Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поглощение и резервирование фосфата некоторыми ахеями и бактериями

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Поглощение и резервирование фосфата некоторыми ахеями и бактериями"

На правах рукописи

СМИРНОВ АЛЕКСЕЙ ВЯЧЕСЛАВОВИЧ

ПОГЛОЩЕНИЕ И РЕЗЕРВИРОВАНИЕ ФОСФАТА НЕКОТОРЫМИ АРХЕЯМИ И БАКТЕРИЯМИ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание\ченой степени кандидата биологических на\ к

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. 1. К. Скрябина РАН

Научные руководители: член-корреспондент РАН,

доктор биологических наук, профессор И. С. Кулаев; доктор биологических наук, Т. В. Кулаковская

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор М. С. Крицкий; кандидат биологических наук;

В. Н. Хмеленина

Ведущая организация Институт микробиологии РАН

Защита состоится " £ " декабря 2003 г. в Э час 30 мин на заседании Диссертационного совета Л 002.121.01 в Инсти1у1е биохимии и физиологии микроор!анизмов им Г.К. Скрябина РАН по адресу: г. Пущине Московской области, проспект Науки, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им Г. К. Скрябина РАН.

Автореферат разослан "31 " Ю 2003 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

В. М. Вагабов

Актуальность проблемы. Сравнительное изучение поглощения и резервирования фосфата клетками микроорганизмов, относящихся к различным систематическим группам, является актуальным с точки зрения понимания того, как происходит их приспособление к изменяющимся условиям окружающей среды, в том числе и к выживанию в средах с избыточным или недостаточным количеством фосфора. Такие исследования важны также для разработки биотехнологии очистки окружающей среды от избытка фосфата.

У большинства изученных к настоящему времени микроорганизмов накопление фосфора в клетках в первую очередь осуществляется в виде неорганических полифосфатов (полиР), линейных полимеров ортофосфорной кислоты (Кулаев, 1975; Kulaev & Vagabov, 1983; Kornberg 1995, 1999; Kulaev et al., 1999). Однако, у микроорганизмов, стоящих на различных стадиях эволюционного развития, а также обитающих в различных природных условиях, способы резервирования фосфора могут весьма существенно отличаться. Известны такие формы запасания этого компонента, как полимерный ортофосфат металлов у грибов (Окороков и Кулаев, 1968; Окороков и др., 1971), тейхоевые кислоты клеточных стенок у некоторых бактерий (Grant, 1979), накопление пирофосфата в специальных органеллах -ацидокальцисомах у некоторых водорослей и простейших (Moreno & Docampo, 2001) и хроматофорах у фотосинтезирующих бактерий (Baltscheffsky, 1968). У цианобактерий обнаружено накопление ортофосфата в виде минеральных чехлов на поверхности клеток (Герасименко и др., 1998).

В настоящее время процесс накопления фосфата и участие в нем полифосфатов в наибольшей степени изучены у Escherichia coli, дрожжей и обитающих в сточных водах бактерий рода Acinetobacter. Значительное разнообразие фосфорного метаболизма у микроорганизмов делает актуальным расширение спектра объектов, у которых изучается эта проблема. Поэтому изучение механизмов реализации способности к накоплению фосфата у галофильных архей и гапотолерантных бактерий, совершенно не изученных в этом отношении, представляется перспективный как ~(Гточки зрения сравнительной биохймииТтак и в свете решения биотехнологических задач.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось сравнительное изучение особенностей поглощения и резервирования фосфата галофильными археями Halobacterium salinarium ET ¡001 и Halorubrum distributum BKM В - 1739, а также галотолерантной эубактерией Brevibacterium antiquum BKM Ac - 2118.

Были поставлены следующие задачи:

1) Изучить способность к поглощению фосфата из культуралыюй среды клетками Н. salinarium, Н. distributum и В. antiquum в различных условиях культивирования и выяснить, является ли это поглощение энергозависимым процессом;

2) Определить, какой компонент является у данных микроорганизмов основным резервом фосфата;

3) Опредечить содержание полифосфатов и активность некоторых

фосфогидролаз в клетках указанных культур в процессе роста и оценить возможную роль полифосфатов в резервировании фосфата;

4) Изучить влияние условий повышенной солености на накопление фосфата и метаболизм полифосфатов у галотолерантной эубактерии В. antiquum.

Научная новизна работы. Одним из основных результатов выполненной работы является выявление новых высокоэффективных поглотителей фосфата, которыми оказались галотолерантная эубактерия Brevibacterium antiquum, способная к росту, как в отсутствие, так и в присутствии 3 М NaCl, и галофильные археи Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum, растущие только в присутствие 34 М NaCl. Клетки этих прокариот поглощали свыше 90% фосфата из среды культивирования в диапазоне концентраций от 2,3 до 11,5 мМ посредством энергозависимого транспорта.

В клетках указанных микроорганизмов впервые обнаружена новая форма запасания фосфата в виде водо-нерастворимых фосфатов магния. Накопление этих соединений приводит к значительным изменениям морфологии клеток Н. salinarium, Н. distributum и В. antiquum. Накопленный резерв может составлять до 80 % от всего фосфата, поглощенного клетками и расходоваться в условиях недостатка фосфата в среде культивирования.

Показано, что условия повышенной солености (ЗМ NaCl) приводят к существенным изменениям в обмене полифосфатов у В. antiquum-, исчезает экзополифосфатазная активность, которая имеется при росте в отсутствие соли в среде, а также увеличивается содержание полифосфатов. На основании этих данных предположено, что у В. antiquum полифосфаты могут выполнять функцию осмопротекторов и увеличивать способность В. antiquum к выживанию при солевом стрессе.

Научно-практическое значение работы. В настоящее время проблема загрязнения окружающей среды избытком фосфата приобрела большое значение вследствие широкого применения фосфорных удобрений и моющих средств. Для решения этой проблемы в мировой практике широко применяются процессы удаления фосфата из сточных вод за счет поглощения его различными микроорганизмами и микробными сообществами. Для понимания биохимических основ таких процессов и их дальнейшего усовершенствования необходим сравнительный анализ механизмов транспорта и накопления фосфата в клетках микроорганизмов, а также отработка удобных экспериментальных моделей для таких исследований. Выявленные в данной работе микроорганизмы, высокоэффективные поглотители фосфата, могут служить хорошей экспериментальной моделью, а также в перспективе быть использованы при разработке микробиологических основ подобных процессов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах, содержит таблиц и рисунков. Библиографический указатель содержит источника литературы.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на ряде конференций: на Международном симпозиуме «Современные проблемы биохимии и

биотехнологии микроорганизмов» (11ущино, 2000), на Международном симпозиуме «Сигнальные системы клеток растений» (Москва, 2001), на Международной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (Саранск, 2001), на 5ой и 6ой конференции молодых ученых «Биология - наука 21го века» (Пущино, 2001, 2002), на 3-ем съезде Российского биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002).

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами данной работы были два вида галофильных архей Halobacterium salinariutn ET 1001 и Halorubrum distributum ВКМ В-1739, растущих только в присутствие 3-4М NaCl и галотолерантная эубактерия Brevibacterium antiquum ВКМ Ас - 2118, выделенная из почв вечной мерзлоты (Колымская низменность, Россия), которая была способна расти как в отсутствии соли, так и в присутствии ЗМ NaCl. Выращивание проводили на жидких средах с начальными концентрациями фосфата от 0,05 до 11,5 мМ.

Экстракцию фосфорных соединений проводили согласно (Крицкий и др., 1972; Kulaev, 1979; Vagabov et al., 1998). Кислоторастворимую фракцию полифосфатов экстрагировали из биомассы 1 н НСЮ4 в течение 15 мин при 0 °С. Нуклеозидфосфаты удаляли сорбцией на активировнный уголь НоритА. Щелочерастворимую фракцию полифосфатов экстрагировали 0,05 н NaOH при 0 °С в течение 30 минут. В указанных двух экстрактах определяли содержание ортофосфата и кислотолабильного фосфора. Количество последнего рассчитывали по разнице между содержанием ортофосфата в экстракте до и после гидролиза в 1н НС1 при 100 °С в течение 10 мин. Количество полифосфатов в этих фракциях оценивали по количеству кислотолабильного фосфора. Оставшуюся биомассу обрабатывали 0,5 н НСЮ4 в течение 30 мин при 90 °С. По количеству ортофосфата в супернатанте судили о содержании полифосфатов в этой фракции. Ортофосфат определяли колориметрическим методом, как описано в (Andreeva & Okorokov, 1993).

Для дополнительной - очистки -полифосфатов из— кислоторастворимой и -щелочерастворимой фракций их осаждали насыщенным раствором Ba(N03)2 и переводили в растворимую форму добавлением смолы Dowex 50 WX 8 в NH4+ форме. Затем полифосфаты хроматографировали на бумаге в системе изопропанол: Н20: 20 % трихлоруксусная кислота: 25 % NH4OH (70:10:20:0,3) в восходящем токе растворителя при 4 °С. Фосфорные соединения окрашивали согласно (Westman, 1952). Определение их длины цепи проводили с помощью электрофореза в 20% полиакриламидном геле, приготовленном на 200 мМ трис-боратном буфере, рН 8,3 с 7 М мочевиной и окрашивали толуидиновым голубым (Kumble et al. 1995).

Водонерастворимые осадки фосфата магния получали с помощью дифференциального центрифугирования после предварительного разрушения клеток архей дистиллированной водой, а клеток В. antiquum экструзией при высоком давлении.

Фосфогидролазные активности определяли в бесклеточном экстракте после разрушения клеток в 25 мМ трис-НС1-буфере, рН 7,2. Экзополифосфатазную активность определяли по образованию ортофосфата при гидролизе полиР и за единицу активности (Е) принимали количество фермента, образующего 1 мкмоль ортофосфата в 1мин (Andreeva & Okorokov, 1993).

Подготовку образцов для электронной микроскопии проводили, согласно (Reynolds, 1963).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Галофильные археи Halobacterium salinarium и Haloruhrum distributum и галотолерантная эубактерии Brevibacterium antiquum эффективно поглощают фосфат из среды культивирования

Выло показано, что в процессе роста клетки галофильных архей Н. salinarium и Н. distributum эффективно поглощали фосфат из среды культивирования на средах с различной начальной концентрацией Р, На рисунке 1 показано поглощение фосфата Н. distributum при двух различных начальных концентрациях его в среде 2,3 мМ и 7,8 мМ. Такая же картина наблюдалась при росте галофильной археи Н. salinarium.

3 ш

0 1 2 3 4 5 6 Время культивирования, сут

„ 6

7,5 _

--2,5

0 1 2 3 4 5 6 Время культивирования, сут

Рис. 1. Рост (1) и поглощение фосфата из среды (2) НаЬгиЬгит йЫпЬШит на средах с различной начальной концентрацией Р|: 2,3 мМ (А), 7,8 мМ (Б).

Для сравнения была определена способность к поглощению фосфата галотолерантной эубактерией В. апЩиит в процессе роста. На рисунке 2 показано поглощение фосфата из среды этой бактерией при начальных концентрациях 2,3 и 11,5 мМ как в отсутствии 3 М ЫаС1 в среде, так и в присутствии соли. Оказалось, что

эта бактерия также хорошо поглощает фосфа1 из среды, причем эта способность лишь немного снижалась в присутствии NaCl.

Следует отметить, что клетки Escherichia coli К-12 при выращивании на таких же средах, что и В. antiquum, поглощали не более 6% от начального количества фосфата в среде.

К стационарной стадии роста, изучаемые микроорганизмы были способны удалять из среды до 95 % содержащегося в ней фосфата при различной его начальной концентрации, и накапливали его в биомассе в количестве, сравнимом с наиболее эффективными микроорганизмами-поглотителями фосфата из биотехнологических установок по очистке сточных вод от фосфата (табл. 1).

А

30 60 90 120 150

Время культивирования, час

Рис. 2. Рост (А) и iioi лощение фосфата из среды (Б) Brevibacterium antiquum на средах с различной начальной концентрацией Р, в отсутствии и в присутствии ЗМ NaCI. 1- 2,3 мМ Р,;

2- 11,5 мМ Р,; 3- 2,3 мМ Р, + 3 М NaCl; 4- 11,5 мМ Р, + 3 М NaCl.

Таблица 1. Эффективность поглощения фосфата различными микроорганизмами

Микроорганизм Поглощение фосфата из среды, ммоль/г сырой биомассы Литература

Halobactenum salmarmm 0,9

Halorubrum distributum 0,65 Насюящая работ

Brevibacterium antiquum 0,5

Acinetobacter /ohnsorui 0,8 van Niel etal., 1999

Rhodocyclus sp. 0,6 Zilles et al„ 2002

Microlunatus phosphovorus 1,0 Santos etal., 1999

Известно, что за поглощение Р, клетками микроорганизмов ответственны транспортные системы, зависимые от протон-движущей силы (van Veen, 1994; Keasling, 1997; Кортсти и др., 2000). Поэтому было изучено влияние протонофора карбонилцианид п - (трифторметокси) фенилгидразон (ФКФ), разрушающего электрохимический градиент Н+ на мембранах, на рост и поглощение Р, из среды культивирования исследуемыми культурами. Для этого в процессе культивирования добавляли 0,005 мМ ФКФ, начиная с первых суток роста культуры. Для всех трех микроорганизмов после добавления протонофора снижение концентрации Р, в среде прекращалось параллельно остановке роста. На рисунке 3 показаны результаты такого эксперимента на примере Н. disributum.

Полученные данные указывает на то, что поглощение фосфата клетками изучаемых микроорганизмов является энергозависимым процессом, связанным с протон-движущей силой.

8

S s

«Г Ч в) а. о

L- 2

Время культивирования, сут

0 12 3 4

Время культивирования, сут

Рис. 3. Влияние ФКФ на рост (А) н поглощение Р, Halorubrum distributum из культуральной среды (Б). Выращивание проводили на среде с начальной концентрацией 7,8 мМ Р„ Стрелки показывают время внесения ФКФ (до концентрации 0,005 мМ) в среду.

2. Фосфат магния - новая форма резервирования фосфора у микроорганизмов

Изучение распределения поглощенного фосфата по известным фракциям фосфорных соединений, полученных из биомассы Н. salinarium, Н. distributum и В. antiquum, показало что при избытке фосфата в среде основная часть поглощенною Р, выявляется в виде ортофосфата (табл. 2).

Таблица 2. Содержание в биомассе Halobacterium salinarium, Halorubrum distributum и Brevibacterium antiquum орто- и полиР в % от Р,, поглощенного из среды культивирования (стационарная стадия роста)

Halobacterium salinarium Halorubrum distributum Brevibacterium antiquum (- NaCl) Brevibacterium antiquum (+NaCl')

2.3 мМ Р, 11,5 мМ Р. 2.3 мМ P. 7,i мМ Р. 2,3 мМ Р, 11.5 мМ Р, 23 мМ Р, 11,5 мМ Р,

Р, поглощенный из среды 100 100 100 100 100 100 100 100

Р, обнаруженный вкштке 65 90 70 90 8 70 35 80

Кииютораст-воримые по iuP 20 9 28 10 2 10 6 5

Щеючераст-воримые по шР 3,4 0,4 3,8 0,9 0,3 0,1 0,2 0,5

Р,горячего д юрнокиаюго JKCilJ/XikWU 0,S 0,1 0,5 0,1 6,7 3,2 4,8 3,2

£ но шР 23,9 9,5 32,3 11 9 13,3 11 8,7

В клетках Н. заИпагшт и Н. distributum от 65 до 90% поглощенного Р, было обнаружено в виде ортофосфата, причем его содержание возрастало с увеличением начальной концентрации Р, в среде. На долю полиР приходилось не более 30%, причем эта доля даже уменьшалась при увеличении концентрации фосфата в среде до 10%. Данные таблицы 2 указывают на то, что уже концентрация 2,3 мМ Р, является избыточной для изучаемых гапофильных архей. При этом большая часть поглощенного Р, не используется для биосинтеза, а накапливается в биомассе в виде ортофосфата.

Для В. antiquum концентрация фосфата 2,3 мМ не является избыточной при росте в отсутствии ЗМ NaCl, и в виде Р, было обнаружено лишь около 8 %, а в виде полиР - 9 % от общего количества фосфата поглощенного культурой. В то же время концентрация 11,5 мМ является избыточной как в отсутствии, так и в присутствии ЗМ NaCl. 11ри этом доля ортофосфата составила около 70- 80 % от поглощенного фосфата, а доля полиР была невелика (табл. 2).

Таким образом, у архей Н. salinarium, Н. distributum и эубактерии В. antiquum в отличие от большинства других изученных ранее в этом отношении микроорганизмов при избытке Р, в среде основная его часть резервируется в виде ортофосфата, а не полиР.

Представляло интерес выяснить, как накопление такого значительного количества Р, сказывается на состоянии клеток. При световой микроскопии было обнаружено, что лишь часть клеток обоих архей сохраняет интактность при накоплении фосфата. В биомассе наблюдали клетки с различной степенью повреждения (рис. 4 а), также обнаружили значительное количество водо-нерастворимых кристаллов, большая часть коюрых ирису твовала в виде агломератов (рис. 4 б).

Г-d'i > £• ". 1 -ч'

Рис. 4. Фазово-контрастное изображение клеток На1оЬас1епит ьаЧпапит, выращенных на среде с 11,5 мМ Р, в течение 5 сут (а) и кристаллов фосфата магния, образующихся в Э1их условиях в биомассе (б). Световой микроскоп ОРТОЫ 1СМ 405. Бар - 10 мкм.

В отличие от изучаемых архей, В. antiquum была более устойчива к повышенной концентрации Р,. При световой микроскопии кристаллы обнаруживали в биомассе только в очень небольшом количестве и только в глубокой стационарной фазе роста (рис. 5). Вероятной причиной такой устойчивости может быть наличие более мощной клеточной стенки.

Методом электронной микроскопии в совместных экспериментах с Н.Е. Сузиной было подтверждено, что клетки изучаемых микроорганизмов претерпевают значительные морфологические изменения в процессе накопления фосфата. Следует отметить, что по данным электронной микроскопии накопление фосфата происходило, по-видимому, внутри клеток.

Рис. 5. Фазово-контрастное изображение клеток и водо-исрастворимых кристаллов (/) в биомассе Brevibacterium antiquum, выращенной на среде 11,5 мМ Pi в отсутствии ЗМ NaCI.

Световой микроскоп OPTON ICM 405. Бар - 10 мкм.

Оказалось, что Р, из биомассы изучаемых культур можно извлечь в виде нерастворимого осадка. Из биомассы H. salinarium и H. distributum такой осадок извлекается при лизисе клеток дистиллированной водой, а из биомассы В. antiquum -после разрушения клеток методом экструзии при высоком давлении. Большее количество этого осадка можно было получить при выращивании клеток на среде с более высокой начальной концен фацией фосфата. С помощью данного метода удавалось извлечь из биомассы примерно столько же ортофосфата, что и при химической экстракции. Кислотолабильный фосфор в осадках не обнаруживался.

Основную часть осадка составляли неорганическая соли, содержащие фосфат и ионы магния. В лаборатории химии фосфатов ИОНХ им. U.C. Курнакова, Чудиновой H.H. с сотр., был проведен рентгенофазовый анализ фосфат-содержащих осадков и установлено, что для Н. salinarium и Н. distributum основным соединением данных осадков является IV^PO-iOlMlhO, а для В, antiquum - KMgP04-6H20.

Таким образом, впервые показано, что основной резерв фосфата у галофильных архей Н. salinarium, H. distributum и гапотолерантной эубактерии В. antiquum в отличие от других известных ранее микроорганизмов, представляет собой водо-нерастворимые фосфаш, в которых основным катионом является магний.

Накопленный ортофосфат действительно может выполнять функцию фосфорного резерва и использоваться клетками Н. salinarium, H. distributum и В. antiquum при росте на Р-дефицитной среде. В процессе культивирования Н.

distributum на фосфат-дефицитной среде происходило уменьшение содержания фосфата магния в биомассе от 45 до 10% (рис. 6). 11ри предварительном насыщении клеток фосфатом магния и последующем пересеве на Р-дефицитную среду больший прирост биомассы наблюдали при использовании посевного материала, предварительно выращенного на среде с более высокой концентрацией фосфата (рис. 6). Подобные результаты были получены также и для Н. salinarium и В. antiquum (не иллюстрируется).

Таким образом, для роста в условиях недостатка Р„ клетки указанных микроорганизмов способны использовать фосфат магния, запасенный на богатой фосфатом среде.

3. Полифосфаты в процессе роста галофильных архей На1оЬас1епит эаИпапит и На1огиЬгит й'ШпЬШит

Несмотря на то, чю полиР составляли относительно небольшую долю в общем количестве фосфата, присутствующую в биомассе архей, содержание этих

Рис. 6. Рост НЫогиЬгит й'ШпЬшит (А)

и содержание фосфата магния в

биомассе (Б) при пересеве 5-ти

суточной культуры со среды с 2,3 и

7,8 мМ Р, на Л-дефицитную среду: I- 2,3 мМ Р,;

2- 7,8 мМ Р„

биополимеров, в клетках изучаемых архей по сравнению с другими изученными прокариотами, было существенным. Наличие полиР было подтверждено с использованием хроматографического и электрофоретического методов. Основная часть полиР была представлена кислоторастворимой фракцией. Н. ьаИпагшт содержала от 30 до 100 мкмоль Р/г сырой биомассы кислоторастворимых полиР и 510 мкмоль Р/г сырой биомассы щелочерастворимых полиР, а Н. й'кшЫиит от 25 до 90 мкмоль Р/г сырой биомассы кислоторастворимых полиР и 5-10 мкмоль Р/г сырой биомассы щелочерастворимых полиР.

Динамика полиР этих фракций в процессе роста была практически одинакова у обоих архей. На рисунке 7 показана динамика содержания ортофосфата и полиР в процессе роста Н. ьаИпагтт.

Рис. 7. Изменения в содержании ортофосфата (А) и полиР (Б) в биомассе НШоЬааепит ьа/тапит при росте на среде с 2,3 мМ Р,.

1- кислоторастворимые полиР;

2- щелочерастворимые полиР.

35--

л _ 5

о и

^ £

^ (О

I

§

2 3 4 5 6 Время культивирования, сут

Максимальное содержание кислоторастворимых полиР приходилось на середину логарифмической стадии, а к стационарной стадии их содержание снижалось (рис. 7 Н, кривая роста представлена на рис. 1 А). Содержание щелочерастворимых полиР возрастало к стационарной стадии, но очень незначительно (рис. 7 Б). Напротив, содержание ортофосфата возрастало к стационарной стадии роста (рис. 7 А).

На рисунке 8 показаны изменения длины цепи полиР кислоторастворимой и щелочерастворимой фракций в процессе роста Н. яаИпагшт. В обоих фракциях наблюдали увеличение количества более длинноцепочечных полиР.

У галофильных архей не удалось выявить основного фермента, ответственного за гидролиз полиР- экзополифосфатазы ни в условиях дефицита, ни в условиях избытка фосфата. Все перечесленные факты согласуются с тем, что функции полиР у изучаемых архей не связаны с резервированием фосфата.

4. Влияние условий повышенной солености на содержание полифосфатов и экзополифосфатазную активность у Brevibacterium antiquum

Для В. antiquum роль полиР в резервировании фосфата также невелика (см. табл. 2).Учитывая представление, развиваемое рядом исследователей о том, что полиР играют важную роль в преодолении стрессовых условий, в том числе и осмотического стресса, мы попытались оценить, какие изменения в метаболизме этих соединений происходят при росте В. antiquum на среде с ЗМ NaCl.

Было установлено, что в отличие от изучаемых галофильных архей, в бесклеточном экстракте В. antiquum присуствовала экзополифосфатаза, сходная по ряду свойств с известными экзополифосфатазами других бактерий. Она имела оптимум рН около 8,0 (рис. 9), слабо гидролизовала триполифосфат по сравнению с более длинноцепочечными полиР (табл. 3), нуждалась для проявления активности в

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112

Рис. 8. Электрофорез в 20% ПААГ полиР, полученных из клеток На1оЬас1епит яаНпапит на различных стадиях роста. ПолиР-метчики: полиР^ (/), ПОЛИР25 (2), полиР45(.?), полиР|88 (</). ПолиР кислоторастворимой фракции из клеток, выращенных в течение 2- (5); ЗЧй); 4-(7) и 5™ («) суток. ПолиР щелочерастворимой фракции из клеток, выращенных в течение 2- (9); 3*(/0); и 5Ш (12) суток.

катионах калия или аммония (рис. 10), подавлялась на 96% гепарином - основным известным ингибитором экзополифосфатаз, в концентрации 20 мг/мл и была нечувствительна к ингибитору пирофосфатаз - фториду № в концентрации 1 мМ.

2 4 6 8 10 РН

Рис. 9. Зависимость экзополифосфатазной (/), пирофосфатазной (2) и неспецифнческой фосфатазиой активностей (3) бесклеточнного экстракта Brevibacterium antiquum от рН.

Таблица 3. Гидролиз полиР с различной длиной цепи препаратом бесклеточного экстракта Brevibacterium antiquum. Измерения проводили в 100 мМ трис-HCI, рН 8,0 в присутствии 150 мМ NH4C1

Субстрат Концентрация, мМ Удельная активность, мЕ/мг белка

Пош1>з 1 0

По ш!\ 0,1 50

По ml'ц 0,07 38

По ml':, 0,07 70

По mPts 0,04 77

По tul' чи 0,004 41

При культивировании изучаемой бактерии в присутствии ЗМ №С1 экзополифосфатазную активность не обнаруживали ни на одной из стадий роста (табл. 4), независимо от концешрации Р, в среде (табл. 5). Это хорошо согласуется с увеличением содержания полиР в условиях повышенной солености примерно в 2 раза (табл. 6).

Можно предположить, что увеличение содержания полиР и исчезновение экзополифосфатазной активность у В. antiquum при повышенной солености указывают на возможное уменьшение скорости обмена полиР в этих условиях и возможное участие полиР в преодолении солевого стресса в качестве осмопротекторов.

100 200 Концентрация, мМ

300

Рис. 10. Влияние катионов моновалентных металлов яа экзополифосфатазную активность бесклточного экстракта Brevibacterium antiquum. Реакционная смесь содержала 100 мМ трис-HCl, рН 8,0 и 0,004 мМ полиР?!«: 1 - NH4C1; 2 - К.С1; J - NaCl.

Таблица 4. Удельная активность экзополифосфатазы в бесклетлочном экоракте Brevibacterium antiquum в зависимости от стадии роста. Реакционная смесь содержала 150 мМ NH4CI и 0,004 мМ полиР2()8 вЮО мМ трис-HCl, рН 8,0

Стадия роста Культивирование в отсутствии ЗМ NaCl Культивирование в присутствии ЗМ NaCl

Удельная активность. мЕ/мг белка

начало логарифмической стадии 6,0 0

середина логарифмической стадии 22,3 0

начало стационарной стадии 38,6 0

стационарная стадия 16,8 0

Таблица 5. Удельная активность экзополифосфатазы в бесклеточном экстракте Brevibacterium antiquum в зависимости от начальной концентрации Pi в среде. Реакционная смесь содержала 150 мМ NH4CI и 0,004 мМ полиРзок вЮО мМ трис-HCl, рН 8,0

Культивирование в Культивирование в

Начальная концентрация Р| (мМ) отсутствии ЗМ NaCI присутствии ЗМ NaCI

0,8 16,0 0

2,3 41 0

11,5 40,4 0

Таблица 6. Содержание полиР и экзо»олифосфа1азная активное! ь у Brevibacterium antiquum на стационарной стадии роста в зависимости от присутствия 3 М NaCI в среде

Соленость среды ПолиР, мкмоль Р/г сырой биомассы Экзополифосфатазная активность, мЕ/мг белка

Кислото-растворимые Щелоче-растворимые Горячий хлорнокислый экстракт Z

-ЗМ NaCI 6 0,3 8,2 14,5 41

+3MNaCl 14,8 1,5 14 30,3 0

Таким образом, изучение особенностей резервирования Р, у таких совершенно неизученных объектов как галофильные археи Н. salinarium и Н. distributum, а также галотолерантная эубактерия В. antiquum, позволило с одной стороны обнаружить новую форму резервирования фосфата в виде фосфата магния, а с другой стороны оценить особенности метаболизма полиР в условиях повышенной солености, что открывает новые возможности для понимания функций этих биополимеров.

выводы

Особенностью фосфорного метаболизма галофильных архей Halobacterium salinarium и Halorubrwn distribution и галотолерантной эубактерии Brevibacterium antiquum является поглощение ими свыше 90% фосфата из среды культивирования в диапазоне концентраций от 2,3 до 11,5 мМ посредством энергозависимого транспорта. У Brevibacterium antiquum, растущей как в отсутствии, так и в присутствии 3 М NaCI, способность к поглощению и резервированию фосфата мало зависела от солености среды.

Впервые показано, что основной резерв фосфата у галофильных архей Halobacterium salinarium, Halorubrum distributum и галотолерантной эубактерии Brevibacterium antiquum в отличие от других известных ранее микроорганизмов, представляет собой водонерастворимые фосфаты, в которых основным катионом является магний.

Неорганические полифосфаты содержат не более 10-30% от всего фосфата, поглощенного клетками Halobacterium salinarium, Halorubrum distributum и Brevibacterium antiquum, причем доля этих биополимеров в общем количестве поглощенного фосфата снижается при увеличении начальной концентрации фосфата в среде. У галофильных архей максимальное содержание полифосфатов наблюдается на логарифмической стадии роста, тогда как содержание ортофосфата максимально на стционарной стадии. Перечисленные факты говорят в пользу того, что полифосфаты в клетках этих микроорганизмов принимают ограниченное участие в резервирование фосфора.

В условиях повышенной солености (3 М NaCI) у Brevibacterium antiquum наблюдаются существенные изменения в метаболизме полифосфатов: наряду с увеличением их содержания исчезает экзополифосфатазная активность, которая характерна для этой бактерии в отсутствии NaCI и сходна по своим свойствам с известными экзополифосфатазами других бактерий. Это согласуется с предположением об участии полифосфатов в преодолении солевого стресса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. A.V. Smirnov, T.V. Kulakovskaya, I.S.Kulaev. Phosphate accumulation by an extremely halophilic archae Halobacterim salinarium. Process Biochemistry. 2002. V. 37/6. P. 643-649.

2. А. В. Смирнов, H. В. Сузина, Т. В. Кулаковская, И. С. Кулаев. Ортофосфат магния - новая форма резервирования фосфата у гапофильной археи Halobacterium salinarium. Микробиология. 2002. Т. 71. № 6. С. 786-793.

3. А. В. Смирнов, Т. В. Кулаковская, член-корреспондент РАН И. С. Кулаев. Экзополифосфатаза галотолерантной бактерии Brevibacterium sp. штамм ВКМ Ас-2118 при росте в условиях нормальной и повышенной солености. Докл. АН. 2002. Т. 386. № 5. С. 696-698.

4. А.В. Смирнов, И.С. Кулаев. Новая форма запасания фосфата у архей. «3 -ий съезд биохимического общества», Санкт-Петербург, 2002, стр.107.

5. А.В. Смирнов. Особенности резервирования фосфата у гапофильной археи Halobacterium salinarium. Биология-наука 21го века (Тезисы докладов. 6"" пущинская конференция молодых ученых). Пущино, 2002, стр.61-62.

6. А.В. Смирнов. Накопление фосфата и полифосфатов археей Halobacterium salinarium. Биология-наука 2ГГ0 века (Тезисы докладов. 5"я пущинская конференция молодых ученых). Пущино, 2001, стр.179-180.

7. А.В. Смирнов. Микроорганизмы, потребляющие фосфат. Материалы международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий». Саранск, 2001, стр. 252-254.

8. A.V. Smirnov, T.V. Kulakovskaya, I.S. Kulaev. Phosphate accumulation and reserve are essential for growth of a halophilic archae Halobacterium salinarium. Abstracts of International symposium "Signaling systems of plant cells: " Moscow, Russia, 2001, pp.108-109.

9. N.A. Andreeva, A.V. Smirnov, T.V. Kulakovskaya. Inorganic polyphosphates and phosphohydrolases of Halobacterium salinarium International symposium "Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology. Abstracts. Pushchino, 2000, p. 56.

№17630

Подписано в печать 27 октября 2003 г Заказ 378 Формат 60 х 90/16 Тираж 100 экз Ошечамно в салоне оперативной печати АртПолшраф Москва, Ь Якччанка, 13, оф 410 Тел 778-97-47

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Смирнов, Алексей Вячеславович

Список принятых сокращений

Введение

Часть 1. Обзор литературы

Глава 1. Роль микроорганизмов в круговороте фосфора

Глава 2. Поглощение фосфата микроорганизмами

Глава 3. Формы и способы резервирования фосфата у микроорганизмов

3.1. ПолиР - основной резерв фосфата в клетках микроорганизмов

3.2. РР± в качестве фосфорного резерва

3.3. Полимерные ортофосфаты металлов (ПОш)

3.4. Минерализация цианобактерий - необычный способ резервирования фосфата

3.5. Накопление ортофосфата 35 3. б. Резервирование фосфата в виде органических соединений

Часть 2. Материалы и методы исследования

1. Объекты исследования

2. Состав сред культивирования

3. Подготовка биомассы для анализов

4. Разрушение биомассы

5. Экстракция фосфорсодержащих фракций из биомассы

6. Экстракция полимерного ортофосфата Ми 2+ (110\и)

7. Осаждение полифосфатов

8. Хроматография полифосфатов на бумаге

9. Электрофорез полифосфатов в ПААГ

10. Очистка полифосфатов от примесей ортофосфата и пирофосфата

11. Определение фосфогидролазных активностей

12. Ультратонкие срезы

13. Аналитические методы 50 13.1. Определение общего фосфора 50 13.2 Определение ортофосфата

13.3. Определение пирофосфата

13.4. Определение элементного состава водонерастворимых осадков

13.5. Определение белка

13.6. Определение ДНК

Часть 3. Результаты исследования и их обсуждение

3.1. Поглощение фосфата клетками галофильных архей Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum и галотолерантной эубактерии Brevibacterium antiquum

3.1.1. Поглощение фосфата галофильными археями Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum

3.1.2. Влияние концентрации Р, на рост галофильных архей Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum

3.1.3. Поглощение Р, галотолерантной эубактерией Brevibacterium antiquum

3.1.4. Влияние концентрации Р, на рост галотолерантной эубактерии Brevibacterium antiquum в среде с нормальной и повышенной соленостью

3.2. Влияние некоторых эффекторов на проиесс поглощения Pi галофильными археями Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum и галотолерантной эубактерией Brevibacterium antiquum

3.2.1. Влияние протонофора карбонилцианид п - (трифторметокси) фенилгидразон (ФКФ)

3.2.2. Влияние М^ и ЭДТА на поглощение Pi галотолерантной эубактерией Brevibacterium antiquum

3.3. Содержания некоторых фосфорных соединений в биомассе галофильных архей Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum и галотолерантной эубактерии Brevibacterium antiquum

3.4. Получение водонерастворимого осадка фосфата из биомассы и его анализ

3.5. Изменение морфологии клеток галофильных архей Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum и галотолерантной эубактерии Brevibacterium antiquum в процессе накопления Pi

3.6. Использование фосфата магния в качестве фосфатного резерва изучаемыми микроорганизмами при росте на РГ дефицитной среде

3.7. ПолиР и некоторые фосфогидролазы у галофильных архей Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum

3.7.1. Доказательство наличия полиР

3.7.2. Динамит содержания полиР в проиессе роста галофильных архей Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum на средах с различной начальной концентрацией Р,

3/7.3. Изменение длины цепи полиР у галофильных архей Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum в процессе роста на среде с начальной концентрацией фосфата 2,3 мМ

3.7.4. Влияние начальной концентрации Pi в среде на активность некоторых фосфогидролаз в процессе роста галофильных архей Halobacíerium salinarium и Halorubrum distributum

3.8. Влияние условий повышеной солености на полиР и экзополифосфатазную активность у галотолерантной эубактерии Brevibacterium antiquum

3.8.1. Сравнение содержания различных фракций полиР в процессе роста Brevibacterium antiquum в отсутствии и в присутствии ЗМ NaCl в среде культивирования

3.8.2. Свойства экзополифосфатазы галотолерантной эубактерии Brevibacterium antiquum

3.8.3. Влияние условий культивирования на экзополифосфатазную активность галотолерантной эубактерии Brevibacterium antiquum

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поглощение и резервирование фосфата некоторыми ахеями и бактериями"

Актуальность проблемы. Выяснение механизмов поглощения и резервирования фосфата клетками является одной из актуальных задач современной биохимии микроорганизмов. Изучение способности микроорганизмов к накоплению этого важного компонента представляет интерес с точки зрения понимания того, как происходит их приспособление к изменяющимся условиям окружающей среды, в том числе и к выживанию в средах с избыточным или недостаточным количеством фосфора.

Большой экспериментальный материал, собранный к настоящему времени, свидетельствует в пользу того, что накопление фосфора в клетках микроорганизмов в первую очередь связано с полифосфатами, полимерами ортофосфорной кислоты, которые обнаружены у многих микроорганизмов. Эти полимеры присутствуют в цитозоле, ядрах, периплазме, в вакуолях низших эукариот (Кулаев,1975; Kulaev & Vagabov,1983; Kornberg 1995, 1999; Kulaev et al., 1999; Kulaev & Kulakovskaya, 2000), а также в клеточной оболочке, мембранах и цитоплазме прокариот (Kulakovskaya & Kulaev, 1999; Kornberg, 1999).

Однако, в литературе известны и другие формы запасания фосфора клетками микроорганизмов. Например, у грибов фосфор может накапливаться в виде полимерного ортофосфата металлов (Окороков и Кулаев, 1968; Окороков и др., 1971), у некоторых бактерий роль резерва фосфата могут выполнять тейхоевые кислоты клеточной стенки (Grant, 1979), а у цианобактерий в качестве резерва обнаружено накопление ортофосфата (Гончарова и Герасименко, 1993; Тихомирова и Орлеанский, 1994; Герасименко и др., 1998). Также было показано, что некоторые бактерии, водоросли и простейшие могут накапливать пирофосфат (Vercesi et al, 1994; Vercesi & Docampo, 1996; Vercesi et al, 1997; Lu et al, 1997). Таким образом, способы накопления фосфата могут весьма существенно отличаться у микроорганизмов, стоящих на различном уровне эволюции, а также обитающих в различных природных условиях.

Кроме того, во многих случаях, когда изучается накопление фосфата

31 микроорганизмами, это делается с помощью Р-ЯМР метода, или метода рассеяния рентгеновских лучей (X-ray-dispersive method), которые, будучи весьма эффективными, для мониторинга уровня внутриклеточного фосфата, при изменении условий окружающей среды, не позволяют оценить соотношение таких форм резервирования фосфата, как ортофосфат, пирофосфат и полифосфаты. В то же время знание того, в каких формах фосфат накапливается у микроорганизмов, является весьма важным с точки зрения его последующей утилизации.

Сравнительное изучение поглощения фосфата и его накопления в клетках микроорганизмов, относящихся к различным систематическим группам, представляет интерес как с точки зрения понимания эволюционных аспектов приспособления микроорганизмов к неблагоприятным условиям среды обитания, так и с точки зрения поиска перспективных организмов для разработки биотехнологии очистки окружающей среды от избытка фосфата.

В настоящее время процесс накопления фосфата и обмен полифосфатов в наибольшей степени изучен у Escherichia coli, дрожжей и обитающих в сточных водах бактерий рода Acinetobacter. Значительное разнообразие фосфорного метаболизма у микроорганизмов делаегг актуальным расширение спектра объектов, у которых изучается эта проблема. Таким образом, изучение механизмов реализации способности к накоплению фосфата у галофильных архей и галотолерантных бактерий, совершенно не изученных в этом отношении представляется актуальным как с точки зрения сравнительной биохимии, так и в свете решения биотехнологических задач.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось сравнительное изучение особенностей поглощения и резервирования фосфата галофильными археями Halobacterium salinarium ЕТ 1001, Halorubrum distributum ВКМ В 1739 и галотолерантной эубактерией Brevi bacterium antiquum ВКМ Ac - 2118.

Были поставлены следующие задачи: Ц Изучить способность к поглощению фосфата из культуральной среды клетками Halobacterium salinarium, Halorubrum distributum и Brevibacterium antiquum в различных условиях культивирования и выяснить, является ли это поглощение энергозависимым процессом; 2± Определить, какой компонент является у данных микроорганизмов основным резервом фосфата,

3± Определить содержание полифосфатов и активность некоторых фосфогидролаз в клетках указанных культур в процессе роста и оценить возможную роль полифосфатов в резервировании фосфата;

Изучить влияние условий повышенной солености на накопление фосфата и метаболизм полифосфатов у галотолерантной эубактерии В. antiquum.

Научная новизна работы. Одним из основных результатов выполненной работы является выявление новых высокоэффективных поглотителей фосфата, которыми оказались галотолерантная эубактерия Brevibacterium antiquum, способная к росту, как в отсутствии, так и в присутствии 3 М NaCl, и галофильные археи Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum, растущие только в присутствии 3-4 М NaCl. Клетки этих прокариот поглощали свыше 90% фосфата из среды культивирования в диапазоне концентраций от 2,3 до 11,5 мМ посредством энергозависимого транспорта.

Впервые показано, что наряду с высокомолекулярными полифосфатами, фосфорным резервом у микроорганизмов могут быть водонерастворимые фосфаты, в первую очередь соли фосфата магния. Эти соли представляют собой основной резерв фосфата у галофильных архей Halobacterium salinarium, Halorubrum distributum и галотолерантной эубактерии Brevibacterium antiquum в отличие от других известных ранее микроорганизмов-накопителей фосфата, у которых основным фосфорным резервом являются неорганические полифосфаты. Накопление большого количества водонерастворимых фосфатов клетками Halobacterium salinarium, Halorubrum distributum и Brevibacierium antiquum приводит к значительным изменениям их морфологии. Накопленный резерв может составлять до 80 % от всего фосфата, поглощенного клетками и расходуется при росте в условиях недостатка фосфата в среде культивирования.

На основании того, что доля высокомолекулярных полифосфатов составляла не более 10-30 % от всего фосфата, поглощенного клетками Halobacterium salinarium, Halorubrum distributum, и тот факт, что количество этих биополимеров в общей картине распределения поглощенного фосфата снижается при увеличении начальной концентрации фосфата в среде, можно говорить о том, что неорганические полифосфаты в клетках этих микроорганизмов принимают ограниченное участие в резервирование фосфора.

Показано, что в условиях повышенной солености (3 M NaCl) у Brevibacierium antiquum наблюдаются существенные изменения в метаболизме полифосфатов: наряду с увеличением их содержания исчезает экзополифосфатазная активность, которая характерна для этой бактерии в отсутствии NaCl и сходна по своим свойствам с известными экзополифосфатазами других бактерий. Это согласуется с предположением об участии полифосфатов в преодолении солевого стресса.

Научно-практическое значение работы. В настоящее время проблема загрязнения окружающей среды избытком фосфата вследствие широкого применения фосфорных удобрений и моющих средств приобрела важное значение. Для решения этой проблемы в мировой практике широко применяется процесс микробиологического удаления фосфата из сточных вод (EBPR - "Enhanced Biological Phosphate Removal") Для понимания биохимических основ процессов очистки сточных вод и их дальнейшего усовершенствования необходим сравнительный анализ механизмов транспорта фосфата и его накопления в клетках различных микроорганизмов, а также отработка удобных экспериментальных моделей для таких исследований. Выявленные в данной работе микроорганизмы, высокоэффективные поглотители фосфата, могут служить хорошей моделью для таких исследований, а также в перспективе могут быть использованы при разработке микробиологических основ подобных процессов.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на ряде конференций: на Международном симпозиуме «Современные проблемы биохимии и биотехнологии микроорганизмов» (Пущино, 2000), на Международном симпозиуме «Сигнальные системы клеток растений» (Москва, 2001), на Международной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (Саранск, 2001), на 5ой и 6ой конференции молодых ученых «Биология - наука 21'° века» (Пущино, 2001, 2002), на 3-ем съезде Российского биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них 3 статьи.

Благодарности. Автор приносит искреннюю благодарность и признательность своим научным руководителям: член-корреспонденту РАН Игорю Степановичу Кулаеву и д.б.н. Татьяне Валентиновне Кулаковской, за постоянное внимание к работе и плодотворное обсуждение результатов. Автор глубоко признателен д.б.н. Владимиру Мамедовичу Вагабову за помощь в разработке методов экстракции полифосфатов и плодотворное обсуждение результатов. Автор благодарит коллег, совместно с которыми проводились некоторые эксперименты: к.б.н. Наталью Егоровну Сузину (лаборатория структурно-функциональной адаптации микроорганизмов ИБФМ РАН им. Г.К. Скрябина) за световые и электронно-микроскопические исследования, д.х.н. Наталью Николаевну Чудинову (ИОХН им Н С. Курнакова), к.х.н. А.Е Середу (РНЦ «КИ»), сотрудников центра инструментальных методов анализа ИБФМ РАН им. Г.К. Скрябина РАН Е В. Кашпарову, В.Я. Лысанскую, A.M. Одинокову за химические исследования фосфат-содержащих осадков. Автор также благодарит всех сотрудников отдела биохимии микроорганизмов ИБФМ РАН за содействие при выполнении работы и активное обсуждение результатов.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Смирнов, Алексей Вячеславович

Выводы

1) Особенностью фосфорного метаболизма галофильных архей Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum и галотолерантной эубактерии Brevibacterium antiquum является поглощение ими свыше 90% фосфата из среды культивирования в диапазоне концентраций от 2,3 до 11,5 мМ посредством энергозависимого транспорта. У Brevibacterium antiquum, растущей как в отсутствии, так и в присутствии 3 М NaCl, способность к поглощению и резервированию фосфата мало зависела от солености среды.

2) Впервые показано, что основной резерв фосфата у галофильных архей Halobacterium salinarium, Halorubrum distributum и галотолерантной эубактерии Brevibacterium antiquum в отличие от других известных ранее микроорганизмов, представляет собой водонерастворимые фосфаты, в которых основным катионом является магний.

3) Неорганические полифосфаты содержат не более 10-30% от всего фосфата, поглощенного клетками Halobacterium salinarium, Halorubrum distributum и Brevibacterium antiquum, причем доля этих биополимеров в общем количестве поглощенного фосфата снижается при увеличении начальной концентрации фосфата в среде. У галофильных архей максимальное содержание полифосфатов наблюдается на логарифмической стадии роста, тогда как содержание ортофосфата максимально на стационарной стадии. Перечисленные факты говорят в пользу того, что полифосфаты в клетках этих микроорганизмов принимают ограниченное участие в резервирование фосфора.

4) В условиях повышенной солености (3 М NaCl) у Brevibacterium antiquum наблюдаются существенные изменения в метаболизме полифосфатов: наряду с увеличением их содержания исчезает экзополифосфатазная активность, которая характерна для этой бактерии в отсутствии NaCl и сходна по своим свойствам с известными экзополифосфатазами других бактерий. Это согласуется с предположением об участии полифосфатов в преодолении солевого стресса.

119

Заключение

В результате проделанной работы было показано, что изучаемые культуры являются уникальными поглотителями фосфата. Halobacterium salinarium, Halorubrum distributum и Brevibacterium antiquum были способны к концу периода культивирования накапливать 0,9, 0,5 и 0,65 ммоль Р,/г сырой биомассы, соответственно. По эффективности поглощения P¡ эти культуры сравнимы с эубактериями, выделенными из установок EBPR, такими как A. johnsonii 210 А (0,8 ммоль P¡/r сырой биомассы) (van Niel et al., 1999), представители рода Rhodocyclus (0,6 ммоль Р/г сырой биомассы) (Zilles et al., 2002) и Microlunatus phosphovorus (1,0 ммоль P¡/r сырой биомассы) (Santos et al., 1999), а также с рекомбинантными штаммами Е. coli, которые путем введения мультикопийных плазмид были специально адаптированы для повышения способности к поглощению фосфата (0,4 ммоль Pi/r сырой биомассы) (Kato et al., 1993).

В данной работе, у высокоэффективных поглотителей P¡, каковыми оказались галофильные археи Н. salinarium и Н. distributum, а также галотолерантная эубактерия В. antiquum, впервые изученные в этом отношении, обнаружено накопление фосфата в виде новой формы - неорганического фосфата магния. Следует отметить, что изучаемые микроорганизмы относятся к разным доменам - архей и эубактерий, что свидетельствует в пользу того, что данный способ резервирования фосфата очень древний и может быть распространен у микроорганизмов стоящих на разных стадия эволюционного развития. Способность образования данного резерва не может быть соотнесена с такими свойствами культур, как галофильность и галотолерантность, так как на примере В. antiquum показано, что как поглощение P¡, так и запасание фосфата магния происходит как в отсутствии, так и в присутствии ЗМ NaCl.

Особенностью изучаемых культур является резервирование P¡ в виде водонерастворимых фосфатов, в которых основным катионом является магний.

В отличие от полиР создание такого резерва клеткой требует значительно меньше энергии, чем накопление полиР, так как не сопровождается образованием макроэргических связей и энергия тратится только на поглощение Pi. Не исключено, что такой способ резервирования может быть свойственным для микроорганизмов, обитающих в средах с недостаточным обеспечением энергией. Ранее было показано, что в активированных илах поглощенный Pj может аккумулироваться либо преимущественно в виде ортофосфата, либо в виде полиР в зависимости от состава сточных вод (Imai et al., 1988; Rickard & McCIintock, 1992; Roske et al., 1995; Schonborn et al., 2001).

Следует отметить, что в большинстве работ, где изучалось накопление Pi рядом прокариот, в том числе и в виде метахроматических гранул (Seufferheld et al., 2003), применялись такие методы, как рентгеноструктурный анализ, ЯМР и электронная микроскопия, которые не позволяли оценить количественное соотношение в содержании полиР и ортофосфата в указнных гранулах. Кроме того, как уже говорилось в обзоре литературы, у цианобактерий наблюдалось накопление нерастворимых фосфатов в виде минеральных чехлов (Гончарова и Герасименко, 1993; Тихомирова и Орлеанский, 1994; Герасименко и др., 1998). Поэтому, нельзя исключить, что обнаруженный в данной работе способ резервирования является достаточно распространенным.

Хотелось бы отметить тот факт, что у Н. salinarium, Н. distributum накопление Pj в виде его нерастворимой соли хотя и является неблагоприятным фактором для жизнедеятельности отдельных клеток, однако может быть полезным для выживания популяции в целом при дальнейшем существовании на Р,-дефицитной среде.

Несмотря на то, что среди функций полиР у этих микроорганизмов резервная функция не является определяющей, их клетки содержат данные биополимеры в значительном количестве. Сходные количества полиР обнаружены у Corynebacterium xerosis и Staphylococcus albus (Kulaev, 1979), а также у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Kluyveromyces marxianus (Schuddemat et al., 1989). У дрожжей содержится от 11 до 240 мкмоль Р/г сырой биомассы полиР в пересчете на лабильный фосфор (Kulaev, 1979; Вагабов и др., 2000). Особенно следует отметить увеличение содержания полиР в клетках В. antiquum при повышенной солености. Возможно, полиР обладают свойством осмопротекторов и увеличивают способность В. antiquum к выживанию при повышенной солености (Shiba et al., 1997; Blum et al., 1997; Kornberg, 1995, 1999; Tsutsumi et al., 2000; Шиба и др., 2000).

Вопрос о наличие и свойствах ферментов метаболизма полиР у архей несомненно представляет интерес с точки зрения эволюционной биохимии и требует дальнейших исследований.

Таким образом, изучение особенностей резервирования Pj у таких совершенно неизученных объектов как галофильные археи Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum, а также галотолерантная эубактерия Brevibacterium antiquum, позволило с одной стороны обнаружить новую форму резервирования фосфата, а с другой стороны изучить особенности метаболизма полиР в условиях повышенной солености, что открывает новые возможности для понимания функций этих биополимеров.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Смирнов, Алексей Вячеславович, Пущино

1. Андреева H.A., Кулаковская Т.В., Кулаев И.С. (2000). Неорганические полифосфаты и фосфогидролазы Halobacterium salinarium. Микробиология 69:4: 499-505.

2. Аристовская Т.В. (1980). Микробиология процессов почвообразования. Л.: Наука, 188 с.

3. Афанасьева Т.П., Кулаев И.С., Мансурова С.Э., Поляков В.Ю. (1968).

4. Нуклеотиды и другие фосфорные соединения митохондрий дрожжей Endomyces magnusii. Биохимия. 33:6: 1245-53.

5. Батурин Г.Н. (1978). Фосфориты на дне океана. М.: Наука. 232 с.

6. Белозерский А.Н. (1945). О химической природе волютина. Микробиология. 14: 2933.

7. Бушинский Г.И. (1952). Апатит, фосфорит, вивианит. М.: Изд-во АН СССР, 102 с.

8. Буяновская A.A. (1977). Проблема антропогенного эвтрофирования в Академии наук СССР // Антропогенное эвтрофирование природных вод. Черноголовка: ОИХФ АН СССР, 1: 7-12

9. Вагабов В.М., Трилисенко Л.В., Щипанова И.Н., Сибельдина Л.А., Кулаев И.С. (1998). Изменение длины цепи неорганических полифосфатов в зависимости от стадии роста Saccharomyces cerevisiae. Микробиология. 67:2: 188-93.

10. Вагабов В.М., Трилисенко JI.B., Кулаев И.С. (2000). Зависимость длины цепи неорганических полифосфатов от содержания ортофосфата в среде у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Биохимия. 65:3: 414-20

11. Гавриш Е.Ю. (2002). Хемотаксономические критерии дифференциации таксонов корине- и нокардиоформных актиномицетов: Автореф. дис. канд. биол. наук, Пущино.

12. Геллер И.Т. (1971). Мобилизация нерастворимых минеральных соединений фосфора почвенными микроорганизмами: Автореф. дис. канд. биол. наук. М.: ТСХА, 17 с.

13. Герасименко Л.М., Гончарова И.В., Зайцева J1.B. (1998). Влияние содержания фосфора в среде на рост и минерализацию цианобактерий. Микробиология. 67:2: 24954.

14. Гончарова И.В. и Герасименко JI.M. (1993). Динамика потребления неорганического фосфора клетками Microcoleus chthonoplastes. Микробиология. 62:6: 1048-55.

15. Гордеев В.В. (1983). Речной сток в океан и черты его геохимии. М.: Наука, 160 с.

16. Гулбрандсен Р. А. и Роберсон Ч.Е. (1977). Неорганический фосфор в морской воде // Фосфор в окружающей среде. М.: Мир, С. 119-25.

17. Денисова А.И. (1977). Роль азота и фосфора в эвтрофикации Днепра в условиях зарегулирования стока // Антропогенное эвтрофирование природных вод. Черноголовка: ОИХФ АН СССР, 1: 119-25

18. Илялетдинов А.Н. (1966). Биологическая мобилизация минеральных соединений. Алма-Ата: Наука, 332 с.

19. Казаков A.B. (1950). Фторапатитовая система равновесий в условиях образования осадочных пород. Тр. Ин-тагеол. наук М., 114:4: 1-21.

20. Кислинг Дж.Д., Вэн Дайен С. Дж., Трелстэд П., Ренниджер Н., МакМахон К. (2000). Метаболизм полифосфатов и проблемы биотехнологии и защиты окружающей среды. Биохимия. 65:3: 385-94.

21. Кокурина H.A., Кулаев И.С., Белозерский А.Н. (1961). Изучение фосфорных соединений у некоторых видов актиномицетов. Микробиология. 30:1: 15-21.

22. Кортсти Г., Аппельдорн JL, Бонтинг К.Ф.С., Ван Нил Дж., Ван Вин Х.Дж. (2000). Биохимия и экология усовершенствованного биологического удаления фосфора. Биохимия 65:3: 394-405.

23. Костлан Н.В. (1972). Характеристика фосфорных соединений сине-зеленых водорослей в зависимости от условий питания // Регуляция биохимических процессов у микроорганизмов. Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, С. 74-6.

24. Корбридж Д. (1982). Фосфор: Основы химии, биохимии, технологии. М.:Мир. 680 с.

25. Крицкий М.С., Чернышева Е., Кулаев И.С. (1970). О корреляции накопления некоторых фракций неорганических полифосфатов и РНК у Ыеигоьрога сганиа Ас! 28610. Докл. АН СССР. 192:5: 1166-9.

26. Крашенинников И.А., Кулаев И.С., Коношеико Г.И., Бирюзова В.И. (1968). Изучение фосфорных соединений митохондрий Ыеигоярога сгаыьа. Биохимия. 33:4: 800-8.

27. Кудеярова А.Ю. (1993). Педогеохимия орто- и полифосфатов в условиях применения удобрений. М.: Наука. 240 с.

28. Кудеярова А.Ю. (1995). Фосфатогенная трансформация почв. М.:Наука. 288 с

29. Кулаев И.С., Крицкий М.С., Белозерский А.Н. (1960). Обмен полифосфатов и некоторых других фосфорных соединений в процессе развития плодовых тел ш&мпинъона Agaricus Ыsporus. Биохимия. 25:4: 735-48.

30. Кулаев И.С. и Вагабов В.М. (1967). Влияние условий выращивания на обмен неорганических полифосфатов и некоторых других фосфорных соединений у Scenedesmus оЪИцииъ. Биохимия. 32:2: 253-60.

31. Кулаев И.С. (1975). Биохимия высокомолекулярных полифосфатов. М.: МГУ, 248 с.

32. Кулаев И.С., Крашенинников И.А., Кокурина Н.К. (1966). О локализации неорганических полифосфатов и нуклеотидов в мицелии Меигоьрога сгаяяа. Биохимия. 31:4: 850-9.

33. Кулаев И.С., Афанасьева Т.П., Беликова М.П. (1967). О локализации неорганических полифосфатов и нуклеозидполифосфатов в в клетках дрожжей Епдотусех та^пихи. Биохимия. 32:3: 539-46.

34. Кулаев И.С., Шади А., Мансурова С.Э. (1974). Полифосфаты у Pénicillium chrysogenum при различных условиях выращивания. Биохимия. 39: 197-205.

35. Курода А., Отаке X. (2000). Молекулярный анализ накопления полифосфатов у бактерий. Биохимия. 65:3: 362-8.

36. Личко Л.П. (1980). Компартментация неорганических ионов и регуляция их уровня в цитоплазме эукариотических микроорганизмов: Автореф. дис. канд. биол. наук, Пущино.

37. Маниатис Т., Фрич Э., Самбрук Дж. (1984). Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир. 480 с.

38. Мартынова М.В. (1984). Азот и фосфор в донных отложениях озер и водохранилищ. М. Наука, 160 с.

39. Мино Т. (2000). Селекция полифосфат-аккумулирующих бактерий для усовершенствованного биологического удаления фосфата в активированных илах при технологических процессах удаления сточных вод. Биохимия. 65:3: 405-14.

40. Мишустин Е.Н., Геллер И.Т., Синха М. (1972). Мобилизация минеральных фосфатов почвы и удобрений в процессе жизнедеятельности микроорганизмов. Изв. ТСХА 4: 116-21.

41. Муромцев Г.С., Маршунова Г.Н., Павлова В.Ф. (1983). Почвенная микрофлора и фосфорное питание растений. Жури. Всесоюз. хим. о-ва. им. Д.И. Менделеева 28:4: 22-7.

42. Наумова И.Б., Шашков А.С., Строганова М.П. (1978). Тейхоевая кислота из клеточной стенки Streptomyces kanamyceticus RI А 690 и применение спектроскопии13

43. С-ЯМР для локализации фосфодиэфирной связи в цепи. Биоорг. хим. 4:11: 1529-37.

44. Наумова И.Б. (1979). Тейхоевые кислоты грамположительных бактерий (структура, локализация, биосинтез). Усп. биол. хим. 20: 128-51.

45. Несмеянова М.А., Дмитриев А., Кулаев И.С. (1973). Высокомолекулярные полифосфаты и ферменты полифосфатного обмена в процессе роста культуры Escherichia coli. Микробиология. 42:2: 213-9.

46. Несмеянова М.А., Дмитриев А., Кулаев И.С. (1974а). Регуляция экзогенным ортофосфатом ферментов фосфорного обмена и уровня полифосфатов у Escherichia coli К-12. Микробиология. 43:2: 227-34.

47. Несмеянова М.А., Гонина С. А., Северин А.И., Кулаев И.С. (19746). Метаболическая регуляция некоторых фосфогидролаз у Escherichia coli. Микробиология. 43:6: 955-60.

48. Несмеянова М.А. (2000). Полифосфаты и ферменты полифосфатного обмена у Escherichia coli. Биохимия. 65:3: 368-74

49. Окороков JI.A. и Кулаев И.С. (1968). Полимерный ортофосфат железа в мицелии Pénicillium chrysogenum Q-176. Биохимия. 33:4: 667-79.

50. Окороков JI.A., Холоденко В.П., Кулаев И.С. (1971). Новое соединение -полимерный ортофосфат железа у различных грибов. Докл. АН СССР. 199:5: 1204-5.

51. Окороков Л.А., Перов Н., Кулаев И.С. (1973а). О локализации полимерного ортофосфата у Pénicillium chrysogenum. Цитология. 15: 481-5.

52. Окороков Л.А., Холоденко В.П., Кулаев И.С. (19736). Обнаружение полимерных ортофосфатов кальция, магния и марганца у Pénicillium chrysogenum. Докл. АН СССР. 209:3: 735-7

53. Плакунов В.К. и Кокоева М.В. (1994). Осмостабилизация клеток галобактерий и получение их сухой биомассы, не содержащей солей. Микробиология. 63:4: 597-60.

54. Продан Е.А., Продан Л.И., Ермоленко Е. Ф. (1969). Триполифосфаты и их применение. Минск: Наука и техника, 536 с.

55. Рябчикова A.M. (1980). Круговорот вещества в природе и его изменение хозяйственной деятельностью человека. М.: МГУ, 272 с.

56. Савенко В.С. (1988). Процессы формирования фосфоритовых и железо-марганцевых конкреций в современных водоемах: Автореф. дис. докт. геол.-минерал, наук, Москва.

57. Скопинцев Б.А. (1985). Гумус вод Мирового океана и почв Земли // Геохимия природных вод. Л.: Гидрометеоиздат. С. 180-90.

58. Скулачев В.П. (1989). Энергетика биологических мембран. М.: Наука. С. 155-75.

59. Тихомирова Н.Н. и Орлеанский В.К. (1994). Моделирование фосфатоосаждения в лабораторных культурах. Литология и полез, ископаемые. 2: 135-40.

60. Шиба Т., Цуцуми К., Ишиге К., Ногучи Т. (2000). Неорганические полифосфаты и полифосфаткиназа :новые биологические функции и применение. Биохимия. 65:3: 375-85.

61. Ahn К. & Kornberg А. (1990). Polyphosphate kinase from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 265: 11734-9.

62. Akiyama M., Crooke E. & Kornberg A. (1993). An exopolyphosphatase of Escherichia coli. The enzyme and its ppx gene in a polyphosphate operon./. Biol. Chem. 268: 633-9.

63. Allen M.M. (1984). Cyanobacterial cell inclusions. Ann. Rev. Microbiol. 38:1-25.

64. Andreeva N.A. & Okorokov L.A. (1993). Purification and characterization of highly active and stable polyphosphatase from Saccharomyces cerevisiae cell envelope. Yeast. 9: 127-39.

65. Antibus R.K., & Linkins A.E. (1992). Effects of liming a red pine forest floor on mycorrhizal numbers and mycorrhizal and soil acid phosphatase activities. Soil Biol. Biochem. 24: 479-87.

66. Appeldoorn K.J., Boom A.J., Kortstee G.J.J. & Zehnder A.J.B. (1992). Contribution of precipitated phosphates and acid-soluble polyphosphate to enhanced biological phosphate removal. Water Res. 26: 937-43.

67. Armstrong J.J., Baddiley J., Buchanan J.G., Carss B. & Greenberg G.R. (1958).1.olation and structure of ribitol phosphate derivatives (teichoic acids) from bacterial cell walls./. Chem. Soc. 1958: 3444-54.

68. Ashford A.E., Vesk P.A., Orlovich D.A., Markovina A.L. & Allaway W.G. (1999).

69. Dispersed polyphosphate in fungal vacuoles in Eucalyptus pilularis/Pisolithus tinclorius ectomycorrhizas. Fungal Genet. Biol. 28:1: 21-33.

70. Atkinson B.W., Mudaly D.D. & Bux F. (2001). Contribution of Pseudomonas spp. To phosphorus uptake in the anoxic zone of an anaerobic-anoxic-aerobic contribution activated sludge system. Water Sci. Technol. 43:1: 139-46.

71. Avnimelech Y. (1984). Behavior of phosphates in the unsaturated zone // Pollutants in porous media: The unsaturated zone between soil surface and groundwater. B.: Springer, P. 68-78.

72. Baltscheffsky M. (1967a). Inorganic pyrophosphate and ATP energy donors in chromatophores from Rhodospir ilium ruhrum. Nature. 216: 241-6.

73. Baltscheffsky M. (1967b). Inorganic pyrophosphate as an energy donor in photosynthetic and respiratory electron transport phosphorylation systems. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28: 270-5.

74. Baltscheffsky M. & Baltscheffsky H. (1992). Inorganic pyrophosphate and inorganic pyrophosphatase. // In Molecular mechanisms in bioenergetics. Ernster L. (ed). Amsterdam: Elsevier. P. 331-48.

75. Bardin S.D. & Finan T.M. (1998). Regulation of phosphate assimilation in Rhizobium (Sinorhizobium) melitoli. Genetics. 148: 1689-700.

76. Barak Y. & R»jn J. (2000). Relationship between nitrite reduction and active phosphate uptake in the phosphate-accumulating denitrifier Pseudomonas sp. strain JR 12. Appl. Env. Microbiol. 66:12: 5236-40.

77. Bark K., Kampfer P., Sponner A. & Dott W. (1993). Polyphosphate-dependent enzymes in some coryneform bacteria isolated from sewage sludge. FEMS Microbiol. Lett. 107: 133-8.

78. Barnard J. L. (1975). Biological nutrient removal without the addition of chemicals. Water Res. 9: 485-90.

79. Becham A.M., Seviour R.J., Lindrea K.C. & Livingstone L (1990). Genospecies diversity of Acinetobacter isolates obtained from a biological nutrient removal pilot plant of modified UCT configuration. Water Res. 24: 23-9.

80. Bensadoun A. & Weinstein D. (1976). Assay of proteins in the presence of interfering materials. Anal. Biochem. 70: 241-50.

81. Berger E.A. (1973) Different mechanisms of energy coupling for the active transport of proline and gluthamine in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 70: 1514-8.

82. BodeG., Mauch F., Ditschuneit H. & Malfertheiner P. (1993). Identification of structures containing polyphosphate in Helicobacter pylori. J. Gen. Microbiol. 139: 302933.

83. Bolan N.S. (1991). A critical review on the role of mycorrhizal fungi in the uptake of phosphorus by plants. Plant and Soil. 134: 189-207.

84. Bonting C.F., Korstee G.J. & ZehnderA.J. (1991). Properties of polyphosphate:AMP phosphotransferase of Acinetobacter strain 210A. J. Bacteriol. 173: 6484-8.

85. Bonting C.F., Korstee G.J. & Zehnder A.J. (1993). Properties of polyphosphatese of Acinetobacter strain 21 OA. Antonie van Leeuwenhoek. 64: 75-81.

86. Blum E., Py B., Carpousis A.J. & Higgins C.F. (1997). Polyphosphate kinase is a component of the Escherichia coli RNA degradosome. Mol. Microbiol. 26: 387-98.

87. Buchan L. (1981). The location and nature of accumulated phosphorus in seven sludges from activated sludge plants, which exhibited enhanced phosphorus removal. Water SA. 7: 1-7.

88. Carr E., Ward A., Gurtler V. & Seviour R.J. (2001). Pyrolysis mass spectrometry (PyMS) and 16S-23S rDNA spacer region fingerprinting suggests the presence of novel acinetobacters in activated sludge. Syst. Appl. Microbiol. 24: 430-42.

89. Carr E.L., Kampfer P., Patel B.K.C., Gurtler V. & Seviour R.J. (2003). Seven novel species of Acinetobacter isolated from activated sludge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol, in press.

90. Cardona S.T., Chavez F.P. & Jerez C.A. (2002). The exopolyphosphatase gene from Sulfolobus solfatarius: characterization of the first gene found to be involved in polyphosphate metabolism in Archaea. Appl. Envir. Microbiol. 68: 4812-9.

91. Castuma C.E., Huang R., Romberg A. & Reusch RN. (1995). Inorganic polyphosphates in the acquisition of competence in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 270:12980-3.

92. Cohen J.M., Rourke G.A. & Woodward R.L. (1959). Ferric sulfate coagulation in the presence of synthetic detergents. J. Amer. Water Works Assoc. 51:10: 1255-67.

93. Condron L.M. & Goh K.M. (1989). Molecular weight distribution of soil organic phosphorus under irrigated pasture in New Zealand. J. Soil Sc. 40: 873-8.

94. De Boer W.R, Kruyssen F.J., Wouters J.T.M. & Kruk C. (1976). The structure of teichoic acid from Bacillus subtilis var.niger WM as detected 13C nuclear-magnetic-resonance spectroscopy. Eur. J. Biochem. 61:1: 1-6.

95. Deinema M.H., van Loosdrecht M. & Scholten A. (1985). Some physiological characteristics of Acinetobacter spp. accumulating large amounts of phosphate. Wat. Sci. Technol. 17: 119-25.

96. Ebel J.P. (1948). Sur le dosage des metaphosphates dans les microorganismes par hydrolyse différentielle technique et application aux levures. C.R. Acad. Sci. 226: 2184-86.

97. Ebel J.P. (1952). Recherchers sur les polyphosphates contenus dans diverses cellules vivantes. 3. Localisation cytologique et role physiologique des polyphosphates dans la cellule vivante. Bull. Soc. Chim. Biol. 34: 498-505

98. Ebel J.P., Colas J & Muller S. (1958). Recherchers cytochimique sur les polyphosphates contenus inorganiques contenus dans les organismes vivants. 3. Presense de polyphosphates chez divers organisms inferierus. Exp. Cell. Res. 15: 36-44.

99. Ehrenberg M. (1961). Der phosphorstoffwechsel von intra- und extracellularer phosphatkonsentration. Arch. Microbiol. 40: 126-33.

100. Ehrlich H.L. (1964). Microbial transformations of minerals II Principles and applications in aquatic microbiology. N. Y., P. 43-57.

101. Fabig B., Vielhauer K., Moawad A.M. & Achtnich W. (1989). Gas-chromatographic separation of organic acids and electrophoretic determination of phosphatases from VA mycorryzal roots. Z Pjlanzenernahr. Bodenk. 152: 261-5.

102. Fares F., Fardeau J.C. & Jacquin F. (1974). Etude quantitative du phosphore organique dans différents types des sols. Phosphore et Agriculture. 63: 25-41.

103. Frink C.R. (1969). Chemical and mineralogical characteristics of eutrophic lake sediments. Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 33:3: 369-72.

104. Frossard E., Brossard M., Hedley M.J. & Metherell A. (1995). Reactions controlling the cycling of P in soils. Tiessen (ed): Phosphorus in the global environment. John Wiley & Sons. 107-39.

105. Fuhs G.W. & Chen M. (1975). Microbiological basis of phosphate removal in the activated sludge process for the treatment of wastewater. Microb. Ecol. 2: 119-38.

106. Geissdorfer W., Ratajczak G. & Hillen W. (1998). Transcription of ppk from Acinetobacter sp. strain ADP1, encoding a putative polyphosphate kinase, is induced by phosphate starvation. Appt. Environ. Microbiol. 64: 896-901.

107. Gianinazzi S. (1991). Vesicular-arbuscular (endo-) mycorrhizas: cellular, biochemical and genetic aspects. Agric. Ecosys. And Envir. 35: 105-19.

108. Golterman H.L. (1973). Vertical movement of phosphate in freshwater // Environmental phosphorus handbook. N. Y : Wiley, P. 509-38.

109. Grant W.D. (1979). Cell wall teichoic acid as a reserve phosphate source in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 137:1: 35-43.

110. Griffith E.J. (1977). Condensed phosphates from abiotic systems in nature // Chemical evolution of the Early Precambrian. N. Y.: Acad, press, P. 61-67.

111. Groenestijn J.W., Zuidema M., van der Worp J.J.M., Deinema M.H. & Zehnder A.J.B. (1989). Influence of environmental parameters on polyphosphate accumulation in Acinetobacter sp. Antonie van Leeuwenhoek. 55: 67-82.

112. Halmann M. (1972). The role of phosphorus in the world // Analytical chemistry of phosphorus compounds. N. Y.: Wiley, P. 1-7.

113. Hammer U.T. (1964). The succession of "bloom" species of blue-green algae and some causal factors. Verh. Intern. Verein. Limnol. 15: 829-36.

114. Hardoyo, Yamada K., Shinjo H., Kato J. & Ohtake H. (1994). Production and release of polyphosphate by a genetically engineered strain of Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 60: 3485-90.

115. Harold F.M. (1966). Inorganic polyphosphates in biology: structure, metabolism, and functions. Bacteriol. Rev. 30: 772-85.

116. Harrison A.F. (1987). Soil organic phosphorus. A review of world literature. CAB international, Oxon, UK, 257 pp.

117. Hensgens C.M., Santos H., Zhang C., Kruizinga W.H. & Hansen T.A. (1996). Electron-dense granules in Desulfovibrio gigas do not consist of inorganic triphosphate but of a glucose pentakis(diphosphate). Eur. J. Biochem. 242: 327-31.

118. Hesse P.R. (1973). Phosphorus in lake sediments // Environmental phosphorus handbook N. Y.: Wiley, P. 573-583.

119. Hesselmann R.P.X., von Rummel R., Resnick S.M., Hany R. & Zehnder A.J.B. (2000). Anaerobic metabolism of bacteria performing enhanced biological phosphorus removal. Water Res. 34: 3487-94

120. Hollender J., Dreyer U, Kornberger L, Kampfer P & Dott W. (2002). Selective enrichment and characterization of a phosphorus-removing bacterial consortium from activated sludge. Appl. Microbiol. Biotechnol. 58:1: 106-11.

121. Holtje J.V. & Tomasz A. (1974). Teichoic acid phosphorylcholine esterase. J. Biol. Chem. 249: 7031-4.

122. Hooper F.F. (1973). Origin and fate of organic phosphorus compounds in aquatic system // Environmental phosphorus handbook. N. Y.: Wiley, P. 179-202.

123. Imai H., Endoh K. & Kozuka K. (1988). Magnesium requirement for biological removal of phosphate by activated sludge. J. Ferment. Technol. 66: 657-66.

124. Iwata S., Tochikubo K., Kato K., Hirata T., Kotani S. & Yagi K. (1976). Microorganism capable of decomposing N-acetylglucosaminyl ribitol teichoic acid of Staphylococcus aureus. Jpn. J. Microbiol. 20: 123-9.

125. Jensen T.E. & Sicko L.M. (1974). Phosphate metabolism in blue-green algae. I. Fine structure of the "polyphosphate overplus" phenomenon in Plectonema boryanum. Can. J. Microbiol. 20:9:1235-9.

126. Jensen T.E., Sicko L.M. & Ayala R.P. (1977). Phosphate metabolism in blue-green algae. III. The effect of fixation and post-staining on the morphology of polyphosphate bodies in Plectonema boryanum. Cytologia (Tokyo). 42:2: 357-9.

127. Kampfer P., Bark K., Busse H.J., Auling G. & Dott W. (1992). Numerical and chemotaxonomy of polyphosphate accumulating Acinetobacter strains with high polyphosphate: AMP phosphotransferase (PPAT) activity. Syst. Appl. Microbiol. 15: 40919.

128. Kato J., YamadaK., Muramatsu A., Hardoyo. & Ohtake H. (1993). Genetic improvement of Escherichia coli for enhanced biological removal of phosphate from wastewater. Appl. Environ. Microbiol. 59: 3744-9.

129. Keister D.I & Yike N.J. (1966). Studies on an energy-linked pyridine nucleotide trashydrogenase in photosynthetic bacteria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 24: 510-5.

130. Keister D.I & Yike N.J. (1967). Energy-linked reactions in photosynthetic bacteria. Biochemistry. 6: 3847-54.

131. Kerr P.c., Brockway D.L., Paris D.F. & Barnett J.Y. (1972). The interrelation of carbon and phosphorus in regulating heterotrophic and autotrophic population in an aquatic ecosystem. Nutr. and Eutroph. Spec. Symp. 1: 41-62.

132. Kim M.H., Hao O.J. & Wang N.S. (1997). Acinetobacter isolates from different activated sludge processes: characterisrics and neural network identification. FEMS Microbiol. Ecol. 23: 217-27.

133. Kornberg A., Kornberg S., Simms E. (1956). Methaphosphate synthesis by enzyme from Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta. 20: 215-27.

134. Kornberg A. (1995). Inorganic polyphosphate, toward making a forgotten polymer unforgottable. J. Bacteriol. 117: 491-6.

135. Kornberg A., Rao N.N. & Ault-Rich D. (1999). Inorganic Polyphosphate: a molecule with many functions. Ann Rev Biochem. 68: 89-125.

136. Kortstee G.J.J., Appeldoorn K.J., Bonting C.F.C., van Niel E.W.J. & van Veen H.J. (2000). Ecological aspects of biological phosphorus removal in activated sludge systems. Adv. Microb. Ecol. 16: 169-200.

137. Kulaev I.S. (1979). The biochemistry of inorganic polyphosphates. // New York: Wiley.

138. Kulaev I.S. & Vagabov V.M. (1983). Polyphosphate metabolism in microorganisms. Adv. Microbiol. Physiol. 24: 83-171.

139. Kulaev I.S., Vagabov V.M. & Kulakovskaya T.V. (1999). New aspects of inorganic polyphosphate metabolism and function. J. Bioscience andBioengineering. 88:2:111-30.

140. Kulaev I.S. & Kulakovskaya T.V. (2000). Polyphosphate and phosphate pump. Ann. Rev. Microbiol. 54: 709-34.

141. Kumble K.D. & Kornberg A. (1995) Inorganic polyphosphate in mammalian cells and tissues.J. Biol. Chem. 270: 5818-22.

142. Kuroda A. & Kornberg A. (1997). Polyphosphate kinase as a nucleoside diphosphate kinase in Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natnl. Acad. Sei. USA. 94: 439-42.

143. Labarca C. & Paigen K. (1980). A simple rapid and sensitive DNA assay procedure. Anal. Biochem. 102: 344-52.

144. Langen P. & Liss E. (1958). Uber den Polyphosphates der Hefe. Naturwisseschaf ten. 45: 191-7.

145. Lapeyrie F., Picatto C., Gerard J. & Dexheimer J. (1990). T.E.M study of intracellular and extracellular calcium oxalate accumulation by ectomycorrhizal fungi in pure culture or in association with Eucalyptus seedlings. Symbiosis. 9: 163-6.

146. Lapeyrie F., Ranger J. & Vairelles D. (1991). Phosphate solubilizing activity of ectomycorrhizal in vitro. Can. J. Bot. 69: 342-6.

147. Li X-L., George E. & Marschner H. (1991). Phosphorus depletion and pH decrease at the root-soil and hyphae-soil interfaces of VA mycorrhizal white clover fertilized with ammonium. New Phytol. 119: 397-404.

148. Lichko L.P. & Kulakovskaya T.V., Kulaev I.S. (2002). Two exopolyphosphatases of Microlunatus phosphovorus, a polyphosphate-accumulating eubacterium from activated sludge. Proc. Biochem. 37: 799-803.

149. Lieberman L. (1888). Uber das Nuclein der Hefe und Kunstliche Darstellung eines Nucleus Eiweiss und Metaphosphatsaure. Ber. Chem-Ges. 22: 598-607.

150. Liss E. & Langen P. (1959). Versuche zur polyphosphate-uberkompensation in hefezellen nach phosphatverarmung. Arch. Mikrobiol. 41: 383-8.

151. Lohmann K. & Langen P. (1956). Untersuchungen an den kondensierten phosphaten der hefe. Biochem. Z. 328: 1-7.

152. Lohmann K. (1956). Untersuchungen an den kondensierten Phosphaten der Hefe. Biochem. Z. 328: 1-11.

153. Loughman B.C. (1978). Metabolie factors and the utilization of phosphorus by plants // Phosphorus in the environment: Its chemistry and biochemistry. Amsterdam: Elsevier, P. 155-74.

154. Lotter L.H. & Murphy M. (1985). The identification of heterotrophic bacteria in activated sludge with particular reference to polyphosphate accumulation. Water SA. 11: 179-84.

155. Lowry O.H., Rosehrough A., Farr A. & Randall J. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-75.

156. Lu H.G., Zhong L., Chang K.P. & Docampo R. (1997). Ca2" storage by acidocalcisomes from Leishmania amazonensis. J. Biol. Chem. 272: 9464-73.

157. McGrath J.W. & Quinn J.P. (2000). Intracellular accumulation of polyphosphate by the yeast Candidi humicola G-l in response to acid pH. Appl. Environ. Microbiol. 66:9: 406873.

158. Mackenthun K.M. (1973). Eutrophication and biological associations // Environmental phosphorus handbook. N. Y.: Wiley, P. 613-32.

159. Madigan M.T., Martinko J.M. & Parker J. (1997). Brock biology of microorganisms // Upper Saddle River, New Jersey: Simon and Schuster / A Viacom Company.

160. Mandl L, Grauer A. & Neuberg C. (1952). Solubilization of insoluble matter in nature. 1. The part played by salts of adenosinetriphosphate. Biochim. Biophys. Acta. 8:6: 654-63.

161. Marchesini N., Ruiz F.A., Vieira M. & Docampo R. (2002). Acidocalcisomes are functionally linked to the contractile vacuole of Dicstyostelium discoideum. J. Biol. Chem. 277:10: 8146-53.

162. Mino T., Kawakami T. & Matsuo T. (1984). Location of phosphorus in activated sludge and function of intracellular polyphosphates in biological phosphorus removal process. Water Sci. Technol. 17: 93-106.

163. Mino T., Kawakami T. & Matsuo T. (1985). Behaviour of intracellular polyphosphates in the biological phosphorus removal process. Water Sci. Technol. 17: 11-21.

164. Mino T., van Loosdrecht M.C.M. & Heijnen J.J. (1998). Microbiology and biochemistry of the enhanced biological phosphate removal process. Water Res. 32: 3193207.

165. Naumova I.B., Yanushkene N.A., Streshinskaya G.M. & Shashkov A.S. (1990). Cell wall anionic polymers and peptidoglycan of Actinoplanes philippinensis VKM Ac-547. Arch. Microbiol. 154: 483-8.

166. Ohtake H., Yamada K., Hardoyo, Muraniatsu A., Anbe Y., Kato J. «& Shinjo H. (1994). Genetic approach to enhanced biological phosphorus removal. Wat. Sci. Technol. 30: 185-92.

167. Olsen S. (1967). Recent trends in the determination of orthophosphate in water. In: Golterman H. L., Clymo R. S. (Eds). Chemical environment in the aquatic habitat. Amsterdam: NV Noord-Hollandische Uitgevers Maatschappij, P. 63-105.

168. Ramesh C., Chellappan P. & Mahadevan A. (2000). X-ray microanalysis of elements of VA mycorrhizal and non-mycorrizal Pennisetum pedicellatum roots. Indian J. Exp. Biol. 38:4: 396-8.

169. Rao N.N, Roberts M.F & Torriani-Gorini A. (1985). Amount and chain length of polyphosphates in Escherichia coli depend on cell growth conditions. J Bacteriol. 162: 242-7.

170. Rea P.A. & Poole R.J. (1993). Vacuolar H1- translocating pyrophosphatase. Ann. Rev. Plant. Physiol. Plant. Mol. Biol. 44: 157-80.

171. Reynolds E.S. (1963). The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J. Cell. Biol. 17: 208-13.

172. Reynolds C.S. & Davies P.S. (2001). Sources and bioavailability of phosphorus fractions in freshwaters: a British perspective. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 76:1: 27-64.

173. Rickard L. F. & McClintock S.A. (1992). Potassium and magnesium requirements for enhanced biological phosphorus removal from wastewater. Water Sci. Technol. 26: 2203-6.

174. Rigler F.H. (1956). A tracer study of the phosphorus cycle in lake water. Ecology 37:3: 550-62.

175. Rodrigues C.O., Ruiz F.A., Rohloff P., Scott D.A. & Moreno S.N.J. (2002).

176. Characterization of isolated acidocalcisomes from Toxoplasma gondii tachyzoites reveals a novel pool of hydrolysable polyphosphate. J. Biol. Chem. 277:50: 48650-6.

177. Roske L, Schornborn C. & Bauer H.D. (1995). Influence of the addition of different metals to an activated sludge system on the enhanced biological phosphorus removal. Int. Rev. Ges. Hydrobiol. 80: 1-17.

178. Rosenberg H. (1966). The isolation and identification of "volutin" granules from Tetrahymena. Exp. Cell. Res. 41: 397-404.

179. Rosenberg H., Gerdes R.G. & Chegwidden (1977). Two systems for the uptake of phosphate in Escherichia coli. J. Bacteriol. 131: 505-11.

180. Rosenberg H, Gerdes R.G & Harold F.M. (1979). Energy coupling to the transport of inorganic phosphate in Escherichia coli. J. Biochem. 178: 133-7.

181. Rosenberg H., Hardy C.M. & Surin B.P. (1984). Energy coupling to phosphate transport in Escherichia coli. In: Leive L, Schlessinger D (eds) Microbiology-1984. ASM, Waschington, DC, pp 50-2.

182. Rudnick H., Hendrich S., Pilatus U. & Blotevogel K-H. (1990). Phosphate accumulation and the occurrence of polyphosphates and cyclic 2,3-diphosphoglycerate in Methanosarcinafrisia. Arch. Microbiol. 154: 584-8.

183. Ruiz-Berraquero F. & Ramos-Cormenzana A. (1977). Relationship between amino acid production and phosphate-dissolving capacity of bacteria. Folia Microbiol. 22:1: 40-2.

184. Ruiz F.A., Marchesini N., SeufTerheld M., Govindjee A. & Docampo R. (2001a). The polyphosphate bodies of Chlamydomonas reinhardtii possess a proton-pumping pyrophosphatase and are similar to acidocalcisomes. J. Biol. Chem. 276:49: 46196-203.

185. Ruiz F.A., Rodriques C.O. & Docampo R. (2001b). Rapid changes in polyphosphate content within acidocalcisomes in response to cell growth, differentiation, and environmental stress in Trypanosoma cruzi. J. Biol. Chem. 276:28: 26114-21.

186. Santos M.M., Lemos P.C., Reis M.A.M. & Santos H. (1999). Clucose metabolism and kinetics of phosphorus removal by the fermentative bacterium Microlunatus phosphovorus. Appl. Ettv. Microbiol. 65:9: 3920-8.

187. Schornborn C., Bauer H.D. & Roske L (2001). Stability of enhanced biological phosphorus removal and composition of polyphosphate granules. Water Res. 35: 3190-6.

188. Schuddemat J., de Boo R., van Leeuwen C.C.M., van den Broek P.J.A. & van SteveninckJ. (1989). Polyphosphate synthesis in yeast. Biochem. Biophys. Acta. 100: 191-8.

189. Schwab S.M., Menge J.A. & Tinker P.B. (1991). Regulation of nutrient transfer between host and fungus in vesicular-arbuscular mycorrhizas. New Phytol. 117: 387-98.

190. Seufferheld M., Vieira M., Ruiz F.A., Rodriques C.O., Moreno S. & Docampo R. (2003). Identification of organelles inbacteria similar to acidocalcisomes of unicellular eukaryotes. J. Biol. Chem. in press.

191. Seviour R.J., Mino T. & Onuki M. (2003). The microbiology of biological phosphorus removal in activated sludge systems. FEMS Microb. Rev. 27: 99-127.

192. Shiba T., Tsutsumi K., Yano H., Ihara Y., Kameda A., Tanaka K., Takahashi H., Munekata M., Rao N. N. & Kornberg A. (1997). Inorganic polyphosphate and the induction of RPOS expression. Proc. Natnl. Acad. Sci. USA. 94: 11210-5.

193. Sivula T., Salminen A., Parfenyev A.N., Pohjanjoki P., Goldman A., Cooperman B.S., Bayakov A.A. & Lahti R. (1999). Evolutionary aspects of inorganic pyrophosphatase. FEBSLett. 454:2: 75-80.

194. Skorko R. (1989). Polyphosphate as a source of phosphoryl group in protein modification in archebacterium Sulfolobus acidocaldarius. Biochimie. 71: 9-10.

195. Skorko R., Osipuk J. & Stetter K.O. (1989). Glycogen-bound polyphosphate kinase from archaebacterium Sulfolobus acidocaldarius. J. Bacteriol. 171: 5162-4.

196. Smith R.S., Cohen J.M. & Walton G. (1956). Effect of synthetic detergents on water coagulation. J. Amer. Water Works Assoc. 48:1: 55-69.

197. Solaiman M.Z., Ezawa T., Kojima T. & Saito M. (1999). Polyphosphates in intraradical and extraradical hyphae of an arbuscular mycorrhizal fungus, Gigaspora margarita. Appi Environ. Microbiol. 65:12: 5604-6.

198. Solorzano L. & Strickland J.D.H. (1968). Polyphosphate in seawater. Limnol. Oceanogr. 13:3: 515-8.

199. Stante L., Cellamare C.M., Malaspina F., Bortone G. & Tiche A. (1997). Biological phosphorus removal by pure culture of Lampropedia spp. Water Res. 31: 1317-24.

200. Stewart J.W.B. & Tiessen H. (1987). Dynamics of soil organic phosphorus. Biogeochemistry. 4: 41-60.

201. Stoekckenius W. & Bogomolni R. (1979). Bacteriorodopsin and the purple membrane of halobacteria. Biochem. Biophys. 505: 215-78.

202. Stumm W. & Morgan J. (1970). Aquatic chemistry. N. Y., P. 514-63.

203. Sudo H., Yamada A., Nakamura N. & Matsunaga T. (1997). Phosphorus accumulation by a marine photosynthetic bacterium, Chromatium sp. Biotechnol. Lett. 19:8: 783-6

204. Syers J.K., Harris R.F. & Armstrong D.E. (1973). Phosphate chemistry in lake sediments. J. Environ. Qual. 2:1: 1-14.

205. Tarafdar J.C. & Claassen N. (1988). Organic phosphorus compounds as a phosphorus source for higher plants, through the activity of phosphotases produced by plant roots and nicroorganisms. Biol. Fertil. Soils. 5: 308-12.

206. Tardieux-Roche A. (1966). Contribution a letude des interaction entre phosphates naturels et microflora du sol. Ann. agron 17:5: 479-528.

207. Terkeltaub R.A. (2001). Inorganic pyrophosphate generation and disposition in pathophysiology. Am./. Physiol. Cell Physiol. 281:1: 1-11.

208. ThiloE. (1955). Die kondensierten phosphate. Angew. Chem. 67: 141-7.

209. Thomas E.A. (1973). Phosphorus and eutrophication // Environmental phosphorus handbook. N. Y.: Wiley, P. 585-611.

210. Tiessen H. (1995). Phosphorus in the global environment, transfers, cycles and management. John Wiley & Sons. 462 p.

211. Tinsley C.R., Manjula B.N. & Gotschlich E.C. (1993). Purification and characterization of polyphosphate kinase from Neisseria meningitidis. Infect. Immun. 61: 3703-10.

212. Tinsley C.R. & Gotschlich E.C. (1995). Cloning and characterization of the meningococcal polyphosphate kinase gene: production of polyphosphate synthesis mutant. Infect. Immun. 63: 1624-30.

213. Torres M., Goldberg J. & Jensen T.E. (1998). Heavy metal uptake by polyphosphate bodies in living and killed cells of Plectonema boryanum (cyanophycae). Microbios. 96:385: 141-7

214. Torriani-Gorini A. (1994). Phosphate in microorganisms: cellular and molecular biology. ASM: Washington. 347 p.

215. Trotsenko Y.A. & Shishkina V.N. (1990). Studies on phosphate metabolism in obligate methanotrophs. FLMS Microbiol. Rev. 87: 267-72.

216. Tsutsumi K., Munekata M., Shiba T. (2000). Involvement of inorganic polyphosphate in expression of SOS genes. Biochim. Biophys. Acta. 1493:2: 73-81.

217. Vaughn J.C., Falkenthal R.F. & Schmidt R.W. (1956). Effect of synthetic detergents on water treatment. J. Amer. Water Works Assoc. 48:1: 30-44.

218. Vercesi A.E., Moreno S.N. & Docampo R. (1994). Ca2+/H+ exchange in acidic vacuoles of Trypanosoma brucei. Biochem./. 304: 227-33.

219. Vercesi A.E. & Docampo R. (1996). Sodium-proton exchange stimulates Ca2+ release from acidocalcisomes of Trypanosoma brucei. Biochem. J. 315: 165-70.

220. Vercesi A.E., Grijalba M.T. & Docampo R~ (1997). Inhibition of Ca2" release from Trypanosoma brucei acidocalcisomes by 3,5,-dibutyl-4-hydroxytoluene. role of the Na+/H+ exchanger. Biochem. J. 328: 479-82.

221. Vollenweider R.A. (1981). Eutrophication A global problem. Water Qua/. Bull. 6: 59-89.

222. Vorisek J., Curdova E., Jechova V., Lenc B. & Hostalek Z. (1983). Electron-cytochemical demonstration of polyphosphates and the appropriate phosphatases in the glycocalyx of Streplomyces aureofaciens. Curr. Microbiol. 8: 31-6.

223. Ward J.B. (1981). Teichoic and tichuronic acids biosynthesis, assembly and location. Microbiol. Rev. 45:2: 211-43.

224. Weber H. (1965). Uber das vorkommen von kondensierten phosphaten in purpurbakterien. Z. Allg. Mikrobiol. 5: 315-22.

225. Westman A., Scott A. & Redley I. (1952). Filter paper chromatography of the condensed phosphates. Chem. in Canada. 10: 189-94.

226. White J.A. & Brown M.F. (1979). Ultrastructure and X-ray analysis of phosphorus granules in a vesicular-arbuscular mycorrhizal fungus. Canad. J. Bot 57:24: 2812-8.

227. Wiame J.M. (1947). Etude d'une substance polyphosphate basophile et metachromatique chez les levures. Biochim. Biophys. Acta. 1: 234-55.

228. Wicken A.J. (1985). Bacterial cell wall and surface. // In: Bacterial Adhesion. D C. Savage & M. Fletcher (eds). Plenum Press: 45-71.

229. Wilsky G.R. & Malamy M.H. (1976). Control of the syntesis of alkaline phosphatase and the phosphate-binding protein in Escherichia coli. J Bacteriol. 127: 595-609.

230. Wise E.M.J., Glickman R.S. & Teimer E. (1972). Teichoic acid hydrolase activity in soil bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 69: 233-7.

231. Wood E.J.F. (1958). The significance of marine microbiology. Bacteriol. Rev. 22:1: 1-19.

232. Wood H.G., Clark J.E. (1988). Biological aspects of inorganic polyphosphates. Ann. Rev. Biochem. 57: 235-60.

233. Yu T., Nassuth A. & Peterson RX. (2001). Characterization of the interaction between the dark septate fungus Phialocephala foriinii and Asparagus officinales roots. Can. J. Microbiol. 47:2: 741-53.

234. Zhang H., Ishige K. & Kornberg A. (2002). A polyphosphate kinase (PPK2) widely conserved in bacteria. Proc. Nail. Acad. Sci. USA. 99: 16678-3.

235. Zilles J.L., Peccia J., Kim M.W., Hung C.H. & Noguera D.R. (2002). Involvement of Rhodocycles related organisms in phosphorus removal in full scall wastewater treatment plants. Appl. Environ. Microbiol. 68:6: 2763-9.