Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительная характеристика некоторых структурных свойств и сродства к кислороду гемоглобина представителей различных классов позвоночных

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная характеристика некоторых структурных свойств и сродства к кислороду гемоглобина представителей различных классов позвоночных"

ЫИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЙ ДОМНЫ р^б СШЩ0П0ЛЬСКИЙ ГССУДДРС1БШШ УНИВЕРОГГЕГ

« о тли

» ° На правах рухогшс*

АЕДЕЛЬ РАЖАН ЭЛЬТАХИР АХМЕД

Ш 547.563.4:577

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ СТРУКТУРНЫХ СВОЙСТВ И СРОДСТВА й КИСЛОРОДУ ГИЮГЛСЕИНА ПРВДЗДВИГЕЯЙ РАЗШШ КЛАССОВ Ш2В01ЮЧШХ

03.00.04 - бяохякхя

АВТОРВМРАТ двссертацнн на сомсканае ученой степей« кандидата баозогяпесххх наук

Симферополь- 1995.

Работа выполнена на кафедре биохимии Симферопольского государственного университета

Научный руководитель - доктор биологических наук

Конссенко C.B.

Официальные оппоненты: член-корр. HAH Украины,

доктор биологических наук, профессор Щульыан Г.Е.; ахадеыих Крымской АН,

доктор медицинских наук, профессор Акицкий Г.Ю.

Ьедутзее учреждение: Киевский государственный

университет и«. Т. Шевче:асо, а кафедра бвоххюш.

Защита диссертации состоится 1995 1

в ^^^-^часов на заседании специализированного ученого совета К. 20.02,02 при Сшферопольсгоы государственном университете.

Адрес университета: 333036, Крым, г.Симферополь, ул. Ялтинская, 4. •

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке уннвер ситета.

Автореферат разослан " _1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук % доцент

A.B. Янцвв

ОБцАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы, ¿опросы эволюции относятся к числу обцебиологических проблем, изучение которых проводится и на молекулярном уровне. С точки зрения систематики и эволюции болыаой интерес представляет не только изучение р;::-иолого-биэ-х;';/ичес.ких особенностей организмов, но и детальное изучение и сопоставление физико-химических, структурных и и ¿с и о к ал ь ; шх особенностей физиологически активных молекул, а также молекулярных систем, вьтюдкящих в организме вахше биологические функции.

Наука, заянкащадся этими вопроса«« - сравнительная биохимия, относится х числу быстро развивающихся, особенно в последние два десятилетия.

При реаении проблем сравнительной бисхикии всё большее внимание исследователей привлекают гомологичные белки, в«полнящие одну и ту не функция в различных организмах / Крепе, 1976,1963; Кагига , 1961; 1937 /.

Гемоглобин, наряду с другими биополимерами, являсгся одним из объектов филогенетического анализа / 2ике?*ая&1, 1965,1975,1976; 1в£газ , 1963; ЗЭауЬоГГ , 1959,1975,1976, 1976; К1а"ога , 1961,1965; Яуяьяненко, др., 1991 /.

< Важнейшая функция гемоглобина (присоединение и транспорт кислорода) и широкое распространение явились причиной с грозного внимания, которое проявлялось и проявляется многими исследователями я данноцу белну крови.

Однако, несмотря на всю широту проводимых исследований работы по изучение структурных и функциональных свойств гемо-глобкнов в сравнительном аспекте не даэт возможности дать полку» сценку кзиенений рззл!тчных параметров внутримолекулярной

структуры гемоглобина л его функциональная активности в процессе филогенеза. 3 связи с этим, дальнейшее накопление материала по сравнительному анализу гемоглобинов у животных разного уровня организации представляется весьма важным и актуальным.

Целью данной работы являлось дать филогенетическую оценку различий в некоторых структурных и функциональных свойствах геыоглобинов на уровне классов позвоночных.

В соответствии с этим, задачами работы было:

1. Дать оценку электрофоретической гетерогенности гемоглобинов Отдельных представителей шести классов позвоночных.

2. Охарактеризовать сродство к кислороду глазных злектрофоре-тических фракций геыоглобинов. Дать филогенетическую оценку различий гемоглобинов по сродству к кислороду.

3. Изучить степень гидрофобности и микровязкости (плотности упаковки) центральных и периферийных областей молекул геыорлобинов.

4. Охарактеризовать общий объём гидрофобных полостей и содержание поверхностных тирозилов в составе молекул гемоглобинов.

5. Определить связь структурных свойств гемоглобинов с их функциональной активностью.

Научная новизна. Впервые по данным флуоресцентной спектроскопии показано, что периферийные области молекул гемоглобинов характеризуются большей вариабельностью размеров и уровня гидрофобности и меньшей вариабельностью плотности упаковки, тогда как центральные области молекул гемоглобинов отличаются меньшей вариабельностью размеров и степени гидрофобности, но большей вариабельностью плотности упаковки.

Установлены филогенетические различия гемоглобинов в уров не микровязкости центральных областей белковых молекул 'и обще-

-

го об^ма гидрофобных полостей.

Показано, что микровязкость центральных областей молекул гемоглобинов снижается, тогда как общий объём их гидрофобных полостей увеличивается в направлении от класса круглоротых к млекоштащим.

Показано, что в характере изменений сродства главных •фракций гемоглобинов к кислороду прослеживается определённая закономерность: снижение сродства гемоглобинов к кислороду при переходе от более низких филогенетических групп позвоночных к высшим.

Полученный экспериментальный материал даёт основание считать, что з филогенезе позвоночных происходили закономерные изменения внутримолекулярной структуры гемоглобина и его сродства к кислороду, способствующие более эффективной отдаче кислорода тканям.

Практическое и теоретическое значение работы

.юлученные экспериментальные данные позволяют определить некоторые общие особенности и закономерности в развитии структурно-функциональных свойств гемоглобина в процессе филогенеза позвоночных.

Показано, что в процессе филогенеза снижается "жёсткость" структуры молекул гемоглобина и, вместе с тем, снюкается их сродство к кислороду, что может способствовать более эффективной отдаче кислорода тканям.

Результаты исследований имеют определённое практическое значения для уточнения и понимания филогенетических связей между отдельными группами и видами позвоночных, для биохимической систематики, а также используют при чтении лекций по общему курсу "Биологическая химия и молекулярная биология" и по специальным курсам "Структурно-функциональные свойства белков",

"Биохимия крови".

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. В характере изменений сродства к кислороду главных электро-форетических фракций гемоглобинов у представителей различных классов позвоночных прослеживается определённая закономерность: снижение сродства к кислороду при переходе от низших филогенетических групп позвоночных к высшим.

2. Периферийные области молекул гемоглобинов характеризуются большей вариабельностью уровня гидрофобности и значительно меньшей вариабельностью плотности упаковки. Центральные области иолекул характеризуются меньшей вариабельностью степени гидрофобности, но большей вариабельностью плотности упаковки.

3. Б процессе филогенеза позвоночных уменьшалась "жёсткость" структуры молекул гемоглобина, о чём свидетельствуют снижение плотности упаковки центральных областей молекул гемоглобина и увеличение общего объёма гидрофобных полостей.

Апробация работы Материалы диссертации докладывались: на научных конференциях профессорско-преподавательского состава Симферопольского госуниверситета (1994,1995 г.г.).и на расширенном заседании кафедры биохимии Симферопольского университета.

Структура и об'ёи работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), описания материалов и методов, результатов собственных исследований с их обсундением "(3 главы), 9 ьыводов и списка литературы (386 источников: из них 306 иностранных авторов). Диссертационная работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включая 44 страницы списка литературы. Текст диссертрции проиллюстрирован 5 таблицами и 18 ри-

ИАТЁРИАЛЫ И МЕТОДЦ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследований были половозрелые особи представителей шести классов позвоночных.

Класс млекопитающие: человек Homo sapiens , бык Bos taurus, свинья Surs ccrcfa, гренландский тюлень Padophilus groenlandicus".

Класс птицы: голубь Columba livia, домашние куры породы корниш Gallus donesticua.

Класс пресмыкающиеся: уж водяной Natrix teasellata.

Класс земноводные: лягушка травяная Rana tenporaria, серая жаба Bufo bufo.

Класс костные рыбы: кефаль-сингиль Mugil aura tus , карп Cyprinoa carpió , толстолоб Hypophthalmichtys colitrix.

Представитель класса круглоротые - минога речная Lanpetra fluviatilis.

Б каждой видовой группе класса было не менее 11-ти особей.

Материалом исследования был гемоглобин. Гемоглобин выделяли из эритроцитов по методу Драбкина / Drabkin , 1949 /, но без толуола во избежание образования метгемоглобинч. Концентрацию гемоглобина в гемолизатах определяли унифицированным геии-глобинцианидкым методом. Электрофоретическую гетерогенность гемоглобинов определяли методом диск-электрофореза в 7%-ном по-лиакриламиднсм геле / Davis,19б4 /• Электрофоретические фракции гемоглобинов выделяли при помощи препаративного электрофореза в блоках 7%-ного ПААГ / Ажицкий,Багдасарьян,1975 /.Анализ чистоты л гомогенности препаративно выделенных фракций проводили методом аналитического электрофореза в ПААГ. Количественное содержание ыетгемоглобина определяли цианметгемоглобино-вым методом / Кушаковский,1970 /.

Количество поверхностных тирозилов в составе молекул гемо-

глобинов определяли спектрофотометрическим методом титрована /Donovan J.» 15?э; liiiaor.,Linkers, 1367 /. Гидрофобную стр: • ТУРУ гемоглобинов исследовали методом солюбилизации углезодо] да (бензола) с пскоцью рефрактометра ИР2-23 при длине волны 589 нм / Измайлоза, Реблидер, 1974 /.

Внутримолекулярную структуру гемоглобинов изучали метод; ми флуоресцентного анализа. В качестве флуоресцентных зондов использовали 1-анилннона£талин-8-сульфонат (АНС) и П -фен нафталин (ЗНА). Интенсивность флуоресценции зондов в раствор исследуемых белкез измеряли на с пе ктрофот о ме триче с ко й устано ке Туроверова / 1^сев,Туроверов,Розанов и др.,1974 /. Инте сивность свечения регистрировали в максимуме полосы флусресц ции, длина волны возб„дцения для двух зондов составляла 360 Микровязкость различ:-/-.»: участков белковой молекулы исследова методом поляризации флуоресценции / Владимиров,Добрецов, 198 Сродство главных фракций гемоглобинов к кислороду изуча спектрофотометричесюш методом построения крики кислородном диссоциации / Шорохов, 1974 /, используя 0,5р-ные растворы гемоглобинов в 0,01 U трис-KCI буфере рН 7,0. 'Содержание метгемоглобина б исследуемкх растворах не_ превышало .

цифровые данные, полученные в результате исследований, статистически обрабатывали по методу малых выборок / Бэйли, 1964 /. 0б'1ём совокупности составлял в среднем от 5 до 12. Сравнение двух переменных еоличин осуществляли на основании t-критерия'Стьюдента. 3 диссертационной работе говорится ос изменениях только в тех случаях, когда Р<0,05.

. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЭДОВАНИ'Л И ИХ ОБСУВДЕНИЕ

I. Гетерогенность и сродство к кислороду гемоглобинов отдельных представителей позвоночных

- У -

1.1. Характеристика фракционного состава и электро-форетической подвижности гемоглобинэв отдельных представителей позвоноч.чнх Полученные нами данные свидетельствуют о тем, что подавляющее большинство исследуемых геисглобиноз у представителей различных классов позвоночных являются гетерогенными. Больпая часть гемоглобинов характеризуется содержанием двух или трёх олсктрофоретических фракций. Исключение составляет гемоглобины голубя одна фракция) и гренландского тюленя (пять фракция). 3 калдой гетерогенной системе гемоглобина можно выделить одну или две фракции с наиболее высоким содержанием белка и минорные (рис. 1, табл. I).

Рис. I. Диск-электрофсрсграыхы гемоглобинов: I - человека; 2 - быка; - 3 -свиньи ; 4 - теленя; 5 - голубя; о - кур; 7 - уна; 6 - травяной яягугжи; 9 - серой "жабы; 10 - кефали-сингиль; II - карпа; - толстолоба; 13 - речной миноги,

•

При анализе данных электрофореза в ЯААГ наблюдается тенденция снижения относительной электрофэретичеекой подвижности (К -) изученных геноглобнноз в наяразлении от круглоротых и

Таблица I

Показатели относительного процентного содержания и относительной электрофоретичесиой подвижности (Кдф) электрофоретических фракций гемоглобинов отдельных представителей позвоночных (п- 11-12)

Показатели

ь

Объекты ' исследования

Человек

Нв-1 I Нв-2*: Нв-3

Бык

Нв-1

Нв-2К

Свинья

Нв-1 : Нв-2* | Не-3

Тюлень

Нв-1 : Нв-2 : Нв-з

Содержание,

"эф

2,0* 0,015

0,21* 0,006

95* 0,85

0,25* 0,006

3,00,017

0,33* 0,00'«'

5,0* 0,04

0,25* 0,007

95* 0,92

0,35* 0,007

16,7* 46,8- 36,5* 0,14 0,60 0,48

11.35* 13.3* П.б* 0,092 0,095 0,098

0,19*

0,24*

0,004 0,006

0,38* 0,008

0,28* 0,006

0,33* 0,007

0,42* 0|009

■

<о

Показатели Объекты исследования

Тюлень : 1'олуоь . • У* Лягушка травяная

Нв-4* ; Нв-5 : идна : : фракция: Нв-1* : Нв-2 | Нв-з : Но-1* 1 • а • • Нв-2 : Нв-1* ; Нв-2

Содержание, 36.5* 27,4* 0,50 0,26 . 100,0 47.0* 35,0* 18,0* 60.0* 0,о2 0,43 0,15 0,72 40,0* 0,55 58,0* 0,70 42,0* 0,59

каф 0,52* 0,56* 0,009 0,01 0,43* 0,008 0,29* 0,43* 0,46* 0,38* 0,005 0,008 0,00Ь 0,008 0,45* 0,009 0,47* 0,008 0,59* 0,009

Продолжение таблицы I

Показатели

Объекты исрледования

Каба серая Кефаль-сингиль Г Карп Толстолоб ; Минога

Нв-1* 1 Нв-2 ' 1 Нв-1* 1 Нв-2 1 Нв-3 I Пв-1 ; На-2* Нв-1 : 'Нв-2* | 1113-1*

Содержание, отн. % 62,0- 38,00,75 О.ёО 47.00,61 41,0- 12.01 0,57 0,09 33,0- 67,01 0,38 0,83 32.0* 0,30 68.0 1 0,б2 64.5 0,(з9

Л зф 0,41- 0,590,006 0,009 0,009 0,63- 0,750,011 0,01 0,60^ 0,800,01 0,011 0,55=: 0,009 0,77^ 0,013 0,520,009

о

I

Показатели

Объект исследования

Минога

нв-а

Нв-3

Содержание, оти. %

3ф

0,1Ь

0^009

0,1 о

0,781

н ~ фракции с наиболее высоким содержанием белка

рыб к млекопитающим. Так, если величина КЭф главных и минорных фракций гемоглобинов у представителей круглоротых и рыб варьирует в пределах 0,52-0,60, то для гемоглобинов представителей других классов позвоночных значения Кэф заметно снижаются: у земноводных - 0,41-0,59; у пресмыкающихся - 0,38-0,45 у птиц - 0,29-0,46; у наземных млекопитающих - 0,19-0,3о; Кэф фракций гемоглобина гренландского тюленя находятся в пределах

1.2. Характеристика сродства к кислороду главных электрофоретических фракций гемоглобинов

Важным показателем функциональной активности гемоглобина является его сродство к кислороду. В наших исследованиях были изучены кривые кислородной диссоциации главных фракций гемоглобинов, отличающихся'от других электрофоретических фракций наиболее высоким содержанием белка (табл. 2).

Таблица 2

Показатели полунасыщения кислородом (Рс^.мм рт.ст.) главных электрофоретических фракций гемоглобинов отдельных представителей позвоночных ;п=7-Ь)

Класс Объект Р50

Млекопитающие Человек 26- 0,9

Бык 26 ± 1,1

Свинья 25 ± 0,8

Тюлень 22 ± 1,1

Птицы Голубь 30 ± 1,1

Куры 29 ±0,7

Пресмыкающиеся Уж водяной 27 ± 0,9

Земноводные Лягушка травяная 22 ± 0,9

Серая жаба 25 ± 0,9

Рыбы Кефаль-сингиль 20 ± 0,8

Карп 17 ±0,8

Толстолоб 16 ± 0.7

Круглоротые Минога речная 17 ± 0,9

Подученные результаты свидетельствуют о том, что в ряду изученных гемоглобинов наиболее высоким'сродством к кислороду характеризуются гемоглобикы речной миноги и представителей класса рыб (кефали-сингиль, карпа и толстолоба). Величины полунасыщения кислородом их главных фракций (Pg^) находятся в пределах от 17 до 20 мм рт.ст.

Сродство я кислороду гемоглобинов других позвоночных также имеет определённые филогенетические особенности.

У представителей земноводный (лягуака и жаба) и пресмыкающихся (уж) наблюдается меньшее сродство к кислороду главных фракций гемоглобиноз (PgQ находится в пределах о? 22 до 27 ш рт.ст.). В большей степени снижение сродства гемоглобинов к • кислороду наблюдается у представителей класса птиц (голубь, домашние куры). Величина P^q данных гемоглобинов составляет 30 и 29 мм рт.ст., соответственно. У представителей класса млеко-питающих отмечена некоторая стабилизация функционального показателя гемоглобинов.

4

Таким образом, в ряду изученных гемоглобинов прослеживается снижение сродства к кислород}' их главных фракций при переходе от более низких филогенетических групп позвоночных к выспим. Наиболее значительные различия гемоглобинов в величине P^q отмечена при переходе от представителей класса рыб к земноводным а от земноводных и пресмыкающихся к представителям класса птиц.

2. Филогенетические особенности структурных свойств гемоглобинов позвоночных

2.1. Анализ внутримолекулярной организации центральных •и периферийных областей гемоглобинов позвоночных

Применение флуоресцентного анализа позволило установить" филогенетические особенности внутримолекулярной организации гемоглобинов; В нагих'исследованиях прозодилось определение интенсивности флуоресценции зондов АШ и ФНА в растворах гемоглоби-

но$, что давало возможность оценить степень гидрофобности областей, занимаемых зондами в белковой молекуле. АНС занимает менее гидрофобные (периферийные) области белковой молекулы, тогда как £НА - наиболее гидрофобные (прежде всего, гидрофобное ядро глобулы). Чем вьше интенсивность флуоресценции зонда, тем больсе размеры и гидрофобность соотв'етстБуххцих областей глобулы / Остоловский,др.,1968 /.

Как следует из данных табл. 3 главные фракции исследуеглкх гемоглобинов характеризуются достоверными видовыми различиями по интенсивности флуоресценции в них зонда АНС (Р<0,05). Максимальный диапазон различий гемоглобинов по интенсивности флуоресценции АНС составляет 39 ед. Вместе с тем, прослеживается относительная стабильность данного показателя на уровне классов позвоночных. Исклх эние составляют гемоглобины млекопитаюдих (человек, бык, св-/"ья, тюлень), для которых показана более низкая интенсивность флуоресценции АКС по сравнению с гекоглоби-наш представителей других классов позвоночных.

Интенсивность (флуоресценции в гемоглобинах более гидрофобного зонда ФНА также характеризуется видовыми различиями. Наиболее высокий уровень флуоресценции ФНА установлен для гемоглобинов кур, толстолоба и речной миноги (34,33 й 35 ед., соответственно),^ наиболее низкий г- для гемоглобина гренландского тюленя (13,9 ед.). Максимальный диапазон различий гемоглобинов по интенсивности флуоресценции в них £НА составляет 21 ед., что почти в 2 раза меньше различий, установленных для АНС. Как и а случае АНС прослеживается стабильность соответствующего показателя для ЗНА на уровне классов позвоночных, которая, однако,по сравнению с АНС носит более выраженный характер и сохраняется во всём ряду позвоночных: от представителя класса круглоротых до представителей класса млекопитающих.

Дальнейшее изучение внутримолекулярной структурной органи-

Таблица 3

Интенсивность флуоресценции ( F ) зондов АНС и ЯНА, анизотропия ( А } и показатель микровязкости (jf ) для главных фракций гемоглобинов отдельных представителей

позвоночных (U-ra ; п =5)

Т"

лласс позвоночных

Объект

отн.ед

АНС

ь'ИА

АНС

Ш

пуаз

АНС

¿НА

Млекспи-тающие

Птицы

Пресмыкающиеся

Земноводные

Рыбы

Круглоро-

TUÜ

Чело ¡зек Бык

Свинья Тюлень Голубь Куры

Уж водя-7 ной

Лягушка травяная

Серая жаба

Кефаль-сингиль

Карп

Толстолоб

Минога речная

18,1*0,35

22,0-0,44

30,8*0,48

34,В-0,46

26,0-0,35

47,2*0,50 40,0-0,48

41,0*0,46

57,0*0,53

39,2*0,45

42,8*0,47. 37,2*0,44

42,5*0,4В

28,5*0,45

23,0-0,42

17,0*0,40

13,9-0,38

19,0-0,35

34,0*0,44 22,5*0,42

18,5-0,40

18,5-0,42

29,0-0,40

' 18,0-0,39 33,0-0,45

35,0*0,4?

0,123*0,004

0,123-0,004

0,122*0,005

0,127-0,006

0,128*0,008

0,115*0,008 0,110*0,006

0,115-0,004

0,126-0,003

0,126*0,006

0,127-0,006 0,124-0,004

0,145±0,006

0,156-0,003

0,153*0,004

0,153-0,003

0,156-0,002

0,153-0,004

0,115-0,003 0,158*0,002

0,168-0,003

0,166-0,002

0,172-0,002

0,176*0,003 0,176*0,005

0,190-0,00-1

0,049-0,001

0,049-0,002

0,049*0,001

О,051±0,002

0,051-0,001

0,046-0,001 0,044*0,002

0,046-0,001

0,050*0,003

0,050*0,002

0,051-0,002 0,050*0,001

0,060^0,001

0,060*0,001

0,058-0,002

О,058-0,001

0,060-0,002

0,058*0,002

0,050-0,003 0,062*0,001

0,064*0,002

0,063*0,001

0,068-0,001

0,070-0,002 0,070*0,003

0,060*0,002

i

эации гемоглобинов было связано с определением показателя мин-ровязкости различных участков белковой молекулы. Для этого использовали метод поляризации флуоресценции зондов (табл. 3). Уровень поляризации и анизотропии флуоресценции зондов в растворах белка характеризует степень микровязкости различных участков белковой глобулы, тем самым свидетельствуя о плотности или "жёсткости" упаковки глобулы в её отдельных частях:чем выше микровязкость, тем более плотной является упаковка соответствующих участков глобулы /' Остоловский,др. ,1950 /.

Как следует из данных табл. 3, микровязкость зон сорбции АНС в гемоглобинах (периферийные участки глобулы) находится в пределах 0,044-0,.060 пуаз. Наиболее низким уровнем микровязкости зон сорбции АНС характеризуется гемоглобин ужа, наиболее высоким - гемоглобин речной миноги. Показаны достоверные видовые различия гемоглобинов в значениях показателя микровязкости у представителей класса птиц (голубь, домашние куры), земноводных (травяная лягушка, серая жаба), круглорошх (речная минога). Прослеживается незначительная вариабельность данного структурного параметра гемоглобинов цри переходе от класса рыб к классу млекопитающих• Исключение составятся гемоглобин речной миноги, для которого установлено достоверно более высокое значение микровязкости окружения зонда АНС по сравнению с геиоглобя-нами представителей других классов позвоночных.

Микровязкость зон сорбции ФНА в исследуемых гемоглобинах, в среднем, в 1,5 раза превосходит микровязкость областей, занятых АНС, что свидетельствует с большей плотности упаковки центральных областей молекул гемоглобинов. Максимальный диапазон различий гемоглобинов по микровязкости огфужения зонда ФНА составляет 0,03 пуаз, что в 2 раза превышает диапазон различий, установленных для АНС.

Б отличие от показателя гянровяэкости зон сорбции АЬС в изменениях показателя микровзякости зон сорбции ¿НА прослеживается определённая закономерность: снижение микровязкости областей, занятых Жк при переходе от низших филогенетических групп позвоночных к высшим. Наиболее выраженные изменения показателя микровязкости наблюдаются яри переходе от класса круглэ-ротых к классу рыб, от класса рыб к классу земноводных и от пресмыкающихся к классам птиц и млекопитающих (рис. 2). Сопоставление данных по микровязкости зон сорбции £НА и сродства гемоглобинов к кислороду свидетельствует о взаимосвязи структурного и функционального показателей: при переходе от низзих филогенетических групп позвоночных к выспиы прослеживается снижение как сродства главных фракций гемоглобинов к кислороду, так и плотности упакозки центральных облзстей их молекул.

Ка основанин результатов флуоресцентного анализа моню сделать предположение о том, что на изменения внутримолекулярной структуры гемоглобина, которые осуществлялись в процессе филогенеза, накладывались определённые ограничения. Центральные * области молекулы гемоглобина претерпевали более жёсткие ограничения з размерах и степени гидрофобнс-сти, что долнно быть принципиально важным для поддержания пространственной структуры ко-лекулы и её оптимального функционирования. Лериферийше области молекулы гемоглобина претерпевали более жёсткие ограничения в плотности упаковки, что также могло иметь большое значение для сохранения общей структурной организации каждой из субъединиц.

2.2. Характеристика общего объёма гидрофобных полостей и содержания поверхностных тиро-зилов в гемоглобина* позвоночных

Применив метод солюбилизации углеводорода С бензола) глазными фракциями гемоглебкноз ш определили обцне объёш гидрофобных полостей, рассчитаз величину связывания бензола этими

р*

*0т

а 04 I о.ог

МИНОГА

КIVЛИь-СННГИЛк

КАРП

ТОЛСТО- ЛИГ НИ- ЖА 6 А ЛОВ КА

ум гслувь куры тюлт шны> бык ченоаы

Рдр ;

1-}> «РНА

Рис. 2. Взаимосвязь показателей микровязкости зон сорбции ФИА £¡? ) и сродства к кислороду (Р^) для главных фракций гемоглобинов отдельных представителей различных классов позвоночных

белками (таблица 4).

Таблица 4

Солюбилизация бензола главными фракциями гемоглобинов и количество поверхностных тирозилов в составе их молекул (п = 5)

Класс

позеоночкых

Объект :Степень :Общий объём". % позерх-:связывания :гидрофобных: носткых :бензола :полостей : тирозилов

оелком ;« ; моль/моль) :( у; А3) •

169 -г 3 24690*421 37,5*1,8

165 + 2 24106±342 40,0*1,2

167 + 3 24398*267 40,0*1,7

143 + 2 23434*413 40,0*1,4

156 + 2 22776*298 25,0-1,2

160 £ 5 23354*700 26,7*1,9

134 + 6 1952Ь*760 30,0*1,8

125 + 5 16214*543 31,6*1,7

, 131 + 3 19050*421 23,6*1,5

112 + 3 16374*382 26,7*1,0

105 + 3 15330*422 23,5*1,1

107 2 15622*430 25,0*1,2

35 + I 5110*215 25,0*1,4

Млекопитающие Человек Еык Свинья Тюлень

Птицы Го'луСь

Куры

Пресмыкающиеся Уж водяной Земнозодные

Рыбы

аруглоротые

лягупка травяная

Серая жаба

Кефаль-сингиль Карп

Толстолоб

Минога речная

Оказалось, что величина связывания бензола гемоглобинами различна и составляет от 35 колей (гемоглобин миноги) до 169 колей (гемоглобин человека) углеводорода на одну молекулу белка.

За исключением гемоглобина миноги, в ряду изученных тетра-мерных гемоглобинов наименьшим общим объёмом гидрофобных полостей, доступных для бензола, характеризуется геюглобикы рыб о„ 0о

(15330 А -'16374 А3), а наибольшы гемоглобины млекопитащкх (23434 А3 - 24690 А3).

В ряду взятых представителей позвоночных прослеживается незначительное, но достоверное увеличение общего объёма гидрофобных полостей гемоглобинов'з направлении ■ от класса кругясро

тых и класса рыб к классу млекопитающих. Наиболее выракешгые изменения данного структурного параметра в ряду тетраыерных гемоглобинов наблюдаются при переходе .от класса рыб к классу земноводных и от пресмыкающихся к классу птиц и к млекопитающим, что соответствует характеру изменений в геыоглобинах плотности упаковки центральных областей их молекул (рис. 3).

Основываясь на представлениях о взаимосвязи общего объёма гидрофобных полостей белковых молекул с "гёсткостьв" их структуры / Измайлова, др., 19*74; Остоловский.др.,1990 /, а такне на данных флуоресцентного анализа, могаю предположить, что в филогенезе позвоночных уменьшалась "жёсткость" структуры . гемоглобина, что должно было отразиться на его функциональной активности, в частности, на сродстве к кислороду.

Так как изменения в структурных параметрах белков могут быть обусловлены количеством и распределением в белковых глобулах остатков тирозина, нами было проведено определение количества тирозилов, локализованных на поверхности молекул гемоглобинов (табл. 4). Содержание поверхностных тирозилов в главных фракциях гемоглобинов находится в пределах от 23,5? до 40,от общего содержания остатков тирозина в исследуемых белках. За исключением гемоглобинов млекопитающих гемоглобины остальных представителей позвоночных характеризуются сравнительно меньшим процентным содержанием поверхностных тирозилов (от 23,52 до 31,6%). У представителей класса млекопитающих содержание поверхностных тирозилов в гемоглобинах составляет от 37,5% (гемоглобин человека) до 40,0% (гемоглобины быка, свиньи и тюленя).

Наблюдается взаимосвязь в данных по количеству поверхностных тирозилов и уровня флуоресценции зонда АНС в главных фрак- . циях гемоглобинов млекопитающих: меньшая гидрофобность периферийных участков мопекул гемоглобинов сочетается с большей локализацией тирозилов на их поверхности.

^ФНА,

ПШ

КРУГЛО • РОТЫЕ

1

%

и

П

РЫБЫ

ЗЕМНОВОДНЫЕ ЛРеСМЫКА■ ПТИЦЫ ЮЩИЕСЯ

млеколнтАЮщнЕ

чД5

«МО1 5010* «МО*

МИНОГА КАРП

толстолоб

КЕФАЛЬ- ЛЯГШ-СИНГНЛЬ КА

ШВА УЛГ ГОЛУбЬ КУРЫ тюлене СЗННЬЯ БЫК ЧЕЛОВЕК

I-V

Рис. 3.

Взаимосвязь микровязкости зон сорбции ФНА (>) и общего объёма гидрофобных полостей ( V) для главных фракций гемоглобинов отдельных представителей различных классов позвоночных

Таким образом, на основании результатов исследований можно сделать предположение о том, что в процессе филогенеза позвоночных осуществлялось неравномерное, но закономерное развитие внутримолекулярной структуры и функциональной активности гемоглобина. Очевидно, выход позвоночных на сушу, преодоление сил гравитации, появление легких, зволвционно сформированная способность поддсру-ивать постоянную температуру тела у птиц и млекопитающих и, в связи с этим, интенсификация метаболизма, - всё это могло Сыть движущей силой изменений структурных и кислородо-7ранспорт1кх свойств гемоглобина в направлении повышения его эффективности на этапе разгрузки в тканях.

Развитие эволюционных представлений о формировании структуру и функции гемоглобина даёт возможность лучше понять молекулярные основы б иол гнческой эволюции и установить закономерности, лежащие в ос№ зэ структурно-фушщиональных взаимосвязей как в гемоглобина, так и в других белках.

вывода

1. Впервые по данным флуоресцентной спектроскопии показано, что геыоглобины позвоночных характеризуются видовой специфичностью уровня гидрофобности и микровязкости (плотности упаковки) в центральных и периферийных областях белковой молекулы.

2. Периферийные (менее гидрофобные) области молекул гемоглобинов характеризуются большей вариабельностью уровня гидрофобности и значительно меньшей вариабельностью плотности упаковки.

Центральные (более гидрофобные) области молекул гемоглобинов отличаются меньшей вариабельностью уровня гидрофобности, но больней вариабельностью плотности упаковки.

3. Показано закономерное снижение плотности упаковки в

более гидрофобных участках молекул гемоглобина при переходе от низших филогенетических групп позвсноодых к выезим.

4. Установлено, что общий объёи гидрофобных полостей главных фракций гемоглобиноа увеличивается в направлении от класса круглоротых к млекопитающим.

3 ряду тетраыерных геыоглобинов наиболее значительные изменения структурного параметра отмечены у представителей класс; земноводных и у представителей птиц и млекопитащих.

5. Показано закономерное снижение сродства пемогдсбкков к кислороду при переходе от низших филогенетических групп позвоночных к высшим.

Наиболее выраженные изменения в сродстве гемоглобиноэ к кислороду отмечены при переходе от представителей класса рыб к представителям класса земноводных, а также к представителям класса птиц.

6. Установлено, что различия геыоглсбинов в сродстве к кислороду имеет видовуя специфичность и могут быть обусловлены приспособлением организмов к определенным условиям существования.

7. Степень электрофоретической гетерогенности геыоглобкнов не зависит от видовой специфичности.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАНИЙ Ш ТШЗ И НАЯРАЗЛЕШХ В ПЕЧАТЬ

1. Сравнительная характеристика некоторых физико-химических я структурно-функциональных свойств гемоглобина в ряду позвоночных // Журнал эволец, биох1ш. и физиол. 1994, 5 5.- С.683 669 {соавтор Коноаенко C.B.).

2. Структурно-функциональные свойства макромолекул и особенности метаболических процессов при различных состояниях органиэ ка // Вестник Симферопольского университета, ч. Î, Симферополь,. СГУ, 1995. - С. 153-157. .

3. К еопросу о внутримолекулярной структуре гемоглобина позвоночных // Биофиэнха (в печати, соавтор Коношенхо С.Б. ).

4. О видовой специфичности внутримолекулярной структуры гемоглобина позвоночных // Журнал эволюционной биохимии и физиологии (в печати, соавтор Конооенко C.B.)

АНЮТАЦДО

АСдель Рахман Эльтахир. Сравнительная характеристика некоторых структурных свойств и сродства к кислороду гемоглобина представителей различных классов позвоночных.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия, Симферополь, 1995.

Методами флуоресцентного анализа изучены филогенетические особенности уровня г;уфофсбности и ыикровязкости различных областей молзкул гемоглобина представителей различных классов позвоночных. Показано снижение "уёсткости" общей структуры и плотности упаковки центральных областей молекул гемоглобина, а такай снижение сродства к кислороду при переходе от более низ-к;гх филогенетических групп позвоночных к высшим. -

Абдель Еахман Ельтах1р. Пор1внлльна характеристика дея-

ких структурних властивостей та спорiдне-ноет! до киенв гемоглобину представник!в р!зних клас1в хребетних.

Дисертац1я на здобуття наукового ступеня кандидата б!оло-г!чних наук з спец!альност1 03.00.04- - б!ох!м1я, С1Ыферополь,

Методами флуоресцентного анал!зу вивчен! ф!логенетичн1 особливост! рхвня Ндрофобност! та м!кров»язкост1 окремих д!ля-нок молекул гемоглоб!ну представни^в р!зних клас1в хребетних. Показано деяке зниження компактност! загальнох структури i щ!льност1 упакування центральних д!лянок молекул гемогло61ну, а також зниження cnopiдненост! до киенга при переход! в!д б!льш кизьких фглогенетичних груп хребетних до" б!льш вящих.

Abdel Kahman Eltahir. Comparative characteristic of so-ae

structural properties) and affinity to oxygen of haeraoglobin of representatives of different classes of vertebrates.

3y methods of fluorescense analysis a jhylogenetic peculiarities of hydrophobicity and microviscousity of different parts of haemoglobin molecules of representative's of "different classes of vertebrates has been studied. The lowering of total structure rigidly, compact of central parts of haemoglobin molecules and the affinity to oxygen have been observed in the course of the transition from the lowest phylogenetic groups of vertebrates to the highest ones.

Ключевые слова: гемоглобин, сродство к кислороду, гидрофобность, микрсвязкость, плотность упаковки.

1995.