Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РАДИОИНДИКАТОРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ОБМЕНА УГЛЕРОДА У ДРОЖЖЕЙ ПРИ АССИМИЛЯЦИИ Н-АЛКАНОВ

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "РАДИОИНДИКАТОРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ОБМЕНА УГЛЕРОДА У ДРОЖЖЕЙ ПРИ АССИМИЛЯЦИИ Н-АЛКАНОВ"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

J— tS0i4 На правах рукописи

Для служебного пользования

Экз № т

Людмила Григорьевна КРЕТОВА

РАДИОИНДИКАТОРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ОБМЕНА УГЛЕРОДА У ДРОЖЖЕЙ ПРИ АССИМИЛЯЦИИ Н-АЛКАНОВ

Специальность: 03.00.02 биофизика, 03.00.03 биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА — 1975

Диссертационная работа выполнена на кафедре прикладной атомной физики и радиохимии' Московской ордена Ленина и ордена' Трудового Красного Знамени сельскохозяй-_ ственной академии им. К. А. Тимирязева.

. Научные руководители: доктор химических наук профессор В. В. Рачинский, кандидат химических наук ст. научн. сотрудник Е. Г. Давидова.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук профессор А. М. Безбородое, доктор биологических наук профессор В. К. Шильникова.

Ведущее предприятие — ВНИИсинтезбелок.

; Автореферат разослан « /<К» . л4л.бс/»-к 4. . . . 1975 г.

Защита состоится на заседании Совета факультета агрохимии и почвоведения ТСХА « л: .» . 'И-/(:/>"?• "• <&/ . 1975 г. в . . . часов. -".',..

"С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА (ул. Тимирязевская, 49). ;

Отзывы в двух, экземплярах, заверенные печатью, просим -присылать по адресу: 125008, Москва А-8, ул. Тимирязевская, 49, Ученый совет ТСХА.---Л-Л

Ученый секретарь ТСХА ~¥\) (Г' - л л ' О * * л —" л 1-

доцент Ф. А.Девочкин

1 \

1 Чо

ВВЕДЕНИЕ

Промышленное выращивание микроорганизмов давно уже стало надежным дополнительным источником для получения ценных органических продуктов, необходимых для питания людей и животных, препаратов для медицинских и сельскохозяйственных целей.

Особое место в микробиологической промышленности занимает производство белка, дефицит которого в пищевом балансе, по данным международных организаций, увеличивается. Для уменьшения и ликвидации этого дефицита наряду со всемерным развитием сельскохозяйственного производства важное значение приобретают способы получения белка и других ч пищевых продуктов на основе использования непищевого органического сырья, в частности отходов нефтяной промышленности — углеводородов.

Решения XXIV съезда партии и пятилетний план дают прямые директивы в этом направлении.

В последнее время все большее внимание уделяется разработке теоретических вопросов микробиологического производства белка на основе использования углеводородов. Подведение научной теоретической базы под технологию производства белка на углеводородах будет способствовать совершенствованию этой технологии, ее интенсификации.

Данная работа выполнена как часть общей программы исследований по проблеме микробиологического синтеза белка на углеводородах, в которых принимает участие кафедра прикладной атомной физики и радиохимии ТСХА. Эта программа охватывает исследования по широкому кругу вопросов: механизм поступления углеводородов в клетки микроорганизмов, локализация окисления углеводородов в клетках дрожжей, химический путь углерода и динамика обмена углерода при ассимиляции углеводородов, механизм индукционного и ре-прессорного действия источников углеродного питания микроорганизмов и другие. В решении всех этих вопросов используются преимущества, которые предоставляют такие экспериментальные методы, как метод радиоактивных индикаторов, хроматография, дифференциальное центрифугирование и другие современные физико-химические методы.

.^(.олыгоз.

В данной работе подведены итоги применения метода радиоактивных индикаторов в исследовании метаболического обмена и пути углерода при углеводородном питании дрожжей. Цель этих исследований — получить новые экспериментальные данные о направленности и динамике углеродного обмена дрожжей в процессе ассимиляции углеводородов.

ЛИТЕРАТУРНАЯ ЧАСТЬ

В литературной части рассматриваются современные подходы в изучении метаболизма веществ с точки зрения теории и.методов изотопной биофизики и биохимии.

Рассматривая процессы обмена веществ в природе, следует различать обмен разнородных частиц (атомов различных химических элементов, молекул различных химических соединений, различных химических фрагментов и радикалов) и обмен однородных частиц (атомов одного и того же химического элемента, молекул одного и того же химического соединения, одинаковых химических фрагментов и радикалов). Обмен однородных частиц получил название изотопного обмена.

Для живых организмов имеется определенная специфика процессов изотопного обмена. В системе «среда — живой организм» происходят обменные процессы метаболической и неме-таболнческой природы. Поэтому следует различать процессы метаболического и неметаболического изотопного обмена. С точки зрения изотопной химии процессы метаболического изотопного обмена можно отнести к разновидности процессов косвенного изотопного обмена. Результатом процессов изотопного обмена в живых организмах является обновление атомно-молекулярмого состава химических компонентов живого организма. Определение скоростей изотопного обмена и обновления атомно-молекулярного состава компонентов живой системы— одна из задач изотопной биофизики и биохимии.

По скорости изотопного обмена компоненты живого организма могут быть условно разделены на две крайние группы— необменные и обменные. В биохимии это соответствует понятиям необменных и обменных фондов (пулов). Процессы изотопного обмена в живых организмах носят, как правило, неравновесный, неэквивалентный характер. Лишь в некоторые интервалы времени могут устанавливаться близкие к равновесию состояния.

В развитии теории процессов метаболизма веществ, в частности процессов метаболического изотопного обмена, все большую роль начинают играть методы физико-химического и математического моделирования.

Критически рассмотрены история и современное состояние исследований изотопного обмена белков, аминокислот, лип"-

дов у микроорганизмов. Специально рассмотрено, состояние работ по изучению процессов изотопного обмена веществ в условиях покоя и голодания.

Специальная глава, литературной части посвящена рас-. смотрению сведений об особенностях углеродного' обмена у дрожжей при' углеводородном питании. Приведены литературные данные об эффективности использования н-алканов и особенностях биоэнергетики в процессе роста дрожжей на н-алканах, о биосинтезе белков, аминокислот и липидов при ассимиляции н-алканов.;

Рассмотрение литературных данных оприменении изотопных индикаторов в исследованиях метаболизма веществ в жи-. вых организмах, в частности в . микроорганизмах, показало, что при постановке этих исследований и .интерпретации результатов недостаточно учитываются "теоретические и методические основы химии изотопов и изотопной" биофизики и биохимии. Изучение метаболического изотопного обмена и пути углерода при углеводородном питании микроорганизмов находится в начальной стадии.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использовали дрожжи' Candida tropicalis. Дрожжи выращивали на среде .№ I (ВНИИсинтезбелок) с добавкой биотина. В качестве источника углерода использовали парафин и в некоторых случаях глюкозу. В опытах с применением метода радиоактивных индикатороз в качестве источника углерода использовали 1-14С-октадекан и 1-14С-ундекан. Методика подготовки накопительной культуры — общепринятая. Инкубацию дрожжей проводили в культивационных колбах на аппарате для встряхивания при температуре 30± 1° в объеме минеральной среды 100, 200 или 300. мл.' Каждый опыт повторяли в идентичных условиях не менее двух раз. Для определения массы дрожжей использовали нефёлометрический и весовой методы.

Массу углерода в биомассе дрожжей -определяли .методом химического микроанализа и колориметрическим методом по И. В. Тюрину в модификации В. П. Цыпленкова.'Кроме того для определения массы углерода в биомассе разработан и ис,п4 ользован радиометрический метод. Выращива,я4 дрожжи на 1-,4С-октадекане, получали тотально меченную ,4С-биомассу. Определяя общую активность 14С в пробе биомассы и зная удельную активность углерода в 1-14С-октадекане, рассчитывали массу углерода в пробе биомассы. Результаты такого определения удовлетворительно сходились с результатами определения,углерода методом элементного микроанализа., Приведено описание радиометрических методик определе-

ния активности 14С в газообразных, водорастворимых продуктах, в органических фракциях биомассы дрожжей при использовании счетчиков Т-25-БФЛ. В части исследований определение активности 14С п препаратах осуществлялось с помощью автоматического жидкостного сцинтилляционного радиометра МАРКИ (фирмы Нуклеа Чикаго). Приведена схема-фракционирования дрожжей по группам органических веществ: белки, нуклеиновые кислоты и полисахариды, свободные аминокислоты, органические кислоты, сахара и яуклеотиды и липиды. В процессе фракционирования использованы: гидролиз биомассы в 5% ТХУ, экстракция липидов смесью хлороформа и метанола, хроматографическое разделение веществ (аминокислот, органических кислот, Сахаров) на ионообменных смолах. Методика фракционирования описана в диссертации подробно. ' В процессе фракционирования биомассы дрожжей на всех стадиях осуществлялся радиометрический контроль'" баланса углерода. Для осуществления такого контроля фракционированию подвергалась тотально меченная 14С-биомасса. Показано, что на всех стадиях фракционирования потери органических компонентов (14С-индикатор) находились в пределах ошибок измерений.

Фракционирование тотально меченой биом1а4ссы (в логарифмической фазе роста), выращенной на 1-14С-октадекано, позволило установить распределение углерода между органическими компонентами биомассы.

Таблица 1

Распределение углерода по органическим компонентам биомассы дрожжей, выращенных на углеводородах

Фракции Масса углерода в % от общего углерода в биомассе

33,4±0,8

Нуклеиновые кислоты и полисахариды 12,3±07

15,3±1,0

Свободныл аминокислоты .... 12,5±1,3 •

2,5=Ь0,2

24,0±1,0

. В таблице 1 приведено распределение 14С, а следовательно, и углерода по фракциям биомассы. Относительное содержание углерода (в %) в органических фракциях было рассчитано относительно суммы активности С в компонентах без учета 14С в составе остаточного 1-14С-октадекана. Как показано в опытах, внутри клеток остается некоторое количество (около 10%) не использованного клетками октадекана. Количество, остаточного октадекана непостоянно и зависит от усло-4

вий культивирования и состояния культуры. Как видно из таблицы 1, относительное распределение углерода по органическим фракциям составляет следующий ряд:Лбелки>сахара и нуклеотиды>л1гаи"ды>свободные • ам1Шок1гслоты>нуклеино-"" вые кислоты иг полисахариды>органич"еские к'ислоты. Полу* ченное распределение рассматривается как, характеристическое предельное распеределение,углерода для культуры дрожжей, находящейся в логарифмической фазе роста. -

Анализ состава липидовосуществлялся методами колоночной и тонкослойной хроматографии, и радиоавтографии.

В заключение методического раздела обсуждены некоторые методические" принципиальные вопросы использования изотопных индикаторов'в исследовании метаболизма вещесгп: интерпретация радиоиндикаторных исследований.при использовании полиуглеродных меченых соединений'при: использовании различных способов введения в организм меченого соединения (фронтальный, элютивный и фронтально-элютивныи методы). .,_..' ';-Ч- .1*-*,.,..'-.,.-**," .. ';„.. ..,--, ,•

Исследование метаболического изотопного обмена в системе «биомасса дрожжей — среда с углеводородом»

* Исследован метаболический изотопный обмен углерода мг-жду биомассой дрожжей и-культивационной средой. Сопоставлялось два потока<углерода: 1) поток'ассимиляции — ассими-

♦ ляция клетками"октадекаиа как источника углеродного питания,, 2) поток диссимиляции—газообразные и растворимые в воде углеродсодержащне продукты, выделяемые клетками во внешнюю среду. Показано, что дрожжевая клетка при росте на н-алканах использует.в синтезе новых веществ исключительно углерод углеводорода. .Скорость ассимиляции ; окта-декаиа составила в наших опытах около 120 мкг С/мг-; (био-массы)-час, скорость диссимиляции "была в десять раз мень-

♦ ше—12 мкг-С/мг-час. Соотношение этих скоростей "может служить мерой эффективности биосинтеза. -

\ Деградация органического вещества биомассы происходит с весьма незначительной скоростью. Она составила около 1% в час, или в абсолютном выражении 4,5 мкг.С/мг (биомассы) -час. Время половинной диссимиляции углерода биомассы составляет около 100 часов. * • * • '*

В процессе синтеза биомассы происходит изотопное разбавление метки 14С. Существенная особенность этого разбавления состоит в том, что оно происходит не на атомарном, а на молекулярном уровне. «Старые» молекулы органических веществ со «старым» углеродом перемешиваются с «новыми» молекулами, построенными из «нового», ассимилированного углерода субстрата— октадекана, .. -,.:

Исследован метаболический изотопный обмен углерода при заторможенном росте культуры (при инкубации биомассы в среде без источника азота). Обнаружено," что в этих условиях скорость диссимиляции углерода биомассы сохранилась на том же уровне, что и в условиях нормального роста. На основании этих результатов и имеющихся литературных данных сделан вывод о том, что регуляторные' механизмы, отвечающие за синтез и распад органических соединений в клетке, различны, и что процессы синтеза и распада непосредственно не связаны друг с другом.

Исследования метаболического изотопного обмена углерода органических фракций дрожжей

Исследован углеродный обмен между отдельными органическими фракциями биомассы в различных условиях инкубации. Была прослежена кинетика распределения* ,4С между органическими компонентами.в логарифмической фазе роста в системе «14С-биомасс*а — среда с немеченым источником углерода». В качестве немеченых'источников углерода-брали глюкозу и октадекан. .

В процессе роста культуры (6 часов) не было обнаружено какого-либо перераспределения ИС между _ органическими фракциями. Ранее синтезированные органические вещества клетки в условиях нормального роста в логарифмической фазе при наличии в среде источника углерода весьма устойчивы и распадаются с такой незначительной скоростью, что,за 6 часов инкубации их деградации обнаружить не удалось.

Сохранение массы меченого углерода во всех определяемых группах низкомолекулярных -и высокомолекулярных веществ — признак отсутствия интенсивного изотопного обмена между ними. Отсутствие заметного изотопного обмена углерода между группами органических веществ клетки в условиях нормального роста дрожжевой культуры позволяет прийти к выводу, что основная масса углерода органических компонентов биомассы закреплена в стабильных, необменных фондах. . — .г •

Отмечается тот факт, что ранее акк14умулированный, но не окисленный клеткамт (остаточный) 1-14С-октадекан при наличии углеродного источника питания в • среде (глюкоза или октадекан) практически не используется >в биосинтезе. Это указывает на то, что количество аккумулированного в клетках углеводорода определяется не потребностью в 'источнике углерода в данный момент культивации, а «емкостью» поглощении углеводорода клетками. Углеводород, запасенный клетками, локализуется в таких труднодоступных для окисления местах, что при нормальных условиях, то.есть при наличии источника б

углерода в среде практически не вовлекается.в метаболические-процессы. ...-. " ;<.-••. , •».;....-,.

Изучен метаболический изотопный обмен углерода органических фракций дрожжей .в условиях углеродного голодания — прекращения потока-углерода из внешней среды. -

Установлено, что в условиях углеродного голодания прежде всего происходит использование ранее 'накопленного в клетках 1-мС-октадекана. Наблюдается также=нек6торая мобилизация липидов. Однако,-видимо, мобильные запасы н-алкана и липи-дов недостаточны* для поддержанияхжизнедеятельности культуры. Через несколько часов начинается снижение массы углерода во всех анализируемых фракциях.. Характерно, что скорость распада для; них оказалась одинаковой и относительное распределение углерода между органическими компонентами практически не изменяется. Это свидетельствует о том, что снижение концентрации биомассы обусловлено лизисом целых клеток, а не деградацией отдельных органических компонентов. Метаболический изотопный обмен между органическими фракциями биомассы в условиях голодания не имеет места.

Тот факт, что накопленный в клетках н-алкан расходуется при условии отсутствия в среде источника углеродного питания, имеет большое практическое значение. Он реализуется в способе уменьшения содержания остаточного углеводорода, который получил название «дозревание». Нами получены пополнительные данные для обоснования; этого способа. В опытах установлено, что деградация биомассы в среде без источника углеродного питания начинается после некоторого покоя (несколько часов). Период интенсивной деградации через некоторое время вновь.может быть сменен периодом покоя. В зависимости от условий и состояния культуры могут быть и другие варианты деградации биомассы при углеродном питании.

Изучена наименее «стабильная» при углеродном голодании фракция липидов и остаточного углеводорода. Более интенсивно используется углеводород, менее интенсивно — ли-пиды. При голодании масса липидов в клетках снижается со следующими скоростями (% в час): воски—23±2, жирные кислоты, триглицериды—15±2, стерины.и спирты — • 10±2, фос-фолипиды — 7±2.'Этот ряд характеризует метаболическую устойчивость различных классов липидов. Обращается внимание на относительно (высокое содержание в клетках дрожжей восков, а также'на их относительно высокую метаболическую подвижность при углеродном голодании. ..

Исследование метаболического пути меченого углерода при ассимиляции 1-14С-октадекана дрожжами

Основная масса углерода органических веществ закреплена в необмевдых, стабильных фондах. Распределение углерода

между органическими компонентами клетки определяется , в основном соотношением необменных-фондов и является предельным, то есть постоянным для определенного организма в определенной фазе роста и соответствует его биохимическому составу. При достаточно длительной инкубации углерод ассимилируемого субстрата должен распределиться по органическим фракциям в соответствии с предельным распределением.

Метод радиоактивных индикаторов позволяет осуществить выявление метаболического пути углерода от момента его вхождения в клетку до наступления предельного распределения. -

В работе получены новые данные о метаболическом пути меченого углерода из 1-14С-октадекана в дрожжах. Результаты приведены на рис. 1. Они показывают, что уже через 30 секунд инкубации дрожжей с 1-иС-октадеканом меченый углерод С* обнаруживается во всех анализируемых фракциях.

По скорости включения анализируемые компоненты составляют следующий ряд: органические кислоты>свободные ами-нокислоты>сахара и нуклеотиды>литшды>белки>'нуклеино-выекислоты и полисахариды, то есть получен довольно характерный ряд для метаболического пути углерода по компонентам клеток живых организмов.

Полученная картина распределения СР в первые минуты отличается от предельного распределения меченого углерода. Она отражает в общих чертах как очередность, так и степень накопления массы метаболитов-предшественников.

Ход кинетических кривых включения СР в различные низкомолекулярные компоненты (рис. 1) свидетельствует о существовании в этих компонентах, по крайней мере, двух фондов, значительно различающихся по скоростям накопления:-быст-рое накопление СР — в мобильных обменных фондах метаболитов и • медленное накопление — в стабильных, малолабильных, необменных фондах. Как было показано выше, во время роста культуры основная масса органических фракций прак-. тически не обновляется. Из этого следует, что масса углерода метаболически подвижных, нзотопнообменных фондов должна , быть значительно меньше массы углерода стабильных фондов метаболитов.

На основе полученных кинетических данных дана оценка относительного содержания углерода обменных, фондов для низкомолекулярных метаболитов. Доля нзотопнообменных, мобильных фондов составляет для свободных аминокислот около 3%, сахаров и нуклеотадов — около 1%, органических кислот — около 1,5%, липидов — около 0,5%. Эти результаты согласуются с установленным фактом высокой стабильности основной массы углерода не только высокомолекулярных, но и низкомолекулярных веществ биомассы дрожжей.

8

Проведено сравнительное изучение включения меченого углерода из 1-14С-октадекана и 1-мС-ундекана в компоненты фракции липидов методом тонкослойной раднохроматографии. Включение СР из 1,-14С-октадекана в различные классы липидов протекает с разной 'скоростью. Для большинства классов липидов кинетические кривые включения СР характеризуются двумя стадиями: быстрой и медленной. Предполагается, что быстрая стадия сзязана с накоплением СР в обменном фонде, а медленная— в стабильном, необменном фонде. Обращено внимание на относительно высокое накопление С1* в восках.

В первые 15 минут скорость включения р* в триглпцериды и воска выше скорости включения в жирные кислоты. Относительно высокая скорость включения Ср в триглпцериды и воска, вероятно, связана с процессом непосред1с4твенного использования продуктов первичного окисления 1-14С-октадекана для синтеза компонентов липидной фракции, без окисления до .уксусной кислоты, то есть в синтезе липидов используется готовая углеродная цепочка н-алкана.

В клетках дрожжей, окисляющих октадекан, по литературным данным, накапливается значительное количество н-окта-децилового эфира пальметиновой кислоты, относящегося к классу восков. Радиохроматографическое сравнительное исследование продуктов окисления углеводородов с различной длиной углеродной цепи (октадекана С-18, ундекана С-11) показало, что накопление восков характерно только для ассимиляции углеводородов с длинной углеродной цепью. При окислении ундекана образования восков не наблюдалось. Вероятно, ассимиляция углеводородов с короткой углеродной цепью идет через окисление его до ацетата.

Прослежена кинетика распределения меченого углерода из 1-14С-октадекана в течение достаточно длительного времени роста культуры с тем, чтобы достичь предельного распределения меченого углерода по органическим фракциям биомассы дрожжей. Установлено, что предельное относительное содержание С* во фракции органических кислот устанавливается через 1 час. В свободных аминокислотах за 5 часов, в углеводах— за 8 часов, в белках, нуклеиновых кислотах — только за 16 часов.

Исследование обменных фондов углерода низкомолекулярных веществ

С помощью фронтально-импульсного радиоиндикаторного метода изучена кинетика насыщения и величина обменных фондов низкомолекулярных веществ биомассы дрожжей. Для этого биомассу на короткое время приводят в контакт с меченым источником углерода, а затем переносят.на среду, содер-

жащую немеченьиТ;источник углеродаг ипрослеживают кине- " ;•; тику распределениялмеченоголуглерода- 'по'органическимфрак-; -дням. Рассчитаны массылобщего углерода для каждой фрак- ; * ♦ ции и удельное,содержание-меченого;углерода в:них. Резуль-*'. таты приведены.на рис/ 2. ло]лук* -л1; {*.-'*.-

. Д Как видно, после,10минутного1Иштульса Л4,5% от общего --углерода аминокислот составили меченыеЛаминокислотыЛаме- . ; ченые органические:кис.тоты~-2,5% от общего углерода орга- < - -нических кислот; За.4*'Уаса1инкубацйигна<немеченом октаде-, кане содержание.меченых аминокислот и .органических кислот •; /снизилось до 1 %. то;ёсть;на:б]1осинтез;бйополимеров было'заЛ •" .трачено 3% Сл.аминокислот:й'20/о;Ьр1-анических кислот. ' "уу -*.

Подробно'ИзученачКИнетикН; синтеза":и величина обменного ,. у фонда свободных-аминокислот. Было.показано, что интенсив- , : . ность синтеза а*минцк-ислот;впервьге(мшуты контакта;био- *• массы с меченым.парафином очень велика, и в основном через-.' >]/! "г 15 минут.завершаетсяЛнасыщение обменного фонда/ К.двум, ' ,, 'часам инкубации он'йасыщается;полностью*то есть приходит в состояние кинетического'равновесия с метаболическими про-\ >.*цессами клетки. • • • •• Н-Уг:^-::-' *:уС;;л~*" ..«• _... ''-Туч У I ' Как видно из. данных;.приведенных;на рис. 3, при'инкуба-

цил дрожжей после импульса на немеченом октадекане.проис- .. $'ходит снижениеьмассы мечшюго.углерода во фракции свобод-, .' них'аминокислот.,;Из\этого; следует,*;.что"; эти аминокислоты/у ' действительно/составляют. обменный;фонд. Однако даже через : / 5 часов'инкубацииЛвсЬставе.а'минокислот обнаруживается некоторое количество мечёных/аминокнслот, масса углерода, ко- ; - , торых тем больше, чем длительнее 'был гимлульс с меченым-, ". октадеканом. Это количество аминокислот.отнесено к нёобмен- -ному фонду/углербда/аминокислЪти'еинтезированному за время импульса. Вычитая.массу--меченого углерода необменного \, \ фонда от,общего"КОлйчества5Меченых*1аминокислот,.синтезиро- ** "ванных за время импульса,;можно оценить величину/обмен-' ного фонда .свободных аминокислот!«Соотношение масс мече-:\: , > ного углерода в обменном и стабильном фонде со временем ' ,: :: изменяется. В таблице-2 приведена'-'кинетика распределения Л

• "". у О. • • Таблица

Кинетика распределения меченого углерода свободных аминокислотл ■ между стабильным,-и обменным фондами (в % от суммы)

: 2 ;

.Мин. *,п Стабильный фонд л Обменный фонд

* * *

•и 15 -......*• 20,6 79,4 "

30 23,2.- ' л76,8

60 24,0 1 ,- 76,0

120 "" * * ' эт 7 1 42,3 *

/

\

углерода вновь синтезированных аминокислот между обменным и стабильным фондами в зависимости от длительности инкубации на меченом 1-14С-октадекане.

Таким образом,вначале инкубации очень велика интенсивность синтеза аминокислот обменного фонда. Масса углерода 'обменного фонда аминокислот по отношению к общему углероду аминокислот стремится к предельному значению около 3%.

Таким образом, получено прямое доказательство того, что метаболический изототшообменный фонд таких низкомолекулярных фракций, как аминокислоты, составляет только небольшую долю углерода этой фракции.

Основная масса углерода ннзкомолекулярных и высокомолекулярных веществ дрожжевой клетки закреплена в стабильных, малообменивающихся фондах и в нормальных условиях роста достаточно устойчива. Углерод этих фондов практически не обновляется.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны модификации радиохимических и радиометрических методик исследования метаболизма веществ: радиометрического определения общего углерода в биомассе и контроля баланса углерода ее компонентов, определения массы углерода классов л ил идо в с применением тонкослойной ра-.диохромдтографии и оценки соотношения обменных и необменных фондов углерода низкомолекулярных веществ.

2. Исследование метаболического изотопного обмена в системе «биомасса дрожжей — среда с углеводородом» показало, что углерод ранее синтезированной биомассы в процессе нормального роста дрожжей на октадекане выделяется во внешнюю среду с очень низкой скоростью, которая .в абсолютном выражении составила 4,5 мкг С/мг биомассы-час. Это свидетельствует о большой метаболической устойчивости биомассы. В процессе роста дрожжей прирост биомассы осуществляется за счет ассимилированного углерода углеводорода.

3. Установлено, что скорость ассимиляции углерода окта-декана дрожжами в логарифмическую фазу роста составляет около 120 мкг С/мг биомассы в час. Скорость его выделения во внешнюю среду— 12 мкг С/мг биомассы в час. Скорость выделения углерода в жидкую фазу в 3 раза выше, чем в газообразную.

В условиях заторможенного роста выделение во внешнюю среду углерода «старой» биомассы происходит с такой же скоростью, как в условиях нормального роста дрожжей.

4. Углерод, ассимилируемый микроорганизмами из среды, при достаточно долгой инкубации распределяется так, как рас-

пределяется общий углерод биомассы по группам органиче- „

* ; ских веществ. Распределение,углерода является постоянным С

для данного вида микроорганизма и;для определенной фазы ; -роста культуры—предельным распределением. „ ' • , Определено относителыноеЛраспределение общего углерода ?':

между органическими фракциями: биомассы],в логарифмическую фазу роста дрожжей* на октадекане (в % от суммы): ; -. белки (33,4±0,8)>сахара и'нуклеотиды (24,0± 1,0)>липиды ; — (15,3±1,0)>свободные аминокислоты ,(12,5± 1,1) >нуклеино- Г-* ,, вые кислоты и полисахариды (12,3±0,7).>Ьрганические кис-

4, лоты (2,5±0,2). г..",. > \:Л1{,,:?:'"-'у ' 5 5." Изучение'обмена углерсаа в группах"органических ве- . • ществ дрожжевых клеток;показало,.у4ТО].при наличии нсточ-; «• > ника «углерода в среде. они. раашдаются. и-Лобмениваются

* ;\с. очень .незначительной .скоростью.'Основная ;масса углерода .. >" "органических веществ закреплена: в «стабильных» малообме-г '

к нивающихся фондах. * ♦,.. .'Л *••',•._'

;,♦! * • При наличии в среде источника углеродного'питания, масса-*~ч ; аккумулированного неокисленйого углеводорода остается также практически неизменной.у.\;. ., , 1 ..., ; Г - 6. Установлено, что "в- условиях,углеродного голодания; •

* прежде всего используется-ранее накопленный , в клетках. н-алкан. Наблюдается также некоторая мобилизация липидов,

.-„, и далее начинается снижение массы углерода во всех органи- •

♦ ческих фракциях. Характерно, что скорость-их распада одина- , -. ;'.. кова.* Метаболический изотопный'обмен углерода между от, '."•". . дельными компонентами биомассы в условиях углеродного го- '«"а ~.-лод ания', не имеет, места. -^гуУ /С -, -,-• . 4 '•' : В условиях углеродного,голодания скорость снижения :

массы углерода в различных классах липидов неодинакова. ' '/Она "составляет (в ,% в час): воска — 23±2, жирные кислоты,, г-; диглицериды, триглицериды — 15±2, стерины и спирты— , * J[ 10±2, фосфолипиды — 7±2. -Л < . ; -,»

7. При исследовании метаболического пути меченого угле-. •'•" рода при ассимиляции дрожжами 1-'4С-октадекана установле-. . ' но, что меченый углерод уже после 30 секунд инкубации обнаруживается во всех, органических фракциях. -По скорости,; 1." включения меченого,углерода органические фракции располагаются в следующий ряд: "органические' кйслоты>свободные аминокислоты>углеводы>лш1иды>белкн>'нуклеиновые кис- -. лоты и -полисахариды. Дана кинетическая картина распреде-/ ления меченого углерода вплоть'до установления предельного / •' .распределения. '-'- •'-*Д:/,\ {Л~' I • * . -I ' , *'»';'

:;<с 8..: Получена кинетическая, картина, включения меченого " ; -углерода в различные классы.липидов. В первые минуты инку-;, .-бацин дрожжей.с 1-МС-октадеканом обнаружено значительное накопление меченого углерода в классе восков и триглицери--

Лов. Предполагается, что часть октадекана непосредственно используется для синтеза этих компонентов лшпидной фракции без превращения в уксусную кислоту. Однако включение меченого углерода в воска характерно только для углеводородов с длинной углеродной цепью. В опытах с 1-14С-ундеканом (С-11) такое явление не наблюдается.

9. Кинетика включения углерода во фракции низкомолекулярных веществ свидетельствует о наличии в клетке для каждой группы веществ по крайней мере двух фондов, имеющих различные скорости синтеза — быстросинтезирующиеся и мед-леннссинтезирующиеся фонды.

10. Установлено, что быстросинтезирующийся фонд свободных аминокислот является обменным фондом и его величина составляет около 3% от общего фонда свободных амино; кислот биомассы. Показано, что между аминокислотами обоих фондов при нормальных условиях роста практически отсутствует изотопный обмен.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Л. Г. Кретова. Кинетика включения меченого углерода из 1-|4С-октадекана в органические фракции дрожжей. Доклады ТСХА, 1972, в. 188, с. 229—234.

2. В. В. Рачинский, Е. Г. Давидова, Л. Г. Кретова. Исследование метаболического изотопного обмена углерода в системе «биомасса дрожжей — среда с углеводородом». Изв. АН СССР, сер. биол., 1973, № 1, с. 80—83.

3. В. В. Рачинский, Е. Г. Давидова, Л. Г. Кре-тоша. Исследование углеродного обмена у дрожжей. В сб.: «Микробиология и еаучный прогресс», Минск, 1971, с. 37—39.

4. Е. Г. Давидова, Л. Г. Кретова. Исследование кинетики включения меченого углерода из 1-,4С-октадекана в органические фракции дрожжей. ВННинформцентр, Б 265017, Сб. реф. НИР, сер. 04, № 5, 1973, с. 47.

5. V. V. R а с h i n s k i, E.G. T о n e v a - D a v i d о v a, L. G. Kretova. Dynamies of carbon metabolisms in yeasts. Proceeding of the third international specializid symposium on yeasts. Helsinki, 1973, s. 141.

Объем 1 п. л. Заказ ,117. Тираж 150

Типография Московской с.-х. академик им.: К- А. Тимирязева 125008, Москва Л-8, Тимпрязсзская ул., 44