Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Образование и использование АТФ в гепатоцитах круглоротых и амфибий

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Образование и использование АТФ в гепатоцитах круглоротых и амфибий"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И М. Сеченова

На правах рукописи УДК 591.128+ 576.34+ 591.124

£

О Гампер Никита Львович

ОБРАЗОВАНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АТФ В ГЕПАТОЦИТАХ КРУГЛОРОТЫХ И АМФИБИЙ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1998

Работа выполнена в лаборатории сравнительной биохимии неорганических ионов Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук

М.В. Савина

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор канди дат биологических наук

С.Н. Лызлова А.А. Никифоров

Ведущее учреждение - Институт цитологии РАН

Защита состоится 17 ноября 1998 г в часов на заседании диссертационного совета по защите кандидатских диссертаций К 002.89.01 при Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН по адресу: 194223, Санкт-Петербург, пр. М. Тореза 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова

Автореферат разослан 16 октября 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Традиционно основной объем работ по биоэнергетике проводится на клетках и митохондриях млекопитающих и микроорганизмов, данных об энергетическом метаболизме клеток эктотермных позвоночных крайне мало. В результате, несмотря на быстрый прогресс в понимании принципов функционирования энергетической машины клетки, мы мало знаем об ее эволюции.

Исследования энергетического метаболизма эктотермных позвоночных интересно еще с одной точки зрения. Спектр экологических адаптации этих животных необычайно широк, и многие условия, такие как переохлаждение, голодание, обезвоживание, существование в условиях крайне скудного снабжения кислородом, являющиеся для большинства млекопитающих стрессорными, патологическими или вообще несовместимыми с жизнью, оказываются приемлемыми для холоднокровных животных в определенные фазы их жизненных циклов. Многие эктотермные позвоночные обладают способностью снижать скорость метаболизма в ответ на неблагоприятные условия окружающей среды, что позволяет им экономить энергетические ресурсы в течение длительного времени. Поэтому изучение окислительного метаболизма клеток эктотермных животных может бьггь полезным при формировании новых терапевтических подходов для защиты клеток от последствий гипоксии, нарушений водно-солевого обмена, неправильного питания или голодания.

ЦЕЛИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целями работы явилось 1) изучение структуры энергетического метаболизма (соотношения между основными процессами, сопряженными с потреблением кислорода, производством и потреблением АТФ) клеток эктотермных позвоночных на примере гепатоцитов миноги Lampetra fluviatilis и лягушки Rana temporaria; сравнение полученных результатов с литературными данными для гепатоцитов млекопитающих; 2) Изучение феномена обратимой метаболической депрессии в гепатоцитах миноги в зимние месяцы преднерестовой миграции.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1) Определить скорость потребления кислорода гепатоцитами миног и лягушек. 1 Оценить вклад в потребление' кислорода клетками митохондриального и немигохондриального дыхания, потребления кислорода

в процессе окислительного фосфорилирования и в результате утечки протонов через внутреннюю мембрану митохондрий; определить вклад активного транспорта натрия и калия в скорость производства и потребления АТФ в клетке.

2) Сравнить скорости потребления кислорода гепатоцитами миноги и лягушки со скоростями потребления кислорода клетками печени других экштермных позвоночных разной массы тела и млекопитающих. На основании полученных данных построить зависимость скорости потребления кислорода гепатоцитами от массы тела для эктотермных позвоночных.

3) Подтвердить наличие депрессии энергетического метаболизма в клетках печени миног в период преднерестовой миграции; исследовать механизмы регуляции окислительного метаболизма в гипометаболическом состоянии; изучить влияние замедления скорости метаболизма на жизнеспособность изолированных клеток и поддержание в них ионного гомеостаза.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РЕЗУЛЬТАТОВ. В результате проведенных исследований впервые было продемонстрировано, что несмотря на 3-5 кратные различия в скорости клеточного дыхания, вклад в потребление кислорода клетками таких процессов как митохондриальное и немитохоцдриальное дыхание, потребление кислорода, обусловленное окислительным фосфорилированием и утечкой протонов через внутреннюю мембрану митохондрий, а также потребление кислорода в результате функционирования Ыа7К+АТФазы одинаково в исследованных гепатоцитах и в гепатоцитах крысы. Впервые было получено уравнение зависимости скорости потребления кислорода гепатоцитами от массы тела у эктотермных позвоночных. На изолированных гепатоцитах миноги был исследован феномен обратимой метаболической депрессии, который выражается в 2-Зх кратном снижении скорости потребления кислорода клетками, снижении интенсивности окислительного фосфорилирования, существенном уменьшении содержания АТФ в клетках. Впервые были исследованы принципы регуляции энергетического метаболизма при обратимой метаболической депрессии в гепатоцитах мигрирующих на нерест миног. Также была получена ценная информация об активности Иа'ЛСАТФазы в клетках, находящихся в гипометаболическом состоянии.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ. Теоретическое значение работы заключается в расширении представлений о принципах функционирования и

регуляции энергетического метаболизма у экготермных позвоночных, выявлении черт сходства и различия биоэнергетики клеток экю- и эндотермных позвоночных. Обнаружена взаимосвязь скорости потребления кислорода гепатоцитами холоднокровных позвоночных и массы тела, сходная с известной для млекопитающих, а также сходная организация энергетического метаболизма в клетках этих животных. Эти закономерности позволяют по-новому взглянуть на проблему многократных различий в скоростях метаболизма между экто- и эндотермными позвоночными. Результаты исследования регуляции энергетического метаболизма при обратимой метаболической депрессии позволяют глубже понять феномен в целом, сформировать представления о принципах выживания клеток при низких скоростях дыхания и производства АТФ, что может найти применение в медицине. В процессе работы усовершенствована методика выделения гепатоцитов (Lappova and Leibush, 1995), что сделало , ее пригодной для выделения жизнеспособных i-епатоцитов, находящихся в гипометаболическом состоянии Также, была разработана новая методика определения нуклеотидов в биологических образцах методом высокоэффекпшюй анионообменной жидкостной хроматографии, которая нашла практическое применение в лабораториях Научно-исследовательского центра Медицинской Академии последипломного образования, а также в Клинике нервных болезней Военно-Медицинской Академии.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исследования, докладывались на Втором съезде Биохимического общества РАН в Москве 19-23 мая 1997; XXXIII Международном Конгрессе физиологических наук в Санкт-Петербурге 30 июня -5 июля 1997; XIX Конгрессе Европейского общества сравнительной физиологии и биохимии в Турку, Финляндия, 23-26 августа 1998; в течение 2ой Финско - Русской школы "Рост и развитие. Ог молекул к организму", проходившей с 6 по 13 февраля 1998 на базе Хельсинского Университета в Финляндии. Методика определения адениновых нуклеотидов методом ВЭЖХ была представлена на Десятом Международном Симпозиуме по капиллярному электрофорезу и изогахофорезу в Праге, Чехия, 17-20 сентября 1996, Международном Конгрессе по аналитической химии в Москве 15-21 июня 1997 и на 22ом Международном Симпозиуме по хроматографии в Риме, Италия, 13-18 сентября 1998. В декабре 1997 г работа получила вторую премию на конкурсе научных работ молодых сотрудников Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Работа занимает 138 страниц, содержит 17 рисунков и 16 таблиц и состоит из следующих глав: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение, Заключение, Выводы, Список литературы. Список литературы содержит 272 источника, 8 на русском и 264 на английском языке.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Гепатощпы выделяли коллагеназным методом (Savina and Gamper, 1998). Скорость потребления кислорода клетками определяли полярографически с использованием закрытого элеюрода Кларка. Вклад различных процессов в потребление кислорода клеткой определяли методами ингибиторного титрования. Для определения концентраций адениновых нуклеотидов применяли микроколоночную высокоэффективную жидкостную хроматографию. Скорость однонаправленных потоков калия в клетке оценивали по распределению рубидия с использованием метода ионизационно-пламенной фотометрии.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

СТРУКТУРА ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО МЕТАБОЛИЗМА В ГЕПАТОЦИТАХ КРУГЛОРОТЫХ И АМФИБИЙ В АКТИВНЫЕ ПЕРИОДЫ ЖИЗНЕННЫХ ЦИКЛОВ. Измерение скорости потребления кислорода клетками представляет ценную информацию об активности энергетического метаболизма. Сочетая определение скорости клеточного дыхания с применением различных ингибиторов окислительных процессов, мы можем также исследовать структурные особенности клеточной биоэнергетики. На рисунке 1 приведена упрощенная схема клеточного ^энергетического метаболизма, на которой нанесены места действия различных : ингибиторов, применяемых в исследованиях по биоэнергетике. Действуя на клетку алтимицином А или миксотиозолом, специфическими блокаторами bei комплекса дыхательной цепи митохондрий, мы можем определить, каков ! вклад в клеточное дыхание составляет потребление кислорода в митохондриях и немигохондриальное дыхание (оксигеназы и гидроксилазы эндошшматического ретикулума, пероксисомы и пр.). Ингибируя синтез АТФ сшигомицином, блокатором АТФсинтетазного комплекса, можно определить, сколько кислорода, потребляемого митохондриями, расходуется при синтезе АТФ и в результате неспецифической утечки протонов через внутреннюю мембрану митохондрий. Ингибируя различные АТФ-потребляющие процессы

Рисунок 1. Схема клеточного энергетического метаболизма с указанием мест действия ингибиторов, применяемых в исследованиях биоэнергетики. Пунктиром указаны процессы, ведущие к портеблению кислорода, но не сопряженные с синтезом АТФ.

(например, Ыа+/К+АТФазу уабаином), можно оценить, сколько кислорода (и соответственно, производимой клеткой АТФ) расходуется в клетке для обеспечения соответствующего процесса.

ТАБЛИЦА 1. Скорость потребления кислорода и соотношения между различными параметрами дыхания гепатоцитов миног, лягушек и крыс.

Параметр

Лягушка Минога Минога Крыса 1996 г 1997 г

Эндогенное дыхание, нмоль СУмин/мг сухой массы клеток доля митохондриального дыхания в эндогенном потреблении кислорода, % доля немитохондриального дыхания в эндогенном потреблении кислорода, % доля потребления кислорода при синтезе АТФ в эндогенном дыхании, %

доля потребления кислорода при утечке протонов в эндогенном дыхании, % доля потребления кислорода при синтезе АТФ в мигохондриальном дыхании доля потребления кислорода при утечке протонов в мигохондриальном дыхании, % доля уабаин-чувствительного дыхания в эндогенном дыхании, %

доля уабаин-чувствительного дыхания в фосфорилирующем дыхании, %___

2.09Ю.07 п = 42

69.4

30.6

51.2

18.2

72.9

27.1

14.2

28.4

4.50+0.38 2.42Ю.12 8.00±0.02 п= 14 п = 25 п = 43

80.2

19.8

59.8

20.4

76.4

23.6

61.5

14.9

74.5 80.5

25.5 19.5

77-86*

14-23* 20.9±3.3**

56-64*

19-25* 26.1±6.5**

33.3±6.8**

13.6 6-10%*

22.1

*Вгапс1 1991; **Вгапс1еГа/., 1994а

В таблице 1 приведены некоторые параметры эндогенного дыхания (то есть потребления кислорода без субстратов в среде инкубации) гепатоцитов миног и лягушек в периоды активного метаболизма (миног брали в начале преднерестовой миграции, когда в кишечнике животных еще можно обнаружить остатки пищи, лягушек летом - во время интенсивного питания), а также гепатоцитов крыс. Скорость потребления кислорода гепатоцитами миног и лягушек в 2.5 - 4 раза меньше, чем гепатоцитами крыс. В расчете на мг сухого веса клеток, гепатоциты миноги потребляют кислород в 1.8 - 3.3, а гепатоциты лягушки - в 3.9 раза медленнее, чем гепатоциты крысы, причем эта разница многократно возрастает, если скорость дыхания рассчитывать на клетку, посколы^ гепатоциты млекопитающих имеют большую массу, чем клетки печени холоднокровных позвоночных (Савина и др., 1997). Однако, несмотря на столь сильные различия в скоростях эндогенного дыхания гепатоцитов, соотношения между основными процессами, сопряженными с потреблением кислорода, синтезом и гидролизом АТФ весьма близки в исследованных нами гепатоцитах и в гепатоцитах крысы. Действительно, в этих клетках потребление кислорода за счет немигохондриальных процессов составляет порядка 20% от скорости эндогенного дыхания (у лягушки несколько выше), остальные 80% составляет потребление кислорода митохондриями; потребление кислорода в процессе окислительного фосфорилирования составляет 55-65% от эндогенного дыхания и 70-80% от митохондриального потребления кислорода, соответственно дыхание, сопряженное с утечкой протонов через внутреннюю мембрану митохондрий составляет примерно 15-20% от эндогенного дыхания и 25-30% от митохондриального. Поддержание гомеостаза внутриклеточных концентраций Ыа+ и К+ требует гидролиза АТФ. Для обеспечения этого процесса тратится примерно 10% эндогенного дыхания или 20-25% от производимой клеткой АТФ. Подобная структура энергетического метаболизма найдена также в гепатоцитах реттитиАтрЬуЫигш уИИсеря (Вгап<1 е! а!., 1991). Приведенные результаты позволяют предположить, что структура энергетического метаболизма в гепатоцитах позвоночных животных достаточно консервативна и не зависит от филогенетического положения вида.

ВЗАИМОСВЯЗЬ СКОРОСТИ ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА ГЕПАТОЦИТАМИ И МАССЫ ТЕЛА У ЭКТОТЕРМНЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ. СРАВНЕНИЕ С МЛЕКОПИТАЮЩИМИ. Другой общей для экю- и эндотермных позвоночных закономерностью оказалась

взаимосвязь скорости потребления кислорода гепатоцитами и массы тела животного (Рис. 2). Корреляция между метаболизмом покоя и массой тела известна давно, более того, для млекопитающих показано, что эта взаимосвязь сохраняется и на уровне отдельных органов, тканевых срезов и клеток (Else and Hulbert, 1985; Шмидг-Нилльсен, 1987: Couture and Hulbert, 1995; Porter and Brand, 1995,). To есть очевидно, что снижение удельной скорости дыхания с увеличением массы тела связано не с уменьшением числа клеток на единицу массы ткани, а с уменьшением метаболической активности самих клеток. В работах Портера и Бранда (Porter and Brand, 1995) показано, что зависимость удельной скорости потребления кислорода гепатоцитами от массы тела млекопитающего может бьггь описана уравнениями VO; = 7.09М"0'20 или VOj = 6.83М"018. На экготермных позвоночных подобные исследования не проводились.

J минога

-0.17 у = 1.60х

г = - 0.84, Р < 0.01

лягушка £

лосось

угорь

г 0.7 «

í 2 „

. о. 3

t 0.6 g g

и M

I s

05 S О

I 5.

„ , u u ,—,

04 ё ь g

i> ,5 S

о.з 11 S

g ô

o ¡5

°< 5

о S

n 1 * S

0.1 о и

ВО ~

о

0 J

-2

-1.5 -1 -0.5

Log массы тела (кг)

Рисунок 2. Зависимость скорости потребления кислорода гепатоцитами некоторых экготермных позвоночных от массы тела. Уравнение °Линейной регрессии: log у = 0.20 - 0.171og х, г = -0.84, Р < 0.01.

Рисунок 2 представляет собой обобщение собственных и литературных данных о потреблении кислорода клетками экготермных позвоночных. Даны скорости потребления кислорода (нмоль Ог/мин/мг сухой массы клеток) гепатоцитами миноги, лягушки (даны два значения - для гепатоцигов молодых лягушек весом 12 - 18 г и для взрослых особей весом 30 - 35 г) а также черепахи Chrysemys picta belly (Buck et al., 1993), лосося Salmo gairdnery

(Seibert, 1985) и угря Anguilla anguilla (Jankowsky et al., 1984). Животные, перечисленные выше, принадлежат к разным классам эктотермных позвоночных, различаются по фазам жизненного цикла; есть некоторые (незначительные) различия по экспериментальным процедурам, поэтому обсуждаемая зависимость скорости потребления кислорода от массы тела носит приближенный, хотя и принципиальный характер.

Сравнение приведенных выше уравнений для гепатоцитов млекопитающих с полученным нами уравнением для эктотермных позвоночных позволяет заключить, что показатели степени во всех трех уравнениях примерно равны и приближаются к показателю степени в уравнении для зависимости удельной скорости потребления кислорода животным от массы тела для млекопитающих: VO2 ~ М"025 (Kleiber, 1932) и рептилий VO2 ~ М"017 (Шмидт-Ниельсен, 1987).

Данные, полученные в группе Бранда и Портера (Porter and Brand, 1993; Porter and Brand, 1995; Porter el al., 1996), свидетельствуют о том, что в гепатоцитах млекопитающих различной массы структура энергетического метаболизма сохраняется неизменной, т.е. скорости митохондриального и немитохондриального дыхания, скорости потребления кислорода при окислительном фосфорилировании и в результате утечки протонов имеют зависимости от массы тела животного, сходные с таковой для общей скорости эндогенного дыхания (Porter and Brand, 1995). То же можно сказать и об активности Ыа7К+АТФазы (Couture and Hulbert, 1995). Это значит, что при многократных различиях в скорости энергетического метаболизма, связанных с массой тела (гепатоциш мелких животных имеют в несколько раз большую скорость потребления кислорода, чем гепатоциты крупных) или филогенетическим положением вида (гепатоциты эктотермных позвоночных имеют примерно в 5 раз меньшую скорость потребления кислорода, чем гепатоциты млекопитающих той же массы и температуры тела) структура энергетического метаболизма в гепатоцитах не меняется. Следовательно можно сделать вывод, что межвидовые различия в скорости энергетического метаболизма в гепатоцитах связаны с пропорциональными изменениями всех перечисленных параметров.

ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ МЕТАБОЛИЗМ В ГЕПАТОЦИТАХ МИНОГИ В ПЕРИОД ПРЕДНЕРЕСТОВОЙ МИГРАЦИИ. Рассмотренные выше параметры энергетического метаболизма круглоротых и амфибий относятся к периодам активности, однако, как уже отмечалось выше, эктотермные

позвоночные интересны прежде всего необычайно широким спектром экологических адапгаций. Поэтому, при исследовании окислительного метаболизма эюшермных позвоночных, для нас, прежде всего, было интересно изучить особенности клеточной биоэнергетики в состояниях, несвойственных большинству млекопитающих. Обширное поле для таких исследований предоставляет период преднерестовой миграции миног {Ьатрегга АиьчаИИх). В это время животные полностью перестают питаться. Жизненная активность в течении 8 месяцев миграции, развитие гонад, а также весенняя поведенческая активация, связанная с нерестом, обеспечиваются энергией исключительно за счет мобилизации липидов и белков (главным образом, мышечной ткани), накопленных в морской период активного питания. Будучи моноцикличными, миноги погибают после нереста (в мае). Важно отметить, что прекращение питания в данном случае не является следствием недоступности пищи, "голодание" миноги является генетически "запрограммированным" и регулируемым поведенческим феноменом, получившим название синхония.

Дыхание и адепииовые нуклеотиды в гепатоцитах мигрирующих миног. Феномен обратимой метаболической депрессии. Феномен обратимой супрессии энергетического метаболизма в печени миноги в зимние месяцы анадромной миграции впервые был описан Савиной на изолированных митохондриях и препаратах ткани печени (Савина, 1985; Савина, 1992). Однако опыты с изолированными митохондриями или замороженной в жидком азоте тканью печени не позволяют исследовать энергетический метаболизм как субъект внутриклеточной регуляции. Поэтому для более глубокого изучения феномена нами был проведен ряд исследований на изолированных гепатоцитах.

Мониторинг скорости эндогенного дыхания гепатоцигов, проведенный нами в течение двух сезонов преднерестовой миграции миног, показал, что в зимние месяцы миграции наблюдается существенное (в 2-3 раза) замедление скорости эндогенного дыхания этих клеток (рис. 3). Скорость потребления кислорода гепатоцитами достоверно (р < 0.05) снижается от осени к зиме, достигая минимума в феврале, однако весной, с приближением нереста, дыхание клеток вновь возрастает, приближаясь к уровню осенних значений. Так в сезон миграции 1996-1997 гг., скорость потребления кислорода гепатоцитами в нмоль Ог/мин/мг влажной массы клеток составляла: 1.19 ± 0.08 в ноябре, 0.53 ± 0.06 в феврале и 0.88 ± 0.03 - в апреле. Подобные изменения наблюдались также и в сезон 1997-1998 гг.

i 3

I 3

S S

o s

ID s H

3

o 5 -

-O o h O ■

0 -

1 §

§ я и к

О 50 100 150 200

дни эксперимента (с 1.11.96 по 5.05.97)

Рисунок 3. Сезонные изменения эндогенного потребления кислорода гепатоцитами миноги в период преднерестовой миграции. Данные сезона 1996-1997 гг. Сплошная линия - полиномиальная регрессия 4 го порядка.

Падение скорости эндогенного потребления кислорода гепатоцитами сопровождались изменениями в скоростях митохонприального и, главным образом, фосфорилирующего дыхания (рис. 4). . .Скорости потребления кислорода в результате немшохондриального окисления (разность между эндогенным и митбхондрийльным. дыханием) и утечкч протонов менялись в значительно меньшей степени. Так, скорость немшохондриального дыхания подвергалась лишь статистически недостоверным,' колебаниям, всегда находясь в пределах.0.15 -.0.23 нмоль СЬ/мин/мг влажной массы клеток Скорость потребления кислорода в результате „утечки протонов хотя и несколько снижалась в зимние месяцы, но не пропорционально снижению общей скорости потребления кислорода гепатоцитами, поэтому вклад утечки протонов в потребление кислорода митохондриями гепатощггов увеличивался с 25% в ноябре до 47% в феврале, а вклад окислительного фосфорилирования (разность между митохондриальным дыханием и потреблением кислорода в результате утечки протонов) в этот период падал,,с;75% до 53% (рис. 4). Весной status quo восстанавливался. Таким образом ,в гепатоцитах миноги в исследуемый период наиболее подвержена супрессии именно система окислительного фосфорилирования.

Рисунок 4. Сезонные изменения эндогенного дыхания гепатоцитов миноги (светлые столбцы), митохондриального дыхания (темные столбцы) и потребления кислорода в результате утечки протонов (заштрихованные столбцы). Данные представлены как М ± SEM, 1996 -1997 гг.

¡. Снижение скорости производства АТФ в гепатоцитах сопровождалось также значительным снижением содержания АТФ в клетках. В таблице 2 Представлены данные по содержанию адениновых нуклеотидов в гепатоцитах миноги в периоды преднерестовой миграции 1996-1997 и 1997-1998 гг. Содержание АТФ в клетках печени миноги достоверно уменьшалось от осени к зиме, весной наблюдалось определенное увеличение этого параметра. Содержание АДФ и АМФ оставалось относительно постоянным в течение исследуемого периода, таким образом и размер суммарного пула адениновых нуклеотидов тоже значительно уменьшается зимой.

Регуляция окислительного метаболизма в гепатоцитах миноги. Описанный выше феномен обратимой супрессии энергетического метаболизма в гепатоцитах мигрирующих миног интересен тем, что изменения скорости метаболизма в этом случае, по-видимому, не связаны напрямую с изменениями условий окружающей среды. Животные в период миграции не испытывают ни недостатка кислорода, ни сильного переохлаждения, они перестают питаться, но это, как мы уже отмечали выше, не связано с недостатком пищи в окружающей среде. Таким образом, должны существовать соответствующие внутренние механизмы регуляции

Таблица 2. Сезонные изменения содержания адениновых нуклеотидов в гепатоцитах миноги в периоды миграции. Данные представляют собой средние значения (по месяцам) для сезонов 1996-1997 и 1997-1998 годов. М ± т для п числа измерений._

Месяц АТФ АДФ АМФ £ адениновых нуклеотидов Энергетический заряд

нмоль/мг влажной массы клеток

Ноябрь 2.08 + 0.05 0.44 ±0.07 0.40 ±0.02 2.92 + 0.10 0.77 ±0.02

п = 4

Декабрь 1.54 ±0.05* 0.50 ±0.08 0.21* ±0.04 2.25 ±0.13* 0.80 ±0.02

п = 4

Январь 1.02 ±0.14* 0.41 ±0.03 0.21 ±0.04 1.64 ±0.16* 0.72 ±0.04

п = 11

Февраль 0.95 ± 0.08 0.51 ±0.03 0.27 ±0.04 1.72 + 0.12 0.68 ±0.03

п= 19

Март 0.95 ± 0.06 0.40 ±0.03 0.21 ±0.02 1.54 ±0.07 0.73 ±0.02

п= 19

Апрель 1.20 ±0.08 0.51 ±0.03 0.27 ±0.02 1.96 ±0.08* 0.72 ±0.02

п = 22

* - значение достоверно отличается от значения предыдущего месяца (Р<0.05)

метаболической скорости, по крайней мере в некоторых тканях, позволяющие животному экономить энергию для нереста в условиях длительного отсутствия экзогенных источников пищи.

Впервые на мысль о том, что скорость энергетического метаболизма в гепатоцитах миноги регулируется через доступность субстратов для окисления нас натолкнул ряд косвенных данных, полученных в сезон миграции 1996-1997гг. Было показано, что скорость дыхания гепагоцитов в присутствии разобщителя (РССР) подвержена сезонным изменениям, очень близким к обнаруженным для эндогенного дыхания (г = 0.69, р < 0.01). Вещества, подобные РССР увеличивают проницаемость мигохондриальной мембраны для протонов. В этой ситуации расход ДцН увеличивается и скорость потребления кислорода, соответственно, возрастает, вплоть до тех пор, когда ее уже начинает лимитировать скорость окисления дыхательных субстратов, всякая регуляция скорости потребления кислорода клетками со стороны системы синтеза и гидролиза АТФ при этом отсутствует. Таким образом, снижение разобщенного дыхания в зимние месяцы миграции

указывало на снижение скорости окисления субстратов в этот период. Было сделано предположение, что снижение скорости окисления субстратов, или снижение доступности субстратов для окисления регулирует скорость окислительного фосфорилирования в гепатоцитах миноги.

К аналогичному выводу приводили данные об изменении содержания аденицовых нуклеотидов в клетках: из таблицы 2 видно, что снижение скорости потребления кислорода в гепатоцитах миноги не связано с падением содержания АДФ в клетке, увеличением АТФ/АДФ или увеличением энергетического заряда Аткинсона, более того, два последних показателя наоборот уменьшались зимой. Следовательно, классические представления о ведущей роли АТФ-потребляющих процессов в регуляции клеточного дыхания неприменимы в данном случае. Считая, что доступность кислорода в этой системе не лимитирована, можно было предположить, что основная регуляция скорости дыхания осуществляется через доступность субстратов для окисления.

Таблица 3. Действие мононодацетата, аминооксиацетата и 2-бромогексадеканоата на поглощение кислорода гепатшщтами миноги. Данные представлены как М ± SEM, п - число экспериментов._

Ингибитор Скорость потребления кислорода, нмоль Ог/мин/Ю6 клеток

В присутствии ингибитора Контроль

монойодацетат, 1.20 ±0.19 1.23 ±0.23

п= 10

аминооксиацетат, п = 4 2-бромогексадеканоат, п= 5 1.33 ±0.25 1.29 ±0.19

0.21* ±0.15 1.24 ±0.15

* - значение достоверно отличается от соответствующего контроля (Р < 0.05)

Для того, чтобы проверить это предположение, мы провели ряд исследований окисления субстратов в гепатоцитах миноги в период анадромной миграции. В таблице 3 представлены данные по влиянию на скорость эндогенного дыхания гепатоцигов ингибиторов окисления углеводов, аминокислот и жирных кислот. Монойодацетат (ингибитор глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы) и аминооксиацетат (ингибитор трансаминаз) не вызывали существенного замедления дыхания. Добавление

фруктозы или глюкозы в концентрациях 5-10 мМ, а также свободных аминокислот в среду инкубации не вызывало увеличения скорости дыхания. В то же время 2-бромогексадеканоат, ингибитор окисления жирных кислот, замедлял дыхание гепатоцитов более чем на 80% (величина 2-бромогексадеканоат-нечув ста отельного дыхания близка к скорости потребления кислорода немигохондриальными процессами). Приведенные данные свидетельствуют о том, что ни гликолиз, ни окисление аминокислот не играют существенной роли в энергетическом метаболизме гепатоцитов миноги в исследуемый период, основным дыхательным субстратом в этих клетках являются жирные кислоты.

Итак, в гепатоцитах миноги для производства энергии используется только аэробный метаболизм, а в качестве топлива - только жирные кислоты. Таким образом, процесс образования АТФ здесь представляет собой более или менее прямую последовательность событий (в сильно упрощенном виде):

жирные кислоты->(3 окисление-»дыхательная цепь->ДцЬГ-»АТФ

Выяснив химическую природу окисляемого гепатоцитами миноги субстрата, мы провели серию опытов по инкубации клеток в средах, содержащих в качестве субстрата лауриновую кислоту (2 мМ). Результаты этих экспериментов представлены на рисунке 5. Добавление лауриновой кислоты в среду инкубации гепатоцитов вызывало увеличение скорости потребления кислорода клетками, причем эффект добавления жирной кислоты по усилению клеточного дыхания оказался идентичным добавлению в среду инкубации пирувата вместе с мал атом. В отличие от эндогенного дыхания, дыхание гепатоцитов в присутствии субстрата не подвержено выраженным сезонным изменениям. Анализ данных, приведенных на рисунках 3 и 5, показывает, что в ноябре добавление субстрата в инкубационную среду вызывало лишь 15%-ное прибавление скорости потребления кислорода гепатоцитами (р < 0.05), в январе эта цифра возрастала до 80%, Р < 0.05. Таким образом, именно доступность жирных кислот для окисления является основным фактором регуляции окислительного фосфорилирования в гепатоцитах миноги в период преднерестовой миграции. Снабжение жирными кислотами, по-видимому, находится здесь под жестким гормональным кошролем и ограничивается зимой в целях экономии ресурсов для обеспечения нереста.

Рисунок 5. Влияние добавления в среду инкубации 2 мМ лаурнновой кислоты на скорость потребления кислорода гепатоцитами минога. Темные столбцы - эндогенное дыхание, светлые столбцы - дыхание в присутствии субстрата. Усредненные данные 1996-1998 гт. Данные представлены как М ± SEM.

Рассмотрев феномен обратимой метаболической депрессии в гепатоцитах миноги, мы кратко остановимся на некоторых последствиях снижения скорости окислительного фосфор илирования и снижения внутриклеточного содержания АТФ для клеточного метаболизма.

Влияние замедления энергетического метаболизма на жизнеспособность изолированных гепатоцитов. В начале нашего исследования - в конце осени 1996 г. мы столкнулись с определенными трудностями при выделении гепатоцитов: с приближением зимы, когда в клетках стало уменьшаться содержание АТФ, выход клеток при изоляции уменьшался, выделенные гепатоциты имели явные повреждения клеточной мембраны (шаровидные вздутия на ее поверхности, blebbing), которые приводили к адгезии клеток и, в итоге, их гибели. Решить проблему выделения жизнеспособных гепатоцитов нам помогло сопоставление трех фактов, известных из литературы:

1) Падение уровня АТФ в клетках, вызванное различными причинами, например, гипоксией, часто сопровождается повреждением цитоплазматической мембраны, что служит причиной их гибели (Lemasters et ed., 1987; Anundi etal., 1987; Sakaida et al„ 1992; Keiminen etat., 1994; Richter et ed., 1996).

2) Закисление внеклеточной среды способно замедлить или даже остановить развитие клеточной гибели в клетках с нарушением энергетического метаболизма (Harrison el al, 1991; Nazaki et al., 1989: Gores et al., 1988; Bonventre and Cheung, 1985; Sakaidae/ al., 1992; Neiminen et al., 1990).

3) Метаболическая депрессия часто сопровождается кислотным сдвигом pH вне- и внутриклеточного пространства в тканях позвоночных и беспозвоночных животных (Hand and Gnaiger, 1988; Brooks and Stoiy, 1989, ReipscMager and Portner, 1996; Wasser et al., 1993; Donohoe etal., 1998).

Проанализировав перечисленные обстоятельства, мы снизили pH сред выделения и инкубации гепагоцигов с 7.6 до 6.6. Эта замена позволила поднять жизнеспособность гепагоцигов в суспензии до 90 - 95%, предотвратить "blebbing" и адгезию клеток По-видимому, закисление является универсальным стабилизирующим механизмом при метаболической депрессии. Причем, этот механизм реализуется не только при гипоксии (накопление лакгата), но и при других видах замедления метаболизма, за счет изменения Рс02 в тканях, изменения буферной емкости физиологических жидкостей (Donnohoe et al., 1998) и др. Одно из возможных объяснений положительного влияния закисления на жизнеспособность клеток -стабилизация мембран за счет подавления мембранных фосфолипаз (в частности, фосфолипазы Аг), pH оптимум которой находиться в щелочной области (Chang et al., 1987).

Влияние замедления энергетического метаболизма в гепатоцитах миноги на ионный гомеостаз. Среди многих процессов, протекающих в клетке за счет энергии гидролиза АТФ, следует выделить один, являющийся, с одной стороны, одним из самых крупных потребителей АТФ, с другой, -критическим для жизнедеятельности клетки, а именно, - поддержание гомеостаза концентраций калия и натрия за счет "работы" Ка7К+АТФазы. Этот фермент поддерживает высокую внутриклеточную концентрацию К* и низкую - Na+, уравновешивая пассивную утечку К+ и вход Na+, сопровождающий транспорт многих метаболитов.

Применение метода, предложенною Крумшнабелем и сотрудниками (Krumschnabel et al., 1996), позволяет одновременно определять скорость активного и пассивного транспорта калия в одном и том же клеточном образце. На рисунке 6 представлены данные зависимости скорости активного входа рубидия (функционального аналога калия) и выхода калия от содержания АТФ в клетках. Скорость пассивной утечки калия, как оказалось, мало зависит от содержания АТФ в клетках и в норме приблизительно равна

(но никогда не больше) скорости активного транспорта МГ. Скорость входа ЯЬ* оказалась в сложной зависимости от содержания АТФ: при падении содержания АТФ в клетке от 2 до примерно 0.5 нмоль/106 клеток, скорость активного транспорта ЮГ снижается незначительно, однако, начиная с определенного "критического" значения содержания АТФ (приблизительно 0.5 нмоль/106 клеток), скорость входа ШГ начинает быстро убывать. При содержании АТФ - 0.1 нмоль/106 клеток сохраняется лишь 8% от первоначальной скорости накопления Шэ .

Содержание АТФ, нмоль/миллион клеток

Рисунок 6. Зависимость скорости накопления ИЬ+ (■; сплошная линия) н выхода К* (о; пунктирная линия) от содержания АТФ в клетке. Линия для скорости накопления ИЬ+ представляет собой линию полиномиальной регрессии, И2 = 0.74. Скорость уабаин-нечувствнтслышго накопления ИЬ+ равнялась 0.015 ± 5х104 нмоль/мин/106 клеток (независимо от содержания АТФ в клетках).

По-видимому, "работа" Ыа7К+АТФазы в гепатоцитах миноги в состоянии гипометаболизма поддерживается на прежнем уровне. Этот вывод также подтверждается данными по сезонной динамике уабаин-чувств итс л ьного дыхания (потребления кислорода в результате функционирования Ка+/КтАТФазы), приведенными в таблице 4. Действительно, этот параметр мало меняется в течение периода миграции, тогда как его доля в олигомицин-чувствительном дыхании (иными словами -

доля производимой клеткой АТФ, которая тратится на "работу" Na+/lCATOa3bi) значительно увеличивается в зимние месяцы. Так в ноябре скорость уабаин-чувствительного дыхания составляла 16.3% от скорости олигомицин-чувствительного дыхания, в феврале - 54.2% (р < 0.05), а в апреле - 28.3%. Таким образом, видно, что в зимние месяцы более 50% от всей производимой клеткой энергии идет на поддержание ионного гомеостаза. Это позволяет избежать снижения пассивной ионной проницаемости цито плазматической мембраны, и, таким образом, снижения ее восприимчивости к внешним сигналам., которое происходит во многих тканях при метаболической депрессии, вызванной гипоксией (Chich el а!., 1989; Nilsson et al, 1993; Lutz and Nilsson, 1997).

Таблица 4. Сезонные изменения уабаин-чувствительного дыхания в гепатоцптах миноги. М ± SEM; п - число независимых экспериментов.

Месяц Потребление кислорода, нмоль Ог/мин/Ю6 клеток % АТФ,

Эндогенное Олигомицин- Уабаин- потребляемой

чувствительное чувств тельное Ыа'ЛСАТФазой

Ноябрь 1.33 ±0.09 0.86 ±0.10 0.14 ±0.04 16,3

п 38 17 11

Январь 0.67 ±0.04* 0.38 ±0.05* 0.20 ± 0.09 52,6*

п 22 16 4

Февраль 0.65 ±0.06 0.24 ±0.07* 0.13 ±0.02 54,2

п 17 11 6

Март 0.83 ±0.04* 0.43 ±0.04* 0.15 ±0.05 34,9

п 30 13 8

Апрель 0.99 ±0.04* 0.60 ±0.03* 0.17 ±0.05 28,3*

п 23 15 3

* - значение достоверно отличается от значения предыдущего месяца (Р<0.05)

В заключение изложения и обсуждения результатов исследования следует подчеркнуть, что настоящая работа посвящена изучению структуры и регуляции клеточного энергетического метаболизма эктотермных позвоночных. Полученные результаты углубляют представления об эволюции энергетического метаболизма позвоночных животных, в частности сравнение структурных соотношений процессов производства и потребления АТФ в гепатоцитах млекопитающих, рептилий, амфибий и круглоротых позволяют выдвинуть принцип эволюционной консервативности структуры

энергетического метаболизма в этих клетках. Изучение феномена обратимой метаболической депрессии в гепатоцигах миног позволило выявить механизм регуляции окислительного метаболизма через доступность субстратов окисления, а также ряд защитных механизмов, позволяющих клеткам в течение длительного времени существовать в гипометаболическом состоянии. Эти данные позволяют глубже понять принципы адаптации организма к неблагоприятным условиям окружающей среды.

ВЫВОДЫ

1. Структура энергетического метаболизма в гепатоцитах миноги и лягушки близка к таковой гепатоцитов млекопитающих и рептилий : примерно 20% общей скорости потребления кислорода клетками составляет немитохондриальное дыхание (у лягушек 30%), 15-20% - потребление кислорода, сопряженное с утечкой протонов, 55-65% - потребление кислорода в процессе производства АТФ; примерно 10% потребляемого гепатацитами кислорода расходуется в результате потребления АТФ Ыа7К+АТФазой.

2. Скорость потребления кислорода гепатоцитами эктотермных позвоночных зависит от массы тела животного согласно уравнению \02 = 1.60М"017. Показатель степени (-0.17) в полученном уравнении близок к таковым в уравнениях, полученных для млекопитающих (-0.18 - -0.20). Таким образом, как и для млекопитающих, для эктотермных позвоночных зависимость скорости метаболизма от массы тела справедлива и на клеточном уровне. Гепатощпы миног и лягушек потребляют кислород в 3 - 5 раз медленнее чем гепатоциш млекопитающих соответствующей массы.

3.' В гепатоцитах миног в зимние месяцы преднерестовой миграции наблюдается обратимая депрессия энергетического метаболизма. Она выражается в 2-3 кратном снижении скорости потребления кислорода клетками, уменьшении интенсивности окислительного фосфорилирования, снижении клеточного содержания АТФ. Регуляция скорости энергетического метаболизма в гепатоцитах минога в этот период осуществляется, главным образом, через доступность для окисления жирных кислот - основного окисляемого субстрата в этих клетках.

4. Снижение интенсивности энергетического метаболизма в гепатоцитах сопровождается падением жизнеспособности изолированных клеток. Закисление сред выделения и инкубации до рН 6.6 способно полностью предотвратил, гибель клеток.

5. Баланс скоростей активного входа и пассивного выхода калия в гепатоцитах миноги поддерживается в широком физиологическом диапазоне внутриклеточного содержания АТФ. Сильное снижение скорости активного транспорта этого иона наблюдается лишь при падении содержания АТФ в клетке ниже 0.5 нмоль/106 клеток. При метаболической депрессии поддержание внутриклеточного гомеостаза концентраций Na' и К+ требует большей доли производимой клеткой АТФ, чем в активном состоянии.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Савина М.В., Гампер H.JL, Брайловская И.В. (1997) Зависимость скорости дыхания гепатоцитов от массы тела у пойкилотермных позвоночных. Ж. Эвол. Биохим. Физиол. Т.ЗЗ № 4-5, С. 392-397.

2. Гампер, Н.Л., Саар, В.Г., Королева, Е.М., Савина, М.В. (1998) Определение свободных нукпеотидов в тканевых, клеточных и митохондриальных экстрактах методом микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Ж. Эвол. Биохим. Физиол. Т.34№2, С.178-184

3. Savina, M.V. and Gamper, N.L. (1998) Respiration and adenine nucleotides of Baltic lamprey (Lampetra fluviatilis L.) hepatocytes during spawning migration. Сотр. Biochem. Physiol. Accepted March 24, 1998,9p.

4. Gamper, N.L. and Savina, M.V. (1998) Metabolic rate regulation in hepatocytes of lampreys (Lampetra fluviatilis) during spawning migration. Submitted to the J. Exp. Biol. July 10,1998,25p.

5. Savina, M.V., Gamper, N.L., Brailowskaya, I.V. (1997). Energy metabolism of ectothermic vertebrate hepatocytes. Comparison with mammal hepatocytes. XXXIII International Congress of Physiological Sciences, St. Petersburg, Russia, June, 30 -July 5, abstract NP072-30

6. Гампер Н.Л., Савина М.В. Регуляция окислительного метаболизма в гепатоцитах миноги (Lampetra fluviatilis) в ходе преднерестовой миграции. Второй съезд Биохимического общества РАН, Москва, 19-23 мая, тезисы докладов, 4.2, С. 182.

7. Gamper, N.L., Savina, M.V. (1998) A problem of lamprey hepatocytes viability: acidification of extracellular media can prevent the death of cells with suppressed oxidative metabolism. XIX ESCPB Congress "Cellular and molecular Responses to Environmental Changes", Turku, Finland, August 23-26, abstract N 34.

8. Savina, M.V., Gamper, N.L. (1998) Possible factors regulating oxidative phosphorylation in lamprey hepatocytes during spawning migration. XIX ESCPB

Congress "Cellular and molecular Responses to Environmental Changes", Turku, Finland, August 23-26, abstract N 8.

9. Gamper, N.L., Saar, V.G., Korolyova, H.M, Savina, M.V. (1997) Fast determination of free nucleotides in mitochondrial, cell and tissue extracts by highperformance anion-exchange liquid chromatography. International Congress on Analytical Chemistiy, Moscow, Russia, June 15-21, abstract N E-56.

10. Gamper, N.L., Slepysheva, V.V., Korolyova, H.M., Kozlov, AV., Davydov, V. (1998) Determination of adenine nucleotides by microcolumn HPLC: an application to the metabolic disturbances assay in lymphocytes of patients with chronic renal failure. 22nd International Symposium on Chromatography,, Roma, Italy, September 13-18, abstract N341.

11. Korolyova H.M., Gamper N.L., Menshenin A.V., Saar V.G., Popov N.S. (1996) Analysis of nucleotides and nucleosides in physiological fluids and tissue extracts. Comparison of capillaiy electrophoresis and microcolumn HPLC. Tenth International Symposium on Capillary Electrophoresis and Isotachophoresis, Prague, Czech Republic, September 17 - 20, abstracts, p 100 -101.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гампер, Никита Львович, Санкт-Петербург



/ у .у» /

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.

Сеченова

На правах рукописи УДК 591.128 + 576.34 + 591.124

Гампер Никита Львович

ОБРАЗОВАНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АТФ В ГЕПАТОЦИТАХ КРУГЛОРОТЫХ И АМФИБИЙ

03.00.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических

наук

Научный руководитель -д.б.н. М.В. Савина

Санкт-Петербург 1998

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений.......................................................... 4

Введение........................................................................ 6

1. Обзор литературы............................................................ 14

1.1. Принципы организации энергетического метаболизма в клетках

позвоночных животных..................................................... 15

1.1.1. Структура клеточного энергетического метаболизма. Потребление кислорода клетками......................................... 18

1.1.2. Межвидовые различия скорости энергетического метаболизма в клетках позвоночных животных.......................................... 24

1.2 Регуляция энергетического метаболизма в клетках позвоночных

животных....................................................................... 29

1.3. Метаболическая депрессия................................................. 36

1.3.1. Что является сигналом к снижению метаболической скорости?... 40

1.3.2. Баланс процессов синтеза и гидролиза АТФ при метаболической депрессии...................................................................... 42

1.3.3. Поддержание ионного гомеостаза........................................ 44

1.3.4. Молекулярные механизмы развития метаболической

депрессии....................................................................... 46

2. Материалы и методы....................................................,... 47

3. Результаты и обсуждение................................................... 56

3.1. Структура энергетического метаболизма в гепатоцитах

круглоротых и амфибий в активные периоды жизненных циклов. 56

3.1.1. Размеры и масса гепатоцитов эктотермных и эндотермных позвоночных.................................................................. 56

3.1.2. Эндогенное потребление кислорода гепатоцитами. Митохондриальное и немитохондриальное дыхание. Распределение митохондриального дыхания........................... 58

3.1.3. Содержание адениновых нуклеотидов в гепатоцитах и ткани печени миног и лягушек в периоды активного метаболизма...... 64

3.1.4. Взаимосвязь скорости потребления кислорода гепатоцитами и массы тела у эктотермных позвоночных. Сравнение с млекопитающими............................................................ 66

3.2. Энергетический метаболизм в гепатоцитах миноги в период преднерестовой миграции.................................................. 74

3.2.1. Жизненный цикл миног. Краткое описание............................ 75

3.2.2. Дыхание и адениновые нуклеотиды в гепатоцитах мигрирующих миног. Феномен обратимой метаболической депрессии............ 76

3.2.3. Регуляция окислительного метаболизма в гепатоцитах

миноги.......................................................................... 86

3.3. Влияние замедления энергетического метаболизма на жизнеспособность изолированных гепатоцитов....................... 94

3.4. Влияние замедления энергетического метаболизма в гепатоцитах миноги на ионный гомеостаз............................................... 99

4. Заключение..................................................................... 104

5. Выводы......................................................................... 113

Список литературы........................................................... 115

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

адф аденозин-5' -дифосфат

АМФ ад енозин-5 '-фосфат

АТФ аденозин-5 '-трифосфат

АФК активные формы кислорода

БСА бычий сывороточный альбумин

ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография

гдф гуанозин-5'-дифосфат

ГМФ гуанозин-5' -фосфат

ГТФ гуанозин-5' -трифосфат

дк дыхательный контроль

жкт желудочно-кишечный тракт

Фн неорганический фосфат

ФП фосфатный потенциал ([АТФ]/[АДФ][Фн])

УДФ уридин-5'-дифосфат

УМФ уридин-5' -фосфат

УТФ уридин-5' -трифосфат

цАМФ аденозин-3' ,5' -циклофосфат

ЦДФ цитидин-5 '-дифосфат

ЦМФ цитидин-5' -фосфат

ЦТФ цитидин-5' -трифосфат

эпо эритропоэтин

ANOVA дисперсионный анализ (analysis of variances)

СССР карбонилцианид-м-хлорофенилгидразон

СоА кофермент А

CiJ коэффициент контроля фермента Ej над потоком J

АОф потенциал фосфорилирования (десятичный логарифм ФП)

ДцН электрохимический градиент протонов

A|iNa электрохимический градиент ионов Na+

АрН градиент рН

Др протонодвижущая сила

Ау мембранный потенциал

EDTA этилендиаминтетрауксусная кислота

ФАД флавинадениндинуклеотид

FCCP карбонилцианид-р(трифлуорометокси)-фенилгидразон

HEPES (N-[гидроксиэтил]пиперазин-N'-[2-этилсульфоновая кислота])

HIF фактор, индуцируемый гипоксией (hypoxia induced factor)

MES 2(Ы-морфолино) этилсульфоновая кислота

НАД никотинамидадениндинуклеотид

НАДФ никотинамидадениндинуклеотидфосфат

Р/О Отношение количества синтезированного АТФ к количеству

потребленного кислорода

pCQ2 парциальное давление СОг

SEM Ошибка среднего (standard error of mean)

tR время удерживания соединения на сорбенте в хроматографической системе

Qio коэффициент увеличения скорости химической реакции при

увеличении температуры на 10°С

рНе рН внеклеточной среды

pHi рН внутриклеточной среды

Vo2 скорость потребления кислорода

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Одна из аксиом молекулярной логики живого, сформулированная Альбертом Ленинжером, гласит: "Живые организмы создают и поддерживают присущую им упорядоченность за счет внешней среды, степень упорядоченности которой в результате этого уменьшается." (Ленинджер, 1974). Высокий уровень молекулярной организации живых систем поддерживается путем извлечения из окружающей среды свободной энергии, которая затем возвращается организмом обратно в виде тепла и других форм, дальнейшее использование которых организмом затруднено. Таким образом, превращение между собой различных форм энергии в организме является основой существования жизни. Неудивительно, что исследованиями энергетического метаболизма занимается огромное количество биологов различных специальностей, успехи этих исследований можно проследить по Нобелевским премиям, неоднократно присуждавшимся ученым в этой области знаний (последняя - в 1997 за открытие принципа функционирования АТФ-синтетазного комплекса и за исследования Na+/K+АТФазы).

С момента открытия окислительного фосфорилирования В.А. Энгельгардтом (Энгельгардт, 1931) прошло уже почти 70 лет; многие проблемы мембранной биоэнергетики за это время уже решены, однако, несмотря на быстрый прогресс в понимании принципов превращения энергии в клетках, существует ряд вопросов, до сих пор требующих разрешения. Так, нет единой теории регуляции окислительного фосфорилирования в клетке ш vivo-, неясно, как поддерживается баланс скоростей синтеза и гидролиза АТФ при изменениях скорости метаболизма; мы очень мало знаем об эволюции "энергетической машины" клетки. Последнее обстоятельство особенно показательно: основные работы по изучению энергетического метаболизма ведутся на клетках и митохондриях млекопитающих, относительно большое внимание привлечено также к изучению биоэнергетики микроорганизмов и растений, однако энергетический метаболизм клеток эктотермных позвоночных до сих пор еще мало изучен. Мы в той или иной степени представляем себе, как происходит

трансформация энергии в клетках млекопитающих, однако, мало знаем о том, что происходило с "энергетической машиной" клетки в процессе эволюции животного мира.

Логично было бы предположить, что за миллионы лет эволюции биоэнергетические мембраны достигли наивысшей степени эффективности, то есть наивысшей степени сопряженности потребления кислорода с окислительным фосфорилированием. Однако, в начале 90х годов стало окончательно ясно, что это не так: существенная часть (20-30%) кислорода, потребляемого клеткой млекопитающего, расходуется в результате пассивной утечки протонов через внутреннюю мембрану митохондрий и не сопряжена с синтезом АТФ (Murphy, 1989; Brand, 1990а; Brand, 1990b; Brown and Brand, 1991; Brown, 1992; Brand et al., 1994a). Более того, было показано (Brand et al., 1991, Brookes et al., 1998), что скорость утечки протонов в митохондриях эктотермных позвоночных ниже, чем у млекопитающих и птиц.

Другой интригующий вопрос эволюции энергетического метаболизма связан с различиями удельной скорости энергетического метаболизма у экто- и эндотермных животных. Известно, что удельная скорость метаболизма эктотермных позвоночных в 5-10 раз ниже, чем у эндотермных (при одинаковой массе и температуре тела). Различия того же порядка сохраняются и при сравнении удельных скоростей метаболизма изолированных клеток экто- и эндотермных животных. При этом, митохондрии, изолированные из клеток эктотермных позвоночных, способны in vitro функционировать со скоростями, присущими митохондриям теплокровных животных (Cassuto, 1971; Smith, 1973; Савина, 1985; Hulbert and Else, 1989; Савина, 1992). Таким образом, здесь мы сталкиваемся с явным нарушением принципа симморфоза, который гласит, что биологические структуры организованы таким образом, чтобы соответствовать максимальным потребностям организма, но не превышать их (Tailor and Weibel, 1981; Шмидт-Нильсен, 1987; Tailor et al., 1996).

Исследование энергетического метаболизма эктотермных позвоночных интересно еще с одной точки зрения. Спектр экологических адаптаций этих животных необычайно широк, и многие состояния, такие как переохлаждение, голодание, обезвоживание, существование в условиях крайне скудного снабжения кислородом, которые для большинства млекопитающих являются

стрессорными, патологическими или вообще несовместимыми с жизнью, оказываются приемлемыми для холоднокровных животных в определенные фазы их жизненного цикла. Многие эктотермные животные обладают способностью снижать скорость базального метаболизма в ответ на неблагоприятные условия окружающей среды (феномен метаболической депрессии) до крайне низких значений, - вплоть до 5% от нормального уровня (Storey and Storey, 1990), что позволяет экономить энергетические ресурсы и переживать неблагоприятные условия в течение длительного времени. Поэтому изучение окислительного метаболизма эктотермных животных может быть полезным при формировании новых терапевтических подходов для защиты клеток от последствий гипоксии (ишемии), нарушений водно-солевого обмена, неправильного питания или голодания.

Для изучения энергетического метаболизма клеток эктотермных позвоночных в данной работе были выбраны миноги (Lampetra fluviatilis) и лягушки (Rana temporaria). Миноги являются интересным объектом сравнительных исследований клеточного энергетического метаболизма по нескольким причинам. Во-первых, эти животные - представители самого древнего из ныне живущих класса позвоночных животных - Круглоротых. Кроме того, миноги обладают своеобразным жизненным циклом, в котором, в контексте настоящей работы, наиболее интересным является период преднерестовой миграции, на протяжении которого животные не питаются в течение 8 месяцев, у них практически полностью атрофируется желудочно-кишечный тракт и дренажная система печени. Развитие гонад и такой весьма активный с точки зрения энергетического метаболизма процесс как нерест протекают исключительно за счет эндогенных субстратов, накопленных в период активного питания. Будучи моноцикличными, миноги умирают после нереста. Известно также, что в зимние месяцы миграции в печени миног наблюдается феномен обратимой метаболической депрессии (Савина, 1985, 1992; Savina and Gamper, 1998).

Выбор второго экспериментального животного, лягушки, которое является представителем другого класса эктотермных позвоночных - Амфибий, обусловлен тем, что эти животные доступны для эксперимента в периоды активного питания (в отличие от миног).

Гепатоциты были выбраны в качестве объекта исследования по нескольким соображениям: 1) использование живых клеток позволяет исследовать "энергетическую машину" клетки в естественном окружении, что невозможно при работе с изолированными митохондриями; 2) печень вносит существенный вклад в энергетический метаболизм организма; 3) гепатоциты относительно легко выделить и они долго сохраняют жизнеспособность в изолированном состоянии; 4) в литературе имеется большое количество данных по энергетическому метаболизму гепатоцитов млекопитающих, что облегчает сопоставление полученных результатов.

Цели и задачи исследования можно сформулировать следующим образом.

ЦЕЛИ РАБОТЫ:

1) изучение структуры энергетического метаболизма (соотношения между основными процессами, сопряженными с потреблением кислорода, производством и потреблением АТФ) клеток эктотермных позвоночных на примере гепатоцитов миноги Lampetra fluviatilis и лягушки Rana temporaria', сравнение полученных результатов с литературными данными для гепатоцитов млекопитающих; 2) Изучение феномена обратимой метаболической депрессии в гепатоцитах миноги в зимние месяцы преднерестовой миграции.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1) Определить скорость потребления кислорода гепатоцитами миног и лягушек. Оценить вклад в потребление кислорода клетками митохондриального и немитохондриального дыхания, потребления кислорода в процессе окислительного фосфорилирования и в результате утечки протонов через внутреннюю мембрану митохондрий; определить вклад активного транспорта натрия и калия в скорость производства и потребления АТФ в клетке.

2) Сравнить скорости потребления кислорода гепатоцитами миноги и лягушки со скоростями потребления кислорода клетками печени других эктотермных позвоночных разной массы тела и млекопитающих. На основании полученных данных построить зависимость скорости потребления кислорода гепатоцитами

от массы тела для эктотермных позвоночных.

3) Подтвердить наличие депрессии энергетического метаболизма в клетках печени миног в период преднерестовой миграции; исследовать механизмы регуляции окислительного метаболизма в гипометаболическом состоянии; изучить влияние замедления скорости метаболизма на жизнеспособность изолированных клеток и поддержание в них ионного гомеостаза.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РЕЗУЛЬТАТОВ.

В результате проведенных исследований впервые было продемонстрировано, что несмотря на 3-5 кратные различия в скорости клеточного дыхания, структура энергетического метаболизма в гепатоцитах круглоротых и амфибий сходна с описанной для млекопитающих: удельный вклад в потребление кислорода клетками таких процессов как митохондриальное и немитохондриальное дыхание, потребление кислорода, обусловленное окислительным фосфорилированием и утечкой протонов через внутреннюю мембрану митохондрий, а также потребление кислорода в результате функционирования Na+/K+ATOa3bi одинаково в исследованных гепатоцитах и в гепатоцитах крысы. Доступные литературные данные по этому в отношении эктотермных позвоночных вопросу касаются только рептилий (Brand et al., 1991).

Впервые было получено уравнение зависимости скорости потребления кислорода гепатоцитами от массы тела у эктотермных позвоночных. Подобные уравнения для клеток млекопитающих были опубликованы в 1995 году (Porter and Brand, 1995а, 1995b), однако для эктотермных позвоночных таких данных до сих пор представлено не было.

На изолированных гепатоцитах миноги были подтверждены более ранние данные, полученные на тканевых гомогенатах и изолированных митохондриях печени (Савина 1985, 1992), о наличии в этих клетках в зимние месяцы преднерестовой миграции обратимой метаболической депрессии, которая выражается в 2-Зх кратном снижении скорости потребления кислорода клетками, снижении интенсивности окислительного фосфорилирования, существенном уменьшении концентрации АТФ.

Впервые были исследованы принципы регуляции энергетического метаболизма при обратимой метаболической депрессии в гепатоцитах мигрирующих на нерест миног. Было показано, что скорость потребления кислорода клетками, а также скорость окислительного фосфорилирования в гепатоцитах миноги регулируется доступностью для окисления жирных кислот - основного энергетического субстрата в этих клетках. Также была получена ценная информация об активности Na+/K+ATOa3bi в клетках, находящихся в гипометаболическом состоянии.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.

Теоретическое значение работы заключается в расширении представлений о принципах функционирования и регуляции энергетического метаболизма у эктотермных позвоночных, выявлении черт сходства и различия биоэнергетики клеток экто- и эндотермных позвоночных. Была обнаружена зависимость скорости потребления кислорода гепатоцитами холоднокровных позвоночных от массы тела, сходная с известной для млекопитающих, а также сходное соотношение процессов потребления кислорода, синтеза и гидролиза АТФ в клетках этих животных. Эти закономерности позволяют по-новому взглянуть на проблему многократных различий в скоростях метаболизма между экто- и эндотермными позвоночными.

Результаты исследования регуляции энергетического метаболизма при обратимой метаболической депрессии позволяют глубже понять феномен в целом, сформировать представления о принципах выживания клеток при низких скоростях дыхания и производства АТФ, что может найти применение в �