НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ ФОСФОРНОГО ОБМЕНА ДРОЖЖЕЙ УСВАИВАЮЩИХ РАЗЛИЧНЫЕ ИСТОЧНИКИ УГЛЕРОДА

Галина, Матвеевна Стрешинская

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ ФОСФОРНОГО ОБМЕНА ДРОЖЖЕЙ УСВАИВАЮЩИХ РАЗЛИЧНЫЕ ИСТОЧНИКИ УГЛЕРОДА
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ ФОСФОРНОГО ОБМЕНА ДРОЖЖЕЙ УСВАИВАЮЩИХ РАЗЛИЧНЫЕ ИСТОЧНИКИ УГЛЕРОДА"

; Биологический факультет;

' . - . На. правах рукопяои Галина Мат^вна (ЭТШИНСКАЯ

.'У*':-'

V ЧЛ:;-

НЕКОТОРЫЕ ОСрБВДОСТИ ФОСФОРНОГО ОБМЕНА ДРОПЕЙ, ' • " УСВАИВАЮЩИХ РАЗЛИЧНЫЕИСТ СЯНИКИ УГЛЕРОДА

: ;; Специальность 03»00.04 - Биологическая химии

У ••' ' • •" •'. : •' г" Автореферат.' ч.~ •'•• /

; ^ диссертации на соискание ученой степени у ; ■ : ^ кандидата бйологическихнаук : •; ■ с;/':

ИЗДАТЕЛЬСТВО МОСКОВСКОЮ УНИВЕРСИТЕТА • 1973 *

-Г'ч ; '

—» -: 1-т/*"-

V Работа выл олаенав Лай оратора*: антибиотиков Биолоига еского .-С ■ С

с V * факультета Московского Гмударствеявого Уштероитета ■ жменя -^ ■ £V - г■ / '-гЧй' Ц;Б.£оыояосова' *-*"-* ; ■> ."'/'■".■,■• **

■ - . -. х.-..- . , - ' " * •. * ■ ■ .■ ;: . ■ , ' " ■ . ■

- > ■' < ■ . , , * . . ■ . - - ■■' ' • ' - ' 5 - - -- .

~ г' '

■■V ' " — ... 1- - . -

_ Официальные- оппоненты: ^ доктор: биологически! наук¿"Г-^'- ^'• > '..•'•/''.. -•-'*.'.;V- . профессор*. И.С.Кулаев ..*•„.-..-•■"

;' •/••V ' Тг:'; г"''" ' ^ЖД^тдаескизГ^к;-:;^

.,. ■ * «> • -.% ' - - старший'ваучшй сотрудняж Е.Г.Давидова■ % ;;

.-.■■V.-:- ■- 4 " • ■: -.■...' . г...^- ■•■?/■. ■ , .

: •;.. • На: о^яляадьный^ отзыв : д8ссерта1да;ш11рашвна 'в Иас^итут^ биоцщди /■

" Им.,Б^ЛНСССР;; .............■'

Я. ".

а.ог0.совета-по'ботанике Физиолого-биохимического" отделени£ - ■■ . ^ • ? : ;' Би<могического факультета. МГУ, - ^еич, КС-*!Ахе. До V} . ; ] л

V- ■ Дрожжи, ассимилирующие н-алканы, в последнее десятилетие при-, влекла к себе внимание исследователей в связи с возможностью получения дешевого кормового белка я ряха ценных веществ (витаминов, атишокЕслот, органических кислот) для пищевой и фармацевтической про» . мытлевности. В 'настоящее время наиболее широко исследуются юпросы, связанные о механизмом проникновения молекулы иара^яш в клетку ж окислением субстрата: начальные и конечные продукты окисления я ферментные системы, принимающие участие в этих процессах. Однако обмен 1 веществ парафанокисляюцих дрожжей изучен неполно, тогда как путь к получению в. достаточных количествах соединений, ценных в хозяйствен» , ной отношении,лежит через изучение основных путей метаболизма этих .организмов*'

' Целью настоящей работы било исследование некоторых особенностей, фосфорного обмена дрсягаей, ассимилирующих н-алканы (контролем служили дрожжи, выращенные ва среде с глюкозой), так как фосфорные'соеда-.нения занимают центральное место в обмене веществ клетки и, особенно, в ее энергетическом обмене. * ■

" Диссертация состоит из литературного обзора к 3-т глав экспериментального исследования.

Первые две главы экспериментальной'части диссертации посвящены сравнительному изучевию количествешогосодержания псяифосфатол и , нуклеотидов адениловой системы-^ фосфорных соединений; содержащих . макроэргические связя. йв'дрожжах,*:'усвагаашах' парафиви глюкозу.

, Конденсированные неорганические , фосфаты -соединения, физиологическая роль которых окончательно м ясна. Представляло интерес исследование количественного содержания этих соединений в процессе развития дрожжей, ассимилирующих различные источники углерода, в сравнении с содержанием аденлдовых нуклеотидов, поскольку бая отмечен уси-

1-2319

ленный синтез полифосфатов в парафиновых вариантах культур, и такое изучение могло пролить свет на особенности энергетического обмена ' клетки, усваивавшей в-адкаяы.

: - Аденидовые нуклеотиды занимаит центральное место в метаболизме - , всех живых организмов«, поскольку АТФ является универсальным источни- ■" кои анергии, а соотношение адениловых вуклеотидов регулирует наорав- .: дение обмена веществ, осуществляя сопряжение экзергонических и эндер-. . тонических процессов клетка. > . ;

Нарялу о адениловыми нуялеотвдами изучены другие кяслотораство- : риыые нуклеотиды и нуклеотид-коферменты, так как они играют важную V . роль в метаболизме клетки, принимая участке в синтезе полисахаридов ^; и другях,соединений клеточной стекки и запасных углеводов, а также во взаимопревращениях моносазаридов. Качественный состав свободных . нуклеотидов меняется, чутко реагируя на изменения условий средн. :

• В последней части работы проведено исследование фоофорсодержа-щях полимеров углеводной природы - тейхоевой кислоты и фосфоманвана. Изучение различных микроорганизмов отечественяымя и зарубежными ас- -следователями пдаазало,что подобные полимеры локализуются на .верь-ферии клеток ( 1971, ВвЛаиеу 1972, Наумова 1973). Инте-

рес к этим соединениям стимулировался с одной стороны тем,что,как пока зало эдектронношкроскопическое изучение дрожк ей/ассимилирование -и-алканов приводит к изменению строения поверхностных структур клетки - клеточная стеака становится тоньше, её поверхность более глад- • кая, увеличивается поверхность, цитоплазматической мембраны за счёт образования выступов и инвагинаций (Мейсель 1969), о другой стороны* тейхоевые кислоты ранее не были обнаружены в дрожжевых организмах, а фосфомаянаны -.в этих видах дрожжей* ■ ."''.'

/ОБЪЕКТ ИССНВДОВАЯИЯ -

Объектом исследования служили дроязи Candida intermedia Н-30 -И Torulopsla faraata Н-110. В 'отдельных случаях использовали еще шесть культур рода Candida - . Все культуры получены во ВНИИ биосинтеза белковых веществ*

Выращивание проводили в каабах со 150-200 мл солевой среда на, качалке (230 об/мин ) ори тешературе 28-30°. Источником углерода служил жидкий очищенный парафин ила глюкоза, добавляем» в таких количествах, чтобы содержание углерода в среде было одинаковым* В про-. цессе культивирования поддерживали постоянный рН(5,5-6,0) среды систематическим добавлением ашвака.

Дня анализов брали клетки середины логарифмической стадии роста,' за исключением тех случаев, когда исследовала содержание нуклеотидав И подифосфатов В процессе развития культур С* intermedia Н-30 и т. famata Н-110. При изучении нуклеотидов наряду о культурой С. intermedia t выращенной в колбах, использовали дрожжи С* gullliermoadli Ш-4-, выращенные в аппарате непрерывного культивирования ВНИИ биосинтеза белковых веществ* При определении количественного содержание полифосфатов и фосфорсодержащих полимеров'углеводной природы дрожжи пос-

' I г

, ле отделения от среда обезжиривали ацетонсм, спиртам в Заиром. Кисло-, торастворимые нуклеотиды »кстрагировали из веобеэжяренных клетзк» бистро замороженных жидким азотом* „

I. ПОШМОСФАТЫ

1 , Предварительный анализ фосфорных соединений клеток С. intermedia . Н-30 и Т. famata Н-110, ассимилирующих углеводороды, показал, что около 50$ всего фосфора принадлежит соединениям, легко гидролизуемым - в кислой среде (табл.1)..Поведение этих соедшений при экстракции НСЮ^

Таблица 1

- Содержание фосфора в кяслотораствориыоЯ а квел отонера створимсй ^акциях дрожжей, выращенных на различных источниках углерода ■,( & %% от сухого веса клеток ) .

Культура і источник общ куль- > Кислотораотворишя фракция' Кислотонера створиыая фракция -. Суша подяфос- $етов обеих фракций

углерода в среде туры ,Р7 . Р0рТ0 р нк р лай рстаб робщ Р горто 'Рнк рстаб

С1псегюе(11аН-50 парафин глюкоза 1» 65 1,26 0,490 0,452 0,283 0,245 0,125 0,149 0,167 0,204 0,158 0,096 0,040 0,003 1,079 0,750 0,561 0,235 0,365 Э,347 і 0,153 0,168 ,0,719 0,331,

т.їша^ Н-110 парафин 2,07 0,742 0,534 0,200 0,142 0,334 0,066 1,198 0,665 0,357 0,176 0,999

глюкоза 1,66 0,587 0,416 0,192 0,110 0,224 0,900 0,440 0,326 0,134 0,664

х) Р^щ - общий фосфор, Р0р10 - ортофосфат, Р7 - фосфор, гвдролизуемый до ортофос$ата ІяНСІ

при 100° за 7 иик., Р^ - фосфор нуклеиновой природы, Рласі - фосфор'полифос^атной природи," ■ рстаб " сга<5альный фосфор* ?тб - кислотора ств. фракции =Р7-Рорто; рстаб = робщ ~ (р7 +

в условиях различных температур позволяло предположить, что они имеет -папяфос$атнув природу, ' _ "V ■ - * L , ■

Обнаружение полифос фатов в культуре С* intermedia. >. представляло интерес, поскольку в литературе ранее не было сообщений о вали*' чии полимеров солЕфсю$атно1 природа в данной родз дрожжей. V \ . Для качественной идентификации полнфосфатов, после экстракция дротшей по методу Лангева и'Лисса и получения аммониевых соле It поли-фоофатов различны* фракций, проводили гидролиз эткх соединений по Тило.и Вккеру. Обнаружение среди продуктов гидролиза триметафоофата-и триполифоофета явилось убедительный доказательством того, что изучаемые фосфорные соединения являются конденсироваяныыя неорганическими фосфатами. ■ , /

- . При рассмотрении табл.1 видно, что содержание поаифосфатов в парафиновых вариантах культур значительно превышает таковое в культурах дрожжей, выращенных на глюкозе.

; Для того, .чтобы подученные различия нельзя было отнести эа.счет видовой специфики изучаемых организмов, представляло интерес количественное определение солифосфатов в других культурах дрожжей, асси-мшшрующах углеводороды или глюкозу. С этой аедъи провела количественное определение дслифосфатов еще в тости видах дрожжей рода Candida, выращенных на средах с различными источниками углерода* Резуль.%ты суммарного определения кислоторастворяшх и кнслсгонерасгворямых полифосфатов приведены в табл. 2*

Как видно из таблицы, закономерность, вабдвдаемая для C.lnterraedia и Т. famata , прослеживается и во воех остальных изученных культурах дрежжей: количество солифосфатс® в парафиновых вариантах заачж-~ тельно вше, чем в глюкозних.

Факт удвоенного синтеза полифосфатов дрожжевой клеткой ори ассимилирования углеводородов казался нам весьма интересным, и мы прове-

2-2319 е ?

Таблищ 2 ■

... Суммарное содержание подифос$атов в исследуемых культурах рода ' Candida (в %% от сухого seca клеток)

;к у л ь т у р а Источник углерода в среде -

Парафин - Глюкоза

с. tropicalis H-346 1,58 0,56

■ с. tropicalis H-331 1,32 0,71

- : С. tropicalis Н-63 1,28 : 0,72

: с. lipolytica Н-342 0,93 ■ 0,55

. с. pellículosa H-26íf 3,38 . 1.25

с. guilliermondii Ш1-4 3,07 0,57

■ ЛИ дополнительное изучение культур С. intermedia и т. íemata . в возрастном аспекте. - - -

Количественное определение полифосфатов прояснили в клетках двух вариантов культур С. intermedia и т. f amata различного возраста. В-связя с поставленной задачей било проведено изучение киелотораство-римой фракции псишфосфатов и'сушарного количества кислотояе рас творимых пшшфэс фатов, экстрагируемых 1н НСЮ^, 20 пин. Количественное содержание полифосфатов в клетках изучаемых культур разного возраста : представлено на рис.1 и 2. При рассмотрении рисунков видно,L что парафиновые варианты культур на всех стадиях роста содержат приблизительно в два раза больше поли фосфатов, чей культуры глхжозннх вариантов* Высокий количественный уровень ЭТИХ соединений В Дрожжах С. intermedia и Т. famata , ассимилирующих и-алканы, обусловлен увеличением КОЛИ-1 чвства псяифосфатов обеих фракций и, особенно, фракции кислотонераст-вориыых полифоо фатов.

на cpiBe t парафином

кишлоеачборшые mwia I I на cptäe а кисмломршлворкмые полиф. fe^j глюкозой

Рнс.1. Содержание полифоофатов в культуре С. intermedia

Н-30.разного возраста (в %%. от сухого веса клеток).

Для подтверждения полученных результатов относительно усиленного синтеза поли фосфатов при ассимилировании парафина дрожжевой клеткой был поставлен эксперимент, в котором проводили замену ас: точяияа углерода: дрожжи С., intermedia' ' переносили со среды с углеводородами на среду о глюкозой (опыт 1) и наоборот ( опат Z ).

Рис.2. Содержание полифосфатов в культуре Т.

- разного возраста (г %% от сухого веса клеток).

Условные обозначения на рис.1. ■ ;•

Н-110

На рис.3 проведаны результаты по определению полифосфатов в перекрёстных опытах." При анализе рисунка видно,- что культура, пере-т-несенная со среды с парафином да среду с глюкозой, значительно они- ■ зила синтез палифос$атов* Во.втором опыте, когда дрокжи вначале вы- . . ращивали на среде с глюкозой, а затем переносили на среду с парафином, синтез полифосфатов в,них значительно увеличивался по сравне-" нию с контрольной культурой. При выращивании на парафине клетки со--держат на всех стадиях роста значительно' больше пошфосфатов (в обоях опытах). Кроме того, количество этих соединений, при выражении полученных результатов в иг в 100 ил культуральной жидкости, в глгаоэных вариантах остаётся приблизительно на одном уровне, тогда как в парафиновых - возрастает.; .-

VFac.3. Содержание полжфосфатов в культуре С. intermedia Н-30 . . , в перекрёстных опытах (в иг в 100 мл культуральной жидкостям. Количество полифосфатов в моиент переносе в оп,1 -2)66

мгДОО нл культуральной жидкости, в оп.2 -1,44 мг/100 мл ктльттральной жидкости. Условные обозначения на рис.1._

Итак, из рассмотрения вышеприведёшых данных можно заклпчрть," чтов том случае, когда дрожжи ассимилируют углеводороды, они накапливают в клетках в два раза больше полифосфагов, чем при ассимилировании обычного источника углерода - глюкозы.

Глава диссертации, посвящёняая полифесфатам,содержит 4 рисунка с изображением динамики роста изучаемых культур ж 5 таблиц.

2. КИСИОТОРАОТВОРУМЫЕ НУКЛЕСТВДЫ

'Увеличение количества макроэргических соединений - полифосфа- ."■" тов в клетках дрожжей, усваивающие парафин, по сравнению с клетками, 1 ассимилирующими глюкозу, вызвало интерес к исследованию других макроэргических соединений, прежде всего, АТф, а также кислотораствориыых ну клеотидов и нуклеотид-кофермеятов, которые могли бы внавить изменения других сторон обмена веществ этих организмов,

Количественное содержание нуклеотидов исследовали в процессе развития культуры С* 1^еиаеа1а Н-30. Ну кл вот иды извлекали из клеток дрожжей хлорной кислотой, отделяли от других соединений экстракта сорбированием на активированный уголь марки "Карбораф^дн", элюировали с : угля щелочным этанолом хроматографир свали на колонке со смолой Дауэкс. Количественное определение.нуклеотидов проводили в клетках дрожжей, выращенных на среде с парафином и глюкозой, взятых в начале и середине логарифмической стадия роста я в начале стационарной. Для глюкоз- -ного варианта это "6-, 15- и 28-часовые, а для парафинового - 15-,36-и 72-часЬ^не культуры. В табл.3 приведено общее количественное содер- ■ жание нуклеотядного материала в культурах разного возраста. Интерес- ■: но отметить, что соответствующие друг другу по стадии развития клетки обоих:вариантов содержат примерно одинаковое количество нуклеотидов и их производных, которое составляет от 26,6 до 42,5 мкмоль/г сухих дрожжей* Максимальное количество этих соединений обнаружено в культу- : рах'серединн логарифмической стадии роста (36-час культура парафинового варианта и 15-час- глюкозного). Однако несмотря ва равное общее количество нуклеотидов и их производных в клетках двух вариантов , . С. 1й1;с:шей1а наблюдаются значительные различия в качественном и количественном содержании отдельных нуклеотидов, авязанные с возраст- 1 ными особенностями культуры и усвояемым источником углерода(табл.4).

V ■ Таблица 3

Количество нуклеотвдов в хлорнокислом экстракте и их , потери при десорбции с угля и смолы в культурах"

С. 1п*вюю<11аН-30 И С. еШШершопйИ НП-4. - ■ ^

Культура и источник углерода в среде Возраст культуры, час Сухой вес дрожжей, взятых для экстракции г. Количество нуклеотидов в хлорнокислом экстракоды сль/г сух*веса Количество ¡Потери . нуклеотидов,! нуклео-элпировав- 1 тидного ных со смо- | материалы, ' ла в % к ■ мкмаль/г' их коли-оух.веса | честву в ■ ХЛОрНО- ! ! кислом ; экстракте

С. 1Ь'Ьег£ае(11а Н-30 парафин 15 і 15,59. 36 | 11,11 72 1 16,83 26,6 42,5 29,4 16,6 ' "'37,58 • 25,6 ' 39,76 17,1 ..." ; 41,83

С* 1пЪегте<11& Н-30 глюкоза 1 . 6 1 12,44 15 | 12,58 28 1 12,74 : і і * 33,8 ! 15,4 54,44 40,6 21,5 47,04 29,5 19,2 34,91

С. єиіііівиаопаіі - [ ! НП-4 ! 16,50 ■ 27,3 12,2 53,30 . парафин ' •

Отличительной особенности) дрожжей, асо шал яру ших парафин, является значительно большее содержание АМФ по сравнению с культурами, выращенными на среде с глвкозо!. Максшвльные количества этого ну-клеотида идентифицированы в 36-час. культуре парафинового варианта х 15 час культуре. глмсозного.

Особенно резкие различия выявлены в содержании АДФ. Дрожжи, выращенные ш среде о углеводородами, содержат следсеые количества это* го. нуклеотида, тогда как в клетках глюкозного варианта отмечено высокое содержание АДф на всех стадиях роста*

Для дрожжей, усваивающих парафин, характерно также пониженное содержание АТф, которое в середине логарифмической стадии роста оостав-

v " Таблида 4

Содержание свободннх' нуклеотидов а ну клеотидсодерхавдс.. соединений в культуре ,*. с.intermedia'ЇЇ-SO ври внра-щивавни на средах с парафином и глюкозой . •(мкмоль/г сухого веса древней)

- Неухлеотиды я .' их производные ' А ; пика і і ■ - Парафин . Глюкоза

15 ча-(сов 36 часов 72 часа 6 часов J 15 ча-! сов 1 28 ча-. I сов

' ?АМФ - ; 2 ' 2,94 6,64 3,60 2,40 ! 3,02 0,44

• АДФ • і 5 Следы Сдеды 0,05 0,76 ■: 1,06 . ¡0,40 ■

АТф , . ■10 0,47 0,36 0,23 ■ і 1,03 І- 1,79 0,65 -' -г;'

А-пр . !.«■ 0,44 0,29 0,18 " 1 0,64 :'0,68 ' 0,29

АМФ-пр І e 2,60 2,03 1,38 { 1,93 Г 1.92 / 1.53 :

'■.А і ■ ДДФ-глюкоза :' 5. . 0,39 0,31 ' 0,11 " ! 0,16 : 0,14 • 0,30 ;

. . "АДФ-пр ^^ ? 1 0,60 0,53 Нет | 0,21 : о,12 нет ' --:;:4

: ■ / АДФ-пр ■ 1-2'. Нет . 1,23 | 0,56 Нет I Нет ■ ■ 0.15

. ■'„ УМФ ; 4 0,89 1,90 [ 0,81 і 0,80 0,92 : 0,55- ■■

V И®.. ■ 8 0,72 '2,05' | 1,32 ■; < 0,58 2,12 2,гб

Г-пр х) ; з : Нет 0,35 0,23 ; ■ Нет ' .Нет 0,22 ' : • -

1 Г . " ххх) ' 1:9 ' 0,39 .0,40 ; 0,33 | Нет Нет нет • : • ;

';-.'. УИф-пр 1 І'з. ■ Нет 0,09 ! 0,07 ; Кет 0,16 0,11 " • ;

. . удф-пр і 8 -: 1,49 1,77 ; 2,43 ; 0,53 . 3,67 1,83

ІМФ.; ! 4 ; 0,37 0,54 "1 0,13 1 0,41. 0,33 0,23

l ; ГИФ-ыанвоза ! ? і 0,13 0,21 ; 0,21 .;". , 0,28 ' 0,43 , 0,20 . . .

- Г2Ф-глюкоэа' ■ в ; 0,04 Следы; Следы 0,21 Следи Следы" '.

х) Нукдеозидвроизводное; хх) суша, состоящая изтрех«№-пр; . ххх) уридияовое производное неизвестной природа. ' .

ляет 2/5 количества этого нуклеотида в соответствующей культуре глю-, ' козного варианта. . '■ " , ;;-

Несмотря на существенные различия в количестве АМФ.АДФ и АТф в •:■.* изучаемых вариантах культуры С. 1а£егт«й1(1 ., сумма адевкловшс .. вуклёотидов меняется шло в зависимости от ассимилируемого источника ' углерода. .

- : Содержание АДФ-производных САЦФ-пр) особенно велико в дроижах,. /.:';■ выращенных на парафине, сумма же АДФ и АДф-пр примерно одинакова в*. і обоих вариантах культур (табл.5). - ■:; о/

.1 ■■.:. -■ - Таблица 5' ■."

Количество АДФ и АДФ-пр в культуре С* intermedia Н-30 ( мкмоль/г сухого веса дрожжей )

- Источник углерода , ' в среде . Возраст культуры, - чао АДФ АДф-пр Сумма ДДФ , и АДФ-пр,;?:

4-І-'-. ■ 15 Следы Л 1,10 , " 1,10. '

парафин ' ■ ■ - 36 Следы 2.07 2,07- :

72 0,05. : 0,67 0,72

.-глюкоза 6 ■ . 15 ■■■' 28 0,76 1,87 0, Ч<У ООО ЗК.З • 1,13 2,13 .. 1,18

; Таким образом; при усвоении дрожжами парафина существенно меняется количественное отншедие нуклеотидов адениловой с 5ю темы при не из- . менной сумме атих "соединений. Среди ДЖФ-пр идентифицированы АДФ-олиго-сахарид, АДф-певтид, характерный для дрожжей логарифмической стадия; росте парафінового варіанта культуры, и АДФ-глюкоза/ количество кото-рой'вше в культурах глюкозного варианта. . ; ,

Адениловые нуклеотидыи кофермеаты составляют около половины общего пула нуклеотидов, независимо от ассимилируемого источника.углерода: 33-46% в парафиновом варианте 'и ЗО-4Э% в глшозном. ■-. : -

Если адениловые компоненты дсынвируют в количественном отношении, то уридиловые занимают второе место: культура парафинового варианта -содержат 22-з03( зтих соединений, а'культуры, выращенные на;среде о,'.; глюкозой,- 12-32%. Из данных табл.^ видно, что содержание УМФ дости-";' гает максимума в период интенсивного роста дрожжей в снижается к ігача-

лу стационарной стадии роста. Эта закономерность прослеживается ь изучаемой культуре независимо от источника углерода в среде при,большем количественном содержании УМф в клетках, усваивающих углеводороды; Ко*' дкчество УДФ увеличивается о возрастом культуры и не меняется в больших пределах в зависимости от ассимилируемого источника углерода.

В клетках парафинового я глюкоза ого вариантов япен гифлцирова нн. производные уридиндифосфета: УДФ-глшоэа, УДф-галактоза, УДф- в -аце-тилглюкозамин. Преобладающей была УДФ-глшоза. Количественное содер- -хание урвдилозых производных в клетках начала л огаря$ияческ ой стадии роста парафинового варианта (15-час,культура) втрое больше, чем в соответствующей культуре глюйоэвого варианта (6-^час культура). Максимальное количество УД4-пр обнаружено в 15-час культуре глвкозяого за" риавта (табл.4).

Как известно, уридиндифосфатсагара принимают участие в синтезе

внутриклеточных полисахаридов, а также полисахаридов клеточной стенки.*

В состав клеточной стенки дрожжей входит манная, глвкан и Я-ацетил-глюкозамда в небольших количествах'( РЬаїГ 1971). Присутствие различных полисахаридных фракций в составе клеточкой стенки находит своЗ отражение в качественном составе урядидовых коферменте®. Увеличение количества УДФ а УКФ-сахаров в середине логарифшческоЯ стадии роста, по всей вероятности, связано с интенсивнш делением клеток я синтезом полисахаридных компонентов клеточной стенки. . , -

Гуанкловыа компонент в нуклеотвднем материале дрожхей С. іп^вг_ аюаіа н-30 представлены в значительно меньшем количестве, чэм адени-ловые и уридкловые. Общее содержание гуаняювых компонентов составляет . 2-ЗІ6 в клетках, вщющенных на среде о углеводородами,! 2-5,8$ в клеттах выращенных на среде о глюкозой. Среди гуан адовых производных обнаружена ЕДф-манноэа, количество которой в два раза вше в культурах глюкозного варианта. ВДФ-глшкоза кденти^ваирсЕана только га ранних стадиях развития культуры, количество этого соединения также выше в дрожжах,

усваивающих глюкозу1 (табл.4).' . 1 , ■ 1 ■

Наличие среди ГДФ-пр ЗДф-манаозн, очевидно, - связано с синтезш . . маянана клеточной стеяви. ГДФ-глюко за, возможно, у чествует в превращениях моносахаридов только на ранних этапах развитии дрожжей, в дальнейшем функции этого соединения, по всей вероятности, выполняют дру- " гие коферыенты, скорее всего уридияовые, поскольку 1Дф-гдюкоза при- . сутсгвует в нуклеотидном материале дрожжей, находящихся в начале лога-, ритмической стадия роста, когда количество УДФ-ср минимальное. В клетках, усваивающих глюкозу,гуанилавые компоненте, видимо, принимают . большее участие в обмене веществ - во взаимопревращениях моносахаридов и синтезе полисахаридов. * :

Содержание 1Мф существенно-не меняется при изменении источника ■ углерода я не превышает 0,54 мкмоль/г сухого веса дрожжей»

Существенное изменение соотношения адевиловых нуклеотидов в клетках дрожжей, усваивающих парафин, било крайне интересным. Для исключения видовой специфичности исследуемой культуры и особенностей культивирования исследовали содержание адениловых нуклеотидов в йроизвод-ственном штамме дрожжей, С., еиЦИегтошшНП-А, которые выращивали в аппарате непрерывного культивирования на среде с парафином.

В вуклеотиднои материале втих дрожжей так же,как и в материале, полученном из С. 1я«егше<11а Н-30, среди адениловых нуклеотидов преобладает АМФ (3,32 мкиоль/г сухих дрожжей), содержание АТф - незначительно (0,22 мкмоль/г сухих дрожжей), АДф обнаружен в следовых количествах..

. Полученные результаты подтвердили вывод, сделанный при изучении > адеаидовых нуклеотидов в культуре С. 1пЪегтв41& Н-30: ассимилирование углеводородов приводит к изменению соотношения адениловых нуклеотидов" в клетке - количество АМФ Увеличивается; АТФ - уменьшается, АДФ.со- , держится в виде АДф-пр.

Суммируя вышеизложенное, следует отметить; что в нуклеотиднш - , фонде С* intermedia н-30 преобладают адениловые компоненты, за ниш ; следуют уридиловые я туааиловые, суща ственннх количеств цитидиловнх нуклеотидов не обнаружено* , ' •

Особенность» дрожжей, усваивающих парафин, является преобладание в нуклеотиднш материале яуклеозидмояофосфатов, которые составляют 35-41% от общего количества свободных рибовуклеотидов клетки, кукле-озкддифосфатн - 21-27Jt в ну клеоз идгрифосфаты - 1,3-2,8%. Дрожжи,асои-: милирурцие глюкозу, содержат больше'нуклеозяддифосфатов (за исклше-нием 6-чао культуры) - 17,8-38,8%, нуклвозкдмоно - и ну клеоз ид трйфос- ■ фаты составляют соответственно 15-29,5% в 3,4-3,3%.

Изучение нуклеотидов в дрожжах, ассимилирующих различные источники углерода, еще раз, в дополнение к имеющемся литературным данным, ' показало, что тончайшим показателем специфика обмена является качественный и количественный состав свободных рибовуклеотидов, пул которых отличается в клетках дрожжей сложностью и многообразием нуклеотад-про-взводшх* При замене обычного для дрожжей источника углерода - глюко-эы на пара$ин меняется набор нуклеотвдов и их производных в клетке.. ;

' Глава диссертации, посвящённая кислоторастворимым нуклеотцдам, содержит 7 рисунков, на которых представлены профили вдшии нуклеотид-ного материала,и 8 таблиц (^таблицы - в приложении).

3. ФОСФОРСОДЕРЖАЩИЕ ПОЛИМЕРЫ УГЛЕВОДНОЙ ПРИРОДЫ И ИХ ЛОКАЛИЗАЦИЯ В ДРОИЕВОЙ КЛЕТКЕ ■ ■ ■ ■'

Анализ фосфорных, соединений, экстра гируемнхНСІО^ при различной , температуре из клеток С. intermedia и Т. famata , показал наличие'; трудиогидролпзуемой фракции (Рстад) { табл.1),' которая составляет до л 10% общего фосфора клетки* Представляло интерес выяснить природу соединений, содержащих стабильный фосфор.

В настоящее время'известно, чтоыногие актяяомицеты, а" также все ■ грамположительные бактерия содержат фосфорсодержащие полимеры - тейхо-. евые кислоты, физиологическая роль которых связана с локализацией ка-.: тионов во внешних областях клетки. Это позволяло предположить;"что. данные полимеры распространены в природе белее широко. Броме того,' предварительный анализ материала, полученного при экстракции дрожжей ТЯГ о последующим осаждением спиртом, показал, что некоторое коли- , : чество стабильного фосфора связано с глицерином - полиолом, входящим .. в состав глицериятейхоевой кислоты*

При изучении этого полимера, било установлено, что часть фосфора стабильной фракции прочно связана не только с глицерином, но й манно-зой. Дальнейшие исследования дозволила установить, что изучаемые куль-, туры С. 1пгегтей1а я Т. £&ма1;а содержат еще один фосфорилирсван-ный полимер - фосфоманнан,' ранее не идентифицированный в этих организмах* Эти обстоятельства, а также увеличение количества стабильного фосфора в клетках, ассимилирующих углеводороды, побудило нас исследо- . ватьприроду соединений, содержащих стабильный фосфор.

Общепринятые методы экстракции подобвых .полимеров в данном случае были неприемлема, так как приводили к экстракции смеси соединений < полифосфатов, тейхоевой кислоты и фосфоманааиа) и частичному разрушению фосфоддэфирних связей фосфонаиаана. -

..-., Был разработан а применён метод дробной экстракции дрожжей ТЕГ, который в сочетании о гель-хроматографией на сефадекое Г-75 и элек- ^ трофорезом яа бумаге привёл к получению относительно чистых, препаратов тейхоевой кислоты и фосфоыаннака. В соответствующей главе диссертации описан метод дробной экстракции и приведен» качественная характеристика и профили алю^ши с геля полученных препаратов.

. Глицеряятейхоевая кислота. Изучение глицериятейхоевой кислоты -проводили в клетках С. ^егщесна Н-30, так как на териал , получен-

ныв из Т. £вшъь& Н-110,содержал незначительные количества этого полимера I

При кислотном гидролизе тейхоевой кислоты.идентифицированы глицерофосфат и дифосфат глицерина. Основными продуктами щелочного гидролиза были изомеры этих фосфорных эфиров глицерина,* что указывало на

наличке в исходном полимере фссфодиэ фарных связей и образование фос-

форяых эфиров через циклический фосфат. Обнаружение в гидролиэатах . двфосфата глицерина свидетельствовало о том, что основная цепь полимера состоит из глицериновых остатков, объединенных фосфодиэфирными связями.

Следовательно, обнаруженный полимер имеет структуру близкую к таковой глицеринтейхоевых кислот, хорошо изученных у ряда микроорганизмов, в которых глицериновые единицы объединяются.в полимер через фосфодиэфирные связи.

Вопрос о наличии в полимере сахарных компонентов, соединенных с глицерином гликоэидной связью, не решен. Обнаружение среди продуктов"' щелочного гидролиза только фосфорных эфиров глицерина указывало, на отсутствие или небольшое количество гликозилькых заместителей в полимере* Наличие в материале небольшого количества фосфоманнаяа ее дало возможности ответить на этот вопрос более определенно.

Таким образом, в клетках дрожжей С* шьегтеа1аобнаружена глице-ринтейхоевая кислота. Количественное содержание полимера может варьировать в зависимооти от источника углерода в среде, составляя 190^ /гр. сухих дрожжей, вщввеяяых на среде с глюкозой, и 300 у /гр сухих дрожжей. выращенных на среде о парафином.

Фосфоманнан* В очищенных препаратах фосфомаинана, полученных из дрожжей.С* Н-ОО И 1. Н-ИО. Сил.0 определено МОЛяр-

кое отношение мааноза: фосфор равное 5:1. При кислотном гидролизе по-

лимера идентифицированы маняоза, шннозофосфат в ортофосфат. С помощью периодатного окисления било установлено, что фосфорный эфир ман— яозы является мавяоэо-6-фосфатом.

Разрушение фосфодиэфирных связей при длительной экотра^сши фос-фомакнана ТХУ, а также при его слабомкпслотноы гидролизе (0,1 н НС1,: 20 мин, 100°) указывает на возможное присутствием атом полимере са- : " хар-1-фосфатных связей, так как известно, что фосфорные афцм.Сахаров,■-": у которых фосфорная кислота этерифицирует полуацетвлышй гидроксил . моносахарида, очень нестойки в вислой среде, ' V

Следовательно, можно предположить, что ыаннозные единицы объеди- V щдагся в полимер фосфодиэфирныш связями га счет гидроксалов при С^ и •' . С6 соседних маннозных единиц."В диссертации приводится предполагаемая; структура полимера.

Таким образом, установлено, что клетки дрожжей С. 1пЪегте<11а и Т. содержат фосфоманнан, имеющий 1,6-фосфодиэфврные связи.

' Дрожжи, ассимилирующие н-алка ны,содержат в 2-4 раза больше этого полимера.

Локализация фосфорсодержащих полимеров углеводной природы в_

... «летке. г"

Представляло интерес установить локализацию изучаемых полимеров в клетке в связи с выяснением их функциональной роли.

.Путем разрушения клеток дрожжей С.¡.а^гшеа1а Н-ЗО в дезинтеграторе со стеклянными шариками и дальнейшего дифференциального центрифу- ' гирования была получена клеточная обол си ка (клеточная стенка с элементами цитоплазматической мембраны) и клеточная стенка (после обработки оболочек дезоксихолатом натрия). Установлено, ^то фосфоманнан локализован в клеточной стенке. Тейхоеван кислота не обнаружена в исследуемых -

: препаратах клеточной оболочка, что является интересным' фактом всвя-зи о возможно новой, неизвестной функцией, которую вшолняет: этот, полимер в клетке дрожжей. В табл.6 приведено количественное содержание некоторых компонентов В оболочках и клеточной стенке дрожжей с; Intermedia н-ао. :v- . '

: . .' Таблица 6

Содержание некоторых компонентов в оболочках и ■ клеточной стенке С, Intermedia Н-30 ( %% от сухого веса препарата,)

Источник углерода в среде и препарат Формы фосфора Белок

робш рвк р орто ^ман

Парафин оболочка 0,76 0,13 0,11 0,07 0,45 16,35

Парафин клеточная стенка 0,75 _ 0,12 ___J i | ^ 1 0,63 4,42 . : ' ■ .1

х) Рфдил - фосфор фосфолшшдов, Ршн - фосфор фосфоыаннаиа.

" Материал этой главы иллюстрируется 7 рисунками, 2 схемами в 5 : таблицами.

Обобщая результаты, полученные в трёх Еаэделах работы, следует обсудить вопрос о тон, связаны ли между собой количественные изменения в содержании полифосфатов, нуклеотидов адениловой системы и фосфорсодержащих полимеров углеводной природы, идёт ли накопление и расходование каждого из них независимо друг от друга или возможна. корреляция между синтезом одних и распадом других соединений?

Здесь"уместно упомянуть работу немецких неследователей( Eigener и др. 1972), в которой обсуждается возможное участие полифосфатов в регулировании энергетического обмена клетки. Болнфосфаты рассьетри-'ваются как,основной пул фосфоре для системы АТФ/АДФ/РР^, который,при- . нимая на оебя избыток фосфора, гидролизу емого АТФ, может служить источником необходимого фосфвта. Так как сопряжение энергодающих и -энергопотреблтощах процессов в рлетке осуществляется соотношением аде-1 ниловых нуклеотидов, то аолифосфаты могут вырашивать колебания в их содержании, создавая благоприятные условия для роста клеток.

. Вполне возможно, что при усвоении парафина в клетке создаются именно такие условия, когда усиленно используется АТФ, и высвобождаю- -щийся фосфор аккумулируется в виде поляфэс фатов. В связи с этим необ- , ходило вспомнить, что окисление■ углеводородав нефти, по последним дан-" нш, идет через образование жирных кислот, которые затем подвергаются : расщеплению с освобождением:2С-фрагментов, поступающих в цикл трикар-бонсвых кислот в виде ацетил-s КоА. Однако пути образования' ацетил -/производных КоА неодинаковы у различный организмов (Мал ер я др.1970). : У дрожжей этот путь следующий: '

, RCOgH + АТФ' + HS КоА j. — - ВСО - s КоА + ШФ + РР1( тогда как у других микроорганизмов подобная реакция протекает с обра-, зованием АДф.

Таким образом, полученные результаты по количественному содержа- -нию полифосфатов и адениловых нуклеотидов в клетках дрожжей, усваивающих углеводороды, можно объяснить тем, что в процессе окисления н-алканов происходит активное использование АТФ, в результате чего накапливается АЫФ и шрофоофат, который аккумулируется в виде полифосфатов. ■ „ - ..

С другой стороны, трудно себе представить, что клетка, накапливая" " огромное количество полифосфвтов, которое составляет 50% общего фосфо-

- ре, держит их в качестве балласта я ве использует в других жизненно-важных обменных процессах. ' - .' ■ -'

По данным И.С.Кулаева и его сотрудников киолотонерастворимые, высокополимерные полифосфаты локализуется в поверхностных структурах клетки, в ее периппазматической области. В этой же области расположены и полифосфатазы, гядролизующие эти соединеаиа. Возможно, кислотонерастворимые поляфосфатн, накапливаясь в клетках дрожжей парафинаво- " го варианта,могут принимать участие в транспорте углеводородных молекул или продуктов их первичного окисления через - цитошшзматнческуп мембрану, являясь поставвдкш энергии или фосфора в этих процессах, аналогично участию полифосфатов в транспорте глюкозы ( таи stevenlnc -и др. 1963,1964).

В настоящее время известно, что одной из функций фосфорсодержащих полимеров, расположенных ва периферии клетки, является, связывание двухвалентных катионов, необходимых для осуществления многих физиологически важных процессов* Показано, что дня актива о! работы полифос-фатаз необходимо присутствие ионов металлов {Кулаев и др. 1972),кроме того, интенсивные ферментативные процессы, связанные о преобразованием . молекулы углеводорода, могут также нуждаться в повшенном содержаний ионов двухвалентных металлов. Поэтому возможно, что увеличение количества фосфорсодержащих полимеров (высокомолекулярных пшшфосфвтов в фосфоианнана), локализованных во внешних областях клеток,-объясняется высокими потребностями в катионах металлов дрожжей, ассимилирующих н-алханы. ~

Итак, проведённое изучение некоторых фосфорных соединений дрожжевых культур* усваивающих н-елханы, в сравнении с.теми же культурами, ./ усваивающими глукозу, показало, что ассимилирование углеводородов

дрожжами приводит-к значительна!; изменениям их'фосфорного обмена,-ko-v-торые1 выражаются в усиленном синтеза полифосфатов,-изменении количественного соотношения нуклеотидов адениловой системы и содержания дру- ' гих нуклеотядов и ну клеотид-коферментов, в повьиения количества фос- -. форсодержащих полимеров углеводной природы - тейхоевой кислоты и фос- ? фоманкава; локализованного в клеточной стенке*

} ■:: :.■ ■' . " выводы ¿у;;..':; J

1. В дрожжах С* intermedia Н-30 обнаружена тейхоевая кислота. Полимер состоит из глицериновых единиц, объединённых фосфодиэ^ирными. ( связями. В о "сличив от тейхоевой кислоты бактерий и актиномицетов, полимер в дрожжевой клетке представлен ® существенно меньшем количестве и локализован не в клеточной стеаде.

2. В клетках дрожжей С. intermedia н_зо и Т. femata Д-110 кдентифи- ' ' - цировая фэсфсыанная с малярным отношением манноза: фос фор-5:1. Ман-

нозные единицы объединяются в полимер 1,6-фоофодиэфирншщ связями.- " :; —¿Установлено, что фосфоманнан локализован в С. intermedia Н-30 - ~ ; в клеточной стенке, -

3. фосфорный обмен дрожжей существенно меняется в зависимости от источ-. пика углерода в ереде. Показано, что ассимиляция углеводородов прл-

'■-;.. водит к увеличение количества фосфорсодержащих полимеров венуклеи-

новей природы и изменению качественного и количественного соотноше-. У ния отдельных компонентов в нуклеотидаом пуле клетки по сравнении -■ о дрожжами, у сваи заводил глюкозу* При этой общее количество свобод-. ' ных нуклеотидов в дрожжах, ассимилирующих различные источники угле-L ~ рода,, одинаково в культурах, соответствующих друг другу по стадии / ' ■■ развитая. ■ - У, ' " .■ • ' -

.а. Дрожжи С. intermedia Н-ЗО И Г* fomata Н-110 При ассимилировании -. углеводородов увеличивают синтез конденсированных неорганических

■ фосфатов. Повшение количественного содержания полифосфатов происходит как за счёт кяслото{встворшой, так и, в основном, кае-л отонера створиной фракций полифосфат се.

б.Пул нуклеотидов в клетках С. intermedia Н-30, вырезанных на сре- -де с парафином, характеризуется преобладанием нуклеозидмонофос-фатов над'нуклеозидди- и нуклеоэидтрифосфатами. В парафиновом и глюкозноы выржнтах культуры аден иловые нуклеогады и их производные составляют около половины нуклеотидного фонда клетки -3S-46J6

и 30—49 JE соответственно, уридиловые компоненты - 22-30% и 12-3 ' гу а лиловые компоненты - 2-3% и 2-5,8$, существенных количеств щ-. тидиловых нуклеотидов не обнаружено,. Среди нуклеотидов аденаловой системы преобладает АМф; АДФ и АТФ в глюкозном варианте'культуры ' * содержатся, примерно, в равных количествах, в парафиновом варианте АТФ обнаружен в незначительных количествах, АДФ - в следовых, АДФ идентифицирован в виде АДФ-пр, которые занишютпо колячест-. венному содержанию первое место среди других нуклеотид-кофермен- , тов.'

в.Количество фосфорсодержащих полимеров углеводной природы - тейхое-бой кислоты и фосфоманнана увеличивается при замене источника уг-" лерода в среде с глюкозы на парафин. . ' .

ОСНОВНЫЕ МАТЕРИАЛЫ ДИССЫТАЦИИ 0ПУБШ10ВАЯИ В СВДУГВДХ СТАТЬЯХ

Наумова И.Б., Стрешинская Г.М., Гололобов Д.Д.» 1968. Фосфорсодержащие полимеры венуклеивовой природа некоторых видов дрожжей,взращенных на разных средах. Полифосфаты. ДАН СССР,Щ,2,465. Стрешинская Г.М., Наумова И.Б., Гололобов А.Д., 1969, Содержание полифосфатов в некоторых видах дрожжей, выращенных на различных источниках углерода* II Всесоюзный Биохимический съезд, секция 20, тезв-сы докладов, 149.

«Ä .

'V у- ,>:'' ' -. Д; v';; ■ С'. "'- ■• W,'. -' ^V- h, i л ir 'ч' —"Tí"- u1

-' T^'V-"'- ^ :"~'y: " .''¿''■'¿i'''." - ■■ i" : '' w

Ji. ^Стрепшнокая; Г.м í;: Hay мова * И; Б. 7 Гололобов-А .Д 1569; Фосфорсодер-^

: - — •;"-*адие"полимеры ненуклёиновой природа некоторых видов дрожжей,' вы- ' ' -.,7. ращенных на различных ^источниках. углфода.. Микробиологический -син- ^

¿"'г-

Л • * Стреишнская'Г.М Г,; Наумова И .Б.Гололобов А. Д;1970.' Политое уЗ

~6. Стрешинская Г.М., Наумова И.Б.,,Гололобов А.Д.,. 1972. Синтез фос- '/ ; форсодеркавдх полимеров ненуклёиновой1 прироцн, некоторый« видами , ■'. \ ^:i-í-ri' дровжеа;'.ввраивнннх..на- углеводородах. ..Непрерывное и;дериодг!есжое:-;.1\£г í.'ir ^ ; Í-'культивирование микроорганизмов • 173 . ^ - л V-; ^ / ' í ; Г I.

fií.-íb-- 7. Стреашнская Г.М.»Наумова И.Б.,-Гололобов 'А.Д.;1973. Свободние-- V.' ; ' -■ г*-^; ■ куклеотиды дрожхей рода Candida ;',"^ усваиюшщх'различные" источал-: ;

'ки - уг лер ода ."i Биохихая,';' 38/. 1.9Z* : vi ' ''í-iл " ^

v:T 8. Наумова И.Б.-Стрешикская Г.М., 1973Í Тейхоевая'кислота в дрокжах" "• . Г ; ';•• - рода Candida-;ГДАН СССР,".¿¿Л 3.720.'- ; :-V: г.... " . a'r:.Г;: г > .: -.9Г Стрешинсмя Г.М.,,Наумова И.Б.," 1973. Локализация фосфоманнаиа в;' .4 ' j клетке Cafldida^í^tertriedieНЧЗО, ДАН СССР» 212 i',3 ,• ■■ .-л //Лс

-10.■ StresíiirislcayaíG.M.Ví Naumova i;В. ,Yl973•'Polypüosphat'éв and núcleo- ' . '

ttide pool -lü\GanüidaÍln-fceMiedle..H-30:grown*on;different.сагЪоплхл'- -:J ;

J- 'r-^soareéaii'JiDiterní" ер ее ial lí ed-ÜS утрon-Yea^ts,;HelBVÍÍLki*,Proe.A'batr '¡.--^ i "i 52; : '.-:..rr:- <

r 11« KaumoVa I.B.'i Streshinsiaya'ff.M.,1973; Detection.of the glicerol'.'

.. ;telchoic ^aotd' lit_L' some ¿species; of-yeast^r¿ani¡3BSv TdzW-Z"/;

" _ 'specialized Sycp.-'on Yeasts', Helislnlcl, , T': t ""

стрешинскея" Г.М;, Наумове И.Бионн'оэофосфотный полимер в.клетках V. ;;л

; V^^Sr^ J- CawUd*, Н-30 ,И iTonAlopele í ^H-110." Би15»11!Йя '(¿ neí

-"T-V—¿¿Zy'^^Z^J'v i ''^-^'-^■r-:V <;í'V-Tr

: " ПОДП.'к ПЕЧАТИ ' 23/X1-73 ФОРМАТ "вОк вО / IS^^.V-^Oii

ФИ3.ПЛ.;I ,В. У4rЙЗЯ JT. 1.0/ 3AKA3 231^

r » "