Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Необратимое взаимодействие гемоглобина человека с перидоксаль -5- фосфатом

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Необратимое взаимодействие гемоглобина человека с перидоксаль -5- фосфатом"

2 92

вдаа ЫАЖ ЕШЕУСК ЙЕСТКТЗГГ (иОТОбИОЛОГИК

на правах рукописи КОНОВАЛОВА. ВОЙНА В1ЩМРСША

ЕЕОЕРАТКИОЕ ЗЗДШОДЕЙСШЕ 1МООША ЧЕЛОВЕКА С Е'дРидОйСАЕЬ-б-ФОС'аАТШ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация ва сшсканна ученой стелена кандидата йишюстнесЕЕх'наук

Малек 1232 .

и -

Рабата вщюлнэна а лаборатории бко^кзнки Института биахиьы!-: АЗ. Беларуси

Научные руководители:, академик. АН Бе.'арусЕ, доктор медицин..

ских наук, профессор Ссхровск::и 1.1/;. кандидат бЕОЮгетесЕКх паук, ведухи научный сотрудйшк Степуро

Официальные оппоненты:, доктор биологически: ааук

Черщщниа. Е.А.

кандидат ^шшса-ттоиатшцзсик: т-ауи ^ельнэдкш А.К.

Ведрда. организация.'- 'Шскгаус ислаку.-шрно1й биологии пл.

. В.А.Энгельгардга, Москва

Здггота диссертации состоится 1992 г. в

/9 часов, на заседании, специализированного СоЕета яр .защг дсшорскшс диссертаций. Д.006.05.01 в Института ^отоб;юлог:п: АК Беларуси. (220733, Мшок, уд. ¿.Скорщщ.),2?).

■ С дасаертацней. мазно огнааошться. з баблшишсе ¿¿штату ФотсбЕОЛегиа ¿Е Беларуси . '

¿вхорзфараг разослан ".. " ___ 1992 г.

1чвж£1 секретарь специализированного совета, кандидат биолог^ескш: наук

ОБЩАЯ ШШШШУШк РАБОТЫ

f Актуальность теш. Имеется. большое, число физических и. _ •,'к3.пзлпческих факторов., вызывающих молекулярное повреждение белка, "¿ций =рлскулнфное повреждение мохет быть, связано на только с окисле-^""кием или ьюдафикацией. функциональных групп бислтрсколакулы. под действием ксенобиотиков, ионизирующего излучения, ультразву . по такие и с усиленней включения, нгзкомолекулнрных соединении в состав макромолекулы и образования аддуктов. Такие реакции. наиболее' характерны, для альдегидов. и кетонов. .Альдегиды. широко распространены в природа, являются промежуточными. метаболиташ. в животнш'и растительном организмах и. при ряда, патологи! могут накапливаться в значительных концентрациях. Характерной особенностью альдегидов является их способность наряду с. образованием обратимых структур (оснований Шиффа, подумеркаитадай.) нзобрати-мо взаимодействовать а макромолекулами. Такие адсукты образую! и транспортные белки крови альбумин и гемоглобин.

Взаимодействие малых молекул с биомакрсашладулаш обычно сопрякено с изменешшш кснфориации биояшшщраг что зшает принципиальное значение для выполнения макромолекулой' ее биологической функция. Как обратимая, так. и. необрат!ая. модификация гемоглобина альдегидами, изменяет его жонформацшо, параметры он-сигенации, скорость- реакций аутоокиеления. Процессы. аутоокисле-ния окси-гемоглобнна сопровождаются генерацией кислородных свободных радикалов. Гемоглобтн также, обладает высокой, активностью в отношении разного рода, лекарств или ксенобиотиков, что также усиливает его окисление и образование активных форм, кислорода. Генерация: кислородных свободных радикалов, может усиливать модификацию гемоглобина альдегидами, и служить таким. образом тестом, на неблагоприятную экологическую обстановку сжруыяцай, сггзнизы среда, на наличие и развитие патологических процессов е организме.

В связи с этим является: актуальным исследование необратимого взаимодействия альдегидов (на примере пирпдаксалъ-а-^ос-рата и. ацетальдагида) с гемоглобином, человека., a такка лошади, и изучение возможных механизмов образования, стабильных аддунтсв при деЛсдвии некоторых физических ¿акторов, (ультразвука, света) и в отсутствие какого-либо внешнего воздействия.

Основной целью работы, является. изучение механизмов, необратимого 'взаимодействия: лирвдоксадь-Е-Зосфгта (1Ш) с. гешглсби-

san (Ев) чалоаптгк.

Qchübhhs задачи ассладовачия. В работа бкли. поставлены сдвдудив акепершанталъвна задачг:

- Ессдежшанив црцроды. хра^атогра^кчесг:; наиболее бистров ик-дсрно! ±ра£ее2 Нб чалозака;

- Espesas образования стайильннх аги/ктав ЕЕ? с Нз человека 'lis лягада eçe гекнсшш иккубацса;

- ^учзшге образованна стабгдьаых алдукгов Ис Нз -человека i' Нь. -гстчдд под дайсттаек света;

-ЗЗГчесте образования стабильных еддуктов ацетолъдег^а с lis «ллвека дад.действием органических ра^калоз; -arpe деление аеатраз необратимой подписала: ils человека ИЬ. Научная вояи-яна.

Из soaopcsQîi дрова человека ааделена ьозорнаа £ракюк Нв, о^дагтапаа необратимо связанный

I сттктг.у ùiviiro плЕазан.0, что гемоглобин, челозека, а такса лздазк оСразуш сгабияыгые адду^тк с HJS¿.

Образование стайдльаото аддуета ШЕ.' с Нв человека с Нз ло-гу-т црг: длтпельао£ днкубадш. в тегдште протекает через перзо-axas, образования иегду дервгчнай. аминатрутюй салка г- —--g^r-^nfift грушай жганда ссаовашт Ши^а. двойная связь патграто ыадленно ЕзагуодеДсЕВует с п^дазольнш ттгьдом оосед-за. Усхааозлен. центр аадбраггтатй ксди$,икащш. Ев че-

—>1-4

ú¿pzsa3£.Kve стабильного аддукта с Нв человека л Нв ло-гг,-г гр:: гнгубгдш. на свету .протекает как. реакция восстановлена cesse. йсновашш Егцда. гедратврованянми электронами., фо-газЕеетггеиаав. еролаигаескими. здвдйвведохшшк остатками балка слп кзлещглацЕ лдганда.,

Lcpascsaï^s стабильного аддукта ацетальдагада с Нв человек з ультразвуковой деле1 протекает по свободао-радикалыюг^ меха-ixa^y. Hps Бэагкода^ствЕЕ с радикалами, спирта, ЙДД* ели IШ* íacüaas: свгаь осыззнея Gzggja -восстгда?лзвавтся з стабдльыып

zzüsí L=uzocTb работа Б гаде ессдедазша: водртенв св5д-:.гд£, Eczqa«. üctte cas. -psisHSHH. да обыхнешыс набхадае-ксго <л и«? cíp£23ssaz£ :;ялсто рада ааа.-ргж кохесненг !1з че-

с£д5Г0 г^лгчества Нв, Лолучанныв результат раслзрянл; драдстаз-

ленде о возкоаных ыахэдазглах аесбрагваога взадиодайствда бэлгш. с шгзкошлеяулярнцш альдегидными соеязганаада.. готорыа ара ряда. патологдд могут дакаплдваться в орсандзаа а значительных заа-центрациях. На основанли полученных результатов. образсшашш. адпуктов белок-альдегид под делстзпегл органлческях радгнадов. спирта, ЙДД.*, Eli' открываемся возможность использовать «£акг усиления. модд-Ьшадгл гемоглобина, альдегидами кал тает за неблагоприятную экологическую обстановку окруЕлюцзя среда, на. налдчца а развито патологических процессов в оргалазме.

Адробаша работы. Материалы работ была, представлены а док-дапывалдсь на совместной заседании. лабораторий Института бхохя-:.яа АН Беларуси и ка~\едри бделдмдя Гродненского гасударсхвеннэ-го иедицинского института (IS63, 1S6G, IS89, 1Э91 г.г.); на 1-сгл Всесоюзной биофизическом съезда (Москва, 1SS2), на 7-ой ¡¿эядуна-родаой конференция "Ьгохаздя и бво^язкка дяхохрома ?—4Ь0Я (LIock-ва, 1991), на УШ Конференции по сдектросдотш бгопсишеров. (Харьков, I2SI).

Пуйгакакпг. По тема дассэртащп. шублаковааа 3 статья. I статья, направлена в печать, 4 тезисов.

Сбьеа а структура работы. Диссертация, изложена на 147 странницах -мапиношиаоЕО текста з. вхшгчаат введение, результат исследований. н ех обсузденде, заключение, вывода а. стасаа. шгшруа-кой. литературы» содерхацей. 175 ссылок. Работа иллюстрирована 33 рдсундаш. а 5 таблицами.

МШРШЫ Ж 12Г0Ш. мссштш.

В работе использовала ахсд-Фз, выделошшй. аз донорской, крозд. человека, а такта .v.er-Ез кристаллический лга^алазарогаи-ныа 22 кравг догада. Eeccpa.TX.tyv глода^яиацда Нэ досади а человека пирддонеаль-З-^ос^атси ссуцествдяда разлдчноЛ яо яродолгл-гагьностд cssv-ecraoii хюг/бшягО. <5yjeряых газ волгнх растворов даангас соеддненаЗ. В загдсдгэстд от хазяаЯ акедериуенга ивдуЗа-цяя раствороа прсзоддлась з тегиота идя на свету. Посла игцгубз-пгп избыток адзкомаг.едудярнога реагента удалгда гель-^дльтра;^-22 creca через кслоняу (50*2 си) с сэ^адексаа fi?-25. Для сблу-чендя. см-зсд аслсльззззда ла^ггу цазаддзадяа без светочдаьтра падкости. ICQ 3r Z3E ртутдуэ ласту 2accTossze ст цент-

ра дсточядЕа света да гкэета, с о^разцеы не дреэигдяо 20 еы, reit-дература среда зженаись. в пределах. 5-7°С.

Обработку улмразаугем доддкх х зодао-с^гртовых раеззереэ

Нз проводили, на ультразвуковой: терапевтической установке ЛП-на частоте SSO кГц. Усредненную по площади, интенсивность ультразвука. (2 ¿т/см^) с иалучааде£. поверхности определяли го радиационному давлению, намеренному приборам ШУ-3. Раствор На ва вреын ультразвуковой, обработки. охлаждался, струей проточной вода, ¿льдагид, образуэди&са при действии ультразвука на води ' раствора этанола, определяли с памощыо 2,4-Я2шюро£эдишйдраз1 на. Оптическую плотность анализируемого раствора после развит! в нак окраски: измерят на длина всшхы. 550 ш. Включение радиоактивной. метки, связанной с этанолом, в белок при действии ультразвука на водно-спиртовш растворы, гемоглобина определял: измеряя радЕоаятивныи счет. в белковых ^ракщшх после отделенно шшкачслекулярши соединений гель-^ильтрадиеи па се£адексе G--1 Радиоактивность, проб оцределяли на счетчике"1.1агк-2" (С]2А), используя. диоксаношй. сцинтиллятор.

Электронные спектры, поглощения, образцоа Еа после делствн* ультразвука, а такаа Ев, образовавшего аддукт с ПШ в процесс« темпов ой инкубации или под действием света, смякала на дзухву* ' енх спектра|атоштрах " fbt-Hin - Eimer" (Швеция) и " Sp&ccrd II СШ). Спектры исдускжгл и. возбуЕдениЕ. щ^аресцендаи регистра решали на' ст&кжро&аторшетре с гиошнфокгшгаеезош воэбуадеааеы и регистращ-.eii "ßminxo Вятзап." (СЖ). Спектры £ИР . регнетраро! ля. на спектрометра SDP ESS-220 (1ДБ).

Наделение и. количественное определение минорных к главно!; щ^шнанз: Ев щюводали методом как.-обкеина1 хдоиатагра^ии (£егл , Hulsmcn. , I96S). В качестве полимерного носителя. и&юль -Еала. Ш-с^адекс С-25 емкостью 4,5$0,5 каин/г (Pharmacia, Яла Chxmitkls, Евецик).

, утагтагАТН ц ИХ 0Н2ЩЕЕ2Е

I. Выделение из доясгоскоИ крови: человека mshophsS йпакдии

сксп-Из, содержащей, коваеантно езязаннян ПЕг. Иатодса ион-сй'лелнси. sgüiSiTQrpaini на гИ-с&^ахексе С-25 и образца. окси-Нв донорская крови человека заделан, ряд ishüphkx ¿оакний. (ряс» I).

£адек, неиденти^иципованного пика I ^.гает параметры. ¿луо-. ресцвнлги характерные даа аддукта. I2S или. ЕЕ. с белков: при возбуждении ёдуорессеншаг. светел длина! волна 2SS hü а

= 330 ьш в спектрах $луорасцешда наблэдаатся. татка вырахзн-ая колоса флуоресценции. с максимумом. при 4С0 ни. (рис. 2).

Ало*

100 200 ¿30 />оо

Бис» I. Хрогдмогрэфпескоа разделений лшнорных (I, II, Щ) и главной. (А) компонент окси-Нв человека на. КИ-се^а.-^гл дексе С-25.

Рис« 2. Сдеятри. флуоресценции ало-Нз, шЕехзега. я процесса зсл-обьэнноЗ. хрс.ттог-ра£ж£ з начала провала. эжа-шгз. (пик.!): (I) -А203з, » 235 ям; (2) -Дздзй. » ЬЗС я.ч.

350

/<оэ

При диализа или епслоткоЙ обработка аддутсг- частично диссеапру-ет, о чен свидетельствует ^ечьдениа интенсивносп •^лусресцзд-сии а полоса 400 ни,

2,!одг;икацзя образца оеси-5? человека зозрастззггьа. избытками: ЕИ псоредстзси (УаЗН4 2 псследтюиая хроггатограйия на сехадекса показали увеличение 1-:го шел. бальдпх избытках Т-' содграание 1-сй ¿сангдги возрастало дс. ¿галхачай.

в

¿задалась уваличэние I-otq пика, при ион-обменной :д>олатограй5 сважагфшгатавлешшй. смеси. Нв - ПШг. Однако* ввиду частичной даасшдацди щи элвдш обратимого комплекса, образованного. i редсивом асновагзш. Шиффа, при сах же избытках ПК процент б£ вшхадеего в. 1-ой. шракцдж меньше, чей в предыдущем случае. У г лтаанаа Е-ога дика, при кон-обшшкж хроматогра^гл ааблюдалос е после доштальнсД тешозай. инкубации Из г HZL¿ (бело;: лредва цельна отделялся. or избытка литанда гель-филыраднаи на се..а дакса- <?-25) . Содержание 1-ой фракции возрастало до 75>í oí во га белка., концентрация. %& сшзавшагоса JUÍQ в данной .¡¡ракццд . превышала двух'молей ШВ на моль белка, при любых избитках ли. да.

Полученные результаты: указывают на возш;аша образована! «л viso с.табнльыш: аддуктов Нв с коферыентоц,. присутствующие в эритроцитах человека в концентрации. ~10 нг/ыл уплотненных зрасроцшмь. В связи, с этим, наши, даяышйпше исслвдокасш. й'лз шсвшдены. азученшо мезалызглов. необратимого взаимодействия aju дехидоа, на. примере ШШ и. ацетаяьдегкда, с Нз человека с лещ: да, а такна локализации. центров обратимого ц необратимого взаи модайствт 1Ш с. оксж-Нв человека.

' ' 2. Необратимое взаимодействие ГРЭ с Нв лошади н человека щж тешово£ инкубации.

Ера. дательной тагшовай. шкубащш. ыет-Ыа щш адо-Нв ло^га, с 50-100-2рагыыш нзбнисама ЗШ происходит образованна стабнл: ных адазрсгов. дитанда о белком. В Уй-спектра поглощения белка, отделенного после инкубации, от избытка, нязкаиолекуллрдоги реа-' згента голъг-филътрацией на сефздексе £-25, появляется, допслш:-таяьнаа полоса поглощения. в. облаем 23Q ны (p:¡c. 3, icp-saa 2). Cuescig флуоресцанцси адо-Ев, .образовавшего коваленттй аддухт с Ш35, содеркит, вфоме полосы триптофановой. фдуоресцешц'ц c'üs сшдушж при S5Q ни, спектральную соатавлшещую в влде плеча дрг 4С0 ни. (ряс. 4, кривая 2). В вцде более четко выраазнно! солэс фдуоресцешда аддукта наблюдается. cpz л Еэас<_ =. 320 жл. ¿ля у:', аашых избытков Ш2 'раакцдя заканчивалась к 50-72 часлу а. даль найлаа: шшубацж нг приводила & увеллченшо Eli с

белком, ^¡акешлальное нэллчестза иолегул литадда, эзглкодайстзу шге: с цет-Нз ила аш-Ев лоегда с образовак^еа стзЗадьнкз. аддук-таз, равна двуг,:. Константа скорости реавди второго порядка

составила 1,4-Ю-^

гео

з¡о

цо

Рис.З. Спектры, поглощения исходного апо-Нв (I); адо-Бз, ыодифици-рованного ШЕ> при инкубации в темноте (2); аяо-Ив, фотоокийденнйго машлановаИ синью, и. мо-ди^ицировашюго затем 1Ш при-инкубации в тешоте (3). МолнрНое соотношение белок-лиганд 1:200, продолжительность инкубации 48 часов.

350

«О Л,им

Рис. 4. Спектры, флуоресценции.

исходного £до-йв, я„паз. =

= 295 им (1); апо-Нв., кодафг-ццрованнсга ЕШ5 иди икзубзцш з, темноте («тщ = 2,0):.

¿воаб. = 295 (2)' *возб. » 330 нм. (3).

Образование стабиодых алдхгзав. наблюдалось и при длительней пзкубацж апо-£в с [-ЦзЗ-ацетальдагвдоьи 3 пользу этого свидетельствовало значительное включение радиоактивной штке а бе-аж. .

Появление дополнительной, лолося поглощения а цш

230 т в УФ-сдектре. поглощения: белка обусловлена образованная, цзличеспз продуктов типа залащенного. альдиьгна, а на основания. Игффа. в гидрофобии озрзтапд. характеризующегося, шам «а

спшагрш пшяющанва, aas. как максимум поглощений остается нелз-кеыаыи. в присутствии 6-8 IÍ гуанидина. Циклические просты тиш ззмещанкнх альдаашов обрадуются вследствие взаимодействия дво: Е02 связи основания Шайа с нуклесхридьныии гтерически доступными айшвокЕадотыыш остаткам белка. Тавши остатками явлтгтся остатки гиотидЕна, триптофана, лизша, тирозина и цистеина. I'абирательная иодафикшдя остатков тирозина, триптофана и цист! на соответственно подои, й-броисувяшицвдом и йлуоресцеиниарку-рпацекшж исключает участие данных аминокислотных остатков в рзагции образования стабильных адпуктов, поскольку число моле-цул £Е>, СЕЕзавиЕХСЯ с белком в этом случае и в контроле, остается. неизменным. Модификация аз гистидиновнх остатков контрольного белка е белка, образовавшего адцкт с 1Ш, диазобензосуль-фскислстой. (реактивом. Паузи) доказывает в спектрах поглощения существенное (на ID-KS) уменьшение во второе случае интенсивности цсшлощеЕЕя деазотираваЕаых гистидиновых производных в области SSO нм, a rarse диаднотах производных в области 363 км. Участие зшвдазольного кольца гистндша в реакции взашодейгавш с едьдеменлой связью подтверждают а данные по предварительному фотоокЕсдении гистидинсвыд остатков в присутствии машлваовой сини, поскольку, количество циклических продуктов., шглощаздвх в области SD0 кг, значительно уменьшалось (рис. 3, кривая 3). Основ: таясъ аа полученных данных, когно считать, что в необратимом св.?якягпшт ШЭ с Ев дошди привлекают участие остатки гис-теди ня, взаимодействующие с двойной связью основания Еиффа, образованно! альдегидной группой ПЛ$ к аминогруппой дизинового остатка балка.

Прд длительной тешоаой. инкубации при комнатной тешерату-ре окси-Нв чалозекг. с бО-кразвымг избытками Шй такие происходит Еонденсапхя 1,5-2,0 ызлевуд легенд» с белком, при этом дриб.ттгагггр.лъто 1,5 остатка лиганда приходилось на З^^цёди и 0,4-0,5 - на 2 d-aessu. Аддукт имеет абсорбционные и фдуоресцеш пне свойства, идентичные свойствам алпукта, образованного дри длительной инкубации. Ев досади и ШЭ.

В случае оксд-Ев человека оказалось возиогныы иден.тг$ипд-ровадь ценгрн. необратимого свнзд: лик ШЕ5, локализованные в JS—цешех. Достатку, необратимое взатмодейотвиа вкгзчаат в себя. стадиЕ образшаго взашодействин., были, установлены центры обратимого гдЕ-эттятуге швь с окси-Ев путем. восстановления альдагиннс

связи в сгабилышй вторичный амш посредством УаШ^. Применение ряда методов: ион-обменной хроматографии, метода педтидг них карт, аминокислотного анализа позволило, установить л гачест-ве одного из наиболее сильных центров, обратимого связывания Ш0 с оксд-Нв Я-концевой ваша J-uemi. По ряду параметров ад-?укт, образованный восстановлением посредством flaEE^ адьдиызн-ной связи с участием аминогруппы й-хсонцевого валпна,. идентичен адлухту, образованному в процессе длительной инкубации. Так, з спектрах флуоресценции изолированных р-цепей, образовавших в составе Нв адпукт с Ш5Ф путем длительной индубацди и. путем, восстановления, альдатнной. связи ЙаШ^, наблщдаатся цраютческд одинаковое уменьшение по сравнении с контрольной, $-цедью датен^--сивности трпптофачовой флуоресценции. Эффективность меахромофор-ной миграции энергии для ^-цепи, образовавшей циклический ад-дукт с ЕЛ§, равна 0,58, для^-цеди, образовйвией. ковалентный адпукт с Д© посредством ¡}аЩ| - 0,65. Следует при этом отметить, что расстояние медду хромофорами (фосфодиридокоиловыы хромофором, связанным с tf-кокцевым важном .р-цеш посредством НэЖ^, и тршиофанплом-15), которое было определено, исходя иа значения эффективности миграции энергии (S = 0,65} .д арктического радауса миграции энергии (PQ = 19,5 А0} дая донорао-акцелторЕоЗ.. пары триптофан - диридокодн-фосфат, не jiiiome соответствовало расстоянию медду хромофорами,. которое модно бшю оценить, есхо-дя из вторичной: структуры. ^-субьедшЕЦЕ. Надболее вероятной причиной такого несоответствия является, писаная псдастносхв фосфодЕрвдоксдлового хромофора не только аа счет вращательной диффузии, но и за счет значительной сегментальной, гибкости ¡Í-кодца |~цадд (йосфощридоксшювый хромофор при воаЗувдензш. в длинноволновой полосе погдвдзниа имеет низку® степень даднра-зации флуоресценции: Р - 0,072).

Был. танде щюзедан. флуоресцентный анализ разделенных meto-, дом пептидных карт традтическдх: пептидов Ев после его дадтедгной. шкубацдд с IШ. Анализ доказал наличие" слабо флуорасцзщргцего а области 400 ни пептида. Локализация тэтттядя на гщдтвдной. карте близка к докашяяпш пептида, образовавши» стабильный. аддат с ШЭ до ы -¡Щ-труше Важ-IJ-nem вследствие зссстг-новдензЕЯ адьдаштой связи flaHSj. В данном ледтаде яминпкиоттннй остаток гкстцдина, способный образовывать- грштвстшй аддукй с двойной связью основания Шийфа, соседствует с tf-ковцевш вала-" ном, аминогруппа которого., связывает ИМ с яшбшгшв! сродством. Дри предварительном фотоокислении сянщшташ кислородом. гдеsos-'

гдиаовыг и ряда ароматических аминокислотных остатков белка в присутствии матияековой сини, наряду с уменьшением. кнтексив-носие флуоресценции в трштофан-содергащих пептидах наблюдали отсутствие флуоресценции в пептиде, ранее образовывавшем ад-душ с ШЕ5.

Участие М-кокцезого валига. в стадии обратимого взашодеп-ствие,, а такае гиотидина-2 в стадии образования, циклического здпукта окончательно подтвердили следующие эксперимент. Так, установленная в. ряда работ шдарпсация. л-аминогрупп. Вал-1 цапай окси-Ев Езвкозо-б-фосфаюы при длительной инкубации с не:.; а такга показанная, наги, первоначальная модификация этих остатков: Ш$ при. восстановлении аладшнной связи ЙаВИ^, препятствуют образовании цзшкгчеоких аддуктов. окси-Ыв с ШЕ&. Кроме того, известной *гю аса двухвалентной меди, образует с окск-Нв человека сильный, четнрех-координациошшй кошяекс с. участит атомов азота «¡-амшогрушц В-аонцевого остатка валина ^-цепи, азота соседа го гисяидина. и, предположительно, атомов азота гшзтвдша-143 и -145 второй, ^-субьединицы- ЗПЕ-спектр'шна меди указывает на ромбический характер, ешмапрш электрического поля, окружающего катион када (риа.5, кривая: I). Лдегельнаа тешован. инкубация.

Рис. 5. ЭПР-сдактры. иона Са(1Г) в, комплексе с исходнш окси-Нв. человека (I); в комплексе с продуктов конденсации Ш к окса-Нв (Пщф = 1,0) (2) в комплексе с окси-Нв, ьюдафи-цнрованЕШ ПЖ посредством ¿¡зт,(Яш = 4,5) (3). [нвсу = е-кгх Гси^о^ = = 8-10"%. Частота (Ж-излуче-ния 9,3 ЕЕц, мощность 5 :/Бт.

окси-Нн ж приводил е. трансформации ромбической еггллетрип. электрического поля, в аксиальную, причеи наибольшее шзко-польаоз смещение претерпевает ¿^-составлаззцгя (кривая 2). Восстановление посредством. НаМ^ адьдошщнои сачзи, образованной альдегидной группой Ш& и 'аминогруппой М-кспцзвсго валика, на изшшхех ферызг ЗШ-спекгра-иона меда, (кривая 3). ИЗ за, ■связанный, с аксл-Яа только за счет образования. ссноьапш Пз&а

<*-ал£:исгрупло.. оси.-!, способстзуе! Ееболькоуу высошнкиыо-• с;. ¿у-оосгаБлязде;; сигнала кдттона мода, а ЗПЕ-сдакгре.

Су^дгру.-; ыд ^а^хе, .-лоано заключись, чга а образовании :гхйг:.1ы:-г. с^уктоз с скса-йз человека. з тешахе участв^-: осса'»хс. ^-коацезого еаса? а Гдс-2 .р-субъедазд Ез.

Следует отъехать, что пра одинаковой количества связанных На .глолекуд лдгаада, кзантозыд выход ^яуоресцвнцка аодаха, браэсзскаого путем дательной яакубацги, значительна нага ваахоэого шхода .„.луоресцеяпст, аддукта, образованного зосста-сг.-.еи^ел: адьддмпядо:! связи посредство» ЙаШ^. Модельная сна-е;ла дозволила содостаздть относительные квантовые выходы дуоресцсшаш цакдачесгаэго аддукта ШЕ«-г>:стлдин., образованного ов.уест«сд пнкусацдей и алашокгсшш (1:ХС0) в течение :еско*.ыах часоз, ц адвунтов ^сс^олиридоксилзагсна и ¿ос^апири-язх'-спдгистпдпла, осразозанных посредство» йаШ^. В качество ¡такдарта применялся аиридсксин-^ос^ат, дда которого а лзтеса-гуре сооа.ено значение абсолютного квантового выхода (табл. I).

Адлукд

циклический зддукх Ша^-гистидин.

аос^оглгрздсксялгистздаа. пиридокс ин—4ос^ах

а*

ю2

0,37

е.7 6,9 4,5 +

0,2

Тайл. I.

Таким образом, квантовый выход йлусресксннии циклического. аддукта почти з 20 раз ннде квантового выхода, '¡лусрс-сцандхз аддукта, образованного восстановление» алъдглпннс! саязх НвЖ*. Существенный вклад в тренде '£лусгесцекдид зассиг икидазольдаз. груша гистддика.

3. Насбоатиг/ая ^оди-Ь^Д"^^ Нз чзлевака а -лодади сгргдса— сзль-5-*1ос.1адз:.: под де2стз::г.; света.

Образование козалеитз-лх аддуктез с Нз дедади л человека значительна усхордатся. при идгубйцди на езету» Тад, 1,5 чаг-ссв интенсивного оолучения. раствора огсз-Ёз человака в с^зсг. -с. ШЗ (1:30) а. диапазона. ззхжэх и улзтра^идлгтезга езетешх

волн достаточно для появления в УФ-сдезктре поглощения белка дополнительного поглощения в области 330 нм. Ела ало- иди кет-Нв лотадк реакция образования стабильных аддуктов с Шш на свету (щш облучении раствора светом обычной лампы накал вания без светофплыра.) заканчивалась к 24-30 часам. Не мен ESCTE молвЕул. лкганда при этой образовало стабильный аддукт ада-Ев в не менее двух - о кет-Ев. Мет-Нв человека такке пр. "инкубации на свету образует аддукты с ЛШ, однако, в меньше: по сраввешгв, с оксп-Ев человека количестве. Количество стабильных аддуктов такке уменьшается в присутствии метиленово; cjjhjî - сильного акцептора электронов и возрастает при замеа растворенного в воде кислорода газообразным азотом.

Интенсивность флуоресценции .аддукта, образованного при инкубации на свету, сопоставима с интенсивностью &луоресцеш аддукта, образованного вследствие восстановления двойной cbj основания Шгффа КаШ4, Существенное различие квантовых buxoj флуоресценции для адауктов. ТШ с Нв лошади и человека, обраг ванных инкубацией. на свету и в темноте, позволяет говорить с различии данных аддуктов., т.е. о разных механизмах реакций, щшводкщах к их образован™.

Еа основе долучвншх результатов мокко сделать вывод о возможности, восстановления ачьдимииной связи в стабцлышй вт ричный амин гцдратированныык электронами, дотоэкекыфуемыш под действием света как ароматическими аминокислотными остат ш белка, так и шлекулаюг. лигаада.

Б модельной системе ш. оденалк электроиакцагаорнне свой ства двойной связи основания Еиффа по эффективности захвата злектрова z ее зависимости от расстояния меаду электроном я акцепторе^. С этой целый сравнили для триптофана и глицил-триптофана способность основания Шиффа, образованного амино-гру глад .зтгх соединений, е алздестдно£ группой, валерианового альдегида, изменять вероятность первичной фотохимической реаз цин. çryopopopa, сопровоЕдащЕица зяектированкем электрона пр его Езаидэдеиствш в возбужденном состоянии с акцепторов. Грг фЕчсскан зависимость гукания флуоресценции триптофана и. глищ трштохана от концентрации альдегида в. координатах Штерна-5ольыера саглетельствует об одновременном динамическом и. сха-тгч&сесь: механизме тушения флуоресценции (рис. 6). йдуорёсцен цел. ацетх^-триптофана, не с'разухдего комплекс основания Шей тугптсд только в результате диццузионных столкновений, что до

ляет рассчитать константу данашческого тушения: Кд^ = ,5 ¿Г . Эффективности статического тушения флуоресценции

рипто^ана и глвдшмрршшофана существенно различаются:

Гри = 71 •25 71 ^ли-Три = 21,5 Kcst^aasii

бразования. основания Щфа с альдегидом для обоих йлуорофорсш □статочно близка: Каа = 180 М"^. Рассчитаннн& значения кся&-ант статического тушения флуоресценции в сравнении а констан-ой ассоциации комплекса отражают вероятности фогошжчесЕпх ревращаниЁ обоих фдуорофоров, Для трншгоЗзана и глщил-тридто-ана,. образовавших комплекс основания ШЕфЗэа с валериановым. аяь-егидом,, вероятности фотохимической реакции равны соотвзтстван-о 0,35 ж 0,12. Увеличение' расстояния на 4,3 А0 (по' пата) в' лэднл-триптофгнй мекду двойной: связью основания Шгйра. и флуо-офором привело к. трехкратному умзнашвншз вероятности фотсшзш.-:есксй реакции, а, следовательно, а трехкратному умекьжендю. ¡ероятнссти захвата алактрсна его акцептором - двойней связно ¡снования Ь&Ьфа.

4. Необратимая. тшфикадия Нз человека ацетальдепщом под действием ордачдческих радикалов

Ера действии на водно-сшгртовдь растворы, окез- дли мзт-На. шлозека гддроксплышх радикалов, образуемых в. процесса ультра-азукозой кавитации вода,, наряду с. изменением, еддолнташюго

ядозй. = 296 ны, Ярес> «

новым альдегидом в координатах Шгерна-Фольмера.

Рис- 6.. Тушение флуоресценции ацетил-триптофана (I), Елжшл-трилтофааа (2) и триптофана (3) валерка-

350 нм.

и

состояния. кона гемогого гелеза наблюдали образование альдегида и в^лачение его в состав белковой. макромолекулы. Продукт взаи-цзд-йствза. Ев а зтаясла в ультразвуковой поле устойчив к ккс-дотшвду гидролизу и элвируетоя в процессе а;.зщокислотного анализа в в:и;е отдельной фракции в лроиш^тке негазу временами вн-хсда гиетидина и аргинина. Добавление ацетальдегпда к Нв с по-слгдуксзы воссшаазительнык ашишровашем МаШ^ дает такой же по времени удерживания пик в спектре аминокислотного анализа. Количество включенных в состав Нв продуктов сонолкза спирта зависит от продсшзахелышсти воздействия ультразвука на водно-сшгрюБой раствор балка.

Поскольку, ультразвуковая кавитация в воднкх растворах сопровождаемся распадом возбундевнкх молекул воды на радикалк Е* и СН*, а такне образованием гидратпрозаннь'х электронов, в качестве одного из механизмов взаимодействия, приводящего к образованию стабильных адпуктов альдегида с. Нв в ультразвуковой zsxs, uoszQ рассматривать восстановление двойной, связи основания Шгффа гетратированнынк электронами.

ДзаЦная связь основания Шкффа восстанавливается таю:е в стабильный Етсричный. ama в реакции взаимодействии с органгчес-кгни свободннма радикалами, поскольку, образование стабильных едд7"тов альдегид-белок возрастает в присутствии, органических соединений КАДЕ ш ШВ, явлнпдиися эд^ектгзншгк перехватчика-пи кислородных свободных радикалов. О Божоаноста образования органических радикалов спирта, НАЛ,' иди ЗШ>4 и ид участия з реакции восстановления двойной связи основания ЕпАйа. свидетельствует хавже реакция, воссгацавленца иона re (III) t.-.ет-Нь под де£стзиш органических соединении: спирта., N421 или HS.

las, в атмосфере СО или hl0 при деизхвгз ультразвука на бод-аыь раствори кет-Ев. иен Еадгза fe (III) йет-Еа только частично восстаназлизаетса 5 húh. Fe(II) слответственно карбсксг- или

(рис. ?, iczbcat). Засогансгландб i:es-Еь происходит в ссотзессгЕИП с р&аннпал: I и 2:

r¿(III) + Е'—-Pedí) -г Z!" (I)

fe (III) ч- —Fe (II) (2)

ELUK^srÁ-escs разновесна СЕИдетелюгвует о наличии конкурапд-.ндх прснесссз, ь лерзух очередь, со стороны радикалов 0E*f прп-вг,.~ —г - и иенедндиг восстановленного газового железа. Б присут-Г.СТ.ГХ oiáisza, или Lí¿ равновесие. сдвигается в сторону

увеличения содержания восстановленной ¿орзгн На и. при больших, концентрациях указанных соединении найтмуигл практически. полное восстановление геиового далаза. (кривая. 3).

Рис. 7. Изменение спектра поглощения мех-Но при воа-дейстз!1И ультразвука ка водный раствор мэт-йз a атмосфера азота: X - исходный мет-Нв; 2 - цослз воздействия, улыраавука, смесь мат- а. дезоксд-Нв; 3 - посла воздействия ультразвука а присутствии этанола ('.¿орма спектра соответствует аар-боксл—Лз). ¡¿арность ультразвука 2 Вт/см2» Концентрации! :.:ет-йн - 2'IQ"5 U, атаиша -U. Продолаах&йъность зоа-де^ств;!Я ультразвука 30 мин.

Радикал спирта,, восстанавливая. аса А(Ш) мат-йз, окяслй-ется до альдегида (реаиддя 3), радзпсад. НАЛ.' окислдатса до рад-лкал. ШЦ * - до ^ос^аядркдогсовай кислоты.

fe(III) + СНд-СИН —- СЕд-СЩ Fe(Щ (3)

Количество альдегзда. образовавшегося в ультразвуковая полз а водцс-сдиртсзом растзсга иез-йэ, достаточна высока. В хо аз вре:.-я, такое :ке до длительности воздействие ультразвука на. вод~ но-сшгртсзкй. раствор в отсутствие .\:е~-Ез сопровождавгсл образе— здкдйгл еле дозах количеств альдегида. Таким образом» сзадствеидуЛ вклад з образование альдегида вносит реазета воссгаасвлвняз.

радикалами■ спирта, и, веред thos реакция. зсссташэздеаая. радикалами. спирта. двоена!, связи основания. Еи^а, образование^. z:.zz-:crzyz~cZ белка а альдегидсм.

В li Ь С £ Н

L. /1л. донорской кссзд. чадозйка гцделанз ¿раддза Г91агт.юбдза, содердадая. «асСрзгдао селДздкдд.

2. длительней дддубзддн 2 малаг^-да пирнгхдсаД!-

о^з 5м ела

-S-^ocgjara связываются. с тематлобинои человека, необратимо в результате взаимодействия альдимишай. связи, с, соседним в поли-дшшдасй. цели. остатком. гистадша. Стадия обратимого взаиглодей,-ствш! протекает & участием, аминогруппы Ы-кокцевнх валиков ß-субъздиниц гемоглобина. Модищицированннй. гемоглобин имеет кз-иавеннна спектральный характеристики.

3. По дяикш ЗПЕ-сиектроскошш. электрическое поле катиона шда, связанного с. гемоглобином человека, имеет ромбическую сишетрив. Образование, стабильных аддуктов гемоглобина человека с пирвдокоальг-5-фосфахом. при длительной темповой инкубации. изменяет ромбичаскув сишетрша электрического пола катиона мода на. аксиальную. Обратимое связывание пиридоксаль-5-4,ос4ата а гемоглобином посредством, образования основания. Шифра или. образование ковалентннх адэдкшв. посредством fíaBH^ не изменяет параметры. ЭПР-сшктра комплекса катиона меда с белком.

4. Иди инкубации, на свету двойная связь, основания ffiisy¿a» образованная, первичными. аминогруппами -На лошади и человека, и

. альдегидной, группой шфидоксалъ-З-чурсфата, восстанавливается а стабильный. вторичной, аш хидратированнщи электронами, жоааектируоадш. молекулой, лшханда или. ароматическими, аыинокис-дотннш остатками. белка. Дпдукт шеет спектральные свойства, адшшчннй свойствам. адаукта, образованного восстановлением альдашных связей. шюредствоы. NaBE^, но отличавшиеся от свойств, аддукта, образованного. вследствие протекания тешовых. реакций»

5. Органическиа радикалы, спирта, NAß*» ЕЕ" восстанавливал ион ft(HL) мат-Нв в ферро-форь^у, а такжа усиливают образований вовалантных аддуктов, альдегида с белком. •

Основное содержания диссертации изложена в. следующих работах:

1. Степура ИЛ., Солодунав. A.A., Митяцок. Н.В. Ыехакзам взаимодействия. ш1рвдоксаль-5-фосфат.а с геноглобкнои интактннх эритроцитов, человека. // Тез. 1-ого Всесоюзного биофизического съезда. - Москва, 1982. - т.1, с.30.

2. Степуро ИЛ., Штянок Н.В. Механизм взаимодействия

• пир5щоксаль-&4оа£аха и. ацатальдегпда а апо-гецоглобцда^ Конкуренция. за маета связывания с гешшвд// £ипдг?.лтя.-19БЗ. - т.4£, т. - С. SS2.

3. Степура H.H., LlaisHoa. Е.В., Яишгенкй В.А. Есследсва-

не аддуктоа лнрцдокоаль-о-^ос^ага о гемагдобиису. телосзиа лусресцекпшц методой // Тез. Всесоюзного спжозну^а. В:оде1П1л:гг.Еыесцшщ2Я. в медицине н сальсяса хозяйства". — ■.зшкею, "-¿Ж"1257. - С. 149.

4. Степуро II.LI., ¡1гнахекжо В.А., Коновалова Н.Б. Дз^стнв глътраззука на. зодше а водно-спнртсдыо растворы нэт-гешсло-

// ¿урн. адз. - ISE8. - д. £2, S 2. - С. 44L.

5. Игнатенко i3.A., Коновалова Н.З., Степуро ИЛ1.» Сардноа З.А., Арабел. С.!.'.., Егорова Г.Д., Соловьев ii.iL Действие ультразвука, на ¿ерро*ор:»!ы гемоглобина. человека // дура. 4дз, сглаз. - 1988. - т. 62, is 9. - С. 24.66.

6. Stcpuro I.I., Koco-a-alova 3.7. Holo of oxyhemoglobin ind nether.oglobin in protection aqoirwt bydroxyl tsui organic •ее radicals in. erythrocytes // 7-th International confernsca ii о chemistry end Biophysica of cjtocfcroae P-450, Structure sad mctibn, biotechnological ard ecological cepacia". - lSoscow, 1991. - p.- T29.

7. Коновалова :1.3., Солодуноз А.Д., Ткщетгеа А.С., Степуро II. ¡1. Ксшалентная. аодо^дзациа гемоглобина а. сиворагачао-т J альбумина карбондльшка. соединениями яод. де^сшюа сдота. // Тез. ЛИ Конференции по споктроскошш. баошыашэраз. -lagbKOB, IS9X. - С. IIS.

3. Стгпура Ii.ll., Коновалова Н.В. Наэазг^агачаскаа Еоггга-низлендй :.-ет-Нв под д&Ьстэиеи радакагоа тааердруешх & присутствии. //ДЕД. а солей. Яг (II). Ангиоасядаягннз сзсЗсгаа. uei-Ез // Еио^азика» -1591.-^ T.2S, ssn.fi (нзщазлшкга начать).