Новая форма препарата "Споробактерин жидкий" и изучение ее эффективности при лечении дисбактериозов кишечника

Никитенко, Мария Вячеславовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Новая форма препарата "Споробактерин жидкий" и изучение ее эффективности при лечении дисбактериозов кишечника
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Новая форма препарата "Споробактерин жидкий" и изучение ее эффективности при лечении дисбактериозов кишечника"

На правах рукописи.

Никитенко Мария Вячеславовна

НОВАЯ ФОРМА ПРЕПАРАТА «СПОРОБАКТЕРИН ЖИДКИЙ» И ИЗУЧЕНИЕ ЕЁ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ДИСБАКТЕРИОЗОВ КИШЕЧНИКА.

03.00.07 - «Микробиология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Оренбург-2004

Работа выполнена в Оренбургской государственной медицинской академии.

Научный руководитель:

Заслуженный деятель науки РФ, академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор О.В. Бухарин

Официальные оппоненты:

1. Доктор биологических наук О. Л. Карташова.

2. Кандидат медицинских наук Н. В. Шеенков.

Ведущая организация: Государственное Учреждение Научно-

исследователь-ский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Защита диссертации состоится 22 апреля 2004 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 208.066.03 при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6, зал заседаний диссертационного совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Оренбургской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан « /I » ига^^д^ 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор медицинских наук, профессор Н.В. Немцева.

ОБШДЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность темы.

Исследования современной биологической и медицинской науки в области взаимоотношений макро- и микроорганизмов позволили внедрить в практику биопрепараты - пробиотики. Основу этих препаратов составляют живые микробные культуры. Пробиотики широко стали использоваться в медицине и ветеринарии для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта, нарушений обмена, после антибактериальной, лучевой, гормональной и химиотерапии в пред- и послеоперационном периодах и т.д. (Н.М. Грачева с соавт., 1994; ЛАЛитяева с соавт., 1994; П.И. Жданов, 1997; О.В. Бухарин, 1999; S.C.Kyriakis, V.K. Tsiloyiannis,1999 и др.).

В последние годы в медицинской практике различных стран применяются пробиотики на основе рода Bacillus (H.M. Грачева с соавт., 1999; И.Б.Сорокулова с соавт., 2002; Н.И. Урсова, 2002; M.R. Spinosa, T. Braccini, 2000). Так, в странах Западной Европы широкое распространение получили несколько препарат "бактисубтил" (фирма «Marion Merrell», Франция) и его аналог "флонивин" (фирма «Галеника», Югославия). В основе препарата -штамм В. cereus IP 5832 из коллекции Института Пастера (Париж). Известен также пробиотик "цереобиоген" («Xing Jian», Китай), действующее начало которого - штамм В. cereus DM-423. Основой препарата "энтерогермин" (фирма «Sanofi Withrop», Италия) является культура B.subtilis. Пробиотик "биоспорин" (Украина, Россия) содержит два штамма бактерий рода Bacillus. В.И. Никитенко с соавт. (1986) был создан препарат "споробактерин сухой", выпускаемый в ампулах. Он с 1992 года рекомендован МЗ РФ для использования в клинической практике для терапии дисбактериозов, кишечных инфекций, профилактики и лечения хирургической инфекции. Данная форма препарата неудобна для больных. При вскрытии ампулы часто в препарат попадает стекло, тяжело разводить препарат перед употреблением водой, трудно его дозировать. Разведенный препарат должен быть сразу использован и не может храниться, и при назначении его маленьким детям значительная часть просто выбрасывается. Лиофильное высушивание снижает лечебно-профилактическую активность препарата и значительно

удорожает производство. Вышеизложенные, причинам обусловили выполнение настоящей работы по созданию жидкой формы препарата споробактерина.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования является разработка новой формы живого бактериального препарата "споробактерин жидкий" и определение ее эффективности при лечении дисбактериозов кишечника.

Для реализации этой цели были решены следующие задачи:

1.Изучена выживаемость бактерий штамма Bacillus subtilis 534 при консервации растворами натрия хлорида, глюкозы, мочевины, лактозы различных концентраций.

2. Изучена возможность контаминации препарата микроорганизмами различных видов.

3. Исследованы стабильность и биологические свойства препарата "Споробактерин жидкий" в процессе хранения при комнатной температуре, при температуре от 0 до +10 °С.

4. Изучены стабильность и биологические свойства препарата "споробактерин жидкий" после хранения в замороженном состоянии

5. Исследована эффективность препарата "споробактерин жидкий" при лечении дисбактериозов кишечника.

Научная новизна.

Впервые создана новая форма лекарственного препарата "споробактерин жидкий", что подтверждается патентом Российской Федерации на изобретение № 2217154 (приоритет от 12.09.2001 г). До настоящего времени лекарственного средства, позволяющего сохранять живые бактерии в жидкости два года и более, в мировой практике не было известно.

температуре в течение года и более, а при температуре до +10 °С - не менее двух лет.

Препарат "споробактерин жидкий'" сохраняет свою стабильность после неоднократного замораживания, герметичность упаковки флаконов при этом не нарушается. Это облегчает транспортировку данного биологического препарата.

Гипертонический раствор натрия хлорида и взвесь бактерий штамма Bacillus subtilis 534, составляющие основу "споробактерина жидкого", обладают бактерицидным действием по отношению к микроорганизмам различных видов, чем способствуют уменьшению вероятности возникновения контаминации готового препарата в процессах изготовления и хранения.

Разработаны методы контроля препарата «споробактерина жидкого» и технология его производства.

"Споробактерин жидкий" оказывает выраженный лечебной эффект при дисбактериозах кишечника у взрослых и детей.

Научно-практическое значение.

Новая форма препарата "споробактерин жидкий" прошла государственные испытания. После них данное лекарственное средство рекомендовано для лечения дисбактериозов после перенесенных бактериальных инфекций или применения антибиотиков; острых бактериальных кишечных инфекций, в том числе острой дизентерии, сальмонеллезов; хирургической инфекции мягких тканей и остеомиелита; профилактики и лечения осложнений, вызываемых патогенными и условно-патогенными микроорганизмами при хирургических и акушерско-гинекологических операциях.

Материалы работы использованы при разработке Фармокопейной статьи предприятия ФСП 42-0216-0735-01 и Экспериментально-производственного регламента на "споробактерин жидкий". Организовано промышленное производство препарата. Лицензия Министерства здравоохранения Российской Федерации № 42/218/2002 от 11 апреля 2002

года выдана ООО "Бакорен" из города Оренбурга. В настоящее время "споробактерин жидкий" распространяется по лечебным учреждениям и через аптечную сеть на территории Российской Федерации.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Разработанная новая форма лекарственного препарата "споробактерин жидкий" во флаконах, представляющая собой взвесь биомассы живых бацилл Bacillus subtilis 534 в 7% растворе натрия хлорида, стабильна, устойчива к контаминации посторонними микроорганизмами, может храниться при температуре до +10 °С не менее двух лет, переносит неоднократные замораживания без потери лечебных свойств.

2. Использование препарата "споробактерин жидкий" у взрослых и детей с дисбактериозами способствует нормализации качественного и количественного состава микрофлоры кишечника и дает возможность купировать диспепсические явления.

Апробация работы и публикации.

Основные результаты исследований представлены и обсуждены на заседании проблемной комиссии по микробиологии Оренбургской государственной медицинской академии в 2004 году. Материалы диссертации доложены на Ш научно-практической конференции врачей. Приволжско-Уральского военного округа (Оренбург, 2002) и на 5-ом Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург -Гастро-2003».

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных научных работ и' получен патент Российской Федерации на изобретение № 2217154 «Препарат споробактерин жидкий» (2003 г.).

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав, выводов и указателя литературы, включающего 251 источник, в том числе работы 164 отечественных и 87 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 2 цветными фотографиями и 9 таблицами

Исследования проводились в Оренбургской государственной медицинской академии (ректор - доктор медицинских наук, профессор С. А. Павловичев) и лаборатории ООО "Бакорен" (директор - В. Г. Никифоров). Работа выполнена в рамках темы открытого плана НИР ОГМА «Разработка новой формы препарата «споробактерин жидкий» и определение его эффективности при лечении дисбактериозов кишечника» (№ гос. регистрации - 01.200.2 02735).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

Работа выполнялась в период с 1997 по 2003 годы в Оренбургской государственной медицинской академии (ОГМА) и лаборатории отдела бактериологического контроля ООО «Бакорен» (г. Оренбург).

В начале нами определялся оптимальный состав жидкой среды для сохранения живых бактерий Bacillus subtilis 534 в течение года или более. Были приготовлены водные растворы глюкозы с концентрациями 5%, 10%, 20%, 40%, мочевины - 5%, 15%, 30%, лактозы - 5%, 10%, 20%, 40%, натрия хлорида- 0,5%, 0,9%, 2%, 5%, 7%, 10%, 15%, 20%, 25% Они стерилизовались в стеклянных флаконах с ватно-марлевыми пробками при (128±1)°С в течение (3 0 ± 5) мин.

Бактерии штамма Bacillus subtilis 534 в течение 24 часов выращивались при температуре (37± 1,0) °С на пробирках со скошенным мясопептонным агаром. Микроорганизмы смывались приготовленными растворами По оптическому стандарту мутности (20 ЕД), созданному в ГИСК им. Л А Тарасевича, готовились взвеси с содержанием бактерий (2,0±1,0) миллиардов живых клеток в одном см3 С соблюдением асептики взвеси по 5 см3 разливались в стерильные стеклянные флаконы емкостью 10 см3. Флаконы закрывались стерильными резиновыми пробками и завальцовывались алюминиевыми колпачками Образцы препарата хранили в картонных коробках при комнатной температуре которая колебалась в диапазоне от 18 до 25 °С

Выживаемость определяли методом серийных разведений через сутки, десять суток, месяц путем подсчета количества жизнеспособных бактерий штамма Bacillus subtilis 534. В эти сроки исследовалось по 6 флаконов (всего 480 штук) с опытными образцами, содержащими различные концентрации избранных химических веществ.

Во второй серии опытов мы изучали устойчивость жидкой формы «споробактерина жидкого» к контаминации посторонними микроорганизмами в зависимости от содержания в растворе натрия хлорида. Во флаконы с 2 см3 растворов натрия хлорида концентраций 0,9%, 2%, 5 %, 7%, 10%, 15%, 20%, 25%, содержащих (2,0±1,0) миллиардов живых клеток сенной палочки штамма 534 в одном см3, вносили по 20 млн. живых микроорганизмов, которые потенциально могли загрязнять споробактерин и вызвать диспепсические, токсические и иные осложнения. Дозу контаминации 10 млн. на 1 см3 мы выбрали исходя из практических соображений, так как при бытовом загрязнении маловероятно попадание в готовый препарат таких относительно больших количеств посторонних бактерий, а меньшее их число, естественно, менее опасно. В качестве тест-штаммов нами использованы грамположительные и грамотрицательные палочки, кокки, дрожжевые грибки (всего 17 штаммов). Штаммы микроорганизмов были получены из коллекций ГИСК им. Л. А. Тарасевича, Оренбургской государственной медицинской академии и Оренбургского государственного аграрного университета. Осуществлялась контаминация пяти флаконов с препаратом каждой из исследуемых концентраций натрия хлорида. Тест-штаммы вносились в образцы каждый по отдельности.

Флаконы закрывали стерильными резиновыми пробками и хранили при комнатной температуре в картонных коробках. Через 20 минут. 1 час, 2 часа, 4 часа, одни и двое суток при помощи стерильных пипеток из пяти образцов мы брали по 0,1 см3 и проводили высевы на чашки Петри с диагностическими средами, распределяя жидкость равномерно по поверхности при помощи стеклянных шпателей. При определении наличия контаминации мы использовали метод серийных разведений, последовательно разводя выемку из препарата стерильным раствором натрия хлорида. Высевы выполняли

из разведений от 10"2 до 10"7. Однако у бактерий сенной палочки есть интересная особенность. На наиболее часто используемых твердых питательных средах бактерии сенной палочки практически не продуцируют антибактериальные вещества. В связи с этим на чашках Петри легко выявляются посторонние колонии даже при высевах цельного препарата споробактерина и сплошном росте сенной палочки.Диагностические среды готовились по методикам, описанным в справочнике по микробиологическим' и вирусологическим методам исследований под редакцией М.О.Биргера (1982).

Нами было проведено изучение стабильности новой формы препарата "споробактерин жидкий". На предприятии "Бакорен" в г. Оренбурге в январе - марте 1998 года изготовлено десять экспериментально-производственных серий. Количество флаконов в каждой серии - 320 - 490 штук. В каждый флакон было расфасовано по (5,0 + 0,2) см3 препарата. В одном см3 "споробактерина жидкого" содержалось миллиардов

жизнеспособных клеток штамма Bacillus subtilis № 534. Готовый препарат (по 150 флаконов каждой серии) хранился в закрытых коробках из гофрированного картона при комнатной температуре, которая в условиях города Оренбурга варьировала от +18 до + 35 °С. Еще по 150 флаконов каждой из десяти серий было помещено в картонных коробках в холодильники, где температура колебалась от 0 до + 10 °С. Сразу после изготовления, через 6, 12, 24 и 36 (только при хранении в холодильниках) месяцев флаконы отбирались для исследований из расчета по три образца каждой серии по каждому параметру. Согласно проектов Временной фармакопейной статьи на препарат «споробактерин жидкий» (ФСП 42-0216-0735-01) и экспериментально-производственного регламента, которые в последующем без принципиальных изменений были зарегистрированы Министерством здравоохранения Российской Федерации (Р № 000792/01-2001), проводился контроль. Определялись внешний вид препарата, вкус, запах, состояние упаковки, (рН), число бактерий в см2, безвредность, наличие контаминации посторонней микрофлорой, антагонистическую активность по отношению к тест-штаммам:

Staphylococcus aureus "Никифоров", Staphylococcus aureus "Филиппов", E.coli 157, Proteus mirabilis, биологические свойства производственного штамма (внешний вид колоний, окраска по Граму, образование спор, подвижность, рост в аэробных условиях, продукция каталазы, ферментация глюкозы). Изучение чувствительности штамма к антибиотикам бензилпенициллину, тетрациклину и полимиксину проводилось с помощью дисков (М. О. Биргер, 1982).

Полученные данные сравнивались с результатами контроля препарата "споробактерина сухого" (серия № 17, шесть ампул по каждому параметру), изготовленного в НПО "Иммунопрепарат" в г. Уфе.

На следующем этапе нами определены температуры замерзания препарата и его свойства после трехкратного замораживания и размораживания. Эти параметры было необходимо выявить с целью определения условий транспортировки и хранения. Шестьдесят флаконов трех серий (№3, № 5 и № 8) при температуре (-20±2) °С в картонных коробках хранили в течение месяца. На 24 часа флаконы были оставлены в помещении с комнатной температурой В последующие дни было проведено еще два цикла замораживания, хранения в течение 30 суток и оттаивания при комнатной температуре.

После создания жидкой формы споробактерина, успешного завершения государственных клинических испытаний нами проведено изучение эффективности данного лекарственного препарата при лечении дисбактериозов.4 Наблюдался 41 больной: 16 мальчиков и мужчин, 25 девочек и женщин. Из них в возрасте от одного года до трех лет было 9, от трех до десяти лет - 6, от десяти до пятнадцати лет - 5, от семнадцати до тридцати лет -4, от тридцати до пятидесяти лет - 11, от пятидесяти до семидесяти лет - 5, свыше семидесяти лет - 1 человек.

В своей работе мы использовали классификацию дисбактериозов Н.М. Грачевой с соавт. (1986). Для лечения дисбактериозов «споробактерин жидкий» назначался через рот взрослым и детям старше трех лет по одному см3 2 раза в сутки, 12 детям в возрасте от одного года до трех лет - по 0,5 см два раза в сутки за 15- 30 минут до еды Больные по их усмотрению

принимали препарат цельным или разбавляли его кипяченой водой. Курс лечения варьировал от 15 до 20 дней. Пациентам рекомендовалось соблюдение диеты, при аллергодерматозах на кожу наносился детский крем.

Оценка клинической эффективности и переносимости препарата осуществлялась путем систематических клинических осмотров. Регистрировались наличие болей в животе, метеоризма, частота стула, его вид, наличие гнилостного запаха, слизи непереваренных остатков пищи в кале, состояние кожных покровов, осложнения и нежелательные побочные реакции при приеме «споробактерина жидкого».

Микрофлору кишечника у больных с дисбактериозами кишечника исследовали в лицензированных бактериологических лабораториях г. Оренбурга: городской инфекционной больницы и Центра по лечению дисбактериозов.

Статистическая обработка полученных результатов исследования проводились на. ПЭВМ IBM PC - Pentium-3 с помощью программного комплекса. Windows, Word и Excel. Использовался метод вариационной статистики с определением достоверности с помощью критерия Стьюдента, а при количестве наблюдений менее 20 - непараметрический метод Вилкоксона для независимых совокупностей. В ряде случаев для оценки статистической значимости различий использован критерий знаков (А. М. Мерков, Л. Е. Поляков, 1974). Для характеристики вариационного ряда использовались средняя величина (М), ошибка средней величины (m), достоверность (р) и число исследований (n).

Результаты исследований.

На первом этапе необходимо было подобрать состав жидкой среды, на которой бактерии сенной палочки могли сохранять жизнеспособность, не погибая в большом количестве и не размножаясь. При этом желательно, чтобы среда была как можно проще по составу, не содержала дефицитных и дорогостоящих компонентов, была стабильной, легко стерилизовалась. Были проведены опыты с водными растворами глюкозы (5% - 40%), мочевины (5% - 30%), лактозы (5% - 40%), натрия хлорида (0,5% - 25%). В

них вносились бактерии штамма Bacillus subtil is 534 из расчета (2,0 + 1,0) миллиардов живых клеток в одном см3. Образцы препарата в герметично закрытых стеклянных флаконах хранили в картонных коробках при комнатной температуре, которая колебалась в диапазоне от 18 до 25 °С.

После месяца наблюдений установлено, что в растворах натрия хлорида во всем диапазоне концентраций бактерии сенной палочки сохраняют жизнеспособность, а их количество менялось мало. В то же время в растворах глюкозы, лактозы и мочевины регистрировалось статистически достоверное уменьшение числа жизнеспособных бактерий. Полученные обнадеживающие результаты о возможности использования водных растворов натрия хлорида в качестве консерванта для создания жидкой формы лекарственного препарата споробактерина позволили отказаться от дальнейших планов по созданию более сложных, многокомпонентных композиций.

На втором этапе работы нам предстояло выбрать ту концентрацию раствора натрия хлорида, которую можно было рекомендовать использовать при промышленном производстве. Было решено проверить устойчивость различных композиций препарата к искусственному загрязнению посторонними микроорганизмами.

Во флаконы с 2 см3 растворов натрия хлорида концентраций 0,9% -25%, содержащих (2,0±1,0) миллиардов живых клеток сенной палочки штамма 534 в одном см3, вносили по 20 млн. живых микроорганизмов, которые потенциально могли контаминировать споробактерин и вызвать диспепсические, токсические и иные осложнения. Дозу контаминации 10 млн. на 1 см3 мы выбрали исходя из практических соображений, так как. при бытовом загрязнении маловероятно попадание в готовый препарат таких относительно больших количеств посторонних бактерий, а меньшее их число, естественно, менее опасно.

Изученные штаммы Staphylococcus aureus "Никифоров", Staphx lococcus aureus "Филиппов", Staphylococcus aureus 209p, Staphylococcus epedermidis 817, Staphylococcus saprophyticus 23, Escherichia coli 157, Eschenchia coli Olll, Proteus mirabilis 24a, Proteus vulgaris 2091, Shigella flexneri 337, Shigella sonnei 177, Pseudomonas aeruginosa 244, Pseudomonas

facilis 17, Salmonella typhimurium 9640, Salmonella typhimurium 178, Klebsiella ozaenae 2305, Candida albicans погибали в препарате в сроки от 20 минут до 48 часов. Сочетание раствора натрия хлорида и антибактериальных веществ, продуцируемых сенной палочкой, препятствует контаминации, препарата посторонними микроорганизмами. Из исследованных штаммов в препарате относительно долго сохраняли жизнеспособность эпидермальный и сапрофитирующий стафилококки, кишечная палочка, псевдомонады. По-видимому, бактерии данных видов наиболее опасны в качестве потенциальных контаминирующих агентов. В то же время, возможность загрязнения препарата золотистым стафилококком, протеем, сальмонеллами, дизентерийной палочкой, дрожжевым грибком значительно менее вероятна.

При увеличении концентрации натрия хлорида в растворе посторонние микроорганизмы погибают в жидкой форме споробактерина несколько быстрее. Однако возрастает и поступление в организм больного натрия хлорида, что не всегда является полезным. По нашему мнению, наиболее оптимальным для жидкого консерванта является содержание натрия хлорида равное семи процентам. Это та минимальная концентрация, которая обеспечивает сохранение жизнеспособности производственного штамма сенной палочки 534 и с большой долей вероятности исключает возможность контаминации препарата посторонними микроорганизмами.

В доступной нам литературе мы не встретили работ, использующий подобный метод изучения возможной контаминации живого бактериального препарата. Производственникам известно как легко могут загрязняться посторонними микроорганизмами другие пробиотики, что, по-видимому, связано с низкой концентрацией в них и слабой активностью антибактериальных веществ. Клиническая эффективность «споробактерина жидкого» значительно шире и сравнима с современными антибиотиками. Так, С. Г. Кудашев (2000) в экспериментах показал, что при огнестрельных ранениях конечностей у кроликов хирургическая инфекция «споробактерином жидким» подавляется более активно, чем антибиотиком цефалоспоринового ряда - цефамизином.

Для готового лекарственного препарата очень желательны длительные сроки хранения. Необходимо было установить их продолжительность для жидкой формы споробактерина при различных температурных режимах. На предприятии ООО "Бакорен" в г. Оренбурге в январе - марте 1998 года изготовлено десять экспериментально-производственных серий. В одном см3 7% растворе натрия хлорида содержалось (2,0 + 1,0) Миллиардов жизнеспособных клеток штамма Bacillus subtilis № 534. Часть флаконов с 5 см3 препарата в картонных коробках хранилась при комнатной температуре, которая колебалась от +18 до + 35 °С. Другие такие же флаконы в картонных коробках были помещены в холодильник, где температура варьировала в пределах от 0 до + 10 °С.

Контроль всех серий «споробактерина жидкого» проводился сразу после изготовления, через 6,12, 24 и 36 месяцев. Определялись внешний вид препарата, герметичность флаконов, состояние упаковки, маркировки, вкус, запах, объем, рН, число бактерий в см3, наличие контаминации посторонними бактериями и грибами, безвредность, антагонистическая активность к St aureus «Никифоров», St. aureus «Филиппов», Рг. mirabilis 24a, E. coli 157. Выявлялись возможность роста в аэробных условиях, подвижность бактерий, окраска по Граму, образование спор, внешний вид колоний, продукция каталазы и ферментация глюкозы, чувствительность к антибиотикам бензилпенициллину, тетрациклину и полимиксину. Полученные данные сравнивались с результатами контроля препарата "споробактерина сухого", изготовленного в НПО "Иммунопрепарат" в г. Уфе.

Проведенные исследования показали, что препарат «споробактерин жидкий» без потери активности и органолептических свойств может длительное время (не менее трех лет) храниться при температуре от 0 до + 10 °С. В пределах заданных параметров сохранялись количество жизнеспособных бактерий (не менее 1 млрд. в CM3), ИХ высокая антагонистическая активность к тестируемым штаммам, биологические свойства бактерий Bacillus subtilis 534, герметичность упаковки, что позволяло избежать контаминации посторонними микрорганизмами По ряду показателей (содержание жизнеспособных бактерий, антагонизм к тест-штаммам) «споробактерин

жидкий» даже после трех лет хранения не только не уступал, но во многом превосходил препарат «споробактерин сухой», изготовленный на НПО «Иммунопрепарат» в г. Уфе.

После двух лет хранения «споробактерина жидкого» во флаконах при комнатной температуре его свойства существенно не менялись. Однако при температуре близкой к. 30 °С в процессе хранения в отдельных образцах образовывались плотные пленки. В мазках при окраске определялись группы грамотрицательных палочек, которые после пересева на мясопептонный бульон или агар становились грамположителъными.

Хотя лечебно-профилактические свойства препарата при этом оставались стабильными, возможное изменение внешнего вида препарата могло насторожить потенциальных потребителей. Это не позволяет рекомендовать его длительное хранение при комнатной температуре, но в то же время дает возможность при транспортировке на протяжении нескольких месяцев не применять «холодовую цепочку». Строгое соблюдение холодового режима в пределах от 0 до 8 °С является, как правило, необходимым условием перевозки и хранения большинства пробиотиков, содержащих живые бактерии. Естественно, последнее увеличивает затраты и, в результате, стоимость препаратов в конечных пунктах реализации.

Нами определен еще один очень важный для транспортировки показатель. Исследованиями установлено, что «споробактерин жидкий» расфасованный во флаконы по 5 см3 замерзает при температуре (-20±2) °С в течение (6±2) часов. Упаковка при этом не повреждается. Более того, даже трехкратные замораживание, хранение в течение месяца в замороженном состоянии и размораживание существенно не меняет органолептические и биологические свойства препарата. Это значительно расширяет возможности транспортировки, хранения и уменьшает затраты.

Таким образом, можно сделать заключение, что 7% раствор натрия хлорида является одним из наиболее удачных консервантов, позволяющих в широком диапазоне температур сохранять жизнеспособность и ценные биологические свойства штамма Bacillus subtilis 534. 7% раствор натрия хлорида дешев, технологичен. Он легко готовится и хорошо стерилизуется. "Споробактерин жидкий, содержащий от

одного до пяти млрд. жизнеспособных бактерий штамма Bacillus subtilis 534 в одном см3 7% натрия хлорида, устойчив к загрязнению посторонними бактериями и грибками. Оптимальным является хранение "споробактерина жидкого" в холодильнике при температуре до + 10 °С, где он остается годным к применению не менее трех лет.

В настоящее время все более широкое распространение получают пробиотики-биодобавки в виде йогуртов, кефиров, других молочных продуктов, бальзамов, настоек и пр. (Т. И. Корнилова с соавт., 2002; И. С. Хамагаева с соавт., 2002; М. Е. Sanders, J. Huis in"t Veld, 1999; E. J. Schiffrin, S. Blum, 2001 и др.). Количество живых бактерий в них постоянно меняется как в процессе производства, так и при хранении. Сроки хранения этих биодобавок - не больше месяца. Содержание живых бактерий в них значительно ниже, чем указано на упаковке, и намного меньше доз микроорганизмов, эффективно используемых для лечения различных заболеваний (J. M. Hamilton-Miller and other, 1999).

В Российской Федерации до разработки «споробактерина жидкого» в качестве лекарства был зарегистрирован только один пробиотик в жидкой форме -"биофлор" (Н. И. Урсова, 2002). Его состав достаточно сложен. Наряду с живыми бактериями кишечной палочки штамма М-17 "биофлор" содержит аутолизат кишечной палочки, экстракты мяты, свеклы, петрушки, укропа, чеснока, сои, прополис, макро-, микроэлементы и др. По-видимому, такой набор субстратов в составе «биофлора» необходим в растворе для поддержания жизнеспособности кишечной палочки. При этом срок его хранения - один год. Жидких форм лекарственных препаратов, содержащих сенную палочку, пригодных для использования в медицине, пока предложено не было. Новизна проведенной работы подтверждена патентом Российской Федерации на изобретение № 2217154 «Препарат споробактерин жидкий» (приоритет от 12.09.2001 г.). Следует отметить, что до настоящего времени в мировой медицинской и ветеринарной практике не было известно о существовании жидких форм лекарственных препаратов - пробиотиков с такими сроками годности, условиями хранения и транспортировки Это было обусловлено тем, что создание жидкой среды для сохранения стабильного количества живых клеток бактерий в течение длительного срока (года и более)

является непростой задачей. Для жизнедеятельности микроорганизмов нужны питательные вещества. При их отсутствии бактерии, как правило, в течение относительно короткого промежутка времени гибнут. В то же время при наличии питательных веществ и повышении температуры на несколько градусов выше комнатной живые микроорганизмы начинают интенсивно размножаться.

Материалы этих исследований предприятием ООО «Бакорен», находящемся в городе Оренбурге, использованы для создания временной фармакопейной статьи, опытно-производственного регламента, отчетов об изучении «споробактерина жидкого». После государственных испытаний предприятию 11 апреля 2002 года выдана лицензия № 42/218/2002 на производство данного лекарственного средства. Это позволило провести собственные клинические наблюдения: по изучению эффективности «споробактерина жидкого» при лечении дисбактериозов кишечника.

Нами наблюдался 41 больной, 29 из них ранее практически безуспешно лечилось другими пробиотиками (бифидумбактерином, колибактерином, бификолом, лактобактерином, бактисубтилом или фловинилом). Однократный 15 - 20-дневный курс лечения «споробактерином жидким» приводил к регрессии патологической симптоматики со стороны желудочно-кишечного тракта. Отмечено статистически достоверное исчезновение или уменьшение болей в животе, явлений диареи, метеоризма, нормализовывались цвет и консистенция кала, исчезали не переваренные остатки пиши в нем.

Изучение состава микрофлоры толстого кишечника подтверждает высокую лечебную эффективность новой формы данного лекарственного препарата. Согласно классификации Н.М.Грачевой с соавт. (1986) до приема споробактерина дисбактериоз I степени был у 5 (12,2%), II степени - у 18 (43,9%), III степени -у 13 (31,7%), IV степени - у 5 больных. После завершения курса лечения полное выздоровление наступило у 13 (31,7%), дисбактериоз I степени выявлен у 16 (39,0%), II степени - у 7 (17,1%) и III степени - у 5 (12,2%) пациентов Только у одного больного не было положительной динамики.

Таблица 1.

Характеристика микробного биоценоза толстого кишечника при лечении дисбактериозов «споробактерином жидким».

Бактерии родов Время исследования Число лиц (%), в кишечнике которых обнаружены бактерии в разведении:

10-Ю2 10J-104 105-107 108 ю'-ю10

1 2 3 4 5 6 7

Echerichia (лактозопозит ивные) До лечения. 2 (4,9%) 11(26,8%) 16(39,1%) 11(26,8%) 1 (2,4%)

После 0 2 (4,9%) 15(36,6%) 24(58,5%) 0

Echerichia (лактозонегат ивные) До лечения 7(17,1%) 18(43,9%) 14(34,2%) 1 (2,4%) 1 (2,4%)

После 3 (7,3%) 21(51,2%) 17(41,5%) 0 0

Echerichia (гемолитические) До лечения 2 (4,9%) 5(12,2%) 6(14,6%) 1 (2,4%) 0

После 2 (4,9%) 2 (4,9%) 0 0 0

Lactobacil-lus До лечения 3 (7,3%) 12(29,3%) 24(58,5%) 1 (2,4%) 1 (2,4%)

После 0 4 (9,8%) 25(61,0%) 12(29,2%) 0

Bifidobacterium До лечения 1 (2,4%) 4 (9,8%) 31(75,6%) 3 (7,3%) 2 (4,9%)

После 0 0 12(29,3%) 20(48,7%) 9(22,0%)

Staphilococcu s aureus До лечения 11(26,8%) 7(17,1%) 5(12,2%) 2 (4,9%) 0

После 7(17,1%) 0 0 0 0

Proteus До лечения 5(12,2%) 10(24,4%) 7(17,1%) 0 0

После 6(14,6%) 2 (4,9%) 0 0 0

Клебсиелла До лечения 4 (9,8%) 7(17,1%) 5(12,2%) 1 (2,4%) 0

После 5(12,2%) 3 (7,3%) 1 (2,4%) 0 0

Псевдомонады До лечения 2 (4,9%) 5(12,2%) 1 (2,4%) 0 0

После 2 (4,9%) 0 0 0 0

Грибы Candida До лечения 6(14,6%) 18(36,6%) 9(14,6%) 0 0

После 5(12,2%) 5(12,2%) 0 0 ' 0

До лечения дисбиотические изменения затрагивали как аэробный, так и анаэробный компонент кишечного биоценоза. Наиболее часто выявилось значительное уменьшение количества основных бактериальных симбионтов облигатной флоры - бифидобактерий. Нормальное количество бифидобактерий (108109) выявлено лишь у 5 (12,2%) из 41 наблюдаемых больных (табл. 1). В анализах кала регистрировались дефицит лактозопозитивнных ишерихий (менее чем 107 - в 61,0%), лактобацилл (менее чем 107 - в 51,2%). В то же время у одного ребенка число кишечной палочки было увеличено до 1010 в одном грамме.

На фоне количественного дисбаланса микрофлоры кишечника выявились и значительные изменения ее качественного состава. У 14 (34,1%) пациентов выявлены эшерихии с гемолитической активностью с довольно высоким удельным содержанием вплоть до 10* в грамме. У 16 (39,0%) больных были обнаружены лактозонегативные и эшерихии со слабовыраженными ферментативными свойствами в количестве 105 и более колониеобразующих единиц (КОЕ), часто было отмечено увеличение числа кишечных палочек со слабовыраженными ферментативными свойствами.

В связи с дефицитом облигатной микрофлоры отмечалось увеличение числа условно-патогенных микроорганизмов. Наиболее часто обнаруживались Staphylococcus aureus (18 больных), в том числе в разведениях 105-108 у 7 человек. Патологическая колонизация толстого кишечника протеем до начала лечения отмечена у 17, клебсиеллами - у 12, псевдомонадами - у 6 пациентов. У 9 больных грибки рода Candida были выше, чем 104 КОЕ в г. Количественный дефицит наиболее важных представителей нормального биоценоза кишечника приводит к увеличению количества ассоциаций условно-патогенных микроорганизмов. Наиболее часто выявлялись ассоциации Enterobacter + Klebsiella. + Candida, Staphylococcus aureus + Ps. aeruginosae + Streptococcus faecalis.

Согласно бактериологическим данным полное излечение дисбактериоза в результате использования препарата «споробактерина жидкого» достигнуто у 13 пациентов. Выраженные изменения в лучшую сторону состава микрофлоры толстого кишечника отмечены у 27 больных ( р < 0 , 0 1 ) .

Количество бифидобактерий восстановилось до 108 КОЕ в г у 29 больных (70,7%), еще у 12 оно повысилось (р < 0,001). Содержание лактозопозитивных ишерихий нормализовалось у 31 пациента (р < 0,01). Статистически достоверно по сравнению с исходными данными уменьшился процент лактозонегативных кишечных палочек (р < 0,05). Гемолитические кишечные палочки в разведении 103 - 104 выделены только у 2, а в разведении 10 - 102 еще у 2 больных, тогда как до начала лечения они в значительно больших количествах были найдены у 14 пациентов (р < 0,01).

Под влиянием бактериотерапии при помощи «споробактерина жидкого» отмечено значительное снижение частоты выделения условно-патогенной микрофлоры (р < 0,001). Золотистый стафилококк в небольшом количестве (разведения 10 — 102) выделен только у 7 человек. Также высокоэффективным препарат был при протейных, клебсиеллезных и кандидозных формах дисбактериоза. Несколько более устойчивыми оказались псевдомонады, хотя по анализам кала также прослеживается положительная динамика.

Только у одного больного после лечения «споробактерином жидким» показатели количественного и качественного состава микрофлоры толстого кишечника существенно не улучшились.

Интересно, что в опытах in vitro штамм Bacillus subtilis 534 подавляет рост бифидобактерий, кишечной палочки, лактобактерий и др У больных, напротив, количество бифидобактерий увеличивалось (р< 0,001), а содержание лактозопозитивные ишерихий нормализовалось: повышалось при их изначальном уменьшении и снижалось, если до лечения количество кишечной палочки было высоким (р<0, 0 1). Статистически достоверно уменьшался процент лактозонегативных кишечных палочек и

гемолитических кишечных палочек (р < 0,05) Под влиянием бактериотерапии при помощи «споробактерина жидкого» отмечено значительное снижение частоты выделения условно-патогенной микрофлоры: золотистого стафилококка протея, клебсиелл, дрожжевых грибков (р<0,001) Несколько более устойчивыми к действию препарата оказались псевдомонады, хотя по анализам кала также прослеживалась положительная динамика По-видимому,

«споробактерин жидкий» в тонком кишечнике подавляет рост условно-патогенных бактерий и за счет действия протеолитических ферментов способствует улучшению переваривания «пищи. Последняя, поступая в толстый кишечник, является той хорошей питательной средой, на которой быстро растут представители нормальной микрофлоры.

Наши данные во многом совпадают с результатами лечения дисбактериозов у больных с различной соматической патологией, полученными Н. М. Грачевой с соавт. (1994), И. Г. Осиповой с соавт. (1996), А. А. Фазыловой с соавт. (1996) В. К. Есиповым (1999), В. С. Тарасенко (2000), А. А. Третьяковым с соавт. (2001), М. В. Фоминой (2003), Эти авторы в большинстве случаев использовали "споробактерин сухой", изготовленный в г. Уфе.

"Споробактерин жидкий" хорошо переносился и практически не давал нежелательных побочных реакций как у взрослых, так и у детей. В процессе терапии у одного ребенка было легкое обострение детской экземы, которое купировано десенсибилизирующими средствами без отмены споробактерина. Напротив, покраснение, шелушение, трещины кожи и зуд исчезли у 5 и уменьшились у 9 из 15 пациентов((р < 0,01). У больной с бронхиальной астмой в первые несколько суток увеличилось количество мокроты, а затем дыхание улучшилось. Число приступов сократилось примерно в шесть раз. Подобное антиаллергическое действие "споробактерина сухого" отмечала ранее Л. Н. Мазанкова с соавт. (1996), наблюдая 54 детей в возрасте от 1 месяца до 2 лет с аллергодерматозами.

Штамм Bacillus subtilis 534 через 2-4 недели после завершения лечения не был обнаружен ни одного больного. По нашим данным эти бактерии полностью выводятся из организма в течение одних - трех суток. В настоящее время в Российской Федерации разрешены и широко используются препараты, изготовленные на основе бактерий рода Bacillus. Это, прежде всего «бактисубтил» и «биоспорин». В отличие от первого споробактерин менее токсичен и продуцирует антибиотик значительно более широкого спектра действия. «Биоспорин» - это комплексный препарат, для усиления антагонистическом активности он содержит два штамма различных видов

бактерий рода Bacillus. Считаем, что "споробактерин жидкий" может найти достаточно большую сферу применения. По-видимому, в ряде ситуаций «споробактерин жидкий» при лечении дисбактериозов и других патологических состояний может полноценно заменять антибиотики и другие мощные антибактериальные препараты. Больным можно не назначать лекарственные препараты, содержащие протеолитические ферменты (фестал, панкреатин и др.).

Лекарственный препарат «споробактерин жидкий» относительно недорог. Во флаконах он более удобен для больных, персонала по сравнению с сухим препаратом в ампулах. Срок хранения в течение двух лет является достаточно большим и удобным как для лечебных учреждений, так и для аптечной сети.

Выводы.

1. Водные растворы натрия хлорида концентраций 0,9 - 25% достаточно надежно обеспечивают сохранение числа жизнеспособных бактерий штамма Bacillus subtilis 534 и его биологических свойств. Это позволило создать новую форму лекарственного препарата «споробактерин жидкий».

2. Сочетание 7% раствора натрия хлорида и взвеси сенной палочки штамма 534 обладает бактерицидным эффектом, в связи с чем «споробактерин жидкий» устойчив к контаминации посторонними микроорганизмами. Увеличение содержания натрия хлорида более 7% нецелесообразно, так как деконтаминирующий эффект жидкой формы препарата усиливается незначительно, а излишнее поступление данной соли в организм больного далеко не всегда полезно.

3. Лекарственный препарат «споробактерин жидкий» в стеклянных флаконах, закрытых резиновой пробкой и завальцованных алюминиевыми колпачками может храниться при температуре до +10 °С не менее двух лет.

4. «Споробактерин жидкий» в стеклянных флаконах без потери биологической активности может в течение года храниться при комнатной температуре, переносит неоднократные замораживания и размораживания, что облегчает его транспортировку.

5. Препарат «споробактерин жидкий» обладает выраженным лечебным эффектом при дисбактериозах как у взрослых больных, так и у детей. Он способствует быстрому купированию патологической симптоматики со стороны желудочно-кишечного тракта, восстановлению качественного и количественного состава нормальной микрофлоры толстого кишечника, при этом подавляя рост условно патогенных бактерий и грибков.

6. Лекарственный препарат «споробактерин жидкий» хорошо переносится • больными и практически не дает нежелательных побочных реакций. Это дает

возможность его использовать для лечения дисбактериозов и у больных с пищевой аллергией, аллергодерматозами.

7. Разработаны стандарт качества лекарственного средства (фармакопейная статья предприятия ФСП 42 02 160 735 - 01) и экспериментально-производственный

- - регламент № 1171-01 на «споробактерин жидкий».

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Захаров В.В., Никитенко М.В. О значении дисбактериоза кишечника в возникновении хирургической инфекции. //В кн.: Тезисы докладов к предстоящей 52-й итоговой конференции студенческого научного общества им. Ф. М. Лазаренко. Оренбург, 1997, с. 44.

2. - Батареева Г.Н., Никитенко М.В. Результаты изучения новой формы

препарата споробактерина «Споробактерин сухой во флаконах». //В кн.: Молодые ученые - здравоохранению. Тез. докл. XII итоговой конференции. Оренбург, 1997, с. 64 -67.

3. Карянов В.П., Никитенко Л.И, Никитенко М.В. Опыт применения споробактерина в лечении больных экземой //Вестник последипломного медицинского образования. Специальный выпуск. Материалы 3-го симпозиума «Новое в дерматовенерологии, андрологии, гинекологии: наука и практика». М., 1998, с. 47.

4 Никитенко В.И . Бородин А.А., Никитенко М.В. Некоторые новые данные о механизме действия спорообразующих пробиотиков //В кн Актуальные вопросы военной и практической медицины. Сб тезисов научн.-прак. конф врачей военного округа Оренбург, 2000, с 79 - 80

5. Никитенко В.И., Полякова B.C., Никитенко М.В. и др. Препарат споробактерин. Новые данные о механизме действия этого и других живых бактериальных препаратов. //Ж. Научный вестник Тюменской медицинской академии, 2001, № 2, с. 70 - 72.

6. Никитенко В.И., Симоненко Е.В., Захаров В.В., Бородин А.В., Никитенко М.В. Применение споробактерина для профилактики и лечения гнойных осложнений открытых переломов и ранений конечностей. //В кн.: Материалы научной конф. "Актуальные проблемы травматологии и ортопедии", проводимой» в рамках международного форума "Человек и травма". Ч. 1. Нижний Новгород, 2001, с. 181 - 183.

7. Кудашев С.Г., Никитенко М.В., Бородин В.Ф. и др. Новый способ профилактики хирургической инфекции огнестрельных ран. //Ж Анналы травматологии и ортопедии. Самара, 2001, № 2, с. 38 - 41.

8. Никитенко М.В., Карянов В.П. Применение споробактерина в лечении больных экземой. //В кн.: Новые лекарственные препараты в практике дерматовенеролога. М., 2001, с. 89 - 90.

9. Никитенко В.И., Копылов В.А., Никитенко М.В. Препарат "Споробактерин", новые данные о механизме действия этого и других живых бактериальных препаратов. //В кн.: Пробиотические микроорганизмы. - современное состояние вопроса и перспективы использования. Международная научн.-практ. конференция памяти Г. И. Гончаровой. Сб. материалов конференции. М., 2002, с. 51 - 52.

10. Никитенко М.В., Копылов В.А. Разработка и испытание новой формы препарата споробактерина - споробактерина жидкого. //В кн.: Актуальные вопросы военной и практической медицины. Сб. трудов III научн.-прак. конф. врачей Приволжско-Уральского военного округа. Оренбург, 2002, с. 211-213.

11. Никитенко В. И., Стадников А.А., Кудашев С.Г., Никитенко М.В. и др. Некоторые новые данные о патогенезе, профилактике и лечении хирургической инфекции. //В кн.: Инфекция в хирургии - проблема современной медицины. Сб. тезисов III Всеармейской конференции с международным участием. Москва, 2002. с 49.

12. Никитенко В.И., Стадников А.А., Никитенко М.В., Копылов ВА Новые данные о механизме действия пробиотиков. //Ж Гастроэнтерология Санкт-Петербурга, 2003, № 2-3,115 -116.

Изобретения по теме диссертации.

1. Никитенко М.В., Никитенко В.И. Препарат споробактерин жидкий. Патент РФ № 2217154,27.11.2003 г. (приоритет от 12.09.2001 г.). 10с.

Никитенко Мария Вячеславовна

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Издательство общий отдел ОрГМА Лицензия 021239 от 22.08.97 г. Подписано в печать 10.03.2004 г. Заказ № 1669 Формат бумаги А-4. Тираж 100 экз. тел.77-24-59

«» - 53 54

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Никитенко, Мария Вячеславовна

Введение.

Глава 1. Современные пробнотнки в лечебной практике (обзор литературы).

Глава 2. Материалы и методы исследования.

Глава 3. Жидкий консервант для бактерий сенной палочки.

Глава 4. Результаты изучения стабильности и биологических свойств препарата "споробактерин жидкий" в процессе хранения.

Глава 5. Материалы изучения эффективности "споробактерина жидкого" при лечении дисбактериозов кишечника

Глава 6. Обсуждение результатов исследования.

Выводы.

Указатель литературы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новая форма препарата "Споробактерин жидкий" и изучение ее эффективности при лечении дисбактериозов кишечника"

Исследования современной биологической и медицинской науки в области взаимоотношений макро- и микроорганизмов позволили внедрить в практику биопрепараты - пробиотики. Основу этих препаратов составляют живые микробные культуры. Пробиотики широко стали использоваться в медицине и ветеринарии, для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта, нарушений обмена, после антибактериальной, лучевой, гормональной и химиотерапии в пред- и послеоперационном периодах и т.д. (Н.М. Грачева с соавт., 1994; Л.А.Литяева с соавт., 1994; П.И. Жданов, 1997; О.В. Бухарин, 1999; S.C.Kyriakis, V.K. Tsiloyiannis,1999 и др.).

В последние годы в медицинской практике различных стран применяются пробиотики на основе рода Bacillus (Н.М. Грачева с соавт., 1999; И.Б.Сорокулова с соавт., 2002; Н.И. Урсова, 2002; M.R. Spinosa, Т. Braccini, 2000). Так, в странах Западной Европы широкое распространение получили пробиотики "бактисубтил" (фирма «Marion Merrell», Франция) и его аналог "флонивин" (фирма «Галеника», Югославия). В основе препарата - штамм В. cereus IP 5832 из коллекции Института Пастера (Париж). Известен также пробиотик "цереобиоген" («Xing Jian», Китай), действующее начало которого - штамм В. cereus DM-423. Основой препарата "энтерогермин" (фирма «Sanofi Withrop», Италия) является культура B.subtilis. Пробиотик "биоспорин" (Украина, Россия) содержит два штамма бактерий рода Bacillus - В. subtilis 3 и В. licheniformis 3.

В.И. Никитенко с соавт. (1986) был создан препарат "споробактерин сухой" (лиофилизат в ампулах), содержащий штамм В. subtilis 534. Он с 1992 года рекомендован МЗ РФ для использования в клинической практике для терапии дисбактериозов, кишечных инфекций, профилактики и лечения хирургической инфекции. Препарат выпускал ГУП

Иммунопрепарат», находящееся в г. Уфе, однако с 1995 года предприятие прекратило его выпуск. Следует отметить, что «споробактерин сухой» хорошо зарекомендовал себя в медицинской практике, но лекарственная форма - лиофилизат в ампулах имеет ряд недостатков. Известно, что процесс лиофилизации негативно влияет на жизнеспособность бацилл, а высокая остаточная влажность также отражается на стабильности препарата.

Кроме того, данная форма препарата неудобна для больных. При вскрытии ампулы часто в препарат попадает стекло, тяжело разводить препарат перед употреблением водой, трудно его дозировать. Разведенный препарат должен быть сразу использован и не может храниться, и при назначении его маленьким детям значительная часть просто выбрасывается. Лиофильное высушивание снижает лечебнопрофилактическую активность препарата и значительно удорожает производство. Вышеизложенные причины обусловили выполнение настоящей работы по созданию жидкой формы препарата споробактерина.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования является разработка новой лекарственной формы пробиотика "споробактерин жидкий" и определение ее бактериологической эффективности при лечении дисбактериозов кишечника.

Для реализации этой цели были решены следующие задачи:

1. Создание новой лекарственной формы пробиотика «споробактерин жидкий».

2. Изучено влияние консервантов-стабилизаторов на специфическую активность штамма Bacillus subtilis 534.

3. Изучена возможность контаминации препарата микроорганизмами различных видов.

4. Исследованы стабильность и биологические свойства препарата "споробактерин жидкий" в процессе хранения при различных температурах.

5. Исследована эффективность препарата "споробактерин жидкий" при лечении дисбактериозов кишечника.

Научная новизна.

Впервые создана новая форма лекарственного препарата "споробактерин жидкий", что подтверждается патентом Российской Федерации на изобретение № 2217154 (приоритет от 12.09.2001 г.). До настоящего времени лекарственного средства, позволяющего сохранять живые бактерии в жидкости два года и более, в мировой практике не было известно.

Установлено, что 7% раствор натрия хлорида обеспечивает сохранение жизнеспособности бактерий сенной палочки и их биологических лечебных свойств в процессе хранения при комнатной температуре в течение года и более, а при температуре до +10 °С — не менее двух лет.

Препарат "споробактерин жидкий" сохраняет свою стабильность после неоднократного замораживания, герметичность упаковки флаконов при этом не нарушается. Это облегчает транспортировку данного биологического препарата.

Разработаны методы контроля препарата «споробактерина жидкого» и технология его производства.

Споробактерин жидкий" оказывает выраженный лечебной эффект при дисбактериозах кишечника у взрослых и детей.

Научно-практическое значение.

Материалы работы, использованы при разработке Фармокопейной статьи предприятия ФСП 42-0216-0735-01 и Экспериментально-производственного регламента на "споробактерин жидкий". Организовано промышленное производство препарата. Лицензия Министерства здравоохранения Российской Федерации № 42/218/2002 от 11 апреля 2002 года выдана ООО "Бакорен" из города Оренбурга. В настоящее время "споробактерин жидкий" распространяется по лечебным учреждениям и через аптечную сеть на территории Российской Федерации.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

Апробация работы и публикации.

Основные результаты исследований представлены и обсуждены на заседании проблемной комиссии по микробиологии Оренбургской государственной медицинской академии в 2004 году. Материалы диссертации доложены на III научно-практической конференции врачей Приволжско-Уральского военного округа (Оренбург, 2002) и на 5-ом Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро-2003».

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных научных работ и получен патент Российской Федерации на изобретение № 2217154 «Препарат споробактерин жидкий» (2003 г.).

Объем и структура диссертации.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Никитенко, Мария Вячеславовна

ВЫВОДЫ.

1. Водные растворы натрия хлорида в диапазоне концентраций от 0,9% до 25% при оптимуме 7,0% поддерживают жизнеспособность бактерий штамма Bacillus subtilis 534 с сохранением его биологических свойств, что позволило создать новую форму лекарственного препарата «споробактерин жидкий».

2. Установлен бактерицидный эффект действия микробной суспензии В. subtilis 534 в 7% растворе натрия хлорида, способствующий подавлению контаминирующей микрофлоры.

3. Показано, что «споробактерин жидкий» в стеклянных флаконах, закрытых резиновой пробкой и завальцованных алюминиевыми колпачками, без потери биологической активности может храниться при температуре до +10 °С не менее двух лет, тогда как при комнатной температуре сроки хранения сокращаются до одного года. Препарат легко переносит неоднократные замораживания и размораживания, что облегчает условия его хранения и транспортировку.

4. Препарат «споробактерин жидкий» у больных детей и взрослых способствует восстановлению качественного и количественного состава нормальной микрофлоры толстого кишечника, подавляя рост условно-патогенных бактерий и грибков, купируя патологическую симптоматику со стороны желудочно-кишечного тракта.

5. Клинические испытания показали, что препарат «споробактерин жидкий» хорошо переносится больными и практически не дает нежелательных побочных реакций, что позволяет его использовать при лечении дисбактериозов у больных с пищевой аллергией и аллергодерматозами.

6. Полученные экспериментальные материалы использованы при разработке стандарта качества лекарственного средства (фармакопейная статья предприятия ФСП 42 02 160 735 - 01) и экспериментально-производственного регламента № 1171-01 на «споробактерин жидкий».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Никитенко, Мария Вячеславовна, Оренбург

1. Акимкин В. Г. Дисбактериоз кишечника как фактор риска заболевания нозокомиальным сальмонеллезом. //Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. М. 1997, № 3. С. 105-106.

2. Алмагамбетов К. X., Бондаренко В. Г, Горская Е. В. и др. Профилактика транслокации кишечной микрофлоры после выведения организма из терминального состояния. //ЖМЭИ, 1992, № 5-6. С. 11-14.

3. Арискина М. А. Бронхиальная астма и дисбактериоз кишечника. (Клинико-бактериол. и биохим. аспекты). Дисс. канд. мед. наук. Самара. 1999, 173 с.

4. Багатурия И. Ф. Эффективность эубиотической терапии у больных с кишечным дисбактериозом различной этиологии. Дисс. канд. мед. наук. М. 1999, 100 с.

5. Баранов А. А., Щербакова Э. Г., Дорофейчук В. Г. и др. Лизоцимосодержащие биосистемы для профилактики и лечения социально значимых болезней детского возраста. //Рос. педиатр, журн. 2000. N4. С. 9-14.

6. Белявская В. А., Игнатьев Г. Г. Иммуностимулирующие свойства субалина, рекомбинантного интерферон-продуцирующего пробиотика. //Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2001, № 6. С. 77-82.

7. Ю.Бердичевский Б. А., Цветцих В. Е., Лерне Г. Я. и др. Значение аутогенного инфицирования в развитии послеоперационных осложнений. //Хирургия, 1993. № 5, 63-66.

8. Беюл Е. А., Куваева И. Б. Дисбактериозы кишечника и их клиническое течение. //Клинич. медицина, 1986, № 11. С. 37-44.

9. Биргер М. О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. М., Медицина, 1982, 464 с.

10. Блохина И. Н., Дорофейчук В. Г. Дисбактериозы. Л., Медицина, 1979, 175с.

11. Боковой А. Г., Козлова Т. Г., Маккавеева Л. Ф. Диагностика, клиника и лечение дисбактериоза кишечника у детей. Метод, рекомендации. М., 1990, 21 с.

12. Бондаренко В. М., Учайкин В. Ф., Мурашова А. О. и др. Дисбактериоз: современные возможности профилактики и лечения. М. АО "Партнер". 1994, 22 с.

13. Бондаренко В. М., Григорьев А. В., Суджан Е. В. и др. Подавление транслокации бактерий из кишечника путем энтеросорбции. //Актуальные проблемы общей и частной патологии (Сб. науч. тр.). М. 1993. С. 27-29.

14. Бухарин О. В., Константинова О. Д., Кремлева Е. А., Черкасов С. В. Характеристика влагалищной микрофлоры при внутриматочнойконтрацепции. //Ж. микробиол., эпидемимиол. и иммунобиол., 1999, № 4. С. 63-65.

15. Бухарин О. В. Персистенция патогенных бактерий. М., Медицина, 1999, 366 с.

16. Верткин A. J1. Дисбактериоз кишечника: патогенез и фармакотерапия. //Междунар. мед. журн. 1998, № 4. С. 27-29.

17. Верткин А. Л., Венгеров Ю. Я., Машарова А. А. и др. Дисбактериоз кишечника. Методические рекомендации. М., 1998, 33 с.

18. Веселов А. Я. Современные представления о нормальной микрофлоре пищеварительного тракта взрослого человека и изменениях ее в норме и при некоторых заболеваниях органов пищеварения (обзор литературы). //Лабораторное дело, 1997, № 4, с. 3 10.

19. Войчишина Л. Г., Чаплинский В. Я., Вьюницкая В. А. Применение спорообразующих бактерий в лечении больных дисбактериозом //Врач, дело.-1991.-№ 2. С. 73-75.

20. Воробьев А. А., Абрамов Н. А., Бондаренко В. М., Шендеров Б. А. Дисбактериозы актуальная проблема медицины. //Вестн. Рос. АМН. 1997, №3. С. 4-7.

21. Воробьев А.А., Пак С. Г. Дисбактериозы у детей. Учебное пособие для врачей и студентов. М., КМК Лтд. 1998. 64 с.

22. Воронин А. А. Разработка схем коррекции микробиоценоза кишечника в комплексной терапии инсулинзависимого сахарного диабета у детей. Дисс. канд. мед. наук, М., 1999, 115 с.

23. Горская Е. М. Гнотобиологические исследования в определении колонизационной резистентности кишечника. //Антибиотики и химиотерапия. 1989, т. 34, № 3. С. 601-606.

24. Гоцик А.А., Захаров В.В., Попов А.В. Место споробактерина в комплексном лечении обжженных. //Актуаьные впросы военной и практической медицины. Сб. тезисов научн.-практ. конф. врачей Приволжского военного округа. Оренбург. 2000. С. 80-83.

25. Грачева Н.М, Гончарова Г.И., Аваков А.А. и др. Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника: метод, рекомендации. М., 1986, 28 с.

26. Грачева Н. М., Чупрынина Р. П., Мацулевич Т. В. и др. Дифференцированное применение бактериальных препаратов (пробиотиков) при острых кишечных инфекциях вируснобактериальной природы в современных условиях (пособие для врачей). М., 1999,21 с.

27. Грачева Н. М., Ющук Н. Д., Чупрынина Р. П. и др. Дисбактериозы кишечника, причины возникновения, диагностика, применение бактерийных биологических препаратов (пособие для врачей и студентов). М., 1999, 45 с.

28. Григорьев П. Я., Коровин В. И., Жуховицкий В. Г., Таланова Е. В. Клиническая трактовка и вопросы терапии синдрома избыточной микробной колонизации кишечника. //Моск. мед. журн. 1999. № 5. С. 20-22.

29. Григорьев П. Я., Яковенко Э. П. Нарушение нормального состава кишечной микрофлоры, клиническое значение и вопросы терапии. Метод, пособие Федер. гастроэнтерол. центра при МЗ Рос. Федерации. М., Комп. "Ферросан Интернейшнл А/С". 2000,15 с.

30. Демин В. Ф., Ильенко JI. И., Холодова И. Н., Сырьевая Т. Н. Дисбактериоз кишечника у детей. Традиционные и нетрадиционные подходы к лечению и профилактике. Методические рекомендации. М., 2000, 55 с.

31. Долгушин И. И., Эберт JI. Я., Лившиц Р. И. Иммунология травмы. Свердловск. Изд-во Урал, ун-та, 1989, 188 с.

32. Егишян Р. Е. Дисбактериоз тонкой кишки. //Нижегор. мед. журн. 1995, №2-3. С. 104-111.

33. Есипов В.К. Патогенетические аспекты острого распространенного перитонита и обоснование рационального метода его лечения. Дис. д-ра мед. наук. Оренбург, 1999, 325 с.

34. Есипов В. К., Полякова В. С., Есипов Д. В., Хотян А. Р. Патогенетические основы рациональной терапиии распространенного перитонита. //Ж. Анналы травматологии и ортопедии. Самара, 2001, № 2. С. 53-56.

35. Жданов П. И. Биологические и эпизоотологические аспекты производства и применения нового пробиотика из бактерий рода Bacillus. Дисс. докт. ветеринарных наук. Оренбург. 1997, 332 с.

36. Жигайлов А.В. Транслокация бактерий как фактор инфицирования ран при металлоостеосинтезе закрытых переломов костей конечностей и обоснование нового принципа антибактериальной терапии. Автореф. дис. канд. мед. наук. Оренбург, 1996,18 с.

37. Истомин А. В. Кисломолочный бифидумбактерин: опыт применения, эффективность. //Народная медицина России: теория и практика. 1999. №3. С. 8-9.

38. Кадышев В. А. Профилактика синдрома гиперколонизации кишечника у новорожденных детей. Автореф. дисс. канд. мед. наук, Оренбург. 1999, 25 с.

39. Калашникова С. А. Функциональная система "лизоцим-антилизоцим" в формировании микробиоценоза кишечника человека. Автореф. дисс. канд. мед. наук. Волгоград. 1999, 23 с.

40. Карасева Г. Н. Кишечный дисбактериоз в патогенезе гастроэнтерологических заболеваний у детей и его коррекция. Дисс. канд. мед. наук. Горький. 1986, 189 с.

41. Кирковский В. В., Третьяк С. И., Мерзляков А. Е., Руммо О. О. Коррекция интраинтестинального статуса у больных с распространенным перитонитом. //Хирургия. 2000. №9. С. 11-15.

42. Кныш И. О. Клинико-патогенетическое значение дисбиоза толстой кишки при вирусных гепатитах А, В и С у детей. Автореф. дисс. канд. мед. наук. Воронеж. 1999. 18 с.

43. Козьминых Д. Ю. Микробиологические основы водолечения и водопрофилактики дисбактериозов кишечника. //Труды молодых ученых ИГМА. Ижевск. 1999. С. 37-38.

44. Копанев Ю. А., Кузьменко JI. Г. Особенности применения препаратов для микробиологической коррекции дисбактериоза кишечника у детей. //Лечащий врач. 2000. N5-6. С. 50-51.

45. Корнева Т. К. Дисбактериоз кишечника у проктологических больных: микробиологические аспекты. //Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии. 1999, т. 8, № 3. С. 55-60.

46. Корнилова Т. И., Сафроненко Л. В., Вязова Л. И. Пробиотики в лечебном питании новорожденных. //Пробиотические микроорганизмы-современное состояние вопроса и перспективы использования. Междун. научн.-практ. конф. Сб. материалов конф. М., 2002. С. 57-58.

47. Коровина Н. А., Чебуркин А. В., Захарова И. Н. И др. Иммунореабилитация часто и длительно болеющих детей. Учебное пособие. Ковров, 1996, 30 с.

48. Коршунов В. М., Ефимов Б. А., Пикина А. П. Характеристика биологических препаратов и пищевых добавок для функционального питания и коррекции микрофлоры кишечника. //Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2000, № 3. С. 86-91.

49. Коршунова О. В., Кафарская Л. И., Ефимов Б. А. и др. Использование биологических препаратов для коррекции микробного статуса у беременных женщин. //Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиологии. 2000, № 5. с. 69-72.

50. Красноголовец В. Н. Дисбактериоз кишечника. М., Медицина, 1989, 206с.

51. Крылов А. А., Козлович И. В., Решетнева Е. М. И др. Дисбактериоз кишечника. Санкт-Петербург, 1994, 24 с.

52. Крышень В. П., Нестерова М. Ф., Бойко Е. Н. Летучие фенолы мочи как признак дисбактериоза тонкой кишки после оперативного лечения язвенной болезни. //Хирургия. 1988, № 3. С. 38-39.

53. Кудашев С.Г. Экспериментальное обоснование нового способа профилактики хирургической инфекции огнестрельных ран. Дисс. канд. мед. наук. Оренбург, 2000, 120 с.

54. Кузнецов В. Ф., Ющук Н. Д., Юрко JI. П., Набокова Н. Ю. Дисбактериоз кишечника у больных иерсиниозами и возможность его коррекции биопрепаратами. //Терапевт, арх. 1994. Т. 66. № 11. С. 1718.

55. Кукулянский А. А., Соколовская А. Д., Гнатенко Т. В. Влияние антибиотиков на микрофлору кишечника у детей от 2 до 6 лет. //В сб.: Материалы Научно-практической конференции, посвященные 10-летию Минского диагностического центра. Минск, 1999. С. 50-51.

56. Лаздин О. А. К вопросу об использовании бифиформа при дисбактериозе. //Становление и перспективы развития факультета последипломного образования на рубеже столетий. Итоги 10-лет. орг.-метод. и н.-и. работы. Тверь. 1999. С. 146-150.

57. Линева 3. Е. Дисбактериоз кишечника и методы его коррекции у больных туберкулезом легких. Дисс. доктора мед. наук, Якутск, 1995, 192 с.

58. Линник С. А., Рак А.В., Бялик И. Ф. и др. Лечение больных хроническим остеомиелитом и гнойными ранами с применением споробактерина. //Ж. Анналы травматологии и ортопедии. Самара, 2001, №2. С. 12-14.

59. Литяева Л. А., Ганыпина И. А., Кононыхина Е. Ю. Иммунопрофилактика микроэкологических нарушений кишечника уноворожденных детей. //В кн.: Медицинские аспекты микробной экологии. Часть 2. М., 1994. С. 193-195.

60. Лучшев В. И., Бондаренко В. М., Шахмарданов М. 3. Дисбактериозы у больных шигеллезами: причины развития и пути коррекции. //Рос. мед. журн. 2000. №3. С. 35-38.

61. Лыкова Е. А. Микробиологические и иммунобиологические нарушения и обоснование применения пробиотиков при инфекционной патологии у детей. Автореф. дисс. докт. мед. наук. М., 2000, 44 с.

62. Лыкова Е. А., Мурашова А. О., Бондаренко В. М. и др. Нарушения микрофлоры кишечника и иммунитета у детей с аллергическими дерматитами и их коррекция. //Рос. педиатр, журн. 2000, № 2. С. 20-24.

63. Лыкова Е. А., Воробьев А. А., Боковой А. Г., Мурашова А. О. Нарушение интерферонового статуса у детей с острой респираторной инфекцией и его коррекция бифидумбактерином-форте. //Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2001. № 2. С. 65-67.

64. Мазанкова Л. Н., Бродинова С. Н., Михайлова Н. А. Опыт применения споробактерина при аллергодерматозах у детей раннего возраста. //Дисбактериозы и эубиотики. Тез. докл. Российской научн.-практ. конф. 1996. С. 44.

65. Мазанкова Л. Н., Запруднов А. М. Микроэкология кишечника у детей в норме и при патологии. Российские медицинские вести. 1996, № 1, с. 3443.

66. Мазанкова Л. Н., Ваулина О. В. Новые лекарственные средства для коррекции дисбиотических нарушений. //Дет. доктор. 2000. № 3. С. 51-53.

67. Маянский А. Н. Дисбактериоз: иллюзии и реальность. //Нижегор. мед. журн. 1999, № 3. С. 80-90.

68. Медведкин В. М., Копылов В. А., Воронов О. В. и др. //Ж. Анналы травматологии и ортопедии. Самара, 2001. С. 47-49.

69. Мельникова В. М., Беликов Г. П., Щербакова Э. Г., и др. Проблемы химиопрофилактики и химиотерапии эндогенной инфекции и дисбактериоз. //Вестн. Рос. АМН. 1997, № 3. С. 26-29.

70. Мерков А. М., Поляков Л. Е. Санитарная статистика. Л., Медицина, 1974,384 с.

71. Минушкин О. Н., Ардатская М. Д., Бабин В. Н. и др. Дисбактериоз кишечника. //Рос. мед. журн. 1999, № 3. С. 40-44.

72. Наймушина Е. С. Клинико-иммунологическая характеристика и современная тактика лечения хронических колитов у детей. //Дисс. канд. мед. наук. Ижевск. 1999. 161 с.

73. Наумова И. В. Отомикозы у детей. //Автореф. дисс. канд. мед. наук. Рос. гос. мед. ун-т. М. 1999. 27 с.

74. Никитенко В. И., Бухарин О. В., Никитенко И. К. Явление естественного защитного бактериального механизма при повреждениях. Заявка на открытие № ОТ 11353. Депонировано во ВНИИГПЭ, 1986, 22 с.

75. Никитенко В. И. Взаимоотношения макроорганизма и бактерий в ране и тканях человека и животных. //Хирургия. 1990. № 9. С. 94-99.

76. Никитенко В. И., Горбункова Н. Н., Жигайлов А. В. Споробактерин -новый препарат для лечения дисбактериозов и гнойно-воспалительных процессов. //Дисбактериозы и эубиотики. Тез. докл. Российской научн.-практ. конф. 1996. С. 26.

77. Никитенко В. И. Транслокация бактерий механизм защиты организмов человека и животных от инфекции при повреждениях. //Ж. Анналы травматологии и ортопедии. Самара, 2001. № 2. С. 20-23.

78. Пайков В. JI. Современные представления о кишечном дисбактериозе. //Практические вопросы детской гастроэнтерологии Санкт-Петербурга. Сб. лекций и науч. работ. СПб, 1999, вып. 2. С. 133-138.

79. Панчишина М. В., Олейник С. В. Дисбактериоз кишечника. Киев, 1983, 117с.

80. Перетц Л. Т. Значение нормальной микрофлоры для организма человека. М. Медгиз, 1955. 436 с.

81. Пинегин Б. В., Мальцев В. Н., Коршунов В. М. Дисбактериозы кишечника. М., Медицина, 1984, 120 с.

82. Положенкова Л. А., Бурков С. Г., Бокерия О. А., Новиков С. В. Эффективность фловинила BS для лечения дисбактериоза кишечника. //Клин. мед. 1999. Т. 77. № 2. С. 40-43.

83. Портенко Ю. Г. Профилактика инфекционных осложнений после плановых операций на органах брюшной полости и мочевой системы с учетом микрофлоры кишечника. Дисс. канд. мед. наук. Тверь. 1999. 100с.

84. Поспелова В. В., Грачева Н. М., Антонова Л. В. и др. Биологические микробные препараты, их лекарственные формы и сферы применения. //Новые лекарственные препараты. М., 1990, вып. 5. С. 1-8.

85. Резник С. Р., Слабоспицкая А. Т., Смирнов В. В. Некоторые биологические свойства бактерий рода Bacillus, выделенных из организма людей. //Микробиол. журн. 1985. Т. 47. № 3. С. 53-59.

86. Родионова Л. В., Холошина Г. И., Мартыненко И. М. Использование пищевых добавок в комплексной терапии дисбактериоза. //Питание XXI века: медико-биологические аспекты, пути оптимизации. Междунар. симпоз., Владивосток. 1999. С. 159-160.

87. Румянцев В. Г. Дисбактериоз кишечника: клиническое значение и принципы лечения. //Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии. 1999, т. 8, № 3. С. 61-63.

88. Савченко 3. И., Ющук Н. Д., Цыб А. Ф. и др. Иммуностимулирующая активность эубиотика "Биофлор" при дисбактериозе кишечника различного происхождения. //Клинич. медицина. 2000, т. 78. №3. С. 50-53.

89. Сайтов М. М., Никитенко В. И., Есипов В. К., Писецкий С. Н. Роль дисбактериоза кишечника в развитии хирургической инфекции. //Вестник академии медицинских наук. 1997. № 3. С. 17-19.

90. Санакоева Л. П., Ганиев М. Г. Дисбактериоз кишечника у детей раннего возраста. //Метод, рекомендации для курсантов ФУВ Перм. гос. мед. ин-т. Фак. усоверш. врачей. Пермь. 1994, 40 с.

91. Сидоренко С. В., Таранеко JI. А., Воронин А. А. Дисбактериоз кишечника у детей, больных сахарным диабетом, и возможности его коррекции пробиотиком. //Моск. мед. журн. 1999, № 1. С. 21-23.

92. Симоненко Е. В. Некоторые аспекты лечения закрытой травмы грудной клетки. Дисс. канд. мед. наук. Оренбург, 2002, 126 с.

93. Слепых Н. И. Лечение послеоперационных раневых инфекций в хирургической практике. //Ж. Анналы травматологии и ортопедии. Самара, 2001, № 2. С. 30-33.

94. Слепых Н. И., Стадников А. А., Третьяков А. А. Профилактика и лечение послеоперационных раневых инфекций пробиотиком споробактерином. Пособие для врачей. Оренбург. 2001. 39 с.

95. Смирнов В. В., Резник С. Р., Василевская И. А. Спорооброазующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ. Киев. Наукова думка, 1982. 278 с.

96. Смирнов В. В., Резник С. Р., Сорокулова И. Б., Вьюницкая В. А. О некоторых механизмах возникновения бессимптомной бактериемии. //Микробиолог, журн., 1988. Т. 50. № 5. С. 56-59.

97. Смирнов В. В., Резник С. О. Бактерии рода Bacillus — продуценты антибиотиков //Проблемы изыскания и биотехнология новых антибиотиков. М., Медицина, 1992. С. 53.

98. Смирнов В. В., Сорокулова И. Б. Перспективы применения бактерий Bacillus в качестве основы новых биопрепаратов для медицины //Дисбактериозы и эндотоксикозы. Тез. докл. Всерос. научн. -практич. конф. 26-28 марта 1996. М., 1996. С. 29.

99. Смирнов В. В. Экологические, таксономические и биотехнологические аспекты изучения бактерий и высших растений, которые продуцируют биологически активные вещества. //Микробиол. ж. Киев. 1998. Т. 60. №5. С. 3-18.

100. Смолянская А. 3., Гончарова Г. И., Лизько Н. Н. и др. Современные аспекты дисбактериоза кишечника и его бактериологическая диагностика. //Лаб. дело. 1984, №3. С. 167-171.

101. Соколов А. Л., Копанев Ю. А., Алешкин В. А. и др. Комплексный иммуноглобулиновый препарат в педиатрической практике. //Вестн. Рос. ун-та дружбы народов. Сер. Медицина. 1999, №2. С. 35-39.

102. Соколова К. Я., Соловьева И. В. Дисбактериозы : Теория и практика. //Под ред. В. А. Княжева. Н. Новгород. 1999, 198 с.

103. Сорокулова И. Б. Сравнительное исследование биологических свойств Биоспорина и других коммерческих препаратов, основанных на бактериях Bacillus. //Микробиол. ж. Киев. 1997.Т. 59. № 6. С. 43-49.

104. Сорокулова И. Б. Влияние пробиотиков из бацилл на функциональную активность макрофагов. //Антибиотики и химиотер. 1998. Т. 43. №2. С. 20-23.

105. Стадников А. А. Роль гипоталамических нейропептидов во взаимодействиях про- и эукариот. Структурно-функциональные аспекты. Екатеринбург, 2001. 244 с.

106. Стукун Е. А., Беседнова Н. Н., Цывкина Г. И., Кольцов И. П. Использование пищевой добавки "Тинростим" в комплексной терапии дисбактериоза кишечника у детей с аллергодерматозами. //Тихоок. мед. журн. 1999, № 3. С. 67-68.

107. Субботина М. Д., Тимченко В. Н., Мартынкин А. С. и др. Дисбактериоз кишечника у детей и микроэкологические подходы к егокоррекции. Учеб.-метод. пособие С.-Петерб. гос. педиатр, мед. акад. СПб, 1997,22 с.

108. Тарасенко В. С. Острый деструктивный панкреатит. Некоторые аспекты патогенеза и лечения. Дисс. докт. мед. наук. Оренбург. 2000. 380 с.

109. Тарасенко В. С., Стадников Б. А., Никитенко В. И., Стадников А. А. Способ лечения острого деструктивного панкреатита. Пособие для врачей. Оренбург, 2000. 24 с.

110. Тарасенко В. С., Стадников Б. А., Валышев А. В., Шефер А. В. Экспериментально-клиническое • обоснование применения споробактерина в лечении панкреонекроза. //Ж. Анналы травматологии и ортопедии. Самара, 2001, № 2. С. 57-59.

111. Ткаченко Е. И. Клиническое питание. Состояние и перспективы развития. //Клиническое питание. Научно-практ. ж., Санкт-Петербург, 2003, № 1.С. 3-7.

112. Третьяков А. А. Клинико-экспериментальное обоснование комплексного лечения холангита при механической желтухе. Дис. д-ра мед. наук. Оренбург, 1998, 340 с.

113. Третьяков А.А., Стадников А. А., Валышев А.В. Клинико-экспериментальное обоснование применения споробактерина в комплексной терапии холангита при механической желтухе. //Ж. Анналы травматологии и ортопедии. Самара, 2001, № 2. С. 42-46.

114. Урсова Н. И. Роль и место пробиотиков в лечении и профилактике различных заболеваний и состояний, обусловленных дисбиотическими нарушениями кишечника. Научный обзор. М., 2002, 28 с.

115. Фазылова А. А., Эткина Э. М., Михайлова Н. А., Кузнецова Т. Н. Применение споробактерина при дисбактериозе у детей. //Дисбактериозы и эубиотики. Тез. докл. Российской научн.-практ. конф. 1996. С. 37.

116. Финохин А. В. Дисбактериоз кишечника при микробной экземе. (Клинико-бактериол. исслед.). Дисс. канд. мед. наук. Саратов, 1989, 159с.

117. Фомина М. В. Комбинированное лечение синуитов у детей с использованием споробактерина. Дисс. канд. мед. наук. Оренбург, 2003, 132 с.

118. Харченко Г. А., Колоколов В. А. Дисбактериоз кишечника у детей. Метод, пособие Астрах, гос. мед. акад. Астрахань. 1999, 38 с.

119. Хецуриани Ш. Г., Рачвелишвили Б. X., Хецуриани К. Г. и др. Выборочное антибактериальное действие левомицетина на биоварианты Escherichia coli, выделенные от больных кишечным дисбактериозом. //Мед. новости Грузии. 1999. N9. С. 67-68.

120. Чердинцева Н. В., Литвяков Н. В. Изменение противоопухолевого действия циклофосфамида с помощью рекомбинантного пробиотика Субалина. //Вопросы онкол., 1997. Т. 43. № 3. С. 313-316.

121. Чернецова Л. Ф. Дисбактериоз. //Тюмен. мед. журн. 1999. N3. С. 16-17.

122. Чернякова В. И., Береза Н. М., Селезнева С. И. и др. Бактериологическая и иммунологическая эффективность препарата биоспорина при неспецифическом язвенном колите //Микробиологии, журнал. 1993. Т. 55. № 3. С. 63-67.

123. Шамаль 3. Ф., Жукова А. А., Суворова Г. М., Завгородняя Е. Ф. Дисбактериоз кишечника и его лечение молоком "Наринэ".

124. Антропонозные инфекции и их профилактика на Дальнем Востоке. Сб. науч. тр. Хабар, гос. мед. ин-т, Хабар. НИИ эпидемиологии и микробиологии; Хабаровск. 1988. С. 57-60.

125. Шендеров Б. А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. //Т. 1: Микрофлора человека и животных и ее функции. М., ГРАНТЪ, 1998,288 с.

126. Шендеров Б. А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. //Т. 2: Социально-экологические и клинические последствия дисбаланса микробной экологии человека и животных. М., ГРАНТЪ, 1998,416 с.

127. Шендеров Б. А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. //Т. 3: Пробиотики и функциональное питание. М., ГРАНТЪ, 1998, 286 с.

128. Шептулин А. А. Синдром избыточного роста бактерий и "дисбактериоз кишечника": их место в современной гастроэнтерологии. //Рос. журн. гастроэнтерологии и гепатологии.1999, № 3. С. 51-55.

129. Щербакова Э. Г. Бифилиз: механизмы действия и клиническое применение. //Рос. мед. вести. 2000. Т. 5. N 2. С. 43-53.

130. Щетинин А. К., Тарасенко В. С., Чевычалова Е. В. Консервативное лечение острого холецистита. //Актуальные проблемы военной и практической медицины. Сб. трудов Ш научн.-практ конф. врачей Приволжско-Уральского воен. окр. Оренбург, 2002. С. 170-172.

131. Яковлев М. Ю., Аниховская И. А., Аполлонин А. В. и др. Иммуноферментные эндотоксин-тест-системы в оценке неблагоприятных экологических воздействий. //Сб. науч. тр.: Актуальные проблемы общей и частной патологии. М., 1993. С. 14-17.

132. Ященя О. В. Дисбиоценозы кишечника при иерсиниозах и острых желудочно-кишечных инфекциях у детей и методы их профилактики. //Автореф. дисс. канд. мед. наук. Владивосток. 1999. 23 с.

133. Adami A., Cavazzoni V. Occurrence of selected bacterial groups in the faeces of piglets fed with Bacillus coagulans as probiotic. //J. Basic Microbiol. Milan, 1999. V. 39. N 1. P. 3-9.

134. Alexopoulos C., Karagiannidis A. Field evaluation of a bioregulator containing live Bacillus cereus spores on health status and performance of sows and their litters. //J. Vet. Med. A. Physiol. Pathol. Clin. Med., 2001. Apr. V. 48. N3. P. 137-145.

135. Baum В., Liebler-Tenorio E. M. Saccharomyces boulardii and bacillus cereus var. Toyoi influence the morphology and the mucins of the intestine of pigs. //J. Gastroenterol. 2002. May. V. 40. N 5. P. 277-284.

136. Benedettini G., De Libera G., Pierotti R. et al. Immunomodulation by Bacilus subtillis spores //Boll. 1st. Sieroter. Milan. 1983. V. 62. N 6. P. 509516.

137. Benoni J. Antibiotic administration and oral bacterial therapie in infants. //Chemotherapia, 1984. V. 3, N 5. P. 291-294.

138. Berg R. D. Bacterial translocation from the intestines. //Jikken Dobutsu, 1985. Jan. V. 34. N1. P. 1-16.

139. Biancone L., Monteleone I. Del Vecchio Blanco G. and other. Resident bacterial flora and immune system. //Dig. Liver. Dis. 2002, Sep., 34 Suppl 2. P. 37-43.

140. Bjorneklett A., Hoverstad Т., Hovig T. Bacterial overgrowth. //Scand. J. Gastroenterol. 1985. V. 109. P. 123-132.

141. Bozovic M. Justivication for combining Bacillus subtilis with antibiotics in the therapy of diarreae syndrome //Med. Pregl. 1986. V. 39. N 11/12. P. 603-604.

142. Browning G. G., Buchan К. A., MacKay C. The effect of vagotomy and drainage on the small bowel flora. //Gut, 1974. V. 15, № 2. P. 139-142.

143. Caldini G., Trotta F. Inhibition of 4-nitroquinoline-l-oxide genotoxicity by Bacillus strains. //Res. Microbiol, Italy. 2002, Apr. V. 153. N 3. P. 165171.

144. Cavazzoni V., Adami A. Performance of broiler chickens supplemented with Bacillus coagulans as probiotic. //Br. Poult. Sci. 1998. Sep. V. 39. N 4. P. 526-529.

145. Cordts P. R., Kaminski M.V., Raju S. and other. Could gut-liver function derangements cause chronic venous insufficiency? //Vase. Surg. 2001, Mar-Apr., V. 35, N 2. P. 107-114.

146. Dalmin G., Kathiresan K. Effect of probiotics on bacterial population and health status of shrimp in culture pond ecosystem. //Indian J. Exp. Biol. 2001. Sep. V. 39. N 9. P. 939-942.

147. Dave R. I., Shah N. P. Ingredient supplementation effects on viability of probiotic bacteria in yogurt. //J. Dairy Sci. 1998. Nov. V. 81. N 11. P. 28042816.

148. Deitch E. A., Specian R. D., Berg R. D. and other. Endotoxin-induced bacterial translocation: a study of mechanisms. //Surgery, 1989. Aug. V. 106. N 2. P. 92-300.

149. Desmond C., Ross R. P., 0"Callaghan E. and other. Improved survival of Lactobacillus paracasei NFBC 338 in spray-dried powders containing gum acacia. //J. Appl. Microbiol. 2002. V. 93. N 6. P. 1003-1011.

150. Drago L., Gismondo M. R., Lombardi A. and other. Inhibition of in vitro growth of enteropathogens by new Lactobacillus isolates of human intestinal origin. //FEMS Microbiol. Lett. 1997. Aug. V. 15. N 153(2). P. 455-463.

151. Drazar B. S. Some factors associated with geographical variations in the intestinal microflora //The normal microbial flora of man. Ed. by Skiner F. A., Carr J. G. -London-New York: Academic Press. 1974. P. 187-196.

152. Dunne С. Adaptation of bacteria to the intestinal niche: probiotics and gut disorder. //Inflamm. Bowel Dis. 2001, May, V. 7, N 2. P. 136-145.

153. Edmiston С. E. Jr., Condon R. E. Bacterial translocation. //Surg., Gynecol., Obstet. 1991. Jul. V. 173. N 1. P. 73-83.

154. Endo Т., Nakano M. Effects of a probiotic on the lipid metabolism of cocks fed on a cholesterol-enriched diet. //Biosci. Biotechnol. Biochem. 1999. Sep. V. 63. N 9. P. 1569-1575.

155. Evaldson G., Heimdahl A., Kager L., Nord С. E. The normal hu- mand anaerobic microflora. //Scand. J. Infect. Dis. 1982, suppl 35. P. 9-15.

156. Gaon D., Garmendia C., Murrielo N. O. and other. Effect of Lactobacillus strains (L. casei and L. Acidophilus Strains cerela) on bacterial overgrowth-related chronic diarrhea. //Medicina (B Aires). 2002. V. 62. N 2. P. 159-163.

157. Goerg K. J., Schlorer E. Probiotic therapy of pseudomembranous colitis. Combination of intestinal lavage and oral administration of Escherichia coli. //Dtsch.Med. Wochenschr. 1998. Oct. V. 23. N 123 (43). P. 1274-1278.

158. Green D. H., Wakeley P. R., Page A. and other. Characterization of two Bacillus probiotics. //Appl. Environ Microbiol., London. 1999. Sep. V. 65. N 9. P. 4288-4291.

159. Grotz M. R., Deitch E. A., Ding J. and other. Intestinal cytokine response after gut ischemia: role of gut barrier failure. //Ann. Surg. 1999. Apr. V. 229. N4. P. 478-486.

160. Gruenwald J., Graubaum H. J., Harde A. Effect of a probiotic multivitamin compound on stress and exhaustion. //Adv. Ther. 2002. May-Jun, V. 19. N3. P. 141-150.

161. Guandalini S., Pensabene L., Zikri M. A. and other. Lactobacillus GG administered in oral rehydration solution to children with acute diarrhea: a multicenter European trial. //J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr.2000. Jan. V. 30. Nl.P. 54-60.

162. Guslandi M., Mezzi G., Sorghi M., Testoni P. A. Saccharomyces boulardii in maintenance treatment of Crohn"s disease. //Dig. Dis. Sci. 2000. Jul. V. 45. N7. P. 1462-1464.

163. Hamilton-Miller J. M., Shah S., Winkler J. T. Public health issues arising from microbiological and labelling quality of foods and supplements containing probiotic microorganisms. //Public. Health. Nutr. 1999. Jun. V. 2. N 2. P. 223-229.

164. Hoa N. Т., Baccigalupi L. Characterization of Bacillus species used for oral bacteriotherapy and bacterioprophylaxis of gastrointestinal disorders. //Appl. Environ Microbiol. London. 2000. Dec. V. 66. N 12. P. 5241-5247.

165. Hoa Т. Т., Due L. H. Fate and dissemination of Bacillus subtilis spores in a murine model. //Appl. Environ. Microbiol. 2001. Sep. V. 67. N 9. P. 38193823.

166. Hopkins M. J., Sharp R., Macfarlane G. T. Age and disease related changes in intestinal bacterial populations assessed by cell culture, 16S rRNA abundance, and community cellular fatty acid profiles. //Gut, 2001, Feb. V. 48, N2. P. 198-205.

167. Huisint-Veid J. H. Gastrointestinal flora and health in man and animal. //Tijdschr diergeneeskd. 1991, Mar. V.l, № 116 (5). P. 232-239.

168. Hyronimus В., Le Marrec C. Acid and bile tolerance of spore-forming lactic acid bacteria. //Int. J. Food Microbiol., 2000. Nov, 1. V. 61. N 2-3. P. 193-197.

169. Jadamus A., Vahjen W. Growth behaviour of a spore forming probiotic strain in the gastrointestinal tract of broiler chicken and piglets. //Arch. Tierernahr., 2001. V. 54. N 1. P. 1-17.

170. Jansen G. J., Wildeboer-Veloo A. C., van der Waaij D., Degener J. E. Escherichia coli as a probiotic? //Infection. 1998. Jul-Aug. V. 26. N 4. 232233.

171. Kailasapathy K. Microencapsulation of probiotic bacteria: technology and potential applications. //Curr. Issues. Intest. Microbiol. 2002. Sep. V. 3. N 2. P. 39-48.

172. Kakkos S. K., Kirkilesis J., Scopa C. D. and other. Nonabsorbable antibiotics reduce bacterial and endotoxin translocation in hepatectomised rats. //HPB Surg. 1997. V. 10. N 5. P. 283-291.

173. Knoke M., Bernhardt H., Mollmann R., Bootz T. Therapeutische Studie zum Einfluss der selektiven Dekontamination auf das mikrobielle Overgrowth-Syndrom des Dunndarms. //Gastroenterol. J., 1989. V. 49, N 2. P. 59-62.

174. Kocian J. Lactobacilli in the treatment of dyspepsia due to dysmicrobia of various causes. //Vnitr. Lek. 1994, Feb. V. 40, N 2. P. 79-83.

175. Kollef M. H. Epidemiology and risk factors for nosocomial pneumonia. //Clinics in Chest Medicine. 1999. Sep. V. 120. N. 3. P. 653-670.

176. Kruis W., Schutz E., Fric P. and other.Double-blind comparison of an oral Escherichia coli preparation and mesalazine in maintaining remission of ulcerative colitis. //Aliment. Pharmacol. Ther. 1997. Oct. V. 11. N 5. P. 853858.

177. Kyriakis S. C., Tsiloyiannis V. K. The effect of probiotic LSP 122 on the control of post-weaning diarrhoea syndrome of piglets. //Res. Vet. Sci. 1999, Dec. V. 67, N 3. P. 223-228.

178. Lee К. H., Jun K. D., Kim W. S., Paik H. D. Partial characterization of polyfermenticin SCD, a newly identified bacteriocin of Bacillus polyfermenticus. //Lett. Appl. Microbiol. 2001. Mar. V. 32. N 3. P. 146-151.

179. Lemaire L.C., van Lanschot J.B., Stoutenbeek C.P. and other. Thoracic duct in patients with multiple organ failure: no major route of bacterial translocation. //Ann. Surg. 1999, Jan. V. 229. N 1. P. 128-136.

180. Lidbeck A., Nord С. E. Lactobacilli and the normal human anaerobic microflora. //Clin. Infec.Dis. 1993, Jun. V. 16, suppl 4. P. 181-187.

181. Madden J. A., Hunter J. O. A review of the role of the gut microflora in irritable bowel syndrome and the effects of probiotics. //Br. J. Nutr. 2002, Sep. V. 88, suppl 1. P. 67-72.

182. Madsen K. L. The use of probiotics in gastrointestinal disease. //Can. J. Gastroenterol. 2001. Dec. V. 15. N 12. P. 817-822.

183. Mastromarino P., Brigidi P., Macchia S. and other. Characterization and selection of vaginal Lactobacillus strains for the preparation of vaginal tablets. //J. Appl. Microbiol. 2002. V. 93. N 5. P. 884-893.

184. McGilliard M. L., Stallings С. C. Increase in milk yield of commercial dairy herds fed a microbial and enzyme supplement. //J. Dairy Sci.,1998. May. V. 81.N5.P. 1353-1357.

185. McNaught С. E., Woodcock N. P., Mitchell C. J. and other. Gastric colonisation, intestinal permeability and septic morbidity in acute pancreatitis. //Pancreatology, 2002. V. 2(5). P. 463-468.

186. McNaught С. E., Woodcock N. P., MacFie J., Mitchell C. J. A prospective randomised study of the probiotic Lactobacillus plantarum 299V on indices of gut barrier function in elective surgical patients. //Gut. 2002. Dec. V.51.N 6. P. 827-831.

187. Nicholson W. L. Roles of Bacillus endospores in the environment. //Cell. Mol. Life Sci. 2002,Mar. V. 59. N 3. P. 410-416.

188. Pinchuk I. V., Bressollier P. In vitro anti-Helicobacter pylori activity of the probiotic strain Bacillus subtilis 3 is due to secretion of antibiotics. //Antimicrob. Agents Chemother. ,2001. Nov. V. 45. N 11. P. 3156- 3161.

189. Pollak R., Varkonyl Т., Nagy E., Varro V. Gastric acidity: an important factor regulating the composition of the bacterial flora in the small intestine. //Acta. Med. Hung, 1986. V. 43, N 4. P. 365-368.

190. Prokesova L., Mlckova P. Immunostimulatory effect of Bacillus firmus on mouse lymphocytes. //Folia Microbiol. Praha, 2002. V. 47, N 2. P. 193197.

191. Sanders M. E., Huis in"t Veld J. Bringing a probiotic-containing functional food to the market: microbiological, product, regulatory and labeling issues. //Antonie Van Leeuwenhoek. 1999. Jul-Nov. V. 76. N 1-4. P. 293-315.

192. Savage D. C. Overview of the association of microbs with epithelial surfaces. //Microecology and Therapy. 1984. V. 14. P. 169-183.

193. Schiffrin E. J., Blum S. Food processing: probiotic microorganisms for beneficial foods. //Curr. Opin. Biotechnol. 2001. Oct. V. 12. N 5. P. 499-502.

194. Senesi S., Celandroni F., Tavanti A. and other. Molecular characterization and identification of Bacillus clausii. Strains marketed for use in oral bacteriotherapy. //Appl. Environ. Microbiol. Italy. 2001. Feb. V. 67. N 2. P. 834-839.

195. Singer S. M., Nash Т. E. The role of normal flora in Giardia lamblia infections in mice. //J. Infect. Dis. 2000, Apr. V. 181, N 4. P. 1510-1512.

196. Simon G. L., Gorbach S. L. Intestinal flora in health and disease. //Gastroenterology. 1984, Jan. V. 86, N 1. P. 174-193.

197. Simon G. L., Gorbach S. L. The human intestinal microflora. //Dig. Dis. Sci. 1986, Sep. V. 31(9 suppl). P. 147-162.

198. Spinosa M. R., Braccini T. On the fate of ingested Bacillus spores. //Res Microbiol, Italy, 2000. Jun. V. 151. N 5. P. 361-368.

199. Styriak I., Demeckova V., Nemcova R. Collagen (Cn-I) binding by gut lactobacilli. //Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr. 1999. Aug. V. 112. N 8. P. 301-304.

200. Suzuki Т., Itoh К., Kaneko Т., Suzuki H. Inhibition of bacterial translocation from the gastrointestinal tract of mice by oral administration ofa culture condensate of Bifidobacterium longum. //J. Vet. Med. Sci. 1997. Aug. V. 59. N 8. P. 665-669.

201. Tachikawa Т., Seo G. Estimation of probiotics by infection model of infant rabbit with enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:H7. //Kansenshogaku Zasshi. 1998. Dec. V. 72. N 12. P. 1300-1305.

202. Tancrede С. H., Andremont A. O. Bacterial translocation and gram-negative bacteremia in patients with hematological malignancies. //J. Infect. Dis. 1985. Jul. V. 152. N 1. P. 99-103.

203. Tokyay R. Mesenteric lymphadenectomy prevents postburn systemic spread of translocated bacteria. //Arch. Surg. 1992, Apr. V. 127. N 4. P. 384388.

204. Tuomola E., Crittenden R., Playne M. and other. Quality assurance criteria for probiotic bacteria. //Am. J. Clin. Nutr. 2001. Feb. № 73(2 Suppl). P. 393-398.

205. Urao M., Fujimoto T. Does probiotics administration decrease serum endotoxin levels in infants? //J. Pediatr. Surg., Tokyo, Japan. 1999. Feb. V. 34. N 2. P. 273-276.

206. Van der Waaij D. Y. Colonization resistance of the digestive tract as a major lead in the selection of antibiotics for therapy. In: New criteria for antimicrobial therapy. //Esc. Medica. Amsterdam, 1979. P. 271-282.

207. Wu С. Т., Li Z. L., Xiong D. X. Relationship between enteric microecologic dysbiosis and bacterial translocation in acute necrotizing pancreatitis. //World J. Gastroenterol. 1998, Jun. V. 4, N 3. P. 242-245.

208. Young J. European market developments in prebiotic- and probiotic-containing foodstuffs. // Br. J. Nutr. 1998. Oct. V. 80. N. 4. P. 231-233.

209. Zivkovic R. Probiotics or microbes against microbes. //Acta Med. Croatica. 1999. V. 53, N 1. P. 23-28.

Информация о работе

Никитенко, Мария Вячеславовна
кандидата медицинских наук
Оренбург, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Новая форма препарата "Споробактерин жидкий" и изучение ее эффективности при лечении дисбактериозов кишечника - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы