Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Липидный состав сыворотки, форменных элементов и липопротеидов крови человека и некоторых позвоночных

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Липидный состав сыворотки, форменных элементов и липопротеидов крови человека и некоторых позвоночных"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

РГб о

2 1 МЛН '»ЯЭД На правах рукописи

РЕГЕРАНД Татьяна Ивановна

ЛИПИДНЫЙ СОСТАВ СЫВОРОТКИ, ФОРМЕННЫХ ЭЛЕМЕНТОВ И ЛИПОПРОТЕИДОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И НЕКОТОРЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1994

Работа выполнена в лаборатории биохимии Института биологии Карельского научного центра. Российской Академии Наук.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ ДИССЕРТАЦИИ: доктор биологических наук, профессор В.С.СИДОРОВ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук, вед.н.ст. Ф.Е.ПУТИЛИНА

доктор биологических наук, вед.н.ст. Ю.Г.ЮРОВИЦКИЙ

Ведущее научно-исследовательское учреждение - Институт эволюционной физиологии и биохимии им.И.М.Сеченова (г.Санкт-Петер-бург).

Защита состоится ".!Л„ 1994 г. в 16 час.....мин.

на заседании Специализированного совета К.063.57.09 по присуждению ученой степени кандидата наук в Санкт-Петербургском государственном* университете.

Адрес: 199034, г.Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9.

Автореферат разослан "1<2." .......1994 г.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

А.Г.1Иарков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение механизмов липидного обмена и, в частности, транспорта липидов в организме в настоящее время проводится на все более тонком уровне /Герасимова, 1973; Климов, 1977; Никульчева, Перова, 1981; Лопухин и др., 1983; Goldstein, Brown, 1977; Stein О., Stein Y., 1979; Gotto, Doody, 1983/. Известно, что транспорт липидов в организме человека и животных осуществляют, главным образом, сывороточные липопротеиды /ЛП/, представляющие собой крупные надмолекулярные комплексы, обладающие различной плотностью. Работы по исследованию ЛП проводятся в основном на человеке, в области медицинской биохимии /прежде всего ради выявления их роли при различных заболеваниях//Климов, IS80; Гасилин, Курдаков, 1981; Cremer et al., 1982; Berger, 1984/. Практически отсутствуют исследования, посвященные сравнительно-эволюционному аспекту данной проблемы. Опубликованные данные, полученные на различных животных, в частности рыбах /Nelson, Shore, 1974; Mills, Tayleur, 1978/ и млекопитающих /Ловягина, Баньковская, 1970; Fried et al., 1966; Mills, Taylaur, 1971; Mille, 1976; Chapman, Goldstein, 1977$ Geister, 1977/, трудно систематизировать по причине использования различных методов исследования, в основном длительных и трудоемких. Для проведения большего объема работы, которое предполагает сравнительно-эволюционное исследование, необходим более быстрый метод, который предлагается в данной работе. Полученные результаты на 12 видах животных, принадлежащих к различным таксонам, могут быть полезными для понимания и теоретического обоснования эволюционного становления атерогенности /предрасположенности к развитию атеросклероза/ организма, поиска новых методов наиболее раннего выявления атеросклероза в организме человека и животных, а также выяснения природы различных естественных защитных механизмов против этого заболевания.

Цель и задачи исследования. Цель работы - изучение липидного состава сыворотки и ЛП различной плотности крови представителей различных классов позвоночных животных для оценки в первом приближении процесса становления и развития липопроте-идной системы крови и возникновения в связи с этим атеросклероза у ряда высших позвоночных и, в первую очередь, человека; В связи с этим были поставлены следующие задачи: I. Освоить метод выделения ЛП сыворотки крови, позволявший в гсроткиз сро-

\ „ ♦

ки и с наименьшими затратами получить наиболее информативные фракции - ЛП низкой плотности /ЛПНП/ и высокой плотности двух подклассов /ЛПВП2 и ЛПВПд/. 2. Определить липидный состав сыворотки, ЛПНП, ЛПВП2 и ЛПВПд у некоторых рыб, земноводных, птиц и млекопитающих. 3. Определить у этих животных фосфолипидный состав сыворотки, ЛПНП, ЛПВП2 и ЛПВПд. 4. Определить жирнокислотный состав эфиров холестерина и фосфати-дилхолина ЛПВП£ к ЛПВПд. 5. Проанализировать зависимость изменения лигшдного и Еирнокислотного состава отдельных ЛП, а тагсге холестериновых коэффициентов атерогенности у филогенетически разных по возрасту позвоночных животных.

Научнач новизна и практическая ценность работы. Найден, в значительной степени модифицирован и апробирован метод выделения ЛПНП и двух подклассов ЛПВП, который можно использовать не только в научных целях, но также и в клинических лабораториях, оснащенных доступной медицинской техникой. Метод внедрен на базе больницы скорой медицинской помощи г. Петрозаводска.

Определен общий липидный и фракционный фосфолипидный состав сыворотки и ЛП у 12 представителей позвоночных разных классов с использованием единого методического и методологического подхода. Впервые исследована сыворотка и ЛП сига, леща и налима. Установлена внутривидовая изменчивость отдельных ли-пидных показателей, на фоне которых.четко прослеживается эво-люционно направленная тенденция развития липопротеидной системы крови от рыб до млекопитающих. Установлено нарастание атерогенности организма в целом в связи с усложнением его организации. Изучен количественный и качественный состав пула жирных кислот эфиров холестерина и фосфатидилхолина ЛПВП2 и ЛПВПд к определена их роль в реакции эстерификации свободного холестерина и выведения его из организма животных, принадлежащих к разным таксонам.

Полученные данные могут быть использованы при проведении более широких сравнительно-эволюционных исследований, а также з качестве контроля при изучении различных патологий у сель-ско-хозяйственных животных /звероводство, рыбоводство/ и у диких при нарушении экологической обстановки в результате усиления неблагоприятного антропогенного воздействия на окружающую среду.

Положения выносимые на защиту. I. Изменения липидного со-

става ЛП, обусловленные возрастающей потребностью позвоночных в холестерине, способствуют нарастал™ атерогенности /предрасположенности к развитию атеросклероза/ в делом от рыб к млекопитающим. 2. Однако, в каждом классе позвоночных имеются виды более и менее восприимчивые к развитию атеросклероза. 3. Основные эволюционные изменения происходят в ядре ЛП-частиц /содержание ЭХС увеличивается, а ТАГ уменьшается/, при этом соотношения индивидуальных фосфолипидов стабильны. 4. Состав жирных кислот ЛПВП у позвоночных различается, что определяет видовую специфичность ЛХАТ.

Апробация работы. Отдельные части диссертационной работы докладывались на Республиканской конференции "Актуальные проблемы биологии и рационального использования природных ресурсов Карелии"/Петрозаводск, 1989/, Всесоюзной научной конференции "Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов Европейского Севера"/Сыктызкар, 1990/, Региональной конференции "Актуальные проблемы биологии и рационального природопользова-ния"/Петрозаводск, 1990/, II Всесоюзном симпозиуме "Экологическая биохимия рыб"/Ростов Великий, 1990/, Международном симпозиуме "Физиологические основы повышения продуктивности хищных зверей"/Петрозаводск, 1991/, XXIII Всесоюзной конференции "Биологические ресурсы водоемов бассейна Балтийского моря" /Петрозаводск, 1991/, ЛП Научной конференции "Экологическая физиология и биохимия рыб"/Петрозаводск, 1992/.

Публикации. По теме диссертации опубликовано II статей и II тезисов для докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 157 страницах машинописного текста, иллюстрирована 50 таблицами и 34 рисунками, дополнена приложением. Список литературы включает 242 наименования, в том числе 170 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. Исследования проводили на 12 видах позвоночных. Для работы с сывороткой крови человека была отобрана группа /30 человек/ доноров мужчин в возрасте 20-50 лет, здоровых по клиническим показателям. Исследовано 5 видов млекопитающих: кролик Огу5Ьо1айиз сигйси1ив

domesticus - 20 особей, норка Mustela Vison - 25 особей, песец Alpex lagopus - 15 животных, крыса- Battus norregicus - 15 особей, свинья Sus domesticus - 25 животных. Птицы представлены двумя группами: куры Gallus üoaesticus - 20 птиц, и голуби Columba palumbus - 15 особей. Из земноводных была изучена лягушка Rana temporaria 90 особей. Из класса рыб исследовано три представителя: сиг coregonus lavaretus L. - 45 особей, налим Xota Iota L. - 30 рыб, лещ Abramis Ъгаша ■ - 50 рыб.

Методы отбора крови описаны в наших работах /Петровский и др., 1986; Регеранд и др., 1988; Лизенко, Регеравд, 1989/.

Сгусток форменных элементов /эритроциты, лейкоциты, тромбоциты и фибрин/ тщательно и многократно промывали дистиллированной водой до полного ее обесцвечивания. Затем его высушивали при комнатной температуре и фиксировали смесью хлороформа-метанола /2:1//Регеранд и др., 1988/.

Ж из сыворотки крови выделяли методом преципитации /qí_ dez et al., 1982/в нашей модификации /Регеранд и др., 1990/. Принцип метода состоит в последовательном осаждении из сыворотки крови сначала ЛПНП /гепарином и coso^/. затем ЛПВ^/де-кстрансульфатом/. Полученные осадки ЛПНП и JIIMIg фиксировали смесью хлороформа-метанола./2:1/. ЛПВПд, находящиеся в растворенном виде в надосадочной жидкости,, фиксировали 5 кратным объемом смеси хлороформа-метанола /1:1/.

Исследованию липидного состава подвергали 5 фракций крови: сыворотку, ЛПНП, ЛПВПз» ЛПВПд и форменные элементы. Общую • экстракцию липидов из зафиксированных материалов проводили по методу Фолча /Polch et al., 1957/. Фракционирование липидов осуществляли с помощью одномерной тонкослойной хроматографии /Кейтс, 1975/. Для разделения общих липидов использовались пластинки силуфол и смесь растворителей: петролейный эфир-серный эфир-уксусная кислота /90:10:1/. Пятна липидов обнаруживали парами йода, идентифицировали по метчикам и цветным реакциям /Лизенко, 1981/. Разделение индивидуальных фосфолипидов на фракции проводили на стеклянных пластинках с тонким слоем си-лик агеля в смеси растворителей: хлорофоры-ыетанол-вода /65:25: 4//Лизенко, 1981/. Для количественного определения общих фосфолипидов /ФЛ/ и триацилглицеринов /ТАГ/ использовали гидро-ксаматный метод, для определения холестерина /ХС/ и его эфиров

/ЭХС/ - метод с применением треххлорного железа, растворенного в хлорной кислоте /Сидоров и др., 1972; Лизенко, 1981/. Определение отдельных фосфолипидов проводили по фосфору /Пицин, Пенев, 1972/.

Метиловые эфиры жирных кислот из фосфатвдилхолина /ФТХ/ и эфиров холестерина /ЭХС/ ЛПВП2 и ЛПВПд получали путем прямой переэтерификации в метаноле /Цыганов, 1971/. Разделение проводили на хроматографе "Хром-41" с пламенно-ионизационным детектором в стеклянных набивных колонках с внутренним диаметром 3 мм и длиной 2.5 м, содержащих в качестве стационарной фазы 15% Reoplex-4-OO на Chi-omosorb У-AW, 120-140 mesh. В качестве подвижной фазы служил инертный газ гелий, скорость потока газа - 60 мл/мин. Разделение проводили в изотермическом режиме при температуре' термостата колонок - 195+1°. Полученные пики идентифицировали сопоставлением с метчиками, а также определяя эквивалентные длины цепей и сравнивая их с табличными данными /Jamieson, Beid, 1969; Jamieson, 1975/. Относительное содержание индивидуальных жирных кислот рассчитывали по методу' Бар-тлера и Иверсона '/Bartlet, Iverson, 1966/.

Содержание полученных липздов из сыворотки, форменных элементов и Ж крови выражали-как в относительных /процент .от суммы/, так и в абсолютных /мг/дл/ единицах.

Полученные данные были обработаны статистически на ЭВМ EC-I052 с применением пакета прикладных программ СТАТЕС-2. При обработке данных придерживались общепринятых правил вариационной статистики /Рокицкий, 1973; Ивантер, 1979/.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Содержание липкдов в сыворотке крови. Данные по липидно-му составу сыворотки крови млекопитающих, птиц, земноводных и рыб свидетельствуют о том, что даже при той небольшой таксономической выборке, которая сделана нами, существует как видовая изменчивость основных групп лкпидов внутри одного класса, так и определенная однонаправленная изменчивость между классами типа позвоночных.

По содержанию общих липидов /ОЛ/ кровь человека и исследованных животных имела довольно близкие показатели, коэффициент вариации /КВ/ в среднем по типу не превышал 385S. При этом стабильно повышенные показатели отмечались в классе рыб, где содержание ОЛ превышало 1000 мг/дл. Наименьшее количество ли-

пидов было обнаружено в сыворотке лягушки - 477 мг/дл, что-значительно отличалось от средних данных /-42&/ по всему типу позвоночных. Подтверждение этому факту можно найти в литературе. В то же время по относительному содержанию отдельных липи-дных фракций /в % от суммы всех липидов или от суммы Ш/ этот вид подчиняется общим закономерностям, характерным для типа позвоночных. По классу млекопитающих в среднем вариабельность Содержания ОЛ составила 43%. Максимальное их количество в сыворотке обнаружено у представителей отряда хищников - норки /семейство куньих/ и у песца/ семейство собачьих/ - свыше 1000 мг/дл, а наименьшее - в сыворотке крови свиньи - 575 мг/дл.

По содержанию отдельных липидных фракций наиболее изменчивыми, в расчетах на абсолютные единицы /мг/дл/, оказались ФЛ. КВ данного показателя в целом по таксону составил 26%. Стабильно повышено количество ©I у рыб - около 607 ыг/дл. Средние данные по классам птиц и млекопитающих по содержанию общих <±Ш в сыворотке крови довольно близки, но в 1.6 раза ниже, чем у рыб. В классе млекопитающих наибольшее количество ФЛ обнаружено в сыворотке представителей отряда хищников - норки и песца /646 и 607 мг/дл, соответственно/, что почти в два раза выше, чем у других млекопитающих, включая человека.

В целом таксономическая вариабельность всех групп липидов не превышала 50^, т.е.-.той черты, за-которой, по мнению некоторых авторов /Сидоров, 1983/ начинаются отклонения от нормы при индивидуальной /внутривидовой/ изменчивости. Следовательно, эволюция липидов сыворотки крови в плане изменчивости их количественного содержания и количественных соотношений друг к другу при адаптации к новым условиям среды, в том числе и питания, приводящим к изменению атерогенных свойств крови, практически не подходила к какой-то запретной границе, за которой уже начинается патология.

Установлена стабильность содержания /в % к сумме Ш1 и соотношения индивидуальных ФЛ у исследованных представителей позвоночных, что свидетельствует в пользу сильной генетической запрограммированности величины этого показателя.

При сравнении средних данных по каздому классу наблюдается определенная направленность величины липидных показателей от низшего таксона к высшему. Содержание ОЛ, суммарных ФЛ, ТАГ имеет тенденцию к уменьшению от рыб /низших позвоночных/ к мле-

копитающим и птицам /высшие позвоночные/, при этой содержание ЗХС имеет обратную направленность. Эта закономерность особенно четко проявляется по отношении к ТАГ и ЗХС - запасным липидам, транспортируемым сывороткой крови. Указанная таксономическая особенность согласуется с ранее высказанным положением /Сидоров, 1983/ о том, что филогенетически более древние семейства рыб /лососевые, осетровые/ в качестве запасных веществ накапливают в основном ТАГ, в то время как более молодые семейства рыб /окуневые, шуковые, карповые, тресковые/ наряду с ТАГ приобретают способность накапливать б заметных количествах и ЭХС, которые являются в определенной степени более прогрессивной формой запасных липидов, т.к. в своей молекуле содержат как энергетические, так и структурные элементы /жирные кислоты и ХС/, значение которых как источников для синтеза половых гормонов, кортикостероидов и простагландинов особенно велико для выживания вида в стрессовых ситуациях.

Наблюдаемая видовая изменчивость основных групп липидов /ФЛ, ТАГ, ХС и ЗХС/ сыворотки крови по сравнению с индивидуальными $Л,' по-видимому, прежде всего связана с конкретными эколого-физиологическими особенностями каждого вида, определенными как генетической компонентой /пределами колебаний этих веществ генетически закрепленными в результате конкретной эволюции каждого вида/, так и способностью системы ЛП организма реагировать на различные экологические и физиологические факторы. В нашей работе мы можем лишь констатировать, что в этом отношении каждый вид специфичен и не похож на другой.

Липидный состав форменных элементов крови. Для сравнительной оценки достоверности таксономической вариабельности содержания липидов крови позвоночных был проведен анализ ли-пидных компонентов общей суммы всех форменных элементов крови. Предполагалось, что вариабельность состава липидов форменных элементов должна быть меньше, чем таковая в сыворотке крови.

Основными липидными компонентами форменных элементов являются ФЛ, Данные по вариабельности /КВ/ 5Л в целом по типу составили только 9%. Это указывает на то, что процентное содержание ФЛ в форменных элементах, в отличие от сыворотки и тем более отдельных ЛП в ней, более стабильно. Разница между средними показателями по классам животных от рыб до млекопитающих практически отсутствует. Аналогичная картина наблюдалась и при

рассмотрении распределения индивидуальных ФЛ. Стабильность состава §Л форменных элементов крови дополняется низкой вариабельностью концентрации ХС.. При этом какой-либо зависимости между атерогенностью организма и содержанием Ш и ХС в форменных элементах крови нами не обнаружено.

Таким образом, монотонность качественного состава и количественных соотношений отдельных ФЛ и ХС в форменных элементах крови отражает идентичное или очень сходное строение мембранной структуры эритроцитов крови исследованных представителей типа позвоночных. Напротив, липидный состав сыворотки и соотношение отдельных липидных компонентов в ней более разнообразно, что особенно четко видно при .анализе различных ЛП.

Липидный состав ЛПНП. По содержанию липидов в ЛПНП изученные млекопитающие четко делятся на две группы. Так, высокое содержание QJI обнаружено в ЛПНП сыворотки крови человека, кролика и свиньи. Особенно они обогащены ЭХС и ТАГ, что соответствует их транспортной функции, состоящей в доставке этих липидов в стенку кровеносных сосудов, а затем в ткани и органы. В ЛПНП норок, особенно крыс и песцов, содержание общих липидов намного ниже. Концентрация ФЛ у них преобладает над ТАГ и ЭХС. Потенциальная возможность доставки избытка ХС к стенкам кровеносных сосудов у этих животных слабее. В классе птиц у кур ЛПНП более насыщены ФЛ и ТАГ, чем у голубей, в' среднем почти в 2 раза. Наиболее сильные колебания в липидных показателях ЛПНП отмечены в классе рыб. Таг:, сиг и налим по некоторым признакам занимали крайние и.противоположные положения в рамках всего типа позвоночных, что говорит о высокой функциональной дифференцирове отдельных семейств рыб /сиг относится к филогенетически более древним лососевым рыбам, а налим - к филогенетически более молодым тресковым рыбам/.

Основными ФЛ ЛПНП, также как и сыворотки в целом, являются ФТХ и СФЫ. КВ относительного содержания индивидуальных ФЛ в ЛПНП значительно ниже, чем других липидных компонентов, что говорит о высокой стабильности и генетической запрограммированности фосфолипидного статуса ЛПНП практически у всех сравниваемых позвоночных. В то же время показано, что содержание ОЛ в ЛПНП уменьшается от рыб к млекопитающим приблизительно в 1.5 раза, что четко коррелирует с несколько большим /почти в 3 раза/ уменьшением в них ФЛ. В среднем в ЛПНП сох-

мг/дл

раняется высокое суммарное содержание транспортируемых нейтральных запасных липидов /ТАГ и ЭХС/ при заметном уменьшении общего содержания ТАГ и пропорциональном увеличении концентрации ЭХС от рыб к млекопитающим. Эволюционирует прежде всего производительность по переносу запасных липидов каждой частицы ЛПНП, т.к. в расчете на ФЛ /структурные элементы частиц ЛИ/ доля переносимых ЭХС и ТАГ увеличивается от рыб к млекопитающим /рис. I/.•

Рис. I Среднее содержание липидов /А/ и их отношения /Б/ в ЛПНП 0 - рыбы; 0 - птицы; Я - млекопитающие ОЛ - общие липиды; ФЛ - фосфоли-пиды; ХС - холестерин; ЭХС - эфи-ры холестерина; ТАГ - триацилгли-церины; ФТХ - фосфатидилхолин; СФМ - сфингомиелин.

Поскольку соотношение выше___ приведенных липидов /ХС и ЭХС,

тттщ ытзкт сушарного ж и фл, таг и эхе/

как известно из медицинской биохимии /Климов, 1977/ связано с активностью проявления атеросклероза у человека, данные показатели были сравнены у животных с разной восприимчивостью к развитию экспериментального атеросклероза, что могло бы иметь теоретическое значение в плане понимания эволюционного становления атерогенности у разных животных. Установлено, что у животных, предрасположенных к развитию атеросклероза /с высоким холестериновым коэффициентом атерогенности/ содержание ОЛ, ФЛ, ТАГ, ХС и ЭХС в ЛПНП в 2-2.5 раза выше, чем у животных, устойчивых к данному заболеванию. Наиболее сильная разница отмечена по ЭХС. При этом соотношение отдельных ФЛ сохраняется как у атерогенных, так и у неатерогенных животных на одном уровне. Остается практически неизменным и соотношение двух мембранных элементов - ХС и ФЛ в целом.

Все характерные моменты распределения липидных компонентов у менее и более атерогенных животных аналогичны таковым у филогенетически более древних /сиг/ и молодых /налим/ рыб.

Причем сходство состоит в том, что сиг по отношению к налиму является менее атерогенным.

• Можно предположить, что эволюция, ведущая к увеличению производительности /транспортной емкости/ ЛПНП, в то же время сопровождалась увеличением атерогенности кровеносной системы.

Липопротеиды высокой плотности. По современным представлениям /Климов, 1983/, удаление ХС с клеточных мембран эндотелия сосудистой стенки осуществляется при участии ЛПВП и фермента лецитин-холестерин-ацилтрансфоразы /ЛХАТ/, который синтезируется в печени и активируется в крови при образовании комплекса ЛПВП и ЛХАТ. Реакция с участием.ЛХАТ протекает на поверхности ЛПВПд, где она катализирует перенос остатка ненасыщенной жирной кислоты из второго положения молекулы ФТХ на свободный ХС. Синтезированные при ЛХАТ-реакции ЭХС вследствие всоей гид-рофобности перемещаются внутрь липопротеидной молекулы, которая превращается в ЛПВП^. Именно эта частица переносит ХС в печень или на другие классы ЛП /Никифорова, 1581/.

Липидный состав ЛПВПо. Несомненно, что свою функцию ЛПВП2 будут выполняить более эффективно в двух случаях: при увеличении общего количества их и при повышении производительности каждой частицы в отдельности /при увеличении холестериновой нагрузки на частицу/.

По содержанию 0Л в ЛПВП2 наиболее сильные различия отмечались в классе рыб. Установленная нами при анализе ЛПНП тенденция к высокой функциональной дифференцирозке отдельных семейств, рыб, сохраняется и в ЛПЗ^. Таким образом, проблема транспорта ЭХС в целом в организме решалась двумя путями в процессе эволюции, как это видно уже на примере низших позвоночных: значительным увеличением общего количества ЛПВП2 по сравнению с ЛПНП, как у сига, и существенным ростом процентного содержания ЭХС в каждой частице, как у налима. В классе птиц более высокое количество 0Л в ЛПВП2 обнаружено у голубя, что соответствует увеличению интенсивности выноса избытка Ж из организма диких голубей и может являться причиной их устойчивости к возникновению экспериментального атеросклероза. Разделение животных класса млекопитающих на две группы по возможности возникновения у них атеросклеротических повреждений -полностью .подтверждается по анализу липидных компонентов ЛПШ^.

Универсальным моментом в строении ЛПВП2 всех позвоночных

мг/'дл 405 355 270\ 230 190_ 150 100 . 50

зЬь

ОЛ 9Л ХС ЗХС ТАГ

- II -

является сходство соотношений индивидуальных ЗД. Состав ФЛ ЛПЗПр остается неизменным как внутри класса, так и всего типа позвоночных, т.е. практически не поддается эволюционным перестройкам и на уровне ЛПВПд.

При рассмотрении данных, усредненных для каждого класса позвоночные, четко выявляется определенная эволюционная направленность изменений концентрации отдельных лилидных показателей и их соотношений /рис. 2/.

Рис. 2 Среднее содержание липидоэ /А/ и их соотношения /Б/ в ЛПВП2 Обозначения■как на рис. I.

Содержание ОЛ в ЛПВПр млекопитающих значительно ниже, чем у рыб и птиц. Аналогично изменяется концентрация ФЛ и ХС. Однако отношение их сохраняется постоянным у всех исследованных представителей позвоночных. В большей степени варьирует содержание запасных ли-пидов - ЭХС и ТАГ. Установлено увеличение концентрации ЭХС в ЛП ВП2 у млекопитающих и птиц по сравнению с рыбами, что указывает на возрастание способности ЛПВП2"принимать" от ДПЗПд, накапливать и удалять из тканей ХС в виде его эфироз. Концентрация ТАГ от рыб к млекопитающим снижается. Таким образом, усиливается функция ЛПВП2 тленно как переносчика ЭХС с уменьшением Транспортной доли других запасных липидоз - ТАГ от рыб к млекопитающим.

Подтверждено также, что человек и животные, склонные к развитию атеросклероза, содержат в 2 раза меньше ЛПВ^, чем ЛПНП. Тогда как у неатерогенных животных это соотношение противоположно. Эффективность выноса избыточного ХС у них з большей степени обусловлена увеличением содержания ОЛ в ЛПВП^ в 2 раза по сравнению с тем же показателем у атерогенкых животных. Анатогичная пропорция сохраняется в отношении 2ХС и ФЛ.

Липиднкй состав ЛПЗП3. По содержанию ОЛ з ЛПВП3 в классе млекопитающих четко выделяются две группы животных: с еысоким /норка, песец, крыса/ и низким /кролик, свинья, человек/ показателем. Основными липидными компонентами ЛПБПд являются £Л,

/.О

0.5 0.1

ХС/9Л ЭХС/ФА ТАГ/ФЛ СФ.Ч'ФТХ ТАГ/ЭХС

- 12 -

которые явно преобладают у песцов /достигают 7С$/, норок и крыс. У этих же животных повышено и содержание ХС в ЛПВПд по сравнению с человеком, кроликом и свиньей. Однако эти значения липидных показателей ке имеют столь большой видовой специфичности как в ЛПНП и ЛГШ^. В классе птиц проявились четкие различия по содержанию отдельных липидных компонентов ЛПВПд дикого голубя и домашних кур. Для рыб характерны наивысшие показатели абсолютных количеств СШ и их отдельных фракций в ЛПВПд по сравнению с другими позвоночными. Однако в пределах класса рыб у разных видов, неодинаковых по филогенетическому возрасту, эти величины сильно отличаются, так что более филогенетически молодые виды /налим/ могут по этим параметрам даже уступать некоторым видам млекопитающих /песцу и норке/.

Установлено, что консерватизм как качественного, тан и количественного /в % от суммы общих ФЛ/ состава отдельных ФЛ сохраняется по всему типу позвоночных и в ЛПВПд.

Рис. 3 Среднее содержание липидов /А/ и'их отношения /Б/ в ЛПВПд Обозначения как на рис. I.

Показана определенная эволюционная направленность отдельных липидных показателей от рыб к млекопитающим, заключающаяся в снижении концентрации ФЛ, ТАГ, ХС и ЭХС. Однако этот процесс идет таким образом, что соотношение липидных компонентов между собой остается, за некоторым исключением, постоянным или меняется с той же тенденцией от рыб к млекопитающим /рис. 3/.

Содержание СШ в ЛПВП3 у не-атерогенных животных вдвое выше, соответственно этому возрастает и концентрация всех липидных компонентов в расчетах на мг/дл по сравнению с ЛПВПд животных, склонных к развитию атеросклероза^ человека.

Жирнокислотный состав ЛПВП. Учитывая, что ЛХАТ-реакция происходит, в основном, между ФТХ и ХС ЛПВП, причем важную роль в определении ее специфичности играют жирные кислоты /Ш/5

<РЛ хс зхс тлг

1.0 £

0.5 0.1

чьШт

ХС/<РЛ ЗХ^ЛТАГ/РЛОВДТТХ ТАГ/ЗХС

нами проведены исследования состава ШК ФТХ и ЭХС ЛПВП2 и ЛПВПд у млекопитающих, птиц, земноводных и рыб.

В ЭХС ЛПВПд состав ЙК более насыщенный, чем в ЭХС ЛПВП2 у всех исследованных нами позвоночных. Основными насыщенными кислотами были пальмитиновая и стеариновая. Концентрация этих кислот выше в ФТХ, чем в ЭХС как в ЛПВПд, так и в ЛПВПд. Установлено, что уровень моноеновых кислот в ЭХС ЛПВП2 возрастает в 2-3 раза от рыб к млекопитающим, тогда как в ФТХ практически не изменяется. Отмечено значительное преобладание ненасыщенных ЕК в ФТХ и ЭХС ЛПВП2 и ЛПВПд сыворотки крови рыб по сравнения с высшими позвоночными, обусловленное наличием полиеновых длин-ноцепочечных кислот, таких как 22:5/п-6/, 22:5/п-3/, 22:б/п-3/, которые могут включаться в реакцию ЛХАТ /рис. 4/.

Н-9ТХ Н-ЗХС П-?ТХ

Б

нч-ттх нч-зхс

Н - ненасыщенные П- палиенобые щ-нечетные

Н-?ТХ Н-ЭХС П-9ТХ П-ЗХС НЧ-9ТХ нч-зхс

3 рыбы

0 птицы

1 млекопитающие

ФТХ ЭХС

ФТХ эхе

Рис. 4 Содержание различных групп Ж в ФТХ и ЭХС ЛПВП2 /А/ и ЛПВПд /В/ и отношение ненасыщенных кислот к насыщенным в ФТХ и ЭХС ЛПВП2 /Б/ и ЛПВПд /Г/

Определено, что в ЭХС ЛПВП2 отношение ненасыщенных кислот к насыщенным выше, чем в ЛПВПд в 1.5-2.5 раза, причем в ЭХС ЛПЗПг- всех позвоночных значительно преобладают кислоты /п-6/ ряда. Аналогичная зависимость характерна и для ЛПВП2 млекопитающих, птиц и земноводных, тогда как у рыб отмечается противоположная особенность - ненасыщенные ЗК /п-3/ ряда составляют 42%, а /п-6/ ряда только 2С%, что свидетельствует о разной

- 14 -

специфичности ЛХАТ.у рыб и высших-позвоночных.

Установлено, что в ЭХС и ФТХ ЛПВПд содержание нечетных ЕК в 2-4 раза выше, чем в ЭХС и ФТХ ЛПВП2, причем в ЭХС как ЛПВП2 так и ЛПВПд концентрация нечетных жирных кислот постоянно выше,, чем в ФТХ у всех исследованных представителей позвоночных /рис. 4/. При этом, если концентрация нечетных Ж в липидах ЛПВП2 от рыб к млекопитающим почти не изменяется, то в ЛПВПд она четко, в 3-3.5 раза, увеличивается как в ФТХ, так и в ЭХС в процессе филогенеза./рис. 4/.

Липогтротеиды и атерогенность организма. Связь с эволюцией. Наиболее четко предрасположенность организма к атеросклерозу отражает холестериновый коэффициент атерогенности /КА/ А.Н. Климова /1977/, использующийся при диагностике больных. КА представляет собой отношение ХС атерогенных ЛП /ЛПНП/ к ХС ан-тиатерогенных ЛП /ЛПЗП/. Данный показатель вычислен нами для каждого исследованного вида. Эти результаты соответствуют литературным данным /Ловягина, Баньковская, 1970; Климов, Ни-кульчева, 1984/. Существует прямая зависимость между средними показателями КА для каждого таксона /рыбы-0.6,.птицы-0.7, млекопитающие-!. 2/ и его филогенетическим положением.

Эволюционный процесс становления системы ЛП крови от низших позвоночных /рыб/ к высшим /млекопитающие, в том числе и человек/, по-видимому, шел через микроэволюционные перестройки этой системы самостоятельно, хотя и в одном направлении, внутри каждого таксона, что и отразилось в особенностях состава ЛП и соотношений их компонентов. Усиленная потребность тканей в ХС, как источника для создания стероидных гормонов, в процессе филогенеза, особенно у теплокровных животных /птиц и млекопитающих/ по сравнению с холоднокровными /рыб и земноводных/ приводит к увеличению его синтеза и транспорта в виде ЭХС ЛПНП. Следствием этого является возможность накопления ХС И ЭХС в организме и создания условий для развития атеросклероза сосудов, что в свою очередь, вызвало соответствующий отбор в механизмах удаления ХС из организма. По нашим данным, это обстоятельство отражено в увеличении содержания ЭХС и в ЛПВП2 /увеличение транспортной емкости частицы/ как в абсолютных количествах, так и при расчете на другие липиды у млекопитающих и птиц по сравнению с рыбами. Это явление может служить компенсаторным механизмом относительно общего снижения концек-

грации ЛПВП в крови млекопитающих и птиц по сравнению с рыбами.

ВЫВОДЫ

1. Проведен качественный и количественный анализ липидов сыворотки, форменных элементов, ЛПНП, ЛПВП2 и ЛПВПд крови у рыб /сиг, лещ, налим/, земноводных /лягушка травяная/, птиц /голубь и курица/, млекопитающих, различающихся по восприимчивости к развитию экспериментального атеросклероза /норка, песец, крыса, кролик, свинья/, и человека. Показано, что качественные различия между сравниваемыми вариантами отсутствуют. Однако наблюдаются заметные количественные различия ме,?ду ними в содержании ОЛ, суммарных <М, ТАГ, ЭХС, ХС и ЖК.

2. Показана низкая вариабельность относительных величин липидных показателей /содержать липидов в расчете на общуя сумму липидов, в процентах к сумме ФЛ/. Особенно стабильны соотношения индивидуальных ФЛ /фосфатидилхолина, сфингомиели-ка, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, лизофосфатидил-холина, фосфатидной кислоты/ к общей сумме ФЛ, что свидетельствует в пользу слабой эволюционной изменчивости количественного соотношения структурных липидных компоненнтов ЛП.

3. Впервые установлена эволюционная тенденция в изменчивости содержания липидов в сыворотке, ЛПНП и ЛПЗП2 крови позвоночных: снижение абсолютного содержания ТАГ и увеличение такового ЭХС от рыб к млекопитающим.

4. Показано, что наименьшей эволюционной изменчивости подвержены концентрации липидов з форменных элементах крови /по сравнению с сывороточными липидами/ и содержание липидов з ЛПВПд /по сравнению с ЛПНП/.

5. Установлено, что в каждом классе животных изученные виды делятся по значению холестеринового коэффициента атеро-генности на две группы: восприимчивые к развитию атеросклероза /человек, кролик, свинья, куры, калим/ и устойчивые к этому заболеванию /норка, песец, крыса, голубь, сиг/. Создается впечатление, что, с одной стороны, атерогенность увеличивается в процессе эволюции диких животных, а с другой стороны, она усиливается под влиянием различного рода антропогенных факторов /в частности в связи с доместикацией/.

б. Показано, что ЭХС ЛПВП2 и ЛПВПд у видов разных классов

животных заметно различаются по составу НК, что свидетельстует о разной специфичности ЛХАТ к жирнокислотной компоненте во втором положении ФТХ ЛПБП.

7. Установлено достаточно высокое суммарное содержание в общем пуле жирнокислотных остатков ЭХС /особенно в ЛПВПд/ нечетных жирных кислот, причем оно увеличивается от рыб к млекопитающим. Это говорит о возможности существования новой функции ЛПВП: удаление из организма необычных для позвоночных нечетных и, возможно, других жирных кислот микробиологического происхождения.

СПИСОК СТАТЕЙ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Петровский В.И., Регеравд Т.И., Лизенко Е.И. Экстракция; разделение и количественное определение липидных фракций сыворотки крови // Лаб. дело. 1986. Ш. С. 339-341.

2. Регеранд Т.И., Петровский В.И., Лизенко Е.И. Разделение липидов, экстрагированных из сыворотки и форменных элементов крови при помощи тблкослойной хроматографии на пластинках силу-фол // Лаб. дело. 1988, К5. С.78. '

3. Лизенко Е.И., Регеранд Т.И. Характеристика липидного состава сыворотки и форменных элементов крови человека и некоторых животных // Биохимия экто- и эвдотермных организмов. Петрозаводск, 1989. С. 20-25.

4. Регеранд Т.И. Липопротеиды сыворотки крови позвоночных животных // Там же. С. 27-53.

5. Регеранд Т.И., Лизенко Е.И., Петровский В.И., Сидоров B.C. Выделение липопротеидов сыворотки крови человека методом осаждения и определение их липидного состава // Лаб. дело. 1990. т. С. 48-52.

6. Лизенко Е.И., Регеранд Т.И., Петровский В.И., Садоров

B.C. Липидный состав липопротеидов сыворотки крови человека и некоторых млекопитающих животных // Биохимия экто- и эндотерм-ных организмов в норме и при патологии. Петрозаводск, 1990.

C. 34-39.

7. Регеранд Т.И., Лизенко М.В. Липидный состав липопротеидов сыворотки крови человека в норме // Там же. С. 45-50.

8. Регеранд Т.И., Петровский В.И., Лизенко Е.И., Сидоров B.C. Выделение липопротеидов сыворотки крови методом осаждения // Вопросы иммунологии и гематологии. Петрозаводск. 1990. С. 3J-36.

9. Регеранд Т.И., Рипатти П.О. Соотношение связанных жир- • пых кислот сыворотки и липопротеидов сига и налима // Биохимические особенности болезней рыб. Петрозаводск. 1991. С. S9-I05.

10. Лизенко Е.И., Регеранд Т.И., Рипатти П.О., Сидоров B.C. Жирнокислотный состав липопротеидов высокой плотности сыворотки крови некоторых экто- и эндотермных животных // Там. же.

С. I06-II3.

11. Лизенко Е.И., Регеранд Т.И., Рипатти П.О., Петровский В.И., Сидоров B.C. Жирнокислотный состав лецитина и эфиров холестерина липопротеидов высокой плотности человека и некоторых млекопитающих и рыбы // Вопр. мед. химии. 1993. KS. С. 52-55.