Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
NO-синтазная активность лактобацилл
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "NO-синтазная активность лактобацилл"
На правах рукописи
ООЗ176988
ЯРУЛЛИНА Дина Рашидовна
Ш-СИНТАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ ЛАКТОБАЦИЛЛ-ОБНАРУЖЕНИЕ, ГЕНОМНЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ, ФУНКЦИИ
03 00 07 - Микробиология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Казань-2007
003176988
Работа выполнена на кафедре микробиологии биолого-почвенного факультета Казанского государственного университета им В И Ульянова-Ленина
Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Ильинская Ольга Николаевна
Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор
Селивановская Светлана Юрьевна (кафедра прикладной экологии Казанского государственного университета, г Казань)
доктор медицинских наук, профессор Дармов Илья Владимирович (кафедра микробиологии Вятского государственного университета, г Киров)
Ведущая организация Институт экологии и генетики микроорганизмов УрОРАН, г Пермь
Защита состоится «27» сентября 2007 г в '5^0С> часов на заседании диссертационного совета Д 212 081 08 при Казанском государственном университете им В И Ульянова-Ленина по адресу 420008, г Казань, ул Кремлевская, д 18, главное здание, ауд 209
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им Н И Лобачевского Казанского государственного университета
Автореферат разослан « УЗ » &é¿£/ew¿h 2007 г
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор биологических наук /''Абрамова 3 И
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В последние несколько десятилетий проблема исследования оксида азота (NO) является одним из наиболее активно развивающихся направлений биомедицинских исследований [Ванин, 1998] Лавинообразный рост публикаций по биологии NO, начавшийся с конца 80-х годов, позволил редакции журнала «Science» в 1992 г провозгласить NO молекулой года [Koshland, 1992] Спустя несколько лет в 1998 г группа американских ученых была удостоена Нобелевской премии в области физиологии и медицины за выяснение роли NO как сигнальной молекулы в регуляции сердечно-сосудистой системы Непрерывно вырабатываемый в организме животных и человека ферментативным путем из L-аргинина, оксид азота является одним из универсальных регуляторов клеточного и тканевого метаболизма Наряду с регуляторными функциями N0 обнаруживает также цитотоксическую/цитостатическую активность, выступая в качестве одного из основных эффекторов системы клеточного иммунитета [Alderton et al, 2001]
В отличие от эукариотического, процесс бактериального синтеза NO исследован недостаточно Лактобациллы — это одни из немногих микроорганизмов, у которых обнаружен альтернативный денитрификации NO-синтазный (NOS) путь образования оксида азота [Adawi et al, 1997, Monta et al, 1997]. Бактерии рода Lactobacillus представляют собой важный компонент естественной микрофлоры кишечного и урогенитального трактов человека и животных, где они подавляют рост патогенных микроорганизмов, способствуют регенерации эпителия слизистой оболочки, оказывают иммуномодулирующее действие [Orrhage, Nord, 2000] Высокая биологическая активность микроорганизмов этой группы обусловила их широкое использование в производстве продуктов питания и промышленно важных пробиотических препаратов [Nguyen et al, 2007] Изучение закономерностей биосинтеза оксида азота комменсальными кишечными бактериями L plantarum позволит разработать фундаментальные основы практического манипулирования внутриклеточными регуляторами на молекулярном уровне и наметить конкретные технологические подходы использования пробиотических препаратов для лечения заболеваний человека и животных, обусловленных теми или иными отклонениями в образовании NO
Цель настоящей работы - поиск альтернативного пути образования оксида азота, отличного от денитрификации, подтверждение его наличия на основе генетического анализа и оценка физиологической роли NO у лактобацилл
Основные задачи исследования:
1 Проанализировать возможность образования оксида азота у L plantarum в процессе диссимиляционной нитритредукции, а также небиологическим путем
2 На генетическом уровне оценить потенциальную возможность проявления NO-синтазной активности у L plantarum
3 Выявить и охарактеризовать ТчЮ-синтазную активность у Ь р1аШагит прямыми методами регистрации оксида азота (ЭПР, флуоресцентное окрашивание и микроскопия), а также с помощью иммунологических подходов
4 Оценить возможность ингибирования бактериальной ЫО-синтазы классическими ингибиторами ИО-синтазы эукариот
5 Выявить влияние прокариотической ЫО-синтазной системы на рост и жизнеспособность продуцентов, а также морфофизиологическое состояние поверхности клеток
6 Установить роль оксида азота М)-синтазного происхождения как универсального фактора стрессорного и адаптивного ответов клеток различного уровня организации в условиях токсического и температурного стресса
Научная новизна Методом ЭПР-спектроскопии и флуоресцентного окрашивания впервые обнаружен специфичный для Ь р1аШагит N0-синтазный путь образования оксида азота Впервые приведены убедительные доказательства того, что исследуемые микроорганизмы не образуют N0 в процессе денитрификации Впервые использован метод окрашивания флуоресцентными красителями для регистрации молекулы оксида азота в метаболизме лактобацилл В работе впервые с помощью методов биоинформатики проведен системный анализ генетической обусловленности биосинтеза оксида азота у Ь р1аЫагит Намечены подходы к оценке физиологического смысла образования оксида азота клетками лактобацилл Установлено, что индуцированный Ь-аргинином синтез N0 нетоксичен для продуцента, но приводит к изменению морфофизиологического состояния поверхности клеток Впервые получены свидетельства наличия у Ь р!аМагит в-слоя, обнаруживаемого в условиях активации ЫО-синтазы Впервые приведены данные, указывающие на участие микробного N0 в стресс-реакциях бактерий, позволяющие рассматривать оксид азота как универсальный фактор стрессорного и адаптивного ответов клеток различного уровня организации
Практическая значимость Перспективы внедрения результатов работы обусловлены двумя аспектами функциональной активностью N0 и высокой промышленной и медицинской значимостью объекта исследования - лактобацилл Установленное участие N0 в регуляции формирования поверхностного Б-слоя бактерий, определяющего адгезию клеток на эпителии кишечника, позволит разработать подходы к увеличению колонизирующей способности лактобацилл, а следовательно, и положительного влияния на здоровье человека Обнаружение закономерностей регуляции биосинтеза N0 у микроорганизмов имеет огромное значение для биотехнологии и медицины, поскольку обеспечивает потенциальную возможность направленной регуляции синтеза N0 комменсальными бактериями в кишечнике человека с целью поддержания уровня оксида азота на необходимом для нормальной жизнедеятельности организма уровне В целом, проведенные исследования открывают перспективы использования пробиотиков на основе Ь рЪЫагит в качестве
альтернативного фармакологического и терапевтического средства борьбы с заболеваниями человека и животных, связанными с отклонениями в образовании NO
В ходе экспериментальной работы была разработана и опробована оригинальная методика определения оксида азота с помощью NO-чувствительных флуоресцентных красителей, а также осуществлен экспериментальный подбор спиновой ловушки для детекции бактериального N0 методом ЭПР-спектроскопии
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа проводится в соответствии с тематическим планом НИР КГУ 1 15 06 «Механизмы регуляции функциональной активности клетки» Исследования автора по тематике работы поддержаны федеральными программами «Развитие научного потенциала высшей школы» РНП 2 1 1 1005, РНП 2 1 1 3222 и «Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники», ГК 02 434 11 3020, ГК 02 512 11 2050, ГК ФЦКП КГУ 02 451 11 7019 Авторские исследования получили персональную поддержку Института фармакологии г Гиссен, Германия (2006, 2007 гг), Немецкой службы академических обменов (DAAD) (2005 г, 2007 - 2008 гг), Немецкого Общества физиологов (2006 г), а также программы партнерских отношений Казанского государственного университета (Казань, Россия) и Университета им Юстуса-Либиха (Гиссен, Германия) (2005 г) Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора Флуоресцентную детекцию оксида азота проводили на базе Института фармакологии г Гиссен, Германия ЭПР-спектроскопия выполнена на кафедре электроники и радиоспектроскопии КГУ Атомную силовую микроскопию осуществляли на кафедре оптики и нанофотоники КГУ Сканирующая электронная микроскопия выполнена на кафедре полезных ископаемых и разведочного дела КГУ
Положения, выносимые на защиту:
1 Бактерии L plantarum обладают специфическим, отличным от денитрификации, NO-синтазным механизмом образования оксида азота
2 Генетическая программа L plantarum подтверждает наличие у них NO-синтазной активности, отличной от NO-синтазы эукариот и прокариот -обладателей оксигеназного домена NO-синтазы
3 Оксид азота NO-синтазного происхождения у бактерий играет роль универсального фактора стрессорного и адаптивного ответов клеток
4 При индукции NO-синтазы субстратом L-аргинином происходит изменение морфофизиологического состояния поверхности клеток L plantarum, связанное с формированием S-слоя
Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2007» (Москва, 2007), XI Международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий Экологический катализ» (Новосибирск, 2006), молодежной научно-
практической конференции «Актуальные проблемы науки и образования», (Зеленодольск, 2006), Международной конференции Немецкого Общества физиологов и Федерации Европейских физиологических обществ (Мюнхен, 2006), II Международной конференции «Микробное разнообразие состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал» (Пермь, 2005), 9-ой Международной Пущинсхой школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005), 79-ой всероссийской студенческой конференции, посвященной 1000-летию Казани (Казань, 2005), конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2004), междисциплинарной конференции с международным участием «Новые биокибернетические и телемедицинские технологии 21 века для диагностики и лечения заболеваний человека» (Петрозаводск, 2003), V, VII конференциях НОЦ КГУ «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2005,2007), а также на итоговых конференциях КГУ (2004-2007)
Публикации По теме диссертации опубликовано 17 научных работ
Структура и объем диссертации Работа изложена на 155 страницах, содержит 8 таблиц и 33 рисунка и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 301 источник, из них 275 на иностранном языке
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования
Объектом исследования служили бактерии Lactobacillus plantarum №52 из коллекции НИИ сельскохозяйственной микробиологии РАСХН (г Санкт-Петербург) и Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ, выделенные из препарата «Лактобактерин сухой» (ФГУП «Пермское НПО «Биомед», г Пермь) Индукцию синтеза оксида азота биназой (РНКазой Bacillus intermedins) фиксировали с помощью фибробластов мыши NIH3T3 и фибробластов мыши, трансформированных онкогеном г as, (ms-NIH3T3) из коллекции Института фармакологии г Гиссен, Германия
Визуализацию объектов исследования проводили с помощью растрового электронного микроскопа XL 30 (Philips, Нидерланды), атомно-силового микроскопа Solver Р47Н (ЗАО «НТ-МДТ», Россия) полуконтактным методом на воздухе [Коновалова с соавт, 2005] и флуоресцентных микроскопов DM 6000В и DMIRE2 (Leica, Германия)
Способность бактерий к денитрификации определяли стандартными методами по содержанию нитратов, нитритов и газообразных продуктов денитрификации в культуральной жидкости [Сайманова, Захарова, 1980, Герхардт, 1984]
Анализ токсичности субстрата (L-аргинина) и ингибиторов NOS проводили, оценивая выживаемость штаммов бактерий, эффекты длительного (3, 6 и 24 ч) контакта бактерий с L-аргинином на число КОЕ, влияние L-аргинина и L-NAME на динамику роста бактерий, а также с
помощью селективного флуоресцентного окрашивания клеток реактивом LIVE/DEAD ßacLight Bacterial Viability Kits (Molecular Probes)
Регистрацию оксида азота методом ЭПР-спектроскопии проводили на спектрометре Bruker ESP-300 (Германия) На способность формировать с оксидом азота, продуцируемым L plantarum 8Р-АЗ, комплексы, детектируемые методом ЭПР, исследовали аскорбиновую кислоту [Kuropteva, Kudryavtsev, 1997], комплекс Fe2+(DETC)2 [Mikoyan et al, 1997] и железосерные центры белков лактобацилл [Жумабаева с соавт, 2001] Опытный вариант для NO-синтазы содержал L-аргинин и NADPH и инкубировался аэробно Для регистрации NO в процессе денитрификации в реакционную смесь добавляли KNO3 и выдерживали в анаэробных условиях в атмосфере углекислого газа
Флуоресцентное определение оксида азота и активных форм кислорода (АФК) проводили с помощью NO-чувствительных флуоресцентных красителей позволяющего визуализировать только внутриклеточный NO диацетильного производного 4-амино-5-метиламино-2',7'-
дифторфлуоресцеина (DAF-FM DA) (Molecular Probes) и детектирующего весь оксид азота пробы 1,2-диаминоантрахинона (DAA) (Molecular Probes) Внутриклеточные АФК окрашивали с помощью реактива Image-iT™ LIVE Green Reactive Oxygen Species Detection Kit (Molecular Probes), основным действующим агентом которого является диацетильное производное 5,6-карбокси-2' ,7'-дихлордигидрофлуоресцеина (Kap6oKCH-H2DCFDA) Также проводили комбинированное окрашивание йодидом пропидия (PI) и DAF-FM DA и PI и Kap6oKCH-H2DCFDA
Иммуноблотинг клеточных экстрактов L plantarum №52 проводили с использованием мышиных антител к nNOS (BD Biosciences, разведение 1 500), eNOS и iNOS (BD Biosciences, разведение 1 2500) Иммунодетекцию осуществляли с помощью конъюгированных с пероксидазой хрена козьих антител против иммуноглобулинов мыши (Dako, Великобритания, разведение 1 2000) и набора ECL (Amersham, Великобритания)
Методы биоинформатики Для анализа использовали полную последовательность генома L plantarum WCFS1 (NC_004567) [Kleerebezem et al, 2003] Поиск гомологичных последовательностей в базе данных GenBank [Benson et al, 1999] осуществляли с помощью программы BLAST [Altschul et al, 1997] (http //www nebí nlm mh gov/BLAST/) Бактериальные пептиды, использовавшиеся в качестве запроса при скрининге генома L plantarum WCFS1 на наличие гомологов bNOSoxy, перечислены в табл 1 Для множественного выравнивания использовали алгоритм ClustalW [Chenna et al, 2003] (http //www ebi ас uk/clustalw/) Метаболические пути анализировали, используя базу данных KEGG [Kanehisa et al, 2002] (http //www genome adjp/kegg/)
Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерной программы «Microsoft-Excel»
Таблица 1
№ Штамм Белок
1 Bacillus cereus АТСС 14579 NP 835105
2 Bacillus halodurans С-125 NP 241689
3 Bacillus subtihs 034453
4 Deinococcus radiodurans R1 Q9RR97
5 Oceanobacillus iheyensis HTE831 NP 693612
6 Staphylococcus aureus N315 NP 375287
7 Staphylococcus aureus N315 NP 374522
8 Staphylococcus aureus Mu50 BAB58076
9 Staphylococcus aureus MW2 BAB95720
10 Staphylococcus aureus P0A004
11 Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 AA005197
12 Streptomyces acidiscabies AA053226
13 Streptomyces scabies AA053225
14 Streptomyces turgidiscabies AA053227
Результаты исследования
Оценка возможности синтеза NO в ходе денитрификации Чтобы исключить возможность синтеза N0 бактериями L plantarum в ходе денитрификации, провели комплексный анализ возможности этого процесса у исследуемых лактобацилл с использованием средств биоинформатики, классических микробиологических подходов и ЭПР-спектроскопии
В геноме L plantarum WCFS1 обнаружен кластер генов нитратредуктазы narG, narH, narj и narl, кодирующие альфа, бета, дельта и гамма цепи нитратредуктазы, и отсутствие генов нитритредуктазы, катализирующей восстановление нитрита до N0 Скрининг генома исследуемого микроорганизма на наличие гомологов известных нитритредуктаз бактерий выявил два белка с е-value менее 0 01 Sufi (CAD63002) и 1р_2219 (CAD64560) Функция одного из них, Sufi (CAD63002), известна и состоит в участии в процессе клеточного деления Биологическая роль второго белка - lp_2219 (CAD64560) - не определена Проведенный поиск его структурных гомологов установил, что по аминокислотной последовательности он очень сходен с 3-карбоксимуконат циклазой Leuconostoc mesenteroides АТСС 8293 (YP818140) (е-value 4е-102), что позволяет предположить участие белка 1р_2219 в метаболизме углеводородов.
Результаты изучения способности лактобацилл к денитрификации (табл 2) показывают, что исследуемые бактерии не способны вести полный процесс денитрификации, однако могут восстанавливать нитраты до нитритов
Таблица 2
Штамм Нитраты Нитриты, мкг/л Газообразные
(cp ± CT откл ) продукты
денитрификации
L plantarum №52 + 6,97 ± 1,77 -
L plantarum 8P-A3 + 6,94 ± 0,74 -
+ - обнаруживаются в пробе, - - не обнаруживаются в пробе
Чтобы убедиться в отсутствии у L. plantarum нитритредуктазы с низкой каталитической активностью, нами проведена ЭПР-спектроскопия проб, инкубируемых в условиях, благоприятных для денитрификации. В инкубируемых анаэробно и содержащих 20 мМ KN03 пробах на активность нитритредуктазы регистрировали сигнал от комплекса (DETC)2-Fe2+-NO (рис. 1Б), свидетельствующий о присутствии в реакционной смеси оксида азота. Однако увеличение времени инкубации проб приводило к снижению концентрации парамагнитных комплексов, а удаление из реакционной смеси бактерий не влияло на концентрацию N0 в пробах (рис. 1А). По-видимому, данный эффект вызван небиологическим происхождением регистрируемого NO из нитритов в кислой среде [Weitzberg, Lundberg, 1998; Zweier et al., 1999].
S 120
Л100
Я 60 те
t 40
а 20
I 0
0=2.035*0.1)01
Б 4
гЪ
30 м ин 60 м ин 60 м ин, без Вариант опыта бактерий
Рис. 1. (А) - Содержание N0 в пробах Ь. р1ап/агит 8Р-АЗ, инкубируемых анаэробно с КЫОз (20 мМ) в присутствии (светлые столбцы) и в отсутствие (заштрихованный столбец) бактерий. * -достоверно отличается от вариантов с 60 мин инкубацией (р < 0.05). (Б) - Спектр ЭПР клеток /.. р1аЫагит 8Р-АЗ, зарегистрированный с использованием комплекса Ре2+(ОЕТС)2 в качестве спиновой ловушки N0.
Таким образом, в условиях, благоприятных для денитрификации (дефицит кислорода и наличие нитратов в среде культивирования), биологическим путем оксид азота не образуется, что свидетельствует об отсутствии активности фермента нитритредуктазы у L. plantarum 8Р-АЗ. Данные микроорганизмы обнаруживают способность вести лишь первый этап денитрификации, что полностью согласуется с их генетической программой.
Влияние субстрата и ингибиторов NO-синтазы на рост лакгобацилл
Цитотоксичность используемых в работе ингибиторов и субстрата NOS была исследована в различных тест-системах. Сравнение динамики роста L. plantarum 8Р-АЗ и L. plantarum №52 в присутствии и в отсутствие 100 мкМ L-аргинина и 100 мкМ L-NAME (рис. 2) показало, что в данной концентрации эти вещества не оказывают влияние на рост бактерий. Полученные данные нашли подтверждение в результатах экспериментов по определению жизнеспособности бактерий с помощью теста LIVE/DEAD: инкубация бактерий L. plantarum 8Р-АЗ и L. plantarum №52 с 100 мкМ L-аргинина, 100 мкМ L-NAME, 100 мкМ L-NIL или 10 мкМ nNOS ингибитора 1 не влияет на жизнеспособность микробных клеток (рис. 3).
15
§10 Ti
О
О 5
0
0
10
6
«л ° §4
2 0
II
В
Б
8 16 24 32 40 48
- Контроль(А) 100 мкМ L-аргинин (Б) 100 мкМ L-NAME (В)
56 64 72 время, ч
0 8
16 24 32 40 48 56 64 72 время, ч
Рис. 2. Динамики роста культур ¿. р1апшгит 8Р-АЗ (I) и Ь. р1аЫагит №52 (II), инкубируемых в отсутствие (А) и в присутствии (Б) 100 мкМ Ь-аргинина или 100 мкМ Ь-ЫАМЕ (В).
100 80 , 60 " 40 20 0
100 ;
80 ;
5?601 40 i
20 -i
0 f
К
1
□ Живые кл.
2 3 4 S Мертвые кл.
Рис. 3. Токсичность субстрата (1 - 100 мкМ L-аргинин) и ингибиторов NOS (2-100 мкМ L-NAME, 3 - 100 мкМ L-NIL, 4-10 мкМ nNOS ингибитор 1) по отношению к культурам L. plantarum 8Р-АЗ (А) и L. plantarum №52 (Б), определенная с помощью L1VE/DEAD BocLight Bacterial Viability Kits. К - контроль.
Поиск генетических детерминант NO-синтазной активности у лактобацилл
С помощью программы BLAST в геноме исследуемых микроорганизмов обнаружили ряд гомологов bNOSoxy (табл. 1), а именно, 92 пептида, среди которых мы выделили 2 группы белков, предположительно способных осуществлять акт каталитического окисления L-аргинина: собственно оксидоредуктазы (5 белков) и белки с неизвестной функцией (8 белков) (табл. 3). Пептиды, обладающие известной, но отличной от оксидоредуктазной активностью, несмотря на гомологию с bNOSoxy, были исключены как неспособные к выполнению заданной каталитической функции. Проведенные выравнивания белков табл. 3 с известными bNOSoxy, а также тремя различными изоформами NO-синтазы млекопитающих (eNOS Bos taurus (NP 851380), nNOS Homo sapiens (NP 000611), iNOS Rattus norvegicus (NP_036743)) идентифицировали их незначительную гомологию с NOS бактерий и животных в функционально активных сайтах: сайтах связывания гемовой группы, птеридинового кольца тетрагидробиоптерина (ВН4) и субстрата L-аргинина. Однако это не исключает возможности выполнения данными белками каталитической функции NO-синтазы, а низкая степень гомологии может объясняться многообразием семейств NOS,
Таблица 3
Гомологи известных бактериальных NO-синтаз (bNOSoxy) в геноме i plantarum WCFS1
Группа Название белка 1 р1аЫагит \VCFS1 Регистрационный номер белка L plantarum WCFS1 в GenBank Гомологом чего является evalue
Регистрационный номер белка в Genßank Микроорганизм -источник
I Окси- доредук- тазы Короткоцепочечн дегидрогеназа NP_7B4171 NP_835105 Bacillus cereus ATCC 14579 0 29
NP_24I689 Bacillus halodurans C-I25 0 021
034453 Bacillus subtihs 3 0
NP_693612 Oceanobacillus ihevensis HTE831 0 88
AA053226 Streptomyces actdiscabies 22
AA053225 Streptomyces scabies 22
AA053227 Sti eptomyces tuigidiscabies 0 44
Алкоголь-дегидрогеназа NPJ785248 034453 Bacillus subtihs 39
NP_375287 Staphylococcus aureus N315 5 6
Оксидоредуктаза NP_785816 NP_375287 Staphylococcus aureus N315 5 6
Аспартат- семиальдегид- дегидрогеназа NP_784981 BAB58076 Staphylococcus aureus Mu50 2 5
BAB95720 Staphylococcus aureus MW2 2 5
P0A004 Staphylococcus aureus 2 5
Короткоцепочечн дегидрогеназа/ок-сидоредуктаза NP_785994 AA005197 Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 42
II Белки с неизвестной функцией белок 1р_2589 NP_786009 NP_241689 Bacillus halodurans C-125 74
белок 1р 1531 NP 785135 034453 Bacillus subtilis 66
белок 1р 3275 NP 786535 68
белок 1р_0457 NP_784249 Q9RR97 Demococcus radiodurans R1 5 5
белок 1р_0444 NPJ784238 NP_375287 Staphylococcus aureus N315 74
белок 1р 0948 NP 784663 NP_374522 Staphylococcus aureus N315 2 8
белок 1р 2149 NP 785655 3 7
белок !р_3683 NP_786870 AA053227 Streptomyces turgidiscabies 63
зачастую очень различных по аминокислотным последовательностям [Zemojtel et al, 2004]
В геноме L plantarum WCFS1 обнаружен белок флаводоксин (CAD63933), который на 50-57% гомологичен редуктазному домену NOS (NOSred) млекопитающих Сходство аминокислотных последовательностей (рис 4) и идентичность выполняемых функций позволяют с большой долей вероятности ожидать, что флаводоксин может выполнять в клетках лактобацилл роль NOSred
human eNOS VKATILYGSETGRAQSYAQQLG-RLFRKAFDPRVLCMDEYDWSLEHETLVLWTSTFGNGDP
human nNOS VKATILYATETGKSQAYAKTLC-EIFKHAFDAKVMSMEEYDIVHLEHETLVLWTSTFGNGDP
human iNOS VRVTILFATETGKSEALAWDLG-ALFSCAFNPKWCMDKYRLSCLEEERLLLVVTSTFGNGDC
flavodoxin MKAEIIYASLTGNNEEIAEIIONQbREHHVDTNFTEIGQADAFDLPVADLIVIVPYTYGEGDL
human eNOS PENGESFAAALMEMS-//-LGTLRFCVFGLGSRAYPH-FCAFARAVDTRLEELGGERLLQLGQG
human nNOS PENGEKFGCALMEMR-//-LANVRFSVFGLGSRAYPH-FCAFGHAVDTLLEELGGERILKMREG
human iNOS PGNGEKLKKSLFMLK-//—NKFRYAVFGLGSSMYPR-FCAFAHDIDQKLSHLGASQLTPMGEG
flavodoxin PEEGLDFFDDLQDVN-//-LSGTVFGVAGSGDRWYAEDYCKAWEFDHQLETTGAT------QG
-//-LLPGLIHVHRRKMFQATIRSVENLQSSKSTRATI 717 -//-LTQGLSNVHKKRVSAARLLSRQNLQSPKSSRSTI 954 -//-LSKALSSMHAKNVFTMRLKSRQNLQSPTSSRATI 691 -//-VQPLFIDLHPEDADEQRLDDFTTSLIKTATQLGV 117
Рис 4 Выравнивание аминокислотных последовательностей NOS человека (eNOS Homo sapiens (NP__000594), nNOS Homo sapiens (P29475), iNOS Homo sapiens (P35228)) и флаводоксина L plantarum WCFS1 (CAD63933) Символами обозначены идентичные (*), консервативные ( ) и слабо подобные аминокислотные остатки ( )
Компьютерный анализ метаболических путей штамма L plantarum WCFS1 констатировал отсутствие у него ферментов биосинтеза ВН4, однако обнаружил целый ряд метаболических путей, ведущих к образованию тетрагидрофолата (табл 4), который в составе бактериальной NO-синтазы является структурным и функциональным аналогом ВН4 [Adak et al, 2002а, Aâaketal, 2002b]
Таблица 4
Ферменты биосинтеза тетрагидрофолата L plantarum WCFS1
Номер EC Название Регистрац номер белка в базе данных GenBar.k
EC 2 1 2 3 фосфорибозиламиноимидазолкарбоксамвд формиятрансфераза CAD64957
EC 2 11 13 З-метклтетрагидрофочат-гомоцистеин S-метшггрансфераза CAD63851
EC 2 1 2 2 фосфорибозилглидинамид формилгрансфераза CAD64958
EC 2 1 2 9 метионил-тРНК формилтрансфераза CAD64056
EC 1 5 i 3 да гвдрофолат редуктаза CAD64265
EC 2 1 2 1 серии гидроксимегилтрансфераза CAD64690
Таким образом, генетическая программа лактобацилл не исключает наличия у них Ж)-синтазной активности На следующем этапе работы мы экспериментально исследовали способность Ь р1аМагит 8Р-АЗ и Ь р1аШагит №52 синтезировать оксид азота по N0-синтазному пути
human eNOS human nNOS human iNOS flavodoxm
Выявление NO-синтазной активности лактобацилл прямыми методами определения N0
а) Идентификация NO-синтазной активности с помощью ЭПР
ЭПР-исследованию NO-синтазной активности лактобацилл предшествовал экспериментальный подбор спиновой ловушки, который позволил отобрать комплекс Fe (DETC)2 в качестве оптимальной для целей настоящего исследования ловушки.
В пробах на активность NO-синтазы, содержащих L-аргиник и инкубируемых аэробно, регистрировали характерный трехкомпонентный ЭПР сигнал комплекса (DETC)2-Fe2+-NO. Существенно, что концентрация NO повышалась с течением времени инкубации (рис. 5, светлые столбцы), что характерно для ферментативных реакций и подтверждает биологическое происхождение регистрируемого N0. Следует отметить, что в пробах, не содержащих бактерий, также обнаружили оксид азота (рис. 5, заштрихованный столбец), однако, количество образованного N0 в данном случае значительно меньше по сравнению с опытным вариантом на активность NO-синтазы (рис. 5, светлые столбцы). Образование N0 неэнзиматическим путем вероятно можно объяснить известным фактом его синтеза из L-аргинина и Hi02 [Nagase et а!., 1997]. Физиология лактобацилл действительно предполагает их устойчивость к значительным количествам Н2О2 [Lee et al, 2005].
S
г 120 *
0 100 pi-,
z 80 T
1 60
I 40 Г^
„ 0 1-1 —1--->~ -
J 30 мин, +L- 60 мин, +L- 60 мин, +L-арг. арг. арг., без
бактерий Вариант опыта г
Таким образом, с использованием метода ЭПР мы впервые обнаружили, что в аэробных условиях бактерии L. plantarum 8Р-АЗ, подобно клеткам млекопитающих, образуют оксид азота из L-аргинина по NO-синтазному пути.
б) Регистрация NO-синтазной активности флуоресцентным методом
В данной работе мы впервые применили к лактобациллам высоко чувствительный, специфичный и простой в реализации флуоресцентный метод регистрации NO-синтазной активности. Окрашивание DAA и DAF-FM DA клеток L. plantarum 8Р-АЗ и L. plantarum №52 свидетельствует о том, что в исследуемых бактериях присутствует оксид азота (рис. 6). Индикатор внутриклеточного NO DAF-FM DA окрашивает не все клетки культур L. plantarum 8Р-АЗ и L. plantarum №52 (рис. 6Б, Д), вероятно, детектируя неодинаковый уровень N0 в клетках, находящихся на разных этапах
Рис. 5. Содержание N0 в пробах ¿. р1ап1агит 8Р-АЗ, инкубируемых аэробно с Ь-аргиннном (20 мМ) в присутствии (светлые столбцы) и в отсутствие (заштрихованный столбец) бактерий. * - достоверно отличается от вариантов с 30 мин инкубацией и Инкубацией без бактерий (р < 0.05).
клеточного цикла. Обработка предварительно окрашенных ОЛР-ГМ О А лактобацилл Р1, маркерные свойства которого основаны на его проницаемости через мембраны мертвых клеток, показала, что N0-синтазная активность присуща именно клеткам с нарушенной целостностью мембран, что подтверждает сделанное нами предположение об участии сигнальной молекулы оксида азота в сопротивляемости лактобацилл различным стрессам (рис. 7).
БАА БАР-РМ ОА контроль
А ■ ' . ^ V 1. ; к. -V; 1!
1 - — 1
Рис. 6. Уровень оксида азота в клетках р1ап1агит 8Р-АЗ (А, Б, В) и р1апШгит №52 (Г, Д, Е), установленный с помощью БАА (весь оксид азота пробы) (А, Г) и ЭАР-РМ БА (внутриклеточный оксид азота) (Б, Д); В, Е—контроль на автофлуоресценцию бактерий, не содержащий красителя. Масштабная линейка - 5 мкм.
ОАР-РМ ПА Р1 совмещение
Рис. 7. Внутриклеточный оксид азота в бактериях Ь. р1аШагит 8Р-АЗ. А - уровень N0 в клетках лактобацилл, установленный с помощью БАР-РМ ОА; Б - бактерии с нарушенной целостностью мембраны, окрашенные Р1. Правое изображение (совмещение) получили с помощью компьютерного совмещения левого и центрального изображений. Желтое окрашивание соответствует совместной локализации флуорофоров. Масштабная линейка—5 мкм.
В работе флуоресцентным методом обнаружена способность бактерий Ь. р1ап1агит 8Р-АЗ и Ь. р1апШгит №52 синтезировать АФК. При этом выявлены субпопуляции клеток, различающихся по содержанию АФК. Добавление к бактериям, окрашенным карбокси-Н2ВСРВА, индикатора клеточной гибели Р1 показало, что в бактериях с нарушенной целостностью мембран уровень АФК резко снижен по сравнению с нативными клетками (рис. 8).
Kap6oKCH-H,DCFDA PI совмещение
Рис. 8. АФК в бактериях Ь. р!апШгит 8Р-АЗ. А - уровень АФК в клетках лактобацилл, установленный с помощью карбокси-НгССРВА; Б - бактерии с нарушенной целостностью мембраны, окрашенные Р1. Правое изображение (совмещение) получили с помощью компьютерного совмещения левого и центрального изображений. Масштабная линейка-10 мкм.
Особенности влияния Ь-аргинина и ингибиторов ИО-синтазы млекопитающих на Ж)-синтазную активность лактобацилл
В работе исследована индукция ИО-синтазной активности Ь. р1ап1агит 8Р-АЗ и Ь. р1ап1атт №52 экзогенным Ь-аргинином («парадокс Ь-аргинина»). Внесение в среду роста Ь. pla.nta.rum 8Р-АЗ 100 мкМ Ь-аргинина приводило к увеличению уровня общего N0 по сравнению с клетками, инкубируемыми без аргинина, при этом внутриклеточная концентрация оксида азота и АФК не менялась (рис. 9). Поскольку Ь-аргинин не активирует рост бактерий (см. рис. 2, 3), вышеописанное усиление флуоресценции при добавлении этой аминокислоты не связано с ее воздействием на рост культуры. Таким образом, с помощью флуоресцентного метода впервые установили, что в клетках Ь. р1апШгит 8Р-АЗ, как и в клетках млекопитающих, происходит увеличение продукции оксида азота под воздействием экзогенного Ь-аргинина («парадокс Ь-аргинина»).
■ NO ^Внутриклеточный NO □ АФК
Рис. 9. Влияние субстрата NOS L-аргинина (100 мкМ) и ингибитора NOS L-NAME (100 мкМ) на синтез NO и АФК бактериями L. plantarum 8Р-АЗ. Уровень оксида азота и АФК определяли с помощью DAA (общий уровень NO), DAF-FM DA (внутриклеточный NO) и карбокси-H2DCFDA (концентрация АФК). * -достоверно отличается от контроля (р < 0.05).
В исследовании влияния ингибиторов NOS млекопитающих на NO-синтазную активность лактобацилл использовали ингибиторы трех различных изоформ NOS млекопитающих: конкурентный ингибитор eNOS L-NAME, iNOS - L-NIL и nNOS - nNOS ингибитор I. Присутствие в среде инкубации лактобацилл 100 mkML-NAME, 100 мкМ L-NIL или ЮмкМ
nNOS ингибитора I не оказывало существенного ингибирующего действия на NO-синтазную активность L. plantarum 8Р-АЗ и L. plantarum №52.
L-NAME не оказывает влияние на образование NO клетками L. plantarum 8Р-АЗ независимо от того, происходит оно из эндогенного аргинина или вызвано добавлением аминокислоты извне (рис. 9). Отметим также, что внесение L-NAME в среду роста не изменяло концентрацию внутриклеточного NO и АФК (рис. 9).
В клетках L. plantarum №52 уровень оксида азота и АФК не изменяется под действием 100 мкМ L-аргинина. На его значении не сказывалось также внесение в среду роста 100 мкМ ингибитора L-NAME.
Анализ иммунологических свойств NO-синтазы лактобацилл
Вестерн-блот анализ с использованием антител млекопитающих к трем известным изоформам NOS (nNOS, iNOS и eNOS) показал отсутствие экспрессии ферментов nNOS, iNOS и eNOS у L. plantarum №52.
Характеристика физиологической активности оксида азота в клетках различного уровня организации
а) Роль NO в культурах клеток эукариот в условиях индуцированного рибонуклеазой Bacillus intermedius стресса
Исследованию физиологической активности NO у бактерий предшествовала оценка цитопротекторного потенциала этого агента в клетках эукариот. С этой целью определяли NO-синтазную активность в фибробластах мыши в условиях стресса, индуцированного биназой (рис. 10).
300 ч250
с, 200 О
^150
ТО
S 100
□ Контроль Ш Биназа (300 мкг/мл)
NIH3T3
ras-NIH3T3
NO
Внутрикл. NO
Т Г ц
H ■
NO
Внутрикл. NO
Рис. 10. Влияние биназы (300 мкг/мл) на образование оксида азота в клетках Н1ЫЗТЗ и газ-N1113X3. Содержание N0 определяли с помощью окрашивания флуоресцентными индикаторами оксида азота ОАА (N0) и ОАР-РМ ОА (внутриклеточный N0).
Мы показали, что способность образовывать N0 присуща обоим исследованным типам клеток (МНЗТЗ и газ-МНЗТЗ), однако NO-cинтaзнaя активность существенно выше в клетках, экспрессирующих Яаз-белок по сравнению с нормальными фибробластами (рис. 10, светлые столбцы). Длительное культивирование (66 ч) с биназой (300 мкг/мл) всегда приводит к значительному увеличению уровня N0 (рис. 10, темные столбцы), что позволяет рассматривать последний как сигнал активации защитных функций клетки.
б) Влияние температурного стресса на NO-синтазную активность лактобацилл
Для индукции температурного стресса использовали нагревание до 80°С в течение 30 мин, зарекомендовавшее себя как летальная обработка для лактобацилл [Alakomi et al., 2005]. Жизнеспособность исследуемых микроорганизмов определяли флуоресцентным окрашиванием с помощью теста LIVE/DEAD, а также классическим чашечным методом. Нагревание губительным образом сказывалось на жизнеспособности клеток, что выражалось в характерной желто-оранжевой флуоресценции клеток и снижении на 100% количества колоний на чашках по сравнению с контрольным вариантом, не подверженным действию высокой температуры. Известный денатурирующий эффект высоких температур на белковые структуры нашел подтверждение в инактивации эстераз бактерий, которую зафиксировали по исчезновению флуоресценции у окрашенных DAF-FM DA, нагретых клеток лактобацилл (рис. 11В, Г). DAA идентифицировал увеличение концентрации оксида азота в клетках лактобацилл после нагревания (рис. 11 А, Б). Это наблюдение находится в русле современного представления об NO как о сигнальной молекуле, участвующей в регуляции противостояния бактерий различным стрессорам, в том числе и температурным [Malyshev et al., 1995]. Существенно, что повышение уровня NO отмечалось практически во всех клетках популяции, что указывает на высокую функциональность этого агента в повышении толерантности бактерий к нагреванию.
Оксид азота Внутриклеточный оксид азота
Рис. 11. ЫО-синтазная активность в нативных (А, В) и подвергшихся нагреванию до 80°С в течение 30 мин (Б, Г) клетках Ь. р1аШагит №52. Общий уровень N0 (А, Б) определяли с помощью ЭАА, внутриклеточный N0 (В, Г) - с помощью БАР-РМ БА. Масштабная линейка-5 мкм.
в) Оценка влияния индуцированного Ь-аргинином синтеза N0 на формирование Б-слояуЬ. р1аМагит
При выращивании на среде с добавлением 10 мМЬ-аргинина у Ь. р1аШагит 8Р-АЗ с помощью метода АСМ наблюдали сглаживание поверхности клеток, свидетельствующее о формировании у них Б-слоя (рис. 12Б). Добавление в среду культивирования лактобацилл положительно заряженной, но не участвующей в метаболизме N0 аминокислоты Ь-гистидина (10 мМ) не приводило к изменению поверхности клеток (рис. 12В);> что исключает вклад катионности Ь-аргинина в указанный эффект. Так как ранее была показана возможность индукции синтеза N0 Ь-аргинином, мы
предполагаем, что роль регуляторного фактора, запускающего экспрессию генов S-белков, выполняет оксид азота.
4>Y VC
*■' w. л\« . >» 'J&
Рис. 12. Влияние 10 мМ L-аргинина (Б) и 10 мМ L-гистидина (В) на морфологию клеток L. plantarum 8Р-АЗ. В контрольном варианте (А) бактерии выращивали на среде MRS без дополнительного внесения аминокислот. АСМ-изображения получены полуконтактным методом на воздухе при комнатной температуре в режиме сигнала рассогласования с разрешением 1024х 1024 точек. Размер скана 3x3 мкм.
Обсуждение результатов
Альтернативные пути биосинтеза N0 у L. plantarum
Детекция NO-синтезирующей способности у L. plantarum прямыми методами регистрации оксида азота, а также компьютерный анализ генетической обусловленности этого процесса, вместе с данными ряда биохимических и микробиологических исследований, позволили по-новому взглянуть на процессы биосинтеза оксида азота у бактерий этого вида. Как известно, в мире прокариот возможны два пути синтеза N0: денитрификация [Zumft, 1997] и катализируемое ферментом NO-синтазой окисление L-аргинина [Salard et al., 2006]. Нами была рассмотрена возможность протекания этих процессов у L. plantarum.
Денитрификационный путь синтеза NO. Анализ данных литературы показал, что диссимиляционная нитритредукция не может быть исключена как источник оксида азота у L. plantarum, а денитрификационный путь метаболизма у лактобацилл этого вида требует дополнительного, более детального изучения. Мы показали, что при росте в микроаэрофильных условиях и при наличии нитратов в среде инкубации L. plantarum экспрессируют нитратредуктазу. Это наблюдение находится в соответствии с генетической программой бактерий и не противоречит данным литературы [Wolf, Hammes, 1988]. Однако активность диссимиляционной нитритредуктазы в условиях, благоприятных для денитрификации (дефицит кислорода и наличие нитратов в среде культивирования), зафиксирована не была, а также не были обнаружены гены этого фермента. Проведенные исследования, с одной стороны, исключают возможность синтеза NO бактериями L. plantarum в ходе денитрификации, а с другой - в целом проливают свет на данный метаболический путь у микроорганизмов этого вида
Синтез NO из L-аргинина NO-синтазой. Результаты ЭПР-спектроскопии (рис. 5) и флуоресцентного окрашивания (рис. 6) свидетельствуют о том, что бактерии L. plantarum обнаруживают NO-синтазную активность, однако этот
процесс у них имеет ряд особенностей, отличающих его от такового млекопитающих и прокариот - обладателей bNOSoxy Так, мы показали, что индукция NOS экзогенным L-аргинином («парадокс L-аргинина») у L plantarum в целом возможна (рис 9), однако в отличие от NOS большинства других организмов зависит также от неких дополнительных факторов Причины, обуславливающие увеличение продукции N0 клетками млекопитающих при добавлении экзогенного L-аргинина, остаются невыясненными Предполагают, что оно связано с наличием эндогенных ингибиторов NOS, в частности, асимметричного диметиларгинина [Tsikas et al, 2000b] Возможно, биосинтез таких эндогенных ингибиторов NOS у L plantarum кодируют плазмидные гены, которые варьируют у представителей различных штаммов одного вида, в результате чего мы наблюдаем различия в способности к индукции NOS аргинином у двух штаммов L plantarum
Действие ингибиторов NO-синтазы млекопитающих на NO-синтазную активность бактерий На отличия NOS L plantarum от известных NO-синтаз животных указывают результаты, полученные нами при изучении эффектов избирательных ингибиторов трех различных изоформ NOS млекопитающих в отношении NO-синтазной активности L plantarum Отметим, что ингибиторы NOS млекопитающих очень часто оказываются неэффективны в отношении NO-синтазной активности бактерий [Cohen, Yamasaki, 2003, Creus et al, 2005] Это может быть связано с деградацией ингибиторов ферментами микроорганизмов [Choi et al, 1998], а также невысокой проницаемостью бактериальных мембран для ингибиторов NOS млекопитающих [Wach et al, 2005] Наиболее вероятную причину неэффективности используемых в работе ингибиторов NOS в отношении NO-синтазной активности L plantarum мы видим в структурных и функциональных различиях между NOS млекопитающих и лактобацилл Они становятся еще более очевидными, если принять во внимание установленный с помощью Вестерн-блот гибридизации факт отсутствия иммунологического родства NO-синтазы L plantarum с NOS млекопитающих
Компьютерный поиск генетических детерминант NO-синтазы лактобацилл Обнаруженный экспериментально бактериальный ферментативный синтез NO из L-аргинина находит подтверждение в результатах компьютерного анализа генома L plantarum WCFS1 Суммированные и подкрепленные данными литературы, они позволяют в общем виде представить NO-синтазную систему L plantarum (табл 5)
Результаты исследования позволяют считать, что L plantarum обладают специфической NO-синтазной системой, отличной от известных NOS про- и эукариот, подобно Helix pomatia [Huang et al, 1997] и Arabidopsis thahana [Guo et al, 2003] - организмам, не имеющим генов NOS, в клетках которых, тем не менее, обнаружена NO-синтазная активность Полученные данные предполагают важность дальнейших исследований регуляторной роли NO у лактобацилл, особенно в связи с их высокой практической значимостью как пробиотиков, а также находятся в русле современной концепции [Свердлов,
1999] о приоритете функциональной активности белков над их генетической программой
Таблица 5
Строение NO-синтазы L plantarum__
№ Элемент NOS млекопитающих Аналог элемента NOS у L plantarum Примечание (Сведения об аналоге)
1 Редуктазньш домен (NOSred) Флаводоксин Высокая гомология флаводоксина с NOS млекопитающих (50-57%) и идентичность выполняемых функций позволяют с большой долей вероятности ожидать, что флаводоксин может выполнять в клетках L plantarum роль NOSred
2 Оксигеназный домен (NOSoxy) Не установлен Обнаружен ряд гомологов NOSoxy (см табл 3) с низкой гомологией в функционально активных сайтах Тем не менее, активность NOS была неоднократно зарегистрирована у L plantarum прямыми методами определения NO
3 Гем Гем Лактобададлы самостоятельно синтезировать гем не способны он потребляется из среды культивирования
4 Тетрагидробиоптерин (ВН4) Тегграгвдрофолат Синтезируется серией ферментов L plantarum (см табл 4)
5 Кальмодулин Неизвестен Гомолог кальмодулина эукариот обнаружен только у некоторых грамположительных бактерий с высоким GC-co держанием fYang, 20011
6 FMN FMN Стандартный компонент метаболической сети лактобацилл
7 FAD FAD
8 NADPH NADPH
Физиологическая роль NO у лактобацилл
Среди многообразия физиологических функций NO можно выделить два основных взаимоисключающих направления Во-первых, NO является мощным цитотоксическим агентом [Fang, 2003] Во-вторых, NO может играть роль одного из ключевых регуляторов различных физиологических процессов в основном за счет участия в передаче сигналов и регуляции транскрипции генов
NO как цитогпоксический агент Губительное действие высоких концентраций NO на микробные клетки известно и не вызывает сомнений [MacMicking et al, 1997]. Тем не менее, индуцированная L-аргинином повышенная генерация N0 не оказывала влияния на рост и жизнеспособность продуцента выращивание в присутствии 100 мкМ L-аргинина не влияло на кривые роста лактобацилл (рис 2) и соотношение нативных и поврежденных клеток (рис ЗА) При этом отмечали увеличение общего содержания оксида азота в пробах, но внутриклеточная концентрация NO и АФК оставалась без изменений (рис 9) По-видимому, лактобациллы обладают системой защиты от повышенных концентраций NO и АФК путем элиминации из клеток избытка
токсических агентов Не исключено, что данная адаптивная система играет существенную роль в выживании бактерий в естественных местах их обитания - желудочно-кишечном тракте человека и животных [Molm et al, 1993, Ahrne etal, 1998].
NO как сигнал к адаптации Удивительная консервативность NOS-подобных белков в процессе эволюции указывает на важную физиологическую функцию NO, обусловившую наличие NOS у подавляющего большинства живых организмов Поэтому логично ожидать, что роль NO-синтазной системы у лактобацилл не ограничивается синтезом потенциально токсичной молекулы Мы показали, что бактерии, целостность оболочки которых оказалась нарушена, характеризуются повышенными внутриклеточными концентрациями N0 (рис 7) Однако, АФК в таких клетках отсутствуют (рис 8) Не исключено, что представленные данные являются первым подтверждением этапности процесса клеточной гибели и определяют основополагающую роль в этом явлении свободнорадикальных соединений N0 и АФК С другой стороны, представленные данные по внутриклеточной локализации АФК у лактобацилл находятся в соответствии с современной теорией, признающей наряду с токсическим эффектом АФК цитопротекторное действие этих агентов [Кулинский, 1999] Нами обнаружено присутствие АФК в нативных клетках L plantarum, предполагающее определенную физиологическую функцию в них этих веществ Полученные результаты не противоречат данным литературы, указывающим на возможность присутствия внутри бактерий рода Lactobacillus некоторого количества АФК [Lee et al, 2005] DAA детектировал наличие оксида азота во всех клетках культуры (рис 6А, Г), что указывает на высокую функциональность этого агента
Представление об NO как о важном стресс-лимитирующем факторе получило дальнейшее развитие в проведенном нами исследовании влияния высокотемпературного воздействия на NO-ергическую систему лактобацилл Мы показали, что для подвергшихся нагреванию клеток L plantarum характерно увеличение продукции N0 (рис 11) Существенно, что аналогичная реакция сопровождает тепловой шок у млекопитающих [Malyshev et al, 1995] и является одним из ключевых звеньев в адаптации клеток животных [Малышев, Манухина, 1998] Полагаем, что активация биосинтеза N0 у L plantarum при температурном воздействии также происходит с целью адаптации к повышению температуры
Свидетельством универсальности NO-ергических систем адаптации клеток различного эволюционного уровня явилась наблюдаемая активация NOS в фибробластах мыши под действием токсичных концентраций биназы (рис 10) Биназа способна оказывать на клетки апоптозиндуцирующее действие [Зеленихин с соавт, 2005], которое сопровождается повышением в них уровня N0 (рис 10) Поскольку апоптоз рассматривают как раннюю стадию токсического поражения клеток [Corcoran et al, 1994], мы склонны считать, что наблюдаемая активация синтеза NO служит стресс-лимитирующим механизмом, направленным на повышение защитных функций клеток
Принимая во внимание известные токсические эффекты N0 [Маеда, Акаике, 1998], мы не исключаем, что чрезмерная активация этого механизма может вести к повреждающему действию на клетки, и стресс-реакция из звена адаптации превратится в звено патогенеза
Исходя из полученных данных, свидетельствующих об активации NOS в фибробластах под действием биназы (рис 10) и в клетках L plantarum при высокотемпературном воздействии (рис 11), мы рассматриваем оксид азота NO-синтазного происхождения как универсальный фактор стрессорного и адаптивного ответов клеток различного уровня организации
NO как индуктор образования S-слоя у лактобацшл В связи с перспективами использования L plantarum в качестве пробиотических препаратов, актуальными являются исследования факторов, определяющих функциональную активность этих микроорганизмов, в частности, адгезивных свойств бактерий Мы впервые показали, что индуцированный L-аргинином синтез NO специфически влияет на морфофизиологическое состояние поверхности L plantarum 8Р-АЗ, приводя к формированию S-слоя (рис 12) Полученные результаты согласуются с данными литературы, косвенно свидетельствующими о возможности образования S-слоя у бактерий этого вида [Kahala, Palva, 1999, Siezen et al, 2006, Talion et al, 2007] Основываясь на известной способности NO участвовать в регуляции активности генетического аппарата [Nunoshiba et al, 1993, Pantopoulos et al, 1994, Shyy et al, 1994], мы предполагаем, что синтезируемый при ферментативном окислении L-аргинина оксид азота выполняет роль регуляторного фактора, запускающего экспрессию генов S-белков
В целом, результаты проведенных исследований определяют важную функцию NO-синтазной системы L plantarum в пробиотической активности бактерий этого вида Токсическая молекула оксида азота расширяет спектр известных бактерицидных и бактериостатических веществ, благодаря которым лактобациллы - симбионты человека и животных проявляют антагонистическую активность по отношению к патогенным и условно-патогенным бактериям Эффективность пробиотиков во многом зависит от успешной колонизации желудочно-кишечного тракта входящими в их состав бактериями, которая, в свою очередь, определяется адгезивными свойствами микроорганизмов [Schar-Zammaretti, Ubbink, 2003] Как известно, последние в значительной степени детерминированы наличием у бактерий S-слоев [Schneitz et al, 1992, Toba et al, 1995, Hynonen et al, 2002, Lorea et al, 2002] По-видимому, NO-синтазная система L plantarum влияет на способность бактерий^ прикрепляться к эпителию животных и человека за счет участия в регуляции образования S-слоя белков на поверхности микроорганизмов Подчеркнутая функциональная активность NO-синтазной системы у промышленно значимой группы лактобацилл обуславливает важность проведенных исследований как способствующих развитию пробиотикотерапии — стратегической ветви современной медицины, направленной на поддержание и восстановление здоровья человека
выводы
1 У Lactobacillus plantarum денитрификационный путь синтеза оксида азота отсутствует в связи с отсутствием энзиматической активности и генетических детерминант нитритредуктазы - фермента ключевой стадии диссимиляционной нитратредукции
2 Впервые комплексом экспериментальных методов прямой регистрации оксида азота, а именно, электронным парамагнитным резонансом и флуоресцентной микроскопией, обнаружен и охарактеризован специфичный для лактобацилл NO-синтазный путь образования оксида азота
3 Впервые проведен компьютерный анализ и выявлены геномные детерминанты NO-синтазного пути образования оксида азота у Lactobacillus plantarum, обеспечивающие биосинтез редуктазного домена и необходимых кофакторов и простетических групп NOS
4 Оксид азота NO-синтазного происхождения служит сигналом активации защитных функций клеток различного эволюционного уровня, поскольку его продукция усиливается в условиях стресса, вызванного (а) экзогенными токсикантами (РНКазой Bacillus intermedins) в культуре фибробластов, (б) высокотемпературным воздействием на бактерии Lactobacillus plantarum
5 Лактобациллы обладают системой защиты от токсического действия генерируемого ими оксида азота, связанной с его элиминацией из клетки через цитоплазматическую мембрану
6 Впервые методом атомно-силовой микроскопии у Lactobacillus plantarum установлено наличие на поверхности клетки S-слоя белков, экспрессия которых происходит в условиях активации NO-синтазы и связана с повышением биосинтеза оксида азота
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1 Яруллина, Д.Р. Альтернативные пути образования оксида азота у лактобацилл обнаружение возможной NO-синтазной активности методом ЭПР [Текст]/ Д Р Яруллина, О Н Ильинская, А В Аганов, Н И Силкин, Д Г Зверев // Микробиология -2006 -Т 75,№6 -С 731-736
2 Яруллина, Д.Р. Детекция NO-синтазной активности лактобацилл методом флуоресцентного окрашивания (краткое сообщение) [Текст]/ Д Р Яруллина, О Н Ильинская // Микробиология - 2007 - Т 76, № 4 -С 570572
3 Яруллина, Д.Р. Геномные детерминанты биосинтеза оксида азота у Lactobacillus plantarum потенциальные возможности и действительность [Текст]/ Д Р Яруллина, О Н Ильинская // Молекулярная биология - 2007 - Т 41,№5 -С 900-907
4. Яруллина, Д.Р. Оксид азота как новая регуляторная молекула и конечный продукт денитрификации [Текст]/ ДР Яруллина, ОН Ильинская, Н И Силкин // Новые биокибернетические и телемедицинские технологии 21
века дай диагностики и лечения заболеваний человека Матер междисц конф с междунар участием - Петрозаводск, 2003 -С 68
5 Яруллина, Д.Р. Оксид азота NO-синтазного происхождения у лакгобацилл [Текст]/ ДР Яруллина, Д Г Зверев, ОН Ильинская // Вестник Татарстанского отделения Российской Экологической Академии - 2004 - 4 (22) - С 11-14
6 Яруллина, Д.Р. Перспективы использования NO-синтезирующих бактерий в разработке фармакологических препаратов [Текст]/ ДР Яруллина, Д Г Зверев, НИСилкин, ОН Ильинская // Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии Матер научн конф -Казань, 2004 - С 91-92
7 Смоленцева, О.А. NO-синтезирующие лактобациллы как биогенный источник оксида азота для фармакологических препаратов [Текст]/ О А Смоленцева, Д Р Яруллина. Д Г Зверев, ОН Ильинская // Сб тез 79-ой всерос студ конф , посвящ 1000-летию Казани - Казань, 2005 - С 77
8 Яруллина, Д.Р. Идентификация NO-синтезирующих систем у бактерий рода Lactobacillus методом ЭПР-спектроскопии [Текст]/ Д Р Яруллина, Д Г Зверев, ОН Ильинская // Биология - наука XXI века Сб тез 9-ой Междунар Пущинской школы-конф молодых ученых - Пущино, 2005 - С 223
9 Яруллина, Д.Р. Определение активности бактериальной NO-синтазы методом ЭПР [Текст]/ Д Р Яруллина, Д Г Зверев, О Н Ильинская // Материалы и технологии XXI века Тез докл V Научн конф научно-образоват центра КГУ-Казань,2005 -С 91
10 Yarullina, D.R. Lactobacilli synthesize nitric oxide through nitric oxide synthase system [Text]/ D R Yarullma, О N Ilinskaya, NI Silkin, К Beuerlein // Microbial diversity, current situation, conservation strategy and biotechnological potentialities Abstr II International conference - Perm-Kazan-Perm, 2005 - P 213214
11 Яруллина, Д.Р. Идентификация NO-синтазной активности у лактобацилл методами ЭПР-спектроскопии и флуоресцентного окрашивания [Текст]/ Д Р Яруллина, О Н Ильинская, Н И Силкин, Д Г Зверев, А В Аганов // Ученые записки Казанского государственного университета Сер Естественные науки -2006 - Т 148, Кн 1 - С 57-70
12 Yarullma, D.R. Production of nitric oxide by gastrointestinal commensal lactobacilli [Text]/ DR Yarullma, ON Ilinskaya, NISiikm, KBeuerlem // Acta Physiologica Abstr The International Meeting of the German Physiological Society and the Federation of European Physiological Societies - V 186, Supplement 1 -2006 -Munich,2006 -P 158
13 Смоленцева, О.А. Применение ЭПР-спектроскопии для определения NO в клетках стрептомицетов [Текст]/ О А Смоленцева, Д Р Яруллина. Д Г Зверев, О Н Ильинская // Актуальные проблемы науки и образования Матер молодежи научно-практ конф - Зеленодольск, 2006. - С 59-62
14 Смоленцева, О.А. Применение метода ЭПР-спектроскопии для регистрации NO-синтазной активности у актиномицетов рода Streptomyces [Текст]/ О А Смоленцева, Д Р .Яруллина // Экология России и сопредельных
территорий Экологический катализ Матер XI Междунар экологич студенч конф -Новосибирск,2006 -С 97-98
15 Яруллина, Д.Р. NO-синтазный путь образования оксида азота у комменсальных кишечных лакгобацилл [Текст]/ Д Р Яруллина, О Н Ильинская // Ломоносов - 2007 Тез докл Междунар конф студентов, аспирантов и молодых ученых, секция Биология -Москва, 2007 -С 124-125
16 Смоленцева, О.А. Применение метода атомно-сшювой микроскопии в исследовании свойств поверхности медицински значимых лактобацилл, ферментативно синтезирующих оксид азота [Текст]/ О А Смоленцева, Д Р Яруллина, Д С Налимов, О А Коновалова, О Н Ильинская // Материалы и технологии XXI века Тез докл VII Научн конф научно-образоват центра КГУ - Казань, 2007 -С 117
17 Смоленцева, О.А. Молекула оксида азота (NO) в метаболизме Lactobacillus plantarum синтез, влияние на поверхностные структуры и жизнеспособность продуцента [Текст]/ О А Смоленцева, Д Р Яруллина. Д С Налимов, О А Коновалова, О Н Ильинская // Структура и динамика молекулярных систем Сб тез XIVBcepoc конф - Казань, 2007 - С 217
Автор выражает глубокую признательность научному руководителю проф О Н Ильинской за поддержку и внимательное отношение к работе, проф ФДрайеру и доктору К Бойерляйну (Институт фармакологии, г Гиссен, Германия) за возможность проведения ряда экспериментов на базе Института, доц Н И Силкину (каф электроники и радиоспектроскопии КГУ) за помощь в проведении ЭПР-спектроскопии, доц О А Коноваловой (каф оптики и нанофотоники КГУ) за постановку экспериментов гю атомно-силовой микроскопии, доц В Г Изотову и доц ЛМСитдиковой (каф полезных ископаемых и разведочного дела КГУ) за проведение сканирующей электронной микроскопии, Р А Шурхно (Центр аналитических исследований ГНУ «ТатНИИ РАСХН», г Казань) за предоставление штаммов лактобацилл, доц. ВГШтырлину (НИЛ координационных соединений каф неорганической химии Химического института им А М Бутлерова, г Казань) за приготовление концентрационной серии Си2+(ВЕТС)г
Отпечатано с готового оригинал-макета
В ООО «Стандарт Инвест» 420095, г Казань, ул Восстания, 100
Заказ № 233 от 1 08 2007 г Формат 60x84 1/16 Усл. печ л 1,2 Бумага офсет 80 г Печать ризографическая Тираж 120
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Яруллина, Дина Рашидовна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Синтез N0 у бактерий.
1.1.1. Образование N0 в процессе денитрификации.
1.1.2. NO-синтазная система эукариот и прокариот.
1.2. Физиологическая роль N0 у прокариот.
1.2.1. Значение экзогенного N0 для микробной клетки.
1.2.2. Сигнальная функция бактериального N0.
1.2.3. Физиологическая роль бактериального оксида азота NO-синтазного происхождения.
1.3. Методы идентификации N0 в биосистемах.
1.4. Морфологические особенности поверхностных структур лактобацилл.
Введение Диссертация по биологии, на тему "NO-синтазная активность лактобацилл"
Актуальность проблемы. В последние несколько десятилетий проблема исследования оксида азота является одним из наиболее активно развивающихся направлений биомедицинских исследований [Ванин, 1998]. Лавинообразный рост публикаций по биологии N0, начавшийся с конца 80-х годов, позволил редакции журнала «Science» в 1992 г. провозгласить N0 молекулой года [Koshland, 1992]. Спустя несколько лет в 1998 г. группа американских ученых была удостоена Нобелевской премии в области физиологии и медицины за выяснение роли N0 как сигнальной молекулы в регуляции сердечно-сосудистой системы. Непрерывно вырабатываемый в организме животных и человека ферментативным путем из L-аргинина, оксид азота является одним из универсальных регуляторов клеточного и тканевого метаболизма. Наряду с регуляторными функциями N0 обнаруживает также цитотоксическую/цитостатическую активность, выступая в качестве одного из основных эффекторов системы клеточного иммунитета [Alderton et al., 2001].
В отличие от эукариотического, процесс бактериального синтеза N0 еще далек от полного понимания. Лактобациллы - это одни из немногих микроорганизмов, у которых обнаружен альтернативный денитрификации N0-синтазный путь образования оксида азота [Adawi et al, 1997; Morita et al, 1997]. Бактерии рода Lactobacillus представляют собой важный компонент естественной микрофлоры кишечного и урогенитального трактов человека и животных, где они подавляют рост патогенных микроорганизмов, способствуют регенерации эпителия слизистой оболочки, оказывают иммуномодулирующее действие [Orrhage, Nord, 2000]. Высокая биологическая активность микроорганизмов этой группы обусловила их широкое использование в производстве продуктов питания и промышленно важных пробиотических препаратов [Nguyen et al, 2007]. В связи с вышеизложенным особую актуальность приобретают исследования, направленные на выяснение молекулярных механизмов, лежащих в основе антагонистических свойств лактобацилл. Поскольку L. plantarum предположительно способны синтезировать оксид азота ферментативным путем из L-аргинина [Adawi et al., 1997], есть все основания полагать, что этот агент, синтезируемый симбионтами человека и животных, может оказывать серьезное воздействие на их физиологическое состояние. Изучение закономерностей биосинтеза оксида азота комменсальными кишечными бактериями L. plantarum позволит разработать фундаментальные основы практического манипулирования внутриклеточными регуляторами на молекулярном уровне и наметить конкретные подходы к использованию пробиотических препаратов для этиотропного лечения заболеваний человека и животных, обусловленных теми или иными отклонениями в образовании N0.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явился поиск альтернативного пути образования оксида азота, отличного от денитрификации, подтверждение его наличия на основе генетического анализа и оценка физиологической роли N0 у лактобацилл.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
1. Проанализировать возможность образования оксида азота у Lactobacillus plantarum в процессе диссимиляционной нитритредукции, а также небиологическим путем.
2. На генетическом уровне оценить потенциальную возможность проявления NO-синтазной активности у Lactobacillus plantarum.
3. Выявить и охарактеризовать NO-синтазную активность у Lactobacillus plantarum прямыми методами регистрации оксида азота (ЭПР, флуоресцентное -окрашивание и микроскопия), а также с помощью иммунологических подходов.
4. Оценить возможность ингибирования бактериальной NO-синтазы классическими ингибиторами NO-синтазы эукариот.
5. Выявить влияние прокариотической NO-синтазной системы на рост и жизнеспособность продуцентов, а также морфофизиологическое состояние поверхности клеток.
6. Установить роль оксида азота NO-синтазного происхождения как универсального фактора стрессорного и адаптивного ответов клеток различного уровня организации в условиях токсического и температурного стресса.
Научная новизна. Методом ЭПР-спектроскопии и флуоресцентного окрашивания впервые показано, что L. plantarum обладают специфической NO-синтазной активностью, отличной от таковой млекопитающих и бактерий обладателей bNOSoxy. Впервые приведены убедительные доказательства того, что исследуемые микроорганизмы не образуют N0 в процессе денитрификации. Впервые использован метод окрашивания флуоресцентными красителями для регистрации молекулы оксида азота в метаболизме лактобацилл. В работе впервые с помощью методов биоинформатики проведен системный анализ генетической обусловленности биосинтеза оксида азота с целью доказательства NO-синтазного происхождения N0 у L. plantarum. Намечены подходы к оценке физиологического смысла образования оксида азота клетками лактобацилл. Установлено, что индуцированный L-аргинином синтез N0 нетоксичен для продуцента, но приводит к изменению морфофизиологического состояния поверхности клеток. Впервые получены свидетельства наличия у L. plantarum S-слоя, обнаруживаемого в условиях активации NO-синтазы. Впервые приведены данные, указывающие на участие микробного N0 в стресс-реакциях бактерий, позволяющие рассматривать оксид азота как универсальный фактор стрессорного и адаптивного ответов клеток различного уровня организации. Представленные результаты являются первым шагом на пути к направленному исследованию биологической роли N0 у лактобацилл, которые имеют важное значение для медицины и промышленной микробиологии.
Практическая значимость. Перспективы внедрения результатов работы обусловлены двумя аспектами: функциональной активностью N0 и высокой промышленной и медицинской значимостью объекта исследования -лактобацилл. Ввиду того, что оксид азота обладает большим набором функций в организме, недостаточная или чрезмерная его продукция лежит в основе многих серьезных заболеваний и патологических состояний [Marin, Rodriguez-Martinez, 1997]. Одно из перспективных направлений современной биомедицины - разработка фармакологических средств, способных влиять на метаболизм этого агента и его уровень в клетках и тканях [Ванин, 2000]. В частности, большие надежды связываются с пробиотикотерапией. Бактерии L. plantarum входят в число микроорганизмов, наиболее часто используемых для производства отечественных пробиотиков и продуктов функционального питания. Поэтому исследование NO-синтазной активности у данного вида лактобацилл имеет несомненную практическую значимость. В настоящей работе проведен комплексный анализ способности L. plantarum синтезировать оксид азота, а также предпринята попытка оценить влияние этого процесса на морфофизиологическое состояние клеток продуцента. Установленное участие N0 в регуляции формирования поверхностного S-слоя бактерий, определяющего адгезию клеток на эпителии кишечника, позволит разработать подходы к увеличению колонизирующей способности лактобацилл, а следовательно, и их положительного влияния на здоровье человека. Обнаружение закономерностей регуляции биосинтеза N0 у микроорганизмов имеет огромное значение для биотехнологии и медицины, поскольку обеспечивает потенциальную возможность направленной регуляции синтеза N0 комменсальными бактериями в кишечнике человека с целью поддержания уровня оксида азота на необходимом для нормальной жизнедеятельности организма уровне. В целом, проведенные исследования открывают перспективы использования пробиотиков на основе L. plantarum в качестве альтернативного фармакологического средства для профилактики и лечения заболеваний человека и животных, связанных с отклонениями в образовании N0.
В ходе экспериментальной работы была разработана и опробована оригинальная методика определения оксида азота с помощью N0-чувствительных флуоресцентных красителей, а также осуществлен экспериментальный подбор спиновой ловушки для детекции бактериального N0 методом ЭПР-спектроскопии.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа проводится в соответствии с тематическим планом НИР КГУ 1.15.06 «Механизмы регуляции функциональной активности клетки». Исследования автора по тематике работы поддержаны федеральными программами «Развитие научного потенциала высшей школы» РНП.2.1.1.1005, РНП.2.1.1.3222 и «Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники», ГК 02.434.11.3020 «Конструирование противоопухолевых препаратов селективного действия на основе микробных рибонуклеаз», ГК 02.512.11.2050 «Идентификация клеточных мишеней экзогенных микробных рибонуклеаз как основа создания противоопухолевых препаратов селективного действия», ГК ФЦКП КГУ 02.451.11.7019. Авторские исследования получили персональную поддержку Института фармакологии им. Рудольфа-Буххайма, г. Гиссен, Германия (апрель 2006 г.; октябрь 2006 г. - январь 2007 г.), Немецкой службы академических обменов (DAAD) (июль 2005 г.; октябрь 2007 г. - март 2008 г.), Немецкого Общества физиологов (март 2006 г.), а также программы партнерских отношений Казанского государственного университета (Казань, Россия) и Университета им. Юстуса-Либиха (Гиссен, Германия) (декабрь 2005 г.). Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора. Флуоресцентную детекцию оксида азота проводили на базе Института фармакологии им. Рудольфа-Буххайма, г. Гиссен, Германия. ЭПР-спектроскопия выполнена на кафедре электроники и радиоспектроскопии КГУ. Атомную силовую микроскопию осуществляж на кафедре оптики и нанофотоники КГУ. Сканирующая электронная микроскопия выполнена на кафедре полезных ископаемых и разведочного дела КГУ.
Положения, выносимые на защиту:
1. Бактерии Lactobacillus plantarum обладают специфическим, отличным от денитрификации, NO-синтазным механизмом образования оксида азота.
2. Генетическая программа Lactobacillus plantarum подтверждает;наличие у них NO-синтазной активности, отличной от NO-синтазы эукариот и прокариот -обладателей оксигеназного домена NO-синтазы.
3. Оксид азота NO-синтазного происхождения у бактерий играет роль универсального фактора стрессорного и адаптивного ответов клеток.
4. При индукции NO-синтазы субстратом L-аргинином происходит изменение морфофизиологического состояния поверхности клеток Lactobacillus plantarum, связанное с формированием S-слоя.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на XIV Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Казань, 2007), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2007» (Москва, 2007), XI Международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий. Экологический катализ» (Новосибирск, 2006), молодежной научно-практической конференции «Актуальные проблемы науки и образования», (Зеленодольск, 2006), Международной конференции Немецкого Общества физиологов и Федерации Европейских физиологических обществ (Мюнхен, 2006), II Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал» (Пермь, 2005), 9-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2005), 79-ой всероссийской студенческой конференции, посвященной 1000-летию Казани (Казань, 2005), конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2004), междисциплинарной конференции с международным участием «Новые биокибернетические и телемедицинские технологии 21 века для диагностики и лечения заболеваний человека» (Петрозаводск, 2003), V, VII конференциях НОЦ КГУ «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2005,2007), а также на итоговых конференциях КГУ (2004-2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 155 страницах, содержит 8 таблиц и 33 рисунка и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 301 источник, из них 275 на иностранном языке.
Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Яруллина, Дина Рашидовна
выводы
1. У Lactobacillus plantarum денитрификационный путь синтеза оксида азота отсутствует в связи с отсутствием энзиматической активности и генетических детерминант нитритредуктазы - фермента ключевой стадии диссимиляционной нитратредукции.
2. Впервые комплексом экспериментальных методов прямой регистрации оксида азота, а именно, электронным парамагнитным резонансом и флуоресцентной микроскопией, обнаружен и охарактеризован специфичный для лактобацилл NO-синтазный путь образования оксида азота.
3. Впервые проведен компьютерный анализ и выявлены геномные детерминанты NO-синтазного пути образования оксида азота у Lactobacillus plantarum, обеспечивающие биосинтез редуктазного домена и необходимых кофакторов и простетических групп NOS.
4. Оксид азота NO-синтазного происхождения служит сигналом активации защитных функций клеток различного эволюционного уровня, поскольку его продукция усиливается в условиях стресса, вызванного (а) экзогенными токсикантами (РНКазой Bacillus intermedius) в культуре фибробластов; (б) высокотемпературным воздействием на бактерии Lactobacillus plantarum.
5. Лактобациллы обладают системой защиты от токсического действия генерируемого ими оксида азота, связанной с его элиминацией из клетки через цитоплазматическую мембрану.
6. Впервые методом атомно-силовой микроскопии у Lactobacillus plantarum установлено наличие на поверхности клетки S-слоя белков, экспрессия которых происходит в условиях активации NO-синтазы и связана с повышением биосинтеза оксида азота.
Автор благодарит доктора биологических наук, заведующую кафедрой микробиологии КГУ, профессора О.Н.Ильинскую за осуществление научного руководства; директора Института фармакологии им. Рудолъфа-Буххайма, (г. Гиссен, Германия), профессора Ф.Драйера за возможность проведения ряда экспериментов на базе его института; доктора КБойерляйна (Институт фармакологии им. Рудолъфа-Буххайма, г. Гиссен, Германия) за помощь в проведении флуоресцентной микроскопии и участие в обсуждении результатов; кандидата физико-математических наук, доцента кафедры электроники и радиоспектроскопии КГУ Н.И.Силкина за методическую помощь в проведении ЭПР-спектроскопии; кандидата физико-математических наук, доцента кафедры оптики и нанофотоники КГУ О.А.Коновалову за постановку экспериментов по атомно-силовой микроскопии; кандидата геолого-минералогических наук, заведующего кафедрой полезных ископаемых и разведочного дела КГУ, доцента В.Г.Изотова и кандидата геолого-минералогических наук, доцента кафедры полезных ископаемых и разведочного дела КГУ Л.М.Ситдикову за проведение сканирующей электронной микроскопии; кандидата биологических наук, руководителя Центра аналитических исследований ГНУ «ТатНИИ РАСХН» (г. Казань) Р.А.Шурхно за предоставление штаммов лактобацилл; кандидата химических наук, доцента НИЛ координационных соединений кафедры неорганической химии Химического института им. А.М.Бутлерова (г. Казань) В.Г.Штырлина за приготовление концентрационной серии
Заключение
Лактобациллы представляют собой важный компонент естественной микрофлоры кишечного и урогенитального трактов человека и животных, где они подавляют рост патогенных микроорганизмов, способствуют регенерации эпителия слизистой оболочки, оказывают иммуномодулирующее действие [Orrhage, Nord, 2000]. Функциональная активность бактерий рода Lactobacillus определила их широкое использование в производстве промышленно важных пробиотических препаратов и продуктов функционального питания [Nguyen et al., 2007].
Согласно данным литературы, микроорганизмы рода Lactobacillus, подобно клеткам эукариот, синтезируют оксид азота в ходе катализируемого NO-синтазой окисления L-аргинина [Adawi et al., 1997; Morita et al., 1997]. Возможно, положительная роль пробиотических бактерий L. plantarum DSM 9843 в кишечнике обусловлена генерацией ими оксида азота именно по этому ; механизму [Adawi et al, 1997], однако это предположение не было подтверждено экспериментально [Xu, Verstraete, 2001].
Общепринято, что альтернативный NO-синтазе NO-ергический процесс денитрификации не свойственен лактобациллам [Краткий определитель бактерий Берги, 1980]. Тем не менее, у многих представителей рода Lactobacillus ; обнаружена способность восстанавливать нитраты до нитритов [Wolf et al, 1990]. В частности, L. plantarum проявляют нитратредукгазную активность, если конечная величина рН выше 6.0 [Краткий определитель бактерий Берги, 1980; Wolf, Hammes, 1988]. У денитрификаторов NO образуется в катализируемой нитритредукгазой ферментативной реакции восстановления нитритов [Zumft, 1997]. Хотя этот процесс не был обнаружен у L. plantarum, тем не менее, возможность такого синтеза NO у них полностью исключить нельзя [Wolf, Hammes, 1988].
Анализ данных литературы о многообразии функций NO позволяет предположить физиологическую роль оксида азота, синтезируемого комменсальными кишечными бактериями L. plantarum. Во-первых, будучи высокореакционноспособной молекулой, NO обладает антимикробной активностью. Главными мишенями токсического действия NO в микробных клетках являются ДНК и белки [Fang, 2003], а также мембранные липиды [Halliwell et al., 1992; Rubbo et al., 1994]. Во-вторых, NO может реализовать сигнальную функцию, заключающуюся в трансдукции генетического сигнала резистентности к различным стрессам и активации экспрессии генов важнейших систем репарации ДНК: SoxRS, OxyR, SOS и Ada [Demple, 1999b; Васильева, Мошковская, 2005]. Поскольку функциональная активность N0 в значительной степени определяется физическими свойствами молекулы, синтезируемый бактериями-комменсалами кишечника этот агент будет в равной степени влиять как на микробные клетки, так и на организм хозяина.
Значительная биологическая роль NO обусловила многообразие методик его определения. Для выявления NO в биосистемах предложено использовать ряд методов: ЭПР-спектроскопию; хемилюминесцентный метод; изотопный метод, в котором прослеживается превращение аргинина в цитруллин; меттемоглобиновый метод, в котором изучается превращение оксигемоглобина . в метгемоглобин под действием NO; электродный метод, позволяющий оценивать уровень NO по его взаимодействию с избирательным для него электродом [Archer, 1993; Ванин, 2001]; метод окрашивания NO-чувствительными флуоресцетными красителями [von Bohlen und Halbach, 2003]. Наряду с методами детекции собственно N0, в отдельную группу выделяют методы непрямого определения оксида азота, которые заключаются в анализе продуктов его превращения или веществ, образующихся в результате биологического действия NO.
Для проявления лактобациллами своей функциональной активности в кишечнике человека большое значение имеет адгезивная способность бактерий [Schar-Zammaretti, Ubbink, 2003], которая, в свою очередь, зависит от наличия S-слоя [Schneitz et al., 1992; Toba et al, 1995; Hynonen et al, 2002; Lorea et al, 2002]. S-слои бактерий и архей представляет собой расположенный над клеточной стенкой, регулярно построенный, поверхностный слой белка или гликопротеина [Дебабов, 2004]. Они обнаружены у многих видов Lactobacillus: L. brevis, L. acidophilis, L. crispatus, L. helveticus, L. amylovorus, L. buchnery, L. gallinarum, L. kefir, L. parakefir, L. johnsonii, L. gasseri [Avail-Jaaskelainen, Palva, 2005]. У L. plantarum S-слой еще не описан, однако ряд приоритетных данных литературы последних лет [Kahala, Palva, 1999; Siezen et al, 2006; Tallon et al, 2007] позволяет считать, что бактерии этого вида способны синтезировать на своей поверхности наружный S-слой белков.
Обобщение приведенных данных литературы позволяет нам обоснованно считать, что бактерии L. plantarum представляют собой перспективный объект исследования, имеющий несомненную практическую значимость. В связи с вышеизложенным основное внимание в работе уделено исследованию у них NO-синтазной активности, предполагающей функционально-регуляторную активность оксида азота.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Бактериальные штаммы и клеточные культуры
Основные сведения о штаммах лактобацилл, использованных в работе, представлены в табл. 1.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Яруллина, Дина Рашидовна, Казань
1. Брюне, Б. Апоптотическая гибель клеток и оксид азота: механизмы активации и антагонистические сигнальные пути Текст./ Б.Брюне, К.Сандау, А.фон Кнетен // Биохимия. 1998. - Т. 63, вып. 7.- С. 966-975.
2. Ванин, А.Ф. Оксид азота регулятор клеточного метаболизма Текст./ А.Ф.Ванин // Соросовский образовательный журнал. - 2001. - Т. 7, № 11. - С. 712.
3. Ванин, А.Ф. Оксид азота в биологии: история, состояние и перспективы исследований Текст./ А.Ф.Ванин // Биохимия. 1998. - Т. 63, вып. 7. - С. 867869.
4. Ванин, А.Ф. Оксид азота в биомедицинских исследованиях Текст./ А.Ф.Ванин // Вестник Академии медицинских наук. 2000. - Вып. 1. - С. 3-5.
5. Васильева, С.В. Активация ^охКБ-регулона в Escherichia coli оксидом азота и его физиологическими донорами Текст./ С.В.Васильева, М.В.Ступакова, И.И.Лобышева, В.Д.Микоян, А.Ф.Ванин // Биохимия. 2001. -Т. 66, вып. 9. - С. 1209-1214.
6. Васильева, С.В. Новые явления квази-адаптивного ответа к алкилирующим агентам в Escherichia coli Текст./ С.В.Васильева, Е.Ю.Мошковская // Генетика. 2005. - Т. 41, №5. - С. 607-613.
7. Васильева, С.В. Роль оксида азота в формировании SOS-индуцирующего сигнала у Escherichia coli Текст./ С.В.Васильева, М.В.Ступакова, И.И.Лобышева // Радиационная биология. Радиоэкология. -2003.-Т. 43, №4.-С. 464-469.
8. Герхардт, Ф. Методы общей бактериологии Текст./ ред. Ф.Герхардт [и др.]. М.: Мир, 1984. - 472 с.
9. Горрен, А.К.Ф. Универсальная и комплексная энзимология синтазы оксида азота Текст./ А.К.Ф.Горрен, Б.Майер // Биохимия. 1998. - Т. 63, вып. 7. - С. 870-880.
10. Ю.Дебабов, В.Г. S-слои бактерий и архей как объект бионанотехнологий Текст./ В.Г.Дебабов // Молекулярная биология. 2004. - Т. 38, №4. - С. 578591.
11. И.Дорощук, Н.А. Регуляция метаболизма азота у грамположительных бактерий Текст./ Н.А.Дорощук, М.С.Гельфанд, Д.А.Родионов // Молекулярная биология. 2006. - Т. 40, №5. - С. 919-926.
12. Жумабаева, Т.Т. Исследование методом ЭПР взаимодействия клеток Е. coli с аскорбиновой кислотой и нитритом натрия Текст./ Т.Т.Жумабаева, Л.М.Байдер, Л.А.Володина, З.В.Куроптева // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. - Т. 37, №6. - С. 742-746.
13. Зеленихин, П.В. Индукция апоптоза опухолевых клеток биназой Текст./ П.В.Зеленихин, А.И.Колпаков, Г.В.Черепнев, О.Н.Ильинская // Молекулярная биология. 2005. - Т. 39, №3. - С. 457-463.
14. Ильинская, О.Н. Краткосрочные тест-системы для определения генотоксичности: методическое руководство Текст./ О.Н.Ильинская, А.Б.Маргулис. Казань: изд-во КГУ. - 2005. - 31с.
15. Ильинская, О.Н. Почему рибонуклеазы вызывают гибель раковых клеток Текст./ О.Н.Ильинская, А.А.Макаров // Молекулярная биология. 2005. -Т. 39, №1.-С. 1-11.
16. Ингрэм, Д. Электронный парамагнитный резонанс в биологии Текст./ Д.Ингрэм. М.: Мир, 1972. - 296 с.
17. Коновалова, О.А. Оптимизация визуализации ДНК атомно-силовым микроскопом Solver Р47Н Текст./ О.А.Коновалова, Т.А.Невзорова, В.Г.Винтер, М.Х.Салахов // Приборы и техника эксперимента. 2005. - № 6. - С. 110-114.
18. Краткий определитель бактерий Берги Текст./ ред. Дж.Хоулт. М.: Мир, 1980. -496 с.
19. Кулинский, В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита Текст./ В.И.Кулинский // Соросовский образовательный журнал. -1999. №1. - С. 2-7.
20. Ленинджер, А. Основы биохимии Текст./ А.Ленинджер. М.: Мир, 1985.-367 с.
21. Маеда, X. Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции, воспалении и раке Текст./ Х.Маеда, Т.Акаике // Биохимия. 1998. - Т. 63, вып. 7.-С. 1007-1019.
22. Малышев, И.Ю. Стресс, адаптация и оксид азота Текст./ И.Ю.Малышев, Е.Б.Манухина // Биохимия. 1998. - Т. 63, вып. 7. - С. 9921006.
23. Реутов, В.П. Цикл оксида азота в организме млекопитающих и принцип цикличности / В.П.Реутов // Биохимия. 2002. - Т. 67, вып. 3. - С. 353376.
24. Сайманова, Р.А. Выделение чистых культур бактерий и их идентификация: методическое руководство Текст./ Р.А. Сайманова, Н.Г.Захарова. Казань: изд-во КГУ. - 1980. - 24с.
25. Свердлов, Е.Д. Микрокосм генома Текст./ Е.Д.Свердлов // Молекулярная биология. 1999. - 33. - С. 917-940.
26. Тихонов, А.Н. Электронный парамагнитный резонанс в биологии Текст./ А.Н.Тихонов // Соросовский образовательный журнал. 1997. -№11.1. C. 9-15.
27. Abu-Soud, Н.М. Subunit dissociation and unfolding of macrophage NO synthase: relationship between enzyme structure, prosthetic group binding, and catalytic function Text./ H.M.Abu-Soud, MXoftus, D.J.Stuehr // Biochemistry. -1995.-34.-P. 11167-11175.
28. Adak, S. Arginine conversion to nitroxide by tetrahydrobiopterin-free neuronal nitric-oxide synthase. Implications for mechanism Text./ S.Adak, Q.Wang,
29. D.J.Stuehr // J. Biol. Chem. -2000.-275.-P. 33554-33561.
30. Adak, S. Chimeras of nitric-oxide synthase types I and III establish fundamental correlates between heme reduction, heme-NO complex formation, and catalytic activity Text./ S.Adak, K.S.Aulak, D.J.Stuehr // J. Biol. Chem. 2001. -276. - 23246-23252.
31. Adak, S. Direct evidence for nitric oxide production by a nitric-oxide synthase-like protein from Bacillus subtilis Text./ S.Adak, K.S.Aulak, D.J.Stuehr // J. Biol. Chem. 2002b. -277. - P. 16167-16171.
32. Adawi, D. Effect of Lactobacillus supplementation with and without arginine on liver damage, bacterial translocation in an acute liver injury model in the rat Text./ D.Adawi, F.B.Kasravi, G.Molin, BJeppsson // Hepatology. 1997. -25(3).-P. 642-647.
33. Adman, E.T. The structure of copper-nitrite reductase from Achromobacter cycloclastes at five pH values, with N02" bound and with type II copper depleted Text./ E.T.Adman, J.W.Godden, S.Turley // J. Biol. Chem. 1995. - 270. - P. 27458-27474.
34. Adrait, A. Spectroscopic and saturation magnetization properties of the manganese- and cobalt-substituted Fur (ferric uptake regulation) protein from Escherichia coli Text./ A.Adrait, LJacquamet, L.Le Pape, A.Gonzalez de Peredo,
35. D.Aberdam, J.L.Hazemann, J.MXatour, I.Michaud-Soret // Biochemistry. 1999. -38(19). - P. 6248-6260.
36. Ahrne, S. The normal Lactobacillus flora of healthy human rectal and oral mucosa Text./ S.Ahrne, S.Nobaek., B.Jeppsson, I.Adlerberth, A.E.Wold, G.Molin // J. Appl. Microbiol. 1998. - 85. - P. 88-94.
37. Alakomi, H.-L. Application of a microplate scale fluorochrome staining assay for the assessment of viability of probiotic preparations Text./ H.-L. Alakomi, J.Matto, I.Virkajarvi, M.Saarela // Journal of Microbiological Methods. 2005. - 62. -P. 25-35.
38. Alderton, W.K. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition Text./ W.K.Alderton, C.E.Cooper, R.G.Knowles // Biochem. J. 2001. - 357. - P. 593-615.
39. Altschul, S.F. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs Text./ S.F.Altschul, T.L.Madden, Schaffer A,A., J.Zhang, W.Miller, D.J.Lipman // Nucleic Acids Res. 1997. - 25(17). - P. 3389-3402.
40. Ananta, E. Evidence on the role of protein biosynthesis in the induction of heat tolerance of Lactobacillus rhamnosus GG by pressure pre-treatment Text./
41. E.Ananta, D.Knorr // Int. J. Food Microbiol. 2004. - 96. - P. 307-313.
42. Anjum, M.F. Nitric oxide metabolism in Neisseria meningitidis Text./ M.F.Anjum, T.M.Stevanin, R.C.Read, J.W.B.Moir // J. Bacteriol. 2002. - 184(11). -P. 2987-2993.
43. Arai, H. Expression of the nir, nor genes for denitrification of Pseudomonas aeruginosa requires a novel CRP/FNR-related transcriptional regulator, DNR, in addition to ANR Text./ H.Arai, Y.Igarashi, T.Kodama I IFEBS Lett. 1995. - 371. -P. 73-76.
44. Archer, S. Measurement of nitric oxide in biological models Text./ S.Archer // FASEB J. 1993. - 179. - P. 349-360.
45. Arena, M.E. Arginine dihydrolase pathway in Lactobacillus plantarum from orange Text./ M.E.Arena, F.M.Saguir, M.C.Manca de Nadra // Int. J. Food Microbiol. 1999. - 47(3). - P. 203-209.
46. Arroyo, C. Difficulties encountered in the detection of nitric oxide (NO) by spin trapping techniques. A cautionary note Text./ C.Arroyo, M.Kohno // Free Radic. Ret. Commun.- 1991.-14.-P. 145-155.
47. Arzumanian, V. Mechanisms of nitric oxide synthesis and action in cells Text./ V.Arzumanian, E.Stankevicius, A.Laukeviciene, E.Kevelaitis // Medicina. -2003.-39(6).-P. 535-541.
48. Assreuy, J. Production of nitric oxide and superoxide by activated macrophages and killing of Leishmania major Text./ J.Assreuy, F.Q.Cunha, M.Epperlein, A.Noronha-Dutra, C.A.O'Donell, F.Y.Liew, S.Moncada // Eur. J. Immunol. 1994. - 24. - P. 672-676.
49. Avall-Jaaskelainen, S. Lactobacillus surface layers and their applications Text./ S.Avall-Jaaskelainen, A.Palva // FEMS Microbiol. Rev. 2005. - 29. - P. 511-529.
50. Averill, B.A. The chemical mechanism of microbial denitrification a hypothesis Text./ B.A.Averill, J.M.Tiedje // FEBS Lett. - 1982. - 138. - P. 8-11.
51. Benson, D.A. Genbank Text./ D.A.Benson, M.S.Boguski, D.J.Lipman, J.Ostell, B.F.Ouellette, B.A.Rapp, D.L.Wheeler // Nucleic Acids Res. 1999. - 27. -P. 12-17.
52. Berkels, R. A new method to measure nitrate/nitrite with a NO-sensitive electrode Text./ R.Berkels, S.Purol-Schnabel, R.Roesen // J. Appl. Physiol. 2001. -90.-P. 317-320.
53. Berks, B.C. Enzymes, associated electron transport systems that catalyse the respiratory reduction of nitrogen oxides and oxyanions Text./ B.C.Berks, S.J.Ferguson, J.W.Moir, D.J.Richardson // Biochim. Biophys. Acta. 1995. - 1232. -P. 97-173.
54. Bird, L.E. Cryctal structure of SANOS, a bacterial nitric oxide synthase oxygenase protein from Staphylococcus aureus Text./ L.E.Bird, J.Ren, J.Zhang, N.Foxwell, A.R.Hawkins, I.G.Charles, D.K.Stammers // Structure. 2002. - 10. - P. 1687-1696.
55. Blaser, M.J. Pathogenesis of Campylobacter fetus infections: critical role of high-molecular-weight S-layer proteins in virulence Text./ M.J.Blaser, Z.Pei // J. Infect. Dis.- 1993.- 167. P. 372-377.
56. Boot, H.J. Expression, secretion and antigenic variation of bacterial S-layer proteins Text./ H.J.Boot, P.HPouwels // Mol. Microbiol. 1996. - 21. - P. 11171123.
57. Bories, P.N. Nitrate determination in biological fluids by an enzymatic one-step assay with nitrate reductase Text./P.N.Bories, C.Bories // Clin. Chem. 1995. -41. -P. 904-907.
58. Braun, C. Marker exchange of the structural genes for nitric oxide reductase blocks the denitrification pathway of Pseudomonas stutzeri at nitric oxide Text./ C.Braun, W.G.Zumft // Biol. Chem. 1991. - 266. - P. 22785-22788.
59. Buddha, M.R. An unusual tryptophanyl tRNA synthetase interacts with nitric oxide synthase in Deinococcus radiodurans Text./ M.R.Buddha, K.M.Keery,
60. B.RCrane // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004a. - 101. - P. 15881-15886.
61. Buddha, M.R. Regioselective nitration of tryptophan by a complex between bacterial nitric-oxide synthase and tryptophanyl-tRNA synthetase Text./ M.RBuddha, T.Tao, RJ.Pany, B.RCrane // J. Biol. Chem. 2004b. - 279. - P. 49567-49570.
62. Callegari, L. The S-layer gene of Lactobacillus helveticus CNRZ892: cloning, sequencing and heterologous expression Text./ M.L.Callegari, B.Riboli, J.W.Sanders, P.S.Cocconcelli, J.Kok, G.Venema, L.Morelli //Microbiology. 1998. -144.-P. 719-726.
63. Carlsson, S. Effects of pH, nitrite, and ascorbic acid on nonenzymatic nitric oxide generation and bacterial growth in urine Text./ S.Carlsson, N.P.Wiklund, L.Engstrand, E.Weitzberg, J.O.NXundberg // Nitric Oxide. 2001. - 5(6). - P. 580- / 586.
64. Chang, C.K. Evidence that heme di is a 1,3-porphyrindione Text./
65. C.K.Chang, R.Timkovich, W.Wu // Biochemistry. 1986. - 25. - P. 8447-8453. >
66. Chartier, F.J.M. Stability of the heme environment of the nitric oxide synthase from Staphylococcus aureus in the absence of pterin cofactor Text./ F.J.M.Chartier, M.Couture // Biophys. J. -2004. 87. - P. 1939-1950.
67. Chen, Y. A bacterial nitric oxide synthase from a Nocardia species Text./ Y.Chen, J.P.N.Rosazza // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994.-203 - P. 12511258.
68. Chen, Y. Purification and characterization of nitric oxide synthase (NOSNOc) from a Nocardia species Text./ Y.Chen, J.P.N.Rosazza // Bacteriol. 1995. - 177. -P. 5122-5128.
69. Chenna, R. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs Text./ RChenna, H.Sugawara, T.Koike, R.Lopez, T.J.Gibson, D.G.Higgins, J.D.Thompson // Nucleic Acids Res. 2003. - 31. - P. 3497-3500.
70. Chikwem, J.O. Purification and characterization of the respiratory nitrate reductase of Bacillus stearothermophilus Text./ J.O.Chikwem, RJ.Downey // Anal. Biochem. 1982. - 126.-P. 74-80.
71. Choi, D.W. Identification and characterization of nitric oxide synthase in Salmonella typhimurium Text./ D.W.Choi, H.Y.Oh, S.Y.Hong, J.W.Han, H.W.Lee // Arch. Pharm. Res. 2000. - 23(4). - P. 407-412.
72. Choi, W.S. Identification of nitric oxide synthase in Staphylococcus aureus Text./ W.S.Choi, M.S.Chang, J.W.Han, S.Y.Hong, H.W.Lee // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. - 237. - P. 554-558.
73. Choi, W.S. Methylesters of L-arginine and N-nitro-L-arginine induced nitric oxide synthase in Staphylococcus aureus Text./ W.S.Choi, D.W.Seo, M.S.Chang, J.W.Han, S.Y.Hong, W.K.Paik, H.W.Lee // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1998.-246.-P. 431-435.
74. Christensen, J.E. Peptidases and amino acid catabolism in lactic acid bacteria Text./ E.Christensen, E.G.Dudley, J.A.Pederson, J.L.Steele // Antonie van Leeuwenhoek. 1999. - 76. - P. 217-246.
75. Christodoulou, D. Electrochemical methods for detection of nitric oxide Text./ D.Christodoulou, S.Kudo, J.A.Cook, M.C.Krishna, A.Miles, M.B.Grisham, M.Murugesam, P.C.Ford, D. A. Wink//Methods Enymol. 1996. - 268. - P. 69-83.
76. Cohen, M.F. Involvement of nitric oxide synthase in sucrose-enhanced hydrogen peroxide tolerance of Rhodococcus sp. strain APG1, a plant-colonizing bacterium Text./ M.F.Cohen, H.Yamasaki // Nitric Oxide. 2003. - 9 - P. 1-9.
77. Corcoran, G.B. Apoptosis: molecular control point in toxicity Text./ G.B.Corcoran, L.Fix, D.P.Jones, M.T.Moslen, P.Nicotera, F.A.Oberhammer, R.Buttyan // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1994. - 113. - P. 167-183.
78. Cosentino, F. Tetrahydrobiopterin and endothelial nitric oxide synthase activity Text./ F.Cosentino, T.FXuscher // Cardiovasc. Res. 1999. - 43. - P. 274278.
79. Coyne, M.S. Immunological identification and distribution of dissimilatory heme cdj, non heme copper nitrite reductases in denitrifying bacteria Text./
80. M.S.Coyne, A.Arunakumari, B.A.Averill, J.M.Tiedje // Appl. Environ. Microbiol. -1989.-55.-P. 2924-2931.
81. Crawford, M.J. Role for the Salmonella flavohemoglobin in protection from nitric oxide Text./ M.J.Crawford, D.E.Goldberg // J. Biol. Chem. 1998. - 273. - P. 12543-12547.
82. Crow, J.P. Reactions between nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite: footprints of peroxynitrite Text./ J.P.Crow, J.S.Beckman // Adv. Pharmacol. 1995. -34.-P. 17-43.
83. Cutruzzola, F. Bacterial nitric oxide synthesis Text./ F.Cutruzzola // Biochemica et Biophysica Acta. 1999. - 1411. - P. 231-249.
84. D'Argenio, D.A. Cyclic di-GMP as a bacterial second messenger Text./ D.A.D'Argenio, S.I.Miller // Microbiology. 2004. - 150. - P. 2497-2502.
85. De Man, J.C. A medium for the cultivation of lactobacilli Text./ J.C.De Man, M.Rogosa, M.T.Sharpe // J. Appl. Bacterid. -1960. 23. - P. 130-135.
86. DeGroote, M.A. Genetic and redox determinants of nitric oxide cytotoxicity in a Salmonella typhimurium model Text./ M.A.DeGroote, D.Granger, Y.Xu, G.Campbell, RPrince, F.C.Fang // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - 92. - P. 6399-6403.
87. Delcour, J. The biosynthesis and functionality of the cell-wall of lactic acid bacteria Text./ J.Delcour, T.Ferain, M.Deghorain, E.Palumbo, P.Hols // Antonie van Leeuwenhoek. 1999. -76. - P. 159-184.
88. Demple, B. Genetic responses against nitric oxide toxicity Text./ B.Demple //Braz. J. Med. Biol. Res. 1999a. - 32(11). - P. 1417-1427.
89. Demple, B. Radical ideas: genetic responses to oxidative stress Text./
90. B.Demple // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 1999b. - 26(1). - P. 64-68.
91. Demple, B. Redox signaling and gene control in the Escherichia coli soxRS oxidative stress regulon a review Text./ B.Demple // Gene. - 1996. - 179. - P. 5357.
92. Denariaz, G. The denitrifying nitrite reductase of Bacillus halodenitrificans Text./ G.Denariaz, W.J.Payne, J.Legall // Biochim. Biophys. Acta. 1991. - 1056. -P. 225-232.
93. Ding, H. Direct nitric oxide signal transduction via nitrosylation of iron-sulfur centers in the SoxR transcription activator Text./ H.Ding, B.Demple // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2000. 97(10). - P. 5146-5150.
94. Dubrac, S. Fur positive regulation of iron superoxide dismutase in Escherichia coli: functional analysis of the sodB promoter Text./ S.Dubrac, D.Touati // J. Bacteriol. 2000. -182(13). - P. 3802-3808.
95. Dworkin, J. Molecular mechanism of Campylobacter fetus surface layer protein expression Text./ J.Dworkin, M.J.Blaser // Mol. Microbiol. 1997. - 26. - P. 433-440.
96. Ehretsmann, C.P. mRNA degradation in prokaryotes Text./
97. C.P.Ehretsmann, A.J.Carpousis, H.M.Krisch // FASEB J. 1992. - 6. - P. 3186-3192.
98. Engelhardt, H. Structural research on surface layers: a focus on stability, surface layer homology domains, and surface-layer-cell wall interaction Text./ H.Engelhardt, J.Peters // J. Struct. Biol. 1998. - 124. - P. 276-302.
99. Everett, S.A. Nitric oxide in biological fluids: analysis of nitrite and nitrate by high performance ion chromatography Text./ S.A.Everett, M.F.Dennis, G.M.Tozer, V.E.Prise, P.Wardman, M.R.L.Stratford // J. Chromatogr. A. 1995. -706. -P.437-442.
100. Fang, F.C. Mechanisms of nitric oxide-related antimicrobial activity Text./ F.C.Fang // J. Clin. Invest. 2003. - 99. - P. 2818-2825.
101. Ferguson, B.J. Signaling interactions during nodule development Text./ B.J.Ferguson, U.Mathesius // Plant Growth Regul. 2003. - 22. - P. 47-72.
102. Ferguson, S.J. Denitrification and its control Text./ S.J.Ferguson // Antonie Van Leeuwenhoek. 1994. -66(1-3). -P. 89-110.
103. Fernandes, P.D. Role of nitric oxide and superoxide in Giardia lamblia killing Text./ P.D.Fernandes, J.Assreuy // Braz. J. Med. Biol. Res. 1997. - 30. - P. 93-99.
104. Friedemann, M.N. o-Phenylen-ediamine-modified carbon fiber electrodes for the detection of nitric oxide Text./ M.N.Friedemann, S.W.Robinson, G.A.Gerhardt // Anal. Chem. 1996. - 68. - P. 2621-2628.
105. Garber, E.A.E. 15N tracer studies on the role of NO in denitrification Text./E.A.E.Garber, T.C.Hollocher//J. Biol. Chem. 1981. -256. -P. 5459-5465.
106. Gardner, P.R. Nitric oxide sensitivity of the aconitases Text./ P.R. Gardner, G.Costantino, C.Szabo, A.L.Salzman 7/ J. Biol. Chem. 1997. -272(40).-P. 25071-25076.
107. Gauthier, C. Dynamics of NO rebinding to the heme domain of NO synthase-like proteins from bacterial pathogens Text./ C.Gauthier, I.Mikula, P.Nioche, P.Martasek, C.S.Raman, A.Slama-Schwok // Nitric oxide. 2006. - 15(4). -P. 312-327.
108. Gerhardt, G.A. Nafion-coated electrodes with high selectivity for CNS electrochemistry Text./ G.A.Gerhardt, A.F.Oke, G.Nagy, B.Moghaddam, R.N.Adams // Brain Res. 1984. - 290. - P. 390-395.
109. Golderer, G. Nitric oxide synthase is induced in sporulation of Physarum polycephalum Text./ G.Golderer, E.R. Werner, S.Leitner, P.Grobner, G.Werner-Felmayer // Genes Dev.-2001. 15(10). -P. 1299-1309.
110. Goretski, J. Steady-state nitric oxide concentrations during denitrification Text./ J.Goretski, O.C.Zafiriou, T.C.Hollocher // J. Biol. Chem. 1990. - 265. - P. 11535-11538.
111. Gow, A.J. A novel reaction mechanism for the formation of S-nitrosothiols in vivo Text./ A.J.Gow, D.G.Buerk, H.Ischiropoulos // J. Biol. Chem. 1997. - 272. -P. 2841-2845.
112. Green, L.C. Analysis of nitrate, nitrite and 15N.nitrate in biological fluids [Text]/ L.C.Green, D.A.Wagner, J.Glogowski, P.L.Skipper, J.S.Wishnok, S.R.Tannenbaum // Anal. Biochem. 1982. - 126. - P. 131-138.
113. Groppe, M. Measurement of nitric oxide production by the lesioned rat • retina with a sensitive nitric oxide electrode Text./ M.Groppe, S.Thanos, W.Schuhmann, P.Heiduschka // Anal. Bioanal. Chem. 2003. - 376. - P. 797-807. .
114. Guo, F.Q. Identifcation of a plant nitric oxide synthase gene involved in ■ hormonal signaling Text./ F.Q.Guo, M.Okamoto, N.M.Crawford // Science. 2003. -302.-P. 100-103.
115. Gusarov, I. NO-mediated cytoprotection: Instant adaptation to oxidative stress in bacteria Text./ I.Gusarov, E.Nudler // PNAS. 2005. - 102(39). - P. 1385513860.
116. Halliwell, B. Interaction of nitrogen dioxide with human plasma. Antioxidant depletion and oxidative damage Text./ B.Halliwell, M.L.Hu, S.Louie,
117. T.R.Duvall, B.K.Tarkington, P.Motchnik, C.E.Cross // FEBS Lett. 1992. - 313. - P. 62-66.
118. Hantke, K. Iron and metal regulation in bacteria Text./ K.Hantke // Curr. Opin. Microbiol. 2001. - 4(2). - P. 172-177.
119. Heiduschka, P. NO production during neuronal cell death can be directly assessed by a chemical reaction in vivo Text./ P.Heiduschka, S.Thanos // NeuroReport. 1998. - 9. - P. 4051-4057.
120. Hevel, J.M. Nitric-oxide synthase assays Text./ J.M.Hevel, M.A.Marletta // Methods Enzymol. 1994. - 233. - P. 250-258.
121. Hibbs, J.B.Jr. Nitric oxide: a cytotoxic activated macrophage effector molecule Text./ J.B.Jr.Hibbs, RRTaintor, Z.Vavrin, E.M.Rachlin // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. - 157. - P. 87-94.
122. Hidalgo, E. Adaptive responses to oxidative stress: the soxRS and oxyR regulons Text./ E.Hidalgo, B.Demple // Regulation of Gene Expression in Escherichia coli; eds. E.C.C.Lin, A.S.Lynch. Austin, Tex.: R.G.Landes Company, 1996. -P. 435-452.
123. Hidalgo, E. Binuclear 2Fe-2S. clusters in the Escherichia coli SoxR protein and role of the metal centers in transcription [Text]/ E.Hidalgo, J.M.Bollinger Jr., T.M.Bradley, C.T.Walsh, B.Demple // J. Biol. Chem. 1995. - 270(36). - P. 20908-20914.
124. Hiramoto, K. Appearance of electron spin resonance signals in the interaction of dithiocarbamate-Fe(II) with nitrogen dioxide and nitrite Text./ K.Hiramoto, S.Tomiyama, K.Kikugawa // Free Radic. Res. 1997. - 27. - P. 505509.
125. Hochstein, L.I. The enzymes associated with denitrification Text./ L.I.Hochstein, G.A.Tomlinson // Annu. Rev. Microbiol. 1988. - 42. - P. 231-261.
126. Hong, I. Purification and characterization of nitric oxide synthase from Staphylococcus aureus Text./ I.Hong, Y.K.Kim, W.S.Choi, D.W.Seo, J.W.Yoon, J.
127. W. Han, H.Y.Lee, H.W.Lee // FEMS Microbiology Letters. 2003. - 222. - P. 177182.
128. Huang, S. Biochemical characterization and histochemical localization of nitric oxide synthase in the nervous system of the snail, Helix pomatia Text./ S.Huang, H.H.Kerschbaum, E.Engel, A.Hermann // J. Neurochem. 1997. - 69(6). -P. 2516-2528.
129. Hunt, J.F. Endogenous airway acidification: implications for asthma pathophysiology Text./ J.F.Hunt, K.Fang, R.Malik, A.Snyder, N.Malhotra, T.A.Platts-Mills, B.Gaston // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2000. - 161. - P. 694699.
130. Hynonen, U. Fibronectin-binding function in the SlpA surface protein of Lactobacillus brevis Text./ U.Hynonen, B.Westerlund-Wikstrom, A.Palva, T.K.Korhonen // J. Bacterid. 2002. -184. - P. 3360-3367.
131. Ignarro, L.J. Endothelium-derived nitric oxide: actions and properties Text./ L.J.Ignarro // FASEB J. 1989. - 3. - P. 31-36.
132. Iizuka, T. Non-enzymatic nitric oxide generation in the stomachs of breastfed neonates Text./ T.Iizuka, M.Sasaki, K.Oishi, S.Uemura, M.Koike, M.Shinozaki // Acta Paediatr. 1999. - 88(10). - P. 1053-1055.
133. Ilinskaya, O.N. Bacillus intermedius ribonuclease as inhibitor of cell proliferation and membrane current Text./ O.N.Ilinskaya, K.Decker, A.Koschinski, F.Dreyer, H.Repp // Toxicology. 2001. - 156. - P.101-107.
134. Ilinskaya, O.N. Bacterial ribonuclease: mutagenic effect in microbial test-systems Text./ O.N.Ilinskaya, O.B.Ivanchenko, N.S.Karamova // Mutagenesis. -1995.-10(3).-P.165-170.
135. Ischiropoulos, H. Peroxynitrite-mediated oxidative protein modifications Text./ H.Ischiropoulos, A.B.A1-Mehdi // FEBS Lett. -1995. 364. - P. 279-282.
136. Ishiguro, E.E. Loss of virulence during culture of Aeromonas salmonicida at high temperature Text./ E.E.Ishiguro, W.W.Kay, T.Ainsworth, J.B.Chamberlain, R.A.Austen, J.T.Buckley, T.J.Trust // J. Bacteriol. 1981. - 148. - P. 333-340.
137. Jackson, M.A. Evidence for an nitric oxide-rebound mechanism for production of N20 from nitrite by the copper-containing nitrite reductase from Achromobacter cycloclastes Text./ M.A.Jackson, J.M.Tiedje, B.A.Averill // FEBS Lett.-1991.-291.-P. 41-44.
138. Ji, X.-B. Mechanism for nitrosation of 2,3-diaminonaphthalene by Escherichia coli: enzymatic production of NO followed by 02-dependent chemical nitrosation Text./ X.-B.Ji, T.C.Hollocher // Appl. Environ. Microbiol. 1988. - 54. -P. 1791-1794.
139. Juedes, M.J. Peroxynitrite-induced mutation spectra of pSP189 following replication in bacteria and in human cells Text./ M.J.Juedes, G.N.Wogan // Mutat. Res.-1996.-349.-P. 51-61.
140. Kahala, M. In vivo expression of the Lactobacillus brevis S-layer gene Text./ M.Kahala, K.Savijoki, A.Palva // J. Bacteriol. 1997. - 179. - P. 284-286.
141. Kahala, M. The expression signals of the Lactobacillus brevis slpA gene direct efficient heterologous protein production in lactic acid bacteria / M.Kahala, A.Palva // Appl. Microbiol. Biotechnol. -1999. 51(1). P. 71-78.
142. Kakutani, T. Purification and properties of a copper-containing nitrite reductase from a denitrifying bacterium Alcaligenes faecalis strain S-6 Text./ T.Kakutani, H.Watanabe, K.Arima, T.Beppu // J. Biochem. 1981. - 89. - P. 453461.
143. Kanehisa, M. The KEGG databases at Genome Net Text./ M.Kanehisa, S.Goto, S.Kawashima, A.Nakaya // Nucl. Acids. Res. 2002. - 30. - P. 42-46.
144. Kaplan, S.S. Effect of nitric oxide on staphylococcal killing and interactive effect with superoxide Text./ S.S.Kaplan, J.R.Lancaster, R.E.Basford, R.L.Simmons // Infect. Immun. 1996. - 64. - P. 69-76.
145. Katayama, Y. A novel molecular system for nitric oxide detection with high sensitivity Text./ Y.Katayama, N.Soh, K.Koide, M.Maeda // Chem. Lett. -2000.- 10.-P. 1152-1153.
146. Kemperers, A.J. Re-examination of the determination of environmental nitrate as nitrite by reduction with hydrazine Text./ A.J.Kemperers, A.G.Luft // Analyst.-1988.-113.-P. 1117-1120.
147. Kers, J.A. Nitration of a peptide phytotoxin by bacterial nitric oxide synthase Text./ J.A.Kers, M.J.Wach, S.B.Krasnoff, J.Widom, K.D.Cameron, R.A.Bukhalid, D.M.Gibson, B.R.Crane, R.Loria // Nature. 2004. - 429. - P. 79-82.
148. Ketchum, P.A. Menaquinol-nitrate oxidoreductase of Bacillus halodenitrificans Text./ P.A.Ketchum, G.Denariaz, J.LeGall, W.J.Payne. // J. Bacterid. 1991.- 173.-P. 2498-2505.
149. Kim, S.O. OxyR: a molecular code for redox-related signaling Text./ S.O.Kim, K.Merchant, RNudelman, W.F.Beyer, T.Keng, J.DeAngelo, A.Hausladen, J.S.Stamler // Cell. 2002. - 109. - P. 383-396.
150. Kim, Y.-M. Nitric oxide and intracellular heme Text./ Y.-M.Kim, H.A.Bergonia, C.Miiller, B.RPitt, W.D.Watkins, J.RXancaster Jr. // Adv. Pharmacol. -1995.-34.-P. 277-291.
151. Kitamura, Y. Microcoaxial electrode for in vivo nitric oxide measurement Text./ Y.Kitamura, T.Uzawa, K.Oka, Y.Komai, N.Ogawa, N.Takizawa, H.Kobayashi, K.Tanishita // Anal. Chem. 2000. - 72. - P. 2957-2962.
152. Klessig, D.F. Nitric oxide and salicylic acid signaling in plant defense Text./ D.F.Klessig, J.Durner, R.Noad, D.A.Navarre, D.Wendehenne, D.Kumar,
153. J.M.Zhou, J.Shah, S.Zhang, P.Kachroo, Y.Trifa, D.Pontier, E.Lam, H.Silva // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2000. 97(16). - P. 8849-8855.
154. Kobayashi, M. Denitrification, a novel type of respiratory metabolism in fungal mitochondrion Text./ M.Kobayashi, Y.Matsuo, A.Takimoto, S.Suzuki, F.Maruo, H.Shoun // J. Biol. Chem. 1996. - 271. - P. 16263-16267.
155. Kobayashi, M. Nitrile hydrolases Text./ M.Kobayashi, S.Shimizu // Curr. Opin. Chem. Biol. 2000. - 4. - P. 95-102.
156. Kojima, H. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: Diaminofluoresceins Text./ H.Kojima, N.Nakatsubo, K.Kikuchi, S.Kawahara, Y.Kirino, H.Nagoshi, Y.Hirata, T.Nagano // Anal. Chem. 1998. - 70. -P. 2446-2453.
157. Komarov, A. In vivo spin trapping of nitric oxide in mice Text./ A.Komarov, D.Mattson, M.M.Jones, P.K.Singh, C.S.Lai // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. - 195. - P. 1191-1198.
158. Korner, H. Phytogeny of the bacterial superfamily of Crp-Fnr transcription regulators: exploiting the metabolic spectrum by controlling alternative gene programs Text./ H.Korner, H.J.Sofia, W.G.Zumft // FEMS Microbiol Rev. 2003. -27(5). - P.559-592.
159. Koshland, D.E.Jr. The molecule of the year Text./ D.E.Jr.Koshland // Science. 1992.-258(5090).-P. 1861.
160. Koval, S.F. The effect of paracrystalline protein surface layers on predation by Bdellovibrio bacteriovorous Text./ S.F.Koval, S.H.Hynes //J. Bacteriol. -1991. -5.-P. 2244-2249.
161. Koval, S.F. The effect of S-layers and cell surface hydrophobicity on prey selection by bacteriovorous protozoa Text./ S.F.Koval // FEMS Microbiol. Rev. -1997.-20.-P. 138-142.
162. Kuropteva, Z.V. Ferrous-ascorbate complexes as carriers of nitric oxide Text./Z.V.Kuropteva, M.E.Kudiyavtsev // Gen. Physiol. Biophys. 1997. - 16(1). -P. 91-96.
163. Kwiatkowski, A.V. Requirement of nitric oxide for induction of genes whose products are involved in nitric oxide metabolism in Rhodobacter sphaeroides 2.4.3. Text./ A.V.Kwiatkowski, J.P.Shapleigh // J. Biol. Chem. 1996. - 271. - P. 24382-24388.
164. Lee, J. Resistance of Lactobacillus plantarum KCTC 3099 from Kimchi to oxidative stress Text./ J.Lee, K.T.Hwang, M.S.Heo, J.H.Lee, K.Y.Park // J. Med. Food. 2005. - 8(3). - P. 299-304.
165. Lee, S. Thiols in a nitric oxide synthase-containing Nocardia sp. strain NRRL 5646 Text./ S.Lee, H.Bergeron, P.C.K.Lau, J.P.N.Rosazza // Appl. Environ. Microbiol. 2007. - 73(9). - P. 3095-3097.
166. Leone, A.M. A rapid and simple method for the measurement of nitrite, nitrate in plasma by high performance capillary electrophoresis Text./ A.M.Leone, P.L.Francis, P.Rhodes, S.Moncada 7/ Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. -200.-P. 951-957.
167. Lepoivre, M. Inactivation of ribonucleotide reductase by nitric oxide Text./ M.Lepoivre, F.Fieschi, J.Coves, Thelander L., Fontecave M. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. -179(1). - P. 442-448.
168. Lim, S.T. Effect of cyclic guanosine-3',5'-monophosphate on nitrogen fixation in Rhizobium japonicum Text./ S.T.Lim, H.Hennecke, D.B.Scott // J. Bacteriol. 1979. - 139. - 256-263.
169. Lorea, G. Lactobacilli express cell surface proteins which mediate binding of immobilized collagen and fibronectin Text./ G.Lorea, MJ.Torino, G.Font de Valdez, A.Ljungh // FEMS Microbiol. Letters. 2002. - 206. - P. 31-37.
170. Ludwig, W. Transfer of Thiosphaera pantotropha to Paracoccus denitrificans Text./ W.Ludwig, G.Mittenhuber, C.G.Friedrich // Int. J. Syst. Bacterid. 1993. -43. -P. 363-367.
171. MacMicking, J. Nitric oxide and macrophage function Text./ J.MacMicking, Q.W.Xie, C.Nathan // Annu. Rev. Immunol. 1997. - 15. - P. 323350.
172. Malinski, T. Nitric oxide release from a single cell measured in situ by a porphyrinic-based microsensor Text./ T.Malinski, Z.Taha // Nature. 1992. - 358. -P.676-678.
173. Malyshev, LYu. Nitric oxide donor induces HSP70 accumulation in the heart and in cultured cells Text./ I.Yu.Malyshev, A.V.Malugin, L.Yu.Golubeva, T.A.Zenina, E.B.Manukhina, A.F.Vanin // FEBS Lett. 1996. - 391(1-2). - P. 21-23.
174. Malyshev, LYu. Nitric oxide is involved in heat-induced HSP70 accumulation Text./ I.Yu.Malyshev, E.B.Manukhina, V.D.Mikoyan, L.N.Kubrina, A.F.Vanin // FEBS Lett. -1995. 370. - P. 159-162.
175. Marin, J. Role of vascular nitric oxide in physiological and pathological conditions Text./ J.Marin, M.A.Rodriguez-Martinez // Pharmacol. Ther. 1997. -75.-P. 111-134.
176. Marshall, H.E. Nitrosation and oxidation in the regulation of gene expression Text./ H.E.Marshall, K.Merchant, J.S.Stamler // FASEB J. 2000. - 14. -P. 1889-1900.
177. Martinez, A. Nitric oxide synthase in invertebrates Text./ A.Martinez // Histochem. J. -1995. 27(10). - P. 770-776.
178. Masuda, К. Distribution and chemical characterization of regular arrays in the cell walls of strains of the genus Lactobacillus Text./ K.Masuda, T.Kawata // FEMS Microbiol. Lett. 1983. - 20. - P. 145-150.
179. Masuy, D. Alternative nitric oxide-producing substrates for NO synthases Text./ D.Masuy, J.-L.Boucher // Free Radic. Biol. Med. 2004. - 37. - P. 11051121.
180. Meineke, P. Cheletropic traps for the fluorescence spectroscopic detection of nitric oxide (nitrogen monoxide) in biological systems Text./ P.Meineke, U.Rauen, H.de Groot, H.-G.Korth // Chem. Eur. J. 1999. - 5. - P. 1738-1747.
181. Messner, P. Crystalline bacterial cell-surface layers Text./ P.Messner, U.B.Steytr // Adv. Microbial. Physiol. 1992. - 33. - P. 213-275.
182. Mizutani, F. Amperometric measurement of nitric oxide (NO) using an electrode coated with polydimethylsiloxane Text./ F.Mizutani, Y.Hirata, S.Yabuki, S.Iijima // Chem. Lett. 2000. - 7. - P. 802-803.
183. Modin, A. Nitrite-derived nitric oxide: a possible mediator of 'acidic-metabolic' vasodilation. Text./ A.Modin, H.Bjorne, M.Herulf, K.Alving, E.Weitzberg, J.O.Lundberg// Acta Physiol. Scand. -2001. -171(1). P. 9-16.
184. Molin, G. Numerical taxonomy of Lactobacillus spp. associated with healthy and diseased mucosa of the human intestines Text./ G.Molin, BJeppson, M.L.Johansson, S.Ahrne, S.Nobaek, M.Stahl, S.Bengmark. // J. Appl. Bacteriol. 1993. -74.-P. 314-323.
185. Mordvintcev, P. On-line detection of nitric oxide formation in liquid aqueous phase by electron paramagnetic resonance spectroscopy Text./
186. P.Mordvintcev, A.Mulsch, R.Busse, A.Vanin // Anal. Biochem. 1991. - 199. - P. 142-146.
187. Morita, H. Synthesis of nitric oxide from the two equivalent guanidine nitrogens of L-arginine by Lactobacillus fermentum Text./ H.Morita, H.Yoshikawa, R.Sacata, Y.Nagata, H.Tanaka//Bacteriol. 1997. - 179(24). - P. 7812-7815.
188. Moroz, L.L. Non-enzymatic production of nitric oxide (NO) from NO synthase inhibitors Text./ L.L.Moroz, S.W.Norby, L.Cruz, J.V.Sweedler, R.Gillette, R.B.Clarkson//Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. - 253(3). - P. 571-576.
189. Morris, S.L. Inhibition of Bacillus cereus spore outgrowth by covalent modification of a sulfhydryl group by nitrosothiol and iodoacetate Text./ S.L.Morris, J.N.Hansen //J. Bacteriol. 1981. - 148. - P. 465-471.
190. Moshage, H. Nitric oxide determinations: much ado about NO «-thing? Text./ H.Moshage // Clinical Chemistry. 1997. - 43(4). - P. 553-556.
191. Motohashi, N. Induction of SOS response in Salmonella typhimurium TA4107/pSK1002 by peroxynitrite-generating agent, N-morpholino sydnonimine Text./ N.Motohashi, Y.Saito // Mutat. Res. 2002. - 502(1-2). - P. 11-18.
192. Muller, U. The nitric oxide system in insects Text./ U.Muller // Prog. Neurobiol. 1997. - 51(3). - P. 363-381.
193. Murphy, M.E. Nitric oxide assay using hemoglobin method Text./ M.E.Murphy, E.Noack // Methods Enzymol. 1994. - 233. - P. 240-250.
194. Nakano, M.M. Induction of ResDE-dependent gene expression in Bacillus subtilis in response to nitric oxide and nitrosative stress Text./ M.M.Nakano // J. Bacteriol. 2002. - 184(6). - P. 1783-1787.
195. Nguyen, T.D. Characterization of Lactobacillus plantarum PH04, a potential probiotic bacterium with cholesterol-lowering effects Text./ T.D.Nguyen, J.H.Kang, M.S.Lee // Int. J. Food Microbiol. 2007. - 113(3). - P. 358-361.
196. Nicoloff, H. Two arginine repressors regulate arginine biosynthesis in Lactobacillus plantarum Text./ H.Nicoloff, F.Arsene-Ploetze, C.Malandain, M.Kleerebezem, F.Bringel // J. Bacteriol. 2004. - 186(18). - P. 6059-6069.
197. Ninnemann, H. Indications for the occurrence of nitric oxide synthases in fungi and plants and the involvement in photoconidiation of Neurospora crassa Text./ H.Ninnemann, J.Maier // Photochem. Photobiol. 1996. - 64(2). - P. 393398.
198. Noonan, B. The synthesis, secretion and role in virulence of the paracrystalline surface protein layers of Aeromonas salmonicida and Aeromonas hydrophila Text./ B.Noonan, T.J.Trust // FEMS Microbiol. Letters. 1997. - 154. -P. 1-7.
199. Orrhage, K. Bifidobacteria and lactobacilli in human health Text./ K.Orrhage, C.E.Nord // Drugs Exp. Clin. Res. 2000. - 26(3). - P. 95-111.
200. Pacelli, R. Nitric oxide potentiates hydrogen peroxide-induced killing of Escherichia coli Text./ R.Pacelli, D.A.Wink, J.A.Cook, M.C.Krishna, W.De Graff, N.Friedman, M.Tsokos, A.Samuni, J.B.Mitchell // J. Exp. Med. 1995. - 182. - P. 1469-1479.
201. Palva, A. Molecular biology of the Lactobacillus brevis S-layer gene (slpA) Text./ A.Palva // FEMS Microbiol. Rev. -1997. 20. - P. 83-88.
202. Pant, К. Structure of a nitric oxide synthase heme protein from Bacillus subtilis Text./ K.Pant, A.M.Bilwes, S.Adak, D.J.Stuehr, B.R.Crane // Biochemistry. -2002.-41.-P. 11071-11079.
203. Pantopoulos, K. Nitric oxide and the post-transcriptional control of cellular iron traffic Text./ K.Pantopoulos, G.Weiss, M.W.Hentze // Trends Cell Biol. 1994. -4(3).-P. 82-86.
204. Pelham, H.R. Speculations on the functions of the major heat shock and glucose-regulated proteins Text./ H.R.Pelham //Cell. 1986. - 46(7). - P. 959-961.
205. Pittner, J. Visualization of nitric oxide production and intracellular calcium in juxtamedullary afferent arteriolar endothelial cells Text./ J.Pittner, R.Liu, R.Brown, M.Wolgast, A.E.Persson// Acta Physiol. Scand. 2003. - 179. - P. 309-317.
206. Raman, C.S. Structural themes determining function in nitric oxide synthases Text./ C.S.Raman, P.Martasek, B.S.S.Masters // The Porphyrin Handbook; eds. K.M.Kadish, K.M.Smith, R.Guilard. N.Y.: Academic Press, 2000. - P. 293339.
207. Rapoport, R Cyclic guanosine monophosphate inhibition of contraction may be mediated through inhibition of phosphatidylinositol hydrolysis in rat aorta Text./ R.Rapoport // Circ. Ret. -1986. 58. - 407-410.
208. Rodriguez, J. Optical methods for the detection of nitric oxide Электронный ресурс./ J.Rodriguez, M.Feelisch. Электрон, дан. - Режим доступа: http://optics.sgu.ru/SFM/2003/internet/jrodrigu/Optics NO.htm, свободный.
209. Sabet, M. The surface (S-) layer is a virulence factor of Bacteroides forsythus Text./ M.Sabet, S.-W.Lee, R.K.Nauman, T.Sims, H.-S.Um // Microbiology. 2003. - 149. - P. 3617-3627.
210. Sara, M. Comparative studies of S-layer proteins from Bacillus stearothermophilus strains expressed during growth in continuous culture under oxigen-limited conditions Text./ M.Sara, U.B.Steytr // J. Bacteriol. 1994. - 176. -P. 7182-7189.
211. Sara, M. Conserved anchoring mechanisms between crystalline cell surface S-layer proteins and secondary cell wall polymers in Gram-positive bacteria Text./ M.Sara // Trends Microbiol. 2001. - 9. - P. 47-49.
212. Sara, M. Isolation of two physiologically induced variant strains of Bacillus stearothermophilus NRS2004/3a and characterization of their S-layer lattices Text./ M.Sara, D.Pum, S.Kupcu, P.Messner, U.B.Steytr // J. Bacteriol. 1994. - 176. -P. 848-860.
213. Sara, M. S-layer proteins Text./ M.Sara, U.B.Steytr // J. Bacteriol. 2000. -182(4).-P. 859-868.
214. Sari, M.-A. Detection of a nitric oxide synthase possibly involved in the regulation of the Rhodococcus sp. R312 nitrile hydratase Text./ M.-A.Sari, C.Moali, J.-L.Boucher, MJaouen, D.Mansuy // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. -250(2).-P. 364-368.
215. Schaffer, C. Surface-layer glycoproteins: an example for the diversity of bacterial glycosylation with promising impacts on nanobiotechnology Text./ C.Schaffer, P.Messner // Glycobiology. 2004. -14. - P. 31R-42R.
216. Schar-Zammaretti, P. The cell wall of lactic acid bacteria: surface constituents and macromolecular conformations Text./ P.Schar-Zammaretti, J.Ubbink // Biophys. J. 2003. - 85. - P. 4076-4092.
217. Schneitz, C. Adhesion of Lactobacillus acidophilus to avian intestinal epithelial cells mediated by the crystalline bacterial cell surface layer (S-layer) Text./ C.Schneitz, L.Nuotio, K.Lounatmaa // J. Appl. Bacteriol. 1992. - 74. - P. 290-299.
218. Schultze-Lam, S. Participation of a Cyanobacterial S-layer in a fine-grain mineral formation Text./ S.Schultze-Lam, G.Haranz, T.J.Beveridge // J. Bacteriol. -1992.-74.-7971-7981.
219. Shibuki, K. An electrochemical microprobe for detecting: nitric oxide release in brain tissue Text./K.Shibuki //Neurosci. Res. 1990. - 9. - P. 69-76.
220. Shyy, Y.-J. Fluid shear stress induces a biphasic response of human monocyte chemotactic protein 1 gene expression in vascular endothelium Text./ Y.-J.Shyy, H.-J.Hsieh, Usami S., Chien S. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994. -91(11).-P. 4678-4682.
221. Режим доступа: http://www.biomedcentral.eom/1471-2164/7/126, свободный.
222. Silvestrini, M.C. The kinetics of electron transfer between Pseudomonas aeruginosa cytochrome c-551 and its oxidase Text./ M.C.Silvestrini, M.G.Tordi, A.Colosimo, E.Antonini, M.Brunori // Biochem. J. 1982. -203. - P. 445-451.
223. Son, J.K. Cyclic guanosine-3',5'-monophosphate and biopteridine biosynthesis in Nocardia sp. Text./ J.K.Son, Rosazza J.P.N. // J. Bacterid. 2000. -182(13).-P. 3644-3648.
224. Stamler, J.S. S-nitrosothiols and the bioregulatoiy actions of nitrogen oxides through reactions with thiol groups Text./ J.S.Stamler // Curr. Top. Microbiol. -Д995.-196.-Р. 19-36.
225. Steytr, U.B. Bacterial S-layers Text./ U.B.Steytr, T.J.Beveridge // Trends Microbiol. 1999. - 7. - P. 253-260.
226. Steytr, U.B. Basic and applied S-layer research: an overview Text./ U.B.Steytr // FEMS Microbiol. Rev. 1997. - 20. - P. 5-12.
227. Steytr, U.B. Characterization and use of crystalline bacterial cell surface layers Text./ U.B.Steytr, M.Sara, D.Pum, В Schuster // Prog. Surf. Sci. 2001. - 68. -P. 231-278.
228. Steytr, U.B. Regular arrays of macromolecules of bacterial cell walls: structure, chemistry, assembly and function Text./ U.B.Steytr // Int. Rev. Cytol. -1978.-53.-P. 1-64.
229. Storz, G. Oxidative stress Text./ G.Storz, J.A.Imlay // Curr. Opin. Microbiol.- 1999.-2.-P. 188-194.
230. Sudhamsu, J. Structure and reactivity of a thermostable prokaryotic nitric-oxide synthase that forms a long-lived oxy-heme complex Text./ J. Sudhamsu, B.KCrane // J. Biol. Chem. 2006. - 281(14). - P. 9623-9632.
231. Takami, H. Complete genome sequence of the alkaliphilic bacterium Bacillus halodurans and genomic sequence comparison with Bacillus subtilis Text./
232. H.Takami, K.Nakasone, Y.Takaki, G.Maeno, R.Sasaki, N.Masui, F.Fuji, C.Hirama, Y.Nakamura, N.Ogasawara, S.Kuhara, K.Hirikoshi // Nucleic Acids Res. 2000. -28.-P. 4317-4331.
233. Tallon, R. Strain- and matrix-dependent adhesion of Lactobacillus plantarum is mediated by proteinaceous bacterial compounds Text./ R.Tallon, S.Arias, P.Bressollier, M.C.Urdaci // J. Appl. Microbiol. 2007. - 102(2). P. 442-451.
234. Fridovich // Circulation Research. 2001. - 89(3). - P. 224-236.
235. Thomas, S.R. Tyrosine phosphorylation of the tetragonal paracrystalline array of Aeromonas hydrophila: molecular cloning and high-level expression of the Slayer protein gene Text./ S.R.Thomas, T.J.Trust // J. Mol. Biol. 1995. - 245. - P. 568-581.
236. Timkovich, R. Isolation of Paracoccus denitrificans cytochrome cdj comparative kinetics with other nitrite reductases Text./ R.Timkovich, R.Dhesi, KJ.Martinkus, M.K.Robinson, T.M.Rea // Arch. Biochem. Biophys. 1982. - 215. -P. 47-58.
237. Toba, T. A collagen-binding S-layer protein in Lactobacillus crispatus Text./ T.Toba, R.Virkola, B.Westerlund, Y.Bjorkman, J.Sillanpaa, T.Vartio, N.Kalkkinen, T.K.Korhonen // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - 61. - P. 24672471.
238. Tsaneva, I.R. soxR, a locus governing a superoxide response regulon in Escherichia coli K-12 Text./ I.RTsaneva, B.Weiss // J. Bacteriol. 1990. - 172(8). -P. 4197-4205.
239. Tsikas, D. Endogenous nitric oxide synthase inhibitors are responsible for the L-arginine paradox Text./ D.Tsikas, R.H.Boger, J.Sandmann, S.M.Bode-Boger, J.C.Frolich // FEBS Letters. 2000b. - 478. - P. 1-3.
240. Tsuchiya, K. Sensitive quantitation of nitric oxide by EPR spectroscopy Text./ K.Tsuchiya, M.Takasugi, K.Minakuchi, K.Fukuzawa // Free Radic. Biol. Med. 1996.-21.-P. 733-737.
241. Ueda, T. The determination of nitrite and nitrate in human blood plasma by capillary zone electrophoresis Text./ T.Ueda, T.Maekawa, D.Sadamitsu, S.Oshita, K.Ogino, K.Nakamura// Electrophoresis. 1995. - 16. - P. 1002-1004.
242. Vallance, P. Direct measurement of nitric oxide in human beings Text./ P.Vallance, S.Patton, K.Bhagat, RMacAllister, M.Radomski, S.Moncada, T.Malinski //Lancet.-1995.-346.-P. 153-154.
243. Vallance, P. Use of L-arginine and its analogs to study nitric oxide pathway in humans Text./ P.Vallance // Methods Enzymol. 1996. - 269. - P. 453-459.
244. Ventura, M. Identification and characterization of novel surface proteins in Lactobacillus johnsonii and Lactobacillus gasseri Text./ M.Ventura, I.Jankovic, D.C.Walker, R.D.Pridmore, R.Zink // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - 68. - P. 6172-6181.
245. Vidgren, G. S-layer protein gene of Lactobacillus brevis cloning by polymerase chain reaction and determination of nucleotide sequence Text./ G.Vidgren, I.Pabva, R.Pakkanen, K.Lounatmaa, A.Palva 7/ J. Bacteriol. 1992. -174.-P. 483-492.
246. Wang, Z.-Q. Bacterial flavodoxins support nitric oxide production by Bacillus subtilis nitric-oxide synthase Text./ Z.-Q.Wang, RJXawson, M.RBuddha, C.-C.Wei, В.R.Crane, A.W.Munro, D.J.Stuehr // J. Biol. Chem. 2007. - 282(4). - P. 2196-2202.
247. Watmough, N.J. Nitric oxide in bacteria: synthesis and consumption Text./ N.J.Watmough, G.Butland, M.R. Cheesman, J.W.B. Moir, D.J.Richardson, S.Spiro // Biochim. Biophys. Acta. -1999. -1411. P. 456-474.
248. Weeg-Aerssens, E. Isotope labeling studies on the mechanism of N-N bond formation in denitrification Text./ E.Weeg-Aerssens, J.M.Tiedje, B.A.Averill. // J. Biol. Chem. 1986. - 261. - P. 9652-9656.
249. Wei, C.C. Tetrahydrobiopterin radical enzymology Text./ C.C.Wei, B.R.Crane, D.J.Stuehr // Chem. Rev. 2003. - 103. - P. 2365-2383.
250. Weitzberg, E. Nonenzymatic nitric oxide production in humans Text./
251. E.Weitzberg, J.O.N.Lundberg // Nitric Oxide. -1998. 2(1). - P. 1-7.
252. Wientjes, F.B. Respiratory nitrate reductase: its localization in the cytoplasmic membrane of Klebsiella aerogenes and Bacillus licheniformis Text./
253. F.B.Wientjes, A.H.J.Kolk, N.Nanninga, J.van't Riet. // Eur. J. Biochem. 1979. - 95. -P. 61-67.
254. Wolf, G. Effect of hematin on the activities of nitrite reductase, catalase in lactobacilli Text./ G.Wolf, W.P.Hammes // Arch. Microbiol. 1988. - 149. - P. 220224.
255. Wolf, G. Heme-dependent and heme-independent nitrite reduction by lactic acid bacteria results in different N-containing products Text./ G.Wolf, E.K.Arendt, U.Pfahler, W.P.Hammes // International Journal of Food Microbiology. 1990. - 10. -P. 323-330.
256. Woodmansee, A.N. Reduced flavins promote oxidative DNA damage in non-respiring Escherichia coli by delivering electrons to intracellular free iron Text./ A.N.Woodmansee, J.A.Imlay // J. Biol. Chem. 2002. 277. - P. 34055-34066.
257. Xu, J. Evaluation of nitric oxide production by lactobacilli Text./ J.Xu, W.Verstraete // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. - 56(3-4). - P. 504-507.
258. Yang, K. Prokaiyotic calmodulins: recent developments and evolutionary implications Text./ K.Yang // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2001. - 3(3). - P. 457-459.
259. Ye, R.W. Characterization of Tn5 mutants deficient in dissimilatory nitrite reduction in Pseudomonas sp. strain G-179, which contains a copper nitrite reductase Text./ RW.Ye, B.A.Averill, J.M. Tiedje // J. Bacteriol. 1992. - 174. - P. 66536658.
260. Ye, R.W. Denitrification: production and consumption of nitric oxide Text./ RW.Ye, B.A.Averill, J.M.Tiedje // Applied and Environmental Microbiology. -1994.-60(4).-P. 1053-1058.
261. Yin, S. Use of a green fluorescent protein-based reporter fusion for detection of nitric oxide produced by denitrifiers Text./ S.Yin, M.Fuangthong, W.P.Laratta, J.P.Shapleigh // Applied and Environmental Microbiology. 2003. -69(7).-P. 3938-3944.
262. Zemojtel, T. A novel conserved family of nitric oxide synthase? Text./ T.Zemojtel, T.Penzkofer, T.Dandekar, J.Schultz // TRENDS in Biochem. Sciences. -2004.-29.-P. 224-226.
263. Zemojtel, T. In search of the prototype of nitric oxide synthase Text./ T.Zemojtel, RC.Wade, T.Dandekar // FEBS Lett. 2003. - 554. - P. 1-5.
264. Zhang, D. Improved method to detect nitric oxide in biological systems Text./ D.Zhang, J.Xiong, J.Hu, Y.Li, B.Zhao // Appl. Magn. Reson. 2001. - 20. - P. 345-356.
265. Zumft, W.G. Cell biology and molecular basis of denitrification Text./ W.G.Zumft // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1997. - 61(4). - P. 533-616.
266. Zumft, W.G. Nitric oxide signaling and NO dependent transcriptional control in bacterial denitrification by members of the FNR-CRP regulator family Text./ W.G.Zumft // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2002. - 4(3). - P. 277-286.
267. Zweier, J.L. Direct measurement of nitric oxide generation in the ischemic heart using electron paramagnetic resonance spectroscopy Text./ J.L.Zweier, P.Wang, P.Kuppusamy // J. Biol. Chem. 1995. - 270. - P. 304-307.
268. Zweier, J.L. Non-enzymatic nitric oxide synthesis in biological systems Text./ J.L.Zweier, A.Samouilov, P.Kuppusamy // Biochim. Biophys. Acta. 1999. -1411(2-3).-P. 250-262.
-
Яруллина, Дина Рашидовна
-
кандидата биологических наук
-
Казань, 2007
-
ВАК 03.00.07
- Повышение уровня секреции внеклеточного полисахарида и выхода биомассы облигатной метилотрофной бактерии Methylophilus quaylei в присутствии экзогенных жирных кислот и их сложных эфиров
- Биологические свойства лактобацилл и тест-системы для их идентификации
- ПРИРОДА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ ЛАКТОБАЦИЛЛ
- Биологические свойства лактобацилл биотопов человека в норме и при дисбиозах
- Высокоантагонистические штаммы лактобацилл, перспективные для конструирования новых пробиотических препаратов
