Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическая характеристика бокавирусов, циркулирующих в Новосибирске

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая характеристика бокавирусов, циркулирующих в Новосибирске"

9 15-3/259

На правах рукописи

Ж

ТЮМЕНЦЕВ АЛЕКСАНДР ИГОРЕВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОКАВИРУСОВ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В НОВОСИБИРСКЕ

03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2015

Работа выполнена на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет» (Новосибирский государственный университет, ИГУ)

Научный руководитель:

д.б.н., доцент Тикунова Нина Викторовна

Официальные оппоненты:

Кочнева Галина Вадимовна, д. б. н.

Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Роспотребнадзора, зав. лабораторией

Краснова Елена Игоревна, д. м. н., профессор

Новосибирский государственный медицинский университет ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава России, зав. кафедрой

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Лимнологический институт СО РАН

Защита состоится Л СЯМЛб^Яшь г. В «^Л » часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и на сайте www.niboch.nsc.ru.

Автореферат разослан

«£> ОЗ 2015 г.

/ / /' / ' /

Ученый секретарь диссертационного совета ,.,<■■/'р/'

к.х.н., доцент ¿Я'//**"" Коваль В.В.

V......'

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТвСУДАРСТЗ^ННА;

I ., БИЬДИСЛ У А

Актуальность работы. Бокавирус человека (HBoV), семеИетыо Pdrv'ovtf'tauir, был открыт в 2005 году в Швеции в носоглоточных смывах, полученных от детей с острыми респираторными заболеваниями верхних и нижних дыхательных путей [Allander et al., 2005]. Это небольшой (18-26 нм) вирус, геном которого представлен одноцепочечной (+)ДНК [Gurda et al., 2010; Schildgen et al., 2013]. В 2007 г. HBoV был обнаружен и в образцах фекалий детей с гастроэнтеритами [Lee et al., 2007; Vicente et al., 2007; Albuquerque et al., 2007; Lau et al., 2007; Chieochansin et al., 2008]. В 2009-2010 гг. в образцах фекалий были обнаружены генетически отличающиеся варианты HBoV, названные HBoV2, HBoV3 и HBoV4, а открытый ранее вирус стали обозначать HBoVl [Arthur et al., 2009; Kapoor et al., 2009; Kapoor et al., 2010]. В 2014 г. была предложена новая таксономия семейства Parvoviridae, согласно которой HBoVl-HBoV4 наряду с gorilla bocavirns входят в род Bocaparvovirus, в котором HBoVl и HBoV3 принадлежат к одному виду, a HBoV2 и HBoV4 - к другому [Cotmore et al., 2014].

В связи с тем, что HBoV3 и HBoV4 встречаются значительно реже, чем HBoVl и HBoV2, особенности структуры геномов этих вирусов исследованы недостаточно. Так, к моменту настоящего исследования в международной базе данных GenBank было представлено 7 геномов HBoV3 и лишь 1 полногеномная последовательность HBoV4. Кроме того, до сих пор нет единого мнения о происхождении HBoV и его генетических вариантов, мало изучены особенности .молекулярной эволюции этого вируса. Не все известно об особенностях жизненного цикла HBoV, механизмах репликации его генома, что связано с отсутствием воспроизводимой системы культивирования HBoV и животных моделей заболеваний, вызываемых этим вирусом.

Молекулярно-эпидемиологические исследования HBoV интенсивно проводятся во многих странах. Накопленные клинические данные показали, что HBoVl является возбудителем заболеваний дыхательных путей, хотя он обнаруживается и в образцах фекалий больных гастроэнтеритом |Jartti et al., 20111. HBoV2, HBoV3 и HBoV4 в основном выявляются в образцах фекалий [Jartti et al., 2011], но также могут выявляться и в носоглоточных смывах. Несмотря на множество проведенных исследований, до сих пор нет единого мнения об этиологической роли HBoV, в частности HBoV2, HBoV3 и HBoV4, в гастроэнтеритах. Разная встречаемость HBoV в различных регионах и частое выявление HBoV одновременно с другими вирусами, вызывающими острые кишечные инфекции (ОКИ), не позволяют сделать однозначных выводов | Wang et al.. 2011: Khamrin el al.,2012].

В Российской Федерации до начала наших исследований встречаемость и генетическое разнообразие HBoV, ассоциированных с гастроэнтеритами, детально не изучали, поэтому не был известен вклад HBoV в этиологию этих заболеваний, отсутствовали данные об эпидемиологических особенностях инфекций, вызываемых HBoV, не были известны сведения о генетическом разнообразии штаммов,

циркулирующих на территории РФ, в международной базе данных ОепВапк не были представлены геномные последовательности изолятов НВоУ, выявленных в РФ.

Исходя из вышесказанного, целью настоящей диссертационной работы являлось изучение встречаемости и генетического разнообразия изолятов НВоУ у детей, госпитализированных с гастроэнтеритами, а также исследование особенностей молекулярной эволюции и репликации этого вируса. Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) оценить встречаемость ДНК НВоУ в образцах фекалий детей раннего возраста, госпитализированных с гастроэнтеритами в 2010-2012 гг. в Новосибирске, и у здоровых детей;

2) генотипировать выявленные изоляты НВоУ и провести филогенетический анализ полученных данных, в частности проанализировать эпидемиологические особенности инфекций, вызываемых НВоУ1 и НВоУ2;

3) определить полногеномные последовательности новосибирских изолятов НВоУ, принадлежащих к различным генотипам;

4) исследовать особенности молекулярной эволюции НВоУ;

5) исследовать особенности репликации НВоУ.

Научная новизна полученных результатов. Впервые в Российской Федерации исследована встречаемость НВоУ у детей раннего возраста, госпитализированных с гастроэнтеритами, и здоровых детей и показано, что вклад этого вируса в этиологию этих заболеваний невысок. Впервые изучено генетическое разнообразие циркулирующих в Российской Федерации штаммов НВоУ. Определены полногеномные последовательности новосибирских изолятов НВоУ, принадлежащих к различным генотипам, в том числе и редко встречающихся НВоУ4 и рекомбинантного НВоУЗ/НВоУ4. Исследованы особенности молекулярной эволюции НВоУ, и впервые установлено, что скорость накопления мутаций в геноме НВоУ составляет 8.6 х Ю"4 замен/сайт/год, являясь высокой для вирусов с ДНК-геномом. Впервые проведена датировка формирования современных генетических вариантов НВоУ.

Практическая значимость работы. Проводившееся оперативное выявление этиологической причины ОКИ у детей раннего возраста, госпитализированных в специализированную клинику, позволило врачам этой клиники оптимизировать курс лечения.

Результаты проведенного исследования позволили определить этиологическую причину в случаях, ранее относившихся к кишечным инфекциям неустановленной этиологии. Полученные данные включены в статистические отчеты детской городской клинической больницы №3 и вошли в Государственные доклады о санитарно-эпидемиологической обстановке на территории Новосибирской области.

Многолетний мониторинг генетического спектра циркулирующих бокавирусов является актуальным ввиду социальной значимости острых кишечных инфекций, а исследование изменчивости геномов этого патогена важно для прогнозирования появления новых эпидемически значимых вариантов бокавируса.

4

Результаты проведенных исследований будут использованы для подготовки практических рекомендаций для клиницистов, специалистов СЭС и эпидемиологов по контролю и профилактике вирусных кишечных инфекций и внедрению современных методов диагностики.

В рамках работы были получены 62 последовательности участка гена, кодирующего неструктурный белок (NS1), длиной 495 н.о. Определены полные нуклеотидные последовательности, за исключением 5'- и 3'- нетранслируемых областей, 6 изолятов HBoV, из которых три изолята являются редко встречающимися. Полученные нуклеотидные последовательности депонированы в международной базе данных GenBank NCBI и являются важным дополнением к существующим в этой базе последовательностям, что может способствовать изучению роли HBoV в ОКИ у детей раннего возраста.

Апробация работы н публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах, цитируемых в базах данных Web of Science и SCOPUS. Материалы диссертации были представлены на Российских конференциях с международным участием: VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА - 2010» (Москва. Россия. 2010); XLIX Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, Россия, 2011); Научно-практическая конференция «Диагностика и профилактика инфекционных болезней» (Новосибирск, Россия, 2013); VIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА 2014» (Новосибирск, Россия, 2014).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов работы, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы; содержит одно приложение. Работа изложена на 131 странице текста, содержит 30 рисунков и 6 таблиц. Список литературы состоит из 193 ссылок.

Вклад автора. Все эксперименты и анализ полученных данных сделаны лично автором, за исключением определения нуклеотидных последовательностей 5'- и 3'-нетранслируемых областей, скорости молекулярной эволюции HBoV и рекомбинационных событий HBoV, которые проводились совместно с с.н.с. ЛММБ ИХБФМ СО РАН И.В. Бабкиным.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Исследование эпидемических особенностей бокавнруснон инфекции человека в Новосибирске

На первом этапе были изучены эпидемические особенности бокавирусной инфекции в Новосибирске. Для этого на наличие ДНК HBoV исследовали образцы фекалий, полученных от всех детей раннего возраста, госпитализированных с диагнозом ОКИ в 3-е отделение МУЗ Детская городская клиническая больница №3 г. Новосибирска в 2010-2012 гг. Аналогично исследовали образцы фекалий от здоровых

детей, проходивших диспансеризацию в ГБУЗ НСО Новосибирской районной больницы № 1 в 2012 г. На каждого ребенка, участвовавшего в исследовании, составлялась карта пациента, где указывались клинические и эпидемиологические данные. На основании этих карт данные переносились в специально разработанную базу данных на базе Microsoft Access.

Всего за исследуемый период было протестировано на наличие ДНК HBoV 5264 образца фекалий, полученных от детей с диагнозом ОКИ, и 339 образцов фекалий от здоровых доноров.

ДНК HBoV выявляли методом ПЦР, визуализацию продукта реакции проводили электрофоретически. ДНК HBoV была обнаружена в 62 пробах, полученных от детей с диагнозом ОКИ, что составило 1,2% от общего числа образцов, и в одном образце от здоровых детей, что составило 0,3 %. Встречаемость ДНК HBoV отличалась в разные годы исследований (таблица I): в 2010 г. она составила 1,2 % (19/1467), в 2011 г. -1,7 % (34/1980), а в 2012- 0,5 % (9/1817).

Все исследуемые образцы фекалий от больных с диагнозом ОКИ и от здоровых доноров были протестированы на наличие не только ДНК HBoV, но и на наличие РНК ротавирусов группы A (HRVA), норовирусов II геногруппы (HNoVII) и астровирусов человека (HAstV). Кроме того, все HBoV-положительные образцы были исследованы на наличие ДНК аденовирусов F и ДНК патогенных бактерий: сальмонелл, кампилобактерий, шигелл и энтероинвазивных Е. coli. В связи с этим можно было оценить вклад HBoV в этиологию ОКИ в составе моноинфекций и инфекций сочетанной этиологии.

За весь исследуемый период ОКИ, вызванные моноинфекцией HBoV, были выявлены в 54,8 % образцов от всех обнаруженных случаев бокавирусной инфекции (таблица 1), однако этот показатель варьировал в разные годы. Так, в 2010 г. HBoV встречались в виде моноинфекций почти в 52,6 % случаев от обнаруженных за этот год (10/19), в 2011 г. произошло увеличение доли моноинфекций до 53,8 % (21/34), а в 2012 г. HBoV встречались в виде моноинфекций в приблизительно в половине

Таблица 1.

Распределение НВоУ, выявленных у детей с ОКИ в Новосибирске (февраль 2010- декабрь

2012)

Вирусы/Бактерии Количество образцов

HBoV HBoVl HBoV2 HBoV3 HBoV4

HBoV alone 34 II 21 1 1

HBoV с др. агентами ОКИ 28 13 14 0 1

HBoV, HNoVGII 10 6 4 0 0

HBoV, HRVA 9 4 5 0 0

HBoV, Shigella spp. and EIEC 1 0 1 0 0

HBoV, Campylobacter spp. 3 2 1 0 0

HBoV, HRVA, HNoVGII 2 0 2 0 0

HBoV, HNoVGII, HAstV 1 0 1 0 0

HBoV, HRVA, Campylobacter spp. 1 1 0 0 0

HBoV, HNoVGII, Shigella spp. and EIEC 1 0 0 0 1

Всего 62 24 35 1 2

случаев (5/9). В НВоУ-положительном образце от здорового ребенка нуклеиновых кислот других возможных возбудителей ОКИ обнаружено не было.

В 44,9 %, случаях НВоУ были зарегистрированы при ОКИ сочетанной этиологии: в 32,2 % случаев они встречались в сочетании с одним инфекционным агентом, преимущественно с наиболее распространенными ИИоУН и НЯУА, в 13 % случаев - в сочетании более чем с одним патогеном. При этом более 10 % выявленных случаев бокавирусной инфекции были обнаружены в сочетании с бактериальными патогенами (таблица1).

Анализ сезонной встречаемости бокавирусов показал, что они выявлялись в течение всего периода исследования, кроме марта месяца. Выявляемость бокавирусов по отношению к общему числу поступивших с диагнозом ОКИ в различные месяцы варьировала от 0 % до 6,5 % (рисунок 1). Наибольшее число выявленных бокавирусов было обнаружено в феврале 2011 г., причем в этом месяце бокавирусы встречались чаще, чем астровирусы, которые являются третьей причиной ОКИ среди вирусных патогенов, уступая ротавирусам и норовирусам [ВаЫап е! а1., 2013]. Анализ помесячной динамики выявления показал, что НВоУ преимущественно встречались в осеннее-зимние месяцы: в октябре - ноябре и в январе - феврале (рисунок 1).

При анализе возрастного распределения больных с бокавирусной инфекцией за весь исследуемый период были выявлены следующие особенности. Чаще всего бокавирусы выявлялись у детей в возрасте от 6 до 8 месяцев, при этом 87 % (54/62) заболевших были младше одного года и более 96 % заболевших были младше полутора лет. В нашем исследовании не была обнаружена зависимость частоты выявления НВоУ от пола ребенка.

Рисунок 1. Сезонное распределение НВоУ инфекции у детей с ОКИ

2. Генотипнрование изолятов бокавирусов, выявленных в Новосибирске

Для определения генетического разнообразия НВоУ, циркулирующих в Новосибирске, все ПЦР-фрагменты, обнаруженные при детекции НВоУ, были

7

секвенированы. Все секвенированные последовательности были депонированы в базе данных GenBank, номера доступа JX046072 - JX046105 и KJ492895 -KJ492923.

Филогенетический анализ определенных нуклеотидных последовательностей показал, что из описанных к настоящему времени четырех генетических вариантов HBoV в Новосибирске были обнаружены: HBoVl - 24 изолята (38,7 %), HBoV2 - 36 изолятов (56,4%), HBoV3 - один изолят (1,6%) и HBoV4 - два изолята (3,2%) (рисунок 2). Выявленная нуклеотидная последовательность в образце от здорового ребенка принадлежала к HBoV2 (рисунок 2).

Большинство последовательностей фрагмента ОРТ1 изолятов HBoVl, обнаруженных в 2010-2012 гг., были полностью идентичны между собой, а также изолятам, выявленным ранее в Нидерландах (2007), США (2009), Японии (2009) и Тунисе (2010). Только три последовательности фрагментов ОРТ1 изолятов N4932, N5042 и N5274, обнаруженных в октябре и декабре 2012 г., отличались от них на 1-2 н.о. (рисунок 2). Нуклеотидные последовательности фрагмента ОРТ1 изолятов HBoV2 разделились на две клады, соответствующие субгенотипам HBoV2A и HBoV2B (рисунок2). В первой кладе, HBoV2A, находилось 7 последовательностей, четыре из которых (все обнаружены в 2010 г.) были идентичны последовательности изолята GQ281567, выделенного в Корее в 2009 г., а остальные группировались с последовательностями, выделенными в Китае (FJ911565, GU301645), Таиланде (GU048662) и Нигерии (FJ973560) в 2009 г. Во второй кладе, HBoV2B, находилось 29 последовательностей, 24 из которых, включая последовательность, полученную из образца от здорового ребенка, были идентичны соответствующим последовательностям из Тайланда (GU048663) [Chieochansin et al., 2010] и Ирана (JN091I81) а также кластеризовались с изолятами из Великобритании (GU048664, FJ170280) [Chieochansin et al., 2010; Kapoor et al., 2009] и Австралии (EU082213, EU082214) [Arthur et al., 2009].

Нуклеотидная последовательность фрагмента OPT1 HBoV3, обнаруженная в образце ребенка, госпитализированного в июле 2011 г., была полностью идентична соответствующим последовательностям изолятов НВоУЗ, выявленных в различных регионах мира в 2008-2011 гг. (рисунок 2). Две нуклеотидные последовательности фрагментов ОРТ1 HBoV4, обнаруженные нами в августе 2011г., различались на 5 н.о. между собой и отличались от ближайшей последовательности изолята HBoV4-NI-385-07 из Нигерии (FJ973561) на 14 и 9 н.о., а от последовательности таиландского изолята HBoV4-CMH-S011-11 (КС461233) на 26 и 21 н.о. соответственно (рисунок 2).

Таким образом, в Новосибирске за весь исследуемый период были обнаружены изоляты всех четырех генетических вариантов HBoV, описанных к настоящему времени, причем чаще всего выявлялись изоляты HBoV2, хотя встречаемость каждого генетического варианта в различные годы отличалась.

-I—н

• HBoV Rus Nsc10 Ml 391 HBoW CU47 TH/GU048662.1 (?009) llfloV? LZ600 China/FJi115i5.1 (2009) I, HBoV2 1/55602 Chin«/GU301645 (2009) • HBoV RusNscll N3187-F , HBoV2 ST479 Korea/GQ28156/. 1 (?009) )1 • HBoV RusNscIO N1191 r—I • HBoV HusNk 10411223 I Ш HBoV Ru»N»c10-N1018 4 ■ Ш HBoV RuiNk 10 M/f>1

L- HBoV USA/F J973560 (2009) ,Tt— «HBoV RusNscI 2 N4 201

• HBoV RusNscll N1/34

• HBoV RusNscll N1/68

• HBoV RusNscI 1 N1 //1

• HBoV Rus-Nscl1 -N1548

• HBoV RuiJfecl 1 -N1543

• HBoV RusNscI 1 -N1 /36

• HBoV Rus-Nscl 1 N1506

• HBoV Rus-Nscl1 N1 /49

• HBoV RusNsc11 N1/70

• HBoV Rus-Nscl1 N1 /37

• HBoV RusNscll N1/77

• HBoV RusNscll N1588

• HBoV Rus-Nsc11 N1557

• HBoV RusNscll N1539 О HBoV RUSNsc12-e24

• HBoV RusNsc12 N5111

• HBoV Rus~Nsc12-N4333

• HBoV RusNscI 2 N4062

• HBoV RusNscll N2935

• HBoV RUS-NSC 10 N386 " HBoV Rus-Nscl 1 N2609

• HBoV RusNscll N260/

• HBoV RusNscll N2472

• HBoV RusNscI1-N2596 HUoV2 PA5166 lian/JN091181.1 (2011) HBoV2 CU54TH Thailarid/GU048663.1 (2009)

- • HBoV RusNscll RusNscll N1726 HBoV RusNscll Rus Nsc11N1739 - • HBoV Rus Nsc11 Rim Nscl 1 N1703

- • HBoV Rus-Nscl 1 N310/ HBoV? W208 Austialin'f 1И>8??14.1 (2007) HBoV2 W153 Australla't 1ДО82213 (2007) HBoV CU15S7UK Tholland/OU048664 (2009)

83 I HBoV UK-648 USA/FJ170280 (2008) I • HBoV RusNscll N3280 HBoV4 N1 385 USA/FJ973561.2 (2010) ~ HBoV Rus-Hscll N2655 HBoV Hue Nscll N2657

1Ф HBoV RusNscll N2512 HBoV3 W471 Australia/I U918/36.1 HBoV3 57701 China/HQ141339.1 HBoV3

HBoV3 USA/JN086998.1 HBoV3 РД5148 lian/J N091179.1

— • HBoV RusNsc 12 N4932

— • HBoV RusNac12 N5042

— • HBoV Rus Nsc12 N5274 HBoV1 TUN8497 Tunls/JF 327789.1 (2011) HBoVI TUN2922 Tunls/JF327787.1 (2011) HBoV1 TUN89// Г unit/H0585888.1 (2010) HBoVI TUN2207 Tunls/JF327786.1 (2011) HBoVI TUN4134 Tunls/JF327788.1 (2011) V HBoV Rus-Nscl 1 N2497

• HBoV RusNsc11 N2462 » HBoV RusNscllN2473

* HBoV RusNscI 0N1344 » HBoV RusNscIO 1220 » HBoV RusNscI 1N2904 t HBoV RusNsc11 N3102 ft HBoV Rus Nsc11 N3243 ft HBoV RusNsc12 N5013

• HBoV Rus-Nscl 2N5028

• HBoV RusNscI0N1269

• HBoV RusNscIO N1155 ft HBoV RusNsc10N1210 ft HBoV RusNscI 0N1088

• HBoV RusNscIO N1298 ft HBoV RusNscIO N1014 » HBoV Rus-Nscl0 N1266 • HBoV Rus-Nscl0 N1075 ft HBoV RusNscI0N1130 » HBoV RusNscI0N1117

• HBoV Rus-Nscl0N897

HBoVI Bonn 1 NtMheilands/Fje58259.1 (2009) HBoVI Fukustilma/AB480173.1 (2009)

>

[ ioVH

Рисунок 2. Филограмма нуклеотидных последовательностей фрагментовОРИ изолятов бокавирусов, построенная методом максимального правдоподобия, в узлах указаны статистические индексы поддержки. Черными кружками отмечены изоляты бокавирусов, выявленных в Новосибирске у детей с ОКИ, белым кружком отмечен бокавирус, выявленный у здорового ребенка в Новосибирске

Большинство изолятов НВоУ1 были обнаружены в 2010 г. - 54% (13/24), в 2011 г. было выявлено 6 изолятов НВоУ1, в 2012 г. - 5 изолятов (рисунок 1). Анализ помесячной динамики выявления показал, что изоляты НВоУ1 обнаруживались в образцах стула от детей, госпитализированных с ОКИ с июня по декабрь;

встречаемость HBoVl варьировала от 1 образца в сентябре 2011 г. до 5 образцов в октябре и ноябре 2010 г. Статистически значимые отличия были выявлены при сравнении встречаемости HBoVl в 2010 г. и 2011 г., в 2011 г. и 2012 г. (х2=12,04. р=0,05 и х2=4,58, р=0.05 соответственно).

Большинство изолятов HBoV2 были выявлены в 2011 г. - 71,4 % (25/35), в 2010 г. было выявлено лишь 6 изолятов HBoV2, в 2012 г. - еще 4 (рисунок 1). Изоляты HBoV2 выявлялись круглогодично с увеличением частоты встречаемости в зимние месяцы: в январе - феврале. Статистически значимые отличия были обнаружены при сравнении данных встречаемости HBoV2 в 2010 г. и 2011 г., в 2011 г. и 2012 г. (х2=12,04. р=0,05 и у_2=4.58, р=0,05 соответственно). Изолят HBoV2 от здорового ребенка был выявлен в феврале 2012 г.

Анализ зависимости возрастного распределения пациентов от генотипа HBoV показал, что встречаемость HBoVl у детей первого года жизни составила 91,7% (22/24), а встречаемость HBoV2 - 83,8 % (30/35) (рисунок 3). Средний возраст пациентов с HBoVl в образцах составил 8,3 месяца, а с HBoV2 -8 месяцев. Не было статистически значимых отличий во встречаемости HBoVl и HBoV2 у детей первого года жизни - 40,7% (22/54) и 55,6% (30/54), соответственно (х2=2,37, р=0,05). Изоляты HBoV3 и HBoV4 были обнаружены у детей возраста 14 месяцев (HBoV3) и 10 месяцев (оба изолята HBoV4). В коллекции образцов от здоровых детей изолят HBoV был обнаружен у ребенка возраста 2-х месяцев.

Мы сравнили встречаемость HBoVl и HBoV2 в виде моноинфекций и инфекций сочетанной этиологии, статистически значимых отличий обнаружено не было (х2=1,15, р=0,05). Из 35 образцов с HBoV2 в 21 образце (60%) присутствовала только ДНК HBoV2; в 14 образцах (40%) ДНК HBoV2 выявлялась вместе с РНК и/или ДНК других вероятных возбудителей ОКИ, (в основном с РНК HRVA или HNoVGIl), из которых в 3-х образцах ДНК HBoV2 присутствовала совместно с нуклеиновыми кислотами двух и более вирусных и/или бактериальных агентов (таблица 2). Встречаемость HBoVl в виде моноинфекции составила 45,8 %(11/24); в 13 образцах (54,2 %) наряду с ДНК HBoVl присутствовали нуклеиновые кислоты других энтеропатогенных вирусов или бактерий, в основном HRVA или HNoVGIl.

14

ОHBoVl

□ HBOV2

П

0-2 3-5 6-8 9-1112-17 18-23 24-29 30-36 37-48 49-60 Возраст пациентов, месяцы

Рисунок 3. Возрастное распределение (среди положительных образцов на НВоУ) у

детей с ОКИ

3. Секвеннрованне геномов изолятов бокавнрусов, выявленных в Новосибирске

Всего к началу данного исследования в международной базе данных GenBank было зарегистрировано 134 полных нуклеотидных последовательностей геномов HBoV. Из них 117 - это последовательности изолятов HBoVl, 9 - изолятов HBoV2, 7 - изолятов HBoV3 и одна последовательность изолята HBoV4. Мы определили геномные последовательности новосибирских изолятов HBoV, принадлежащих ко всем известным генетическим вариантам, и провели сравнительный анализ этих последовательностей с известными.

В ходе работы были определены полные нуклеотидные последовательности изолята HBoVl RUS-NSC10-N1117 выявленного в Новосибирске в октябре 2010 г., изолятов HBoV2 RUS-NSC10-N386 и RUS-NSC10-N751, выявленных в мае и июле

2010 г., изолята HBoV3 RUS-NSC11-N2512, выявленного в Новосибирске в июле

2011 г., и изолятов HBoV4 RUS-NSC11-N2655 и RUS-NSC11-N2657, выявленных в Новосибирске в августе 2011 г. Нуклеотидные последовательности депонированы в базе данных GenBank под номерами JQ964114, JQ964116, JQ964115, KJ710645, KJ649741 и KJ649742 соответственно.

Для определения нуклеотидной последовательности изолятов HBoV, был разработан набор из 31 оригинального праймера. Кроме того, использовали два ранее описанных праймера: HBoVsf2 и HBoVsr2 [Kapoor et al., 2009].

Шесть определенных и 25 референсных (как наиболее близкие к полученным последовательностям, так и наиболее от них отдаленные) нуклеотидных последовательностей были выровнены в программе Clustal. Созданное выравнивание было вручную верифицировано. Затем был выполнен филогенетический анализ данных методами максимального правдоподобия(рисунок 4).

Из филогенетического дерева (рисунок 4) следует, что нуклеотидная последовательность новосибирского изолята HBoVl кластеризуется с изолятами НК10 (EF450726) и TUN2207 (JF327786), выделенными соответственно в 2005 г. в Гонконге и в 2010 г. в Тунисе. Новосибирские изоляты HBoV2 группируются со штаммами W298 (FJ948860) и W208 (EU082214), выделенными в 2001 г. в Австралии [Arthur et al., 2009]. Филогенетический анализ полногеномной последовательности изолята HBoV3 подтвердил ее принадлежность к HBoV3, однако эта последовательность находится на отдельной ветке. Наиболее близкой к геномной последовательности новосибирских изолятов HBoV4 является геномная последовательность HBoV4-NI-385 (FJ973561), выделенная в 2007 г. в Нигерии.

Анализ попарной изменчивости нуклеотидных последовательностей изолятов HBoV, выявленных в Новосибирске, относительно наиболее гомологичных последовательностей HBoV соответствующих генотипов показал, что наиболее консервативной была геномная последовательность изолята HBoVl RUS-NSC10-N1117, а наименее консервативными - геномные последовательности изолятов HBoV3 и HBoV4, выявленных в Новосибирске (таблица 2). Из всех ОРТ наименьшая

изменчивость была выявлена у ОРТ1, кодирующей неструктурный белок NS1 (таблица 2).

Рисунок 4. Филограмма

полногеномных последовательностей (не включающих нетранслируемые 5'-и 3' - области) изолятов бокавирусов, построенная методом максимального правдоподобия, в узлах указаны

статистические индексы поддержки. Черными кружками отмечены изоляты бокавирусов, выявленных в Новосибирске

ооб '

Таблица 2.

Показатели попарной изменчивости нуклеотидных последовательностей изолятов НВоУ, выявленных в Новосибирске, относительно наиболее гомологичных _последовательностей НВоУ соответствующих генотипов_

Изолят OPT1 ОРТ2 ОРТЗ Вся послед-ть

Сравнение с HBoVl (JF327786)

HBoVl RUS- 0,05 xlO"2 0,75хЮ"2 0,05x10"2 0,17х]0"2

NSC10-N1117 замен/сайт замен/сайт замен/сайт замен/сайт

Сравнение с HBoV2 (EU082214)

HBoV2 RUS- 0,36xl0"2 0,31хЮ"2 0,55x10"2 0,47x10"2

NSC10-N386 замен/сайт замен/сайт замен/сайт замен/сайт

HBoV2 RUS- 0,26x10"2 0,77x10"2 0,60x10"2 0.51 х 10"2

NSC10-N751 замен/сайт замен/сайт замен/сайт замен/сайт

Сравнение с HBoV3 W471 (EU918736)

HBoV3 RUS- 0,52x10"2 0,46x102 9,76x10"2 4,32х10"2

NSC11-N2512 замен/сайт замен/сайт замен/сайт замен/сайт

Сравнение с HBoV4 N1385 (FJ973561)

HBoV3 RUS- 5,94x102

NSC11-N2512 замен/сайт

HBoV4 RUS- 2,03x10"2 2,44x10"2 2,97x10'2 2,68x10"2

NSC11-N2655 замен/сайт замен/сайт замен/сайт замен/сайт

HBoV4 RUS- 2,14х10"2 2,28х10"2 4.31Х10"2 3,46x10"2

NSC11-N2657 замен/сайт замен/сайт замен/сайт замен/сайт

TW141 JPOC07-511

HBoV 1 Rus W»c 10 N1117 TUW207 НКЮ TUW1Î4 НК4

TW7717C6 G6oV1 ~ Bocaparvovirus qorilla

• НММ RUS-NSC11-N26S5 • HBtV-4 RUS-NSC11N2657 HBOV4-M38Ç CMHSOtl 11

Ihbowb

HBoV?B-«3?7 J Щ

H8OV2A-TU-A-1U-06 W298 mot

• HBoV 7 RusWm10-N386 HBoV-г Rms-Nk104<751

4. Анализ рекомбинацнонных событий в геномах HBoV

При построении деревьев на основе аминокислотных последовательностей вирусных белков изучаемых изолятов HBoV были отмечены отличия в топологии деревьев, построенных для разных ОРТ в случае изолятов HBoV2 и HBoV3 (рисунок 5), что можно объяснить их происхождением в результате рекомбинации [Fu et al., 2011; Kapoor et al., 2009; 2010; Cheng et al., 2011; Babkin et al„ 2013].

lu»ius<

IWOV« Ш A 710 П7

-•HSOV 1HWNK11 MJSli ■ MHOV4 N1 Ml BHHoV 1 HUB ИЯС11 ЮШМ ГСЖ seil 11

HUB 1МС1111Ж7

IGOJHBDVSS HI 211 iHBeWeWI 177

O ll'j NPl

О isVp//2

Рисунок 5. Филограммы нуклеотидных последовательностей (А - ОРТ 1, Б - ОРТ2, В - ОРТЗ) изолятов бокавирусов, построенные методом максимального правдоподобия, в

узлах указаны статистические индексы поддержки. Черными кружками отмечены изоляты бокавирусов выявленных в Новосибирске

Так, хотя филогенетический анализ полногеномной последовательности подтвердил принадлежность новосибирского изолята ЯШ-ЫвС! 1-Ы2512 к НВоУЗ (рисунок 5). при филогенетическом анализе отдельных ОРТ наблюдалась сложная картина. На деревьях, построенных на основе ОРТ1 и ОРТ2, этот изолят показывал значительное сходство с шестью близкородственными штаммами генотипа НВоУЗ, в то время как при анализе ОРТЗ он с высокой достоверностью кластеризовался с изолятами НВоУ4 (рисунок 5). Для ОРТ1 уровень идентичности изолята Яи8-Ы8С 11 -N2512 с изолятом Ти-А-210-07 НВоУЗ составил 99,5%, с остальными пятью изолятами кластера - 99,3 %-99,4 %. Для ОРТ2 значения идентичности составили 99,6% между изучаемым новосибирским изолятом и ТО-А-210-07, и 99,5 % в случае остальных пяти изолятов. Уровень идентичности ОРТЗ между изолятами НВоУЗ ЯШ-ШСП-N2512 и ТО-А-210-07 НВоУЗ составил всего 89,9%, а наибольшее сходство изучаемого изолята наблюдалось с изолятом НВоУ-4 СМ! 1-8011-11 -96,4 %. Этот факт свидетельствует о рекомбинанационном происхождении изолята НВоУЗ ЯШ^а 1-Ш512.

Для исследования рекомбинационных событий в геномах новосибирских изолятов был проведен анализ их геномных последовательностей в пакете программ КОР. при использовании различных методов - 1ШР, ОспсСопу, ВоЛвсап, 818сап и др. Анализ не выявил значимых рекомбинационных событий в геномах новосибирских изолятов НВоУ4. Отдельные методы показывали возможность рекомбинации в этих изолятах, но надежность этих событий была невысока и не поддерживалась анализом, проведенным другими методами.

Проведенный анализ точек рекомбинации в геноме изолята НВоУЗ 1-Ш8-№С11-Ы2512 в пакете программ ЯОР при использовании метода Воо(8сап с высокой надежностью выявил существование сайта рекомбинации в районе 3270 н.о. в геноме этого изолята. Этот район имеет координаты 3250-3290 н.о. при отсечении 70 % и расположен в начале гена, кодирующего белок УР1. Проведенное исследование выявило еще один небольшой район 4150-4260 н.о. в центральной части гена, кодирующего белок УР1, имеющий значимое сходство с геномом НВоУЗ (рисунок 6).

\ ?

i! i! t

VP,

1236 2473

Пожцня в выравннваннн

HBoV3 RUS-WSC11-N2512 scanned against

-HBOV4CMH-S011-11

----HBoV3TU-A-210-07

--HBOV1LWK

Bootstrap cutoff of -70%

Рисунок

6. Воо^сап анализ генома изолята ЯШ-ШО NN2512 с референсными изолятами НВоУ генотипов 1, 2 и 3. Серые стрелки показывают ОРТ НВоУ

S. Оценка скорости молекулярной эволюции HBoV

Для дальнейшего анализа кроме полных геномных последовательностей шести изолятов HBoV, выделенных в Новосибирске, также использовали полные геномные последовательности девяти штаммов HBoV разных генотипов с известными данными о времени их изоляции. В анализ не вошли последовательности штаммов, точное время изоляции которых не известно. Кроме того, из анализа были исключены последовательности изолятов HBoV2 и HBoV3, поскольку при формировании этих генотипов важную роль играли рекомбинационные процессы. Таким образом, эволюционную историю бокавирусов реконструировали на основе последовательностей HBoVl, HBoV4 и GBoVl.

Вначале полные геномные последовательности этих бокавирусов были проверены на наличие сайтов рекомбинации в пакете программ RDP3, при этом вероятность потенциальных рекомбинационных событий оказалась низкой. Средние значения отношения несинонимичных замен к синонимичным (dN/dS, со) составили 0.14 в случае ОРТ1, 0.33 - для ОРТ2 и 0.13 - для ОРТЗ. Анализ выявил, что все гены находятся под действием консервативной селекции, так как во всех случаях со < 1. Более того, методы SLAC и PARRIS, использованные для обнаружения посайтового селективного давления, не выявили позитивной селекции (р< 0.1). Полученные результаты свидетельствуют о возможности проведения эволюционного анализа на основе данных последовательностей.

Реконструкция молекулярной эволюции осуществлялась с использованием программы Beast на основе известных дат изоляции штаммов бокавирусов. В качестве начальной была использована скорость эволюции данных вирусов 8.6х 10-1 замен на сайт в год (95 % HPD: 3.5-15.0x10^), ранее установленная в работе Zehender и др. [Zehender et al., 2010] на основе фрагмента ОРТЗ. На первом этапе была оценена приемлемость гипотезы строгих молекулярных часов для проводимого эволюционного анализа бокавирусов с помощью теста отношения правдоподобия [Huelsenbeck and Rannala, 1997]. На его основе был сделан вывод о необходимости использования релаксированных лог-нормальных часов для датирования молекулярной эволюции бокавирусов. Поэтому для анализа была использована HKY+Г модель эволюции, предварительно выбранная в программе Modeltest 3.7. Известно, что эта модель наиболее четко описывает изменчивость в кодирующих последовательностях геномов [Shapiro et al., 2006].

При анализе хронограммы, основанной на полногеномных нуклеотидных последовательностях бокавирусов (рисунок 7), можно заключить, что HBoV4 отделился от HBoVl около 200 лет назад, a GBoVl, изолированный от гориллы, содержащейся в неволе в США, дивергировал от HBoVl позднее. К сожалению, надежность положения ветви GBoVl весьма низка (апостериорная вероятность около 60 %) в отличие от остальных узлов, для которых значения апостериорной вероятности более 95 %. При анализе скоростей эволюции можно отметить, что для разных ветвей она варьирует в пределах одного порядка величины и составляет от 1.6х 1до 1.6* Ю-3 замен на сайт в год. Эти величины соответствуют скоростям

15

-G8oV1 LWK HK7 Чг—TW2715

i-"

гФь-HK

—HK4

rL-TOMI 34 ■HK10 J-JPOC

I'lWUI

6

r HBoV-1_RU8_NSC J(Ri1117 ■-TUN2207 -7W2717 — HBOV4-NI-385

14 2l№ I5ii l«l 50 о \earcigu

Рисунок 7. Хронограмма, построенная на основе нуклеотидных последовательностей полных геномов различных генотипов HBoV (обозначения штаммов приведены в таблице 4).

Времена дивергенции оценены с использованием программы Beast. Значения времен дивергенции в годах приведены в узлах дерева

накопления мутаций, ранее полученным в работе Zehender и др. [Zehender et al., 2010].

В работе [Sharpetal., 2010] авторы выявили бокавирусы в образцах фекалий диких горилл и шимпанзе из Камеруна в 2009 году. Были получены данные о нуклеотидной структуре "бокавирус-подобных" вирусов: четырех фрагментов ОРТ1 (два от горилл - GG-GB2155, GG-CP1426 и два от шимпанзе - PT-BQ2392, РТ-LM1861) и трех фрагментов ОРТЗ (для тех же изолятов, за исключением изолята GG-GB2155). Эти последовательности также были использованы в эволюционном исследовании HBoV. С учетом этих последовательностей, последовательностей всех генотипов HBoV и бокавируса гориллы GBoVl [Kapoor et al., 2010b] были построены выравнивания для изучаемых фрагментов ОРТ1 и ОРТЗ. Отсутствие достоверных сайтов рекомбинации в изучаемых геномных фрагментах позволили провести реконструкцию эволюционной истории бокавирусов. Для этого были построены хронограммы с использованием описанных выше подходов. Были использованы релаксированные лог-нормальные молекулярные часы и установлено, что средняя скорость эволюции для обоих деревьев составила около 9><10"4 замен на сайт в год.

Интересно, что все последовательности изолятов бокавируса гориллы из США и из Камеруна показывают высокую гомологию между собой и образуют общую кладу с HBoVl на обоих деревьях. В то же время изоляты бокавируса шимпанзе значительно отличаются друг от друга. Таким образом, анализируя времена дивергенции предков современных генотипов бокавирусов приматов, можно отметить, что времена дивергенции HBoVl и HBoV4, а также изолятов бокавируса горилл и HBoVl от общих предков хорошо согласуются между собой на обеих полученных хронограммах.

6. Исследование особенностей репликации HBoV

Ранее при изучении особенностей репликации HBoV были обнаружены структуры интермедиатов типа «голова к хвосту» у HBoVl, HBoV2, и НВоУЗ, porcine bocaviruses и canine bocavirus, при этом структуры типа «голова к голове» или «хвост к хвосту» у этих вирусов обнаружены не были, что могло свидетельствовать о механизме репликации бокавирусов, отличающимся от других парвовирусов [Cheung et al., 2010; Kapoor et al., 2011; Liisebrink et al., 2011; Zhao et al., 2012; Huang et al„ 2012]. Для изучения возможных механизмов репликации бокавирусов, включая HBoV4, репликационные интермедиа™ которого не исследовались, мы попытались получить репликативные интермедиаты HBoV4 и других HBoV.

Для секвенирования концевых районов новосибирских изолятов HBoV4 и обнаружения возможных конкатомерных и эписомальных форм геномов вирусов мы использовали набор праймеров, рассчитанный на основе последовательностей новосибирских изолятов HBoV4 (таблица 3) и консервативный для всех генотипов HBoV. Прямые праймеры были рассчитаны на основе З'-конца HBoV4, а обратные -5'-концевой последовательности генома. Цифры в названии праймера соответствуют шагам гнездового ПЦР.

Таблица 3.

Праймеры | Последовательности (5'-3')

Первый раунд гнездовой ПЦР

F1 + GGGTGACTGTAATCCCGAGCTCAT

F1- ACGAATATTCAAGGAGAGGTTACCTGTT

R1+ AGTCTGACGAGATGCGGAAGTGC

R1- GGTCTCTACAAGTGAGCGGCCTCT

Второйраунд гнездовой ПЦР

F2+ GTGTTGCCGTCTCGAACCTAGC

F2- TCCGATGTCAGGCTACCGTCAC

R2+ TACGTCACTTCCTGGGCGTGTT

R2- ATATATCCGATATACGAGTTACGACTAACC

«+» - прямой праймер; «-» - обратный праймер; «Р» - последовательность праймера, соответствующая ориентации «голова»;

«Л» - последовательность праймера, соответствующая ориентации «хвост»

Праймеры были проверены во всех возможных сочетаниях «голова»/«хвост» методом гнездовой ПЦР с использованием в качестве матрицы ДНК изолятов НВоУ4 1-Ы2655 и РШЗ-^С 11 -N2657. В результате было показано, что ПЦР-продукт нарабатывается только при использовании праймеров Р+/Я+ («голова»/«хвост») на матрице 1Ш8^8С1 NN2657, что соответствует кольцевой последовательности отрицательной полярности в ориентации «голова к хвосту» (рисунок 8). Все минорные фрагменты, полученные в ходе ПЦР, также были секвенированы. Обнаружено, что они образуются вследствие ошибочного праймирования и не содержат концевых последовательностей генома НВоУ.

Дополнительно аналогично были проанализированы новосибирские изоляты других генотипов НВоУ - 11 ВоVI (ЯШ-ШСЮ-Ш117), НВоУЗ(Яи8-Ы8С11-Ы2512) и

два изолята НВоУ2 (1Ш8-№С10-Ю86 и Ш8-^С10-Ы751)с использованием вышеописанных праймеров (таблица 3). ПЦР-фрагменты, соотетствующие формам

Рисунок 8. Пример продуктов гнездовой ПЦРсо всеми возможными комбинациями пар праймерами. Стрелка указывает на фрагмент, который содержал последовательность НВоУ4 «голова к хвосту»

вирусного генома в ориентации «голова к голове» или «хвост к хвосту»для всех проанализированных изолятов выявлены не были. При использовании в ПЦР ДНК изолята НВоУ2 Ки8-Ы8С10-Ю86 и праймеров Р+/Я+(«голова»/«хвост») были обнаружены структуры, соответствующие форме с ориентацией «голова-к-хвосту» (данные не приводятся).

На следующем этапе ампликон, полученный на ДНК матрице изолята НВоУ4 1Ш8-М8С11 -N2657 и содержащий последовательность «голова к хвосту» (рисунок 8), был клонирован в рвЕМ-Т вектор. Клонирование полученных ампликонов, содержащих концевые нетранслируемые участки генома изолятов НВоУ2 1Ш8_ШС_10-№86 и НВоУ4 1Ш8_К8С_11-Ш657 с последующим секвенированием ПЦР-фрагментов из индивидуальных клонов позволило установить нуклеотидные последовательности полных геномов этих изолятов, включая концевые шпилечные структуры. При этом выявилась гетерогенность терминальных последовательностей НВоУ2 и НВоУ4, что, возможно, является следствием сложной вторичной структуры этого района вирусного генома. Гетерогенность терминальных последовательностей также была обнаружена ранее при секвенировании концевых районов генома СпВоУЗ был открыт в работе [У е1 а1., 2013].

Важную роль в репликации НВоУ играют концевые шпилечные структуры некодирующих районов, поэтому были проанализированы их вторичные структуры. Ранее были предсказаны вторичные структуры концевых некодирующих районов

HBoV2 и HBoV3 и проведено их сравнение [Zhao et al., 2012; Kapoor et al., 2011]. Аналогичным способом мы провели предсказание вторичных структур всех генотипов HBoV, включая новосибирские изоляты HBoV2 RUSNSC10-N386 и HBoV4RUS-NSCl 1-N2657 (рисунок 9).

При сравнениии выведенных вторичных структур можно заключить, что, несмотря на значительные отличия в нуклеотидных последовательностях, наблюдается сходство их вторичных структур. Во всех случаях присутствуют 3' концевой стебель с петлей, шпилька-1, имеющая «структуру кроличьих ушей», и 5' концевой кластер стеблей и петель. Можно отметить, что в большинстве случаев образуются протяженные шпильки, характеризующиеся высокими значениями свободной энергии, особенно для новосибирских изолятов HBoV4, HBoV2 и штамма HBoVl Salvador. Возможно, эти шпильки стабилизируют вторичную структуру концевых участков генома HBoV.

S'-trrminal rluMrr

Рисунок 9.

Предсказанные структуры концевых некодирующих районов HBoVl Salvador (А), HBoV4 RUS-NSC11 -N2657 клон 10 (В) и HBoV2 RUS-NSC 10-

N386 клон 25 (С). Стрелка указывает на расположение области,

содержащей гены, кодирующие NS, NP, и VP

■в«Ч

ч/б.

Вместе с тем, отсутствие структур, присущих механизму репликации по принципу катящейся шпильки, обнаруживаемых у других парвовирусов, и выявление ковалентно замкнутых кольцевых структур генома негативной полярности для всех генотипов НВоУ ставит вопрос о небходимости более детального изучения репликации бокавирусов. Кроме того, отсутствие достоверных отличий во встречаемости НВоУ у больных и здоровых детей в Новосибирске, подтверждаемое результатами исследований и в других регионах мира, обнаружение быстрой, трудно объяснимой смены генетических вариантов циркулирующих НВоУ и ряд других вопросов делает необходимым проведение дальнейших исследований молекулярно-генетических особенностей этого относительно недавно открытого вируса.

ВЫВОДЫ

1. Впервые проведено комплексное исследование молекулярно-эпидемиологических особенностей бокавирусной инфекции у детей раннего возраста, госпитализированных с диагнозом ОКИ в 2010-2012 гг. в Новосибирске и показано, что

• бокавирусы человека, выявленные в среднем в 1,2 % (62/5264) клинических образцов от больных детей, не являются высоко значимой этиологической причиной этих заболеваний;

• выраженной сезонной зависимости бокавирусной инфекции в исследуемый период не обнаружено;

• чаще всего бокавирусы выявлялись у детей в возрасте от 6 до 8 месяцев, 87 % детей с бокавирусной инфекцией были младше одного года и более 96 % заболевших бокавирусами были младше полутора лет;

• бокавирусы выявлялись в виде моноинфекций приблизительно в половине случаев (54,8 %), при инфекциях смешанной этиологии чаще всего они встречались в сочетании с ротавирусами группы А и норовирусами II геногруппы.

2. Исследование молекулярно-генетического разнообразия изолятов бокавирусов человека, выявленных в 2010-2012 гг. продемонстрировало, что

• в Новосибирске доминировали изоляты бокавируса второго генотипа (НВоУ2, 56,4 %), при этом встречаемость НВоУ2В составила 80 % от общего количества НВоУ2;

• изоляты бокавируса первого генотипа (НВоУ1) встречались в 38,7% случаев, изоляты НВоУЗ и НВоУ4 обнаруживались в единичных образцах (1 -НВоУЗ, 2 -НВоУ4);

• с течением времени происходило изменение спектра генетических вариантов НВоУ.

3. Определены нуклеотидные последовательности геномов шести изолятов НВоУ (1 изолят НВоУ1, 2 - НВоУ2, 1 - НВоУЗ и 2 изолята НВоУ4), выявленных в Новосибирске, и показано, что геномные последовательности изолятов НВоУ1,

НВоУ2 и НВоУ4 кластеризовались с таковыми изолятов из различных географических областей, относящихся к соответствующиму генотипу. Новосибирский изолят НВоУЗ возник в результате рекомбинации между генотипами НВоУЗ и НВоУ4; сайт рекомбинации (в позиции 3270 н. о.), совпадающий с «горячей» точкой рекомбинации бокавирусов, расположен между районами с аномально низким и аномально высоким ОС-составом генома.

4. Установлено, что скорость изменчивости генома НВоУ составляет около 9У10~* замен на сайт в год. Показано, что дивергенция генотипов НВоУ от общего предшественника произошла несколько сотен лет назад, а современные изоляты НВоУ дивергировапи внутри генотипов в течение последних 50 лет.

5. Впервые установлено, что репликативные интермедиаты НВоУ4 имеют структуру «голова к хвосту», что свидетельствует о использовании этим вирусом механизма репликации по принципу «катящегося кольца»; впервые обнаружен полиморфизм нуклеотидных последовательностей концевых районов у НВоУ.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Babkin I.V., Tyumentsev A.I., Tikunov A.Y., Kurilshikov A.M, Ryabchikova E.I., Zhirakovskaya E.V., Netesov S.V., Tikunova N.V. Evolutionary time-scale of primate bocaviruses // Infect. Genet. Evol. - 2013. - V. 14. - P. 265-274.

2. Tyumentsev А.1., Tikunova N.V., Tikunov A.Y., Babkin I.V. Recombination in the evolution of human bocavirus // Infect. Genet.Evol. -2014 - V. 28. -P. 11-14.

3. Babkin I.V., Tyumentsev А.1., Tikunov A.Y., Zhirakovskaia E.V., Netesov S.V., Tikunova N.V. A study of the human bocavirus replicative genome structures // Virus Res. -2015.-V. 195.-P. 196-202.

4. Тюменцев A.M., Бабкин И.В., Тикунов А.Ю., Нетесов С.В., Тикунова Н.В. Молекулярно-эпидемиологическое исследование бокавирусной инфекции у детей раннего возраста в Новосибирске, 2010- 2012 гг. секвенирование полных геномов бокавирусов 1-4 генотипов // Сборник «Диагностика и профилактика инфекционных болезней»-2013.-С. 102-104.

5. Тюменцев А.И., Тикунов А.Ю., Курильщиков A.M., Жираковская Е.В., Нетесов С.В., Тикунова Н.В. Молекулярная диагностика и генотипирование бокавирусов человека у детей раннего возраста с острой кишечной инфекцией в Новосибирске в 2010-2012 гг. //Сборник «Молекулярная диагностика 2014» -2014. - Т. 1. -С. 394-395.

Подписано в печать 12.08.2015 Формат 60x84 1\ 16 Усл. печ. л. 1,5 Объем 24 стр. Тираж 100 экз. Заказ № 169 Отпечатано Омега Принт 630090, г. Новосибирск, пр. Ак.Лаврентьева,6 email: omegap@yandex.ru

2015672885

2015672885