Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Неорганические полифосфаты и фосфат-аккумулирующий потенциал дрожжей

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Неорганические полифосфаты и фосфат-аккумулирующий потенциал дрожжей"

На правах рукописи —•

Бреус Наталья Александровна

НЕОРГАНИЧЕСКИЕ ПОЛИФОСФАТЫ И ФОСФАТ-АККУМУЛИРУЮЩИЙ ПОТЕНЦИАЛ ДРОЖЖЕЙ

03.01.04 Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2013

005058592

Работа выполнена в лаборатории регуляции биохимических процессов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино

Научный руководитель: доктор биологических наук

Кулаковская Татьяна Валентиновпа

Официальные оппоненты: Калебина Татьяна Сергеевна

доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, ведущий научный сотрудник

Арипбасарова Анна Юрьевна

кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, старший научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится «28» марта 2013 г. в 10 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, Проспект Науки, д.5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино. Автореферат размещен на официальном сайте Высшей аттестационной комиссии при Министерстве образования и науки Российской Федерации vak.ed.gov.ru и на сайте Института www.ibpm.ru.

Автореферат разослан «<?"£» 2013 г.

Ученый секретарь . у

Диссертационного совета, ^ /¡т-—

кандидат биологических наук Н.В. Васильева

Актуальность проблемы

Фосфор является жизненно необходимым элементом всех живых организмов, входя в состав важнейших органических соединений, в том числе нуклеиновых кислот, АТФ и других нуклеозидфосфатов, фосфолипидон, фосфорилированных белков, углеводов. Недостаточное количество этого элемента в среде обитания является неблагоприятным фактором, лимитирующим рост и развитие, а его отсутствие приводит к гибели организмов. В связи с этим важной стратегией выживания в изменяющихся условиях среды для организмов, является накопление резервов фосфорных соединений. Эти соединения отличаются разнообразием. Это могут быть органические фосфорные соединения, такие как фитин (Ca-Mg-соль инозитолфосфата) высших растений (Rasmussen et al., 2010; Gibson et al., 2010), фосфоманнан некоторых видов дрожжей (Hansenula capsulata) (Avigad and Kaiina, 1979), тейхойевые кислоты клеточной стенки бактерий (Grant, 1979). Живые организмы, находящиеся на всех ступенях эволюции, от архей и бактерий до человека, содержат неорганические соединения фосфора: ортофосфат (Р.), пирофосфат (РР,) и неорганические полифосфаты (полиР). Р| и пирофосфат являются субстратами и продуктами многих ферментативных реакций, поэтому необходимо поддержание их внутриклеточной концентрации на относительно постоянном уровне. Концентрация пирофосфата у большинства организмов поддерживается на невысоком уровне за счет высокой активности пирофосфатаз (Baykov et al., 1999). У некоторых микроорганизмов пирофосфат участвует в энергетическом обмене наряду с АТФ или даже в большей степени, чем АТФ (Baltscheffsky 1967; Baltscheffsky et al., 1966, 1992; Khmelenina et al., 2011).

Постоянство концентрации P; в цитоплазме достигается за счет его накопления и резервирования в виде осмотически инертных соединений и компартментации в клетке. У некоторых бактерий обнаружены внутриклеточные включения, содержащие малорастворимые фосфаты магния и кальция, а также внеклеточные малорастворимые фосфаты, связанные с клеточной стенкой (Smirnov et al., 2005; Рязанова и др., 2007; Герасименко и

1

др., 1999). В организме позвоночных значительное количество нерастворимого фосфата кальция (апатита) входит в состав костной ткани, где он выполняет структурную роль (Оте1оп е/ а!., 2009).

Большинство микроорганизмов накапливают Р; в виде высокомолекулярных полифосфатов (полиР), линейных полимеров ортофосфата, соединенных богатыми энергией фосфоангидридными связями (Ки1аеу, 1979, Кулаев и др., 2005, КогпЬе^ е/ а!., 1999). Недавно показано, что и в костной ткани содержится относительно много полиР, которые непосредственно вовлечены в процесс образования апатита (Оте1оп е1 а1., 2009).

Исследование биоразнообразия фосфорных минеральных соединений и способности микроорганизмов разных таксонов к поглощению Р; из среды представляет собой актуальную задачу, важную для понимания функций этих соединений в клетках и участия микроорганизмов в круговороте фосфорных соединений в природе. Кроме того, микроорганизмы эффективны в качестве модели для изучения стратегии образования фосфорных минеральных соединений в других живых организмах.

Актуальность изучения образования фосфорных минеральных соединений у дрожжей связана с проблемой приспособления этих микроорганизмов к избытку и недостатку фосфатов в среде, а также их участия в круговороте фосфора. Актуальность этой проблемы возросла в связи с загрязнением окружающей среды техногенными фосфатами. Потенциал различных видов дрожжей в качестве фосфат-аккумулирующих организмов малоисследован в отличие от бактерий. Кроме 5. се/-еу/'.?;ае, только для трех видов аскомицетных дрожжей, выделенных из сточных вод с высоким содержанием фосфатов, продемонстрирована способность к поглощению значительного количества Р, из среды (МсОгаШ апс1 С>шпп, 2000; '\Уа1апаЬе е1 а!., 2008). Дрожжи, как эукариотические микроорганизмы, представляют собой базовую модель для получения новых знаний об обмене фосфорных минеральных соединений у эукариот.

Цели и задачи исследования

Целью работы была оценка фосфат-аккумулирующего потенциала дрожжей, относящихся к различным таксонам, а также изучение особенностей метаболизма неорганических полиР в клетках видов, наиболее эффективно накапливающих Р,.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Оценить способность представителей аскомицетных и базидиомицетных дрожжей поглощать Р| из среды в неростовых условиях и выявить среди них виды, обладающие наибольшим фосфат-аккумулирующим потенциалом.

2. Определить условия максимального поглощения Р; из среды клетками представителей аскомицетных и базидиомицетных дрожжей.

3. Определить содержание и химический состав резервных неорганических фосфорных соединений у БассИаготусез сеге\>Ыае и Сгур1ососсш кштсо1а.

4. Выявить особенности локализации полиР в клетках дрожжей £ сегеу/5/ае и О. Иитко1а при поглощении Р| из среды.

5. Изучить влияние М§2+ на поглощение накопление и длину цепи полиР у Х сегеушае и Сг. Иштсокг.

6. Выявить различия в накоплении минеральных фосфорных резервов клетками представителей аскомицетных и базидиомицетных дрожжей.

Стратегия: Изучение поглощения Р; клетками дрожжей проводили в модельных условиях, позволяющих оценить необходимость отдельных компонентов среды для этого процесса. Для определения качественного и количественного состава фосфорных резервов использовали комплексный подход, включающий химический анализ минеральных фосфорных соединений, прижизненную окраску клеток специфическим флуоресцентным красителем на полифосфаты и методы электронной микроскопии.

Научная новизна работы

Впервые представители пяти видов базидиомицетных дрожжей и трех видов аскомицетных дрожжей протестированы на способность к поглощению Р; па минимальных средах. Обнаружено, что для исследованной выборки дрожжей способность к поглощению Р; не связана с их принадлежностью к аекомицетам или базидиомицетам. Показано, что наибольшим потенциалом по поглощению Р1 из среды обладают аскомицеты 5. сегеуи/яе и базидиомицеты О. 1шгтсо1а. Выявлены условия, обеспечивающие проявление высокой способности к аккумуляции Р| из среды у 5. сеге\>131ае и Сг. Иит1со!а: клетки обоих видов дрожжей поглощают около 80% Р; (при концентрации 5 мМ) в минимальной среде, содержащей только глюкозу и сульфат магния. Поглощенный Р, накапливается в клетках 5. сегеУ1$1ае и Сг. Рштко1а преимущественно в виде полиР. Установлена существенная роль ионов магния в накоплении минеральных фосфорных резервов у дрожжей: уровень полифосфатов и средняя длина их цепи в клетках 5. сегеум/'ае и Сг. Ыт'1со1а возрастали более чем вдвое в присутствии этих ионов. Впервые обнаружены изменения в структуре и локализации этих полимеров при их накоплении в неблагоприятных условиях, связанных с отсутствием источника азота, особенно выраженные в присутствии катионов магния: увеличение степени полимерности полиР, появление множества полиР - содержащих включений в различных компартментах клеток, в первую очередь в цитоплазме. На примере £ сегс\<'тае и Сг. Иштсо1а показано, что структура и локализация полиР существенно различаются у неродственных видов в одних и тех же условиях.

Научно-практическая ценность работы

Даная работа относится к разряду фундаментальных исследований: полученные экспериментальные данные расширяют представления о фосфорном метаболизме эукариотической микробной клетки. Модельная система, разработанная для дрожжей, может быть использована для определения Ргпоглощающего потенциала различных микроорганизмов. Выявлены виды дрожжей, не уступающие по эффективности поглощения Р, известным в этом отношении бактериям из сточных вод. Дрожжи 51. сепзушяе и

4

Сг. ИитюоШ представляют собой перспективные модельные микроорганизмы для изучения процессов фосфорной биоминерализации.

Апробация работы и публикации

Результаты работы были представлены на ряде конференций: иа 13°" конференции молодых ученых «Биология - наука 21го века» (Пущино, 2009), 2ом Междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2010) и Международной конференции «Окружающая среда и человек: друзья или враги?» (Пущино, 2011). По материалам диссертации опубликованы 3 статьи в журналах, входящих в список, рекомендованный ВАК.

Положения, выносимые на защиту

1. Среди дрожжей, относящихся к разным систематическим группам, имеются виды, поглощающие неорганический фосфат из среды с эффективностью, сравнимой с таковой у наилучших фосфат-аккумулирующих бактерий, выделенных из стоков, загрязненных фосфатами. Эта способность обнаружена у дрожжей, относящихся к различным таксонам: наилучшим фосфат-аккумулирующим потенциалом среди проверенных видов обладают аскомицетные дрожжи Л", сегех'и'ше и базидиомицетные Сг. Ъштсо1а.

2. Максимальное поглощение фосфата клетками & сеге\>'тае и Сг. Иитко1а наблюдается в среде, лимитированной по азоту, и стимулируется ионами магния. Модельные условия на основе лимитированных сред позволяют оценивать потенциал поглощения фосфата микроорганизмами.

3. При избытке фосфата, достаточном количестве глюкозы в качестве источника углерода, и присутствии ионов магния происходит биоминерализация клеток дрожжей 5. сегеушае и Сг. китко1а. Она выражается в накоплении преимущественно длинноцепочечных полифосфатов в виде цитоплазматических включений.

Личный вклад

Экспериментальная работа проведена лично Н.А. Бреус. Электронная микроскопия проводилась совместно с к.б.н. Н.Е. Сузиной (ИБФМ РАН). Конфокальная микроскопия проводилась в сотрудничестве с В.А. Яшиным (ИБК РАН). Микрорентгеновский анализ проводился совместно с В.В.

5

Сорокиным (ИНМИ РАН). Флуоресцентная микроскопия проводилась совместно с к.б.н. В.В. Дмитриевым (ИБФМ РАН).

Структура работы

Диссертация состоит из разделов "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и их обсуждение", "Выводы", "Список литературы". Материалы диссертации изложены на 123 страницах машинописного текста, включают 19 рисунков и 13 таблиц, список литературы включает 201 наименование.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В данной работе были использованы следующие виды дрожжей: Cryptococcus terreas ВКМ Y-2253, Cryptococcus terrícola ВКМ Y-1598, Cryptococcus curvatus ВКМ Y-2236, Cryptococcus (Asterotremella) humicola 9-6, Pseudozyma fuslformata BKM Y- 2821; S. cerevisiae BKM Y-1173, Hansenuta fabianii BKM Y-1450 и Kuraishia capsulata BKM Y-2514. Все виды дрожжей были предоставлены Всероссийской коллекцией микроорганизмов (ВКМ). Дрожжи S. cerevisiae культивировали на качалке (120 об/мин) при 29°С в течение 20 часов в 200 мл среды Ридер, содержащей (г/л): (NH4)2S04 - 3,0; MgS04 х 7Н20 - 0,7; Ca(N03)2 - 0,4; дрожжевой экстракт - 2,0; глюкозу - 20,0; КН2Р04 - 2,0; К2НР04 - 0,2. Фосфат-лимитированная среда Ридер не содержала КН2Р04 и К2НР04. Cr. terreus ВКМ Y-2253, Cr. curvatus BKM Y-2236, K. capsulata BKM Y-2514, H. fabianii BKM Y-1450 и Ps. fusiformata BKM Y- 2821 культивировали на качалке (120 об/мин) при 29°С в течение 48 часов, или 65 часов (Cr. terreus, Н. fabianii) в 200 мл среды, содержащей (г/л): глюкозу - 10,0; пептон - 5,0; дрожжевой экстракт - 4,0. Cr. humicola 9-6 культивировали при 29°С (120 об/мин) в течение 36 часов в 200 мл среды, содержащей (г/л): глюкозу - 10,0; дрожжевой экстракт - 0,5; (NH4)2S04 - 1; MgS04 -7Н20 - 0,05. Cr. terrícola VKM Y-1598 культивировали при 24°C (150 об/мин) в течение 96 часов в 200 мл среды, содержащей (г/л): глюкозу - 10,0; пептон - 5,0; дрожжевой экстракт - 4,0.

Опыты по поглощению Р, из среды проводили в модельных условиях, разработанных ранее (Рязанова и др., 2007; Яуагапоуа с/ а/., 2009) для исследования фосфат-поглотительной способности бактерий. Для опытов использовали клетки, выращенные до стационарной фазы в присутствии 1 мМ Pi и содержащие незначительное количество полиР.

Клетки инкубировали при 29°С в 25 мл среды при 120 об/мин. Время инкубирования, состав и концентрации компонентов в средах указаны в подписях к таблицам и рисункам.

Экстракцию полиР из клеток проводили по известному методу (Вагабов и др., 2000) и получали пять фракций: кислоторастворимую полиР 1 (экстрагировали при 0°С 0,5 н НСЮ4), солерастворимую полиР2 (экстрагировали при 0°С насыщенным раствором К'аСЮ4), две щелочерастворимые фракции полиРЗ и полиР4 (экстрагировали при 0°С раствором ИаОН рН 9,0-10,0 и 0,05 н ЫаОН рН 12,0 соответственно), и фракцию полиР5, которую экстрагировали горячей хлорной кислотой для количественного анализа по высвобождающемуся Р; и с помощью НгО при 0°С в течение 12 ч для качественного анализа длины цепи (с помощью электрофореза).

Определение длины цепи полиР проводили с помощью электрофореза в 30% ПААГ, приготовленном на 200 мМ Тпз-боратном буфере, рН 8,3, с 7 М мочевиной. Пластину окрашивали толуидиновым голубым (КишЫе апс! КогпЬе^, 1995). Предварительно полиР в полученных фракциях концентрировали осаждением насыщенным раствором Ва(М03)2 и переводили в растворимую форму с помощью катионообменной смолы Ооууех 50 \УХ 8 в МН4+ форме.

Содержание Р, определяли колориметрически известным методом с образованием фосфомолибденового комплекса и восстановлением его аскорбиновой кислотой (Кулаковская и др., 1999).

Содержание глюкозы в среде инкубирования определяли спектрофотометрически с помощью глюкозооксидазного метода.

Белок определяли по модифицированному методу Лоури (Bensadoun and Weinstein, 1976). Содержание Mg2+ в пробах определяли с помощью атомно-абсорбционного спектрофотометра АА 240FS и АА 240Z (Varían, USA). Для подготовки проб к ним добавляли 57% НС104 в соотношении 1:1, и проводили озоление при 150°С.

Для получения гомогенатов отмытые клетки разрушали экструзией при высоком давлении с помощью ИБФМ-пресса. Экзополифосфатазную активность определяли в гомогенате клеток по скорости образования P¡ при 30°С в течение 30 мин в 1 мл реакционной смеси, содержавшей 2,5 мМ MgS04, 1 мМ полиРш (концентрация выражена в количестве P¡ образующемуся после 10 мин гидролиза полиР в 1 н HCl при 100°С) и 50 мМ Tris-HCl, pH 7,2. Образовавшийся в ходе реакции P¡ определяли как описано выше.

Ультратонкие срезы дрожжей готовили по методу Рейнольдса (Reynolds, 1963) и просматривали с помощью электронного микроскопа JEM-100B (JEOL, Japan). Срезы без дополнительной обработки использовали для рентгеновского микроанализа.

Для выявления полиР in vivo использовали окрашивание ДАПИ (4',6-диамидино-2-фенилиндол) («Sigma», США) и флуоресцентную микроскопию. Максимум флуоресценции ДАПИ 456 нм. ДНК значительно увеличивает флуоресценцию ДАПИ при этой длине волны. ПолиР изменяют максимум флуоресценции на 525 нм. Комплекс ДАПИ-ДНК флуоресцирует голубым, а ДАПИ-полиР - желтым или оранжевым цветом. Клеточную суспензию в PBS -буфере (pH 7,4) инкубировали с 10 мкг/мл DAPI (Sigma, USA) 30 мин при 30°С, клетки собирали центрифугированием, ресуспендировали в PBS-буфере, и анализировали с помощью фазово-контрастного и люминисцентного микроскопа АХЮ Imager Al (Germany).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Сравнение способности дрожжей различных видов к поглощению избытка Р; из среды

Поскольку минеральные фосфорные соединения в процессе роста микробных культур расходуются на биосинтез, для разработки модели резервирования Р; клетками дрожжей были использованы условия лимитирования роста. При разработке экспериментальной модели на основе условий, разработанных ранее для бактерий (Рязанова и др., 2007), использовали аскомицетные дрожжи 5. сегеуШаг, наиболее изученные в отношении фосфорного обмена. Было установлено, что клетки этих дрожжей способны поглощать до 40% Р, из среды, содержащей только 5 мМ К2НРО4 и глюкозу. Добавление 5 мМ К^БС^ приводило к увеличению поглощения до 80%. Данные условия были выбраны в качестве модельных для изучения способности поглощать избыток Р, из среды несколькими видами дрожжей, относящимися к двум крупным систематическим группам: аскомицетам и базидиомицетам (табл. 1).

Как среди аскомицетных, так и среди базидиомицетных дрожжей выявлены виды, обладающие высокой способностью к поглощению Р, (табл. 1). Среди исследованных видов лучше всего поглощали Р, Сг. }шт\со\а и 5'. сеге\''тае, филогенетически далекие друг от друга. Среди представителей базидиомицетов выявлены Сг. (еггеия, совсем не поглощающие Р,, и Сг. Иитко1а, поглощающие его почти полностью при концентрации 5 мМ. Дрожжи Ря. /и.ч1/огта!а также относящиеся к базидиомицетам, поглощали Р, вдвое хуже, чем Сг. Иит1со1а. Представители аскомицетов также различались по способности поглощать Р,. Для всех исследованных видов обнаружено стимулирующее влияние М§2+ на поглощение Р„ но степень этой стимуляции была неодинакова.

Таблица 1. Поглощение Р; клетками различных видов дрожжей и влияние на этот процесс. Среда содержала 30 мМ глюкозу, 5 мМ К2НРО4, и 5 мМ К^8С>4 (+Мё2+), время инкубации 5 ч

Вид дрожжей Среда инкубации Поглощение Р, из среды, % от исходного количества

Phylum: Basidiomycota Cryptococcus terreus BKM Y-2253 0±0.17

5.7±1.2

Cryptococcus terrícola BKM Y-1598 -мг 0±0.5

5.7±0.б

Cryptococcus curvatus BKM Y-2236 6.0±1.6

+ Мё/+ 44.6±1.0

Cryptococcus humicola 9-6 -мг 36.0±2.0

+ Мё2+ 75.0±10.2

Pseudozyma fusiformata BKM Y- 2821 -мГ 29.8±1.4

41.4±1.0

Phylum: Ascomycota Saccharomyces cerevisiae BKM Y-l 173 -мг 44.0±4.1

84.0±2.1

Hansenula fabianii BKM Y-1450 4.5±0.5

23.2±1.0

Kuraishia capsulata BKM Y-2514 -мг 19.5±1.4

45.0±0.3

Для дальнейших исследований поглощения и резервирования Р, были выбраны аскомицетные дрожжи £ сегегише и базидиомицетные Сг. Иит'1со1а.

2. Поглощение Р; клетками 5. сегех'тае и Сг. Иит'юоШ в средах минимального состава

Потенциал поглощения Pi клетками двух выбранных видов дрожжей оценивали в неростовых условиях в модельных лимитированных средах различного состава (табл. 2). Сравнение полученных данных для двух видов дрожжей и литературных данных, полученных для бактерий, показало, что для эффективного поглощения Р, из среды, разным микроорганизмам нужны

10

разные минимальные среды. При отсутствии источника углерода (глюкозы) в среде инкубирования клетки Я. сегеу/х/ае не поглощали IV Этим они отличаются от изученных ранее бактерий Вгег1Ьас1егшт са$е1 (Рязанова и др., 2007), у которых глюкоза не стимулирует поглощение Р|, и Асе1оЬас1ег хуНпит (Яуагапоуа е! а/., 2009), которые могут поглощать Р, из среды, как в отсутствии, так и в присутствии глюкозы (табл. 2). Сг. Иитко1а, также как и сегеуи^ае, эффективно поглощали Р; в присутствии глюкозы. Однако эти дрожжи могли поглощать Р, даже при отсутствии глюкозы в среде (табл. 2). Предположительно, такое поглощение происходит за счет внутренних резервов Сг. Нит'юоЬ. Стимулирующее влияние глюкозы на поглощение Р| дрожжами очевидно связано с тем, что процесс транспорта Р; внутрь клетки является энергозависимым (Регяяоп е/ а!., 2003).

Таблица 2. Поглощение Р; из среды (% от исходного количества) клетками В. са$е1, А. хуНпит, Б. сегеу'ише и Сг. Иит1со1а. Во всех вариантах среда содержала КН2Р04 (5 мМ). К ней добавляли глюкозу (30 мМ), N^04 (5 мМ) и смесь аминокислот (5 г/л) в различных вариациях. Время инкубации для бактерий -15 часов, для дрожжей - 20 часов

Состав среды Микроорганизм

5. селеушае Сг. кит\со1а В. сазе1 (Рязанова и др., 2007) А. хуНпит (Рязанова и др., 2009)

N^04 0 45 0 0

глюкоза 44 36 4 3

Мё304, глюкоза 84 75 4 50

N^04, смесь аминокислот 13 55 95 86

Наличие в среде источника азота в виде смеси аминокислот не приводило к значительному поглощению I', клетками 5. сеге\Ыае, в отличие от бактерий В. сазе1 и А хуИпит, которые в аналогичных условиях поглощали до 90% Р, из среды (Рязанова и др., 2007, Яуа2апоуа ег а/., 2009). При инкубировании клеток Сг. 1шписо1а в присутствии смеси аминокислот и ионов магния поглощение Р; было почти таким же, как в присутствии только ионов магния (табл. 2).

Наличие в среде инкубирования не является необходимым условием для поглощения Р, клетками cerevisiae и Сг. Иит1со1а, однако присутствие этого катиона увеличивает поглощение в 2 раза (табл. 2). В этом состоит еще одно отличие дрожжей от бактерий, где без М§2+ значительного поглощения Р, не происходит (Рязанова и др., 2007, Иуагапоуа е/ а1., 2009). Таким образом, наилучшей средой для поглощения Р; дрожжами является среда, содержащая глюкозу и М^* (табл. 2). Минимальная модельная среда для поглощения Р| клетками cerevisiae и Сг. Ытко1а должна содержать глюкозу, а добавление к этой среде увеличивает это поглощение в 2 раза.

Использованная нами модель, в которой рост подавляется отсутствием источника азота, является подходящей для оценки фосфат-поглощающего потенциала микроорганизмов, особенно с учетом того, что ростовые условия для различных видов неодинаковы.

В выбранных модельных условиях была изучена динамика поглощения Р, и ионов К^2+, а также потребления глюкозы клетками дрожжей 5. сеге\'таг и Сг. 1итйсо1а (рис. 1). Рост был подавлен отсутствием источников азота в среде: за время эксперимента прирост биомассы был незначительным, а оптическая плотность суспензии клеток не изменялась (рис.1, А, Б). Поглощение Р( из среды сопровождалось потреблением глюкозы. Это согласуется с энергозависимостью транспорта Р| через цитоплазматическую мембрану (РегеБоп е/ а!., 2003). Клетки 5. сегтиае за 5 часов эксперимента полностью потребляли глюкозу, причем в присутствии М|>?+ потребление происходило быстрее. Сг. Иитко1а потребляли глюкозу гораздо медленнее, использовав за 5 ч ~ 26% и 9% глюкозы в присутствии и отсутствии ионов М§2+, соответственно. Разница в потреблении глюкозы в присутствии и отсутствии ионов М§2+ может

12

быть связана с тем, что ферменты гликолиза нуждаются в этих ионах (Garfinkel and Garfinkel, 1985).

Время инкубнровашш (ч) Время инкубировании (ч)

Рисунок 1. Динамика поглощения Р;, и потребления глюкозы клетками 5. сегеушяе ВКМ У-1173 (А, В) и Сг. Иитко1а 9-6 (Б, Г) в иеростовых условиях. Среда содержала 30 мМ глюкозы и 5 мМ КН2РО4 (Д, □); 30 мМ глюкозы, 5 мМ КН2Р04 и 5 мМ N^04 (А, ■, ♦). Оптическая плотность - (о) и (•); Р| - (А) и (А); глюкоза (□) и (■); (♦).

Более медленное потребление глюкозы клетками Сг. 1штко1а, видимо, связано с меньшей скоростью метаболизма у этого вида. В средах, использованных нами для выращивания биомассы, стационарная фаза роста у 5. сегеу'тае достигалась за 14 часов, а у Сг. Ииписо/а — за 26 ч. Однако, потребленного количества глюкозы было достаточно для поглощения такого же количества Р>, как и у селеу«/ае (рис. 1).

Основываясь на данных о потреблении глюкозы и поглощении Р;, мы произвели расчет количества АТФ и полиР, которые могут образоваться за счет энергии, полученной в процессе гликолиза. Клетки Сг. Иит1со1а за 5 часов потребляют примерно 3 ммоль глюкозы/г сухой биомассы. Из такого количества глюкозы в процессе гликолиза может быть получено 6 ммоль АТФ/г сухой биомассы. С г. кипйсо1а накапливают 1,2 ммоль Р/г сухой биомассы в виде полиР. Энергия фосфоангидридной связи в АТФ приблизительно равна энергии связи в полиР (Ки1аеу е( а1, 2004). На перенос одного иона Р; через цитоплазматическую мембрану вероятно тратится одна молекула АТФ, и еще одна молекула АТФ тратится на удлинение цепи полиР в процессе синтеза. Таким образом, на транспорт Р| и образование полиР у Сг. ИиткоШ должно быть затрачено примерно 2,4 ммоль АТФ (или примерно 40% энергии полученной в процессе гликолиза из потребленной глюкозы). Такой же расчет для Б. сеге\п!1ае показывает, что у этих дрожжей всего 8% энергии, полученной в результате гликолиза, должно расходоваться на транспорт Р, и синтез полиР.

Клетки Сг. 1шт'1со1а поглощали в присутствии 5 мМ 40% Р, даже без глюкозы (табл. 2). Клетки се№1$1ае в отсутствии глюкозы не поглощали Р;. По-видимому, клеткам С.г. Иит1Со1а для такого уровня поглощения Р| было достаточно внутренних резервов энергии.

Клетки обоих видов дрожжей также поглощали ионы хотя не в

эквивалентном соотношении с Р^ Клетки 5. сегеу/^/ае поглощали 2,1 ммоль Р/г сухой биомассы и 0,28 ммоль 1У^2+/г сухой биомассы, клетки Сг. Иит1со1а поглощали 1,88 ммоль Р,/г сухой биомассы и 0,85 ммоль сухой биомассы

(рис. 1).

3. Состав фосфорных резервов дрожжей Я. сегеУ1з'ше и Сг. 1шгтсо1а

Для того чтобы проанализировать количество и состав минеральных фосфорных резервных соединений в выбранных нами условиях, применили известный из литературы метод экстракции Р; и полиР из клеток дрожжей (Вагабов и др., 2000). Из клеток обоих видов были получены пять фракций полиР: кислоторастворимая полиР 1, солерастворимая полиР2,

щелочерастворимые полиРЗ и полиР4 и экстрагируемая горячей НСЮ4 полиР5. Весь Р;, содержащийся в клетке, экстрагировался во фракцию полиР 1.

При культивировании на полноценных средах с низким содержанием Р| (1 мМ), содержание полиР у 5. сегеук/ае и Сг. кштсо1а на стационарной фазе роста было небольшим: 20 и 13 мкмольР/г сухой биомассы (в пересчете на Р;), соответственно. При поглощении Р, в неростовых условиях в клетках обоих видов накапливались полиР. Содержание полиР у & сегеушяе увеличивалось за время инкубации в 32 раза, а у Сг. 1гит'1со1а — в 34 раза в сравнении с исходными клетками. При добавлении к этой среде содержание полиР у

5. сегеушяе увеличивалось в 73 раза, а у Сг. 1гитюо1а - в 91 раз в сравнении с исходными клетками (табл. 3, 4). Содержание Р< увеличилось в меньшей степени, его количество в клетках 5. селеушяе и Сг. 1тписо1а составляло не более 10% от общего количества поглощенного Р|. Основным минеральным фосфорным резервным соединением в условиях голодания по азоту у обоих видов дрожжей являются полиР (табл. 3, 4).

При росте на полноценных средах содержащих 20 мМ Р], максимальное найденное нами содержание полиР у Сг. !ттко!а составило 306 мкмоль Р/г сухой биомассы полиР, ауХ се/'еушае согласно литературным данным оно составляло 780 мкмоль Р/г сухой биомассы полиР (Кулаковская и др., 2005). Таким образом, в модельных условиях, когда рост культуры ограничен отсутствием источников азота и при наличии М§2+ в среде инкубирования, клетки исследуемых нами дрожжей накапливали существенно больше полиР, чем на полноценных средах во время роста.

У 5. сегеуШае в отсутствии ионов магния более 50% полиР представлены фракцией кислоторастворимых полиР (полиР1). В присутствии у

сегем'тае увеличивается количество фракций полиР2, полиРЗ и полиР5, а содержание полиР1 снижается.

Таблица 3. Содержание Р| и полиР (мкмоль Р/г сухой биомассы) в клетках £ селеушае ВКМ - 1173 после 5 ч инкубации в неростовых условиях с глюкозой в присутствии и отсутствии М§2+. (В скобках указана доля Р, и суммы полиР в % от поглощенного Р; среды)

Фракция Условия инкубации

Р;, поглощенный из среды 1100 ± 114(100%) 2100 ±223 (100%)

Р| 90 ± 10 (8,2%) 130 ±23 (6,2%)

£полиР 637 ±49 (58%) 1450 ± 140 (69%)

ПолиР1 370 ± 22,5 115 ±5,0

ПолиР2 110 ±7,0 550 ±41

ПолиРЗ 130 ± 12 480 ±65

ПолиР4 18 ±2,0 105 ± 10,5

ПолиР5 9± 1,8 200 ± 5,0

Таблица 4. Содержание Р, и полиР (мкмоль Р/г сухой биомассы) в клетках Сг. Иит'юоЬ 9-6 после 5 ч инкубации в неростовых условиях с глюкозой в присутствии и отсутствии М§2+. (В скобках указана доля Р, и суммы полиР в % от поглощенного Р; среды)

Фракция Условия инкубации

Р1, поглощенный из среды 900 ±78 (100%) 1875 ±263 (100%)

Р1 70 ±7,1 (8%) 70 ± 5,9 (4%)

ХполиР 436 ± 49 (48%) 1188 ±105 (63%)

ПолиР1 318 ± 20 832 ±86

ПолиР2 25 ± 4,2 59 ± 6,9

ПолиРЗ 34 ±5,6 49 ± 11

ПолиР4 12 ±3,3 46 ± 9,5

ПолиР5 47 ±11 202 ± 22

Анализ длин цепи полиР сегем'шае с помощью электрофореза в 30% ПААГ показал, что в данных модельных условиях сохраняется характерное для этого вида дрожжей распределение полиР по фракциям в соответствии с длиной цепи: наиболее короткими являются полиР 1, а в последующих фракциях длина цепи возрастает (рис. 2). При накоплении полиР в присутствии катионов М^ + средняя длина цепи полиР ни в одной из фракций не изменилась (рис. 2).

1212121212 1212121212

полиР 1 полиР2 полиРЗ полиР4 гтолиР5 Saccharomyces cerevisiae

полиР! полиР2 полиРЗ полиР4 полиР5 Cryptococcus humicola

Рисунок 2. Электрофорез в ПААГ полиР различных фракций, полученных из клеток дрожжей S. cerevisiae и Cr. humicola. 1 - после инкубации в среде с глюкозой (30 мМ) и К2НРО4 (5 мМ); 2 - после инкубации в среде глюкозой (30 мМ), К.2НР04 (5 мМ) и MgS04 (5 мМ). ПолиР 15-208 - коммерческие полиР с известной длиной цепи, использованные в качестве маркеров (15, 25, 45, 75, 188 фосфатных остатков).

Из данных, представленных в таблице 5, видно, что в присутствии Mg2+ в клетке S. cerevisiae увеличивалось суммарное содержание длинноцепочечных полиР.

У Cr. humicola содержание, распределение по фракциям и длины цепей полиР ранее не были изучены. Оказалось, что в отличие от S. cerevisiae,

основную часть полиР клетки составляет кислоторастворимая фракция полиР 1. Она составляет 73 и 70% от общего количества полиР при инкубировании в среде с глюкозой и глюкозой и соответственно.

Средняя длина цепи полиР всех фракций, кроме полиР2 и полиР5 у Сг. Ытко1а больше, чем у сегеу'шае (рис. 2). Средняя длина цепи полиР 1, основной фракции в клетках этого вида, возрастала в присутствии \^2+(рис. 2).

Используя данные по определению количества отдельных фракций полиР (табл. 5) и их средней длине цепи (рис. 2), мы сравнили содержание полиР с разной длиной цепи у обоих видов как в присутствии так и в отсутствии Оказалось, что в присутствии М§2+ у обоих видов увеличивалось содержание полиР, причем именно более высокополимерных фракций. С использованием данных о содержании полиР различных фракций и их длине цепи, мы провели расчет количества полиР с определенной длиной цепи в клетках £ сегеушае и Сг. ¡штко1а (табл. 5). Оказалось, что у Сг. Иитко!а накапливаются более длинноцепочечные полиР, причем при добавлении в среду инкубирования длина цепи полиР 1 увеличивается.

Итак, при азотном голодании увеличение поглощения Р; из среды в присутствии приводит к увеличению биоминерализации клеток дрожжей: накоплению полиР, в особенности длинноцепочечных.

Таблица 5. Общее содержание полиР (% от общего количества) с различной средней длиной цепи в клетках сегеушсге и Сг. Иитко1а при накоплении Р, в присутствии и отсутствии

Средняя длина 5. селеушае Сг. Иитко1а

цепи, ~п

(фосфатных остатка) -ме1+

15 58 8 6 5

45 - - 73 -

75 38 71 - 70

>200 4 21 21 25

Измерение активности экзополифосфатазы в гомогенатах у 5. сегем'шае и Сг. Иитко1а показало, что активность этого фермента у них не одинакова. Активность экзополифосфатазы в исходных клетках 5. сегех'тае составляла 0,052 мкмоль Р/мин на мг белка, а у Сг. !ттко1а - 0,105 мкмоль Р/мин на мг белка. После инкубирования клеток в среде с экзополифосфатазная

активность в гомогенате 5. сегегшае составляла 0,076 мкмоль Р/мин на мг белка, а у Сг. Иитюо1а - 0,029 мкмоль Р/мин на мг белка. Таким образом, у Сг. Иитко!а экзополифосфатазная активность в условиях наилучшего накопления полиР снизилась почти в четыре раза, в то время как у 5. сегеушае такого падения активности не наблюдалось. Возможно, уменьшение экзополифосфатазной активности способствует накоплению

длинноцепочечных полиР у Сг. 1тписо1а.

4. Локализация полиР в клетках 5. сегеум/ае и Сг. Иштсо1а

Для оценки локализации полиР в живых клетках 5. сегеу'шае и Сг. Иитко1а было применено окрашивание ДАПИ и флуоресцентная микроскопия (рис. 3). Флуоресцентный краситель ДАПИ применяется для окрашивания ДНК, полиР и липидных включений в клетках (Зегайт е/ а/., 2002; АЬгатоу е/ а1., 2001; РисЬкоу, 2010). Комплексы ДАПИ-ДНК флуоресцируют в голубой области спектра, ДАПИ-полиР - в желто-оранжевой, а флуоресценция комплексов с липидами бледно-желтая и гаснет в течение нескольких секунд (БегаАт е/ а/., 2002).

В контрольных клетках 5. сегегшае и Сг. Иитко1а, выращенных до стационарной фазы при дефиците Р, и не накопивших полиР, наблюдали голубое свечение, характерное для комплексов ДАПИ-ДНК (рис. 3, А, Г). При этом у Сг. ЬиткоШ хорошо выявлялись ядра, а митохондриальная сеть светилась относительно слабо, напротив у 5. сегеги/'яе ярко флуоресцировали элементы митохондриальной сети, а ядра слабее. В клетках 5. сегеуШае, накопивших полиР в отсутствии ядра флуоресцируют ярче, а в

цитоплазме обнаруживаются включения, флуоресцирующие ярко-желтым,

19

цитоплазма имела зеленоватое свечение (рис. 3, Б). У Сг. китксЯа также наблюдались включения, однако они флуоресцировали оранжевым цветом, что может быть связано с большей длиной цепи полиР (рис. 3, Д).

2

\ П--

3 1

/ 1 1

Б 4

ТГ

\ 3'

д

.........; )

•. ш

Щк

Е

Рисунок 3.

Микрофотографии флуоресцирующих клеток 5. се^еушае (А, Б, В) и Сг. кит1со1а (Г, Д, Е), окрашенных с помощью ДАПИ. А, Г -контрольные клетки, выращенные на Р; -лимитированной среде; Б, Д — клетки,

инкубированные с 30 мМ глюкозой и 5 мМ Р|; Г, Е — клетки, инкубированные с 30 мМ глюкозой, 5 мМ Р, и 5 мМ Мя2+. 1 -митохондрии, 2 - ядро, 3 -гранулы, 4 - клетки, содержащие большое количество гранул.

При накоплении полиР в присутствии у обоих видов дрожжей

выявляются клетки, очень плотно заполненные включениями (рис 3, В и Е). У 5. сегеушае эти включения флуоресцировали ярко-желтым, а у Сг. кит\со1а -оранжевым, что характерно для комплексов ДАПИ-полиР (рис. 3, В и Е). По-

видимому, появление таких включений связано с образованием длинноцепочечных полиР. Количество таких клеток в популяции составляло в среднем 20 и 55%, у 5. сегеушяе и Сг. кит1со1а соответственно. Остальные клетки светились слабо, на уровне, характерном для контрольных клеток, не накопивших полиР (рис 3, В и Е). Возможно, накопление полиР и биоминерализация происходит не у всех клеток популяции или не в одинаковой степени.

Интересно отметить, что минерализация клеток 5. сегеушае и Сг. Иитко1а происходит неодинаково. Так, у 5. сегеушае минерализация клеток начинается с минерализации митохондрий, а у Сг. Иит'юоЬ значительное количество полиР накапливается вблизи вакуолей (рис. 4).

Рисунок 4. Микрофотографии флуоресцирующих клеток 5. сегеушае (А, Б) и Сг. китко1а (В), окрашенных с помощью ДАПИ. А - контрольные клетки 5. сегеушае, выращенные на Р, - лимитированной среде, Б — клетки 5. сегеушае, инкубированные с 30 мМ глюкозой и 5 мМ Р,; В - клетки Сг. Нит\со1а, инкубированные с 30 мМ глюкозой и 5 мМ Р,. 1 -митохондриальная сеть; 2-вакуоль; 3 - полиР.

Известно, что клетки 5. селеушае, накапливающие полиР, содержат множественные электроноплотные включения в разных компартментах (УопБек е? а!., 1982). Для того, чтобы определить в каких компартментах клеток

дрожжей 5. сегеушое и Сг. кит1со1а локализуются полиР, была проведена электронная микроскопия ультратонких срезов клеток с контрастированием свинцом. Для микроскопии были взяты контрольные клетки, выращенные на Р,-дефицитной среде и содержащие мало полиР (20 и 13 мкмольР/г у 5". сегелпв1ае и Сг. Ьитко1а, соответственно), и клетки, накопившие много полиР (1450 и 1188 мкмольР/г у 5. сегегшае и Сг. Иит1со1а, соответственно) в присутствии Мё2+ (рис. 5, 6).

В клетках, выращенных на бедной по Р, среде и содержащих мало полиР, не обнаруживали характерных электроноплотных включений (рис. 5А, 6А). Клетки Б. сегеушае, накопившие полиР в присутствии М§2+, содержали множество мелких электроноплотных включений в цитоплазме, вакуолях и митохондриях (рис. 5, Б). Особенностью локализации этих включений было наличие их вблизи цитоплазматической мембраны, а также в ассоциации с крупными электронопрозрачными включениями, возможно липидной природы (рис. 5, Б - 3). Не исключено, что именно эти включения и окрашиваются ДАПИ, поскольку они совпадают с ДАПИ-окрашиваемыми гранулами по размеру. Следует отметить, что обилие таких включений наблюдается именно в клетках, накопивших полиР.

Клетки Сг. кигп1Со1а, накопившие полиР в присутствии также

содержали множество мелких электроноплотных включений в цитоплазме (рис. 6, Б), вакуолях, особенно вблизи вакуолярной мембраны и в митохондриях. В цитоплазме вблизи вакуолей наблюдались плотные скопления гранул, отдельные крупные гранулы обнаруживались вблизи клеточной стенки. Большое количество гранул полиР, обнаруживаемое при электронной микроскопии Сг. кит1со1а, согласуется с данными, полученными при флуоресцентной микроскопии (рис. 3, 4).

Рисунок 5. Ультратонкие срезы клеток 5. сегеушае: А - клетки выращенные на среде с низким содержанием Рь Б - клетки после 5 часов инкубации в среде, содержащей 30 мМ глюкозу, 5 мМ КН2Р04 и 5 мМ 1^804. 1 - цитоплазма, 2 - вакуоль, 3 - жировые включения, 4 — митохондрии, 5 -электроноплотные гранулы, б - электроноплотные гранулы, ассоциированные с электронопрозрачными включениями.

Рисунок 6. Ультратонкие срезы клеток Сг. китюо1а\ А — клетки выращенные на среде с низким содержанием Р;; Б - клетки после 5 часов инкубации в среде, содержащей 30 мМ глюкозу, 5 мМ КН2Р04 и 5 мМ М§8С>4. 1 - цитоплазма, 2 — вакуоль, 3 - жировые включения, 4 - митохондрии, 5 -электроноплотные гранулы, 6 - скопление мелких электроноплотных гранул.

Микрорентгеновский анализ, выполненный совместно с В.В. Сорокиным в Институте микробиологии РАН, подтвердил, что эти мелкие включения содержат фосфор (рис. 7), и, в совокупности с данными по экстракции, можно считать, что они представляют собой полиР. Гранулы, ассоциированные с электронопрозрачными включениями, содержали больше фосфора, чем рассеянные по цитоплазме (рис. 7). Каких-либо катионов в ассоциации с этими структурами методом рентгеновского микроанализа найдено не было. В связи с этим, вопрос о локализации ионов Mg2+ в процессе поглощения Р| из среды и синтеза полиР клетками дрожжей требует дальнейших исследований. Однако известно, что ионы магния накапливаются у этих дрожжей преимущественно в вакуолях (Личко, 1981).

Рисунок 7. Ультратонкий срез (Б) и микрорентгеновский анализ (А) клеток б1, сегеушае, накопивших полиР в присутствии ионов Mg:!+. 1 — цитоплазма, 2 - мелкие электроноплотные гранулы в цитоплазме, 3- мелкие электроноплотные гранулы, ассоциированные с электронопрозрачными включениями.

Совокупность данных флуоресцентной и электронной микроскопии, а также микрорентгеновского анализа позволяет считать, что в цитоплазме 5. сегеушде при поглощении Р, в условиях подавления роста культуры и в присутствии ионов Мё2+, полиР обнаруживаются не только в виде мелких включений в цитоплазме и вакуолях, но и в ассоциации с более крупными включениями, предположительно липидной природы. Фосфорсодержащие включения, расположенные в вакуолях и цитоплазме отдельно, малы по размерам и поэтому не обнаруживаются при флуоресцентной микроскопии. Следует учитывать, что метод окрашивания ДАПИ при всей своей специфичности и наглядности не обеспечивает выявления всех полиР, присутствующих в дрожжевой клетке. Полученные данные согласуются с представлением о множественной локализации полиР в клетках дрожжей, которое было развито на основе получения субклеточных фракций (ЫсЬко е/ а!., 2006).

Заключение

Впервые для аскомицетных и базидиомицетных дрожжей была изучена зависимость формирования накоплений полиР от присутствия ионов М£2+ и от наличия источников азота, обеспечивающих депо фосфора при определенных соотношениях Р:Ы. Было показано, что ионы стимулируют накопление

полиР как для аскомицетных, так и для базидиомицетных дрожжей. Причем, в обоих случаях увеличивается пул длинноцепочечных полиР. Различия между двумя изученными представителями дрожжей в том, что у Сг. 1шписо1а основной фракцией является фракция полиР1 и средняя длина цепи полиР выше, чем у 5. сегеушяе, что по-видимому связано с особенностями локализации полиР в клетке. Впервые выявлены закономерности локализации запасов полиР в клетках аско- и базидиомицетных дрожжей: у 5. сегеушяе запасы полиР локализуются в основном в цитоплазме в виде крупных гранул и в митохондриях, а у Сг. Ьит'хоШ наибольшее количество гранул полиР находится вблизи вакуолей.

выводы

1. Впервые проведено сравнение способности базидиомицетных (пять видов) и аскомицетных (три вида) дрожжей к снижению концентрации фосфата в среде. Наибольший фосфат-аккумулирующий потенциал выявлен у аскомицетных дрожжей Басскаготусех сегеу'151ае и базидиомицетных дрожжей Сгур1ососсш Иит1со1а.

2. Показано, что максимальное поглощение фосфата (около 80%) клетками 5. сегеу'шае и Сг. \mmicola происходит при голодании по азоту в присутствии глюкозы и ионов магния.

3. Установлено, что поглощение фосфата клетками 5. се/'еушае и Сг. 1гит1со1а в неростовых условиях сопровождается накоплением полифосфатов в качестве основных резервных фосфорных соединений (свыше 60% поглощенного фосфата).

4. Выявлено, что потребление фосфата из среды в условиях азотного голодания сопровождается появлением полифосфат-содержащих включений в различных компартментах клеток сегем'шае и Сг. 1гштсо1а.

5. Обнаружено, что присутствие ионов магния приводит к увеличению уровня полифосфатов, средней длины их цепи и количества полифосфат-содержащих включений в клетках 5. сегеу1з'ше и Сг. 1штко1а.

6. В неростовых условиях клетки Сг. 1тт1со1а накапливают полифосфаты с большей длиной цепи, чем се/'еушае, что коррелирует со снижением экзополифосфатазной активности у этого вида.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бреус, Н.А. Накопление неорганических полифосфатов у Saccharomyces cerevisiae при дефиците азота: стимуляция ионами магния и особенности локализации / Н.А. Бреус, Л.П. Рязанова, Н.Е. Сузина, Т.В. Кулаковская, А.Я. Валиахметов, В.А. Яшин, В.В. Сорокин, И.С. Кулаев // Микробиология. - 2011. - Т. 80. - № 5. - С. 612-618.

2. Кулаковская, Т.В. Неорганические полифосфаты в регуляции фосфорного и энергетического метаболизма у дрожжей / Т.В. Кулаковская, В.М. Вагабов, А.А. Томашевский, Н.А. Бреус, И.С. Кулаев // Иммунопатология, аллергология, инфектология. — 2010.-№ 1.-С. 24-25.

3. Breus, N.A. Accumulation of Phosphate and Polyphosphate by Cryptococcus humicola and Saccharomyces cerevisiae in the Absence of Nitrogen / N.A. Breus, L.P. Ryazanova, V.V. Dmitriev, T.V. Kulakovskaya, I.S. Kulaev // FEMS Yeast Research. -2012. -V. 12. -№ 6. - P. 617-624.

4. Бреус, Н.А. Влияние ионов магния на содержание и длину цепи полифосфатов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae / Н.А. Бреус // 13"ая международная Пущинская конференция молодых ученых «Биология-наука 21 века», Пущино. - 2009. — С. 63.

5. Kulakovskaya, Т. Inorganic polyphosphate: biological activities, industrial application and environmental role / T. Kulakovskaya, N. Breus, L. Ryazanova, V. Vagabov, I. Kulaev // International Conference "Man and Environment: Enemies or Friends?", Pushchino. - 2011. - P. 279-281.

Подписано в печать:

26.02.2013

Заказ № 8201 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru