозологических форм заболеваний, ассоциированных с ними, поиска чувствительных к вирусам клеточных систем различного видового и тканевого генеза. Решение указанной проблемы позволит получить вирусы, специфические антитела к ним, использовать их в ИФА для мониторинга инфекций у

пациентов в РФ, исследовать патогенез инфекции, а также проводить скрининг лекарственных препаратов с целью оценки их профилактической и терапевтической эффективности.

Цель исследования: определение значения HMPV и HBoV в этиологии респираторных заболеваний у детей в России, изучение патогенетических и клинических особенностей HMPV-и HBoV-инфекций, а также изучение эффективности широко используемых в клинической педиатрии лекарственных препаратов в отношении HMPV.

Задаче исследования

1. Определение частоты изолированных и сочетанных форм HMPV и HBoV инфекций у детей разного возраста, госпитализированных в клиники Москвы с диагнозом ОРВИ; идентификация клинических особенностей течения HMPV и HBoV moho- и ко-инфекций;

2. Выявление эпидемиологических особенностей циркуляции HMPV и HBoV за период 20032009 гг.; изучение популяционного иммунитета к HMPV;

3. Определение спектра пермиссивных к HMPV клеточных культур;

4. Моделирование HMPV инфекции на мышах с последующим изучением патогенеза;

5. Сравнение эффективности противовирусного действия лекарственных препаратов Арбидол, Оциллококцинум и Рибавирин в отношении HMPV.

Научная новизна

У детей, госпитализированных в клиники Москвы с диагнозом ОРВИ, установлена важная роль новых вирусов в этиологии отдельных нозологических форм инфекций, изучены эпидемиологические закономерности циркуляции HMPV и HBoV и выявлены клинические особенности ассоциированных с ними моно- и ко-инфекций.

При серологическом исследовании сывороток крови детей в возрасте от 1 месяца до 15 лет установлено, что 40% детей к началу второго года жизни и 60,9% детей к 5-летнему возрасту имеют антитела к HMPV.

Впервые показано, что HMPV активно реплицируется в клетках конъюнктивы человека Chang Conjuctiva и почки кошки CRFK.

Впервые в России выделен вирус HMPV от ребенка с ОРВИ, депонирован в Государственную коллекцию вирусов НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН, депонент «НМ-1» № 2476.

Апробировано использование белых мышей для моделирования HMPV инфекции, изучены некоторые особенности патогенеза инфекции.

Показана эффективность лекарственных препаратов Арбидол и Оциллококцинум в отношении HMPV.

Практическая значимость

1. Штамм HMPV «НМ-1» депонирован в Государственную коллекцию вирусов НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН, депонент № 2476.

2. Применение выделенного в ходе настоящей работы штамма «НМ-1» и высокоактивных антител к нему позволяет вести мониторинг заболеваний, ассоциированных с HMPV.

3. Создание экспериментальных моделей in vitro и in vivo дает возможность изучения патогенетических аспектов HMPV инфекции, скрининга лекарственных противовирусных препаратов и создания диагностических тест-систем.

4. Выявленные клинико-эпидемиологические особенности HMPV и HBoV инфекций способствуют своевременной диагностике заболеваний.

5. Высокая эффективность препарата Оциллококцинум против HMPV обусловливает возможность его применения в клинической практике для профилактики и лечения заболеваний у детей.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Этиологическая структура ОРЗ у детей, госпитализированных в стационары г. Москвы, представлена в 8,3-14,2% HMPV и в 13,5-17,0% HBoV инфекциями. Циркуляция HMPV и HBoV круглогодичная, пики активности приходятся на периоды с марта по июнь и с сентября по декабрь.

2. Основными нозологическими формами HMPV инфекции являются бронхиты, пневмонии и бронхиолиты, HBoV инфекции - обструктивные ларинготрахеиты. Наиболее восприимчивы к HMPV и HBoV дети раннего возраста.

3. Чувствительными к HMPV являются клетки перевиваемых линий человека и животных: Chang Conjunctiva, А549, Нер-2, НТ29, CRFK, СПЭВ, ВНК-21, Vero, и LLC-MK2. Наиболее активно HMPV накапливается в клеточной линии CRFK.

4. Инфицирование HMPV белых беспородных мышей приводит к появлению маркеров инфекции: накопления вируса в легких и выработки специфических антител.

5. Препараты Оциллококцинум и Арбидол способны подавлять размножение HMPV в культуре клеток Chang Conjunctiva и при экспериментальной инфекции у белых мышей.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на Международном конгрессе «Стратегия и тактика борьбы с внутрибольничными инфекциями на современном этапе развития медицины», Москва, 2006 г.; IX съезде Всероссийского научно - практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения РФ», Москва, 2007 г.; VII и VIII конгрессах детских инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей», Москва, 2008 и 2009 гг.; I Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням, Москва, 2009 г.; II Ежегодной конференции молодых ученых НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского, Москва, 2009 г.; IV Европейском педиатрическом конгрессе Europaedíatrics, Москва, 2009 г.; XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2009 г.; X Международном конгрессе "Здоровье и образование в XXI веке", Москва, 2009 г.

На IV Европейском педиатрическом конгрессе Europaediatrics (Москва, 2009) стендовый доклад по теме диссертации вошел в 20 лучших из более чем 500 представленных; на VIII Конгрессе детских инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики» (Москва, 2009) доклад на конкурсе молодых ученых удостоен диплома за 1 место.

В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отделов экологии вирусов с Центром по экологии и эпидемиологии гриппа, отдела общей вирусологии и апробационного совета НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 28 января 2010 года.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 4 статьи в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК, и 8 - в материалах международных и российских конгрессов и съездов.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 134 листах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, методов и результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, содержащего 278 источников, из них 23 отечественных и 255 зарубежных. Иллюстративный материал представлен 22 таблицами и 25 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы н методы исследований

Носоглоточные смывы. За период с января 2003 по май 2009 гг. исследовано 2826 носоглоточных смывов детей в возрасте от 1 месяца до 15 лет, госпитализированных в инфекционные отделения Морозовской, Филатовской и Тушинской ДГКБ г. Москвы с острыми заболеваниями верхних и нижних ДП.

Материал хранили при -20°С до исследования. Образцы тестировали на присутствие респираторных вирусов: HMPV, HBoV, вирусов гриппа типа A (H1N1, H3N2) и типа В, парагриппа, респираторно-синцитиального вируса (HRSV) и аденовируса.

Клеточные линии. С целью определения пермиссивности к HMPV исследовано 19 перевиваемых клеточных линий человека и животных, любезно предоставленных профессором Р. Я. Подчерняевой из Государственной коллекции культур клеток (табл. 1, стр. 5).

Животные. Эксперименты проводили на белых беспородных мышах самцах весом 1214 г. Работу с мышами осуществляли согласно инструкциям по работе с лабораторными животными. Перед исследованием мышей подвергали 5-дневному карантину. Животные получали стандартный рацион питания и содержались в равноценных условиях.

Противовирусные препараты. На экспериментальных моделях HMPV инфекции in vitro и in vivo изучена активность противовирусных препаратов Арбидол (Фармстандарт-Лексредства ОАО, Россия, артикул 100005977), Оциллококцинум («Лаборатории Буарон», Франция, per. удостоверение П №014236/01-2002) и Рибавирин (Озон ООО, Россия, артикул 100007321).

Полимеразнаи цепная реакция (ПЦР). Для выделения РНК и ДНК респираторных вирусов применяли коммерческие тест-системы «Рибо-сорб» производства «Амплисенс» (Москва) в соответствии с инструкцией производителя.

Для детекции HMPV и других ОРВИ использовали ПЦР тест-системы ООО "Компании Биоком" и «Амплисенс» (Москва). С целью выявления HMPV и HBoV использовали праймеры, любезно предоставленные профессором С. О. Вязовым (Институт вирусологии, Эссен, Германия).

Для идентификации HMPV праймеры из области N гена - размер ДНК продукта 171 bp:

1. 750as - 5'- TGCTTTGCTGCCTGTAGATGATGAG (для получения сДНК);

2. Ills - 5'- AGAGTCTCAGTACACAATMAAAAGAG;

3. 442as - 5' - GCCATTGTTTTYCTTGCYTC

ПЦР проводили в двухраундовом режиме по 35 циклов каждый. Для первого раунда использовали праймеры 750as и Ills, для второго 111 s и 442as.

Для HBoV использовали праймеры из области гена белка нуклеокапсида - размер ДНК продукта 313 bp:

1. sv608s -5 '-TGA AAA CAG TGA CCA CCA AGT AC;

2. sv607as -5 '-GTG ТОТ TCC TTC TGG GTT AGT GC.

ПЦР проводили в режиме автоматической амплификации на приборе «Терцик» (ЗАО «ДНК-Технология», Москва). Продукты ПЦР анализировали методом горизонтального электрофореза в 1,7 % агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, с последующей визуализацией в ультрафиолетовом спектре на транслюминаторе Vilber Louwmat.

Таблица 1

Клеточные линии, использованные в работе

Наименование клеточной линии (обозначение) Среда культивирования

Диплоидные клетки легкого эмбриона (ЛЭЧ) Игла-MEM и 199 ( 1:1 ) + 10% ЭТС; ИП = 2,0

л ж Карцинома легкого (А549) Игла-MEM и 199 (1:1) + 10% ЭТС; ИП = 3,0

й о 5 Печень (Chang liver) Игла-MEM и 199 (1:1) + 10% ЭТС; ИП = 3,0

г Гепатома (СН5) ДМЕМ + 10% ЭТС; ИП = 2,5

н и 5 Гепатома (Lunet) ДМЕМ + 10% ЭТС; ИП = 2,5

и Костный мозг человека с лейкемией (L41) Игла-MEM + 10% ЭТС; ИП = 4,0

S Конъюнктива (Chang Conjunctiva, клон 1-5С4) Игла-MEM + 10% ЭТС; ИП = 3,0

& и а Карцинома кишечника (НТ-29) ДМЕМ + 10% ЭТС; ИП = 2,5

Карцинома гортани (Нер-2) Игла-MEM и 199 (1:1) + 7% ЭТС; ИП = 4,0

Карцинома шейки матки (HeLa) 199+ 10% ЭТС; ИП = 5,0

§ I а Почки собаки (MDCK) Игла-MEM + 10% ЭТС; ИП = 4,0

Почки свиньи (СПЭВ) 199 + 10% СККРС; ИП = 5,0

Почки обезьяны (Vero) Игла-MEM + 10% ЭТС; ИП = 4,0

Р Почки кошки (CRFK) ДМЕМ+ 7% ЭТС; ИП = 3,0

и о Фибробласты кошки (СС-81) 199+10% СККРС; ИП = 4,0

1 Фибробласты мыши (L929) 199 + 7% ЭТС; ИП = 5,0

я Я 8. ñ Мозг хорька (Mpf) ДМЕМ + 10% ЭТС; ИП=4,0

Почки сирийского хомячка (ВНК-21) 199+10% СККРС; ИП = 4,0

Почки эмбрионов макаки-резус (LLC-MK2) Игла-MEM + 10% ЭТС; ИП = 3,0

Примечание: ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка; СКРС - сыворотка крови крупного рогатого скота; ИП - индекс пролиферации.

Непрямой иммуноферментный анализ (ИФА). Идентификацию в носоглоточных смывах вирусов гриппа типа A (H1N1, H3N2) и типа В, парагриппа, HRSV и аденовируса проводили с кроличьими сыворотками, моноспецифичными для каждого вируса, комплекс антиген-антитело выявляли с помощью антител направленных против иммуноглобулинов кролика и конъюгированных с пероксидазой хрена.

Детекцию HMPV в культуральной жидкости и суспензии легких инфицированных мышей осуществляли с сывороткой кролика к HMPV.

Для определения специфических антител к HMPV в сыворотке крови детей в качестве антигена использовался супернатант HMPV-инфицированной клеточной среды. Реакцию учитывали по оптической плотности при 492 нм на спектрофотометре фирмы «Пикон» (Россия).

Выделение HMPV на культуре клеток. Первичное заражение монослоя культур клеток проводили по методике Davies H.W. с соавт. [Davies H.W 1978].

Носоглоточные смывы, позитивные на HMPV в ПЦР и отрицательные на другие респираторные вирусы, были инокулированы на монослой культур клеток в среде, содержащей 5 мкг/мл трипсина.

Планшеты с зараженной культурой инкубировали при 37°С в течение 24 дней. Каждые 2-3 дня наблюдали за появлением ЦПЭ, отбирали пробы по 100 мкл. К клеточной культуре вновь добавляли 100 мкл среды, содержащей трипсин. Инфицированные супернатанты культуры клеток исследовали на присутствие РНК HMPV в ПЦР. При отсутствии положительной реакции после первичного заражения выполняли до 3 последовательных пассажей, после чего пробу считали отрицательной. При невозможности использовать первичный монослой клеток, инфицированный супернатант переносили на новый монослой этой же клеточной линии.

Определение инфекционного титра вируса проводили путем внесения десятикратных рабочих разведений вируса на подготовленный монослой клеток. Вирус был адсорбирован в течение часа при температуре 37°С, после чего была добавлена соответствующая среда, содержащая 2% сыворотки и 5 мкг/мл трипсина. Инфицированные клетки инкубировали при 37°С. После этого в надосадочной жидкости клеточной культуры определяли инфекционный титр HMPV (среднее реципрокное значение lg ± 5).

Создание экспериментальной модели HMPV-инфекции ш vivo. Для заражения белых мышей использовали вирус HMPV, который был предварительно оттитрован на клеточной линии почки кошки CRFK. Под легким эфирным наркозом мышам интраназально инокулировапи надосадочную жидкость клеточной культуры CRFK с инфекционным титром HMPV 5,5 lg ТЦДзо. Контрольным животным был введен в том же объеме супернатант неинфицированной клеточной культуры.

На 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 14, 28, 30 и 32 дни мышей взвешивали и забирали у них легкие, печень, мозг и селезенку для исследования в ПЦР на наличие РНК HMPV, а также кровь для выявления специфических антител к HMPV. Каждый образец тестировали в дубликатах методами: ОТ-ПЦР и выделением вируса на клеточной линии почки кошки CRFK.

Результаты серологического исследования сывороток крови мышей представлены как среднее значение log2 титра специфических антител со средним отклонением ± 5 в зависимости от результатов 3 отдельных экспериментов.

Изучение цитотоксинеского действия противовирусных препаратов па культуре клеток. Токсичность препаратов оценивали по жизнеспособности клеточных линий CRFK и

Chang Conjunctiva, Для этого клетки культивировали в 9б-луночных панелях фирмы «Costar» в соответствующей среде (табл. 1). Монослой клеток CRFK и Chang Conjunctiva культивировали в присутствии лекарственных препаратов в концентрациях от 12,5 до 500 мкг/мл в течение 72 часов при 37°С.

Расчет параметров токсичности проводили используя установленные в эксперименте значения максимальной переносимой концентрации (МПК), т.е. максимальной концентрации, которая еще не вызывает цитодеструктивных изменений в тканевой культуре, и минимальной активной концентрации (МАК).

Изучение эффективности противовирусных препаратов в отношении HMPV in vitro. Противовирусное действие препаратов изучали на линии эпителиальных клеток человека Chang Conjunctiva. Оценку противовирусной эффективности используемых лекарственных препаратов осуществляли в соответствии с требованиями Фармакологического государственного комитета РФ (2005).

Система оценки противовирусного действия препаратов в культуре клеток включала в себя количественное изучение подавления развития репродукции HMPV в клетках Chang Conjunctiva. Противовирусный эффект препаратов in vitro оценивали по показателям: снижению уровня накопления вируса под воздействием препарата (Д lg) и коэффициенту ингибирования (КИ).

Изучение эффективности противовирусных препаратов в отношении HMPV in vivo. Все изучаемые препараты вводили мышам перорально через 24 часа после инфицирования по рекомендованным производителями схемам, концентрации препаратов соответствовали равноэффекгивным суточным дозам для человека.

Арбидол вводили в дозе 60 мг/кг ежедневно 1 раз в сутки в течение 4 дней. Оциллококцинум - в дозе 50 мг/кг 2 раза с интервалом в 2 суток. Рибавирин - 40 мг/кг ежедневно в течение 4 суток.

На 3 и 5 сутки после инфицирования проводили оценку противовирусной активности исследуемых лекарственных препаратов согласно требованиям, изложенным в Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (2005). Определение противовирусной активности препаратов проводили по снижению инфекционного титра вируса в ПЦР и подавлению экспрессии вирусных антигенов, выявляемой в реакции ИФА.

Клиническое обследование детей. С целью определения клинических особенностей HMPV и HBoV инфекций с февраля по апрель 2008 г. обследованы 169 детей, госпитализированных в Морозовскую ДГКБ с диагнозом ОРВИ. Исследование включало сбор анамнестических данных, ежедневный клинический осмотр больных, лабораторно-инструментальные методы диагностики. Результаты регистрировались в специально разработанных дня этого картах.

Статнстическая обработка данных. Статистический анализ результатов проведен с применением ПО Microsoft Excel. Использовались непараметрический критерий Фишера, параметрический t-критерий Стьюдента; различия считали достоверными при р<0,05, высоко достоверными при pO.OOl, недостоверными при р>0,05. Для определения зависимости частоты инфекций от возрастной категории, применяли непараметрический метод х2-

Расчет инфекционных титров вируса проводили по методу Рида и Менча [Reed, Muench 1938]. За титр вируса принимали наибольшее разведение супернатанта зараженной культуры, в

котором идентифицировалась РНК вируса. Титр выражали обратным значением разведения вируса, в котором определяли РНК (1§/мл).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Эпидемиологические особенности циркуляции НМРУ и НВоУ инфекций

Из 2826 детей в возрасте от ] месяца до 15 лет, госпитализированных в стационары г. Москвы с острыми заболеваниями верхних и нижних ДП за период с 2003 по 2009 гг., НМРУ был идентифицирован у 340 (12,0%), из них как моновирусная инфекция у 3,91% и в составе ко-инфекций у 8,1% детей. НВоУ инфекция была зарегистрирована у 306 (14,0%) из 2189 обследованных пациентов: только НВоУ - 3,97% и в сочетании с другими возбудителями ОРВИу 10,1% детей.

Частота детекции изучаемых вирусов варьировала в разные годы исследования: НМРУ -от 8,3% в 2003 г. до 14,2% в 2006 и 2008 гг. и НВоУ - от 13,5% в 2006 г. до 17,0% в 2008 г. (р<0,001, метод Фишера) (рис. 1).

2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 Годы исследования

Рис. 1. Долевое участие НМРУ и НВоУ в структуре общей инфекционной патологии

дыхательных путей у детей, госпитализированных в стационары г. Москвы за период 2003-2009 гг. (в 2009 г. исследования велись только в первой половине года)

Из рис. 1 также видно, что в последние годы отмечается тенденция к увеличению доли вызываемых этими вирусами инфекций в структуре общей инфекционной патологии дыхательных путей в детском возрасте, о чем свидетельствует постепенное нарастание частоты выявления новых вирусов к 2009 г.

Исследуемые патогены достоверно чаще определялись в составе смешанных инфекций на протяжении всех лет исследования (р<0,001, метод Фишера; •£> 16,28, число степеней свободы = 8, табличное значение %2 = 15,51 для р=0,05) (рис. 2 и рис. 3). Моно-инфекции зарегистрированы у 24,2-37,3% детей, позитивных по НМРУ, и у 21,1-37,3% детей, позитивных по НВоУ. Ассоциации с изучаемыми новыми вирусами формировали различные возбудители ОРВИ.

Рис. 2. Соотношение moho- и микст-HMPV инфекций в разные годы исследования (частота детекции HMPV указана в процентах от общего числа детей с ОРЗ, обследованных в разные годы; в 2009 г. исследования велись только в первой половине года).

0 микст ■ моно

2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 Годы исследования

Рис. 3. Соотношение моно- и микст-НВоУ-инфекций в разные годы исследования (частота детекции HBoV указана в процентах от общего числа детей с ОРЗ, обследованных в разные годы; в 2009 г. исследования велись только в первой половине года).

0 микст ■ моно

2005 2006 2007 2008 2009 Годы исследования

Изучение сезонного распределения инфекций выявило, что HMPV циркулировал в популяции детей на протяжении всех календарных месяцев всего периода исследования. Исключение составил июнь 2008 г., по-видимому, в связи с малым количеством обследованных детей (10 человек), т.к. в аналогичный период других лет исследования частота детекции HMPV колебалась в пределах 4,6-16,7%. Подъем заболеваемости респираторными инфекциями, ассоциированными с HMPV, регистрировался дважды в год. первый - начинался с марта, достигал максимума в апреле-мае и постепенно снижался в начале лета, второй -осенью - в начале зимы (рис.4). Существование пиков активной циркуляции изучаемого вируса статистически достоверно для каждого года наблюдения (р<0,05).

—♦—2005-2006 ......2006-2007

-- 2007-2008 -2008-2009

Рис. 4. Сезонное распределение НМРУ инфекции среди госпитализированных детей с ОРВИ (2003-2009 гг.).

В 2003-2004 гг. частота ОРЗ, ассоциированных с НМРУ, не превышала 16,7-16,2% от числа обследованных в разные месяцы детей. С 2005 по 2007 гг. волны активной циркуляции стали достигать 27,3-29,8% и в ноябре 2008 г. был зарегистрирован максимальный уровень заболеваемости НМРУ - 31,9% от количества обследованных в этом месяце. В весенний эпидемический сезон 2009 г. частота детекции исследуемого вируса составила 14,1-18,5% (р<0,001, метод Фишера).

Была выявлена следующая зависимость; если в осенний сезон пик активности НМРУ был низким (2004 г.), то в следующий за ним весенний сезон пик был высоким, и наоборот, если осенью регистрировался высокий уровень заболеваемости НМРУ (2007 и 2008 гг.), то весной наблюдался спад (рис. 4).

НВоУ циркулировал с 2005 по 2009 гг. в г. Москве круглогодично. Наибольшая активность вируса отмечалась с сентября по декабрь (р<0,01), перекрывая пики активной циркуляции НМРУ (рис. 5).

IX X XI XII I II III IV V VI

Период исследования (месяцы) —»—2005-2006 ......2006-2007

- - 2007-2008 -2008-2009

Рис. 5. Сезонное распределение HBoV инфекции среди госпитализированных детей с ОРЗ (2005-2009 гг.).

Наиболее высокий уровень респираторных заболеваний, ассоциированных с НВоУ, был зарегистрирован в ноябре-декабре 2005 г. - 32,3-28,6% и октябре-ноябре 2008 г. - 29,8-31,3 от числа детей, обследованных в каждом месяце. Весной и в начале лета также отмечались волны активности, но значительно менее выраженные. Частота НВоУ инфекций нарастала к апрелю и сохранялась на достигнутом уровне до начала лета. В 2005-2006 гг. к июлю отмечался спад активности изучаемого вируса с 18,8-16,0% до 8,3-5,6%, соответственно. А в 2007-2008 гг., наоборот, к середине лета было зарегистрировано еще большее нарастание уровня заболеваемости ОРЗ НВоУ этиологии - с 10,5-25,0% до 16,7-30,0%.

Клинические особенности НМРУ и НВоУ инфекций

При изучении нозологического спектра установлено, что НМРУ и НВоУ инфекции идентифицировались в структуре разных ОРВИ и характеризовались поражением как верхних, так и нижних ДП. Вместе с тем наиболее высокая частота НМРУ инфекций наблюдалась у детей с патологией нижних отделов респираторного тракта, а НВоУ инфекций - у пациентов с заболеваниями верхних ДП.

Так, у детей в возрасте от 1 месяца до 15 лет наибольший удельный вес НМРУ имел в этиологии острых бронхитов и пневмоний, при этом доля НМРУ позитивных больных была одинаковой в структуре обеих нозологий - 29,2% (рис. 6). У детей с бронхитами изучаемый вирус несколько чаще встречался в качестве моно-инфекции, а у пациентов с пневмониями превалировали ко-инфекции. Так, среди бронхитов моно-НМРУ-инфекция зарегистрирована у 16,7% детей, в сочетании с НИБУ - у 8,3% и в комбинации с вирусами гриппа, парагриппа и аденовирусами - у 4,2% больных (р<0,05, метод Фишера).

В структуре пневмоний одинаково часто выявлялись как моно-инфекция, так и ко-инфекция НМРУ с НЯвУ (12,5%). Процент одновременного присутствия в респираторных образцах с НМРУ вирусов гриппа был идентичен таковому у детей с бронхитами и составлял 4,2%. Бронхиолиты в 21,4% случаев были обусловлены НМРУ: у 7,1% детей микст-инфекциями с ШБУ и у 9,5% с вирусами гриппа. Только НМРУ определялся у 4,8% детей (р<0,05, метод Фишера). При этом важно отметить, что в этиологии пневмоний и бронхиолитов ассоциации с НМРУ формировали НЯвУ и вирусы гриппа. У 14,2% больных ОРВИ со стенозирующим ларинготрахеитом 1-2 степени был идентифицирован НМРУ, при этом превалировала моно-инфекция (10,2%).

Наиболее часто НВоУ выявлялся у детей с обструктивными ларинготрахеитами (28,4%) (рис. 6). Моно-инфекция составила 13,6%, ко-инфекции НВоУ с различными респираторными вирусами 14,8%.

Одинаковый процент детекции НВоУ выявлен у больных с острыми бронхитами и пневмониями - 4,2%. При этом в этиологии пневмоний изучаемый вирус идентифицировался исключительно как моновирусная инфекция, тогда как в носоглоточных смывах у детей с бронхитами в 2/3 случаев одновременно присутствовали другие респираторные вирусы. В респираторных образцах детей с бронхиолитами НВоУ обнаружен не был.

А&яявш

7-43,0%

6 -14,8%

5- 13,6%

Обструктивные ларинготрахситы (крупы)

4-4,2% Острые бронхиты

3 -16,7%

7 - 78,6%

нвь»

7 - 17,9%

2 - 7,1%

4- 9,5%

3 - 4,8%

1 - 23,6%

1. тзу

2 - 8,3% 2. Ко- инфекция НИ РУ ШБ У

3. шру

4. Ко-инфекции ШРУ другие респираторные вирусы (кроне И«У);

5. НВоУ

6. Ко-инфекции НВо V другие респираторньЕ вирус ц

7. Другая этиология 2 -12,5%

1 - 18,8%

3 -12,5% Пневмонии

Бронхиолиты

Рис. 6 Дшевое участие }М РУ и НВоУ вэтиологии отдельных нозологических форм СРЗ у детей(2005-2009 гг.).

С целью выявления клинических особенностей HMPV и HBoV инфекций с февраля по апрель 2008 г. на базе боксированных инфекционных отделений Морозовской ДГКБ были обследованы 169 пациентов в возрасте от 1 месяца до 7 лет с острыми ларингитами, ларинготрахеитами и бронхитами.

HMPV инфекция зарегистрирована у 22 детей (13,02%), HBoV - у 34 (20,1 %) детей.

Частота детекции HMPV в структуре ОРВИ была обратно пропорциональна возрасту пациента (р<0,001; х2=9,81): чем младше ребенок, тем выше данный показатель (рис. 7). Более четверти исследуемых респираторных заболеваний (27,5%) в грудном возрасте были вызваны этим вирусом. Частота выявления HBoV оказалась наиболее низкой у детей до года. Затем она возрастала и достигала пика в возрасте от 1 до 3 лет (30,2%), после чего к 5 годам жизни вновь снижалась (р=0,001; %2=6,99) (рис. 7).

i а а а я а

Ч® ех

35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% ■ 0%

27,5%

30,2%

Шщ

fe з

16,7%

10,0%

В HMPV ■ HBoV

<1 1-2 3-6 Возраст (годы)

Рис. 7. Частота выявления НМРУ и НВоУ у детей разных возрастных групп.

Симптомокомплекс изучаемых инфекций представлен в табл. 2, Клиническая картина заболеваний в целом была сходна с таковой при другой этиологии ОРВИ, однако у детей раннего возраста были выявлены некоторые особенности.

Таблица 2

Клинические симптомы НМРУ и НВоУ моно-инфекций у детей

Симптомы HMPV (п* = 19) HBoV (п* = 23)

п % п %

Лихорадка 16 84,2 22 95,7

Ринит 18 94,7 17 73,9

Фарингит 19 100 23 100

Инъецированность сосудов склер 9 47,4 1 4,4

Кашель 17 89,5 23 100

Осиплость голоса 17 89,5 23 100

Дыхательная недостаточность 1-2 ст. 18 94,7 22 95,7

Средний отит 2 10,5 2 8,7

Диспепсия 10** 52,6** 5 17,4

Примечание: * - общее число детей с изолированными формами инфекций;

** - связь НМРУ с диспепсией недостоверна, т.к. все дети получали лекарственные препараты,

способные вызвать данные явления как побочные эффекты.

Так, у всех детей первых б месяцев жизни НМРУ инфекция протекала с развитием обструктивного бронхита - наиболее тяжелой нозологии из вошедших в клиническое исследование. Признаки дыхательной недостаточности появлялись в первые дни заболевания. Несмотря на выраженность симптоматики, температура тела либо кратковременно повышалась до субфебрильных значений, либо вовсе оставалась нормальной. Общая длительность заболевания составляла не менее 9 дней.

В возрасте от 6 месяцев до 2 лет НМРУ инфекция характеризовалась яркостью клинических симптомов. В 90,9% случаев регистрировалась фебрильная лихорадка, причем у 54,5% детей температура тела превышала 39,0°С. У 10 (90,9%) больных из этой возрастной категории НМРУ провоцировал развитие дыхательной недостаточности 1-Й степени, у 2 детей (10,53%) развитие острого среднего отита.

Из 169 детей, вошедших в клиническое исследование, у 2 были идентифицированы сочетанные формы НМРУ инфекции. У 3,5-летней девочки с диагнозом рецидивирующего обструктивного бронхита, осложнившегося сегментарным ателектазом легкого в этиологии была выявлена ассоциация НМРУ с вирусом гриппа типа В. У ребенка 5 лет ко-инфекция НМРУ с вирусом парагриппа привела к развитию обструктивного ларингита II степени в отсутствии неблагоприятного преморбидного фона.

Относительно клинической картины НВоУ-инфекции необходимо отметить, что у детей всех возрастных групп имелась осиплость голоса (100%), свидетельствующая о явлениях ларингита. В 17,4% случаев одновременно отмечались явления диспепсии разной степени выраженности, в основном у детей первых 3 лет жизни.

Сочетанные формы НВоУ инфекции выявлены у 32,4% детей (11 из 169). В комбинации с НВоУ были идентифицированы вирусы парагриппа, гриппа В, аденовирусы и ЖБУ.

Гуморальные иммунитет к НМРУ у детей

В ходе нашей работы на клеточной линии СМК был выделен вирус НМРУ, и нам представилась возможность изучить гуморальный иммунитет к НМРУ у детей.

Для выявления уровня серопозитивности по НМРУ 111 образцов крови детей были исследованы в ИФА. Результаты серологического исследования показали, что более половины (55,9%) детей в возрасте от 1 месяца до 15 лет жизни имеют антитела к изучаемому вирусу (рис. 8).

Установлено, что уровень серопозитивности по НМРУ одинаковый у детей I и II полугодий жизни, затем постепенно нарастает и достигает максимума (85,7%) в возрасте 5-15 лет. При этом более половины (54,5%) детей приобретают специфические АТ к НМРУ к 3 году жизни и около двух третей (60,9%) детей к 5-летнему возрасту (р<0,001, метод Фишера). Достаточно высокий процент (40%) содержания антител к изучаемому вирусу у детей первых месяцев жизни, по-видимому, обусловлен их трансплацентарной передачей от матерей.

Таким образом, более половины (55,9%) детей в возрасте до 15 лет имеют в крови специфические анти-НМРУ антитела. Инфицирование НМРУ происходит преимущественно в возрасте от 6 до 36 месяцев жизни.

g 90% | 80% § 70% | 60% >g 50% g 40% 5 30% | 20% g 10% S? 0%

85,7%

54.5%

60,9%

40,0% 40.0%

1-5 мес. 6-11 мес. 12-35 мес. 3-4 года 5-15 лет Возраст Рис. 8. Специфические антитела к HMPV у детей разного возраста.

Чувствительность клеточных линий человека н жнвотных к HMPV

На чувствительность к HMPV исследовали 7 онкогенных и 3 нормальные перевиваемые клеточные линии человека (табл. 1). При микроскопическом анализе монослоя в течение 22 дней после инфицирования РНК-позитивными смывами мы не наблюдали ЦПЭ ни в одной из клеточных культур человека. Вместе с тем исследование инфицированных супернатантов методом ПЦР показало присутствие РНК HMPV в 4 клеточных линиях: Chang Conjunctiva, А549, Нер-2 и НТ29.

В культуре Chang Conjunctiva РНК HMPV выявлялась с 8 по 18 дни после заражения, пик репликации вируса определялся на 12 день. В клеточной линии Нер-2 репродукция HMPV выявлялась с 8 по 20 дни с наибольшим уровнем вирусной нагрузки на 16 сутки. В клетках карциномы легкого А549 РНК определялась с 10 по 18 дни, пик вирусной активности приходился на 14 день. В культуре клеток НТ-29 репродукция вируса происходила наиболее медленно - с 12 по 20 дни после инфицирования, достигая максимума лишь к 18 дню (рис. 9).

1,4

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Период после инфицирования (дни) ■ СЬ.Со^ипсИуа н А549

О Нер-2 ИНТ29

Рис. 9. Репликация НМРУ в перевиваемых клеточных линиях человека.

При дальнейшем пассировании оказалось, что клеточные линии человека Нер-2 и А549 не поддерживают эффективно вирусную репликацию, для них требуется более длительный

срок развития HMPV инфекции, клетки гибнут раньше, чем вирус реплицируется в достаточном для выявления РНК количестве, что лимитирует возможность получения хороших урожаев вируса.

Изучение вирусной активности HMPV показало, что наиболее чувствительными к изучаемому вирусу являются линии клеток конъюнктивы, клон 1-5С-4 и эпителиальной карциномы Нер-2, менее - клетки карциномы кишечника НТ29 и легкого А549.

Важно отметить, что из 4 выбранных нами РНК-позитивных смывов только 2 реплицировались в клеточных линиях человека и животных, при этом второй образец - лишь в клетках эпителиальной карциномы Нер-2 с наибольшей активностью 0,23 ± 0,012 после второго слепого пассажа.

Из 9 исследованных клеточных линий животных (табл. 1) способными поддерживать репродукцию HMPV оказались гоггь: почки кошки CRFK, почки эмбрионов макак-резусов LLC-MK2, почки обезьяны Vero, почки свиньи СПЭВ и почки сирийского хомячка ВНК-21. РНК HMPV в фибробластных клетках кошки СС-81 и мыши Ьда, культуре клеток мозга хорька Mpf и почек собаки MDCK в ОТ-ПЦР не выявлена на протяжении всего периода наблюдения.

В ходе настоящей работы было установлено, что изучаемый вирус способен вызывать ЦПЭ в клетках LLC-MK2, Vero и CRFK. В клеточной линии LLC-MK2 ЦПЭ вируса характеризовался округлением клеток и образованием небольших кластеров. В культурах почек обезьяны Vero и кошки CRFK ЦПЭ HMPV проявлялся изменениями клеток, характерными для ЦПЭ других вирусов: клетки округлялись и умирали. Следовательно, единственным способом установить причину ЦПЭ является исследование инфицированных супернатантов клеточных культур на присутствие РНК- и ДНК-содержащих вирусов в ПЦР. Важно отметить, что в клеточных линиях СПЭВ и ВНК-21 ЦПЭ нами не выявлено, несмотря на репликацию HMPV.

Наиболее чувствительной к HMPV оказалась культура почки кошки CRFK, в меньшей степени репродукция вируса отмечена в культурах клеток Vero и LLC-MK2, существенно слабее - в линиях СПЭВ и ВНК-21 (рис. 10).

1,6 у

1,4 -

I 1 g-0,8

0,6 0,4 0,2 О

2 4 б 8 10 12 14 16

18 20 22 24

Период после инфицирования (дни)

■ СПЭВ a Vero OLLC-MK2 BCRFK В ВНК-21

Рис. 10. Репликация HMPV в перевиваемых клеточных линиях животных.

Изучение динамики репликации HMPV в клеточных линиях животных в течение 24 дней после инфицирования показало, что в клетках СПЭВ и ВНК-21 вирус реплицировался медленно и достигал пика вирусной активности к 16 дню (рис. 10). В клетках Vero РНК HMPV выявлялась с 10 по 22 дни, пик репродукции определялся лишь к 20 суткам. В культуре почек макаки-резус LLC-MK2 РНК HMPV выявлялась с 12 по 20 дни с наиболее высоким уровнем вирусной нагрузки на 18 сутки.

Наиболее активно HMPV накапливался в клеточной линии CRFK. Репликация HMPV в этой культуре начиналась значительно раньше, чем в других клеточных линиях человека и животных - с 4 дня после инфицирования. Пик вирусной активности в надосадочной жидкости культуры почек кошки был выше (1,2 lg) и определялся раньше по срокам - на 10 сутки, чем в других культурах клеток животных. Инфекционный титр HMPV составил 5,5-6,0 lg.

Изолированный на культуре клеток CRFK вирулентный штамм HMPV был депонирован в Государственную коллекцию вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, депонент № 2476.

Патогенез HMPV инфекции у белых мышей

Для создания экспериментальной модели in vivo белым беспородным мышам интраназально инокулировали вируссодержащую жидкость культуры клеток CRFK инфицированной HMPV. Контроль веса животных и забор внутренних органов для исследования кинетики репликации вируса проводили на 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 14, 28, 30 и 32 сутки от момента инфицирования.

Изучение динамики массы тела HMPV-инфицированных и неинфицированных мышей показало, что вес животных начинал снижаться со следующего дня после заражения (рис. 11). К 4 дню потеря массы тела была максимальной и составляла 10,7% от исходной. К 7 суткам после заражения HMPV вес мышей восстановился до исходного, к 32 суткам он был ниже, чем у здоровых мышей на 7,6%. К концу эксперимента масса тела HMPV-инфицированных животных увеличилась в 2,4 раза по сравнению с исходной, тогда как у неинфицированных мышей в 2,6 раз.

5---

0 -,-,-,-,-1-,-,-1-1-,-

1 2 3 4 5 7 9 14 28 30 32

Срок наблюдения (дни) .....неинфицированные

■ НМРУ-инфицированные

Рис. 11. Сравнительная характеристика показателей веса белых мышей, инфицированных и неинфицированных НМРУ, в динамике.

Следующим этапом было исследование кинетики репликации HMPV в легких белых мышей методом ОТ-ПЦР. Установлено, что вирус начинает накапливаться в легких животных с 3 дня после инфицирования. Максимальная вирусная нагрузка (2,7 lg) определяется на 5 сутки. К 14 суткам после заражения титр HMPV не превышает 0,9 lg. Однако к 28 дню зарегистрировано повторное увеличение вирусной нагрузки до 2,1 lg. Титр вируса в легких мышей снизился до 0,6 лишь к 32 суткам от начала инфекции. Эти результаты позволяют говорить о том, что HMPV персистирует в легких мышей в течение, по крайней мере, месяца, и имеет 2 волны активности репродукции - на 5 и 28 дни с момента заражения.

Для того чтобы определить, присутствует ли HMPV помимо легких в тканях других внутренних органов у мышей, в те же сроки исследовались печень, мозг и селезенка в ПЦР. Однако РНК HMPV не была обнаружена ни в одном из этих образцов, свидетельствуя в пользу тропизма вируса к легочной ткани.

Далее исследовались легкие мышей на присутствие HMPV методом выделения вируса на клеточных линиях. Детекция вируса в суспензии легких на клеточной линии CRFK показала, что вирус определялся на 3,4, S и 7 дни после инфицирования, кроме того с 14 по 32 дни вирус выделялся постоянно. На линии Chang Conjunctiva в легочной суспензии HMPV выделялся на 4,5 и 7 сутки, а также с 14 по 32 сутки, как и на культуре клеток CRFK.

Следующим шагом являлось определение инфекционного титра HMPV в легких мышей на культуре клеток CRFK. Установлено, что инфекционный титр HMPV в легких на 3 сутки составляет 1,1 ± 0,7 lg, затем нарастает до 3,4 ± 0,3 lg к 5 суткам, после чего снижается до 0,9 ± 0,2 lg к 7 дню после заражения (рис. 12). На 28 сутки отмечалось повторное накопление вируса до 2,3 ± 0,2 lg. На 14 и 32 дни от начала инфекции вирусная нагрузка в легочной ткани мышей на клеточной линии CRFK была низкой - за порогом чувствительности ПЦР.

3 4 5 7 14 28 30 32 Дни после заражения

Рис. 12. Кинетика репликации HMPV в легких мышей (метод выделения вируса на культуре клеток CRFK).

Определение титра специфических антител к HMPV осуществляли в сыворотке крови животных на 3,4,5,7,14,28, 30 и 32 сутки после инфицирования животных.

Существенное нарастание титра антител у мышей наблюдалось к 14 дню после инфицирования (> 3,1 log2), к 30 дню он достигал пика (> 5,2 log2) (рис. 13).

5 7 14 Дни инфекции

Рис. 13. Уровень специфических антител к HMPV у мышей в разные сроки после инфицирования.

Следовательно, HMPV персистирует в легких мышей, несмотря на присутствие вирусспецифических антител.

Чувствительность HMPV к лекарственным препаратам in vitro

Эффективным способом предупреждения развития патологического процесса при инфицировании патогенными агентами является повышение специфической и неспецифической резистентности организма. Препаратов зарегистрированных, внесенных в государственный реестр лекарственных средств РФ и разрешенных к применению у детей с младенческого возраста, мало. Мы исследовали широко применяемые в педиатрии.

Противовирусная активность интерферонов и интерфероногенов была установлена в отношении широкого спектра вирусных инфекций. Одним из наиболее часто используемых в лечении ОРВИ отечественных препаратов является индуктор эндогенного интерферона Арбидол. Принимая во внимание защитную эффективность данного лекарственного средства в отношении гриппа и ОРВИ, мы посчитали целесообразным оценить его противовирусную активность в отношении HMPV in vitro и in vivo.

Учитывая стремительный рост среди пациентов и врачей популярности лечения и профилактики ОРВИ гомеопатическими средствами, мы решили включить в исследование один из наиболее часто используемых в клинической педиатрии препаратов Оциллококцинум. Согласно литературным данным, этот препарат обладает высокой степенью профилактического и лечебного воздействия при ОРВИ, удобен в применении, не имеет противопоказаний, не имеет выраженных побочных эффектов и риска лекарственного взаимодействия [Селькова Е.П. 2005,2007 и 2008; Самсыгина Г. А. 2008].

И последним препаратом, вошедшим в наше исследование, является Рибавирин, обладающий широким спектром противовирусной активности. Эффективность этого лекарственного средства в отношении HMPV была изучена за рубежом. Wyde P. R., Hamelin М. Е. и их коллеги установили, что Рибавирин оказывает эффективное действие против HMPV на моделях in vitro и in vivo, значительно снижая вирусную нагрузку и выраженность легочного воспаления [Wyde P. R. 2003; Hamelin М. Е. 2006]. Его использование у детей показано только

при тяжелом течении заболеваний. Поэтому в нашей работе Рибавирин играл роль контрольного препарата.

Необходимо отметить, что вошедшие в исследование препараты являются зарегистрированными, внесенными в государственный реестр лекарственных средств РФ и разрешенными к применению в педиатрии.

Первым этапом этой серии экспериментов была оценка цитотоксичности Арбидола, Оциллококцинума и Рибавирина для клеточных линий CRFK и Chang Conjunctiva, клон 1-5С-4, определяемая по влиянию различных концентраций препаратов на клетки. Результаты представлены на рис. 14.

• 100 • 90 80 70 60 +50 40 30 20 10

12,5 25 50 100 500 Концентрация Оциллококцинума (мкг/мл)

12,5 25 50 100 500 Концентрация Рибавирина (мкг/мл)

С? 100

О4*

Г 90

g 80

5 70

fi 60

1 50

"§ 40

| 30

1 20 -|

S 10

« 0

12,5 25 50 100 500 Концентрация Арбидола (мкг/мл)

-CRFK

1 Ch. Conjunctiva

Рис. 14. Влияние концентрации противовирусных препаратов на жизнеспособность клеток CRFK и Chang Conjunctiva, клон 1-5С-4.

Более токсичным из исследуемых препаратов оказался индуктор интерферона Арбидол. В концентрации 100 мкг/мл этот препарат полностью разрушал монослой клеточных линий Chang Conjunctiva и CRFK. Величина МПК Арбидола для культуры CRFK составила 50 мкг/мл, а для Chang Conjunctiva - 12,5 мкг/мл. Рибавирин оказался наиболее токсичным для культуры Chang Conjunctiva, величина МПК составила 100 мкг/мл. На клетки линии CRFK

препарат не оказывал ЦПЭ в этой концентрации. В концентрации до 100 мкг/мл он не вызывал видимых цитодеструктивных изменений в клеточной линии CRFK.

Натуропатический препарат Оциллококцинум в максимальной концентрации 500 мкг/мл вызывал ЦПЭ лишь 20% клеток линии CRFK. В концентрации 100 мкг/мл деструктивные изменения затрагивали 50% клеток линии Chang Conjunctiva.

Установив МПК лекарственных препаратов, мы определили значения ТЦД50 для того, чтобы установить предельную концентрацию изучаемых препаратов (табл. 3).

Таблица 3

Параметры токсичности препаратов для клеточной линии Chang Conjunctiva, клон 1-5С-4

Препарат МПК* (мкг/мл) ТЦЦ50** (мкг/мл)

Арбидол 12,5 25

Оциллококцинум 100 500

Рибавирин 100 500

Примечание: * - максимальная переносимая концентрация; **-тканевая цитотоксическая доза.

Результаты исследования вирулицидной активности лекарственных препаратов в отношении НМРУ на культуре клеток СЮТС представлены в табл. 4

Таблица 4

Оценка вирулицидной активности препаратов на клеточной линии СЯБК

Препарат Вирулицидная активность

Арбидол концентрация (мкг/мл) 2,5 5,0 10,0 контроль вируса

инфекционный титр вируса 3,5 4,5 4,5 4,5

Оциллококцинум концентрация (мкг/мл) 0,25 0,5 1,0 контроль вируса

инфекционный титр вируса 4,5 4,5 4,5 4,5

Рибавирин концентрация (мкг/мл) 25 50 100 контроль вируса

инфекционный титр вируса 3,5 4,5 4,5 4,5

Достоверных различий между инфекционными титрами вируса и вируса после контакта с изучаемыми препаратами в различных концентрациях не выявлено, что свидетельствовало об отсутствии вирулицидного действия препаратов в исследуемых концентрациях.

Следующим этапом стало определение эффективности изучаемых лекарственных препаратов в отношении HMPV на культуре клеток Chang Conjunctiva, клон 1-5С-4 по подавлению инфекционной активности вируса. Использовали три схемы внесения препаратов относительно инфицирования вирусом: за 24 часа до инфицирования, одномоментно и через 24 часа после инфицирования.

Подавление репродукции HMPV препаратом Арбидол на культуре клеток Chang Conjunctiva наиболее эффективно при введении препарата за 24 ч до инфицирования в дозе 10 мкг/мл (табл. 5). Препарат снижал уровень накопления вируса на 1,5 lg. КИ составил 33,3%. Через 24 ч после инфицирования Арбидол в обеих исследуемых концентрациях (5 и 10 мкг/мл) практически не оказывал действия на вирус, поскольку Д lg составила 0,5 и 1,0, а КИ 11,1% и 22,2%, соответственно. Подобные результаты получены и при одномоментном введении препарата и вируса - уровень накопления НМРУ снизился лишь на 0,5 lg (КИ 11,1%).

Таблица 5

Оценка эффективности препарата Арбидол в отношении HMPV по подавлению инфекционной активности вируса in vitro

Схема внесения препарата относительно инфицирования вирусом Доза препарата (мкг/мл) Инфекционные титры вируса

Уровень накопления вируса (lg) Подавление репродукции вируса (Д lg*) КИ** (%)

За 24 часа до инфицирования 5 4,5 - -

10 3,0 1,5 33,3

Одномоментно 5 4,0 0,5 11,1

10 4,0 0,5 11,1

Через 24 часа после инфицирования 5 4,0 0,5 11,1

10 3,5 1,0 22,2

Контроль вируса без внесения препарата - 4,5 - -

Примечание: * - разность между уровнями накопления вируса до и после внесения препарата; ** - коэффициент ингибирования.

Натуропатический препарат Оциллококцинум более эффективно подавлял инфекционную активность HMPV через 24 часа после инфицирования в дозе 100 мкг/мл: уровень накопления вируса снизился на 1,0 Ig, КИ составил 22,2% (табл. 6). В концентрации 50 мкг/мл по терапевтической схеме, а также в обеих исследуемых концентрациях по профилактической схеме Оциллококцинум подавлял репродукцию вируса на 0,5 !g, КИ 11,1%. Введение лекарственного средства одномоментно с HMPV не влияло на репродукцию вируса в культуре клеток Chang Conjunctiva.

Таблица 6

Оценка эффективности препарата Оциллококцинум в отношении HMPV по подавлению инфекционной активности вируса in vitro

Уровень накопления вируса (lg) Подавление репродукции вируса (Д lg*) КИ** (%)

За 24 часа до инфицирования 50 4,5 0,5 11,1

100 4,5 0,5 11,1

Одномоментно 50 4,5 - -

100 4,5 - -

Через 24 часа после инфицирования 50 4,0 0,5 11,1

100 3,5 1,0 22,2

Контроль вируса без внесения препарата - 4,5 - -

Примечание: см. табл. 5.

Активность химиопрепарата Рибавирин в отношении НМРУ была достаточно высокой, что соответствует данным зарубежных исследователей [\Уус1е Р. 2003]. Наиболее эффективной схемой оказалась лечебная с использованием Рибавирина в концентрации 25-50 мкг/мл (Д 2,0-2,5 и КИ 44,4-55,6%, соответственно). Снижение активности НМРУ на 1,0 получено при

введении препарата за 24 часа до инфицирования и на 0,5 lg при одномоментном внесении в клетки культуры Chang Conjunctiva препарата и вируса (табл. 7).

Таблица 7

Оценка эффективности препарата Рибавирин в отношении HMPV по подавлению инфекционной активности вируса in vitro

Уровень накопления вируса (Ir) Подавление репродукции вируса (Д lg*) КИ** (%)

За 24 часа до инфицирования 25 3,5 1,0 22,2

50 3,5 1,0 22,2

Одномоментно 25 4,0 0,5 11,1

50 4,0 0,5 II,I

Через 24 часа после инфицирования 25 2,5 2,0 44,4

50 2,0 2,5 55,6

Контроль вируса без внесения препарата - 4,5 - -

Примечание: см. табл. 5.

Следовательно, среди исследуемых препаратов in vitro в отношении HMPV наиболее эффективен Рибавирин в концентрации 50 мкг/мл через 24 часа после инфицирования.

Чувствительиость HMPV к лекарственным препаратам in vivo С целью оценки чувствительности HMPV к лекарственным препаратам in vivo Арбидол, Оциллококцинум и Рибавирин вводили мышам через 24 часа после инфицирования HMPV по рекомендованным производителями схемам применения для других ОРВИ. Концентрации препаратов соответствовали равноэффективным суточным дозам для человека (табл. 8).

Таблица 8

Схема введения противовирусных препаратов с целью лечения НМРУ инфекции у мышей

Препараты Количество животных Способ введения Разовая доза (мг/кг) Кратность приема

Арбидол 10 Перорально 60 1 раз в день х 4 дня

Оциллококцинум 10 Перорально 50 1 раз в день * 2 раза в нед. (с интервалом в 2 дня)

Рибавирин 10 Перорально 40 1 раз в день х 4 дня

Основными критериями оценки эффективности препаратов in vivo являлись снижение накопления вируса в легких, определяемое по инфекционному титру вируса в культуре клеток CRFK и ИФА непосредственно в суспензиях легких мышей, используя специфическую сыворотку к HMPV. В ходе оценки эффективности проводили сравнение с референс-препаратом Рибавирин.

Наиболее высокой анти-HMPV активностью in vivo обладал Оциллококцинум, подавлявший репродукцию вируса в легких мышей на 3,7 lg, в то время как Рибавирин - на 3,0

^ (табл. 9). Препарат Арбидол снижал инфекционный титр вируса на 1,5 ^ через 3 суток и лишь на 0,9 ^ через 5 суток после инфицирования.

Таблица 9

Оценка эффективности лекарственных препаратов в отношении НМРУ по подавлению инфекционной активности вируса в легких мышей на клеточной линии СЯИК

Препарат Время отбора проб* (часы) Инфекционный титр вируса (lgTUOso) Подавление репродукции вируса (Д lg) КИ (%)

Арбидол 72 1,8 1,5 45,5

120 3,9 0,9 18,8

Оциллококцинум 72 1,2 2,1 63,6

120 1,1 3,7 77,1

Рибавирин 72 2,3 1,0 30,3

120 1,8 3,0 37,5

Контроль без препарата 72 3,3 - -

120 4,8 - -

Примечание: * - время от момента инфицирования.

При изучении эффективности препаратов Арбидол, Оциллококцинум и Рибавирин в отношении НМРУ инфекции у мышей по подавлению инфекционной активности вируса в легких методом ИФА получены аналогичные результаты (рис. 15).

□ через 72ч ■ через 120ч

20 40 60

% ингибирования репродукции HMPV

Рис. 15. Подавление репродукции HMPV в легких мышей под действием препаратов через 72 и 120 часов с момента инфицирования (метод ИФА).

Наибольшей противовирусной активностью in vivo по результатам ИФА обладал Оциллококцинум, вызывая подавление репродукции HMPV в легких мышей на 53,2-68,9% в зависимости от времени после инфицирования. Референс-препарат Рибавирин менее активно ингибировал репродукцию HMPV - через 72 ч после инфицирования на 28,7%, а через 120 ч на 40,7%. Минимальное снижение инфекционной активности вируса в легких мышей отмечалось при использовании Арбидола. На 3 сутки после инфицирования препарат снижал инфекцион-ность вируса на 31,3%, а на 5 сутки - лишь на 25,7%.

Изучение влияния препаратов Арбидол, Оциллококцинум и Рибавирин на динамику и

уровень репродукции HMPV в легких белых мышей выявило, что Оциллококцинум в

изученных дозах на протяжении всего срока наблюдения наиболее эффективно подавлял

репродукцию вируса в легких белых мышей.

ВЫВОДЫ

1. Установлено долевое участие Метапневмовируса (HMPV) и Бокавируса человека (HBoV) в структуре ОРВИ у детей, госпитализированных в стационары г. Москвы за период 20032009 гг., которое составило 26%. Циркуляция вирусов выявлена на протяжении всех календарных месяцев. Наибольшая активность HMPV и HBoV зарегистрирована в периоды с марта по июнь и с сентября по декабрь. Установлено возрастание частоты выявления HMPV и HBoV у детей с ОРВИ с 2003-2005 гг. к 2009 г.

2. Выявлены клинические особенности HMPV инфекции у детей: удельный вес в структуре патологии нижних дыхательных путей составил 27,2%. Основными нозологическими формами HMPV инфекции были бронхиты, пневмонии (29,2%) и бронхиолиты (16,7%). Установлено, что наиболее восприимчивыми к HMPV были дети грудного возраста; 54,5% детей к 3 годам жизни и 60,9% к 5-летнему возрасту имели антитела к HMPV.

3. Основной нозологической формой HBoV инфекции у детей являлся обструктивный ларинготрахеит (28,4%). В 17,4% случаев ОРВИ, ассоциированные с HBoV, сопровождались явлениями диспепсии. Наиболее восприимчивыми к HBoV были дети 1-2 лет жизни.

4. Показано, что HMPV и HBoV у 67,6% и 72,2% детей, соответственно, идентифицировались в сочетании с другими возбудителями ОРВИ. Клиническое течение смешанных форм инфекций было более тяжелым.

5. Впервые установлено, что чувствительными к HMPV являются клетки перевиваемых линий человека - Chang Conjunctiva, НТ-29 и животных - CRFK, СПЭВ и ВНК-21. Наиболее пермиссивны к HMPV клеточные линии конъюнктивы человека Chang Conjunctiva, клон 1-5С-4 и почки кошки CRFK.

6. Впервые в РФ из носоглоточного смыва ребенка с ОРВИ выделен штамм HMPV (НМ-1), который был депонирован в Государственную коллекцию вирусов НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН, депонент № 2476. При культивировании в клеточной линии CRFK получен вирусный материал с инфекционной активностью 6,0 lg ТЦЩо/мл.

7. Кинетика репликации HMPV в легочной ткани белых мышей характеризовалась наиболее высокими уровнями накопления РНК вируса на 5 и 28 дни после инфицирования животных. РНК HMPV детектировалась до 32 дня от начала инфекции в ткани легких мышей, однако не обнаруживалась в печени, мозге и селезенке животных.

8. Впервые установлена противовирусная активность в отношении HMPV препаратов «Арбидол» и «Оциллококцинум» в культуре клеток и у мышей. Инфекционная активность вируса на клеточной линии Chang Conjunctiva снижалась на <1,0-1,5 lg. На экспериментальной модели in vivo наиболее эффективным оказался «Оциллококцинум», подавляющий репродукцию HMPV в легких белых мышей через 3-5 суток после инфицирования на 2,1-3,7 lg, соответственно.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью совершенствования этиотропной терапии у детей с респираторными заболеваниями следует проводить диагностические исследования по идентификации HMPV и HBoV.

2. В схемы комплексного лечения острых респираторных заболеваний метапневмовирусной и смешанной этиологии у детей в возрасте до 5 лет целесообразно включать Оциллококцинум, в возрасте старше 5 лет - Оциллококцинум или, в тяжелых случаях, Рибавирин.

3. Для изоляции HMPV можно использовать перевиваемые линии клеток конъюнктивы человека Chang Conjunctiva, клон 1-5С-4, и почки кошки CRFK.

4. Штамм метапневмовируса «НМ-1», депонированный в ГКВ, может быть использован для приготовления диагностических тест-систем и скрининга противовирусных препаратов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Исаева Е.И., Козулина И.С., Баринкова Е.А., Мажуль Л.А., Вязов С.О. Метапневмовирус -новая респираторная инфекция. // Материалы Международного конгресса «Стратегии и тактика борьбы с внутрибольничными инфекциями на современном этапе развития медицины», 2006, стр. 82-83;

2. Самсыгина Г.А., Малиновская В.В., Дудина Т.А., Исаева Е.И., Козулина И.С. Особенности этиологии и клинического течения осложненных острых респираторных вирусных инфекций у детей. // Материалы Международного конгресса «Стратегии и тактика борьбы с внутрибольничными инфекциями на современном этапе развития медицины», 2006, стр. 154-156;

3. Козулина И.С., Исаева Е.И., Баринкова Е.А., Дудина Т.А., Самсыгина Г.А., Малиновская В.В. Новый инфекционный агент в этиологии респираторных вирусных инфекций у детей младшего детского возраста. // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения РФ», 2007, стр. 248-249;

4. Козулина И.С., Исаева Е.И., Легкова Т.П., Самсыгина Г.А., Дудина Т.А. Вирусные ассоциации как причина ОРЗ у детей. // Материалы VII конгресса детских инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей», 2008, стр. 66;

5. Козулина И.С., Самсыгина Г.А., Исаева Е.И., Легкова Т.П., Шевченко H.H., Донин И.М., Павлов С.А. Метапневмовирусная инфекция у детей. // Педиатрия. Журнал им. Г.Н. Сперанского, 2009,88(JVs5), стр. 58-62;

6. Козулина И.С., Самсыгина Г.А., Исаева Е.И., Легкова Т.П., Шевченко H.H., Донин И.М., Павлов С.А. Бокавирус - новый инфекционный агеит в этиологии острых респираторных заболеваний в детском возрасте. // Педиатрия. Журиал им. Г.Н. Сперанского, 2009,88(Х«6), стр. 51-54;

7. Козулина И.С., Самсыгина Г.А., Исаева Е.И., Легкова Т.П., Шевченко H.H., Донин И.М., Павлов С.А. Бокавирус в этиологии респираторных заболеваний у детей раннего и дошкольного возраста. //Детские инфекции, 2009,8(№3), стр. 13-16

8. Козулина И.С. Метапневмовирусная инфекция у детей первых лет жизни. // Инфекционные болезни, 2009; 7(№2), стр. 85-86;

9. Исаева Е.И., Козулина И.С., Подчерняева Р.Я. Репликация нового инфекционного агента -Металневмовируса (HMPV) в культурах клеток человека. // Сборник материалов XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство», 2009, стр. 319-320;

10. Kozulina I.S., Isaeva Ye.I., Samsygina G.A. Human metapneumovirus and human bocavirus in hospitalized Russian children with acute respiratory infection. // 4th European Pediatrics Congress EUROPAEDIATR1CS 2009, abstract R 279, p. 326;

11. Козулина И.С., Исаева Е.И., Подчерняева Р.Я, Самсьггина ГЛ. Новые респираторные вирусные инфекции у детей. // Материалы X международного конгресса "Здоровье и образование в XXI веке" "Инновационные технологии в биологии и медицине", 2009, стр. 169-170;

12. Козулина И.С., Исаева Е.И., Самсыгина Г.А. Метапневмовирусная инфекция - важная причина заболеваний нижних дыхательных путей у детей. // Материалы VIII конгресса детских инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики», 2009, стр. 62.

Автор выражает искреннюю благодарность и глубокую признательность директору НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, академику РАМН Д. К. Львову за предоставленную возможность проведения работы; своим научным руководителям Заслуженному врачу РФ, д.м.н,, профессору, академику РАЕН, заведующей кафедрой детских болезней №1 ГОУ ВПО РГМУ Росздрава Г.А. Самсыгиной и к.б.н., ведущему научному сотруднику лаборатории иммунологии НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН Е.И. Исаевой за научное руководство; профессору, академику РАЕН Р. Я. Подчерняевой, к.м.н. Г. X. Данлыбаевой и О. М. Гриневич за предоставленную возможность исследования клеточных линий; д.б.н. В. Т. Ивановой и к.б.н. Т. П. Оспельниковой за любезно оказанные внимание и консультации по работе; д.м.н., профессору С. О. Вязову за предоставленные для работы реактивы и праймеры; коллективам Морозовской, Филатовской и Тушинской детских городских клинических больниц за помощь в сборе клинического материала; коллективу лаборатории иммунологии за ценные советы и помощь в освоении методов исследования; д.м.н. Е. И. Бурцевой, В. П. Лапшиной, профессору, д.м.н. В. В. Колобухиной, д.б.н. Т. М. Соколовой и к.б.н. А. Л. Беляеву за консультации и участие в оформлении работы; а также родным и близким за оказанные внимание и поддержку.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 26.03.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,7 Печать авторефератов (495)730-47-74,778-45-60

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Козулина, Ирина Сергеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Метапневмовирусная инфекция.

1.1. Структура НМР V, организация генома.

1.2. Генетическое и антигенное разнообразие вируса.

1.3.Эпидемиологическая характеристика HMPV инфекции.

1.4. Патогенетические механизмы инфекции.

1.5. Клинические проявления HMPV инфекции.

1.6. Ассоциации HMPV с другими возбудителями ОРВИ.

1.7. Лабораторные методы в диагностике HMPV инфекции.

1.8. Основные принципы создания вакцин.

1.9. Спектр исследований по разработке специфических анти-HMPV препаратов.

Глава 2. Бокавирусная инфекция.

2.1. Структура вирионов HBoV. Организация генома.

2.2. Генетическая дивергенция.

2.3. Циркуляция HBoV в природе.

2.4. Патогенетические аспекты инфекции.

2.5. Нозологический спектр и клиническая картина HBoV инфекции.

2.6. Сочетанные формы инфекции.

2.7. Методы диагностики.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новые инфекционные агенты - Метапневмовирус и Бокавирус человека"

Актуальность проблемы

ОРВИ являются одной из актуальных проблем ВОЗ, поскольку имеют наибольший удельный вес в структуре всей инфекционной патологии [Селькова Е. П. и др. 2001; Заплатников A. JL 2007; Самсыгина Г. А. и др. 2008 (б); Покровский В. И. и др. 2009]. Причем уровень заболеваемости ОРЗ практически одинаковый в развитых и развивающихся странах [Shapiro Е. et al. 1998]. В России ежегодно регистрируется 27,341,2 млн больных ОРВИ, из них 45-60% - дети. Так, за первое полугодие 2009 г. заболеваемость ОРВИ составила 10366,9 на 100 тысяч населения [Онищенко Г. Г. 2009].

ОРВИ остаются неконтролируемыми инфекциями, что связано с широким спектром возбудителей, высокой контагиозностью, отсутствием для большинства из них вакцинопрофилактики, а также формирующейся резистентностью к лекарственным препаратам [Смирнов В. С. и др. 2003; Заплатников А. Л. 2007; Львов Д. К. и др. 2008; Селькова Е. П. и др. 2008; Самсыгина Г. А. и др. 2008 (б)].

К известным возбудителям ОРВИ относятся вирусы гриппа, парагриппа, HRSV, адено-, рино-, энтсро- и реовирусы. Однако перечисленные инфекционные агенты не исчерпывают всей этиологии ОРВИ. До недавнего времени, несмотря на обширные диагностические исследования, существенная часть инфекций органов дыхания оставалась нерасшифрованной [Liolios L. et al. 2001; Nokso-Koivisto J. et al. 2002]. Благодаря современным достижениям вирусологии в течение последних лет были идентифицированы новые, ранее неизвестные возбудители респираторных инфекций [Anderson LJ. 2007; Broor S. et al. 2008], к числу которых относятся Метапневмовирус (HMPV) и Бокавирус человека (HBoV).

Вирусы впервые были выделены в носоглоточных смывах детей с ОРЗ неясной этиологии в Нидерландах и Швеции. Впоследствии они были обнаружены у людей всех возрастов на всех континентах Земли. В настоящее время многие зарубежные исследователи рассматривают HMPV и HBoV в качестве одних из наиболее значимых вирусных патогенов в структуре детской заболеваемости ОРВИ с поражением нижних ДП [Landry М. L. et al. 2008; Hengst М. et al. 2008; Cilia G. et al. 2008; Esposito S. et al. 2008; Garcia M. L. et al. 2009; Cilia G. et al. 2009]. Вместе с тем данные инфекционные агенты не ограничиваются патологией респираторного тракта: HMPV способен проникать в ЦНС с развитием тяжелых энцефалитов [Schildgen О. et al. 2005 (б)], а ДНК HBoV была обнаружена в крови, кале, моче и жидкости из среднего уха, свидетельствуя о способности HBoV вызывать системную инфекцию [Lindner J. etal. 2008 (г)].

Ретроспективные серологические исследования сывороток крови больных ОРИ позволили установить, что HBoV циркулирует в популяции людей, по крайней мере, более 10 [Zhao L. Q. et al. 2009], a HMPV - более 50 лет [Мажуль Л. А. и др. 2007]. Причины столь позднего открытия данных вирусов кроются в особых условиях культивирования, отсутствии ЦПЭ при инфицировании широко используемых в практической вирусологии клеточных линий, длительности периода развития инфекции и ограниченности спектра чувствительных клеточных культур [Hamelin М. Е. et al. 2004; Lin F. et al. 2008 (6); Maranich A. etal. 2009; Dijkman R. etal. 2009].

В связи с этим актуальной является проблема определения эпидемиологических особенностей циркуляции HMPV и HBoV, нозологических форм заболеваний, ассоциированных с ними, поиска чувствительных к вирусам клеточных систем различного видового и тканевого генеза. Решение указанной проблемы позволит получить вирусы, специфические антитела к ним, использовать их в ИФА для мониторинга инфекций у пациентов в РФ, исследовать патогенез инфекции, а также проводить скрининг лекарственных препаратов с целью оценки их профилактической и терапевтической эффективности.

Цель исследования

Цель исследования — определение значения HMPV и HBoV в этиологии респираторных заболеваний у детей в России, изучение патогенетических и клинических особенностей HMPV- и HBoV-инфекций, а также изучение эффективности широко используемых в клинической педиатрии лекарственных препаратов в отношении HMPV.

Задачи исследования

2. Выявление эпидемиологических особенностей циркуляции HMPV и HBoV за период 2003-2009 гг.; изучение популяционного иммунитета к HMPV;

3. Определение спектра пермиссивных к HMPV клеточных культур;

4. Моделирование HMPV инфекции на мышах с последующим изучением патогенеза;

Научная новизна

Впервые показано, что HMPV активно реплицируется в клетках конъюнктивы человека Chang Conjuctiva и почки кошки CRFK.

Показана эффективность лекарственных препаратов Арбидол и Оциллококцинум в отношении HMPV.

Практическая значимость

3. Создание экспериментальных моделей in vitro и in vivo дает возможность изучения патогенетических аспектов HMPV инфекции, скрининга лекарственных противовирусных препаратов и разработки диагностических тест-систем.

Основные положения, выносимые на защиту

2. Основными нозологическими формами HMPV инфекции являются бронхиты, пневмонии и бронхиолиты, HBoV инфекции — обструктивные ларинготрахеиты. Наиболее восприимчивы к HMPV и HBoV дети раннего возраста.

Личный вклад автора Все разделы представленной работы выполнены автором.

Диагностика методом непрямого ИФА — совместно с лаборантом-исследователем лаборатории иммунологии НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН Н.Б. Гаврюшиной. Ведение клеточных линий осуществлялось научными сотрудниками лаборатории культур тканей Г. X. Данлыбаевой, О. М. Гриневич.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на Международном конгрессе «Стратегия и тактика борьбы с внутрибольничными инфекциями на современном этапе развития медицины», Москва, 2006 г.; IX съезде Всероссийского научно — практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения РФ», Москва, 2007 г.; VII и VIII конгрессах детских инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей», Москва, 2008 и 2009 гг.; I Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням, Москва, 2009 г.; II Ежегодной конференции молодых ученых НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского, Москва, 2009 г.; IV Европейском педиатрическом конгрессе Europaediatrics, Москва, 2009 г.; XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2009 г.; X Международном конгрессе "Здоровье и образование в XXI веке", Москва, 2009 г.

Публикации

Структура и объем диссертации

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Козулина, Ирина Сергеевна

ВЫВОДЫ

1. Установлено долевое участие Метапневмовируса (HMPV) и Бокавируса человека (HBoV) в структуре ОРВИ у детей, госпитализированных в стационары г. Москвы за период 2003-2009 гг., которое составило 26%. Циркуляция вирусов выявлена на протяжении всех календарных месяцев. Наибольшая активность HMPV и HBoV зарегистрирована в периоды с марта по июнь и с сентября по декабрь. Установлено возрастание частоты выявления HMPV и HBoV у детей с ОРВИ с 2003-2005 гг. к 2009 г.

2. Выявлены клинические особенности HMPV инфекции у детей: удельный вес в структуре патологии нижних дыхательных путей составил 21,2%. Основными нозологическими формами HMPV инфекции были бронхиты, пневмонии (29,2%) и бронхиолиты (16,7%). Установлено, что наиболее восприимчивыми к HMPV были дети грудного возраста; 54,5% детей к 3 годам жизни и 60,9% к 5-летнему возрасту имели антитела к HMPV.

8. Впервые установлена противовирусная активность в отношении HMPV препаратов Арбидол и Оциллококцинум в культуре клеток и у мышей. Инфекционная активность вируса на клеточной линии Chang Conjunctiva снижалась на <1,0-1,5 lg. На экспериментальной модели in vivo наиболее эффективным оказался Оциллококцинум, подавляющий репродукцию HMPV в легких белых мышей через 3-5 суток после инфицирования на 2,1-3,7 lg, соответственно.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

2. В схемы комплексного лечения острых респираторных заболеваний метапневмовирусной и смешанной этиологии у детей в возрасте до 5 лет целесообразно включать Оциллококцинум, в возрасте старше 5 лет — Оциллококцинум или, в тяжелых случаях, Рибавирин.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Козулина, Ирина Сергеевна, Москва

1. Евсеева Е.Л. Клинико-эпидемиологические особенности, диагностика метапневмовирусной инфекции у детей. // Автореферат дисс. . кандидата медицинских наук.-М., 2009.

2. Заплатников А.Л. Принципы рациональной терапии острых респираторных вирусных инфекций у детей раннего возраста. // РМЖ. 2004. — Т. 12(13). — С.796-799.

3. Заплатников А.Л. Современные возможности иммунопрофилактики и иммунотерапии острых респираторных инфекций у детей. // Медицинский совет. — 2007. — №1.

4. Информация Союза педиатров России. Шестая всемирная встреча экспертов по респираторным вирусам. // Педиатрическая фармакология. — 2008. — Т.5(6). — С.120-122.

5. Исаева Е.И., Ровнова З.И., Селиванов Я.М. Идентификация гемагглютинирующих антигенов вируса гриппа методом иммуноферментного анализа. // Вопросы вирусологии. 1988. - №5.-С. 538-543.

6. Мажуль Л.А., Исаева Е.И., Злобин В.И., Вязов С.О. Бокавирус человека. // Вопросы вирусологии. 2009. - 54(3). - С.4-7.

7. Мажуль Л.А., Шилдген О., Исаева Е.И., Вязов С.О. Метапневмовирус как частая причина болезней дыхательных путей. // Вопросы вирусологии. — 2007. — № 3. — С.4-8

8. Медицинская вирусология: Руководство. / Под ред. Львова Д.К. — М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2008. 656с.

9. Онищенко Г.Г. Санитарно-эпидемиологическая обстановка в Российской Федерации. http://epidemiolog.ru/news/detail.php?ELEMENTID=3440 (2009)

10. Острые респираторные заболевания у детей: лечение и профилактика. / Научно-практическая программа Союза педиатров России. — М.: Международный Фонд охраны здоровья матери и ребенка, 2002. 69с.

11. Покровский В.И., Пак С.Г., Брико Н.И., Данилкин Б.К. Инфекционные болезни и эпидемиология // Учебник для студентов лечебных факультетов медицинских вузов. — 2-е изд., испр. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 816с.

12. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М. Минздрав РФ, 2005.

13. Самсыгина Г.А., Богомильский М.Р., Казюкова Т.В., Радциг Е.Ю. Профилактика и терапия острых респираторных заболеваний с использованием гомеопатических средств. // Педиатрия. Журнал им. Г.Н. Сперанского. 2008. - Т.87(6). - С.92-96. (а)

14. Селькова Е.П., Алешина Е.Н., Штундер И.П., Ларусси Ж., Лапицкая А. Современные препараты в лечении гриппа и ОРВИ. Оциллококцинум. // Русский медицинский журнал.- 2008. Т. 16(22). - С. 1516-1520.

15. Селькова Е.П., Семененко Т.А. и др. Циркуляция респираторных вирусов в Москве и их роль в формировании ОРЗ // ЖМЭИ. 2001. № 4. - С. 55-57.

16. Селькова Е.П., Семененко Т.А., Горбачев И.А. Применение препарата Оциллококцинум для профилактики и лечения гриппа и ОРВИ. // Инфекционные болезни.2005. — Т.3(4). — С.74-78.

17. Смирнов B.C. Современные средства профилактики и лечения ОРВИ. — СПб: ФАРМиндекс, 2003. 48с.

18. Соловьев В.Д., Бектемиров Т.А. Интерферон в теории и практике медицины. — 2-е изд., испр. -М. 1981.

19. Швец Е.Ю. Клинико-эпидемиологические особенности и диагностика бокавирусной инфекции у детей. // Автореферат дисс. . кандидата медицинских наук. М., 2009.

20. Щеплягина Л.А., Римарчук Г.В., Круглова И.В., Борисова О.И. Новые технологии в лечении острых респираторных заболеваний у детей. // Лекция для врачей. — М., 2008. — 28с.

21. Юнкеров В.И., Григорьев С.Г. Математико-статистическая обработка данных медицинских исследований. — СПб.: ВМедА. — 2002. — 266с.

22. Abdullah Brooks W, Erdman D, Terebuh P, Klimov A, Goswami D, Sharmeen AT, Azim T, Luby S, Bridges C, Breiman R. Human metapneumovirus infection among children, Bangladesh. // Emerging Infectious Diseases. 2007. - Vol.l3(10). - P.1611-3.

23. Aberle SW, Aberle JH, Sandhofer MJ, Pracher E, Popow-Kraupp T. Biennial spring activity of human metapneumovirus in Austria. // Pediatr Infect Dis J. 2008. — Vol.27(12). — P. 10651068.

24. Aberle SW, Aberle JH, Sandhofer MJ, Pracher E, Popow-Kraupp T. Biennial spring activity of human metapneumovirus in Austria. // Pediatr. Infect. Dis. J. -2008. Vol.27(12). - P.1065-1068.

25. Acosta В, Casas I, Perez Brena P, Savon C, Goyenechea A, Oropeza S, Pinon A. Human metapneumovirus infection in Cuba: first report. // 16th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. -Nice, France, April 1-4, 2006. — P. 1655.

26. Agapov E, Sumino КС, Gaudreault-Keener M, Storch GA, Holtzman MJ. Genetic variability of human metapneumovirus infection: evidence of a shift in viral genotype without a change in illness. // J Infect Dis. 2006. - Vol.193. - P.396-403.

27. Albuquerque MC, Pena GP, Varella RB, Gallucci G, Erdman D, Santos N. Novel respiratory virus infections in children, Brazil. // Emerg Infect Dis. 2009. - Vol. 15(5). - P.806-808.

28. Allander T, Tammi MT, Eriksson M, Bjerkner A, Tiveljung-Lindell A, Andersson B. Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -2005. Vol.102. - P. 12891-96.

29. Alvarez R, Harrod KS, Shieh WJ, Zaki S, Tripp RA. Human metapneumovirus persists in BALB/c mice despite the presence of neutralizing antibodies. // J Virol. 2004. - Vol.78(24). — P.14003-11.

30. Alvarez R, Tripp RA. The immune response to human metapneumovirus is associated with aberrant immunity and impaired virus clearance in BALB/c mice.// J Virol. —2005. — Vol.79(10). — P.5971-78.

31. Anderson LJ. Human bocavirus: a new viral pathogen // Clin. Infect. Dis. — 2007. -VoI.44(7).-P.911-912.

32. Antonaki G, Paleologou N, Tsialta P, Gouriotis D, Kallergi K. Detection of human metapneumovirus infection in a paediatric hospital in Greece // The 4th European Congress of paediatricians — Europaediatrics 2009. Abstract G185.

33. Arnold JC, Singh KK, Spector SA, Sawyer MH. Human bocavirus: prevalence and clinical spectrum at a children's hospital. // Clin. Infect. Dis. 2006. - Vol.43. - P.283-288.

34. Arthur JL, Higgins GD, Davidson GP, Givney RC, Ratcliff RM. A novel bocavirus associated with acute gastroenteritis in Australian children. // PLoS Pathog. — 2009. Vol.5(4). -P.el000391.

35. Banerjee S, Bharaj P, Sullender W, Kabra SK, Broor S. Human Metapneumovirus infections among children with acute respiratory infections seen in a large referral hospital in1.dia. // J. Clin. Virol. 2007. - Vol.38. P.70-72.

36. Bastien N, Brandt K, Dust K. et al. Human bocavirus infection, Canada. // Emerg. Infect. Dis. 2006. - Vol.12. - P.848-850.

37. Bastien N, Chui N, Robinson JL. et al. Detection of human bocavirus in Canadian children in a 1-year study // J. Clin. Microbiol. 2007. - Vol.45. -N2. - P.610-613.

38. Bastien N, Liu L, Ward D. et al. Genetic variability of the G glycoprotein gene of human metapneumovirus. // J. Clin. Microbiol. 2004. - Vol.42. - P.3532-37.

39. Bastien N, Normand S, Taylor T. et al. Sequence analysis of the N, P, M and F genes of Canadian human metapneumovirus strains. // Virus Res. 2003. - Vol.93. - P.51-62.

40. Beder LB, Hotomi M, Ogami M, Yamauchi K, Shimada J, Billal DS, Ishiguro N, Yamanaka N. Clinical and microbiological impact of human bocavirus on children with acute otitis media. //Eur J Pediatr.-2009.-Vol. 168(11).-P. 1365-72.

41. Bharaj P, Sullender WM, Kabra SK et al. Viral infections detected by multiplex PCR among pediatric patients with lower respiratory tract infections seen at an urban hospital in Delhi from 2005 to 2007. // Virol J. 2009. - Vol.6(l). - P.89.

42. Bohmer A, Schildgen V, Lusebrink J, Ziegler S, Tillmann RL, Kleines M, Schildgen O. Novel application for isothermal nucleic acid sequence-based amplification (NASBA). // J Virol Methods. 2009. - Vol. 158(1 -2). - P. 199-201.

43. Boivin G, De Serres G, Cote S, Gilca R, Abed Y, Rochette L, Bergeron LG, Dery P. Human metapneumovirus infections in hospitalized children. // Emerg. Infect. Dis. — 2003. Vol.9. — P.634-640.

44. Boivin G, Mackay I, Shots T. P. et al. Global genetic diversity of human metapneumovirus fusion gene // Emerg. Infect. Dis. -2004. Vol.10. - P. 1154-1157.

45. Bosis S, Esposito S, Osterhaus AD, Tremolati E, Begliatti E, Tagliabue C. Association between high nasopharyngeal viral load and disease severity in children with human metapneumovirus infection. // J Clin Virol. 2008. -Vol.42(3). - P.286-90.

46. Boukhvalova MS, Prince GA, Blanco JC. The cotton rat model of respiratory viralinfections // Biologicals. -2009. Vol.37(3). - P.l52-9.

47. Brieu N, Gay B, Segondy M. et al. Electron microscopy observation of human bocavirus (HboV) in nasopharyngeal samples from HboV-infected children // J. Clin. Microbiol. 2007. -Vol.45(10). - P.3419-3420.

48. Brieu N, Guyon G, Rodiere M, Segondy M, Foulongne V. Human bocavirus infection in children with respiratory tract disease. // Pediatr. Infect. Dis. J. 2008. - Vol.27. - P.969-973.

49. Brodzinski H, Ruddy RM. Review of new and newly discovered respiratory tract viruses in children. // Pediatr Emerg Care. 2009. - Vol.25(5). - P.352-360.

50. Broor S, Bharaj P, Chahar HS. Human metapneumovirus: a new respiratory pathogen. // J Biosci. 2008. - Vol.33(4). - P.483-93.

51. Broughton S, Sylvester KP, Fox G, Zuckerman M, Smith M, Milner AD, et al. Lung function in prematurely born infants after viral lower respiratory tract infections. // Pediatr Infect Dis J. 2007. - Vol.26(11). - P.l 019-24.

52. Buchholz UJ, Biacchesi S, Pham Q N. et al. Deletion of M2 gene open reading frames 1 and 2 of human metapneumovirus: effects on RNA synthesis, attenuation, and immunogenicity // J. Virol. 2005. - Vol.79. - P.6588-6597.

53. Buchholz UJ, Nagashima K, Murphy BR, Collins PL. Live vaccines for human metapneumovirus designed by reverse genetics. // Expert Rev. Vaccines. 2006. - Vol.5. -P.695-706.

54. Bufflier E, Savelli H, Jacobs F, Moore C, Van de Wiel P. Development of a real-time NASBA for human metapneumovirus. // 16th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Nice, France, April 1-4 2006. — Abstract: o65.

55. Calico I, Lowak M, Bas A. et al. A comparative study of direct immunofluorescence, enzyme immunoassay, and culture for diagnosing metapneumovirus infection. // Enferm Infecc Microbiol Clin. 2009. - Vol.27(6). - P.322-5.

56. Campe H, Hartberger C, Sing A. Role of Human Bocavirus infections in outbreaks of gastroenteritis. // J. Clin. Virol. 2008. - Vol.43. - 340-342.

57. Chan E, Li Y. Human metapneumovirus infection in the Canadian population. // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol.41. - P.4642-4646

58. Chan PK, To KF, Wu A. et al. Human metapneumovirus-associated atypical pneumonia and SARS // Emerg. Infect. Dis. 2004. - Vol.10. - P. 497-500.

59. Chieochansin T, Chutinimitkul S, Payungpom S. et al. Complete coding sequences and phylogenetic analysis of human bocavirus (HboV) // Virus Res. 2007. — Vol.129(1). - P.54-57.

60. Chieochansin, T, Thongmee C, Vimolket L, Theamboonlers A, Poovorawan, Y. Human bocavirus infection in children with acute gastroenteritis and healthy controls. // Jpn. J. Infect. Dis. 2008. - Vol.61. -P.479-481.

61. Chow BD, Huang YT, Esper FP. Evidence of human bocavirus circulating in children and adults, Cleveland, Ohio. // J Clin Virol. 2008 Nov. - Vol.43(3). - P.302-6.

62. Christensen A, Nordbo SA, Rrokstad S, Rognlien AG, Dollner H. Human bocavirus commonly involved in multiple viral airway infections. // J Clin Virol. 2008. - Vol.41(1). -P.34-37.

63. Chun JK, Lee JH, Kim HS, Cheong HM, Kim KS, Kang C, Kim DS. Establishing a surveillance network for severe lower respiratory tract infections in Korean infants and young children. // Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2009. - Vol.28(7). - P.841-4.

64. Chung JY, Han TH, Kim JS, Kim SW, Park CG, Hwang ES. Thl and Th2 cytokine levels in nasopharyngeal aspirates from children with human bocavirus bronchiolitis. // J Clin Virol. — 2008. Vol.43(2). — P.223-5.

65. Cilia G, Onate E, Perez-Yarza EG, Montes M, Vicente D, Perez-Trallero E. Viruses in community-acquired pneumonia in children aged less than 3 years old: High rate of viral coinfection. // J Med Virol. 2008. - Vol.80(10). - P. 1843-9.

66. Collins PL, Chanock RM, Murphy BR. Respiratory Syncytial virus. // Fields virology 4th edition / Knipe DM et al. 2001: Philadelphia, Lippincott-Raven Publishers. - Vol. 1. - P. 14431485.

67. Cote S, Abed Y, Boivin G. Comparative evaluation of real time PCR assays for detection of the human Metapneumovirus. // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol.41. - P.3631-3635.

68. Crow E. J. Human metapneumovirus as a major case of human respiratory tract disease. // Pediatr. Infect. Dis. J. -2004.-Vol.23.-P.S215-S221.

69. Cseke G, Wright DW, Tollefson SJ, Johnson JE, Crowe JE Jr, Williams JV. Human metapneumovirus fusion protein vaccines that are immunogenic and protective in cotton rats. // J Virol. 2007. - Vol.81(2). P.698-707.

70. Darniot M, Pitoiset C, Petrella T, Aho S, Pothier P, Manoha C. Age-associated aggravation of clinical disease after primary metapneumovirus infection of BALB/c mice. // J Virol. — 2009.- Vol.83(7). P.3323-32.

71. David P, Hirschwerk D, Goldberg S, Ginocchio C. Acute Pericarditis Caused by Human Metapneumovirus. // Infectious Diseases in Clinical Practice. 2009. - Vol. 17(4). - P.283-285.

72. Davies HW, Appleyard G, Cunnighan P, Perera MS. The use of continuous cell line for the isolation of influenza virus // Bull.WHO. 1978. - Vol. 56. - P. 1991-1993.

73. De Graaf M, Osterhaus AD, Fouchier RA, and Holmes EC. Evolutionary dynamics of human and avian metapneumoviruses. // J Gen Virol. 2008. Vol.89(12). - P.2933-42.

74. De Graaf M, Schrauwen EJ, Herfst S, van Amerongen G, Osterhaus AD, Fouchier RA. Fusion protein is the main determinant of metapneumovirus host tropism. // J Gen Virol. — 2009.1. Vol.90(6). P.1408-16.

75. Deffrasnes C, Cavanagh MH, Goyette N, Cui K, Ge Q, Seth S, Templin MV, Quay SC, Johnson PH, Boivin G. Inhibition of human metapneumovirus replication by small interfering RNA // Antivir Ther. 2008. - Vol. 13(6). - P.821-32 (a).

76. Deffrasnes C, Cote S, Boivin G. Analysis of replication of the human metapneumovirus in different cell lines by real-time PCR // J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol.43. - P.488-490.

77. Deffrasnes C, Hamelin ME, Boivin G. Human metapneumovirus. // Semin Respir Crit Care Med. 2007. - Vol.28(2). - P.213-221.

78. Deffrasnes C, Hamelin ME, Prince GA, Boivin G. Identification and evaluation of a highly effective fusion inhibitor for human metapneumovirus. // Antimicrob Agents Chemother. — 2008. Vol.52(l). - P.279-87 (6).

79. Dijkman R, Koekkoek SM, Molenkamp R, Schildgen O, van der Hoek L. Human bocavirus can be cultured in differentiated human airway epithelial cells. // J Virol. 2009. - Vol.83(15). -P.7739-7748.

80. Ditt V, Viazov S, Tillman R. et al. Genotyping of human bocavirus using a restriction length polymorphism. // Virus Genes. 2008. - Vol.36. - P.67-69.

81. Domachowske J. Human Metapneumovirus. // eMedicine: URL: http://emedicine.medscape.com/article/972492-overview (2009)

82. Douville RN, Bastien N, Li Y, Pochard P, Simons FE, Hay Glass KT. Human metapneumovirus elicits weak IFN-gamma memory responses compared with respiratory syncytial virus. // J Immunol. 2006. - Vol.176. - P.5848-5855.

83. Druce J, Tran T, Kelly H. et al. Laboratory diagnosis and surveillance of human respiratoryviruses by PCR in Victoria, Australia, 2002-2003. // J. Med. Virol. 2005. - Vol.75. - P. 122-129.

84. Easton AJ, Domachowske JB, Rosenberg HF. Animal pneumoviruses: molecular genetics and pathogenesis. // Clin. Microbiol. Rev. 2004. - Vol.17. - P.390-412.

85. Ebihara T, Endo R, Kikuta H, Ishiguro N, Ishiko H, Нага M, Takahashi Y, Kobayashi K. Human metapneumovirus infection in Japanese children. // J. Clin. Microbiol. 2004. - Vol.42. -P. 126-132 (a)

86. Ebihara T, Endo R, Kikuta H, Ishiguro N, Yoshioka M, Ma X, et al. Seroprevalence of human metapneumovirus in Japan. // J Med Virol. — 2003. Vol.70(2). - P.281-3.

87. Ebihara T, Endo R, Ma X, Ishiguro N and Kikuta H. Detection of human metapneumovirus antigens in nasopharyngeal secretions by an immunofluorescent-antibody test. // J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol.43. - P.l 138-1141.

88. Ebihara T, Endo R, Ishiguro N. et al. Early reinfection with human metapneumovirus in an infant // J. Clin. Microbiol. 2004. - Vol.42. - P. 5944-5946. (6)

89. Endo R, Ishiguro N, Kikuta H, Teramoto S, Shirkoohi R, Ma X, Ebihara T, Ishiko H, Ariga T. Seroepidemiology of human bocavirus in Hokkaido prefecture, Jpn // J. Clin. Microbiol. —2007. — Vol.45(10). -P.3218-3223.

90. Englund JA, Boeckh M, Kuypers J, Nichols WG, Hackman RC, Morrow RA, et al. Brief communication: fatal human metapneumovirus infection in stem-cell transplant recipients. // Ann Intern Med. 2006. - Vol. 144(5). - P.344-9

91. Escobar C, Luchsinger V, de Oliveira DB, Durigon E, Chnaiderman J, Avendano LF. Genetic variability of human metapneumovirus isolated from Chilean children, 2003-2004. // J Med Virol. 2009. - Vol.81(2). P.340-4.

92. Esper F, Martinello RA, Boucher D, Weibel C, Ferguson D, Landry ML, Kahn JS. A 1 -year experience with human metapneumovirus in children aged -5 years. // J. Infect. Dis. — 2004. — Vol.189.-P.1388-1396.

93. Esposito S, Bosis S, Niesters HG, Tremolati E, Sabatini C, Porta A, Fossali E, Osterhaus AD, Principi N. Impact of human bocavirus on children and their families. // J Clin Microbiol.2008. Vol.46. - P.1337-1342.

94. Falsey AR, Erdman DD, Anderson LJ, Walsh EE. Human metapneumovirus infections in young and elderly adults. // J. Infect. Dis. 2003. - Vol.l87. - P.785-790.

95. Falsey AR. Human metapneumovirus infection in adults. // Pediatr Infect Dis J. 2008. -Vol.27(10). - P.S80-3.

96. Fouchier RA, Kuiken T, Schutten M, van Amerongen G, van Doornum GJ, van den Hoogen BG, Peiris M, Lim W, Stohr K, Osterhaus AD. Aetiology: Koch's postulates fulfilled for SARS virus. // Nature (London). 2003. - Vol.15. - P.240

97. Fry AM, Lu X, Chittaganpitch M, Peret T, Fischer J, Dowell SF, et al. Human bocavirus: a novel parvovirus epidemiologically associated with pneumonia requiring hospitalization in Thailand. // J Infect Dis. 2007. - Vol.195. - P. 1038-45.

98. Gagliardi ТВ, Iwamoto MA, Paula FE, Proenca-Modena JL, Saranzo AM, Criado MF, Acrani GO, Camara AA, Cintra OA, Arruda E. Human bocavirus respiratory infections in children. // Epidemiol. Infect 2009. - Vol. 137(7). - P. 1032-6.

99. Galiano M, Videla C, Puch SS, Martinez A, Echavarria M, Carballal G. Evidence of human metapneumovirus in children in Argentina. // J Med Virol. 2004. - Vol.72(2). - P.299-303.

100. Garbino J, Inoubli S, Mossdorf E, Weber R, Tamm M, Soccal P, Aubert JD, Bridevaux PO, Tapparel C, Kaiser L. Respiratory viruses in HIV-infected patients with suspected respiratory opportunistic infection. // AIDS. 2008. - Vol.22(6). - P.701-705

101. Garbino J, Soccal PM, Aubert JD, Rochat T, Meylan P, Thomas Y, Tapparel C, Bridevaux PO, Kaiser L. Respiratory viruses in bronchoalveolar lavage: a hospital-based cohort study in adults. // Thorax. 2009. - Vol.64(5). - P.399-404.

102. Garcia ML, Calvo C, Pozo F, Perez-Brena P, Vazquez MC, Casas I. Detection of human bocavirus in ill and healthy Spanish children: a 2-year study. // Arch. Dis. Child. —2009. — PMID: 18676432.

103. Garcia-Garcia M L, Calvo R, Po SF. et al. Human bocavirus infection in 0-4 year-old: clinical and epidemiological characteristics of an emerging respiratory virus // An. Pediatr. (Barcelona). -2007. Vol.67(3). - P.212-219.

104. Gerna G, Piralla A, Campanini G. et al. The human bocavirus role in acute respiratory tract infections of pediatric patients as defined by viral load quantification. // New Microbiol. 2007. -Vol.30(4) - P.383-392.

105. Graham BS, Perkins M.D, Wright PF and Karzrn DT. Primary respiratory syncytial virus infection in mice. // J.Med.Virol. 1988.- Vol.26.-P. 153-162.

106. Greensill J, McNamara PS, Dove W, Flanagan B, Smyth RL, Hart CA. Human metapneumovirus in severe respiratory Syncytial virus bronchiolitis. // Emerg. Infect. Dis. — 2003. Vol.9. - P.372—375.

107. Guerrero-Plata A, Baron S, Poast JS, Adegboyega PA, Casola A, Garofalo RP. Activity and regulation of alpha interferon in respiratory syncytial virus and human metapneumovirus experimental infections. // J Virol. 2005. - Vol.79(16). - P.10190-9.

108. Guerrero-Plata A, Casola A, Suarez G, Yu X, Spetch L, Peeples ME, Garofalo RP. Differential response of dendritic cells to human metapneumovirus and respiratory syncytial virus. // Am J Respir Cell Mol Biol. 2006. - Vol.34(3). - P.320-9.

109. Guerrero-Plata A, Kolli D, Hong C, Casola A, Garofalo RP. Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections. //J Immunol. — 2009. — Vol. 182(5). — P.3072-83.

110. Hamelin ME, Abed Y, Boivin G. Human metapneumovirus: a new player among respiratory viruses // Clin. Infect. Dis. 2004. - Vol.38. - P.983-990.

111. Hamelin ME, Boivin G. Development and validation of an Enzyme-linked immunosorbent assay for human Metapneumovirus serology based on a recombinant viral protein. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005. - Vol.12. - P.249-253. (a)

112. Hamelin ME, Prince GA, Boivin G. Effect of ribavirin and glucocorticoid treatment in a mouse model of human metapneumovirus infection. // Antimicrob Agents Chemother. 2006. -Vol.50(2). - P.774-7.

113. Hamelin ME, Yim K, Kuhn KH, Cragin RP, Boukhvalova M, Blanco JC, Prince GA, Boivin G. Pathogenesis of human metapneumovirus lung infection in BALB/c mice and cotton rats. // J Virol. 2005. - Vol.79. - Р.8894-8903(в).

114. Нага M, Takao S, Fukuda S, Shimazu Y, Miyazaki K. Human metapneumovirus infection in febrile children with lower respiratory diseases in primary care settings in Hiroshima, Japan. // Jpn J Infect Dis. 2008. -Vol.61(6). -P.500-2.

115. Heegaard ED, Brown KE. Human parvovirus В19. // Clin.Microbiol.Rev. 2002. - Vol.15. - P.485-505.

116. Heininger U, Kruker AT, Bonhoeffer J, Schaad UB. Human metapneumovirus infections-biannual epidemics and clinical findings in children in the region of Basel, Switzerland // Eur J Pediatr. 2009. - PMID: 19238433.

117. Hengst M, Hausler M, Honnef D, Scheithauer S, Ritter K, Kleines M. Human Bocavirus-infection (HBoV): an important cause of severe viral obstructive bronchitis in children. // Klin Padiatr. 2008. - Vol.220(5). - P.296-301.

118. Henrickson KJ. Advances in the laboratory diagnosis of viral respiratory disease // Pediatr. Infect. Dis. J.-2004.-Vol.23.-P.S6-S10.

119. Herfst S, De Graaf M, Schickli JH. et al. Recovery of human metapneumovirus geneticlineages A and В from cloned cDNA // J. Virol. 2004. - Vol.78. - P.8264-8270.

120. Hindiyeh MY, Keller N, Mandelboim M. et al. High rate of human bocavirus and adenovirus coinfection in hospitalized Israeli children // J. Clin. Microbiol. 2008. - Vol.46(l). - P.334-337.

121. Jacques J, Moret H, Renois F, Leveque N, Motte J, Andreoletti L. Human Bocavirus quantitative DNA detection in French children hospitalized for acute bronchiolitis. // J. Clin. Virol. 2008. - Vol.43. - P. 142-147.

122. Kahn JS, Kesebir D, Cotmore SF. et al. Seroepidemiology of human bocavirus defined using recombinant virus-like particles. // J. Infect. Dis. 2008. - Vol.l98(l). - P.41-50.

123. Kahn JS. Human bocavirus: clinical significance and implications// Curr. Opin. Pediatr. — 2008. Vol.20(l). - P.62-66.

124. Kaida A, Kubo H, Shiomi M, Kohdera U, Iritani N. Evaluation of real-time RT-PCR compared with conventional RT-PCR for detecting human metapneumovirus RNA from clinical specimens. // Jpn J Infect Dis. 2008. - Vol.61(6). - P.461-4.

125. Kainulainen L, Waris M, Soderlund-Venermo M, Allander T, Hedman K, Ruuskanen O. Hepatitis and human bocavirus primary infection in a child with T-cell deficiency. // J Clin Microbiol. 2008. - Vol.46. P.4104-4105.

126. Kantola K, Hedman L, Allander T. et al. Serodiagnosis of human bocavirus infection. // Clin. Infect. Dis. 2008. - Vol.46 (4). - P.540-546.

127. Kaplan NM, Dove W, Abu-Zeid AF, Shamoon HE, Abd-Eldayem SA, Hart CA. Human bocavirus infection among children, Jordan. // Emerg Infect Dis. 2006. - Vol.12. - P. 1418-20.

128. Kapoor A, Slikas E, Simmonds P, Chieochansin T, Naeem A, Shaukat S, Alam MM, Sharif S, Angez M, Zaidi S, Delwart E. A newly identified bocavirus species in human stool. // J Infect Dis. 2009. - Vol. 199(2). - P. 196-200.

129. Kashiwa H, Shimozono H, Takao S. Clinical pictures of children with human metapneumovirus infection: comparison with respiratory syncytial virus infection. // Jpn J Infect Dis. 2004. - Vol.57(2). - P.80-2.

130. Khetsuriani N, Kazerouni NN, Erdman DD et al. Prevalence of viral respiratory tract infections in children with asthma. // J Allergy Clin Immunol. 2007. - Vol.119. - P.314-321.

131. Kim S, Sung H, Im HJ, Hong SJ, Kim MN. Molecular epidemiological investigation of a nosocomial outbreak of human metapneumovirus infection in a pediatric hemato -oncology patient population. // J Clin Microbiol. 2009. - Vol.47(4). - P. 1221-4.

132. Kim YK, Lee HJ. Human metapneumovirus-associated lower respiratory tract infections in korean infants and young children. // Pediatr. Infect. Dis. J. 2005. - Vol.24. - P.l 111-1112.

133. Koskenvuo M, Mottonen M, Waris M, Allander T, Salmi TT, Ruuskanen O. Human bocavirus in children with acute lymphoblastic leukemia. // Eur J Pediatr. 2008. - Vol.167. — P.l 011—1015.

134. Kukavica-Ibrulj I, Boivin G. Detection of human metapneumovirus antigens in nasopharyngeal aspirates using an enzyme immunoassay. // J Clin Virol. 2009. - Vol.44(l). -P.88-90.

135. Landry ML, Cohen S and Ferguson D. Prospective Study of Human Metapneumovirus Detection in Clinical Samples by Use of Light Diagnostics Direct Immunofluorescence Reagentand Real-Time PCR. // J Clin Microbiol. -2008. -Vol.46(3). P.l098-1100.

136. Lin F, Guan W, Cheng F, Yang N, Pintel D, Qiu J. ELISAs using human bocavirus VP2 virus-like particles for detection of antibodies against HBoV. // J Virol Methods. — 2008. -Vol.149.-P.l 10-117. (a)

137. Lin F, Hou JY, Zheng MQ. et al. Characterization of the cytopathic effect in human bronchial epithelial cell after human bocavirus infection (HBoV) // Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi. 2008. - Vol. 22(2). - P. 107-109. (6)

138. Lin F, Zeng A, Yang N, Lin H, Yang E, Wang S, Pintel D, Qiu J. Quantification of human bocavirus in lower respiratory tract infections in China. // Infect. Agent. Cancer. — 2007. — Vol.2. -P.3.

139. Lin JH, Chiu SC, Lin YC, Chen HL, Lin KH, Shan KH, Wu HS, Liu HF. Clinical and genetic analysis of Human Bocavirus in children with lower respiratory tract infection in Taiwan. // J Clin Virol. 2009. - Vol.44(3). - P.219-24.

140. Lindner J, Karalar L, Schimanski S, Pfister H, Struff W, Modrow S. Clinical and epidemiological aspects of human bocavirus infection. // J Clin Virol. 2008 Dec. - Vol.43(4). -P.391-5. (a)

141. Lindner J, Karalar L, Zehentmeier S, Plentz A, Pfister H, Struff W, Kertai M, Segerer H, Modrow S. Humoral immune response against human bocavirus VP2 virus-like particles. // Viral Immunol. 2008. - Vol.21(4). - P.443-9. (6)

142. Lindner J, Modrow S. Human bocavirus — a novel parvovirus to infect humans. // Intervirology. 2008. - Vol.51(2). - P. 116-22. (в)

143. Lindner J, Zehentmeier S, Franssila R, Barabas S, Schroeder J, Demi L, Modrow S. CD4+ T helper cell responses against human bocavirus viral protein 2 viruslike particles in healthy adults. // J Infect Dis. 2008. - Vol. 198(11). - P. 1677-84. (r)

144. Liu L, Bastien N, Li Y. Intracellular Processing, Glycosylation, and Cell Surface Expression of Human Metapneumovirus Attachment Glycoprotein. // J. Virol. 2007. - Vol.81. - P. 1343513443.

145. Liu Y, Haas DL, Poore S, Isakovic S, Gahan M, Mahalingam S, Fu ZF, Tripp RA. Human metapneumovirus establishes persistent infection in the lungs of mice and is reactivated by glucocorticoid treatment. // J Virol. 2009. - Vol.83(13). - P.6837-48.

146. Longtin J, Bastien M, Gilca R, Leblanc E, de Serres G, Bergeron MG, Boivin G. Human bocavirus infections in hospitalized children and adults. // Emerg. Infect. Dis. — 2008. — Vol.l4(2). -P.217-221.

147. Lu X, Chittaganpitch M, Olsen SJ, Mackay IM, Sloots TP, Fry AM, Erdman DD. Real-time PCR assays for detection of bocavirus in human specimens. // J. Clin. Microbiol. — 2006. — Vol.44.-P.3231-3235.

148. Lu X, Gooding LR, Erdman DD. Human bocavirus in tonsillar lymphocytes. // Emerg Infect Dis. -2008. Vol.14. - P. 1332-1334.

149. Ludewick HP, Abed Y, van Niekerk N, Boivin G, Klugman К P and Madhi SA. Human metapneumovirus genetic variability, South Africa. // Emerg. Infect. Dis. — 2005. Vol.1. -P. 1074-1078.

150. Luo L, Sabara MI, Li Y. Analysis of Antigenic Cross-Reactivity Between Subgroup С Avian Pneumovirus and Human Metapneumovirus by Using Recombinant Fusion Proteins. // Transbound Emerg Dis. 2009. - Vol.56(8). - P.303-10.

151. Ma X, Endo R, Ebihara T. et al. Production and characterization of neutralizing monoclonal antibodies against human metapneumovirus F protein. // Hybridoma (Larchmt.). 2005. — Vol.24.-P.201-205.

152. Ma X, Endo R, Ishiguro N, Ebihara T, Ishiko H, Ariga T, Kikuta H. Detection of human bocavirus in Japanese children with lower respiratory tract infections. // J. Clin. Microbiol. -2006. Vol.44. - P.l 132-1134.

153. Manning A, Rusell V, Eastick K. et al. Epidemiological profile and clinical associations of human bocavirus and other human parvoviruses. // J. Infect. Dis. — 2006. Vol. 194(9). - P.l283-1290.

154. Manning A, Willey SJ, Bell JE, Simmonds P. Comparison of tissue distribution, persistence, and molecular epidemiology of parvovirus B19 and novel human parvoviruses PARV4 and human bocavirus. // J Infect Dis. 2007. - Vol.195. - P. 1345-1352.

155. Mao HW, Yang XQ, Zhao XD. Characterization of human metapneumoviruses isolated in Chongqing, China. // Chin Med J (Engl). 2008. - Vol. 121(22). - P.2254-7.

156. Maranich A, Rajnik M, Nissen MD, Sloots TP. Human Metapneumovirus. // eMedicine: URL: http://emedicine.medscape.com/article/237691-overview (2009)

157. Martin ET, Kuypers J, Heugel J, Englund JA. Clinical disease and viral load in children infected with respiratory syncytial virus or human metapneumovirus. // Diagn Microbiol Infect Dis. 2008. - Vol.62(4). - P.382-8.

158. Matsuzaki Y, Takashita E, Okamoto M et al. Evaluation of a new rapid antigen test using immunochromatography for the detection of human metapneumovirus compared with real-time PCR assay. // J Clin Microbiol. 2009. - Vol.47(9). - P.2981-4.

159. McManus ТЕ, Marley AM, Baxter N, Christie SN, O'Neill HJ, Elborn JS. Respiratory viral infection in exacerbations of COPD. // Respir Med. 2008. - Vol.l02(l 1). - P.1575-80.

160. McNamara PS, Flanagan BF, Smyth RL, Hart CA. Impact of human metapneumovirus and respiratory syncytial virus co-infection in severe bronchiolitis. // Pediatr Pulmonol. — 2007. — Vol.42. -P.740-743.

161. Naghipour M, Cuevas LE, Bakhshinejad T, Dove W, Hart CA. Human bocavirus in Iranian children with acute respiratory infections. // J Med Virol. 2007. - Vol.79. - P.539-543.

162. Neske F, Blessing K, Tollmann F. et al. Real-time PCR for diagnosis of human bocavirus infections and phylogenetic analysis // J. Clin. Microbiol. 2007. - Vol.45(7). - P.2116-2122.

163. Newcomb DC, Peebles RS Jr // Bugs and asthma: a different disease? // Proc Am Thorac Soc. 2009. - Vol.6(3). - P.266-71.

164. Papadopoulos NG, Moustaki M, Tsolia M, Bossios A, Astra E, et al. Association of rhinovirus infection with increased disease severity in acute bronchiolitis. // Am J Respir Crit Care Med. -2002. Vol.165. - P. 1285-1299.

165. Pavlova S, Hadzhiolova T, Abadjieva P, Kotseva R. Application of RT-PCR for diagnosis of respiratory syncytial virus and human metapneumovirus infections in Bulgaria, 2006-7 and 2007-8 //Euro Surveill. —2009. — Vol.l4(23). — P.19233.

166. Peiris JS, Tang WH, Chan KH, Khong PL, Guan Y, Lau YL and Chiu SS. Children with respiratory disease associated with metapneumovirus in Hong Kong. // Emerg. Infect. Dis. — 2003. Vol.9(6). - P.628-633.

167. Pelletier G, Dery P, Abed Y and Boivin G. Respiratory tract reinfections by the new human metapneumovirus in an immunocompromised child. // Emerg. Infect. Dis. 2002. — Vol.8. — P.976-97.

168. Percivalle E, Sarasini A, Visai L. et al. Rapid detection of human metapneumovirus strains in nasopheringeal aspirates and shell vial cultures by monoclonal antibodies // J. Clin. Microbiol. — 2005. Vol.43. - P.3443-3446.

169. Poutanen SM, Low DE, Henry B, Finkelstein S, Rose D, Green K, Tellier R, Draker R, et al. Identification of severe acute respiratory syndrome in Canada. // N. Engl. J. Med. — 2003. — Vol.348.-P.1995-2005.

170. Prins JM, Wolthers КС. Human metapneumovirus: a new pathogen in children and adults. // Netherlands J. Med. 2004. - Vol.62. - P. 177-179.

171. Qi ZY, Qu XW, Liu WP. et al. Genome cloning and phylogenetic analysis of human bocavirus capsid gene. // Bing Du Xue Bao. 2007. - Vol.23(6). - P.447-453.

172. Qu XW, Liu WP, Qi ZY. et al. Phospholipase A2-like activity of human bocavirus VP1 unique region. // Biochem. Bi-ophys. Res. Commun. — 2008. Vol.365(1). - P.158-163.

173. Rao BL, Gandhe SS, Pawar SD, Shah SC, Kinikar AA, Arankalle VA. First Detection of Human Metapneumovirus in Children with Acute Respiratory Infection in India: a Preliminary Report. // J. Clin Microbiol. 2004. - Vol.42. - P.5961-5962.

174. Rawlinson WD, Waliuzzaman Z, Carter IW, Belessis YC, Gilbert KM, Morton JR. Asthma exacerbations in children associated with rhinovirus but not human metapneumovirus infection. //J. Infect. Dis. 2003. - Vol.187. - P. 1314-1318.

175. Red Book: 2000. Report of the Committee on Infection Diseases. 25rd: American Academy of Pediatrics. 2000. - P.855.

176. Redshaw N, Wood C, Rich F, Grimwood K, Kirman JR. Human bocavirus in infants, New Zealand. // Emerg. Infect. Dis. 2007. - Vol.13. - P. 1797-1799.

177. Reed L., Muench H. A simple method of estimating 50 % endpoints // Amer. J. Hygiene. -1938.-V. 27.-P. 493-497.

178. Rohde G, Borg I, Arinir U, Kronsbein J, Rausse R, Bauer TT. Relevance of human metapneumovirus in exacerbations of COPD. // Respir Res. 2005. -Vol.6. - P. 150.

179. Ruohola A, Waris M, Allander T, Ziegler T, Heikkinen T, Ru O. Viral Etiology of Common Cold in Children, Finland. // Emerg Infect Dis. 2009. - Vol. 15(2). - P.344-346.

180. Sasaki A, Suzuki H, Saito R, Sato M, Sato I, Sano Y, Uchiyama M. Prevalence of human metapneumovirus and influenza virus infections among Japanese children during two successive winters. // Pediatr Infect Dis J. 2005. - Vol.24(10). - P.905-8.

181. Schenk T, Strahm B, Kontny U, Hufnagel M, Neumann-Haefelin D, Falcone V. Disseminated bocavirus infection after stem cell transplant. // Emerg Infect Dis. 2007. Vol.13. -P. 1425-1427. (a)

182. Schenk T, Huck B, Forster J. et al. Human bocavirus DNA detected by quantitative real-time PCR in two children hospitalized for lower respiratory tract infection // Eur. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2007. - Vol.26. - P.147-149. (6)

183. Schildgen O, Geikowski T, Glatzel T, Schuster J, Simon A. Frequency of human metapneumovirus in the upper respiratory tract of children with symptoms of an acute otitis media. // Eur J Pediatr. Jun. 2005. - Vol.164(6). - P.400-1. (a)

184. Schildgen О, Geikowski T, Glatzel Т. et al. New variation of the human metapneumovirus (HMPV) associated with an acute and severe exacerbation of asthma bronchiale // J. Clin. Virol.2004. Vol.31. - P.283-288.

185. Shapiro E. Epidemiology of acute respiratory infections. // Semin. Pediatr. Infect. Dis. -1998,-Vol.9.-P.31-36.

186. Shots TP, McErlean P, Speicher DJ. et al. Evidence of human coronavirus HKU1 and human bocavirus in Australian children. // J. Clin. Virol. 2006. - Vol.35. - P.99-102.

187. Sloots TP, Whiley DM, Lambert SB, Nissen MD. Emerging respiratory agents: new viruses for old diseases? // J Clin Virol. 2008. - Vol.42(3). - P.233-43.

188. Suzuki A, Watanabe O, Okamoto M, Endo H, Yano H, Suetake M. Detection of human metapneumovirus from children with acute otitis media.// Pediatr Infect Dis J. —2005. — Vol.24(7). — P.655-7.

189. Szomor KN, Kapusinszky B, Rigo Z, Kis Z, Rozsa M, Farkas A, Szilagyi A, Berencsi.G, Takacs M. Detection of human bocavirus from fecal samples of Hungarian children with acute gastroenteritis. // Intervirology. 2009. - Vol.52(l). - P. 17-21.

190. Taylor G, Stott EI, Hughes M and Collins AP. Respiratory syncytial virus infection in mice. Infect Immun. — 1984.-Vol.43.-P 649-655.

191. Talavera GA, Mezquita NE. Human metapneumovirus in children with influenza-like illness in Yucatan, Mexico. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2007. - 76(1). - P.182-183.

192. Tan BH, Lim EA, Seah SG, Loo LH, Tee NW, Lin RT, Sugrue RJ. The incidence of human bocavirus infection among children admitted to hospital in Singapore. // J Med Virol. — 2009. -Vol.81(l). -P.82-9.

193. Tecu C, Ora§anu D, Sima A, Mihai ME, Alexandrescu V, Matei D, Samoila N. First detection of human metapneumovirus in children with respiratory infections in Romania. // Roum Arch Microbiol Immunol. 2007. Vol.66(l-2). - P.37-40.

194. Tozer SJ, Lambert SB, Whiley DM, Bialasiewicz S, Lyon MJ, Nissen MD, Sloots TP. Detection of human bocavirus in respiratory, fecal, and blood samples by real-time PCR. // J Med Virol. 2009. - Vol.81(3). - P.488-93.

195. Tu CC, Chen LK, Lee YS, Ко CF, Chen CM, Yang HH, Lee JJ. An outbreak of human metapneumovirus infection in hospitalized psychiatric adult patients in Taiwan. // Scand J Infect Dis. 2009. - Vol.41(5). - P.363-7.

196. Van den Hoogen BG, de Jong JC, Groen J, Kuiken T, de Groot R, Fouchier RA, Osterhaus

197. AD. A newly discovered human pneumovirus isolated from young children with respiratory tract disease. //Nat. Med. 2001. - Vol.7. - P.719-724.

198. Van den Hoogen BG, Herfst S, Sprang L. et al. Antigenic and genetic variability of human metapneumoviruses. // Emerg. Infect. Dis. — 2004. Vol.10. - P.658-666 (a).

199. Van den Hoogen BG, Osterhaus DME, Fouchier RAM. Clinical impact and diagnosis of human metapneumovirus infection. // Pediatr. Infect. Dis. J. 2004. - Vol.23. - P.S25-S32 (6).

200. Vargas SO, Kozakewich HP, Perez-Atayde AR, McAdam AJ. Pathology of human metapneumovirus infection: insights into the pathogenesis of a newly identified respiratory virus. // Pediatr. Dev. Pathol. 2004. - Vol.7. - P.478-486.

201. Viazov S., Ratjen F., Scheidhauer R., Fiedler M., Roggendorf M. High prevalence of human metapneumovirus infection in young children and genetic heterogeneity of the viral isolates. // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol.41(7). - P.3043-3045.

202. Vicente D, Montes M, Cilia G, Perez-Yarza EG, Perez-Trallero E. Differences in clinical severity between genotype A and genotype В human metapneumovirus infection in children. // Clin. Infect. Dis. -2006. -Vol.15. -P.elll-el 13.

203. Von Linstow ML, Hogh M, Hogh B. Clinical and epidemiologic characteristics of human bocavirus in Danish infants: results from a prospective birth cohort study. // Pediatr. Infect. Dis. J. 2008. - Vol.27(10). - P.897-902.

204. Wang HC, Huang SW, Wang SW, Tsai HP, Kiang D, Wang SM, Liu CC, Su IJ, Wang JR. Co-circulating genetically divergent A2 human metapneumovirus strains among children in southern Taiwan. // Arch Virol. 2008. - Vol.l53(12). - P.2207-13.

205. Wilkesmann A, Schildgen O, Eis-Hubinger AM, et al. Human metapneumovirus infections cause similar symptoms and clinical severity as respiratory syncytial virus infections. // Eur J Pediatr. 2006. - Vol. 165(7). - P.467-75.

206. Williams JV, Chen Z, Cseke G, Wright DW, Keefer С J, Tollefson SJ, Hessell A, Podsiad A,

207. Williams JV, Tollefson SJ, Johnson JE, Crow JE Jr. The cotton rat (Sigmodon hispidus) is a permissive small animal model of human metapneumovirus infection, pathogenesis, and protective immunity // J. Virol. 2005. - Vol.79(17). - P. 10944-10951 (6).

208. Williams JV, Wang CK, Yang CF, Tollefson SJ, House FS, Heck JM. The role of human metapneumovirus in upper respiratory tract infections in children: a 20-year experience. // J Infect Dis. 2006. - Vol. 193(3). - P.387-95.

209. Wolf DG, Greenberg D, Kalkstein D et al. Comparison of human metapneumovirus, respiratory syncytial virus and influenza A virus lower respiratory tract infections in hospitalized young children. // Pediatr Infect Dis J. 2006. - Vol.25. - P.320-324.

210. Wolf DG, Zakay-Rones Z, Fadeela A, Greenberg D, Dagan R. High seroprevalence of human metapneumovirus among young children in Israel. // J Infect Dis. 2003. - Vol.l88(12). -P. 1865-7.

211. Woo PC, Lau SK, Chu CM. et al. Characterization and complete genome sequence of a novel corona virus, coronavirus HKUI from patients with pneumonia. // J. Virol. 2005. - Vol.79(2). — P.884-895.

212. Wyde PR, Chetty SN, Jewell AM, Boivin G, Piedra PA. Comparison of the inhibition of human metapneumovirus and respiratory syncytial virus by ribavirin and immune serum globulin in vitro. И Antiviral Res. 2003. - Vol.60(l). - P.51-59.

213. Wyde PR, Chetty SN, Jewell AM, Schoonover SL, Piedra PA. Development of a cotton rat-human metapneumovirus (hMPV) model for identifying and evaluating potential hMPV antivirals and vaccines. // Antiviral Res. 2005. - Vol.66(1). - P.57-66.

214. Wyde PR, Moylett EH, Chetty EH, Jewell AM, Bowlin TL, Piedra PA. Comparison of the inhibition of human metapneumovirus and respiratory syncytial virus by NMS03 in tissue culture assays. // Antiviral Res. 2004. - Vol.63. - P.51-59.

215. Xepapadaki P, Psarras S, Bossios A, Tsolia M, Gourgiotis D, Liapi-Adamidou G,

216. Constantopoulos AG, Kafetzis D, Papadopoulos NG. Human Metapneumovirus as a causative agent of acute bronchiolitis in infants. // J. Clin. Virol. 2004. - Vol.30 - P.267-270.

217. Xing JM, Weng XJ, Zhang S et al. Detection and identification of human metapneumovirus by real time reverse transcription PCR. // Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi. 2008. - Vol.22(6). - P.510-2.

218. Zhang Q, Yang XQ, Zhao Y, Zhao XD. High seroprevalence of human metapneumovirus infection in children in Chongqing, China. // Chin Med J. 2008. - Vol.l21(21). - P.2162-6.

219. Zhao LQ, Qian Y, Zhu RN, Deng J, Wang F, Dong HJ, Sun Y, Li Y. Human bocavirus infections are common in Beijing population indicated by sero-antibody prevalence analysis. // Chin Med J (Engl). 2009. - Vol. 122(11). - P. 1289-92.

220. Zheng MQ, Lin F, Zheng MY. et al. Clinical prospective study on maternal-fetal transmission of human bocavirus. // Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi. — 2007,-Vol.21.-P.331-333.

221. Zou LR, Mo YL, Wu D et al. Investigation of human metapneumovirus in children with acute respiratory tract infections in Guangzhou areas. // Zhonghua Yu Fang Yi Xue Za Zhi. -2009. Vol.43(4). - P.314-8.

Информация о работе

Козулина, Ирина Сергеевна
кандидата медицинских наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.02

Диссертация

Новые инфекционные агенты - Метапневмовирус и Бокавирус человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Новые инфекционные агенты - Метапневмовирус и Бокавирус человека ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Новые инфекционные агенты - Метапневмовирус и Бокавирус человека"

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Козулина, Ирина Сергеевна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новые инфекционные агенты - Метапневмовирус и Бокавирус человека"

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Козулина, Ирина Сергеевна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Козулина, Ирина Сергеевна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Новые инфекционные агенты - Метапневмовирус и Бокавирус человека
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология