Неканонические субстраты и матрицы в реакциях, катализируемых РНК-полимеразой бактериофага Т7 и обратной транскриптазой ВИЧ-1

Андреева, Ольга Игоревна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Неканонические субстраты и матрицы в реакциях, катализируемых РНК-полимеразой бактериофага Т7 и обратной транскриптазой ВИЧ-1
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Неканонические субстраты и матрицы в реакциях, катализируемых РНК-полимеразой бактериофага Т7 и обратной транскриптазой ВИЧ-1"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

АНДРЕЕВА ОЛЬГА ИГОРЕВНА

НЕКАНОНИЧЕСКИЕ СУБСТРАТЫ И МАТРИЦЫ В РЕАКЦИЯХ, КАТАЛИЗИРУЕМЫХ РНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ БАКТЕРИОФАГА Т7 И ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПТАЗОЙ ВИЧ-1

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2004

Работа выполнена в лаборатории этимологии транскрипции Института молекулярной биологии имени ВА. Энгельгардта РАН.

Научный руководитель:

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Кочетков С.Н.

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Габибов А.Г. доктор биологических наук, профессор Иткес А.В.

Ведущая организация:

кафедра химии природных соединений Химического факультета МГУ.

Защита диссертации состоится «15» апреля 2004 г. в 11 ч. на заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. ВА Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. ВА Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан «15» марта 2004 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы и направление исследования. Нуклеотид-полимеразы (ДНК- и РНК-полимеразы разных типов) представляют собой большой класс ферментов, ответственных за синтез ДНК и РНК в клетке и катализирующих единую химическую реакцию — синтез 3'-5'-фосфодиэфирной связи между рибо- или. дезоксирибонуклеотидами. Большинство этих ферментов представляют собой сложные мультисубъединичные комплексы, исследование которых во многих случаях затруднительно. В то же время изучение односубъединичных нуклеотид-полимераз, обладающих всей функциональной полнотой, позволяет в настоящее время получить максимум достоверной информации об их структуре и механизмах катализа.

Особую роль в понимании механизмов действия нуклеотид-полимераз играет их субстратная специфичность. Какие факторы влияют на выбор нуклеотид-полимеразой РНК или ДНК матрицы, рибо- или дезоксирибонуклеозидтрифосфата или

dNTP)? В данной работе мы постарались определить некоторые критерии, влияющие на выбор субстрата, для представителей двух различных семейств нуклеотид-полимераз: ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7 (Т7 РНКП) и обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека 1 (ОТ ВИЧ-1).

Благодаря своим молекулярным свойствам (односубъединичная структура и относительно небольшая молекулярная масса 98 кДа), Т7 РНКП является удобной моделью для изучения химических основ транскрипции и биосинтеза нуклеиновых кислот в целом. Кроме того, этот фермент широко используется в молекулярной биологии как инструмент для получения специфических транскриптов.

ОТ ВИЧ-1 - фермент, осуществляющий репликацию генома ВИЧ-1. Активная форма фермента представляет собой гетеродимер, состоящий из большой (рбб) и малой (р51) субъединиц. Малая субъединица является продуктом специфического расщепления рбб в С-концевой области и не обладает каталитической активностью. ОТ ВИЧ-1 является привлекательным объектом для анти-ВИЧ терапии, поскольку обратная транскрипция характерна только для ретроэлементов и не является жизненно необходимым процессом для человека. Однако, соединений, полностью подавляющих жизненный цикл ВИЧ, пока не найдено.

Цели и задачи исследования. Целью данной диссертационной работы было исследование специфичности Т7 РНКП и ОТ ВИЧ-1 в отношении неканонических субстратов.

В работе решались следующие задачи: (1) поиск условий препаративного синтеза смешанных полинуклеотидов определенного состава мутантной формой Т7 РНКП и (2) их использование в качестве матриц для ОТ ВИЧ-1, (3) определение влияния введения объемного заместителя в различные положения цепи праймера для ОТ ВИЧ-1 и (4) изучение специфичности Т7 РНКП и ОТ по отношению к трифосфатной части молекулы субстрата.

Научная новизна работы. В работе впервые показана возможность синтеза в препаративных количествах смешанных полинуклеотидов различного состава в промотор-зависимой реакции и выявлены основные закономерности этой реакции. Осуществлено использование смешанных полинуклеотидов в качестве матриц для ОТ ВИЧ-1, определены кинетические параметры этих реакций. Показано, что сродство ОТ ВИЧ-1 к смешанным полинуклеотидам зависит от соотношения рибо- и дезоксирибо-оснований в цепи матрицы.

В реакции, катализируемой ОТ ВИЧ-1, изучено влияние введения остатка 2'-О-(Р-О-рибофуранозил)аденозина в различные положения цепи праймера на элонгацию ДНК. Найден специфический олигонуклеотидный ингибитор ОТ, несущий этот остаток.

Исследовано взаимодействие ОТ ВИЧ-1 и Т7 РНКП с модифицированными нуклеозидтрифосфатами и аналогами неорганического пирофосфата, содержащими негидролизуемую бисфосфонатную группировку. Выявлен универсальный ингибитор этих ферментов.

Практическая ценность работы. Предложенный в работе метод препаративного синтеза смешанных полинуклеотидов позволяет использовать их в качестве матриц для различных ферментов нуклеинового обмена (полимераз, нуклеаз, метилаз и др.). Исследованные нами праймеры с объемными заместителями [2'-0-(p-D-рибофуранозил)аденозина] могут быть использованы для специфического ингибирования различных полимераз. Кроме того, выявленные параметры субстратной специфичности позволяют сравнить особенности катализа исследуемых ферментов и подтверждают универсальный характер механизма реакции полимеризации для всех нуклеотид-полимераз.

Апробация. Материалы диссертации были изложены на Международном симпозиуме «Биокатализ-98» (Пущино, 1998), 4ой Международной конференции по молекулярной биологии им. Энгельгардта (Москва - Санкт-Петербург, 1999), Международном симпоузиме «Текущие проблемы молекулярной генетики и клеточной биологии» (Москва, 2000).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах

машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего наименований. Диссертация содержит рисунков и таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Функциональные особенности нуклеотид-полимераз, катализирующих синтез РНК и ДНК, характеризуются их различной субстратной специфичностью, проявляемой in vivo. Полимеразы могут катализировать несвойственные для них

процессы in vitro, хотя с пониженной эффективностью и/или в условиях, резко отличающихся от природных. Несмотря на большое количество работ, посвященных описанию свойств кристаллических комплексов нуклеотид-полимераз, в том числе и каталитически компетентных, структурные нюансы, обеспечивающие высокую специфичность этих ферментов, не всегда понятны. В данной работе мы постарались рассмотреть некоторые аспекты специфичности Т7 РНКП и ОТ ВИЧ-1, представляющих два различных семейства нуклеотид-полимераз, с использованием неканонических субстратов.

Синтез смешанных рибо/дезоксирибополинуклеотидов мутантной формой Т7 РНКП.

В течение ряда лет в лаборатории этимологии транскрипции ИМБ РАН изучаются различные аспекты функционирования Т7 РНКП. Особое внимание было уделено роли консервативного структурного мотива В, характерного для всех ДНК-зависимых полимераз (Delarue M. et al, 1990). В результате сайт-специфического мутагенеза этого мотива было, в частности показано, что инвариантный остаток Туг639 ответственен за выбор ферментом rNTP или dNTP, а мутантная форма фермента Tyr639Phe способна использовать в качестве субстратов как rNTP, так и dNTP. Введение дополнительной мутации Ser64IAla многократно усиливало это свойство (Kostyuk D.A. et al, 1995). Способность "двойного" мутанта Tyr639Phe, Ser641Ala T7 РНКП включать dNTP в растущую цепь РНК вместо соответствующего rNTP открыла возможность ферментативного синтеза нового неприродного типа нуклеиновых кислот — дезоксинуклеотидсодержащих РНК-подобных одноцепочечных полинуклеотидов, иными словами смешанных рибо/дезоксирибополинуклеотидов (СПН), в которых один или несколько типов rNMP заменены на соответствующий тип dNMP. В первой части работы мы попытались сформулировать общие принципы синтеза СПН определенного нуклеотидного состава и получить такие СПН в препаративных количествах.

Как известно, последовательность инициаторной области влияет на эффективность транскрипции, количество и тип абортивных продуктов реакции. Для исследования основных закономерностей препаративного синтеза СПН нами в качестве матриц для транскрипции был использован набор плазмид, содержащих консенсусную последовательность Т7 промотора (от положения -17 до -1 относительно старта транскрипции), GTP в +1 положении и различную последовательность нуклеотидов в области инициации (табл. 1).

Получение препаративных количеств СПН потребовало внесения существенных изменений в методики, разработанные ранее для синтеза РНК в стандартных условиях. Образование полноразмерных транскриптов регистрировали по данным

электрофорезов в ПААГ и агарозном гелях. Во всех случаях в качестве контролен были получены соответствующие РНК- продукты.

Таблица 1.

в качестве матриц при синтезе СПН.

Плазмид а/сайт 5'-концевая последовательность Длина

рестрикции РНК-транскрипта транскрипта

15 10 15

рРУ18/Я;ЫШ СООААииСОАССиСО 134

рРУ19Ш>я1 ССОААССииОСА1ЮС 109

рВ5К5Н-/£«ЛУ ССОССААтЮСАОСи 73

рБЕ1.ЕСТ-1/£соКУ ОСОСОААииСОАССи 642

рвЕМ-ИВатШ СССАОАССССААССи 42

рТ5¥о/ЕсоШ ССОССициАССШАС 77

рЬуз,3 /£соЫ ССОХЗОАиАССиСАС 86

рТ2К70/Яуи11 ОСООССОАиССАСиС 131

1 234 * « 7 I $ 10 11 М * ♦ ' т* щ* ш* тл ш

1ЩШ 0Ш

Рис. 1. Синтез РНК и СПН Туг639РЬе, 8сг641Л1и Т7 РНКП и Т7 РНКП дикого типа на матрице рРУ19/ЛЬа1. (А) 1% агарозный гель, окрашенный бромидом этидия. (Б) радиоавтограф 10% ПААГ. Дор. 1 - синтез РНК Т7 РНКП д.т. Дор. 2-11 - синтез СПН мутантом Т7 РНКП. Комбинации нуклеотидов в реакционной смеси: 2- гGTP, МТР, гТТР, гСТР; 3- гGTP, гАТР, ОТР, гСТР; 4- гGTP, гАТР, гТТР, аСТР; 5- аСТР, гАТР, гТТР, гСТР; 6- гGTP, гАТР, гТТР (контроль без гСТР); 7- ЮТР, гАТР, ОТР, аСТР; 8- гGTP, ЙАТР, dTTP,'гCTP; 9- гGTP, ЙАТР, гТТР, аСТР; 10- авТР, гATP, гTTP, аСТР; 11- гGTP, аАТР, ОТТР, аСТР

На рис. 1 представлены результаты агарозного (рис. 1А) и полиакриламидного (рис. 1Б) гель-элекгрофорезов продуктов, иолученньж в процессе гип-ойтранскрипции на матрице рРУ19/Л2>а1. Как видно, не все комбинации г/ЮТГ приводят к эффективному синтезу полноразмерного транскрипта. В частности, не было получено определяемых этими методами количеств dG-содержащего продукта. Уменьшение выхода остальных СПН наблюдали в следующем порядке РНК > dT-PHK > dC-PHK > (ПУС-РНК > сЗА-РНК, что соответствовало позиции первого включения нуклеотида в растущую цепь

<иО <1сСЗ ЛЕИ <*А11С|==Э <1АЛЕИ «ето шаг

120 100

I «0

'| 60 X •4

1 40 ?

6 20 О

-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-

О 1 2 3 4 5 в 7 а а 10 11 12 13 14 15 16 1? 18

ПОЗИЦИЯ ВКЛКПСЮН первого <1ЫМР

Рис. 2. Относительная эффективность промотор - зависимого синтеза СПН. (А) Выход СПН для различных использованных матриц. Эффективность синтеза РНК во всех случаях принята за 100%. (Б) Зависимость выхода моно-дезоксизамещенных СПН от позиции первого включения dNTP.

Практически такие же закономерности синтеза СПН были выявлены для большинства тестируемых плазмид. На рис. 2А представлена относительная эффективность синтеза СПН с различными комбинациями гДЮТГ. Включение dGMP во всех случаях не наблюдалось, а относительный выход синтезируемых продуктов полностью соответствовал позиции первого включения сЮТР. Последнее утверждение ясно иллюстрируется на рис. 2Б. Так, для плазмид рТ5Ро и рЬуэ.З не было получено dC-СПН (позиция первого включения С +2), тогда как для рОЕМ-2, где первое dTMP включение возможно только в позиции +15, эффективность синтеза dT-СПН практически равна таковой для РНК (98%). Вероятно, фермент становится

нечувствительным к различиям между гКТР и (СКГР, когда расстояние от старта транскрипции превышает некоторое фиксированное значение.

Представленные результаты позволяют предположить, что эффективный синтез СПН может быть достигнут при условии, что позиция первого включения (СКМР расположена после 5-6 нуклеотида относительно старта транскрипции. Как показано выше, для всех матриц, транскрипционная область которых начинается с ОТР, синтез (СО-содержащих СПН практически невозможен. Кроме того, синтез трех-сСКГР-замещенного СПН сильно затруднен. Для преодоления последнего обстоятельства был сконструирован новый вектор, рТ2Я7О, содержащий семь остатков (СОМР непосредственно после промотора в некодирующей цепи (табл. 1).

Рис. 3. Синтез РНК и СПН Tyr639Phe, Ser641 Ala Т7 РНКП на матрице ^TZRlG/Pvull. Представлен 1% агарозный гель, окрашенный бромидом этидия. Комбинации нуклеотидов в реакционной смеси: дорожка 1- контроль (без NTP); 2- rGTP, rATP, гТТР, гСТР; 3- rGTP, dATP, гТТР, гСТР; 4- rGTP, гАТР, dTTP, гСТР; 5- rGTP, rATP, гТТР, dCTP; 6- dGTP, rATP, гТТР, гСТР; 7- rGTP, dATP, гТТР, dCTP; 8- rGTP, rATP, dTTP, dCTP; 9- rGTP, dATP, dTTP, rCTP; 10- dGTP, rATP, гТТР, dCTP; 11- dGTP, dATP, rTTP, rCTP; 12- dGTP, rATP, dTTP, rCTP; 13- rGTP, dATP, dTTP, dCTP.

Результаты разделения продуктов реакции синтеза СПН на матрице рТ2Я7О в агарозном геле представлены на рисунке 3. Как видно, достигнут эффективный синтез всех типов СПН, за исключением (Ю-содержащих. Показана возможность синтеза трех замещенного СПН, САСССТ-СПН, с достаточно высокой эффективностью (26%). Таким образом, рТ2Я7О представляет собой удобную матрицу для получения СПН различного состава. Такая высокая эффективность синтеза обеспечивается положением первого влючения (СКМР в позиции +8. Этой точке предшествует олиго(гО) «праймер» (+1-+7), синтезируемый ферментом в начале синтеза.

Суммируя полученные результаты, можно сформулировать следующие закономерности синтеза СПН:

- эффективность синтеза СПН определенного г/сС-1гуклеотидного состава полностью определяется 5'-концевой последовательностью транскрипта;

- мутантная форма Т7 РНКП не способна инициировать синтез с (СКГР (или эффективность такого синтеза очень низка). Поскольку ОМР является

инициирующим нуклеотидом для всех известных Т7 промоторов, синтез dG-содержащих СПН в промотор - зависимой реакции практически невозможен; - эффективность утилизации dNTP мутантной формой Т7 РНКП увеличивается по мере удаления позиции первого включения dNMP от старта транскрипции. В начале реакции (позиции утилизации dNTP не происходит, в середине

области инициации (+2-+7) она принимает промежуточные значения, а в дальнейшем существенно увеличивается.

Мы предполагаем, что эти закономерности коррелируют с известным двуступенчатым механизмом Т7 РНКП - катализируемой транскрипции (Steitz T.A. et al, 1994). В соответствии с этим механизмом реакционный комплекс, состоящий из фермента, ДНК матрицы, NTP и РНК-продукта весьма не стабилен до тех пор, пока длина транскрипта не достигнет 8-10 нуклеотидов, при этом сохраняется большая тенденция к прерыванию синтеза. При встраивании нескольких следующих NTP в РНК-цепь транскрипт фиксируется в соответствующем сайте связывания, что значительно увеличивает стабильность комплекса и эффективность синтеза.

Для подтверждения изложенных выше предположений мы решили изучить возможность синтеза СПН мутантной формой Т7 РНКП в условиях отсутствия стадии инициации. Такой прием, т.е. проведение реакции в условиях неканонического синтеза по отношению к матрице/праймеру, должен был, по всей видимости, привести к получению более широкого спектра СПН.

Ранее в ряде работ было показано, что Т7 РНКП дикого типа способна удлинять короткие олигонуклеотидные дуплексы, используя в качестве субстратов rNTP. В нашей работе мы решили протестировать мутантную форму Т7 РНКП в системе, высокоспецифичной по отношению к ОТ ВИЧ-1.

Как известно, ОТ осуществляет синтез ДНК на вирусной РНК,

используя в качестве праймера Для нашего фермента в качестве матрицы

использовали фрагмент РНК ВИЧ-1, а в качестве праймера - тРНК1у5,3. На рисунке 4 показаны результаты разделения продуктов реакции удлинения на РНК-

матрице с помощью Tyr639Phe, Ser641AIa мутанта Т7 РНКП.

В предложенных условиях синтез СПН, как и РНК, мало эффективен по сравнению с каноническими условиями промотор-зависимой реакции. Тем не менее, полученные результаты позволяют сделать выводы об особенностях синтеза СПН в такой системе. Прежде всего, был получен dG-замещенный СПН, синтез которого являлся невозможным в промотор-зависимой реакции, а также двух- и трех-замещенные СПН, содержащие dG. Кроме того, показано удлинение РНК-праймера с помощью четырех dNTP, иными словами, синтез фрагмента ДНК. Эти результаты говорят о значительном расширении специфичности мутантной формы Т7 РНКП в отношении нуклеотидного субстрата. В данном эксперименте свойства мутантной Т7 РНКП в известной степени сближаются со свойствами ОТ ВИЧ-1.

Рис. 4. Синтез СПН мутантной формой Т7 РНКП в системе РНК-матрица/РНК-праймер. В качестве РНК праймера использовали природную ТРНКЬуй (дор. 10) или тРНКЬу"3-транскрипт (дор. 1-9). Комбинации нуклеотидов в реакционной смеси: дорожка 1- гОТР, dATP, гТТР, гСТР; 2- гОТР, гАТР, гТТР, аСТР; 3- аСТР, гАТР, гТТР, гСТР; 4- гОТР, ОАТР, гТТР, аСТР; 5- авТР, аАТР, гТТР, гСТР; 6- авТР, аАТР, гТТР, аСТР; 7- авТР, аАТР, аТТР, аСТР; 8- гОТР, гАТР, гТТР, гСТР; 9- контроль (без ЭТР); 10- гОТР, гАТР, гТТР, гСТР.

Следует, однако, заметить, что в данных условиях синтез ДНК представляет собой всего лишь удлинение праймера. Учитывая низкую эффективность этой реакции, можно утверждать, что получение таким способом препаративных количеств одноцепочечной ДНК для дальнейшего использования вряд ли возможно. Тем не менее, полученные данные подтверждают установленные нами основные закономерности синтеза СПН мутантной формой 17 РНКП.

Смешанные полинуклеотиды в качестве матриц для ОТ ВИЧ-1.

Как известно, ОТ ВИЧ-1, являющаяся ключевым ферментом метаболизма этого вируса, способна утилизировать как ДНК, так и РНК. В ряде работ было показано, что сродство ОТ по отношению к РНК- и ДНК- матрицам in vitro различается на один-два порядка (Pokholok D.K. et al, 1993). Причины таких значительных различий до конца не выяснены.

С другой стороны, на сегодняшний день интересным остается изучение феномена устойчивости ВИЧ-1 к различным ингибиторам, сопровождающегося появлением характеристических точечных мутаций в гене ОТ. Хотя по последним данным рентгеноструктурных исследований позиции мутаций устойчивости локализованы вокруг dNTP-связывающего центра, в ряде работ показано, что эти замены могут также влиять и на удерживание ферментом матрицы/праймера (Tantillo С. etal, 1994).

В данной части работы мы решили изучить возможность использования СПН в качестве матриц для ОТ ВИЧ-1 и ряда ее «АСТ-устойчивых» мутантных форм и сравнить основные характеристики этого процесса с таковыми для РНК и ДНК. Из ряда мутантных форм ОТ, обеспечивающих устойчивость к азидотимидину, нами были выбраны 4 фермента, несущие одну, две, три или четыре аминокислотные замены: Ьу821901п ОТ (ОТ219); Ар67АБп, Ьу821901п ОТ (ОТ67.219); Ар67АБп, Ту870Ав, Ту8219С1п ОТ (ОТ67,70,219); АврбТАвп, Ьу$70Аг& ТЬг215РЬе, Ьу821901п ОТ (ОТ67,70,215,219).

^ считываемая область (78 н.) " 5'

-Полноразмерная РНК или СПН (109 н.) -►

Рис. 5. Схема реакции обратной транскрипции, использованная в работе. В скобках указаны размеры полинуклеотидов.

В качестве субстратов мы использовали СПН, полученные на матрице рРУ19: сСС-РНК, сСТ-РНК и сСТсСС-РНК, а также РНК соответствующей последовательности. Полученные СПН и РНК отжигали с одним и тем же олигонуклеотидным праймером и использовали в качестве матрицы/праймера в реакции обратной, транскрипции, катализируемой ОТ и ее "А2Т-устойчивыми" мутантными формами. Количества полученных продуктов в реакциях с СПН сравнимы с таковыми для РНК-зависимого синтеза, что позволило провести кинетический анализ. Для всех используемых матриц наблюдали линейную зависимость эффективности синтеза от концентрации субстрата в двойных обратных координатах, что однозначно подтверждало, что СПН-зависимый синтез ДНК, катализируемый ОТ, подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен.

В работе нами было показано, что первичная последовательность СПН полностью идентична структуре РНК, поэтому сравнение значений кажущихся позволяет сделать выводы о чувствительности ОТ к соотношению остатков рибо- и дезоксирибонуклеотидов в матрице. В таблице 2 приведены величины К„,"* матрицы/праймера для ОТ дикого типа и «АСТ-устойчивых» мутантных форм. В соответствии с известной субстратной специфичностью, максимальное сродство ОТ проявлялось по отношению к ДНК, а минимальное - к РНК матрицам. Соответствующие значения для СПН занимали промежуточное положение.

Введение сПЧТР даже одного типа в РНК-цепь приводило к понижению величины Ко!"". Это утверждение справедливо как для нативной ОТ, так и для всех протестированных мутантов. По всей видимости, ОТ способна различать остатки гКТР и (СКГР в матричной цепи, и это вносит свой вклад в значение Кт**.

Таблица 2.

Значения для исследуемых РНК и смешанных полинуклеотидов.

Матрица

Фермент РНК ас- ат- сКМТ- ДНК К,^ Км

рнк РНК РНК

1200+170 370+20 275+48 178+87 15+2

ОТ д.т. (1150) (300) (440) (120) (18) 1.095 1.038

4 19 38 32 25

900+190 273+9 325+76 196+50 53+7

ОТ219 (740) (315) (400) (170) (50) 1.088 1.052

18 14 19 13 6

950+210 194+14 310+57 174+23 30+4

ОТ67,219 (760) (270) (360) (130) (30) 1.089 1.045

20 29 14 25 <1

810+145 322+40 500+90 155+48 27+5

0167,770,219 (960) (315) (430) (140) (30) 1.092 1.044

16 2 14 10 10

802+64 566+50 540+55 176+35 16+3

С)Т67,70Д 15,21 (1300) (360) (530) (140) (20) 1.097 1.040

9 39 36 2 21 20

Теоретические значения Кт"" , рассчитанные по уравнению 3, приведены в скобках, разница между теоретическими и экспериментальными величинами (%) выделена жирным шрифтом.

Для экспериментального подтверждения этого предположения мы провели дальнейший кинетический анализ. Согласно данным Реардона и др. (Reaгdon J.F. е/ а1, 1991), в случае ОТ для матрицы/праймера близка величине Поскольку синтез ДНК, катализируемый ОТ, представляет собой мультистадийный процесс, то в соответствии с соотношением Бриггса-Хэлдана, значение полной реакции синтеза

будет равно суперпозиции всех промежуточных равновесных стадий. Таким образом, синтез ДНК длиной N нуклеотидов может быть представлен следующим образом:

Кткюс = П{К)1 1

где К- «элементарная» равновесная константа для каждой стадии реакции.

Каждая стадия состоит из образования продуктивного комплекса между ферментом и матрицей/праймером с последующим связыванием нуклеотида и синтеза фосфодиэфирной связи. Связывание «правильного» dNTP в основном определяется взаимодействиями между приходящим субстратом и соответствующим нуклеотидом в последовательности матрицы. Поскольку сродство ОТ к ДНК и РНК значительно различается, можно предположить, что кроме контактов Уотсона-Крика между основаниями, остатки сахара (рибоза или дезоксирибоза), находящиеся в активном центре на каждой стадии, также вносят свой вклад в константу «элементарного» сродства. Это означает, что «элементарная» константа стадии, в которой приходящий

ё^ЭТР взаимодействует с комплементарным рибонуклеотидом в матричной цепи (/ТГЧ|), должна отличаться от константы в случае контактов (ЮТР-дезоксирибонуклеотид №-<1).

Таким образом, в случае СПН-матрицы длиной N нуклеотидов с числом рибонуклеотидов п, сггоавелливо следующее твенство:

Ктк™=(Кы)' X 2

где КТ.4 и Кб-ь- «элементарные» константы реакционных стадий. Следовательно,

1пА"шк,ж=[п х 1п(/Гг-а + N х 1пАГ« 3

и график зависимости К,^ от п должен быть линейным, отсекая на оси ординат значение и с тангенсом угла наклона Такого вида зависимость на

основе значений К„,*** для СПН, полученньж в нашей работе, приведена на рисунке 6. Теоретические значения Кщ"", рассчитанные по уравнению 3 (табл. 2, приведены в скобках), хорошо согласуются с экспериментальными. Таким образом, полученные данные подтверждают предположение о том, что остатки сахара цепи матрицы, находящиеся в активном центре фермента, влияют на характер ДНК-белковых взаимодействий, что находит отражение в значениях

In^"**

РНК».

dC-PHK^"^

dCdT-PHK ■ ____ » / dT-PHK

ДНК

О 20 40 60 80

Рис. 6. Зависимость Ктт матрицы/праймера от рибо-/дезоксиробо- состава матрицы. Значения 1п/кт для ОТ д.т. (таб. 2) отложены в соответствии с количеством рибонуклеотидов в матрице (п). Прямая подчиняется уравнению 3 (считываемая область матрицьгМ=78). 1.095 нМ; /^=1.038 нМ; г=0.98429.

Сравнение величин для ОТ дикого типа и ее мутантных форм

показало, что эти величины близки (табл. 2). Этот результат означает, что «АСТ-устойчивые» мутанты, по всей видимости, не чувствительны к тонким взаимодействиям между входящим (ЮТР и остатком нуклеотида матрицы, с которым он спаривается. Это

не удивительно, поскольку остатки замещенных аминокислот (67, 70 и 215) расположены достаточно далеко от сайта связывания dNTP и не способны непосредственно влиять на образование комплементарной пары между входящим нуклеотидом и соответствующим остатком матрицы. Только остаток 219 локализован возле dNTP связывающего сайта, но его роль, вероятно, сводится в основном к изменению сродства фермента к азидо-группе, и он также не принимает непосредственного участия в образовании комплементарной пары в активном центре фермента.

Таким образом, можно полагать, что ОТ специфична не только к типу приходящего нуклеотида (rNTP или dNTP), но и чувствительна к структуре сахарного фрагмента в каждом нуклеотидном остатке матричной цепи. Хотя на сегодняшний день не известны аминокислотные остатки ОТ, принимающие непосредственное участие в распознавании типа нуклеотидов (рибо- или дезоксирибо-) в составе матрицы, полученные нами кинетические 1 параметры явно свидетельствуют в пользу этого утверждения. Следует отметить, что использованный в работе кинетический подход, по всей видимости, применим и для других нуклеотид-полимераз. Таким образом, полученные результаты демонстрируют перспективность использования СПН в качестве инструмента для изучения белково-нуклеиновых взаимодействий.

Исследование взаимодействия ОТ ВИЧ-1 с модифицированными праймерами. содержащими 2'-0-(В-Р'-рибофуранозил)аденозин

Как было показано выше, ОТ способна различать отдельные остатки рибо- и дезоксирибонуклеотидов в цепи матрицы. Но происходящие при этом изменения можно увидеть только на кинетическом уровне. Введение в цепь праймера более объемного дополнительного заместителя, по нашему мнению, должно привести к значительным изменениям характера синтеза. Кроме того, ингибирование ОТ олигонуклеотидами изучено мало. Описанные примеры такого рода представляют собой праймеры, несущие терминирующий нуклеотид на З'-конце (Canard В. et al, 1998). В связи с этим нам представляется интересным поиск олигонуклеотидных ингибиторов другого строения.

В качестве неканонических праймеров для ОТ ВИЧ-1 нами было решено использовать дезоксирибоолигонуклеотиды, содержащие в различных положениях остаток -рибофуранозил)аденозина (рис. 7). Синтез модифицированных

нуклеотидов был ранее разработан проф. С.Н. Михайловым (Институт молекулярной биологии РАН). Проведенные впоследствии физико-химические исследования показали, что включение такого объемного заместителя в 2'-0-положение не оказывало заметного влияния на термостабильность дуплекса. Методом ЯМР было обнаружено, что РНК в составе дуплекса соответствует спирали А-типа, а дополнительный рибозный остаток экспонирован в малую бороздку дуплекса. Этот

остаток принимает СЗ'-эндо-конформацию, а дополнительная О-гликозидная связь характеризуется торзионным углом 02'-С1"-С2"-02", равным - 134° (Ейш^уа Е.М. Л а1, 2003).

X =

А<Ь

__Л1

—о 1 но он

П1 5'-ОТТ-ОТА5'-САС -ААА-СС-З' П2 5 '-ОХС-ШТ-ОТА-ААА-СО-З' ПЗ 5'-ОАС-СТТ-ОТХ-ААА-СО-3' П4 5 '-в АС-СТТ-СТА-ХАА-СС-З' П5 З'-ОАС-ОТТ-СТА-АХА-СО-З' П6 5 '-в АС-ОТТ-ОТА-ААХ-СО-З' матрица 3'-(64н)-СШ-САА-САи-иии-ОСи-ОСС-(69н)-5'

Рис. 7. Структура использованных в работе олигонуклеотидов, содержащих остаток -рибофуранозил)аденозина в различных положениях.

праймер+1 _(16 и)

ет— 1 # ш # * -

Рис. 8. Удлинение 5'-[32Р]-меченных модифицированных праймеров ОТ ВИЧ-1. Дорожки: 1- праймер П1 (контроль); 2- П2; 3- ПЗ; 4- П4; 5- П5; 6- П6.

В качестве матрицы в ОТ-катализируемой реакции использовали РНК-фрагмент длиной 149 нуклеотидов, полученный в результате Т7-транскрипции линеаризованной плазмиды Очищенный транскрипт отжигали с одним из праймеров, и

полученный дуплекс использовали в реакции, катализируемой ОТ ВИЧ-1.

На рисунке 8 представлены результаты гель-электрофореза разделения продуктов реакции удлинения праймеров, содержащих остаток рибофуранозил)аденозина. Как видно, праймер П2, несущий модификацию в положении -13 от 3'-конца (или реакционного центра) удлиняется практически с той

же эффективностью, что и не модифицированный П1. По мере того, как позиция модификации сдвигается к З'-концу праймера, эффективность элонгации падает, хотя при этом не наблюдается прямой зависимости: праймер П4, модифицированный в положении —5 удлиняется более эффективно, чем ПЗ с заместителем в —6 позиции. В то же время олигонуклеотид П5 (модификация в положении -4) не удлиняется ОТ, а праймер П6, несущий заместитель еще ближе к З'-концу, удлиняется только на один нуклеотид. Другими словами, в реакции с П6 сЮТР формально действует как терминатор синтеза. В связи с этим, можно предположить, что для эффективной элонгации важна не только относительная удаленность модифицированного нуклеотида от 3'-конца праймера, но и особенности его расположения в нуклеотидной цепи, определяющиеся топографией сайта связывания праймера фермента. Можно предположить также, что в случае П6 причиной остановки реакции после удлинения на одно звено и последующей изомеризации Е8 комплекса является идентичность последнего тому, который был сформирован с праймером П5.

Кинетические параметры реакции удлинения праймеров на один нуклеотид (Кт и относительная Кит) представлены в таблице 3. Как видно, значения Кт и ^пих изменяются незначительно. Параметр как известно, определяет

эффективность ферментативной реакции и коррелирует с общим выходом продукта в реакции с четырьмя (СКГРв. Как видно из таблицы, в случае праймера П4 (модификация в позиции - 5) параметры Кт и уменьшаются. Снижение Кт, по всей видимости, может сопровождаться появлением новых водородных связей между дополнительным рибофуранозным мотивом и ферментом, а уменьшение -

образованием каталитически некомпетентного фермент-субстратного комплекса. Однако, два низких значения приводят к достаточно значительной величине

параметра Улт/Кт и, следовательно, эффективному удлинению праймера. Из таблицы также видно, что кинетические параметры реакции удлинения праймера П6 на один нуклеотид близки к таковым для немодифицированного нуклеотида П1.

Таблица. 3.

Кинетические параметры реакций удлинения праймеров, несущих остаток 2'-0-([Н5-рибофуранозил)аденозина.

Праймер Продукт Удлинение Кт, мкМ Кт«, отн. единицы Утах^Кт

П1 ДНК 100% 0,45 ±0,11 100 222

112 ДНК 90% 0,62± 0,13 100 161

ПЗ ДНК 10% 1,47±0,24 86 58

П4 ДНК 15-20% 0,19 ±0,05 18 93

П5 Удлинения нет, Ю = 1,05 ±0,33

П6 Короткий продукт, +1 нуклеотид 90% 0,56± 0,07 100 178

В присутствии немодифицированного праймера Ш олигонуклеотиды ПЗ-П6 также являются эффективными конкурентными ингибиторами реакции В целом, значения Кх близки соответствующим величинам Кт что подтверждает близость последних к истинным константам диссоциации комплекса фермент-матрица/праймер. А.

Номер нукпеотида в праймере 4»

10 17 18 19 20 22

5' С-АСТ-ССС-ТС*Т-ТС0-А0С*-0*С«С*-00 3'

2 3 4 5 6 праймеры

-13 -6 -5 -4 -3 -1

Позиция нуклеотида относительно началаэлонгации цепи ДНК

Б.

Рис 9. Моделирование связывания модифицированных праймеров в активном центре ОТ. А. Структура олигонуклеотидных праймеров. Положения модифицированных нуклеотидов отмечены звездочками Б. Модель связывания праймеров 5 и 6 в активном центре ОТ. Показана только цепь ДНК-праймера. Близкие межатомнае контакты между дополнительной рибозой и белком, составляющие менее 70% от суммы ковалентных радиусов, выделены жирным.

Для более подробного рассмотрения поведения олигонуклеотидов в реакции нами были построены модели связывания модифицированных праймеров в активном центре ОТ на основании данных, полученных для трехмерной структуры ОТ с матрицей и праймером (Huang H. et al, 1998). Моделирование проводили с помощью программы WebLabViewerPro 3.7 (Molecular Simulations Inc) в соответствии с инструкциями фирмы-изготовителя. Расположение и конформация дополнительного остатка рибозы были смоделированы в соответствии со структурой декамерного РНК-дуплекса, содержащего -рибофуранозил)аденозин, определенной методом

ЯМР (см. выше). В качестве оценки стерических препятствий были выбраны близкие межатомные контакты между дополнительной рибозой и белком, составляющие менее

70% от суммы ковалентных радиусов Введение дополнительных остатков рибозы в нуклеотиды 19 и 20 из комплекса ОТ/матрица/праймер (Huang H. et al, 1998), топологически соответствующих модификациям в праймерах П5 и П6, продемонстрировано на рис. 9.

Как видно из рисунка, в случае праймера П5 присутствуют значительные межатомные взаимодействия между дополнительным рибозным остатком и боковыми цепями аминокислотных остатков Lys 263 и Тгр266. Следует отметить, что данные аминокислотные остатки входят в состав а-спирали Н фермента (helix H), которая, как известно из данных рентгеноструктурного анализа, является единственным структурным элементом ОТ, контактирующим с малой бороздкой ДНК-дуплекса в активном центре фермента. Для П6 (а также П2-П4) таких взаимодействий не обнаруживается. Таким образом, праймер 6 остается в значительной мере стерически свободным, что дает ему возможность корректно взаимодействовать с активным центром ОТ и вступать в реакцию с входящим нуклеотидом. После одного шага элонгации и последующей изомеризации комплекса П6 становится идентичным комплексу, образуемому праймером П5, и реакция останавливается.

Таким образом, дополнительный 2'-рибофуранозный остаток в положении —4 ДНК-праймера препятствует его удлинению ОТ ВИЧ-1, что объясняется значительными стерическими препятствиями при взаимодействии этого заместителя с аминокислотными остатками ос-спирали Н ОТ. Мы полагаем, что такие праймеры с объемными заместителями могут быть использованы для специфического ингибирования различных полимераз.

Взаимодействие ОТ ВИЧ-1 и Т7 РНКП с фосфонатными аналогами NTP и неорганического пирофосфата

Заключительная часть работы была посвящена изучению специфичности исследуемых нами ферментов в отношении функционально важной группировки нуклеозидтрифосфата, непосредственно участвующей в реакции, а именно - его пирофосфатной части (остатка трифосфата). Предстояло оценить влияние введения заместителей в это положение на субстратные или ингибиторные свойства соответствующих соединений. При этом в качестве объектов исследования были выбраны модифицированные производные как NTP (субстрата), так и неорганического пирофосфата являющегося одним из продуктов реакции полимеризации -

"уходящей группой" субстрата.

Структурные формулы аналогов и NTP приведены на рис. 10 и 12, соответственно. Как видно из рисунков, аналоги обоих типов (за исключением соединений 11, 12) содержат метиленбисфосфонатную группировку, несущую различные заместители у атома углерода. Тестируемые соединения 1-10 и 13-23 были

любезно предоставлены проф. М.Я Карпейским и проф. С.Н. Михайловым (Институт молекулярной биологии РАН), а соединения 11 и 12 Г.Б.ФДиксоном (Факультет биохимии Кембриджского Университета, Кембридж, Великобритания).

Все исследованные нами аналоги являлись конкурентными ингибиторами Т7 РНКП и ОТ.

-P-ONa I

ON»

llO-P-O-ONa

97±Ю 4.6±0.8

О О

II II НО—P-CHj-P—ONa

ONa ONa

/72±33 (7.1 ±1.4)

CHj

NaO

О I О i-ri„F-

- ONa

I OH | OH ONa

300±46 (19.4±2.7)

HO-

P-0

a i о

2304±241 (36.1±9.1)

он

51±4 (10.7±0.7)

0 н о

luk11

NaO-Г I P-ONi

1 NHl HO I OH

НО-Д Я1»

Q-OH

CH,

6.9±0.5 (7.0±1.6)

Ini

0 н о

ii.ii N.O-HP-ON«

1 NHl HO I OH

,<4

СЦ

360±5S (34.1±1.5)

NaO-

P-ONa

ONa

HjN 106±19 (37.7±2.1)

P—ONa ^ONa

v."

NaO—r P—ONa

' 4 I

OH >OH 7H HN 0=^-0—V NCHj

ONa /=\

CHi

965±I56 (4.6±0.6)

CH2(-AS03H2)2X 2СбНпШ2 >5000 (>500)

H2O3AS-CH2-PO3H2X3

CeHnNHj

>5000

(41.96±0.57)

II/

NaO-P

H3C CHj

250±26 (35.1 ±4.9)

Рис. 10. Ингибирование T7 РНКП и ОТ ВИЧ-1 аналогами иирофосфата. Курсивом выделены значения констант ингибирования Т7 РНКполимеразы [К,(АТР), мкМ]. Значения констант ингибирования ОТ ВИЧ-1 — в скобках [KXdATP), мкМ].

Ингибирование аналогами РР,. На рис. 10 приведены значения констант ингибирования Т7 РНКП и ОТ аналогами РР,. Исследованные соединения можно условно разделить на три группы: аналоги метиленбисфосфоновой кислоты, имеющие один или два небольших заместителя у атома углерода (2-6), аналоги с более объемными заместителями, содержащие ароматические группы (7-10) и соединения, несущие атом Л вместо Р (арсенаты) (11-12). Как видно, последние соединения (11, 12), не оказывали заметного влияния на каталитическую способность обоих ферментов.

Сравнение величин констант ингибирования ОТ и Т7 РНКП показывает, что ОТ ингибируется существенно более низкими концентрациями аналогов (за

исключением соединения 9). Этот факт не является неожиданным, поскольку как значения для пирофосфата (1), так и величины для нуклеозидтрифосфатов (Туницкая В.Л. и соавт., 1994) также соответствуют этой тенденции, что, вероятно, отражает разницу в строении активных центров этих ферментов.

Анализируя полученные данные, можно видеть, что в ряду соединений, содержащих неароматические заместители у атома углерода, мы не обнаружили ингибитора, обладающего более сильным действием, чем неорганический пирофосфат, как для ОТ, так и для Т7 РНКП. В случае ОТ введение дополнительных заместителей в молекулу метиленбисфосфоновой кислоты и увеличение их размера приводит к уменьшению ингибирующего эффекта. Для Т7 РНКП эта закономерность также прослеживается. Единственным исключением является соединение (4), .К, которого близка к таковой для пирофосфата. Этот факт, возможно, объясняется дополнительными взаимодействиями между заряженной аминогруппой ингибитора и аминокислотными остатками в центре связывания пирофосфата.

Ингибирование Т7 РНКП соединениями, несущими ароматические группировки в боковом заместителе (7-10), носит более сложный характер. Введение пиридоксиламино заместителя (соединения 7 и 9), несмотря на его большой объем, не только не приводит к потере сродства к ферменту, но, напротив, существенно усиливает ингибирующий эффект. При этом введение дополнительной фосфатной группы (соединения 8 и 10) приводит к резкому падению ингибирующего действия. Нельзя исключить, что такое падение связано с компенсацией положительного заряда пиридинового кольца (выше уже отмечалось повышение ингибирующей способности при введении положительно заряженной аминогруппы, соединение 4). Из полученных данных также явно видно влияние длины углеродной «ножки» на степень ингибирования. В случае Т7 РНКП более предпочтительной является короткая «ножка» (АГ, (7) > К, (9), а К, (8) > К, (10)). Таким образом, можно предположить, что вблизи участка связывания пирофосфата содержится отрицательно заряженный аминокислотный остаток (остатки), способные реагировать с положительно

заряженными группировками аналога. Из конкурентного характера ингибирования следует, что пирофосфат (или его аналог) связывается в сайте связывания нуклеозидтрифосфата, очевидно, занимая площадку, предназначенную для его трифосфатной части. Согласно данным рентгеноструктурного анализа (Cheethman G.M.T., Steitz ТА., 1999), именно в этом участке расположены остатки Asp537 и Asp812, координированные с ионами Mg* и, принимающие участие в катализе. Весьма привлекательным в этой связи выглядит предположение, что именно эти остатки реагируют с положительно заряженными группировками аналога. Естественно, такое взаимодействие должно приводить к резкому повышению связывания последнего.

Рис. 11. Моделирование связывания соединений 7, 8 (а) и 9,10 (б) в активном центре Т7 РНКП. Атомы фосфора бисфосфонатной группировки аналогов совмещены с атомами PJ5 и Ру приходящего NTP. rib соответствует положению рибозного фрагмента праймера, Р — фосфатной группе в пиридиновом кольце аналогов (у соединений 7 и 9 отсутствует). щ т - постулируемая связь между пиридиновым азотом и Asp812 • • • - электростатическое отталкивание

Для проверки этого предположения мы провели моделирование связывания соединений 7-10 в активном центре Т7 РНКП с использованием программы WebLabViewer. В качестве исходной модели была использована структура комплекса Т7 РНКП с матрицей и субстратом (Cheethman G.M.T., Steitz T.A., 1999). Результаты моделирования представлены на рис. 11 а,б. Как видно из рисунка, введение дополнительного фосфатного заместителя в пиридиновое ядро (соединения 8, 10) приводит к нежелательному сближению последних (2,3 и 2,6 А, соответственно) с остатком Asp537 (данный остаток координирован со вторым ионом Mg2*, который, по всей видимости, улучшает свойства РР, как уходящей группы). Кроме того, для аналогов с длинной «ножкой» (7, 8) наблюдается стерически неблагоприятное взаимодействие с остатком His811 и рибозным фрагментом праймера. В случае

б.

- стерические препятствия

соединений с короткой «ножкой» (9, 10) такое взаимодействие отсутствует. Для «наихудшего» из аналогов 8 (К, = 965 тМ) наблюдается как взаимодействие фосфата с Лр537, так и стерические препятствия, для следующего по величине К{ = 360 тМ (10) - взаимодействие фосфата с Лр537 сохраняется, но стерические препятствия отсутствуют. Для соединения (7) при наличии стерических препятствий образование дополнительной связи между азотом пиридинового кольца с карбоксильной группой Лр812 приводит к небольшому увеличению сродства по сравнению с РР* (АГ[ = 51 шМ). Наконец, образование этой связи наряду с отсутствием как взаимодействия фосфат- Лр537, так и стерических препятствий (соединение 9) приводит к повышению сродства по сравнению с пирофосфатом примерно на порядок

Таким образом, наблюдаемые в модели особенности прямо коррелируют с полученными величинами K1 ,что с определенными оговорками свидетельствует о ее применимости.

Рассматривая в том же аспекте ингибирование ОТ, следует сказать, что только соединение (8) способно подавлять синтез ДНК на том же уровне, что и природный пирофосфат, остальные соединения являются более слабыми ингибиторами ОТ. В данном случае не просматривается такого явного влияния длины углеродной "ножки" или наличия дополнительного фосфата, как для Т7 РНКП. Предпочтительными являются соединение (8) с длинной ножкой и дополнительным фосфатом и соединение (9) без фосфата и с короткой "ножкой". Интересно, что последнее соединение имеет одинаковые (в пределах ошибки) константы и для Т7 РНКП и для ОТ. Универсальный характер этого ингибитора может служить одним из доказательств сходного строения этих полимераз и, в частности, сайта связывания КТР, несмотря на различные кинетические параметры реакции полимеризации.

Модифицированные NTP в качестве субстратов 77 РНКП. Как указано выше, Рй представляет собой один из продуктов полимеразной реакции, играя роль уходящей группы. В связи с этим весьма интересно исследовать фосфонатные производные нуклеозидтрифосфатов, где эту роль выполняет бисфосфонатная группировка. Нами были изучены модифицированные нуклеозидтрифосфаты рибо-(соединения 13-21) и дезоксирибо- (22-23) ряда в качестве субстратов и/или ингибиторов Т7 РНКП и ОТ, соответственно (рис. 12). При использовании соответствующим ферментом этих соединений в качестве субстратов, уходящей группой в случае соединений (14-16, 22) является метиленбисфосфонат (2), а для (1721 и 23) - замещенный бисфосфонат (3).

Нами показано, что Т7 РНКП способна синтезировать продукт той же длины, что и при синтезе природной РНК, используя соединение (15) вместо иТР и соединение (16) вместо АТР, хотя и с гораздо меньшей интенсивностью. Фермент не может встраивать остальные модифицированные КТР при синтезе протяженных РНК-продуктов (длиннее продуктов абортивного синтеза). Как было сказано выше,

уходящей группой для встраивающихся соединений является метиленбисфосфоновая кислота (2). Таким образом, можно утверждать, что метиленбисфосфонат является лучшей уходящей группой по сравнению с соединением (3), а более высокое значение (3) говорит о большем сродстве фермента к бисфосфонату (2).

Рис. 12. Анализ ингибирования аналогами NTP T7 РНКП и ОТ ВИЧ-1. Курсивом выделены значения констант ингибирования Т7РНКполимеразы [К,(АТР), мМ]. Значения констант ингибирования ОТ ВИЧ-1 - в скобках [/f,(dATP), мкМ].

Для соединений (15) и (16) нами были определены кинетические параметры реакции встраивания модифицированных нуклеотидов в растущую цепь РНК. Как видно из таблицы 4, Кт модифицированных нуклеотидов повышается на два порядка по сравнению с природными субстратами, сродство фермента к этим аналогам значительно меньше. Вместе с тем, максимальная скорость реакции уменьшается не так значительно. Исходя из этого, можно предположить, что лимитирующей стадией реакции является связывание аналогов субстратов, а не сама реакция полимеризации.

Таблица 4.

Кинетические параметры встраивания аналогов ОТР в РНК-продукт в реакции Т7 РНКП.

Ингибирование модифицированными нуклеозидтрифосфатами. На рис. 12 представлены константы ингибирования ферментов модифицированными нуклеозидтрифосфатами. Как видно, большинство этих соединений являются очень слабыми ингибиторами Т7 РНКП, а для соединений (14) и (20) ингибирующего эффекта не выявлено. Значения К-, ингибиторов находятся приблизительно на одном уровне и превышают природного пирофосфата на два порядка.

ОТ ВИЧ-1 более чувствительна к соединениям этого типа. Наряду с довольно слабыми ингибиторами нами выявлены четыре соединения, оказывающих заметное ингибирующее действие на фермент (соединения 16, 21-23). Как видно из

приведенных структур, это два аналога, представленных в рибо- и дезоксирибо-«вариантах». Ингибиторы дезокси-ряда имеют более низкие значения К, по сравнению с их рибо-аналогами, что не удивительно, поскольку сродство рибонуклеозидтрифосфатов к ОТ невелико. С другой стороны, соединения (16) и (22), как отмечалось выше, несут в своем составе метиленбисфосфонат (2), а соединения (21) и (23) - замещенный бисфосфонат (3). Как и в случае Т7 РНКП, сродство ОТ к остатку бисфосфоната (2) выше (см. рис. 10).

Таким образом, можно отметить, что ряд производных дифосфата являются высокоспецифичными ингибиторами ОТ. Для некоторых из них (соединения - 7, 8, 9, 22) константы ингибирования близки к таковым для пирофосфата. Если учесть, что эти соединения не расщепляются неорганической пирофосфатазой при их действии in vivo или в культурах клеток, можно ожидать значительного ингибирования репликации ВИЧ-1. Естественно, это предположение требует дальнейшей экспериментальной проверки. В то же время, как аналоги пирофосфата, так и фосфонатные производные NTP достаточно слабо ингибируют Т7 РНКП. Единственным исключением является соединение (9), представляющее собой в настоящее время самый мощный ингибитор фермента.

Говоря о специфичности ОТ ВИЧ-1 и Т7 РНКП в отношении трифосфатной части приходящего нуклеотида, исходя из полученных данных, можно предположить, что ферменты чувствительны к малейшим изменениям в этой области. Даже замена остатка пирофосфата на незамещенный метиленбисфосфонат приводит к значительному ухудшению субстратных свойств таких соединений, а аналоги, содержащие замещенную метиленбисфосфанатную группировку вообще не являются субстратами. Ферменты также способны различать природный пирофосфат и аналоги, содержащие атом As вместо Р. Вероятно, модификации, вносимые нами в структуру NTP и кажущиеся на первый взгляд небольшими, приводят к значительным изменениям в пространственной организации молекул. Как следствие, нарушается координация фосфатной группы атомами металла в активном центре фермента, что и сказывается на эффективности катализа. Это утверждение частично подтверждается проведенными нами модельными построениями для нескольких соединений в активном центре Т7 РНКП. Таким образом, можно утверждать, что специфичность нуклеотид-полимераз in vitro в отношении фосфатной группировки NTP достаточно высока, хотя, по всей вероятности, несколько меньше той, которую проявляют эти ферменты при выборе правильного (рибо- или дезоксирибо-) углеводного остатка.

ВЫВОДЫ.

1. Исследована реакция ферментативного синтеза нуклеиновых кислот нового типа - смешанных рибо/дезоксирибонуклеотидов (СПН), катализируемая мутантной формой РНК-полимеразой бактериофага Т7 Tyr639Phe, Ser641AIa. Установлено, что эффективность включения дезоксирибонуклеотида зависит от его позиции относительно начала транскрипции. Инициация транскрипции с дезоксирибонуклеозидтрифосфата. в наших условиях не наблюдалась, а эффективное включение dNMP происходило примерно с 6-7 позиции. Отработаны условия препаративного получения моно-, ди-. и тризамещенных СПН.

2. Показано, что СПН являются эффективными матрицами в реакции, катализируемой ОТ ВИЧ-1. Посредством кинетического анализа выяснено, что ОТ действует избирательно не только при выборе типа приходящего нуклеотида (rNTP или dNTP), но и чувствительна к структуре сахарного фрагмента в каждом нуклеотидном остатке матричной цепи.

3. Обнаружен принципиально новый принцип ингибирования ОТ ВИЧ, достигаемый за счет введения остатка -рибофуранозил)аденозина в определенное положение праймера. При этом формальным терминатором реакции является природный нуклеозидтрифосфат, а эффект терминации достигается за счет невозможности связывания ферментом праймера, удлиненного на одно нуклеотидное звено.

4. Изучена специфичность Т7 РНК-полимеразы и ОТ к метиленбисфосфонатным аналогам неорганического пирофосфата и r/dNTP. Найден универсальный ингибитор этих ферментов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. S.O.Gudima, E.G.Kazantseva, DAKostyuk, I.L.Shchaveleva, O.I.Grishchenko, L.V.Memelova, S.N.Kochetkov. Deoxyribonucleotide-containing RNAs: a novel class of templates for HIV-1 reverse transcriptase. Nucl.Acids.Res., 1997, Vol. 25, pp. 4614-4618.

2. S.O.Gudima, DAKostyuk, O.I.Grishchenko, V.L. Tunitskaya, L.V.Memelova,

5.N.Kochetkov. Synthesis of mixed ribo/deoxyribopolynucleotides by mutant T7 RNA polymerase. FEBS Lett., 1998, Vol. 439, pp. 302-306.

3. О.И.Андреева, Е.В.Ефимцева, Н.Ш.Падюкова, С.Н.Кочетков, С.Н.Михайлов, Г.Б.Ф.Диксон, М.Я.Карпейский. Взаимодействие обратной транскриптазы ВИЧ-1 и РНК-полимеразы бактериофага Т7 с фосфонатными аналогами NTP и неорганического пирофосфата. Молекулярная биология, 2001, т. 35, с. 1-13.

4. O.I.Andreeva, A.S.Golubeva, S.N.Kochetkov, AVan Aerschot, P.Herdewijn, E.V.Efimtseva, B.S.Ermolinsky, S.N.Mikhailov. An additional 2'-ribofuranose residue at

a specific position of the DNA primer prevents its elongation by HIV-1 reverse transcriptase. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2002, Vol. 12, pp. 681-684.

5. Mikhailov S.N., Efimtseva E.V., Ermolinsky B.S., Bobkov G.V., Andreeva O.I., Golubeva A.S., Kochetkov S.N., Van Aerschot A., Schepers G., Herdewijn P. Oligonucleotides containing disaccharide nucleosides: synthesis, physicochemical, and substrate properties. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 2003, Vol. 22, pp. 1117-

1118.

№ - 51 1 в

Подписано в печать 05 марта 2004 г. Заказ 402. Формат 60 х 90/16. Тираж 100 экз.

Отпечатано в салоне оперативной печати АртПолиграф. Москва, Б. Якиманка, 13, оф. 410. Тел 778-97-47

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Андреева, Ольга Игоревна

Список сокращений.

Введение.

I. ДНК- и РНК-полимеразы: структурно-функциональное разнообразие и единый каталитический механизм (литературный обзор).

1.1. Пространственная структура односубъединичных нуклсотид-полимсраз.

1.2. Структура активного центра и связывание субстратов.

1.2.1. Структурные мотивы.

1.2.2. Связывание матрицы/праймсра.

1.2.3. Связывание нуклеозидтрифосфатов.

1.3. Катализ полимеразной реакции.

1.3.1. Ионы металла в активном центре полимеразы.

1.3.2. Конформационные изменения полимераз при связывании субстратов.

1.3.3. Процессивность полимераз.:

II. Материалы и методы.

11.1. Материалы.

11.1.1. Ферменты.

11.1.2. Реактивы.

П.1.2.Нуклеозиды, нуклеотиды и их производные.

11.1.4. Среды для культивирования клеток E.coli.

11.1.5. Плазмиды, использованные в работе.

11.2. Методы.

11.2.1. Выделение и очистка Т7 РНКП и ее мутаитной формы

Tyr639Phe, Scr641 Ala Т7 РНКП).

11.2.2. Выделение обратной транскритазы ВИЧ-1 и ее мутантных форм.

11.2.3. Электрофорез белков.

11.2.4. Препаративное выделение плазмидной ДНК.

11.2.5. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции.

11.2.6. Транскрипция in vitro. Получение смешанных полинуклеотидов.

11.2.7. Электрофорез образцов нуклеиновых кислот в ПЛАТ.

11.2.8. Электрофорез образцов в агарозном геле. Элюция из геля.

11.2.9. Определение эффективности полимеразной реакции.

11.2.10. РНК/РНК-полимеразная реакция, катализируемая формы

Tyr639Phc, Ser641Ala Т7 РНКП.

11.2.11. Реакция обратной транскрипции.

11.2.12. Получение [иР]-мечсных ДНК и олигонуклеотидов.

11.2.13. Секвенирование РНК и СПН.

11.2.14. Получение активированной ДНК.

11.2.15. Определение констант ингибирования аналогами пирофосфата и нуклеотидов.

11.2.16. Включение модифицированных rNTP в РНК-продукт реакции

Т7 РНКП.

II.3. Построение пространственных моделей.

11.3.1. Моделирование связывания модифицированных праймеров в активном центре ОТ.

11.3.2. Моделирование связывания аналогов в активном центре Т7 РНКП.

III. Неканонические субстраты и матрицы в реакциях, катализируемых РНК-полимеразой бактериофага Т7 и обратной транскиптазой ВИЧ-1. (обсуждение результатов)

111.1. Синтез смешанных рибо/дезоксирибополинуклсотидов мугантной формой Т7 РНКП.

111.2. Смешанные полинуклеотиды в качестве матриц для ОТ ВИЧ-1.

111.3. Исследование взаимодействия ОТ ВИЧ-1 с модифицированными праймерами, содержащими 2'-0-(Р-0-рибофуранозил)адснозин.

111.4. Взаимодействие ОТ ВИЧ-1 и Т7 РНКП с фосфонатными аналогами

NTP и неорганического пирофосфата.

IV. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Неканонические субстраты и матрицы в реакциях, катализируемых РНК-полимеразой бактериофага Т7 и обратной транскриптазой ВИЧ-1"

Нуклеотид-полимеразы (ДНК- и РНК-полимеразы разных типов) представляют собой большой класс ферментов, ответственных за синтез ДНК и РНК в клетке и катализирующих единую химическую реакцию — синтез 3'-5'-фосфодиэфирной связи между рибо- или дезоксирибонуклсотидами. Большая часть этих ферментов представляют собой сложные мультисубъсдиничные комплексы, исследование которых во многих случаях затруднительно. В то же время существует значительное число нуклеотид-полимераз, сохраняющих весь спектр функций, но гораздо более простых по строению (в частности, односубъединичпых). Последнее обстоятельство делает такие полимеразы наиболее удобными моделями для изучения фундаментальных механизмов биосинтеза нуклеиновых кислот и позволяет получить максимум достоверной информации об их структуре и особенностях катализируемых ими реакций.

Особое место в исследованиях нуклеотид-полимераз занимает анализ их субстратной специфичности. Выяснение вопросов о том, какие факторы влияют на выбор нуклеотид-полимеразой РНК или ДНК матрицы, рибо- или дсзоксирибонуклеозидтрифосфата (rNTP или dNTP) представляются основополагающими в нашем понимании их функционирования.

Целыо настоящей работы являлся поиск критериев, влияющих на выбор субстратов, для представителей двух различных семейств нуклеотид-полимераз: ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7 (Т7 РНКП) и обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека 1 (ОТ ВИЧ-1). Оба этих фермента представляют собой относительно простые по структуре полимеразы, катализирующие реакции транскрипции и обратной транскрипции, соответственно. Особый интерес представляло исследование специфичности Т7 РНКП и ОТ ВИЧ-1 в отношении неканонических субстратов, поскольку их использование потенциально может существенно расширить спектр применения этих ферментов в различных областях физико-химической биологии.

В работе был проведен поиск условий препаративного синтеза смешанных полинуклеотидов определенного состава мутантной формой Т7 РНКП, а также использование последних в качестве матриц для ОТ ВИЧ-1. Исследовано влияние введения объемного заместителя [2'-0-(Р-рибофуранозил)адснозина] в различные положения цепи нраймера на протекание реакции обратной транскрипции, катализируемой ОТ ВИЧ-1. Отдельной частью работы являлось исследование специфичности Т7 РНКП и ОТ в отношении нуклеозидтрифосфатов, содержащих модификации трифосфатной части молекулы.

I. Литературный обзор.

ДНК- И РНК-ПОЛИМЕРЛЗЫ: СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И ЕДИНЫЙ КАТАЛИТИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ.

Среди процессов, протекающих в клетке, важнейшими являются воспроизведение и передача генетической информации от родителей потомству. Для этого все живые организмы кодируют ряд ферментов — нуклеотид-полимераз, осуществляющих репликативные, рспаративные и транскрипционные функции. На первый взгляд, между этими ферментами мало общего: к ним относятся и оД11осубъсдиничпая рспарирующая ДНК-полимераза р эукариотичсской клетки с молекулярной массой 39 кДа [1], и огромные мультисубъсдиничные полимеразы, например, ДНК-полимераза III E.coli, которая состоит, по крайней мере, из 20 субъсдиниц, а се молекулярная масса достигает 900 кДа [2]. Среднюю ступень сложности занимают такие полимеразы, как ДНК-полимераза I E.coli, имеющая несколько ферментативных активностей, связанных с единственной достаточно большой полипептидной цепью [3]. В настоящем обзоре речь будет идти в первую очередь об односубъединичных полимеразах. Именно эти ферменты, относительно простые по строению, и, в то же время, обладающие всей функциональной полнотой, способны в настоящее время дать наиболее полную информацию о тонких механизмах их действия. Успехи последних лет, связанные, в первую очередь, с исследованиями трехмерных структур этих ферментов, позволяют, сформулировать общие черты функционирования нуклеотид-полимераз.

Несмотря на значительное разнообразие в семействе нуклеотид-полимераз, при ближайшем рассмотрении оказывается, что все они являются вариациями на одну тему. Как ДНК-, так и РНК-полимеразы катализируют одну и ту же химическую реакцию - образование фоефодиэфирной связи при взаимодействии концевой 3'-гидроксильной группы вновь синтезирующейся полинуклеотидной цепи с а-фосфатом субстрата — dNTP или rNTP [4]. Изучение точности полимеризации, важного атрибута ферментов этого типа, позволяет предположить, что многие (хотя и не все) механизмы дискриминации между правильными и неправильными парами оснований сохраняются во всем семействе полимераз [5].

Вероятно, наиболее важный аргумент в пользу схожести механизма всех полимераз вытекает из анализа их белковых последовательностей. Хотя существует лишь небольшое сходство последовательностей отдаленно родственных полимераз, оказывается, что несколько критических остатков их активного центра консервативны. Такого рода гомологии среди ДНК-, РНК- полимераз и обратных транскриптаз предполагают существование общего механизма переноса фосфата, необходимого для синтеза межнуклеотидной связи [6]. Однако эти ферменты обладают и рядом различий — способностью дискриминации между рибо- и дезоксирибо-субстратами, специфичностью в отношении типа матрицы (так, обратная транскриптаза (ОТ) способна использовать в качестве последней как РНК, так и ДНК [4]) и характером белок-нуклеинового взаимодействия характера белок-нуклеинового взаимодействия (РНК-полимеразы узнают специфическую нуклеотидную последовательность промотора, ДНК-полимсразы относительно неспецифично связываются с 3'- концом ДНК-нраймера, комплементарно взаимодействующего с ДНК-матрицей). Очевидно, что эти отличия обусловлены тем, что разные полимеразы участвуют в различных молекулярно-генетических клеточных процессах (репликация, транскрипция, обратная транскрипция, репарация). Как следствие, от них требуется работа с различными типами матриц, с отличающейся процессивиостью, точностью и скоростью, в разных условиях и в различном окружении. Поэтому большинство полимераз имеет дополнительные активности, ассоциированные с различными доменами белковой молекулы или с отдельными субъсдиницами мультисубъедипичиого комплекса, a in vivo многие из них работают лишь в комплексе с несколькими вспомогательными белками. Так, полимеразы, участвующие в репарации, часто обладают 5'—>3' экзонуклеазной активностью [4] и эндонуклеазной активностью по отношению к одноцепочечным 5'-"хвостам" [7]. Большое число ДНК-полимераз, от которых требуется высокая точность копирования (в первую очередь репликационные), обладают корректирующей У—>5* экзонуклеазной активностью, ассоциированной либо с отдельным доменом (ДНК-полимераза I E.coli [8]), либо с отдельной субъедипицей (s-субъединица ДНК-полимсразы III E.coli [2]). Обратные транскриптазы часто содержат домен с активностью РНКазы Н, отвечающей за удаление РНК из РНК-ДНК -гибрида при синтезе второй цепи ДНК [9J.

Локализация различных функций в определенных элементах вторичной структуры и структурах более высокого порядка привела к представлению о модульной организации полимераз: помимо доменов с "минимальной" полимеразной активностью, имеющих определенные черты сходства у всех полимераз, в подавляющем большинстве ферментов содержатся также домены, ассоциированные с различными дополнительными активностями. Эти домены, как правило, не имеют структурного сходства друг с другом [2,10].

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Андреева, Ольга Игоревна

IV. выводы.

I. Исследована реакция ферментативного синтеза нуклеиновых кислот нового типа — смешанных рибо/дезоксирибонуклеотидов (СПН), катализируемая мутантной формой РНК-полимсразой бактериофага Т7 Tyr639Phc, Ser641AIa. Установлено, что эффективность включения дсзоксирибонуклсотида зависит от его позиции относительно начала транскрипции. Инициация транскрипции с дсзоксирибонуклсозидтрифосфата в наших условиях не наблюдалась, а эффективное включение dNMP происходило примерно -Ф Позиции. Отработаны условия препаративного получения моно-, ди-. и тризамещенных СПН.

2. Показано, что СПН являются эффективными матрицами в реакции, катализируемой ОТ ВИЧ-1. Посредством кинстичсскош анализа выяснено, что ОТ действует избирательно не только при выборе типа приходящего нуклеотида (rNTP или dNTP), но и чувствительна к структуре сахарного фрагмента в каждом нуклеотидном остатке матричной цепи.

3. Обнаружен принципиально новый принцип ингибирования ОТ ВИЧ, достигаемый за счет введения остатка 2'-0-(Р-0-рибофуранозил)аденозина в определенное положение праймера. При этом формальным терминатором реакции является природный нуклсозидтрифосфат, а эффект терминации достигается за счет невозможности связывания ферментом праймера, удлиненного на одно нуклеотидное звено.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Андреева, Ольга Игоревна, Москва

1. Kumar A., Widen S.G., Williams K.R., Kedar P., Karpel R.L., Wilson S.H. Studies of the domain structure of mammalian DNA polymerase P: identification of discrete template binding domain//J. Biol. Chcm. 1990. V. 265. P. 2124-2131.

2. Hcrcndccn D.R., Kelly T.J. DNA polymerase III: running rings around the fork. // Cell. 1996. V. 84. P. 5-8.

3. Joycc C.M., Stcitz T.A. Function and structure relationships in DNA polymerases. // Annu. Rev. Biochem. 1994. V. 63. P. 777-822.

4. Kornbcrg A., Baker T.A. 1992. DNA Replication. // San Francisco: Freeman. 931pp. 2nd ed.

5. Joycc C.M., Sun X.C., Grindley N.D.F. R. Reactions at the polymerase activc site that contribute to the fidelity of Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 2485-2500.

6. Delaruc M., Poch O., Tordo N., Moras D., Argos P. An attempt to unify the structure of polymerases. // Protein Eng. 1990. V. 3. P. 461-467.

7. Lyamichcv V., Brow M.A.D., Dahlbcrg J.E. Structure-specific cndonucleolytic clcavage of nuclcie acids by eubactcrial DNA polymerases. // Sciencc. 1993. V. 260. P. 778-783.

8. Bccsc L.S., Steitz T.A. Structural basis for the 3'->5' cxonuclease activity of Escherichia coli DNA polymerase I: a two metal ion mechanism. // EMBO J. 1991. V. 10. P. 25-33.

9. Davies J.F., Hostomska Z., Hostomsky Z., Jordan S.R., Matthews D.A. Crystal structure of ribonucleasc H domain of HIV-1 reverse transcriptase. // Science. 1991. V. 252. P. 88-95.

10. Arnold E., Ding J., Hughes S.H., Hostomsky Z. Structures of DNA and RNA polymerases and their interactions with nuclcic acids substrates. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1995. V. 5. P. 27-38.

11. Ollis D.L., Brick P., Hamlin R., Xuong N.G., Stcitz Т.Д. Structure of large fragment of Escherichia coli DNA polymerase 1 complcxcd with dTMP. // Nature. 1985. V. 313. P. 762-766.

12. Frccmont P.S., Friedman J.M., Bccse L.S., Sanderson M.R., Steitz T.A. Cocrystal structure of an editing complex of Klcnov fragment with DNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85 P. 8924-8928.

13. Beese L.S., Derbyshire V., Steitz T.A. Structure of DNA polymerase 1 Klcnow fragment bound to duplex DNA. // Science. 1993. V.260. P. 352-355.

14. Beesc L.S., Friedman J.M., Steitz T.A. Crystal structure of Klenow fragment DNA polymerase 1 complcxcd with deoxynuclcosidc triphosphate and pyrophosphate. // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 14095-14101.

15. Doublic S., Tabor S., Long A.M., Richardson C.C., Ellcnberger T. Crystal structure of a bactcriofage T7 DNA replication complex at 2.2 A resolution. // Nature. 1998. V. 391. P. 251-258.

16. Kim Y., Eom S.H., Wang J., Lcc D.-S., Suh S.W., Stcitz T.A. Crystal stracturc of Thermus aquaticus DNA polymerase. // Nature. 1995. V. 376. P. 612-616.

17. Li Y., Korolev S., Waksman G. Crystal structures of open and closcd forms of binary and ternary complexes of the large fragment of Thermus aquaticus DNA polymerase I: structural basis for nucleotide incorporation. // EMBO J. 1998. V. 17. P. 7514-7525.

18. Eom S.H., Wang J., Steitz T.A. Structure of Taq polymerase with DNA at polymerase active site. //Nature. 1996. V. 382. P. 278-81.

19. Korolev S., Nayal M., Barnes W.M., Di Cera E., Waksman G. Crystal structure of the large fragment of Thermus aquaticus DNA polymerase 1 at 2.5 A resolution: structural basis for thermostability. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 9264-9268.

20. Kcifcr J.R., Мао С., Bramant J.C., Bccse L.S. Visualizing DNA replication in a catalytically active Bacillus DNA polymerase crystal. // Nature. 1998. V. 391. P. 304-307.

21. Kohlstacdt L.A., Wang J., Friedman J.M., Rice P.A., Steitz T.A. Crystal structure at 3.5 A resolution of HIV-1 reverse transcriptase complexed with an inhibitor. // Science. 1992. V. 252. P. 1783-1790.

22. Huang H., Chopra R., Vcrdine G.L., Harrison S.C. Structure of a covalently trapped catalytic complex of HIV-1 reverse transcriptase: implications for drug resistance. // Science. 1998. V.282. P. 1669-1675.

23. Boyer P.L., Ferris A.L., Hughes S.H. Cassette mutagenesis of the reverse transcriptase of human immunodeficient virus type 1. // J. Virol. 1992. V. 66. P. 1031-1039.

24. Larder B.A.,Purifoy D.J.M., Powell K.L., Darby G. Sitc-spcsific mutagenesis of AIDS virus reverse transcriptase. //Nature. 1987. V.327. P. 716-718.

25. Polesky A.H., Stcitz T.A., Grindley N.D.F., Joycc C.M. Identification of residues critical for the polymerase activity of Klcnow fragment of DNA polymerase I from E.coli. II J. Biol Chem. 1990. V. 265. P. 14579-14591.

26. Polesky Л.Н., Dahlberg M.E., Bencovic M.J., Grindley N.D.F., Joyce C.M. Side chains involved in catalysis of polymerase reaction of DNA polymerase 1 from Escherichia coli. I I J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 8417-8428.

27. Sousa R., Chung Y.J., Rose J.P., Wang B.-C. Crystal structure of bacteriofage T7 RNA polymerase at 3.3 A resolution. //Nature. 1993. V. 364. P. 593-599.

28. Jcruzalmi D., Stcitz T.A. Structure of T7 RNA polymerase complexcd to the transcriptional inhibitor T7 lysozyme. // EMBO J. 1998. V. 17. P. 4101-4113.

29. Chcctham G.M.T., Jcruzalmi D., Steitz T.A. Structural basis for initiation of transcription from an RNA polymerasc-promotor complex. // Nature. 1999. V. 399. P. 80-83.

30. Chccthman G.M.T., Stcitz Т.Л. Structure of transcribing T7 RNA polymerase initiation complex. // Science. 1999. V. 286. P. 2305-2309.

31. Tahirov Т.Н., Temiakov D., Anikin M., Patlan V., McAllister W.T., Vassylycv D.G., Yokoyama S. Structure of a T7 RNA polymerase elongation complex at 2.9 A resolution. // Nature. 2002. V. 420. P. 43-50.

32. Basu S., Basu A., Modak M.J. Pyridoxal 5'-phosphate mediated inactivation of Escherichia coli DNA polymerase I: identification of lysin-635 as an essential residue for the proccssivc mode of DNA synthesis. // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 6710-6716.

33. Mullcr D.K., Martin C.T., Coleman J.E. Processivity of proteolytically modified forms of T7 RNA polymerase. // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 5763-5771.

34. Patra D., Lafcr E.M., Sousa R. Isolation and characterization of mutant bacteriofage T7 RNA polymerase. // J. Mol. Biol. 1992. V. 224. P. 307-318.

35. Moras D. Two sisters and their cousin. // Nature. 1993. V. 364. P. 572-573.

36. Lesburg С.Л., Cable M.B., Ferrari E., Hong Z., Mannarino A.F., Weber P.C. Crystal structure of the RNA-dcpendcnt RNA polymerase from hepatitis С virus reveals a fully encircled active site. // Nat. Struct. Biol. 1999. V. 6. P. 937-943.

37. Ago H., Adashi Т., Yoshida A., Yamamoto M., Habuka N., Yatsunami K., Miyano M. Crystal structure of the RNA-depcndcnt RNA polymerase of hepatitis С virus. // Structure. 1999. V.7. P. 1417-1426.

38. Bressanelli S., Tomci L., Roussel A., Incitti I., Vitalc R.L., Mathieu M., De Francesco R., Rey F.A Crystal structure of the RNA-dcpendent RNA polymerase of hepatitis С virus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 13034-13039.

39. Bressanelli S, Tomci L, Rcy FA, De Francesco R. Structural analysis of the hepatitis С virus RNA polymerase in complex with ribonucleotides. // J Virology. 2002. V. 7. P. 34823492.

40. O'Farrcll D, Trowbridge R, Rowlands D, Jager J. Substrate complexes of hepatitis С virus RNA polymerase (HC-J4): structural cvidencc for nucleotide import and dc-novo initiation. // J Mol Biol. 2003. V. 326. P. 1025-1035.

41. Poch O., Sauvaget I., DeLarue M., Tordo N. Identification of four concerved motifs among the RNA-depended polymerase encoding element. // EMBO J. 1989. V. 8. P. 3867-3874.

42. Sousa R. Structural and mechanistic relationships between nucleic acid polymerases. // Trends Biochem. Sci. 1996. V. 21. P. 186-190.

43. Canard В., Chowdhury K., Sarfati R., Doublie S., Richardson C.C. The motif D loop of Human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase is critical for nucleoside 5'-triphosphate selectivity. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 35768-35776.

44. Cheng Y.C., Dutschman G.E., Bastow K.F., Sarngadharan M.G., Ting R.Y. Human immunodcficicncy virus reverse transcriptase. General properties and its interactions with nucleoside triphosphate analogs. // J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 2187-2189.

45. Basu S., Basu A., Modak M.J. Pyridoxal 5'-phosphate mediated inactivation of Escherichia coli DNA polymerase I: identification of lysin-635 as an essential residue for the processive mode of DNA synthesis. // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 6710-6716.

46. Mohan P.M., Basu A, Basu S., Abraham K.I., Modak M.J. DNA binding domain of Escherichia coli DNA polymerase I: identification of arginine-841 as an essential residue. //Biochemistry. 1988. V. 27. P. 226-233.

47. Catalano C.E., Allen D.J., Benkovic S.J. Interaction of Escherichia coli DNA polymerase I with azidoDNA and fluorescent DNA probes: identification of protein-DNA contacts. // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 3612-3621.

48. Carroll S.S., Co wart M., Benkovic S.J. A mutant of DNA polymerase I (KJcnow fragment) with reduced fidelity. // Biochemistry. 1991. V. 30. P. 804-813.

49. Allen D.J., Darke P.L., Benkovic S.J. Fluorescent oligonucleotides and deoxynucleotide triphosphates: preparation and their interaction with large (Klenow) fragment of Escherichia coli DNA polymerase I.// Biochemistry. 1989. V. 28. P. 4601-4607.

50. Kati W.M., Johnson K.A., Jerva L.F., Anderson K.S. Mechanism and fidelity of HIV reverse transcriptase. //1992. J. Biol. Chem. V. 267. P. 25988-25997.

51. Gopalakrishnan V., Peliska J.A., Benkovic S.J. Human immunodeficicncy virus tipe 1 reverse transcriptase: spatial and temporal relationship between the polymerase and RNase H activities. // Proc. Natl. Acad. ScL 1992. V. 89. P. 10763-10367.

52. Kim J.L., Nikolov D.B., Birlcy S.K. Co-crystal structure of TBP recognizing the minor groove of a TATA element. // Nature. 1993. V. 365. P. 520-527.

53. Basu A., Ahluwalia K.K., Basu S., Modak M.J. Identification of the primer binding domain in human immunodeficicncy virus reverse transcriptase. // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 616-623.

54. Sobol R.W., Suhadolnik R.J., Kumar A., Lee B.J., Hatfield D.L., Wilson S.II. Localization of a polynucleotide binding region in HIV-1 reverse transcriptase: implications for primer binding. // Boichemistry. 1991. V.30. P. 10623-10631.

55. Ikeda R.A., Richardson C.C. Interactions of the RNA polymerase of bacteriophage T7 with its promoter during binding and initiation of transcription. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 3614-3618.

56. Steitz T.A. DNA- and RNA-dependcnt DNA-polymcrases. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1993. V.3. P. 31-38.

57. Raskin C.A., Diaz G., Joho K., McAllister W.T. Substitution of a single bacteriophage T3 residue in bacteriophage T7 RNA polymerase at position 748 result in a switch in promoter specifity. // J. Mol. Biol. 1992. V. 228. P. 506-515.

58. McGinness K.E., Joyce G.F. Substitution of ribonucleotides in the T7 RNA polymerase promoter element. Hi. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 2987-2991.

59. Kuchta R.D., Mizrahi V., Benkovic P.A., Johnson K.A., Benkovic S.J. Kinetic mechanism of DNA polymerase I (Klenow fragment) // Biochemistry. 1987. V. 26. P. 8410-8417.

60. Tabor S., Richardson C.C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase 1 family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 6339-6343.

61. Astatkc M., Grindlcy N.D.F., Joyce C.M. How E.coli DNA polymerase (Klenow fragment) distinguishes between deoxy- and dideoxynucleotides. //J. Mol. Biol. 1998. V. 278. P. 147165.

62. Tabor S., Richardson C.C. DNA sequence analysis with a modified bacteriophage T7 DNA polymerase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 4767-4771.

63. Tabor S., Richardson C.C. Effect of manganese ions on the incorporation of dideoxynuclcotides by bacteriophage T7 DNA polymerase and Escherichia coli DNA polymerase 1.11 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 4076-4080.

64. Innis M.A., Myambo K.B., Gelfand D.H., Brow M.A.D. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 9436-9440.

65. Cheng N., Merrill B.M., Painter G.R., Frick L.W., Furman P.A. Identification of the nucleotide binding site of HIV-1 reverse transcriptase using dTTP as a photoaffinity label. // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 7630-7634.

66. Gao G., Orlova M., Georgiadis M.M., Hendrickson W.A., Goff S.P. Conferring RNA polymerase activity to a DNA polymerase: a single residue in reverse transcriptase controls substrate selection. //Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1997. V. 94. P. 407-411.

67. Krebs R., Immcndorfcr U., Thrall S.H., Wohrl B.M., Goody R.S. Single-step kinetics of HIV-1 reverse transcriptase mutants responsible for virus resistance to nucleoside inhibitors zidovudine and 3-TC. // Biochemistry. 1997. V. 36. P. 10292-10300.

68. Caroll S.S., Geib J., Olsen D.B., Stahlhut M., Shafer J.A., Kuo L.S. Sensitivity of H1V-1 reverse transcriptase and its mutants to inhibition by azidothymidine triphosphate. // Biochemistry. 1994. V. 33. P. 2113-2120.

69. Kellam P., Bouchcr C.A.B., Larder B.A. Fifth mutation in human immunodeficiency virus typc-1 reverse transcriptase contributes to the development of high-level resistance to zidovudine. // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1992. V. 89. P. 1934-1938.

70. Bonner G., Patra D., Lafer E.M., Sousa R. Mutations in T7 polymerase that support the proposal for a common polymerase activc site structure. // EMBO J. 1992. V. 11. P. 27673775.

71. Kostyuk D.A., Dragan S.M., Lyakhov D.L., Rechinsky V.O., Tunitskaya V.L., Chernov B.K., Kochetkov S.N. Mutants of T7 RNA polymerase that are able to synthesize both RNA and DNA. // FEBS Lett. 1995. V. 369. P. 165-168.

72. Reardon J.E. Human immunodeficiency virus reverse transcriptase: steady-state and pre-steady-state kinctics of nucleotide incorporation. // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 44734479.

73. Reardon J.E. Human immunodeficiency virus reverse transcriptase. A kinetic analysis of RNA-dependent and DNA-dcpcndent DNA polymerisation. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 8743-8751.

74. Allen D.J., Darke P.L., Benkovic S.J. Fluorescent oligonucleotides and deoxynuclcotidc triphosphates: preparation and their interaction with large (Klenow) fragment of Escherichia coli DNA polymerase I. // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 4601-4607.

75. Johnson K.A. Conformational coupling in DNA polymerase fidelity. // Annu. Rev. Biochem. 1993. V. 62. P. 685-713.

76. Ferrin L.J., Mildvan A.S. NMR studies of conformations and interactions of substrates and ribonucleotide templates bound to the large fragment of DNA polymerase I. // Biochemistry. 1986. V. 25. P. 5131-5145.

77. Eger B.T., Benkovic S.J. Mcchanism of DNA replication fidelity for three mutants of DNA polymerase I: Klenow fragment KF(exo+),KF(polA5), KF(cxo-). // Biochemistry. 1992 V. 31. P. 9227-9236.

78. Painter G.R., Wright L.L., Hopkins S.t Furman Р.Л. Initial binding of 2'-dcoxynuclcoside 5'-triphosphates to human immunodeficicncy virus type I reverse transcriptase. // J.Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 19362-19368.

79. Dahlberg M.E., Benkovic S.J. Kinetic mcchanism of DNA polymerase I (Klenow fragment): identification of a sccond conformational changc and evaluation of the internal equilibrium constant. // Biochemistry. 1991 V. 30. P. 4835-4843.

80. Краевский A.A., Куханова M.K. Итоги науки и техники. Серия Молекулярная биология. 1986. Т. 22. С. 3-164.

81. Краевский А.А. Химические реакции, катализируемые ДНК-полимеразами. // Биоорг. Химия. 2000. Т. 26. С. 4-11.

82. Brody R.S., Frey Р.А. Unambiguous determination of the stereochemistry of nucleotidil transfer catalyzed by DNA polymerase I from Escherichia coli. II Biochemistry. 1981. V. 20. P. 1245-1252.

83. Brautigam C.A., Stcitz Т.Л. Structural principles for the inhibition of the 3'-5' cxonucleasc activity of Escherichia coli DNA polymerase I by phosphorothioates. // J. Mol. Biol. 1998. V. 277. P. 363-377.

84. Burgers P.M., Eckstcin F. A study of mechanism of DNA polymerase I from Escherichia coli with diastereomeric phosphorothioate analogs of dcoxyadenosinc triphosphate. //J. Biol. Chem. 1979. V. 254. P. 6889-6893.

85. Doublic S., Ellenberger T. The mechanism of action of T7 DNA polymerase. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1998. V. 8. P. 704-712.

86. Wong I., Patcl S.S., Johnson K.A. An induccd-fit kinetic mcchanism for DNA replication fidelity: direct measurement by single-turnover kinctics. // Biochemistry. 1991. V. 30. P. 526-537.

87. Kaushik N., Pandey V.N., Modak M.J. Significance of the O-hclix residues of Escherichia coli DNA polymerase I in DNA synthesis: dynamics of the dNTP binding pocket. //Biochemistry. 1996. V. 35. P. 7256-7266.

88. Doublic S., Sawaya M.R., Ellenberger T. An open and closcd case for all polymerases. // Structure. 1999. V. 7. P. R31-R35.

89. Martin C.T., Mullcr D.K., Coleman J.E. Processivity in early stages of transcription by T7 RNA polymerase. // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 3966-3974.

90. Ikeda R.A., Richardson C.C. Interactions of the RNA polymerase of bacteriophage T7 with its promoter during binding and initiation of transcription. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 3614-36.

91. Sousa R., Patra D., Lafer E.M. Model for the mcchanism of bacteriophage T7 RNAP transcription initiation and termination. // J. Mol. Biol. 1992. V. 224. P. 319-334.

92. Moroncy S.E., Piccirilli J.A. Abortive products as initiating nucleotides during transcription by T7 PNA polymerase. // Biochemistry. 1991. V. 30. P. 10343-10349.

93. Brieba L.G., Sousa R. The T7 RNA polymerase intercalating hairpin is important for promoter opcrning during initiation but not for RNA displacement or transcription bubble stability during elongation. // Biochcmisrty. 2001. V. 40. P. 3882-3890.

94. Bedford E., Tabor S., Richardson C.C. The thioredoxin binding domain of bacteriophage T7 DNA polymerase confcrs processivity on Escherichia coli DNA polymerase I. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 479-484.

95. Richardson C.C. Bacteriophage T7: minimal requirements for the replication of a duplex DNA molecule. // Cell. 1983. V. 33. P. 315-317.

96. Himawan J.S., Richardson C.C. Amino acid residue critical for the interaction between bacteriophage T7 DNA polymerase and Escherichia coli thioredoxin. // J. Biol. Chem. 1996. V.271. P. 19999-20008.

97. Olson M.W., Wang Y., Elder R.H., Kaguni L.S. Subunit strucrute of mitochondrial DNA polymerase from Drosophila embryos. Physical and immunological studies. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 28932-28937.

98. Boehmer P.E., Lehman I.R. Herpes simplex virus DNA replication. // Annu. Rev. Biochem. 1995. V. 66. P. 347-384.

99. McDonald W.F., KIcmpcrcr N., Traktman P. Characterization of a proccssive form of the viccinia virus DNA polymerase. // Virology. 1997. V. 234. P. 168-175.

100. Das S.K., Fujimura R.K. Proccssiveness of DNA polymerases. A comparative study using a simple procedure. //J. Biol. Chem. 1979. V. 254. P. 1227-1232.

101. Braithwaitc D.K., Ito J. Compilation, alignment, and phylogenetic relationships of DNA polymarases. //Nucleic Acid Res. 1993. V.21. P. 787-802.

102. Речинский B.O., Драган C.M., Костюк Д.Л., Ляхов Д.Л., Кочетков С.Н. Генетическая система отбора точечных мутантов РНК-полимеразы бактериофага Т7. // Мол. Биология. 1991. Т. 25. С. 1588-1593.

103. Pokholok D.K., Gudima S.O., Ycsipov D.S., Dobrynin V.N., Rechinsky V.O., Kochctkov S.N. Interactions of the HIV-1 reverse transcriptase 'AZT-resistant' mutants with substrates and AZT-TP // FEBS Lett. 1993. V. 325. P. 237-241.

104. Kumar A., Wilson S.H. Mapping of nuclcic acid binding in proteolytic domains of HIV-1 reverse transcriptase. // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 7466-7474.

105. Sambrook K.J., Fritsch E.F., Maniatis Т. Molecular cloning. A laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

106. Promega protocol and application guide. 2nd edition, Madison: Promega Corporation, 1991.

107. Бсрезин И.В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа. Москва. Высшая школа. 1997.

108. Ricchetti M., Вис Н. E.coli DNA polymerase I as a reverse transcriptase. // EMBO J. 1993. V. 12. P. 387-396.

109. Cazenave C., Uhlcnbcck O.C. RNA template-dircctcd RNA synthesis by T7 RNA polymerase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 6972-6976.

110. Тупицкая В.Л., Мемслова Л.В., Косткж Д.А., Гудима С.О., Кочетков С.Н. Исследование закономерностей утилизации дезоксирибонуклсозид-трифосфатов муталтными формами РНК-полимсразы бактериофага Т7. // Мол. Биология. 1997. Т.31.С. 353-358.

111. Gudima S.O., Kostyuk D.A., Grishchcnko O.I., Tunitskaya V.L., Memelova L.V., Kochetkov S.N. Synthesis of mixed ribo/deoxyribopolynuclcotides by mutant T7 RNA polymerase. // FEBS Lett. 1998. V. 439. P. 302-306.

112. Basu S., Maitra U. Specific binding of monomcric bacteriophage T3 and T7 RNA polymerases to their rcspcctivc cognate promoters requires the initiating ribonucleoside triphosphate (GTP).//J. Mol. Biol. 1986. V. 190. P. 425-437.

113. Reardon J.E., Furfinc E.S., Cheng N. Human immunodeficiency virus reverse transcriptase. Eficct of primer length on template-primer binding. // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 14128-14134.

114. Kedar P.S., Abbots J., Ко vacs Т., Lesiak K., Torrence P., Wilson S.I I. Mechanism of HIV reverse transcriptase: enzyme-primer interaction as revealed through studies of a dNTP analogue, З'-azido-dTTP. // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 3606-3611.

115. Martin-Hernandez A.M., Domingo E., Menendez-Arias L. Human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase: role of Tyrll5 in deoxynucleotide binding and misinscrtion fidelity of DNA synthesis.// EMBO. 1996. V. 15. P. 4434-4442.

116. Hcidcnreich O., Kruhoffer M., Grossc F., Ekstein F. Inhibition of human immunodeficiency virus 1 reverse transcriptase by З'-azidothymidine triphosphate. // Eur. J. Biochem. 1990. V. 192. P. 621-625.

117. Richman D.D. Antiretroviral activity of cmtricitabinc, a potent nucleoside reverse transcriptase inhibitor. // Antivir Ther. 2001.V. 6. P. 83-88.

118. Kaufmann G.R., Cooper D.A. Antiretroviral therapy of HIV-1 infection: established treatment strategies and new therapeutic options. // Current Opinion in Microbiology. 2000. V. 3. P. 508-514.

119. Rando R.F., Nguycn-Ba N. Development of novel nucleoside analogues for use against drug resistant strains of HIV-1. // Drug Discovery Today. 2000. V. 5. P. 465-476.

120. Canard В., Sarfati S.R., Richardson C.C. Binding of RNA template to a complex of HIV-1 reverse transcriptasc/primcr/template. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1997. V. 94. P. 11279-11284.

121. E.V.Efimtscva, G.V.Bobkov, S.N.Mikhailov, A Van Acrschot, G.Schcpers, R.Busson, J.Rozenski, P.Hcrdcwijn. Oligonucleotides containing disaccharidc nucleosides. // Hclv. Chim. Acta. 2001. V. 84. P. 2387-2397.

122. Basavappa R., Siglcr P.B. The 3 A crystal structure of yeast initiator tRNA: functional implications in initiator/clongator discrimination. // EMBO J. 1991. V. 10. P. 3105-3111.

123. Valverdc-Garduno V., Gariglio P., Gutierrez L. Functional analysis of HIV-1 reverse transcriptase motifC: site-directed mutagenesis and metal cation interaction. //J Mol Evol. 1998. V. 47. P. 73-80.

Информация о работе

Андреева, Ольга Игоревна
кандидата химических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.03

Диссертация

Неканонические субстраты и матрицы в реакциях, катализируемых РНК-полимеразой бактериофага Т7 и обратной транскриптазой ВИЧ-1 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Неканонические субстраты и матрицы в реакциях, катализируемых РНК-полимеразой бактериофага Т7 и обратной транскриптазой ВИЧ-1 - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы