Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное изучение функциональных свойств гемоглобина и реакции термогемолиза эритроцитов у экто- и эндотермных позвоночных

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное изучение функциональных свойств гемоглобина и реакции термогемолиза эритроцитов у экто- и эндотермных позвоночных"



на правах рукописи БОРИСОВА Александра Григорьевна

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ГЕМОГЛОБИНА И РЕАКЦИИ ТЕРМОГКИОЛИЗА ЭРИТРОЦИТОВ У ЭКТО- И ЭПДОТЕПШЫХ позвоночных

03.00.04 - биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Петрозаводск - 1996 г.

Работа выполнена в Институте биологии Карельского научного центра РАН

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор В.С.СИДОРОВ кандидат физ.-мат. наук, ст.н.с. А.С.ГОРШОВ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, вед.н.с. Ю.Г.ПРОВИЦКИЙ

кандидат биологических наук, ст.н.с. А.Ф.ТОПУНОВ

Ведущая организация - Биологический факультет Московского государственного университета им. Ломоносова

Защита состоится "18'.. игня_1996 г. в_час. мин..

на заседании Диссертационного совета К.002.96.01. по присуждению ученой степени.кандидата наук при Институте биохимии им.А.Н.Баха РАН

Адрес: 117071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп.2

Автореферат разослан "__"__ 1996 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (Ленинский проспект, 33, корп.1).

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук

М.И.Молчанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Мембрана отделяет клетку от внешней среды, и ее сохранность является необходимым условием существования клетки как единого целого. Широкие ис- ' следования эритроцитов как модели клеточных мембран показали, что различные' воздействия на красные кровяные клетки сопровождаются неспецифическими опосредованными изменениями физико-химических и функциональных свойств гемоглобина (Иржак,1988;Masala & Manca,1989). Однако механизмы соответствующих коррелятивных отношений остаются невыясненнными.

Подобные эффекты имеют важное значение для ■ состоя- ' ния организма в целом, поскольку осуществление кислород-транспортной функции крови, являющейся ведущим фактором в обеспечении энергетического обмена, обусловлено как количественными и качественными характеристиками эритроцитов, так и в большей степени свойствами оксигенации -дезоксиге-нации гемоглобина, обусловленными, в свою очередь, структурой молекулы, особенностями ее взаимодействий со' стро- -мой, метаболическими процессами в эритроците.

Одним из возможных подходов к исследованию этих вопросов является биофизический анализ свойств красных кровяных клеток в их взаимосвязи со структурой мембран и молекулы гемоглобина. В качестве приемов исследования мембран эритроцитов, в ластоящеё время используется оценка раз-. ; ■ ных типов резистентности" и изучение проницаемости мембран' (Ямайкина, Черницкий, 1988, 1989, 1991; Coackley et- al., - " 1978, 1979, 1980, 1983; Иванов, 1993). Гемолиз эритроцитов < 1 является одним из методов медицинской-, диагностики. :(Кост, : 1975), поэтому важно знать, состояние каких именно компонентов клетки влияет на ее устойчивость. В клинической лабораторной диагностике определяют осмотическую, механическую, кислотную и в гораздо меньшей мере тепловую резистентность .эритроцитов. Изучение механизма и особенностей;про-цесса термогемолиза:эритроциов, а также его.связи со свойствами гемоглобина имеет важное значение для выяснения согласованности температурных зависимостей физиологических процессов и температурного поведения белков. . ..

Данная работа является составной частью исследова- .

ний, проводимых группой молекулярной биофизики Института биологии Карельского научного центра РАН.

Цель и задачи исследования. Исходя из вышеизложенного, мы ставили целью работы анализ свойств эритроцитов в их взаимосвязи с особенностями структуры мембраны и физико-химическими и функциональными свойствами гемоглобина. Непосредственые задачи, которые необходимо было решить, заключались в следующем: 1)провести сравнительное исследование терморезистентности эритроцитов человека и ряда позвоночных; 2)определить энергию активации процесса термогемолиза эритроцитов различных видов; 3)провести анализ взаимосвязи между структурными свойствами мембраны эритроцитов и функциональным состоянием гемоглобина в них; 4)изучить закономерности необратимого автоокисления гемо-глобинов выбранных видов позвоночных; 5)выявить, как влияют на устойчивость эритроцитов к термогемолизу компоненты среды различной природы, а также модификация гемоглобина внутри эритроцитов; 6)сравнить спектральные и функциональ-•ные свойства гемэглобинов различных видов при варьировании условий среды; 7)провести сравнительное изучение структурно-динамических изменений метгемоглобинов под действием факторов среды.

Научная новизна. Получены экспериментальные результаты, которые дополняют представления о действии теплового повреждения на клетку, о вкладе структурных свойств мемб-" раны и физико-химических свойств гемоглобина в термогемолиз эритроцитов. Показано, что, хотя конечным этапом термогемолиза является разрыв мебмраны, процесс зависит от функциональных свойств гемоглобина. Новизна работы определяется тем, что в ней впервые;

-рассчитаны константы скорости реакции термогемолиза эритроцитов быка, барана, пэсца и белуги при высоких температурах и определена энергия активации процесса для этих эритроцитов;

-показана чувствительность параметров термогемолиза к аби-етату натрия;

-обнаружена корреляция между функциональными, термодинамическими и спектральными свойствами гемоглобина и терморе-

2

зистентностью эритроцитов;

-рассчитаны константы скорости автоокисления гемоглобинов быка, барана, песца и осетра при варьировании условий среды

Практическая ценность работы. Полученные экспериментальные результаты и извлеченные на их основе выводы могут найти практическое применение при изучении эритроцитов в норме и при патологии, а также в молекулярно-экологических иследованиях.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на республиканской конференции молодых ученых (Петрозаводск, 1989), на лабораторных семинарах Института биологии Карельского НЦ РАН (Петрозаводск, 1991, 1992, 1993, 1994), на 1(Х1) Международном совещании и школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 1996), на Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Карельского научного центра РАН (Петрозаводск, 1996).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, включая 6 ста-• тей.

Структура и объем работы. Диссертация ' состоит из следующих разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение" (2 главы), "выводы" , "Заключение". Работа завершается списком цитированной литературы, включающем 141 ссылку. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 таблицами и 27 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводили на эритроцитах человека и различных видов позвоночных: быка, барана, песца и белуги Huso huso. Кровь отбирали в гемоконсервант "Глюгицир". Эритроциты человека и животных получали путем трех последовательных центрифугирований крови в изотоническом буфере (0,01 М .натрий-фосфатный буфер в 0,15 М NaCl) с рН 7,4 при 3000 об/мин в течение 10 минут. Для кинетических исследований осадок эритроцитов разводили в изотоническом буфере в пропорции 1:100 и уравновешивали 30 минут при комнатной

•температуре. Гемоглобин в эритроцитах переводили в мет-форму с помощью нитрита натрия. В экспериментах по влиянию абиетата натрия и сывороточного альбумина человека (САЧ) использовали абиетат натрия в концентрациях 2-107s ' 4-1075 6-1075 4-10"4 и i-10"3 М и САЧ в концентрации 1 мг/мл ("Реанал").

Для получения гемоглобина эритроциты отмывали, а затем подвергали осмотическому лизису в дистиллированной воде, удаляли строму центрифугированием при 10000 об/мин в течение 30 минут на центрифуге VAC 602. Супернатант пропускали через колонку с гелем TOYO PEARL HW-55, а затем диа-лизовали против необходимого буфера (Antonini, Brunori, 1971).

Исследование термоустойчивости эритроцитов ' проводили модифицированным нами равновесным методом (Ямайкина, Черницкий, 1989), который заключался в следующем. Исходную И-ную суспензию эритроцитов выдерживали на водяной бане при требуемой температуре в течение времени т и сразу же переносили на холод (+4°С). Спустя 3-4 часа оценивали сте-.пень гемолиза по количеству выделившегося из лизированных эритроцитов гемоглобина. Для этого измеряли . светопоглоще-ние надосадочной жидкосiH на длине волны 540 нм на ' спектрофотометре "Specol-1 11" (Carl Zeiss,' Jena) и расчитывали степень гемолиза по формуле. '

По данным о степени гемолиза эритроцитов за различ- ■ ные промежутки времени строили кинетические кривые, по ко-'торым затем рассчитывали константу скорости термогемолиза, а вслед за этим и энергию активации этого процесса.

Для изучения автоокисления гемоглобина использовали св^еввделенный белок. Реакцию проводили, инкубируя при определенной температуре раствор гемоглобина , находящийся в равновесии с атмосферным воздухом, на водяной бане (термостат MLW 0-4 (Чехия)) в течение времени т. Через определенные промежутки времени спектрофотометрически определяли содержание окси-формы гемоглобина в растворе, используя для расчета формулы, выведенные нами с применением известных коэффициентов экстинкции на трех длинах волн - 560, 576 и 630 нм. Спектры поглощения регистрировали с помощью

спектрофотометра "Specord М40" (Carl Zeiss, Jena).

Пользуясь такими уравнениями для различных значений рН, рассчитывали концентрации участников реакции через определенные промежутки времени, а затем - константы скорости реакции как тангенс угла наклона зависимости ln(N/Ho) от времени, где N - концентрация оксигемоглобина.

Для изучения термостабильности гемоглобинов . определяли их температуры денатурации из калориметрических кривых, полученных на прецизионном сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4 (СКБ БП, Пущино) с объемом ячейки 1 мл (скорость прогрева образца 1°/мин, избыточное давление 2 атм). Концентрация белка составляла 2 мг/мл.

Спектроскопические исследования метгемоглобинов. Гемоглобин переводили в мет-форму с помощью некоторого избытка феррицианида калия. Для того, чтобы освободиться от продуктов реакции, раствор пропускали через колонку с сефадек-сом С-25, а затем диализовали против соответствующего буфера. Спектры поглощения метгемоглобинов регистрировали также на спектрофотометре "Specord М40", оборудованном те-рмостатируемым кюветодерхателем.

1 В работе были использованы следующие буферные системы:

1) фосфатно-солевой буфер: 0,01 М натрий-фосфатный буфер + 0,15 М NaCl, рН 7,4;

2) фосфатно-солевой буфер: 0,01 М натрий-фосфатный буфер + 0,15 М NaCl, рН 5,15;

3) 0,01 Н натрий-фосфатный буфер, рН 7,6;

4) 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рИ 4,6;

5) 0,1 М боратный буфер, рН 9,18;

значения рН растворов контролировали на рН-метре ЭВ-74.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. 1._Термоустойчивость_эритроцитов.

Термоустойчивость эритроцитов позвоночных изучали в интервале температур 47-66°С, причем для каждого вида был выбран свой интервал. Кинетические кривые . термогемолиза эритроцитов человека представлены на рис.1. Аналогичные семейства кривых получены для всех исследованных видов.

Время у мин.

Рис.1. Кинетические кривые термогемолиза эритроцитов человека при разных температурах в изотоническом буфере, - рН 7,4.

Ухе из сравнения кинетических зависимостей видно, что эритроциты позвоночных обладают различной термостабильностью: при 58°, например, в течение 5 минут лизирует около В5% эритроцитов человека, 80% эритроцитов песца и лишь А% эритроцитов барана.

Анализируя полученные кинетические зависимости, мы определяли т50 - время, за которое лизирует 50% клеток, и К5о = 1/г^ - константу скорости полуперехода. Рассчитанные таким образом значения констант представлены в таблице.

Таблица

Значения констант скорости термогемолиза (К50> мин"1) человека и некоторых позвоночных при разных температурах

т, °с баран бык человек песец белуга

66 - 0,83 - - -

64 0,22 0,39 - - -

62 0,09 0,15 - 1,33 -

60 0,05 - 0,77 0,80 -

58 - - 0,38 0,51 -

56. - 0,20 0,28 -

54 - 0,06 0,17 1,68

52 - - - - 0,49

50 - - - 0,28

Из таблицы явствует, что устойчивость эритроцитов к высокотемпературному гемолизу убывает в ряду: баран, бык, человек, песец, белуга. Наиболее устойчивыми к действию высокой температуры из исследованных являются эритроциты жвачных (быка и барана)» а наименее- белуги.

Зависимость между логарифмом константы скорости реакции (К50) и обратной температурой имеет вид прямой, которая описывается уравнением Аррениуса. Экспериментальные аррениусовские зависимости для скорости реакции представлены на .рис.2.

Из наклонов линий были рассчитаны энергии активации процесса термогемолиза Еа:

баран 370 ± 10 кДж/моль;

О

о-1

—г

-1

-з -4

~Б 2.98 3.00 3.02 3.04 3.06 3.0В 1£ ,

тх1

Рис.2. Зависимость константы скорости термогемолиза от температуры в координатах Аррениуса: 1- баран, 2 - человек, 3 - песец, 4 - белуга, 5 - бык-.

бык 400 ± 10 кДж/моль;

песец 220,± 5кДж/моль; человек 340 ± 30 кДж/моль; белуга 350 ± 50 кДх/моль. Столь высокие значения энергии активации процесса термогемолиза указывают на- то, что он инициируется структурными перестройками белков. В ряде работ показано, что лимитирующей стадией многоступенчатого процесса термогемолиза является термоденатурация гемоглобина (Ямайкина, Черницкий, 1991), а в других отрицается участие этого белка (Иванов, 1993).

Полученные в наших опытах результаты были сопоставлены с данными по функциональным свойствам гемоглобинов, поскольку известно, что различные воздействия на эритроци-

ты сопровождаются неспецифическими опосредованными изменениями физико-химических и функциональных свойств гемоглобина (Иржак, 1988).

Известно, что гемоглобины млекопитающих можно разделить на две большие группы: гемоглобины с высоким сродством к кислороду, которое регулируется 2,3-БФГ, и гемоглобины с низким сродством к кислороду и низкой чувствительностью к 2,3-БФГ (Bunn et al., 1971). Гемоглобины человека и песца относятся к первой группе, а гемоглобины жвачных (быка и барана) - ко второй. Считается, что существенно более высокое сродство к кислороду гемоглобина человека по сравнению с гемоглобинами жвачных животных может быть обусловлено стабилизацией низкоаффинной (обусловливающей низкое сродство к кислороду) конформацией последних (Ascenzi et al., 1992).

Гемоглобины пресноводных рыб обладают высоким сродством к кислороду, пониженным эффектом Бора и высокой устойчивостью к действию щелочи - эти свойства характерны для "медленной" фракции гемоглобина при электрофорезе (Hashimoto & Matsuura, 1959). Анализ гемоглобинограмм белуги и каспийского осетра.(Лукьяненко и.др., 1991) свидетельствует об относительно высоком содержании белка доминантного компонента в УДФ (умеренно-движущейся фракции): это компоненты с относительной подвижностью 0,53-0,51 у белуги и 0,52-0,50 у осетра, на долю которого приходится 67-75Я всего белка. По уровню относительной подвижностью это "медленные" компоненты УДФ на гемоглобинограммах осетровых, которые являются характерной особенностью гемоглобинограмм "пресноводного" типа. Исходя из этого можно утверждать, что гемоглобин белуги имеет высокое сродство к кислороду, характерное для пресноводных рыб.

Таким образом, в наших экспериментах по термогемолизу эритроциты, содержащие гемоглобин с более низким сродством к кислороду (эритроциты быка и барана), проявили существенно большую устойчивость к термогемолизу, чем те, в которых гемоглобин имеет высокое сродство (эритроциты человека, песца и белуги).

Если сравнить значения энергий активации, получен-

ных нами в эксперименте, с данными по устойчивости эритроцитов к термогемолизу, то видно, что энергии активации процесса термогемолиза эритроцитов барана, человека и белуги практически одинаковы, в то время как их терыорезис-тентность существенно различается (см. таблицу). Эти данные указывают на то, что процессы, которые характеризуются величиной Еа, не вносят решающего вклада в суммарную тер-•оустойчивость к гемолизу.

Необходимо отметить также и различия в структуре мембран эритроцитов различных видов. Известно, что наиболее типичным фосфолипидом в мембранах эритроцитов многих млекопитающих является фосфатидилхолин, тогда как у жвачных животных он почти полностью заменен сфингомиелином, который составляет около 50% всех фосфолипидов мембраны (ВгегэсЬег, 1973). Для сфингомиелина характерен минимальный "индекс двойных связей" по сравнению с фосфатидилхоли-ном, фосфатидилэтаноламином и фосфатидилсерином (Черниц-кий, Воробей, 1981), что сказывается на текучести компоне-.нтов в плоскости мембраны и ее гибкости, а также, склоннос-•ти к перекисному окислению.

У рыб, которые являются эктотермными позвоночными, отмечается относительно"более высокий уровень ненасыщенных жирных кислот в мембранах по сравнению-с эйдотермными . животными (Хочачка, Сомеро, 1977). Следовательно, в эритроцитах белуги, обитающей при 4-8°С, степень ненасшценности' мембраны в целом заметно выше, чем у человека и песца. Очевидно, существует корреляция между сродством гемоглобина к кислороду и липидным составом мембраны.

Связь термогемолиза с функциональными свойствами гемоглобина подтверждают и наши опыты по гемолизу эритроцитов, в которых гемоглобин был переведен в мет-форму. Эти эритроциты оказались менее устойчивыми, чем интактные. На рис.3 приведены аррениусовские зависимости термогемолиза контрольных и содержащих 100% метгемоглобина эритроцитов. Поскольку термоустойчивость эритроцитов, содержащих гемоглобин в мет-форме, снижается, график Аррениуса смещен по оси ординат вверх. Видно, что энергия активации при этом не меняется.

inh5o

Рис.3. Зависимости константы скорости термогемолиза эритроцитов человека от температуры в координатах Аррениуса: 1 - интактные эритроциты; 2 - эритроциты, содержащие 100% метгемоглобина; среда - изотонический буфер, рН 7,4.

Является установленным фактом, что появление ln vivo в эритроцитах телец Гейнца, образующихся из денатурированного гемоглобина, является первым признаком наступающего гемолиза (Гольдберг, Гольдберг, 1980). Следовательно, и при термогемолизе вслед за окислением гемоглобина происходит его денатурация.

Мы измеряли температуру денатурации окси- и метге-моглобинов исследуемых позвоночных в изотоническом буфере, рН 7,4, и обнаружили, что оксигемоглобины млекопитающих денатурируют при 70°С, а гемоглобин осетра - при 66°. Что касается метгемоглобинов, то термостабильность белка падает при окислении гемового железа у всех изученных нами ге-

моглобинов, причем наиболее стабильным оказался метгемо-глобин барана (денатурирует при 65°), а наименее - метге-моглобин песца (59°); метгемоглобины человека и осетра денатурировали при 62°.

Эти данные стали дополнительным доводом в пользу того, что термодинамические свойства гемоглобина оказывают влияние на термоустойчивость эритроцитов, т.к., во-первых, эритроциты, содержащие гемоглобин с более низкой температурой денатурации (теШэ), оказались более чувствительными к действию высоких температур, а во-вторых, снижается термостабильность самого гемоглобина при переводе его в мет-форму, причем температуры денатурации метгемоглобинов коррелируют с энергиями активации термогемолиза соответствующих эритроцитов: наименьшая энергия активация была для эритроцитов песца, а наибольшая - для эритроцитов барана. Возможно, полученные значения энергии активации отражают также и взаимодействие продуктов окисления гемоглобина с мембранными белками и липидами.

Поскольку ранее было показано (Герасимов,, Захаров, ■1985), что сульфгидрильные группы сывороточного альбумина могут быть донорами электронов, мы предположили, что САЧ может вносить вклад в перекисное окисление мембранных ли-пидов. Для подтверждения этого мы проводили термогемолиз эритроцитов человека и барана в присутствии САЧ (1 мг/мл). Установлено, что альбумин в такой концентрации повышал чувствительность эритроцитов к высокой температуре (рис.4), причем эритроциты барана и в данном случае оказались менее чувствительными. На наш взгляд, это подтверждает роль структурных свойств мембраны в терморезистентности клеток.

Исследование кинетики гемолиза эритроцитов может быть использовано в качестве тест-метода при изучении их функционального состояния или влияния на клетки различных факторов, в том числе ксенобиотиков. В качестве одного из таких веществ мы использовали натриевую соль абиетиновой (сильвиновой) кислоты. Это соединение относится к классу природных трициклических дитерпенов с общей формулой С19Н29С00Н. Абиетиновая кислота является довольно реакци-онноспособным соединением и обнаруживается в сточных водах

Рис.4. Кинетические кривые термогемолиза эритроцитов барана при 64°С в изотоническом буфере, рН 7,4 (1) и в присутствии 0,1Ж раствора САЧ (2). лесохимической промышленности.

Мы изучали кинетику гемолиза эритроцитов человека и барана в присутствии абиетата натрия как- при комнатной температуре, так и при 58°С. Абиетат натрия в концентрации 2-Ю"5 М при комнатной температуре не вызывал гемолиз эритроцитов человека по крайней мере в течение 24 часов; такое же действие оказывала на эритроциты барана эта соль в концентрации 6-Ю"4 М. Для концентрации абиетата 4-Ю"4 М определена константа скорости гемолиза эритроцитов человека при 22° К50 = 8,98-10 ~4 мин-1. Таким образом, эритроциты барана оказались более устойчивыми при комнатной температуре к действию абиетата по сравнению с эритроцитами человека.

В опытах по изучению модифицирующего действия абиетата натрия на чувствительность эритроцитов человека к изменению температурных условий среды получено семейство Б-образных кинетических кривых, аналогичных приведенным на

рис.1, но снятых при 58° и различных концентрациях абиета-та. Существенное усиление гемолитического эффекта наступало при концентрации соли выше 4-10"5 М. На рис.5 представлена зависимость константы скорости гемолиза эритроцитов человека К от концентрации абиетата. При уменьшении кон-'

?пЪ50

Рис.5. Зависимость скорости гемолиза эритроцитов человека от концентрации абиетата натрия при 58°С в изотоническом буфере, рН 7,4.

центрации этой соли значение константы приближалось к величине, полученной для термогемолиза эритроцитов человека при 58° в изотоническом буфере: К&0= 0,38 мин"!

Анализируя полученные результаты, мы предположили, что изменение температурной чувствительности красных кровяных клеток происходит вследствие модифицирующего действия абиетата натрия на плазматическую мембрану. Действие его, вероятно, сопряжено с тем, что липофильная часть молекулы встраивается' во внутренний слой мембраны, что сопровождается нарушением белок-липидных контактов и тем самым влияет на структурные переходы в мембранах.

Исходя из приведенных данных можно предполагать, что абиетат натрия способен значительно модифицировать состояние эритроцитов, причем проявление этого действия зависит от температуры инкубации клеток и концентрации соли. Как уже отмечалось, абиетат натрия в концентрации 2-10~ь М не вызывал гемолиз эритроцитов по крайней мере в течение 24 часов, но при температуре 58°С эта же концентрация соли вызывала заметное увеличение константы скорости гемолиза: с 0,38 мин'1 (в отсутствие абиетата) до 0,45 мин"1, т.е. в 1,2 раза. Следовательно, дефекты мембран, образующиеся при действии малых концентраций абиетата и не проявляющиеся, казалось бы, при 22°, стали явными при высокой температуре.

Вследствие этого мы предполагаем, что метод термогемолиза позволит обнаруживать скрытые повреждения в метках (эритроцитах) животных, вызванные субпредельно-допустимыми концентрациями токсических факторов антропогенного происхождения.

2.Физико^химические свойства_гемоглобинов.

Как отмечалось выше, тельца Гейнца, которые появляются в эритроцитах перед гемолизом, состоят из видоизмененного гемоглобина. Основными процессами при этом являются окисление гемоглобина до метгемоглобина, а затем и до необратимого гемихрома и его денатурация. В процессе автоокисления гемоглобина выделяется супероксид-анион, а также перекись водорода, которые атакуют строму эритроцита, вызывая гемолиз клеток. В связи с тем, что эти реакции имеют место и в процессе термогемолиза, мы исследовали автоокисление гемоглобинов человека, быка, барана, песца и осетра

в его взаимосвязи с терморезистентностью соответствующих эритроцитов.

При автоокислении гемоглобина наблюдается целый ряд спектральных изменений: интенсивность "низкоспиновых" полос 540 и 575 нм падает, и растет интенсивность "высоко-' спиновых" полос полос 500 и 630 нм. На рис.6 представлены спектры гемоглобина человека при рН 4,6 и их изменения с ростом температуры.

600 нм

Рис.6. Спектральные изменения, наблюдаемые при автоокислении оксигемоглобина человека при рН 4,6:1 - 18°, 2 - 25°, 3 - 34°, 4 - 45°, 5 - 47°, 6 - 50°. 7 - охл. ДО 23°.

Кинетику автоокисления изучали при нескольких температурах; на рис.7 представлены кинетические зависимости для оксигемоглобина песца в полулогарифическом масштабе.

Рис.7. Автоокнсление оксигемоглобна песца (1,5-10_& М): 1-41°С, боратный буфер, рН 9,18; 2 - 41°, 0,01 Н фосатккй буфер, рН 7,6; 3 - 41°, 0,01 М фосфатный буфер + 0,15 М N801, рН 7,3; 4 - 43°. 0,1 М ацетатный буфер; 5 - 39°, 0,1 М натрий-ацетатный Оуфер, рН 4,6.

Аналогичные зависимости получены для всех исследованных гемоглобинов при нескольких значениях рН. Из рис.7 следует, что существует зависимость скорости реакции автоокисления от рН среды: с ростом рН константа скорости уменьшается.

Известно, что при отклонении рН раствора гемоглобина от нейтрального происходит сдвиг равновесия в сторону димеров: уже в слабокислой среде (рН 6,0) концентрация ди-меров ощутима (КаХт, е1 а1., 1973). Такая дисссоциация вызывает кояформационные изменения белка, повышающие лабильность (неустойчивость) оксигемоглобина к автоокислению.

Т

1. /

Протежирование дистального гистидина приводит к резкому повышению эффективности процесса автоокисления, поскольку известно, что в оксигемоглобине дистальный гистидин играет стабилизирующую роль, образуя водородную связь с лиганди-рованной ионом Ре2+ молекулой кислорода.

Поскольку при повышении рН происходит сдвиг равновесия в сторону И- формы, то можно сделать вывод, что ок-сигемоглобин в этой конформации более устойчив к автоокислению. Стабилизация Т-конформации молекулы гемоглобина, в которой гемовый цикл имеет куполообразное, а не плоское строение, повышает вероятность процесса автоокисления.

На рис.8 показаны зависимости константы сокрости автоокисления различных гемоглобинов при 43"С. Видно, что при всех значениях рН автоокисление гемоглобина осетра протекает гораздо быстрее, чем у млекопитающих. Это под-

Рис. 8. Зависимости автоокисления гемоглобинов от рП при 43°С: 1 - Оык, 2 - баран, 3 - песец, 4 - человек, 5 -осетр.

1В

тверждает данные о том, что гемоглобины пойкилотермных животных довольно склонны к автоокислению.

Зависимости для констант скорости автоокисления ге-моглобинов барана и быка лежат выше, чем для гемоглобинов человека и песца, что свидетельствует о больших скоростях автоокисления гемоглобинов последних по сравнению с гемо-глобинами жвачных животных.

Исходя из полученных результатов можно предположить, что скорость автоокисления отражает изменения структуры гемоглобина и в значительной степени является мерой его денатурации. Вероятно, различия в скоростях автоокисления между гемоглобинами млекопитающих и рыб отражают лежащую в основе этого процесса структурную адаптацию, связанную с пониженными температурами.

В то же время в группе млекопитающих при рН 7,4 константа скорости была в целом почти одинакова, что позволяет предположить, что стадия окисления гемоглобина до метгемоглобина не является лимитирующей в термогемолизе эритроцитов. Этот факт подтверждается и тем, что энергия активации термогемолиза не менялась при переводе внутри-эритроцитарного гемоглобина в мет-форму.

Показано, что растворы высокоспиновых производных метгемоглобина, в том числе и аквамет-НЬ, обычно содержат I?- и Т- формы в состоянии динамического.равновесия, которое смещается при изменении рН,. добавлении органических фосфатов и нейтральных электролитов (Репйг е1 а1., 1974). К- форма существует преимущественно при высоких рН, а 1-конформация - при низких рН и в присутствии органических фосфатов, поэтому спектр поглощения метгемоглобина является суперпозицией спектров поглощения К- и Т- конформеров и в зависимости от их количества может иметь характерные особенности. Для количественной оценки содежания конформеров в растворах метгемоглобинов ряда позвоночных мы использовали отношение интенсивностей "высоко"- и "низкоспиновых" полос П / .

бЗОнк 57Ьнм

Зависимость 0„ от рН для акваметгемоглобина

ОоО о 7Ь

человека при 20°С имеет почти линейный характер в интервале рН 6,5-9,0 (рис.9).

РбЗО

_I_I__1_I_I

О 4 6 8 10 12 рН

Рис.9. Зависимость отношения оптических плотностей Свзо/с^75 спектРа акваметгемоглобина человека от рН при 20°С.

Определяя объем молекулы метгемоглобина человека в зависимости от рН, Катц (Ка1г е1 а1., 1973) установил, что она увеличивает свой объем с повышением рН от 7,0 вплоть до 10,0, после чего начинаются объемные изменения, которые авторы связывают с диссоциацией на димеры. При уменьшении рН ниже 5,0 также происходило резкое уменьшение молекулы метгемоглобина. Очевидно, что при изменении рН происходят сильные структурные перестройки■вплоть до разрушения четвертичной структуры, и, возможно, полученная нами зависимость, представленная на рис.9, отражает эти изменения.

го

Исходя из наших результатов и данных М.Перутца (Ре-п^и et а1.,1974) мы предположили, что при рН ниже 6,0 акваметгемоглобин находится преимущественно в Т-конформации, а при рН 10,0 - в Я-форме. Таким образом, критерием константы равновесия КТ5}.к может являться соотношение С575/Бвзо.

Мы изучали влияние температуры на I* ^ Т- равновесие в интервале 15-45°С для гемоглобинов человека, песца, лошади, барана и осетра (рис.10).

Р575

ОбЗО

осетр.

Видно, что с повышением температуры эти зависимости 21

растут для всех изученных видов. Увеличение /И ^ сви-

57о 630

детельствует об уменьшении интенсивности "высокоспиновой" полосы 630 нм и одновременном усилении интенсивности "низкоспиновой" полосы 575 нм, что характерно для смещения равновесия й г Т в сторону И- конформации. Различные наклоны этих зависимостей отражают, на наш взгляд, разные значения константы И ^ Т- равновесия для гемоглобинов разных видов. Следовательно, увеличение доли Б- конформера в растворах метгемоглобинов человека и песца с ростом температуры будет значительнее, чем у метгемоглобина лощади, а у того, в свою очередь, больше, чем в растворах метгемоглобинов барана и осетра (как следует из наклонов зависимостей).

В группе млекопитающих прослеживается- корреляция между спектральными свойствами метгемоглобинов и сродством гемоглобинов к кислороду: с увеличением последнего возрастает доля высокоаффинной конформации в растворе белка с ростом температуры. Сдвиг равновесия в сторону И- конформации отражает, по-видимому, общую тенденцию в белках к усилению межсубъединичных и междоменных' гидрофобных взаимодействий 'с температурой.

ВЫВОДЫ

1. При исследовании терморезистентности эритроцитов позвоночных (человека, быка, барана, песца и белуги) установлено, что эритроциты жвачных, содержащие гемоглобин с более низким сродством к кислороду, имеют существенно большую устойчивость, чем те, в которых гемоглобин находится в высокоаффинной конформации.

2. Значения энергии активации высокотемпературного гемолиза не коррелируют с устойчивостью мембран эритроцитов у изученных видов, но существует взаимосвязь между термодинамическими свойствами соответствующих метгемоглобинов и энергией активации: чем ниже температура их денатурации, тем меньше энергия активации термогемолиза.

3. Перевод оксигемоглобина в метформу в эритроците приводит к снижению терморезистентности клеток, но энергия активации процесса термогемолиза не меняется, т.е. существует корреляция между степенью окисления геиового железа и

термоустойчизостью мебраны эритроцита, но при этом окисление гемоглобина не является лимитирующей стадией термогемолиза .

4. Сывороточный альбумин человека в концентрации 0,1% повышает чувствительность эритроцитов человека и барана к высокой температуре.

5. Абиетат натрия, являясь амфифильным соединением, способен значительно модифицировать мембрану эритроцита, причем проявление этого действия зависит от его концентрации и температуры инкубации клеток.

6. Константа скорости автоокисления гемоглобинов позвоночных (человека, быка, барана, песца и осетра) существенно возрастает с понижением pH среды для всех изученных видов и с повышением температуры. Скорость автоокисления гемоглобина осетра была на порядок выше, чем у гемоглобинов млекопитающих, что, возможно, связано с адаптационными изменениями свойств гемоглобинов пойкилотермных животных, приводящими к лабилизации связи молекулы белка с кислородом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕТРАЛИИ

1. Борисова А.Г. Оценка применяемости метода спектра • мутности, для изучения взаимодействия клетка-растворитель II Респ. конф. мол. ученых, специалистов и студентов "Актуальные проблемы . биологии и рациональное природопользование природных ресурсов Карелии": Тез. докл. Петрозаводск: Карельский НЦ РАН, 1990, с.12.

2. Борисова А.Г. Молекулярно-биологические аспекты экологических исследований // В сб.: Биологические исследования растительных и животных систем. Петрозаводск: Карельский НЦ РАН, 1992, С.131-134.

3. Горюнов A.C., Борисова А.Г., Колосов И.А. Роль структурной динамики белков в адаптации и эволюции их функций // В сб.: Теоретические аспекты экологической биохимии. Петрозаводск: Карельский НЦ РАН, 1993, С.183-194.

4. Рожков С.П., Борисова А.Г. Фазовый переход критического типа в водно-белковой матрице молекул сывороточного альбумина, индуцируемый соль» // Биофизика. 1S93.

-jt

Т.38. вып.4. С.590-595.

5. Горюнов A.C., Суханова Г.А., Борисова А,Г., Дор-шакова Н.В. Использование низкотемпературного 1Н-ЯМР для оценки изменений в крови человека под действием химических факторов производственной среды // В кн.: Фундаментальные основы жизнедеятельности организма в норме и патологии. М., 1996, С.118-122. ,

6. Борисова А.Г. 0 влиянии абиетината натрия на термогемолиз эритроцитов человека в изотонической среде // Биофизика. 1996. Т.41. вып.З.

7. Борисова А.Г., Горюнов A.C. Таксономические различия резистентности мембран эритроцитов и оксигенация ге-моглобинов // I(XI) Международное совещание и школа по эволюционной физиологии: Тез. докл. Санкт-Петербург, 1996, С.23-24.

8. Борисова А.Г., Горюнов A.C. Термогемолиз эритроцитов позвоночных // Гбилейная конф. "Карельскому научному центру - 50 лет": Тез. докл. Петрозаводск: Карельский НЦ РАН, 1996.

9. Горюнов A.C., Суханова Г.А., Борисова А.Г., Сидоров B.C. Характеристика изменений в крови рыб под действием химического загрязнения среды по данным низкотемпературной 1Н-ЯМР спектроскопии // Биополимеры и клетка (в печати).

10. Борисова А.Г., Горюнов A.C. Термогемолиз' эритроцитов, различающихся по сродству гемоглобина к кислороду // Журнал эволюционной биохимии и физиологии (в печати)

[iC^

I

Сдано в производство 16.05.96 г. Формат 60x84 1/16. Уч.-изд.л. 1,5. Тир. 100. экз. 3aK.*J3

185610, Петрозаводск, ул.Пушкинская, 11. Карельский научный центр РАН.