Неупругое рассеяние света в модельных белках и полупроводниковых наноструктурах CdSe/ZnS, функционализированных пептидами

Байрамов, Фарид Бахыш оглы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Неупругое рассеяние света в модельных белках и полупроводниковых наноструктурах CdSe/ZnS, функционализированных пептидами
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Неупругое рассеяние света в модельных белках и полупроводниковых наноструктурах CdSe/ZnS, функционализированных пептидами"

На правах рукописи

ИЫ46Ы3809

Байрамов Фарид Бахыш оглы

НЕУПРУГОЕ РАССЕЯНИЕ СВЕТА В МОДЕЛЬНЫХ БЕЛКАХ И ПОЛУПРОВОДНИКОВЫХ НАНОСТРУКТУРАХ Сс18е/2п8, ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННЫХ ПЕПТИДАМИ

Специальность 03.01.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

1 О ИЮН 2010

Санкт-Петербург - 2010

004603809

Работа выполнена в Отделении молекулярной и радиационной биофизики Учреждения Российской академии наук Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН

Научные руководители: доктор биологических наук,_

(Владислав Александрович Ланшв 1

кандидат биологических наук, Дмитрий Михайлович Байтин

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

профессор, Николай Михайлович Кожевников

доктор физико-математических наук Владимир Григорьевич Маслов

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный технологический университет растительных полимеров».

Защита состоится «15» июня 2010 г. в 16:00 на заседании диссертационного совета Д 212.229.25 при ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный политехнический университет» по адресу:

195251, Санкт-Петербург, ул. Хлопина, д. 5, Факультет медицинской физики и биоинженерии, ауд. 305

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ВПО «Санкт Петербургский государственный политехнический университет».

Автореферат диссертации разослан мая 2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат физико-математических наук,

доцент Власова О. Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Современная биофизика представляет собой бурно развивающуюся междисциплинарную область знаний, определяемую быстрым развитием новых методов исследований структур и их взаимодействий, проявляющихся в биологических процессах. Прежде всего, это связано с возникновением в биофизике и молекулярной биологии нового направления -протеомики, изучающей взаимосвязь биологической активности белков и их структуры на молекулярном уровне. Это чрезвычайно важно как для фундаментальной науки, так и для биотехнологии. Другое важное и интенсивно развиваемое направление биофизики связано с исследованием нового класса низкоразмерных структур - полупроводниковых квантовых точек (ПКТ), фуикциопализировапных биоспецифическими лигандамн (в частности, пептидами), обладающими строгим сродством к клеточным структурам. Всё возрастающий интерес к такому классу материалов связан с уникальными флуоресцентными свойствами ПКТ в сравнении с традиционными органическими флуорофорами, что позволяет создавать эффективные биомаркеры и биосенсоры, средства адресной доставки лекарственных препаратов к клеткам-мишеням и онкологические диагностикумы. Развитие таких новых нанобиотехнологий немыслимо без фундаментальных структурных исследований и детального понимания физических процессов, протекающих как в отдельности в исходных системах - белковых молекулах и ПКТ, так и в целостной функционализированной структуре.

Структурные свойства белков на молекулярном уровне исследуются практически всеми самыми современными физическими методами такими как, рассеяние рентгеновских лучей, нейтронов, синхротронного излучения, электронная микроскопия, ЯМР-, оптическая- и ИК-спектроскопии и др. При этом требуются дорогостоящее оборудование и высококачественные кристаллы белков, имеющие большие линейные размеры. Для их получения необходимо использовать достаточно трудоемкие методы. Одним из наиболее важных и перспективных методов изучения вторичной структуры белков и закономерностей их конформационного поведения является лазерная спектроскопия неупругого (рамановского) рассеяния света (НРС) на колебаниях отдельных молекул. Исследование колебательных мод, зависящих от массы атомов и сил межатомного взаимодействия биомолекул, позволяет получить ценную информацию о механизмах химического, внутримолекулярного и межмолекулярного взаимодействия, о вторичной, а также третичной структуре белков. Это в первую очередь, связано с зависимостью спектральных параметров различных характеристических линий от конформации и локального окружения макромолекул, от механизмов межмолекулярных взаимодействий. Метод быстро развивается вместе с прогрессом лазерных, оптоэлектронных и компьютерных технологий. В настоящее время он становится все более привлекательным для выполнения разнообразных структурных исследований на молекулярном уровне. Дальнейшее совершенствование спектроскопии НРС в биомолекулах может играть важную роль в создании высокочувствительных аналитических методов, необходимых для развития перспективных направлений молекулярной диагностики. Высокая значимость и недостаточная разработанность указанных проблем протеомики определяет актуальность выбранной темы исследований.

Основная цель работы:

1. Получить и исследовать спектры неупругого рассеяния света микрокристаллов модельных белков лизоцима и ЯесАЕс в низкочастотном диапазоне

внутрирешеточных колебаний молекул в элементарной ячейке и высокочастотном диапазоне молекулярных колебаний различных атомов, образующих химические связи. Установить спектральные параметры, позволяющие определять степень структурной упорядоченности белков и дающие информацию о механизмах внутри- и межмолекулярных взаимодействий.

2. Методами спектроскопии НРС, люминесценции и оптического поглощения с использованием разработанных подходов исследовать суспензии ПКТ, сопряженные с короткими пептидами.

3. Исследовать специфичность взаимодействия с раковыми клетками ПКТ, функционализированных пептидами, имеющими сродство к интегринам раковых клеток.

Научная новизна работы:

1. Впервые получены и сопоставлены с данным по лизоциму спектры неупругого рассеяния света микрокристаллов белка RecAEc. При этом кристаллизация RecAEc также осуществлена впервые модифицированным методом «висящей капли». В спектрах RecAEc выделены узкие линии и полосы, позволяющие определить с высокой точностью относительное содержание аминокислот в белке в a-, ß- и у-конформациях и удостоверить высокую степень совершенства выращенных микрокристаллов.

2. Впервые с применением спектральных методов (в том числе спектроскопии неупругого рассеяния света) и разработанных подходов исследованы ПКТ CdS, функционализированные пептидами с различной степенью сродства к интегринам раковых клеток MDA-MB-435. Выявлены особенности электронных, оптических и колебательных свойств таких наноструктур. Показано, что взаимодействие таких ПКТ с раковыми клетками строго дискриминируется по наличию или отсутствию флуоресценции, отвечающей экситонному переходу между основными уровнями размерного квантования lS1/2(h) - lS(e).

Апробация работы. Обоснованность и достоверность результатов работы подтверждается их обсуждением на отечественных и международных конференциях и публикациями в ведущих реферируемых журналах. Результаты докладывались на следующих конференциях: 11-ой Международной конференции по рассеянию фононов в конденсированных средах, С-Петербург, 2004; 14-ом Международном симпозиуме «Наноструктуры: физика и технология», 2005, С-Петербург; Конференции Европейского общества по материаловедению - «Современные направления в нанонауках - от материалов к применениям», секция «Нанобиотехнологии», Ницца, Франция, 2006; 10-ом Международном венчурном семинаре «Российские технологии для промышленности» 2006, С-Петербург; 3-ей Международной конференции науки о материалах, 2006, Кишинёв; Конференции -«Молекулярная генетика, биофизика и медицина сегодня» Бреслеровские чтения II, 2007, С-Петербург; Международной конференции по функционализированным материалам и нанотехнологиям, 2007, Рига; Европейском симпозиуме международного общества оптических технологий (SPIE) по микроэлектронике для нового тысячелетия, 2007, Масполамос, Испания; Международной конференции «Химия и применения наноструктур», 2007, Минск; 8-ой Российской конференции по физике полупроводников, «Полупроводники-2007», Екатеринбург; 14-ой Международной конференции по биоинженерии и медицинской физике, 2008, Рига; Европейской конференции по нанотехнологиям стран Северной Европы, 2008, Копенгаген, Дания; Международной конференции «Комбинационное рассеяние - 80

лет исследований, 2008, Москва и Международном форуме по нанотехнологиям «Rusnanotech 08», Москва, 2008.

Основные научные положения, выносимые на защиту:

1. В полученных впервые спектрах НРС микрокристаллов белка RecAEc спектральные параметры линии Phe при 1004 см"1, Тгр при 1554 см"' и при 1664,6 см"1 (линия Амида I) позволяют определить структурные характеристики белка и степень совершенства таких микрокристаллов.

2. Измерения спектров оптического поглощения и люминесценции ПКТ позволяют отбирать структуры, обладающие малой полушириной линии люминесценции и высокой относительной эффективностью излучения, а комплексные исследования оптическими методами оптимизированных комплексов таких ПКТ, фунциаиализированных короткими пептидами позволяют установить особенности электронных, оптических и колебательных свойств таких наноструктур.

3. Функционализация ПКТ пептидом, последовательность 4-х концевых аминокислот которого имеет сродство к мембранным интегринам раковых клеток, обеспечивает селективное связывание таких

ПКТ с раковыми клетками, обнаруживаемое по флуоресценции, отвечающей экситонному переходу между основными уровнями размерного квантования lS3/2(h) - lS(e).

Достоверность и надежность результатов обеспечивается тщательной комплексной проработкой технического обеспечения экспериментов с разработкой прецизионных методик получения микрокристаллических образцов модельных белков лизоцима и RecAEc и проведением высокоточных измерений, а также выполнением тестовых измерений с проверкой воспроизводимости результатов. Помимо этого, такая цель достигалась сопоставлением с результатами, полученными при одинаковых экспериментальных условиях на исходных образцах, начиная с буферного раствора, а также на модельных образцах белка лизоцима. С этой же целью для всех 20 стандартных аминокислот создан собственный банк спектральных данных и основные научные положения экспериментально и теоретически обоснованы.

Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в 21 работе в отечественных и зарубежных изданиях.

Личный вклад автора: Научные результаты исследований, содержащиеся в диссертации, получены автором tía равных правах с соавторами и при его непосредственном участии на всех этапах работы. Он принимал участие в постановке задач, в работах по усовершенствованию методики получения микрокристаллов лизоцима и белка RecAEc, в измерениях спектров НРС в таких микрокристаллах и полупроводниковых наноструктурах, функционализированных различными пептидами, в измерениях спектров люминесценции, в обработке, анализе полученных данных и интерпретации результатов. Доля участия автора в опубликованных по теме диссертации работах составляет от 30% до 80%.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав («Литературный обзор», «Экспериментальные подходы и подготовка объектов исследования», «Лазерная спектроскопия неупругого рассеяния света микрокристаллов лизоцима и белка RecAEc», «Оптические свойства полупроводниковых квантовых точек CdSe/ZnS и их специфическое взаимодействие с раковыми клетками MDA-MB-435»), Заключения, Выводов и Списка цитированной литературы, включающего 136 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация изложена на 133 страницах и включает 23 рисунка и 3 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

В главе 1 представлен обзор имеющихся к настоящему времени наиболее важных результатов экспериментальных исследований НРС в белках. Параллельно приводятся результаты изучения молекулярной структуры лизоцима и RecAEc. Отмечается что, несмотря на большую активность рентгеноструктурных и электронно-микрографических исследований различных модифицированных и комплексных структур белка RecAEc и достигнутые при этом очевидные успехи, многие особенности его структуры на атомном уровне, которые могут быть получены из изучения колебательных движений различных атомов и молекулярных групп по спектрам НРС в кристалле RecAEc, еще не исследованы. Здесь же представлен обзор основных результатов исследования ПКТ и ПКТ, функционализированных биоспецифическими лигандами, делающих их привлекательными в качестве альтернативы традиционным флуоресцентным органическим молекулам. В этой главе обоснованы цели и задачи диссертационной работы.

Глава 2 посвящена экспериментальным подходам и подготовке объектов исследования. Описаны развитые в работе экспериментальные и методические подходы, примененные для получения спектроскопической информации о структуре белков и ПКТ, функционализированных биоспецифическими лигандами. Представлена схема экспериментальной установки для регистрации спектров НРС. Даны краткие характеристики источников возбуждения спектров - лазеров, а также измерительной аппаратуры.

Модельными объектами исследования выбраны лизоцим яичного белка и рекомбинационный белок RecAEc из Escherichia coli, для которого исследования НРС ранее не выполнялись. Создан банк спектральных данных колебательных свойств всех 20 L-аминокислот. В качестве ПКТ отобраны CdS и CdSe/ZnS, сопряженные со специально подобранными короткими пептидами: CGGGRGDS, CGGGRVDS, CGGIKVAV и CGGGLDV. Концевые аминокислотные последовательности в каждом из пептидов сконструированы таким образом, что одни обладали (RGDS), а другие (RVDS) не обладали сродством к специфическим трансмембранным клеточным структурам - интегринам раковых клеток MDA-MB-435.

Кристаллизация белка RecAEc была осуществлена модифицированным методом «висящей капли». При этом экспериментально изучен процесс медленного удаления растворителя для различных концентраций исходною раствора белка в диапазоне от 20 до 236 мкм в 20 мМ трис-ИС1-буфере с рН=7,5 и при различных температурах в интервале 18-25°С.

Подобрана оптимальная концентрация 50 мкМ раствора белка, для которой в оптимизированных контролируемых условиях (при температуре 20°С с точностью поддержания ± 0.1 °С и относительной влажности 60%) впервые осуществлен рост микрокристаллов белка RecAEc из пересыщенного раствора белка, солей буфера и их смесей. В таких же экспериментальных условиях осуществлялся рост микрокристаллов лизоцима. Приведены результаты отбора и контроля полученных образцов с помощью конфокального микроскопа (типичное изображение показано на рис. 1) и атомно-силовой микроскопии. Описаны наиболее характерные особенности рельефа естественных граней полученных образцов, Для последующих подробных структурных исследований выделены микрокристаллы белка RecAEc с размерами -2x3*5 мкм3.

Глава 3 посвящена лазерной спектроскопии неупругого рассеяния света микрокристаллов лизоцима и белка ЯесАЕс. На специально отобранных образцах микрокристаллов белка ЯесАЕс впервые получены спектры НРС. Отмечены основные сложности исследований коллективных колебательных движений в белках с большим числом аминокислот. Таким белком является белок КесАЕс, содержащий 352 аминокислоты. В первую очередь это связано с большим числом самих колебательных мод.

Рис. 1. Изображение, фрагмента пятна закристаллизовавшейся капли 50 мкМ раствора белка ЯесАЕс в 20 мМ трис-буфере с рН=7.5.

Размер кадра 550x750 мкм2, длина размерной метки 50 мкм.

Число нормальных мод колебаний N0 трехмерной системы вычисляется как общее число степеней свободы системы минус число степеней свободы, отвечающих за движение системы как целого (вращение или перемещение): N0=Зхп-6, где п -число атомов в элементарной ячейке. Для белка ЯесАЕс (пространственная группа Р6|) число атомов в асимметричной ячейке п,г=5355 (1662 атомов С, 2701- Н, 455-Ы, 525-0 и 12-8), а число атомов в элементарной ячейке и=6йд=32 130, и тогда число колебаний в элементарной ячейке N0=96 354. Для сравнения отметим, что в элементарной ячейке кристалла лизоцима, состоящего из 128 аминокислот, содержится 1960 атомов. Экспериментальный спектральный диапазон возможных частот, отвечающих таким колебаниям, а также межмолекулярным колебаниям, ограничен сверху ~ 4200 см'1, не учитывая обертонов или суммарных колебаний отдельных мод. Даже с учетом значительного снижения числа колебаний, например, за счет вырождения отдельных мод, задача экспериментальной регистрации таких спектров в виде изолированных линий или структурированных перекрывающихся полос кажется весьма проблематичной.

В работе измерены спектральные параметры нормальных колебаний в широком спектральном диапазоне от 200 до 3800 см"1.

Смещение частоты, с«"'

Рис. 2. Фрагмент спектра неупругого рассеяния света в микрокристаллах белка RecA из Е. coli в области частот 200-1000 см"1. Спектр получен при возбуждении излучением лазера с длиной волны 532,16 нм и мощностью 1 мВт при параллельных поляризациях падающего и рассеянного света.

Т=300К. Спектральное разрешение 4 см"'.

На рис. 2-4 приведены спектры НРС микрокристаллов белка RecAEc в диапазонах частот соответственно от 200 см"1 до 1000 см"' и от 1000 см"' до 1750 см"1.

Идентифицировать все многочисленные линии спектра НРС пока не представляется возможным, но анализ некоторых наиболее интенсивных линий позволяет получить важную информацию о различных уровнях структуры белка.

Особое внимание привлекает обнаружение четко выраженной линии при 1004 см"', которая приписана деформационным колебаниям атомов ароматического фенольного кольца Phe. При комнатной температуре измеренное значение полуширины (полной ширины на половине высоты) этой линии Г= 6,0 см"' (с поправкой на спектральное разрешение). Зависимость полуширины линии спектральной линии фонона с частотой v от температуры Г(Т) с учетом ангармонического взаимодействиям, обусловленного процессами распада этого фонона на два фонона с частотой v„=v/2 и рождения двумя такими фононам с частотами va одного фонона с частотой v может быть представлена в следующем виде

Г(Т) = /',, + а(1 + 2пг ), где n(j/„) =--—. (1)

"та-1

Здесь Г<„- полуширина фононной линии, независящая от температуры, а -полуширина фононной линии, обусловленная энгармонизмом при Т—>0, nv -

статистическим множитель Бозе-Эйнштейна, /г=6,620693* 10"34 Дж-с - постоянная Планка и кв = \ ,3806504х 10"23 Дж/К - постоянная Больцмана. Время жизни, соответствующее полуширине Г= 6,0 см"' и определенное как т=1/2жсГ=0,9х 10~12 секунд, впервые позволяет оценить временную шкалу таких колебаний. Здесь с -

скорость света. При комнатной температуре основной вклад в это время определяется указанными ангармоническими взаимодействиями. В пределе низких температур Т—>0, когда ангармонический вклад резко падает, это время определяет время жизни для данного колебания. Таким образом, время 1=0.9 пикосекунд задает нижний предел времени жизни для колебаний атомов ароматического кольца Phe. Представляет интерес сравнение этой величины полуширины Л=6,0 см"1 для линии Phe при 1004 см"1 в кристалле RecAEc, в элементарной ячейке которого содержится 32 130 атомов, с полушириной линии оптического фонона Л=1,3 см"1 с частотой при 1332 см"1 в упорядоченной решетке кристалла алмаза, в элементарной ячейке которого содержится всего 8 атомов углерода и, соответственно, колебательные спектры которого значительно проще. Известно, что в алмазе эта линия оптического фонона, связанная с противофазными колебаниями атомов углерода, испытывает значительное уширение (в десятки раз) при нарушении совершенства кристаллической решетки (при аморфизации, при больших концентрациях примесей, сопровождающихся образованием различных дефектов кристаллической структуры и т.д.). Из этого можно предположить, что выращенные микрокристаллы RecAEc могут иметь высокое совершенство кристаллической структуры.

Из ряда других наблюдавшихся спектральных особенностей, можно также выделить, к примеру, наблюдение серии линий (при 1771, 1616,1575,1554,1358, 1338, 1328, 1314 1253, 1204, 1118, 1009, 877 и 761 см"1), которые из анализа литературных данных и на основании собственного банка данных, полученных при таких же экспериментальных условиях, можно приписать Тф. Наблюдение именно такой серии линий способствует утверждению данной интерпретации.

Смещение частоты, см '

Рис. 3. Фрагмент спектра неупругого рассеяния света в микрокристаллах белка RecAEc в области частот «отпечатка пальцев» 1000-1750 см"'. Экспериментальные условия такие же, как и па рис. 2.

Показано, что измеренное значение частоты линии при 1554 см"', отвечающее колебаниям атомов ароматического индольного кольца Тгр, позволяет определить

величину торсионного угла /z/fC5'-C,'-(/i-C'a)=(l 14±0.5)°, что хорошо согласуется с расчетным значением средней величины этого угла у обоих Тгр-290 и Тгр-308

13±4)°, полученным недавно методом молекулярной динамики для RecA без ДНК М.Г. Петуховым.

Для более детального анализа на рис. 4 представлен фрагмент спектра НРС в микрокристаллах белка RecAEc для области частот 1500-1750 см"1. Спектр получен при возбуждении излучением непрерывного аргонового лазера с длиной волны 514,5 нм и мощностью 1 мВт. При обработке экспериментальных данных, выполненных с помощью пакета программ Origin7.5 Pro (OriginLab Corporation, USA), специально не выполнялось процедура сглаживания. Это делалось для того, чтобы не потерять наблюдавшиеся особенности сильной структурированности спектра, отражающие суперпозицию вкладов многих других колебаний большого числа функциональных групп.

1 г 'V1 ...' % у

>кL^rstf"-ft"?'/ *' , .-"/ч

„,& / f 'f'i

Amide I

fi i \

I \

j i J нерегулярные

•k

1 600 1650 1700

Смещение частоты. cu!

Рис. 4. Спектр неупругого рассеяния света в микрокристаллах белка ЯесАЕс в области частот 1500-1750 см"'. Пунктирные линии -спектральные составляющие, полученные при разложении полосы Амида I.

Стрелки указывают положения частот соответствующих линий различных аминокислот из собственного банка спектральных данных.

Этот спектр хорошо воспроизводился при возбуждении излучением второй гармоники непрерывного лазера на алюмоиттриевом гранате с длиной волны 532 нм, что является также дополнительным подтверждением, что все наблюдаемые линии обусловлены именно рассеянием света, а не люминесценцией. Стрелки указывают положения частот соответствующих линий различных функциональных групп аминокислот из созданного собственного банка спектральных данных, полученных при тех же экспериментальных условиях для всех Ь-аминокислот.

Обнаруженная наиболее интенсивная и четко выраженная характеристическая полоса приписана полосе Амида I. Измеренные значения положения максимума V и полуширины Г для полосы Амида I, полученные путем её описания с помощью лоренцевской кривой дают, соответственно, у= 1664,6 ±0,3 см"1 и Л=45,8 ±1,0 см"1 (при спектральном разрешении 4,0 см"1). Отметим, что наши оценки для этой полосы в

спектрах, полученных для 50 мкМ раствора белка RecAEc при тех же экспериментальных условиях, дают величину Г ~ 2 раза больше. Близкое значение полуширины полосы Амида I /"=44,3 ±1,0 см"' было получено нами при тех же экспериментальных условиях и для микрокристаллов модельного белка лизоцима в хорошем согласии с литературными данным. Аналогичными измерениями, представленными в другой опубликованной работе для кристалла Т6 - гексамера инсулина, было получено значение Г=43,7 см"'. При этом высокое совершенство кристаллов инсулина специально контролировалось рентгеновскими и многомерными ЯМР измерениями.

Проведенный детальный анализ на основе полученных экспериментальных данных позволил дополнительно подтвердить сделанный выше вывод о высоком кристаллическом совершенстве выращенных микрокристаллов белка RecAEc.

Показано, что такое обнаружение четкой и узкой полосы Амида I представляет особый интерес и для микроскопического описания особенностей вторичной структуры, позволяя надежно выполнить подробный анализ составляющих этой полосы.

Проведенное каноническое разложение полосы Амида I на элементарные составляющие, с фиксированными значениями частоты с помощью пакета программ Origin 7.5 Pro позволило с достаточно высокой точностью измерить площади под каждой из этих кривых и, соответственно, определить численные значениями содержания остатков, находящихся в а-спиралях (32,6%), /?-листах (19,0%) и нерегулярных у-конформациях (48,4.%). Причём численное значение содержания для у-конформаций для белка RecAEc экспериментально определено впервые. Это связано с тем, что такие неупорядоченные структуры не дают четких рефлексов при рентгенографических измерениях, и этот параметр является подгоночным в достаточно сложных теоретических моделях. Полученные результаты, в сравнении с рентгенографическими данными (погрешность такого сравнения не превышает 5%), наряду с обнаружением узких спектральных линий, рассмотренных выше, позволили сделать вывод о высоком кристаллическом совершенстве выращенных микрокристаллов белка RecAEc. Для модельного белка лизоцима, полученная нами, величина этой погрешности не превышает 6%, что хорошо согласуется с литературными данными для белка лизоцима и для других белков. Полученные результаты существенно продвигают вперед понимание на молекулярном уровне не только процессов роста микрокристаллов белка RecAEc, но и мало изученных механизмов их самоорганизации при осаждении белка из раствора на подложку. Они создают основу для последующих исследований свойств различных модификаций белка RecA с помощью лазерной спектроскопии НРС при направленной вариации его структуры внешними воздействиями, включая образование комплексов с Mg-АТФ и ДНК, и др., которые представляют белок RecAEc в активированном состоянии, необходимом для индуцирования рекомбинации. Помимо этого они также указывают на возможные методические подходы при изучении колебательных свойств и особенностей проявления межмолекулярных взаимодействий различных комплексов ПКТ, функционализированных биоспецифическими лигандами.

В главе 4 приведены результаты исследований возможных путей функционализации коллоидных ПКТ биоспецифическими лигандами, когда достигается согласование и объединение их индивидуальных свойств и функций в целостной структуре.

Здесь также кратко рассмотрены основные преимущества ПКТ по сравнению с органическими и металлическими флуоресцентными метками.

Экспериментально показано, что в спектрах оптического поглощения суспензии ПКТ СёБ, функционализированных пептидами СОООГКУАУ и СОвОЬОУ, обнаруживается проявление эффектов размерного квантования, а именно смещение края поглощения СёБ в сторону больших энергий с Ее1,(П)-2,60-2,63 эВ, соответственно, приписанных экситонному переходу 183/2(к) - 18(е) между основными уровнями размерного квантования тяжелых дырок (И) и электронов (с) ПКТ Сс15. По величине сдвига определен эффективный диаметр ПКТ СёБ, который оказался равным 3,0 нм, а в случае ПКТ Сс18е/7пЗ, функционализированных пептидами СССОЬОУ, диаметр КТ Сс18е ¿1=4,3 нм.

В этой главе приводятся также результаты обнаружения спектра НРС для оптимизированной концентрации водного раствора КТ СёЗе^пБ,

функционализированных ССООКСБ пептидами (рис 5). Такие комплексы были использованы для связывания с клетками МОА-МВ-435. Здесь специально подобрана концентрация 2 мг пептида ССССИСГО и 2 мл водного раствора ПКТ С(18е/7п8. В этом спектре из-за большой концентрация пептидов и воды, интенсивности соответствующих им полос достаточно большие. Они сильно подавляют спектры рассеяния света непосредственно от ПКТ Сс18е/2п8, которые локализованы вблизи 307 см"1. Для получения более структурированного спектра необходимо сильно уменьшить концентрации пептидов или закристаллизовать такой комплекс.

С««из*»»# частоты, см '

Рис.5. Спектр неупругого рассеяния света водного раствора ПКТ Ссйе/гпБ, функционализированных ССООРСЮ-пептидами.

Возбуждение осуществлялось излучением лазера с длиной волны 532 нм.

Из сравнения этого спектра со спектрами модельных белков установлено, что, что такая структура с коротким пептидом не содержит набора фрагментов упорядоченных канонических вторичных структур типа а-спиралей, /?-полос и др., имеющих место в регулярных пептидах и белках. Для сравнения на рис. 3 вертикальными линиями показаны результаты (из нашего банка спектральных

данных) для частот в спектрах НРС поликристаллических образцов аминокислот Cys, Gly, Arg и Asp, входящих в состав данного пептида. Установлено, что, такой спектр содержит сильно перекрывающиеся полосы, связанные с колебаниями молекулярных групп пептида CGGGRGD. Показано, что узкая полоса с максимумом при 1018 см"1 может быть приписана растягивающим связь v(C-N)slr колебаниям пептидной связи, а электростатическое взаимодействие положительно заряженной гуанидиновой группы аргинина и двух отрицательно заряженных карбоксильных групп аспарагиновой кислоты с поверхностными зарядами ПКТ Cd, Zn (+) и Se, S (-) могут дать вклад в уширения наблюдаемых полос.

Рис. 6. Спектр люминесценции ПКТ CdSe/ZnS, функционализированных пептидами СООО.

Далее приведены результаты исследования люминесценции ПКТ CdSe/ZnS, функционализированных пептидами ССОО, демонстрирующие обнаружение коротковолновой люминесценции (рис. 6) с симметричной полосой при 604,16 нм (2,05 эВ). Установлено, что она обусловлена оптическим переходом 15}/2(к) — 18(е) (рис. 7) и хорошо описывается гауссовой кривой с довольно малой величиной полуширины (полной шириной на половин е высоты) 26,8 нм, что указывает на высокое совершенство кристаллической структуры ансамбля самоорганизованных коллоидных ПКТ CdSe/ZnS.

Из сопоставления с известными результатами расчета зависимости энергии квантовых переходов от радиуса ПКТ по величине энергии перехода 2,05 эВ определен эффективный диаметр ПКТ, который оказался равным 3,0 нм с разбросом, не превышающим 5%.

В спектрах суспензии ПКТ CdS, функционализированных пептидами СОвИКУ АУ, обнаружена также широкая полоса длинноволновой люминесценции при 700 нм, обусловленная переходами между уровнями глубоких доноров и акцепторов ПКТ CdS. Обнаруженное гашение люминесценции с увеличением концентрации пептидов объяснено наличием у пептидов поверхностного химического связывания, приводящего к большей поверхностной локализации зарядов.

Установлено, что узкая полоса, обнаруженная на фоне широкой полосы люминесценции, при 2900-3700 см"', связана с наложением на спектры НРС валентных О-Н колебаний молекулы воды, рассмотренных в параграфе 4.5. Показано, что нормировка по интенсивности этой полосы может быть использована в качестве репера для оптического метода определения концентрации пептидов.

Рис. 7. Схема электронных уровней для ПКТ CdSe/ZnS.

Далее в этой главе приведены результаты исследования взаимодействия комплексов ПКТ CdS-пептиды с клетками-мишенями на примере раковых клеток MDA-MB-435. В пептидах CGGGRGDS, CGGGRVDS чередование последовательности концевых аминокислот RGDS и RVDS сконструировано таким образом, что пептиды с последовательностью RGDS обладают сродством к специфическим трансмембранным клеточным структурам, известным как интегрины нейронов раковых клеток MDA-MB-435. Утрата интегринов (например, при раке молочной железы) или их избыток (при меланоме и др.) сопряжены с высокой степенью злокачественности опухоли. Известно, что нарушение экспрессии и состава афз интегринов выявляются в большинстве опухолевых клеток. Метастазы клеток MDA-MB-435 содержат высокий уровень интегринов аф3.

t-интегрин

Рис. 8. Схематическое представление комплекса ПКТ CdS функционализированных пептидами, построенными из последовательности аминокислот CGGGRGDS, связанных с интегринами аф3 липидного бислоя клеточной мембраны.

Эти интегрииы аф) селективно узнают пептид последовательности RGDS. Следовательно, можно предположить, что комплекс ПКТ CdS, функционализированных пептидами, построенными из последовательности аминокислот CGGGRGDS, свяжется с клетками MDA-MB-435. Схематическое представление такого комплекса приведено на рис. 8. В то же время пептиды с концевой последовательностью RVDS не обладают таким сродством. Роль селективности таких пептидов в присоединении к клеткам-мишеням выявлена путем прямого наблюдения невооруженным глазом или с помощью флуоресцентного микроскопа (если необходимо выяснение детальной структуры клеток).

Показано, что связывание обнаруживается при освещении комплекса ПКТ CdS-CGGGRGDS-раковая клетка светом с длиной волны 360 нм по наличию излучения с длиной волны 440 нм, отвечающего экситонному переходу lS)n(h) - IS(e) ПКТ CdS с эффективным диаметром 3,0 нм. При этом в изображении, полученном при тех же экспериментальных условиях, также освещаемом светом с длиной волны 360 нм, но для комплекса ПКТ CdS-CGGGRVDS-раковая клетка, такое излучение с длиной волны 440 нм не наблюдается, что прямо указывает на факт отсутствия связывания такого комплекса с клетками MDA-MB-435.

Таким образом, полученные результаты демонстрируют селективность комплекса полупроводниковой точки на примере модельной системы CdS-пептид к раковым клеткам MDA-MB-435. Полученные данные представляют интерес для разработки бионаносенсоров, а также наносредств для целенаправленной доставки и точной локализации лекарственных препаратов, например, к пораженной клетке-мишени.

Выводы:

1. В полученных спектрах неупругого рассеяния света микрокристаллов белка RecAEc идентифицирован ряд линий, позволяющих судить о различных уровнях структуры белка. Узкая линия при 1004 см"1 приписана деформационным колебаниям атомов ароматического фенольного кольца Phe. Полуширина этой линии равна Г= 6,0 см"', что впервые позволяет определить время жизни таких колебаний г = 0,9 пикосекунд.

2. Значение частоты линии при 1554 см"' позволяет определить величину торсионного угла у2' (С)!-C'-d'-C) = (114 ± 0,5)°, что хорошо согласуется с расчетным значением средней величины этого угла /" '=(113±4)° у обоих триптофана белка RecAEc: Тгр-290 и Тгр-308.

3. Выполнено каноническое разложение выделенной полосы Амида I при v = 1664,6 ± 0,3 см"' и полушириной Г= 45,8 ± 1,0 см"' на спектральные составляющие, что позволило определить численные значения содержания аминокислотных остатков белка RecAEc в «-спиралях (32,6%), //-листах (19,0%) и нерегулярных у-конформациях (48,4%).

4. Анализ спектров неупругого рассеяния света микрокристаллов белка RecAEc позволил сделать вывод о высоком совершенстве кристаллической структуры выращенных микрокристаллов.

5. Экспериментальные измерения спектров оптического поглощения и люминесценции ПКТ CdS/ZnSe позволяют отобрать структуры с малой полушириной линии люминесценции (26,8 нм) и высокой относительной эффективностью

излучения, а комплексные исследования оптическими методами с привлечением спектроскопии НРС оптимизированных комплексов таких ПКТ, фунцианализированных короткими пептидами, позволяют установить особенности электронных, оптических и колебательных свойств таких наноструктур.

6. Функционализация ПКТ CdS пептидом, последовательность 4-х концевых аминокислот которого имеет сродство к мембранным интегринам раковых клеток MDA-MB-435, обеспечивает селективное связывание таких ПКТ с раковыми клетками, обнаруживаемое по флуоресценции, отвечающей экситонному переходу между основными уровнями размерного квантования lS3/¡(h) - lS(e).

Работа поддержана грантами: МНТЦ №2006 (2002-2004), МНТЦ №2007 (20022004), ИНТАС 03-51-6314 (2005-2007), РФФИ 06-02 16304-а (2006-2008) и Президиума РАН «Основы фундаментальных исследований нанотехнологий и наноматериалов» - Нанобиотехнологии (2009).

Автор чтит память о своем первом учителе и первом научном руководителе, Владиславе Александровиче Ланцове, идеи и советы которого оказали решающее влияние при выборе научной деятельности, а моральная поддержка, неиссякаемый оптимизм и неоценимая помощь помогали на всех этапах выполнения работы. Автор выражает искреннюю благодарность руководителю работы Дмитрию Михайловичу Байтину за совместный труд и помощь при заключительной работе над диссертацией. Особые слова благодарности Е.А. Глазунову за организацию и помощь в приготовлении образцов, за ценные консультации и замечания при написании рукописи, а также М.Г. Петухову, Г.Н. Рычкову и A.B. Швецову за полезные обсуждения и предоставление расчетных значений торсионных углов для Тгр-290 и Тгр-308, полученных ими методом молекулярной динамики для белка RecA, и В.В. Топорову за помощь в организации и проведении экспериментальных работ. Слова благодарности автор выражает всему коллективу Отделения молекулярной и радиационной биофизики ПИЯФ за всестороннюю поддержку.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Bayramov F., Toporov V.V., Petukhov M, Glazunov E., and Bairamov B.H. Structural Properties and Dynamics of Low-Energy Collective Excitations of Water and Lysozime // Phys. Status Solidi. (c). -2004. -v.l.-pp.3134-3137.

2. Bairamov B.H., Toporov V.V., Bayramov F.B., Petukhov M., Glazunov E.A., Shchegolev В., Li Y., Ramadurai D, Shi P., Dutta M., Stroscio M.A., Irmer G. Functionalzation of II-VI Semiconductor Quantum Dots With Peptides and Integrins of Cancer Cells for Biophotonic Applications // Moldavian. J. Phys. Sciensis. - 2006. -V.5. - pp.320-326.

3. Bairamov B.H., Toporov V.V., Bayramov F.B., Lanzov V.A., Glazunov E.A., Shchegolev В., Li Y., Ramadurai D, Shi P., Dutta M., Stroscio M.A., Irmer G. Inelastic Laser Light Scattering Spectroscopy Functionalization of Semiconductor Quantum Dots With Peptides and Integrins of Cancer Cells for Biophotonic Applications // J. Phys.: Conf. Ser. -2007.-v.93. -p.012046.

4. Bairamov B.H., Toporov V.V., Bayramov F.B., Vasidev M., Dutta M., Stroscio M.A., Irmer G. Semiconductors and Biomedical Structures for Nanobiometric Applications // Proceedings of the International Federation for Medical and Biological Engineering. Springer New York. -2008. -v.20. -pp.594-597.

5. Bairamov B.H., Toporov V.V., Bayramov F.B., Lanzov V., Dutta M., Stroscio M.A., Inner G. Selective Functionalization of II-VI Semiconductor Quantum Dots With Peptides and Integrins of Cancer Cells for Biophotonic Applications // Proceedings of SPIE. Bioengineered and Bioinspired Systems III. -2007. -v.6592 -pp. 65920W.

6. Bairamov B.H., Toporov V.V., Bayramov F.B., Vasidev M., Dutta M., Stroscio M.A., Irmer G. Semiconductors and Biomedical Structures for Nanobiometric Applications // Proceedings of the International Federation for Medical and Biological Engineering. Springer New York -2008. -v.20.-pp. 594-597.

7. Байрамов Ф., Петухов М.Г., Глазунов E. А. Исследование гидратации лизоцима с помощью лазерной спектроскопии неупругого рассеяния света // Материалы межвузовской научно-технической конференции, Санкт-Петербургский Государственный Политехнический Университет и НОЦ «Биофизика». -2004. -С.39.

8. Bayramov F., Toporov V.V., Petukhov М., Glazunov Е., and Bairamov B.H. Structural Properties and Dynamics of Short-Wavelength Collective Acousticlike Excitations of Water and Lysozyme // lllh International Conference on Phonon Scattering in Condensed Matter, St. Petersburg, Russia. Book of abstracts. -2004. -pp.202-203.

9. Bairamov B.H., Toporov V.V., Bayramov F.B., Petukhov M., Glazunov E.A., Shchegolev В., Li Y., Ramadurai D, Shi P., Dutta M., and Stroscio M.A. Functionalization of Semiconductor Quantum Dots with Biomedical Structures for Biophotonic Applications // Proceedings of the 14-th International Symposium, "Nanostructures: Physics and Technology", - Ioffe Institute, St. Petersburg. June 2630. -2006. -pp. 259-260.

10. Bairamov B.H., Toporov V.V., Bayramov F.B., Petukhov M., Glazunov E.A., Shchegolev В., Li Y., Ramadurai D, Shi P., Dutta M., and Stroscio M.A. Functionalization of Semiconductor Quantum Dots with Biomedical Structures // European Material Research Society Spring Meeting, Symposium A "Current Trends in Nanoscience - from Materials to Applications", Nanobiotechnology, Nice. -2006. -p. A12.

11. Bayramov F.B., Toporov V.V., Lanzov V.A., Petukhov M., Glazunov E.A., and Bairamov B.H. Development of Inelastic Laser Light Scattering Spectroscopy and Nanoscale Integration of Semiconductor Quantum Dots with Biomedical Structures for Biophotonic Applications. // 10-th Intern. Venturing Seminar "Russian Technologies for Industry", St. Petersburg. -2006. -p. 44.

12.Ф. Байрамов. Разработка лазерной спектроскопии неупругого рассеяния света и намомасштабная интеграция полуроводниковых квантовых точек с биоспецифическими лигандами для биофотонных приложений. // Приглашенный доклад на 2-ом Международном конкурсе диссертаций (The 2-nd Inside Edge International Thesis Competition), проводимой Исследовательской Компанией Самсунг Электро-Механикс, Сеул, Южная Корея, (Samsung Electro-Mechanics Research Center, Seul). -2006г. - С. 2. htlp://sem.samsung.ni/thesis.hlml: hilp://hepd.pnpi.spb.ru/ioc/ioc/line061112/n6.hlm

13. Байрамов Б.Х., Топоров B.B., Dutta M., Stroscio M.A., Байрамов Ф., Inner G. Селективная функционализация полупроводниковых квантовых точек с биомедицинскими структурами // «Молекулярная генетика, биофизика и медицина сегодня», Бреслеровские чтения-Н, Петербургский институт ядерной физики, Санкт-Петербург. -2007. -С.405-414.

M.Bairamov B.H., Toporov V.V., Bayramov F.B., Petukhov M., Glazunov E.A., Shchegolev В., Li Y., Ramadurai D, Shi P., Dutta M., Stroscio M.A., Irmer G. Inelastic Laser Light Scattering Spectroscopy and Functionalization of Semiconductor Quantum Dots With Peptides and Integrins of Cancer Cells for Biophotonic Applications // (Invited). Abstracts of the International Baltic Sea Region Conference Functional Materials and Nanotechnologies , FMandNT 2007, University of Latvia, Riga. -2007. -p.76.

15.Байрамов Б.Х., Топоров B.B., Байрамов Ф. Б., Ланцов В.А. Лазерная спектроскопия неупругого рассеяния света и селективная функционализация полупроводниковых квантовых точек с биомедицинскими структурами. // Тезисы VIII Российской конференции по физике полупроводников. Полупроводники-2007, Екатеринбург. -2007. -С.12.

16.Bairamov В.Н., Toporov V.V., Bayramov F.B., Lanzov V., Petukhov M., Glazunov E.A., Li Y., Ramadurai D, Shi P., Dutta M., and Stroscio M.A. Irmer G. Selective Functionalization of Semiconductor Quantum Dots With Short Peptides and Integrins of Cancer Cells for Biophotonic Applications // Physics, Chemistry, and Applications of Nanostructures. World Scientific. -2007. -pp. 511-515.

17.Bairamov B.H., Toporov V.V., Bayramov F.B., Vasidev M., Dutta M., Stroscio M.A., Irmer G. Nanoscale Functionalization of Semiconductor Quantum Dots with Cancer Cells for Nanobiometric Applications // The Europe Nanotechnology Conference Nanotech Northern Europe. Copenhagen, Spinverse,- 2008. - P. 136.

18. Байрамов Б.Х., Топоров B.B., Байрамов Ф. Б., Ланцов В.A. Irmer G. Неупругое резонансное рассеяние света в полупроводниках: от объемных материалов до квантовых точек, функционализированных биомедицинскими структурами // Тезисы докладов Международной конференции «Комбинационное рассеяние -80 лет исследований». Москва ФИАН. -2008. - С.21.

19. Байрамов Б.Х., Топоров В.В., Байрамов Ф. Б., Ланцов В.A., Vasidev М., Dutta М., Stroscio М.А., and Irmer G. Селективная функционализация полупроводниковых квантовых точек с биоспецифическими лигандами для нанобиометрических применений // Международный форум по нанотехнологиям Rusnanotech 08, Сборник тезисов докладов нанотехнологических секций, Роснано, Москва. -2008. - С.217-218.

20. Байрамов Ф.Б., Глазунов Е.А., Топоров В.В., Байрамов Б.Х. Самоорганизованный рост и лазерная спектроскопия неупругого рассеяния света микрокристаллов белка RecA из Е. Coli // Препринт ПИЯФ-2828, Гатчина.-2010.-С.27.

21. Байрамов Ф.Б. Лазерная спектроскопия полупроводниковых наноструктур, функционализированных раковыми клетками MDA-MB-435 с биомедицинскими материалами для нанобиометрических применений и ранней диагностики социально значимых болезней. // Тезисы докладов на конференции по физике и астрономии для молодых ученых Санкт-Петербурга и Северо-Запада, "Физика СПб", ФТИ им. А.Ф. Иоффе, Санкт-Петербург. - 2009. -С. 16.

Лицензия ЛР № 020593 от 07.08.97

Подписано в печать 13.05.2010. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 6032b.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812) 550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Байрамов, Фарид Бахыш оглы

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. СПЕКТРОСКОПИЯ НЕУПРУГОГО РАССЕЯНИЯ СВЕТА БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ И ПОЛУПРОВОДНИКОВЫХ КВАНТОВЫХ ТОЧЕК, ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННЫХ СПЕЦИФИЧЕСКИМИ ЛИГАНДАМИ

1.1. Основы теории неупругого рассеяния света в белках

1.2. Литературный обзор работ по экспериментаоьному исследованию неупругого рассеяния света в белках

1.3. Основные свойства белков лнзоцима и ИссАЕс.

1.4. О необходимости функционалшации полупроводниковых квантовых точек биоснецифическнми лигандами

1.5 Основные преимущества ПКТ но сравнению с органическими и ' металлическими флуоресцентными метками

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ И МЕТОДЫ ПОДГОТОВКИ ОБЪЕКТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Описание установки н методики для исследования спектров неупругого рассеяния света.

2.2. Получение микрокрис! аллов лнзоцима и белка КесАЕс с помощью моднфнфицированного метода "висящей капли".

2.3. Изучение микрокрис галлов белка 1*есАЕс с помощью конфокального микроскопа.

2.4. Изучение микрокристаллов 1*есАЕс с помощью атомно-енловой

Микроскопии

2.5. Выводы.

ГЛАВА 3. ЛАЗЕРНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ НЕУПРУГОГО РАССЕЯНИЯ СВЕТА МИКРОКРИСТАЛЛОВ ЛИЗОЦИМА И БЕЛКА ЯесАЕс

3.1. Экспериментальные результаты и их обсуждения

3.2. Выводы.

ГЛАВА 4. ОПТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПОЛУПРОВОДНИКОВЫХ КВАНТОВЫХ ТОЧЕК СаБе/гпБ, ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННЫХ ЛИГ АНДАМИ И ИХ СПЕЦИФИЧЕСКОЕ ВЗАИМДЕЙСТВИЕ С РАКОВЫМИ КЛЕТКАМИ МПА-МВ

4.1. Экспериментальные результаты и их обсуждения

4.1.1. Спектры оптического поглощения

4.1.2. Неунругое рассеяние света оптическими колебаниями водных растворов ПКТ СсШе/ХпБ, функционализнрованных ССССКСВ-иептидами.

4.1.3. Люминесценция ПКТ С{Ш, функционализнрованных пептидами

4.1.4. Люминесценция ПКТ Сс18, функционализнрованных пептидами ССССЖУАУ.

4.1.5. Исследование с помощью флуоресцентного микроскопа ПКТ, функционализнрованных раковыми клетками МБА-МВ

4.2.Вывод ы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Неупругое рассеяние света в модельных белках и полупроводниковых наноструктурах CdSe/ZnS, функционализированных пептидами"

Актуальность темы. Современная биофизика представляет собой бурно развивающуюся междисциплинарную область знаний, определяемую быстрым развитием новых методов исследований структур и их взаимодействий, проявляющихся в биологических процессах. Прежде всего, это связано с возникновением в биофизике и молекулярной биологии нового направления - протеомики, изучающей взаимосвязь биологической активности белков и их структуры на молекулярном уровне. Это чрезвычайно важно как для фундаментальной науки, так и для биотехнологии. Другое важное и интенсивно развиваемое направление биофизики связано с исследованием нового класса низкоразмерных структур - полупроводниковых квантовых точек (ПКТ), функционализированных биоспецифическими лигандами (в частности, пептидами), обладающими строгим сродством к клеточным структурам. Всё возрастающий интерес к такому классу материалов связан с уникальными флуоресцентными свойствами ПКТ в сравнении с традиционными органическими флуорофорами, что позволяет создавать эффективные биомаркеры и биосенсоры, средства адресной доставки лекарственных препаратов к клеткам-мишеням и онкологические диагностикумы. Развитие таких новых нанобиотехнологий немыслимо без фундаментальных структурных исследований и детального понимания физических процессов, протекающих как в отдельности в исходных системах - белковых молекулах и ПКТ, так и в целостной функционализированной структуре.

Одним из наиболее важных и перспективных методов изучения вторичной структуры белков и закономерностей их конформационного поведения является лазерная спектроскопия неупругого (рамановского) рассеяния света (НРС) на колебаниях отдельных молекул. Исследование колебательных мод, зависящих от массы атомов и сил межатомного взаимодействия биомолекул, позволяет получить ценную информацию о механизмах химического, внутримолекулярного и межмолекулярного взаимодействия, о вторичной, а также третичной структуре белков. Это в первую очередь, связано с зависимостью спектральных параметров различных характеристических линий от коиформации и локального окружения макромолекул, от механизмов межмолекулярных взаимодействий. Метод быстро развивается вместе с прогрессом лазерных, оптоэлектронных и компьютерных технологий. В настоящее время он становится все более привлекательным для выполнения разнообразных структурных исследований на молекулярном уровне. Дальнейшее совершенствование спектроскопии НРС в биомолекулах может играть важную роль в создании высокочувствительных аналитических методов, необходимых для развития перспективных направлений молекулярной диагностики. Высокая значимость и недостаточная разработанность указанных проблем протеомики определяет актуальность выбранной темы исследований.

Основная цель работы: 1. Получить и исследовать спектры неупругого рассеяния света микрокристаллов модельных белков лизоцима и ЯесАЕс в низкочастотном диапазоне внутрирешеточных колебаний молекул в элементарной ячейке и высокочастотном диапазоне молекулярных колебаний различных атомов, образующих химические связи. Установить спектральные параметры, позволяющие определять степень структурной упорядоченности белков и дающие информацию о механизмах внутри- и межмолекулярных взаимодействий.

2. Методами спектроскопии неупругого рассеяния света, люминесценции и оптического поглощения с использованием разработанных подходов исследовать суспензии ПКТ, сопряженные с короткими пептидами.

Научная новизна работы:

1. Впервые получены и сопоставлены с данным по лизоциму спектры неупругого рассеяния света микрокристаллов белка 11есАЕс. При этом кристаллизация ЯесАЕс также осуществлена впервые модифицированным методом «висящей капли». В спектрах 11есАЕс выделены линии, позволяющие определить с высокой точностью относительное содержание аминокислот в белке в а-, р- и у-конформациях и удостоверить высокую степень совершенства выращенных микрокристаллов.

2. Впервые с применением спектральных методов (в том числе спектроскопии неупругого рассеяния света) и разработанных подходов исследованы ПКТ Сс18е/2п8 , функционализированные пептидами с различной степенью сродства к интегринам раковых клеток МОА-МВ-435. Выявлены особенности электронных, оптических и колебательных свойств таких наноструктур. Показано, что взаимодействие таких ПКТ с раковыми клетками строго дискриминируется по наличию или отсутствию флуоресценции, отвечающей экситонному переходу между основными уровнями размерного квантования 18з/2(Ъ) - 18(е).

Апробация работы. Обоснованность и достоверность результатов работы подтверждается их обсуждением на отечественных и международных конференциях и публикациями в ведущих реферируемых журналах. Результаты докладывались на следующих конференциях: 11 -ой Международной конференции по рассеянию фононов в конденсированных средах, С-Петербург, 2004; 14-ом Международном симпозиуме «Наноструктуры: физика и технология», 2005, С-Петербург; Конференции Европейского общества по материаловедению - «Современные направления в нанонауках - от материалов к применениям», секция «Нанобиотехнологии», Ницца, Франция, 2006; 10-ом Международном венчурном семинаре «Российские технологии для промышленности» 2006, С-Петербург; 3-ей Международной конференции науки о материалах, 2006, Кишинёв; Конференции - «Молекулярная генетика, биофизика и медицина сегодня» Бреслеровские чтения II, 2007, С-Петербург; Международной конференции по функционализированным материалам и нанотехнологиям, 2007, Рига; Европейском симпозиуме международного общества оптических технологий (SPIE) по микроэлектронике для нового тысячелетия, 2007, Масполамос, Испания; Международной конференции «Химия и применения наноструктур», 2007, Минск; 8-ой Российской конференции по физике полупроводников, «Полупроводники-2007», Екатеринбург; 14-ой Международной конференции по биоинженерии и медицинской физике, 2008, Рига; Европейской конференции по нанотехнологиям стран Северной Европы, 2008, Копенгаген, Дания; Международной конференции «Комбинационное рассеяние - 80 лет исследований, 2008, Москва и Международном форуме по нанотехнологиям «Rusnanotech 08», Москва, 2008.

Основные научные положения, выносимые на защиту;

1. В полученных впервые спектрах НРС микрокристаллов белка RecAEc спектральные параметры линий Phe при 1004 см"1, Тгр при 1554 см"1 и при 1664,6 см"1 (линия Амида I) позволяют определить структурные характеристики белка и степень совершенства таких микрокристаллов.

2. Измерения спектров оптического поглощения и люминесценции ПКТ позволяют отбирать структуры, обладающие малой полушириной линии люминесценции и высокой относительной эффективностью излучения, а комплексные исследования оптическими методами оптимизированных комплексов таких ПКТ, фунцианализированных короткими пептидами позволяют установить особенности электронных, оптических и колебательных свойст в таких наноструктур.

ПКТ с раковыми клетками, обнаруживаемое по флуоресценции, отвечающей экситонному переходу между основными уровнями размерного квантования 18з/2(к) — Щг).

Достоверность и надежность резулыаюв обеспечивается тщательной комплексной проработкой технического обеспечения экспериментов с разработкой прецизионных методик получения микрокристаллических образцов модельных белков лизоцима и ЯесАЕс и проведением высокоточных измерений, а также выполнением тестовых измерений с проверкой воспроизводимости результатов. Помимо этого, такая цель достигалась сопоставлением с результатами, полученными при одинаковых экспериментальных условиях на исходных образцах, начиная с буферного раствора, а также на модельных образцах белка лизоцима. С этой же целью для всех 20 стандартных аминокислот создан собственный банк спектральных данных и основные научные положения экспериментально и георетически обоснованы.

Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в 21 работе в отечественных и зарубежных изданиях.

Личный вклад автора: Научные результаты исследований, содержащиеся в диссертации, получены автором на равных правах с соавторами и при его непосредственном участии на всех этапах работы. Он принимал участие в постановке задач, в работах по усовершенствованию методики получения микрокристаллов лизоцима и белка И.есАЕс, в измерениях спектров НРС в таких микрокристаллах и полупроводниковых наноструктурах, функционализированных различными пептидами, в измерениях спектров люминесценции, в обработке, анализе полученных данных и интерпретации результатов. Доля участия автора в опубликованных по теме диссертации работах составляет от 30% до 80%.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав («Литературный обзор», «Экспериментальные подходы и подготовка объектов исследования», «Лазерная спектроскопия неупругого рассеяния света микрокристаллов лизоцима и белка КссАЕс», «Оптические свойства полупроводниковых квантовых точек Сс18е/2п8 и их специфическое взаимодействие с раковыми клетками ¡УША-МВ-435»), Заключения, Выводов и Списка цитированной литературы, включающего 136 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация изложена па 133 страницах и включает 23 рисунка и 3 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Байрамов, Фарид Бахыш оглы

Основные результаты диссертационной работы, определяющие ее научную новизну, можно кратко сформулировать следующим образом:

1. В полученных спектрах неупругого рассеяния света микрокристаллов белка 11есАЕс идентифицирован ряд линий, позволяющих судить о различных уровнях структуры белка. Узкая линия при 1004 см"1 приписана деформационным колебаниям атомов ароматического фенольного кольца РЬе. Полуширина этой линии равна Г= 6,0 см'1, что впервые позволяет определить время жизни таких колебаний т = 0,9 пикосекунд.

2. Значение частоты линии при 1554 см"1 позволяет определить величину торсионного угла X'1 (С?1-С-С^-С1) = (114 ± 0,5)°, что хорошо согласуется с расчетным значением средней величины этого угла/==(113±4)°.у обоих остатков триптофана: Тгр-290 и Тгр-308.

3. Выполнено каноническое разложение выделенной полосы Амида I при V = 1664,6 ± 0,3 см"1 и полушириной Г= 45,8 ± 1,0 см"1 на спектральные составляющие, что позволило определить численные значения содержания аминокислотных остатков белка в в «-спиралях (32,6%), /?-листах (19,0%) и нерегулярных у-конформациях (48,4%).

4. Анализ спектров неупругого рассеяния света микрокристаллов белка ЯесАЕс позволил сделать вывод о высоком совершенстве кристаллической структуры выращенных микрокристаллов.

5. Экспериментальные измерения спектров оптического поглощения и люминесценции ПКТ Сс18/2п8е позволяют отобрать структуры, с малой полушириной линии люминесценции (26,8 нм) и высокой относительной эффективностью излучения, а комплексные исследования оптическими методами с привлечением спектроскопии НРС оптимизированных комплексов таких ПКТ, фунцианализированных короткими пептидами, позволяют установить особенности электронных, оптических и колебательных свойств таких наноструктур.

6. Функционализация ПКТ пептидом, последовательность 4-х концевых аминокислот которого имеет сродство к мембранным интегринам раковых клеток MDA-MB-435, обеспечивает селективное связывание таких ПКТ с раковыми клетками, обнаруживаемое по флуоресценции, отвечающей экситонному переходу между основными уровнями размерного квантования lS3/2(h) - IS(e).

Работа поддержана грантами: МНТЦ №2006 (2002-2004), МНТЦ №2007 (2002-2004), ИНТ АС 03-51-6314 (2005-2007), РФФИ 06-02 16304-а

2006-2008) и Президиума РАН «Основы фундаментальных исследований нанотехнологий и наноматериалов» - Нанобиотехнологии (2009).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Байрамов, Фарид Бахыш оглы, Санкт-Петербург

1. Landsherg G.S., Mandelstam L.I. Uber die Lichtzerstrenung in Kristallen. // Zs. Phys. B. -1928.-v.50.-pp.750.

2. Raman С .V., Krishnan K.S. A New Type of Secondary Radiation. // Nature. -1928. -v.121. -pp.508-511.

3. Гинзбург B.JI., Фабелинский И.Л. Еще раз к истории открытия комбинационного рассеяния света. // Вестник РАН. -2003. -т.73. -С.215-227.

4. Фабелинский И.Л. Комбинационному рассеянию света 70 лет. // УФН. -1998. -т.168. -С.1341.

5. Горелик B.C., Сущинский М.М., Комбинационное рассеяние света в кристаллах, УФН. -1969. -т.98. -С.2. Сущинский М.М. Резонансное рассеяние света, УФН. -1988. -Т.154.-С.З.

6. Loudon R . The Raman Effect in Crystals. // Advances in Physics. -1964. -v.52. -pp. 424482.

7. Набиев И.P., Ефремов P.Г., Чуманов Г.Д. Гигантское комбинационное рассеяние и его применение к изучению биологических молекул. // Успехи физических наук. -1988. -т. 154. -С.459-496.

8. Ojha А.К., Singha A., Dasgupta S., Singh R.K., and Roy A. pH dependent surface enhanced Raman study of the Phe+ag complex and DFT calculations for spectral analysis. // Chemical Physics Letters. -2006. -v.431. -pp. 121 -126.

9. Sonois V., Faller P., Bacsa W., Fazouan N., and Esteve A. Nanoscale needle shaped histidine and narrow vibrational Raman bands using visible excitation. // Chemical Physics Letters. -2007. -v.439. -pp.360-363.

10. Hannah S., Shafaat B.S., Michael T.J., and Judy E.R. Resonance Raman Characterization of a Stable Tryptophan Radical in an Azurin Mutant. // J. Phys. Chem. B. -2009. -v.113. -pp.382-388.

11. Tu E.R. Raman spectroscopy in biology: Principles and applications. New York, Wiley. -1982.

12. Austin J.C., Rodgers K.R., Spiro T.G. Protein structure from ultraviolet resonance Raman spectroscopy.In: Methods in enzymology. Chap. 15. -1993. -v.226. -pp.374-396.

13. Carey P.R. Raman spectroscopy, the sleeping giant in structural biology, awakes. // J. Biol. Chem. -1999. -v.274. -pp.26625-26628.

14. Kudryavtsev A.B., Christopher G., Smith C.D., Mirov S.B., Rosenblum W.M., DeLucas W.M. The elect of ordering of internal water in thaumatin and lysozyme crystals as revealed by Raman method. // J. Cryst. Growth. -2000. -v.219. -pp. 102-114.

15. Raso S.W., Clark P.L., Hasse-Pettingell C., King J., Thomas G.L., Distinct Jr. cysteine sulfhydryl environment detected by analysis of Raman S-H markers of Cys-Ser mutant proteins. // J. Mol. Biol. -2001. -v.307. -pp.899-911.

16. Carey P.R., Dong J. Following Ligand Binding and Ligand Reactions in Proteins via Raman Crystallography. // Biochemistry. -2004. -v.43. -pp.8885-8893.

17. Tuma R. Raman spectroscopy of proteins: From peptides to large assembles. // J. Raman Spectrosc. -2005. -v.36. -pp.307-319.

18. Carey P.R. Raman crystallography and other biochemical applications of Raman microscopy. //Annu Rev Phys Chem. -2001. -v.57. -pp.527-554.

19. Gelder J.D., Gussem K.D., Vandenabeele P. and L. Moens. Reference database of Raman spectra of biological molecules. // J. Raman Spectrosc. -2007. -v.38. pp.1133-1147.

20. Takeuchi H., and Harada I. Normal coordinate analysis of the indole ring. // Spectrochim. Acta. -1986. -v.42A. -pp. 1069-1078.

21. Takeuchi H., Kimura Y., Koitabashi I., and Harada I. Raman bands of N-deuterated histidinium as markers of conformation and hydrogen bonding. // J. Raman Spectrosc. -1991. -v.22. -pp.233-236.

22. Takeuchi H., Matsuno M., Overman S.A., and Thomas G.J., Raman Jr. linear intensity difference of flow-oriented macromolecules: Orientation of the indole ring of tryptophan-26 in filamentous virus fd. // J.Am. Chem. Soc. -1996. -v.l 18. -pp.3498-3507.

23. Benevides J.M., Overman S.A., and Thomas G.J., Raman Jr. Spectroscopy of Proteins Current Protocols in Protein Science. John Wiley & Sons, Inc. 17.8.1-17.8.35 (2003).

24. Wojtuszewski K., and Mukerji I. The HU-DNA binding interaction with UV resonant Raman spectroscopy: Structural elements of specificity. // Protein Science. -2004. -v. 13. -pp. 2416-2428.

25. Wen Z.Q., Thomas G.J., UV Jr. resonance Raman spectroscopy of DNA and protein constituents of viruses: Assignments and cross sections for excitations at 257, 244, 238, and 229 nm. // Biopolymers. -1998. -v.45. -pp.247-256.

26. Overman S.A., Thomas G.J., Novel Jr. vibrational assignments for proteins from Raman spectra of viruses. //J. Raman Spectrosc. -1998. -v.29 -pp.29 (1998).

27. Wen Z.Q., Thomas G.J., Ultraviolet Jr. resonance Raman spectroscopy of the filamentous virus Pf3: Interaction of Trp 38 specific to the assembled virion subunit. // Biochemistry.2000. -v.39. -pp. 146-152.

28. WenV, Thomas G.J., Overman SA, Bondre P. Structure and organization of bacteriophage Pf3 probed by Raman and ultraviolet resonance Raman spectroscopy. // Biochemistry.2001.-v.40. -pp.449-458.

29. Gelder J.D., Gussem J.D., Vandenabeele P. Vos P.D., and Moens L. Methods for extracting biochemical information from bacterial Raman spectra: An explorative study on Cupriavidas metalladurans. // Analytical chimica acta. -2007. -v.585. -pp.234-240.

30. Lord R.C., and Yu N. Laser-excited Raman spectroscopy of biomolecules. I. Native lysozyme and its constituent amino acids. // J. Mol. Biol. -1970. -v.50. -pp.509-524.

31. Bussian B.M., Sandler C. How to determine protein secondary structure in solution by Raman Spcctrosxopy: Practical guide and test case DNase I.// Biochemistry. -1989. -v.28. -pp.4271.

32. Xu M., Shashilov V., and Lednev I.K. Probing the Cross-a Core Structure of Amyloid Fibrils by Hydrogen-Deuterium Exchange Deep Ultraviolet Resonance Raman Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. -2007. -v. 129. -pp. 11002-11003.

33. Story R.M., Weber I.T. & Steitz T.A. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer. // Nature. -1992. -v.355. -pp.318-325.

34. Story R.M., & Steitz R.M., T. A. Structure of the recA protein-ADP complex. // Nature. -1992.-v.355.-pp.374-376.

35. Xing X., and Bell C.E. Crystal Structures of Escherichia coli RecA in a Compressed Helical Filament. // Mol. Biol. -2004. -v.342. -pp.1471-1485.

36. Roca A.I., and Cox M.M. RecA protein: structure, function, and role in recombinational DNA repair. // Prog. Nucl. Acid. Res. -1997. -v.56. -pp. 129-223.

37. Kowalczykowski S.C., Dixon D.A., Eggleston A.K., Lauder S.D., and Rehrauer W.M. Biochemistry of homologous recombination in Escherichia coli. // Microbiol. Rev. -1994. -v.58.-pp.401-465.

38. Lusetti S.L., and Cox, M.M. The bacterial RecA protein and recombinational DNA repair of stalled replication forks. // Annu. Rev. Biochem. -2001. -v.71. -pp.71-100.

39. Cromie G.A., Connelly J. C., and Leach D.R. Recombination at double-strand breaks and DNA ends:conserved mechanisms from phage to humans. // Mol. Cell. -2001. -v.8. -pp. 1163-1174.

40. Neale M.J., Keeney S. Clarifing the mechanisms of DNA starnd exchange in meotic recombination. // Nature. -2006. -v.442. -pp. 153-158.

41. Ланцов В.А., Бакланова И.В., Дудкина А.В. и Киль Ю.В. Регулироание рекомбинационной активности у бактерий. // Бреслеровские чтения II. Молекулярная генетика, биофизика, и медицина сегодня. ПИЯФ, С.-Петербург. -2007.-С.110-122.

42. Петухов М.Р., Лебедев Д.В., Карелов Д.В. и Исаев-Иванов В.В. Крупномасштабная конформационная подвижность филамента белка RecA. // Бреслеровские чтения И. Молекулярная генетика, биофизика, и медицина сегодня. ПИЯФ, С.-Петербург. -2007. С.99-109.

43. Петухов М.Г. Киль В. Ланцов В.А. О природе терморезистентности белков: стабильность альфа-спиралей белков RecA термофильных бактерий. // Докл. Акад. Наук. -1997. -т.356. -С.268-271.

44. Petukhov М., Lebedev D., Shalguev V., Islamov A. Kuklin A., Lanzov V., Isaev-Ivanov V. Conformational flexibility of RecA protein filament: transitions between compressed and stretched states. // Proteins. -2006. -v.65. -pp.296-304.

45. Baitin D.M., Bakhlanova I.V., Kil Y.V., Сох M.M., and Lanzov V.A. Distinguishing Characteristics of Hyperrecombinogenic RecA Protein from Pseudomonas aeruginosa Acting in Escherichia coli. //J. Bacteriology. -2006. -v. 188. -pp.5812-5820.

46. Aihara H., Ito Y., Kurumizakal H., Terada Т., Yokoyama S., and Shibata T. An Interaction Between a Specified Surface of the C-terminal Domain of RecA Protein and Double-stranded DNA for Homologous Pairing. // J. Mol. Biol. -1997. -v.274. -pp.213221.

47. Roca A.I., and Singleton S. F. Direct Evaluation of a Mechanism for Activation of the RecA Nucleoprotein Filament. //J. Am. Chem. Soc. -2003. -v.125. -pp. 15366-15375.

48. Roberts J.W., Roberts C.W., and Craig N.L. Escherichia coli recA gene product inactivates phage lambda repressor. // Proc. Natl Acad. Sei. USA. -1978. -v.75. -pp. 4714-4718.

49. Little J.W. Autodigestion of LexA and phage lambda repressors. // Proc. Natl Acad. Sei. USA. -1984. -v.81. -pp. 1375-1379.

50. Roca A.I., and Cox M.M. The RecA protein: structure and function. // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. -1990. -v.25. -pp.415-456.

51. DiCapua E., Engel A., Stasiak A., and Koller T. Characterization of complexes between RecA protein and duplex DNA by electron microscopy. // J. Mol. Biol. -1982. -v. 157. -pp.87-103.

52. DiCapua E., Schnarr M., Ruigrok R.W., Lindner P., and Timmins P.A. Complexes of RecA protein in solution. A study by small angle neutron scattering. // J. Mol. Biol. -1990. -v.214. -pp.557-570.

53. Egelman E.H., and Stasiak A. Structure of helical RecA-DNA complexes. Complexes formed in the presence of ATP-y-S or ATP. // J. Mol. Biol. -1986. -v.191. -pp.677-697.

54. VanLoock X., Yu M.S., Yang S., Reese J. T. and Egelman E. H. What is the structure of the RecA-DNA filament? // Curr. Protein Pept. Sei. -2004. -v.5. -pp.73-79.

55. Chen Z., Yang H., and Pavlctich N.P. Mechanism of homologous recombination from the RecA-ssDNA/dsDNA structures. // Nature. -2008. -v.453. -pp.489-496.

56. Стрелов В.И., Захаров Б.Г., Безбах И.Ж. и др. Кристаллизация белка лизоцима в прецизионно-управляемом градиенте температуры. // Кристаллография. -2007. -т. 52. -С.1134-1139.

57. Butt H.J., Downing К.H., Hansma P.К. Imaging the membrane protein bacteriorodopsin with the atomic force microscope. // Biophys. J. -1990. -v.58. -pp. 1473-1480.

58. Worcester D.L., Kim H.S., Miller R.G., Bryant P.J. Imaging bacteriorodopsin lattices in purple membranes with atomic force microscopy. // J. Vac. Sci. Technol. A. -1990. -v.8. -pp.403-405.

59. Hoh J.H., Sosinsky G.E., Revel J.P., Hansma P.K. Structure of the extracellular surface of the gap junction by atomic force microscopy. // Biophys. J. -1993. -v.65. -pp.149-163.

60. Vander K.O., Werf C.A. Putman J., Grooth B.G., Greve J. Adhesion force imaging in air and liquid by adhesion force mode atomic force microscope. // Appl. Phys. Lett. -1994. -v.65.-pp.1195-1197.

61. Yang J., Mou J., Shao Z. Structure and stability of pertussis toxin studied by in situ atomic force microscopy. // FEBS Lett. -1994. -v.338. -pp.89-92.

62. Radmacher M., Fritz M., Hansma H.G. Hansma P.K. Direct observation of enzyme activity with the atomic force microscope. // Science. -1995. -v.265. -pp. 1577-1579.

63. Yamada H., Hirata Y., Miyake J. Atomic force microscopy studies of photosynthetic protein membrane Langmuir-Blodgett films. // J. Vac. Sci. Technol. A. -1995. -v.13. -pp. 1742-1745.

64. Masai J., Shibata-Seki T., Ogawa Y. Sato K., Yanagawa H. Friction force microscopy of petide filament: an application to estimate the size of a supramolecular unit. // Thin Solid Films. -1996. -v.281-282. -pp.624-629.

65. Thomson N.H. Fritz M., Radmacher M.M., Cleveland J.P., Schmidt C.F., Hansma P.K. Protein tracking and detection of protein motion using atomic force microscopy. // Biophys. J. -1996. -v.70. -pp.2421-2431.

66. Hinterdorfer P., Baumgartner W. Gruber H.J., Schilcher K., Schilder H. Detection and localization of individual antibody-antigen recognition events by atomic force microscopy. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1996. -v.93. -pp.3477-3481.

67. Perrin A., Lanet V., Theretz A. Quantification of specific immunological reactions by atomic force microscopy. // Langmuir. -1997. -v. 13. -pp.2557-2563.

68. Binnig G., Gerber Ch., Stoll E„ Albrecht T.R., Quate C.F. Atomic resolution with atomic force microscope.//Europhys. Lett.-1987.-v.3.-pp.1281-1287.

69. Durbin S.D., Carlson W.E. Lysozyme crystal growth studied by atomic force microscopy. //Journal of Crystal Growth. -1992. -v.122. -pp.71-79.

70. Konnert J.U., D'Antonio P., Ward K.B. Observation of growth steps, spiral dislocations and molecular packing on the surface of lysozyme crystals with the atomic force microscope. // Acta Cryst. D. -1994. -v.50. -pp.603-613.

71. Land T.A., Malkin A.J., Kuznetsov Yu.G., DeYoreo J.J. Mechanisms of protein crystal growth: An atomic force microscopy study of canavalin crystallization. // Phys. Rev. Lett. -1995. -v.75. -pp.2774-2777.

72. McPherson A. The science of macromolecular crystallization. // Structure. -1995. -v.3. -pp .759-786.

73. Kuznetsov Yu.G., Malkin A.J., Land T.A., DeYoreo J.J., Barba A.P., Konner J., McPherson A. Molecular resolution imaging of macromolecular crystals by atomic force microscopy. // Biophys. J. -1997. -v.72. -pp.2357-2364.

74. Жавнерко Г.К. Кучук Т.А., Агабеков В.Е., Галлямов М.О., Яминский И.В. Свойства и структура мономолекулярных пленок на основе Ы-октадил-3,4:9,10-перилен-бис-(дикарбоксимидина). // Журнал физической химии. -1999. -v.73. -pp. 1244-1248.

75. Рашкович JI.H., Филонов А.С. Яминский И.В. О форме ступеней на грани (010) кристаллов ромбического лизоцима. // Кристаллография. -2008. -v.53. -pp.346-350.

76. Dubrovin E.V., Voloshin A.G., Kraevsky S.V., Ignatyuk Т.Е., Abramchuk S.S., Yaminsky I.V., and Ignatov S.G. Atomic force microscopy investigation of phage infection of bacteria. // Langmuir. -2008. -v.24. -pp. 13068-13074.

77. Рашкович JI.H., Гвоздев H.B., Яминский И.В. Механизм движения ступеней при кристаллизации лизоцима. // Кристаллография. -1998. -v.43. -pp.745-750.

78. Темкина Н., Филонов А. Яминский И. Силовая спектроскопия единичных макромолекул и их комплексов с использованием АСМ. // Наноиндустрия. -2008. -v.6. -pp. 26-29.

79. Образцова Е.А., Калинина Н.О., Тальянский М.Е., Габренайте-Верховская Р., Макинен К., Яминский И.В. Атомно-силовая микроскопия А вируса картофеля. // Коллоидный журнал. -2008. -v.70. -pp. 199-201.

80. Григорьева Н.Р., Григорьев Р.В. Новиков Б.В., Анкудинов А.В. и др. Морфология стабилизированных естественных граней твердого раствора CdS|.xSex. // ФТТ. -2006. -v.48.-pp.591-596.

81. Howell N.K., Herman Н., Li-Chan Е. Elucsidation of protein-lipid interactions in a lysozyme-corn oil system by Fourier transform Raman spectroscopy. // J. Agric. Food Chem. -2001. -v.49. -pp. 1529-1533.

82. Howell N.K., Li-Chan E. Elucsidation of interactions of lysozyme with wey proteins by Raman spectroscopy. // Int. J. Food Sci. Technol. -1996. -v.31. -pp.439-451.

83. Шайтан К.В, Михайлюк М.Г., Леонтьев К.М., Сарайкин С.С., Беляков А.А. Молекулярная динамика изгибных флуктуаций элементов вторичной структуры белков. // Биофизика. -2002. -v.47. -pp.411-419.

84. Shaitan K.V. Protein dynamics and new approaches to the molecular mechanisms of protein functioning. In: Stochastic Dynamics of Reacting Biomolecules (ed. Ebeling W., Romanovsky Yu., Schimansky-Geier L.) // World Scientific. -2003. -pp.283-308.

85. Mikhonin A.V., Ahmed Z., Ianoul A., and Asher S.A. Assignments and Conformational Dependencies of the Amide III Peptide Backbone UV Resonance Raman Bands. // J. Phys. Chem. B. -2004. -v. 108. -pp. 19020-19028.

86. Dong J., Wan Z., Popov M. Carey P.R., and Weiss M.F. Insulin assembly damps conformational fluctuations: Raman analysis of Amide I linewidths innative state and fibrils. //J. Mol. Biol. -2003. -v.330. -pp.431-442.

87. Zheng R. Zheng X. Dong J., and Carey P.R. Proteins can convert to (3-sheets in single crystals. // Protein science. -2004. -v.13. -pp.1288-1294.

88. Edler J., and Harnm P. Spectral response of crystalline acetanilide and N-methylacetamide: Vibrational self-trapping in hydrogen-bonded crystals. // Phys. Rev. B. -2004. -v.69. -pp.214301.

89. H'edoux A., Affouard F., Descamps M., Guinet Y., and Paccou L. Microscopic description of protein thermostabilization mechanisms with disaccharides from Raman spectroscopy investigations. // J. Phys.: Condens. Matter. -2007. -v. 19. -pp.205142.

90. Debelle L.A., Alix J.P., Jacobi M., Huvenne J., Berjot M., Sombret В., and Legrand P. Bovine Elastin and k-Elastin Secondary Structure Determination by Optical Spectroscopies. // J. Biol. Chem. -1995. -v.270. -pp.26099-26103.

91. Huang C.Y., Balakrishnan G. and Spiro T.G. Protein secondary structure from deep-UV resonance Raman spectroscopy. // J. Raman Spectr. -2006. -v.37. -pp.277-282.

92. Shashilov Y.A., and Lednev I.K. 2D Correlation Deep UV Resonance Raman Spectroscopy of Early Events of Lysozyme Fibrillation: Kinetic Mechanism and Potential Interpretation Pitfalls. //J. Am. Chem. Soc. -2008. -v. 130. -pp.309-317.

93. Zavaleta C., Zerda A., Liu Z., Keren S., Cheng Z., Schipper M., Chen X., Dai H., Gambhir S.S. Noninvasive Raman Spectroscopy in Living Mice for Evaluation of Tumor Targeting with Carbon Nanotubes.//Nano Letters. -2008. -v.8. -pp.2800-2805.

94. Liu Z„ Cai W„ He L„ Nakayama N., Chen K., Sun X., Chen X., and Dai H. In vivo biodistribution and highly efficient tumour targeting of carbon nanotubes in mice.// Nature Nanotechnology. -2006. -v.2. -pp.47 52.

95. Liu Z„ Li X., Tabakman S.M. Jiang K., Fan S., and Dai H. Multiplexed Multi-Color Raman Imaging of Live Cells with Isotopically Modified Single Walled Carbon Nanotubes. // J. Am. Chem. Soc. -2008. -v. 130. -pp. 13540-13541.

96. Екимов А.И., Онущенко А.А. Квантовый размерный эффект в трехмерных микрокристаллах полупрорводников. // Письма в ЖЭТФ. -1981. -т.34. -С.363-366.

97. Murray С.В., Norris D.J., Bawendi M.G. Synthesis and characterization of nearly monodisperse CdE (E = sulfur, selenium, tellurium) semiconductor nanocrystallites. // J. Am. Chem. Soc. -1993. -v.l 15. -pp.8706-8715.

98. Danek M., Jensen K.F., Murray C.B., and Bawendi M.G. Synthesis of Luminescent Thin-Film CdSe/ZnSe Quantum Dots Composites Using CdSe Quantum Dots Passivated With an Overlayer ZnSe. // Chem. Mater. -1996.-V.8, -С. 173-180.

99. Bfranov A.V. et.al. Effect of ZnS shell thickness on the phonon spectra in CdSe quantum dots. // Phys. Rev. B. 2003. -v.68. -pp.165306.

100. Олейников В.А., Суханова А.В., Набиев И.P. Флуоресцентные полупроводниковые метки в биологии и медицине. // Российские нанотехнологии, 2007. -т.2. -С.160-173.

101. Algar W.R. and Krull U.J. Multidentate Surface Ligand Exchange for the Immobilization of CdSe/ZnSe Quantum Dot-Oligonucleotide Conjugates. // Langmuir. -2008. -v.24. pp.5514- 5520.

102. Chan W., and Nie S. Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection. // Science. -1998. -v.281. -pp.2016-2024.

103. Zhang C.Y. et al. Quantum dot-labeled trichosanthin. // Analyst. -2000. -v. 125. pp. 10291031.

104. Winter J.O., et al. Recognition molecule directed interfacing between semiconductor quantum dots and nerve cells. // Adv. Mater. -2001. -v.13. -pp.1673-7.

105. Thomas N. L., Allione M., Fedutik Y., Woggon U., Artemyev M.V., and Ustinovich E.A. Multiline spectra of single CdSe/ZnS core-shell nanorods. // Appl. Phys. Lett. -2006. -v.89. -pp.263115.

106. Bimberg D., Grundmann M., and Ledentsov N.N. Quantum dot Heterostructures. // (New York, Wiley). 1998.

107. Leatherdale C.F., Woo W.R. Mikulec F.V., Bawendi M.G. Emission Intensity Dependence and Single-Exponential Behavior In Single Colloidal Quantum Dot Fluorescence Lifetimes. // J. Phys. Chem. B. -2002. v. 106. -pp.7619.

108. Wolcott A., Gerion D., Visconte M., Sun J., Schwartzberg A., Chen S.H., and Zhang J.Z. Silica-Coated CdTe Quantum Dots Functionalized with Thiols for Bioconjugation to IgG Proteins. // J. Phys. Chem. B. -2006. -v.l 10. -pp.5779.

109. Gerion D., Pinaud F., Williams Sh., Parak W.J., Zanchet D., Weiss Sh., and Alivisatos A.H. Synthesis and Properties of Biocompatible Water-Soluble Silica-Coated CdSe/ZnS Semiconductor Quantum Dots. // J. Phys. Chem. B. -2001. -v.105. -pp.8861.

110. Goldman E.R., Anderson G.P. Tran P.N., Mattoussi H., Charles P., and Mauro J.M. Conjugation of Luminescent Quantum Dots with Antibodies Using an Engineered Adaptor

111. Protein To Provide New Reagents for Fluoroimmunoassays. // Anal. Chem. -2002. —v.74. -pp. 841.

112. Ji X., Zheng J., Xu J. Rastogi V.K., Cheng T.C., DeFrank J., and Leblanc R.M. CdSe/ZnS Quantum Dots and Organophosphorus Hydrolase Bioconjugate as Biosensors for Detection of Paraoxon. II J. Phys. Chem. B. -2005. -v. 109. -pp.3793-3799.

113. Днепровский B.C., Добынде И.И., Жуков Е.А. и Санталов А.Н. Замедление релаксации по уровням размерного квантования в квантовых точках с ростом числа возбужденных состояний. // Физика твердого тела. -2007. -т.49. -С.741-744.

114. Dybiec M., Chomokur G., Ostapenko S., Wolcott A., Zhang J.Z., Zajac A., Phelan C., Sellers T., and Gerion G. Photolumineseence spectroscopy of bioconjugated CdSe/ZnS quantum dots. // Appl. Phys.Lett. -2007. -v.90. -pp.263112.

115. Huynh W.U., Dittmer J.J., and Alivisatos A.P. Hybrid Nanorod-Polymer Solar Cells. // Science. -2002. -v.290. -pp.2425.

116. Bruchez M.P., Moronne M., Gin P., Weiss S., and Alivisatos F.P. // Science. -1998. -v. 281.-pp.2013.

117. Chan W.C., Maxwell D.J., Gao X., Bailey R.E., Han M., Nie S. Luminescent quantum dots for imaging. // Curr. Opin. Biotechnol. -2002. -v. 13. -pp.40-44.

118. Klimov V.I. McBranch D.W. Leatherdale C.A., and M.G. Bawendi. Electron and hole relaxation pathways in semiconductor quantum dots. // Phys. Rev. B. -1999. -v.60. -pp.13740.

119. Torchynska T.V., Interface states and bio-conjugation of CdSe/ZnS core-shell quantum dots. // Nanotechnology. -2009. -v.20. -pp.095401.

120. Zhao X.S., Schroeder J., Persans P.D., and Bilodeau T.G. Resonant-Raman-scattering and photoluminescence studies in glass-composite and colloidal CdS. // Phys. Rev. B, Condens Matter. -1991. -v.43. -pp. 12580-12589.

121. Creti A. et al. Role of the shell thickness in stimulated emission and photoinduced absorption in CdSe core/shell nanorods. // Phys. Rev. B. -2006. -v.73. -pp.165410.

122. A Creti et al., Ultrafast carrier dynamics and confined acoustic phonons in CdSe nanorods. //J. Opt Pure and Apllied Optics. -2008. -v. 10. -pp.064005.

123. Creti A. et al. Role of defect states on Auger processes in resonantly pumped CdSe nanorods. // Appl. Phys. Lett. -2007. -v.91. -pp.093106.

124. Peng Z.A., and Peng X. Formation of high-quality CdTe, CdSe, and CdS nanocrystals using CdO as precursor. // J. Am. Chem. Soc. -2001. -v.123. -pp.183-4.

125. Stroscio M.A., and Dutta M. Advances in Quantum Dot Research and Technology: The Path to Applications in Biology, in Advanced Semiconductor Heterostructures. // World Scientific Publ. Co., Singapore. 2003.

126. Rufo S., Dutta M., and Stroscio M.A. Acoustic Modes in Free and Embedded Quantum Dots. // J. Appl. Phys. -2003. -v.93. -pp.2900.

127. Mizejewski M.A. Role of Integrins in Cancer: Survey of Expression Patterns. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. -1999. -v.222. -pp.124-138.

128. Wong N.C., Mueller B.M., Barbas C.F., Ruminski P., Quaranta V., Lin E.C., and Smit J.W. Alpha v Integrins Mediate Adhesion and Migration of Breast Carcinoma Cell Lines. // Clin. Exp. Metastasis. -1998. -v. 16. -pp.50-61.t

Информация о работе

Байрамов, Фарид Бахыш оглы
кандидата физико-математических наук
Санкт-Петербург, 2010
ВАК 03.01.02

Диссертация

Неупругое рассеяние света в модельных белках и полупроводниковых наноструктурах CdSe/ZnS, функционализированных пептидами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Неупругое рассеяние света в модельных белках и полупроводниковых наноструктурах CdSe/ZnS, функционализированных пептидами - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы