Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Чувствительное и специфическое определение редких молекул РНК

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Чувствительное и специфическое определение редких молекул РНК"

На правах рукописи

ФАЛАЛЕЕВА МАРИНА ВИТАЛЬЕВНА

00347362Б

Чувствительное и специфическое определение редких молекул РНК

03.00.03 - Молекулярная биология

1 5 ОКТ ?009

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

003479626

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научный руководитель:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук

Четверин Александр Борисович

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор

Разин Сергей Владимирович

кандидат биологических наук

Алкалаева Елена Зиновьевна

Ведущая организация:

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Защита состоится «Л^» 2009 года в.

г//- _часов на заседании совета Д. 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «¿<Р» года.

Ученый секретарь

Диссертационного совета, Л

кандидат биологических наук ---М • И.А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Выявление редких молекул РНК необходимо как для молекулярной диагностики, так и для решения многих научных задач. Редкими молекулами в данном случае называются РНК, находящиеся в образце в малом количестве среди огромного избытка посторонних (отличных от искомых) нуклеиновых кислот. В связи с этим возникают две главные проблемы при определении редких молекул: одна из них связана с чувствительностью, а другая со специфичностью детекции. Об ограниченной чувствительности говорят тогда, когда изучаемый образец содержит искомую РНК (мишень), но её невозможно обнаружить по ряду причин, из-за чего исследователь получает ложноотрицательный результат. Во-первых, мишени могут деградировать при хранении образца, во-вторых, могут быть потеряны в ходе выделения. Кроме этого, вместе с изучаемой мишенью могут выделяться примеси, являющиеся ингибиторами последующих реакций, служащих для размножения и детекции мишени. В настоящее время для того, чтобы надежно обнаружить малые количества ДНК, изучаемую мишень размножают при помощи ПЦР. РНК также можно размножить в ПЦР, если её предварительно перевести в кДНК с помощью обратной транскрипции (ОТ). Теоретически, с помощью ПЦР можно размножить и обнаружить единственную молекулу мишени. Однако в том случае, когда нужно определить малое число молекул мишени на фоне огромного избытка посторонних нуклеиновых кислот, которые часто присутствуют в анализируемом образце, чувствительность и специфичность ПЦР может значительно снижаться из-за ограниченной специфичности праймеров. Проблема ограниченной чувствительности ПЦР была решена в нашей лаборатории (биохимии вирусных РНК Института белка РАН). Был создан способ размножения нуклеиновых кислот в геле, названный методом молекулярных колоний или наноколоний. При проведении ПЦР в геле образуются колонии ДНК, росту которых не мешает даже большое число неспецифических колоний благодаря пространственному разделению ампликонов. Данный метод не требует использования внутренних контролей, а простой подсчет мишень-специфичных колоний позволяет прямо определять титр мишени в анализируемом образце.

Вопрос сохранности нуклеиновых кислот при хранении анализируемого препарата был решен в нашей лаборатории ранее. Однако открытыми оставались вопросы, связанные со способами выделения изучаемых мишеней, а также с проблемой низкого выхода стадии обратной транскрипции.

Другой проблемой является низкая специфичность выявления редких РНК-мишеней, вследствие того, что в ходе анализа образуются ложные мишени, которых не было в анализируемом образце. Это приводит к получению ложноположительного результата. Ложные мишени могут образовываться, например, в результате ложной рекомбинации РНК на стадии обратной транскрипции. В отличие от истинной рекомбинации, в которой рекомбинантная РНК образуется из других молекул РНК, в ходе ложной рекомбинации из РНК-предшественников образуется рекомбинантная кДНК. Происходит это из-за природного свойства РНК-зависимых ДНК-полимераз ретровирусов, используемых для обратной транскрипции in vitro, осуществлять рекомбинацию по типу смены матриц. Эта рекомбинация может приводить к ложноположительным результатам при изучении такого редкого события, как рекомбинация между молекулами РНК, а также при диагностике. Данная проблема часто остаётся недооцененной многими исследователями.

Цель и задачи работы. Целью данной работы явилась разработка количественной высокочувствительной и высокоспецифичной молекулярной диагностики, а также определение продуктов рекомбинации РНК с помощью ОТ-ПЦР в отсутствии ложной рекомбинации. В связи с этим были поставлены следующие задачи: усовершенствовать или заново разработать методы выделения из крови РНК, как свободной от ДНК (для диагностики рака), так и наряду с ДНК (для диагностики вирусных инфекций), при использовании которых не происходило бы потери нуклеиновых кислот, а анализируемый препарат был бы свободен от примесей, ингибирующих обратную транскрипцию и ПЦР; повысить выход обратной транскрипции; определить частоту ложной рекомбинации на стадии обратной транскрипции и разработать способы ее понижения. И наконец, было необходимо убедиться, что все разработанные подходы действительно работают на практике и их применение позволяет повысить чувствительность и специфичность обнаружения искомых молекул РНК.

Научная новизна и практическая значимость. С целью устранения ложноотрицательных результатов разработаны способы выделения нуклеиновых кислот из крови, обеспечивающие близкий к 100% выход РНК и освобождение образца от ингибиторов ОТ-ПЦР, оптимизирована стадия обратной транскрипции и применен метод молекулярных колоний для выявления специфических молекул «ДНК. Для устранения ложноположительных результатов предложены следующие способы понижения частоты ложной рекомбинации, происходящей при синтезе кДНК из-за смены матриц обратной транскриптазой: селективная деградация РНК

полинуклеотидфосфорилазой Пегтиэ ^егторЛ/'/уэ, проведение обратной транскрипции в геле, а также уменьшение концентрации обратной транскриптазы в реакционной смеси. При этом показано, что, вопреки распространенному мнению, частота ложной рекомбинации не зависит от того, обладает ли обратная транскриптаза активностью РНКазы Н.

Продемонстрирована эффективность разработанных подходов для решения фундаментальных и прикладных задач; в частности, для изучения рекомбинации РНК, катализируемой Ор-репликазой, и для молекулярной диагностики. Показано, что разработанные способы понижения частоты ложной рекомбинации позволяют обнаруживать и исследовать в отсутствие селекции (с помощью ОТ-ПЦР) продукты истинной рекомбинации РНК. Также показано, что разработанные способы устранения ложноотрицательных и ложноположительных результатов позволяют с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять в крови человека химерные РНК, ассоциированные с лейкозами, а также вирусные РНК-мишени.

Апробация работы и научные публикации. Работа прошла апробацию на открытом семинаре лаборатории биохимии вирусных РНК Института белка РАН. Результаты работы изложены в 4 статьях, опубликованных в отечественных и международных научных журналах, в 2 заявках на патент, а также доложены на 10 научных конференциях.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного описанию способов выявления и количественной оценки РНК, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит^рисунков. Библиография включает ¿^¿названий.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Ложноотрицательные результаты и их устранение

Разработка метода одновременного выделения РНК и ДНК из цельной крови. Чаще всего для диагностики используют кровь. Кровь, с точки зрения выделения из нее нуклеиновых кислот, является трудным объектом, поскольку содержит большое количество белков (около 10% по массе), в том числе нукпеаз, РНК - и ДНК-связывающих белков, которые могут разрушать нуклеиновые кислоты и/или уводить их из водной фазы при фенольной депротеинизации. Кровь также содержит много различных ингибиторов ОТ-ПЦР. В настоящее время существуют коммерчески доступные наборы для выделения РНК и/или ДНК из крови. Действие этих наборов основано на том, что в присутствии солей гуанидина РНК и/или ДНК задерживается на

А Б

Рис. 1 Характеристика метода, разработанного для одновременного выделения РНК и ДНК из цельной крови.

(А) Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот, выделенных согласно разработанному методу (1). В лизаты крови перед выделением была добавлена [32Р]-меченная РНК - Qß РНК длиной 4200 нт (2) и фрагмент HIV-1 РНК длиной 880 нт (3). Дорожки 2 и 3 также содержат по 0,5 мкг соответствующих немеченых РНК. Верху - гель окрашен бромистым этидием, внизу - радиоавтограф того же геля.

(Б) Нуклеиновые кислоты, выделенные по разработанной методике из 100 мкл крови здорового донора, к которой в момент лизиса не добавляли (нижний ряд) или добавили 150 молекул HIV-1 РНК и 50 молекул HBV ДНК (верхний ряд), подвергали обратной транскрипции, а затем выращивали колонии ДНК. Колонии выявляли посредством последовательной гибридизации мембраны с [32Р]-меченным РНК-зондом (HIV-1, а затем HBV).

колонке из стекловолокна или силикагеля, а сопутствующие компоненты не задерживаются, либо сорбируются слабее, чем нуклеиновые кислоты. Далее

нуклеиновые кислоты элюируют с колонки и используют для анализа. Мы попробовали выделить суммарные нуклеиновые кислоты, используя набор реактивов и протокол фирмы Roche. При использовании данного метода происходили потери как ДНК, так и РНК. Кроме того, препарат ингибировал последующие стадии анализа (ОТ-ПЦР). Поскольку приемлемого метода для одновременного выделения РНК и ДНК из цельной крови не нашлось, надо было разработать такой метод.

Кровь лизировали раствором, описанным Чиргвином и др. для выделения РНК из источников, богатых рибонуклеазами (Chirgwin et al. 1979. Biochemistry 18, 52945299). Оказалось, что если лизат сразу экстрагировать фенолом, то большая часть ДНК уходит в фенол. Однако потерю ДНК можно предотвратить, если предварительно провести двукратное осаждение нуклеиновых кислот изопропанолом, которое удаляет большую часть белков, остатки которых удаляются в ходе последующей экстракции фенолом. Выход меченых РНК, добавленных в лизат (рис. 1А), составляет около 100%. Для того, чтобы определить выход ДНК, а также убедиться, что препарат нуклеиновых кислот не содержит ингибиторов ОТ-ПЦР, был проведён эксперимент, в котором к 100 мкл лизата крови добавляли 150 молекул фрагмента HIV-1 РНК и 50 молекул фрагмента HBV ДНК, а затем выделяли нуклеиновые кислоты, используя разработанную процедуру. Выделенные нуклеиновые кислоты подвергали обратной транскрипции и ПЦР в геле. Колонии ДНК выявляли посредством гибридизации на мембране с радиоактивно-меченными РНК-зондами - сначала с HIV-специфичным, а затем с HBV-специфичным. Из рисунка 1Б видно, что выросло 53 HBV-специфичных и примерно 70 HIV-специфичных колоний. В семи независимых экспериментах было выявлено 78±18 HIV-специфичных и 53+11 HBV-специфичных колоний, что приблизительно соответствует 50% добавленной РНК-мишени и 100% ДНК-мишени.

Таким образом, разработанный метод позволяет выделять из лизата цельной крови одновременно РНК и ДНК с выходом около 100%, при этом нуклеиновые кислоты не содержат ингибиторов ни обратной транскрипции, ни ПЦР.

Более низкий процент выявления РНК-мишени обусловлен выходом обратной транскрипции.

Усовершенствование метода выделения РНК. Иногда присутствие ДНК может мешать определению РНК, например, в случае детекции молекул мРНК, имеющих псевдогены.

Для выделения только РНК (без ДНК) из животных тканей часто используют метод, разработанный Хомчинским и др. (Chomczynski & Sacchi. 1987. Anal. Biochem., 162,156-159). Мы попробовали применить этот метод для выделения РНК из цельной

А Б

1 2 3 4 5

Рис. 2. Анализ препаратов РНК, выделенных из цельной крови.

(А) Результат электрофореза РНК. В лизаты крови (3) была добавлена [32Р]-меченная РНК - Q(B РНК длиной 4200 нт (2) и фрагмент HIV-1 РНК длиной 880 нт (1). Дорожки 1 и 2 также содержат по 0,5 мкг соответствующих немеченых РНК. РНК выделяли из крови (3,5) или из костного мозга (4) по оригинальному методу Хомчинского и др. (3) и по усовершенствованному методу (4,5). Верхняя панель: гель окрашен бромистым этидием, нижняя панель: радиоавтограф этого же геля.

(Б) Колонии ДНК, выросшие из продуктов ОТ, полученных при использовании 100 молекул мРНК AML1-ETO и 2 ед обратной транскриптазы superscript® II в отсутствие (1) и в присутствии РНК из 90 мкл цельной крови здорового донора, выделенной по оригинальному (2) или усовершенствованному (3) методу Хомчинского и др. Колонии выявляли посредством гибридизации в геле с FRET-зондами.

крови. Следует отметить, что ядерные клетки составляют лишь около 1% цельной крови, поэтому исходное содержание РНК в крови примерно в 100 раз меньше, чем в обычной ткани. Выход РНК, определенный по выходу добавленной в момент лизиса крови радиоактивно меченных РНК (рис. 2А), составил 85-90%. Для проверки присутствия ингибиторов в конечном препарате, к выделенной из 100 мкл крови РНК добавляли 100 молекул фрагмента мРНК AML1-ETO (маркер острого миелоидного лейкоза, сопровождающегося хромосомной транслокацией t(8;21)). Далее проводили обратную транскрипцию в пробирке и ПЦР в геле с АМИ-ЕТО-специфичными праймерами. Выяснилось, что полученный препарат содержит примеси, ингибирующие ОТ-ПЦР (рис. 2Б, гель 2). От ингибиторов удалось избавиться с помощью фенольной экстракции образца в отсутствие тиоцианата гуанидина и гель-фильтрации через Sephadex G-25 (рис. 2Б, гель 3). В препаратах РНК, выделенных из крови и костного мозга (который по составу близок к крови, но содержит на порядок больше ядерных клеток), частично сохраняется даже рибосомная 28S РНК длиной

А Б В

г^юююю ^ттюююю юююю о о

Концентрация неспецифических нуклеиновых кислот, нг/мкл

Рис. 3. Влияние неспецифических нуклеиновых кислот на обратнотранскриптазную активность Tth ДНК-полимеразы.

Влияние указанных концентраций плазмидной ДНК («ДНК»), рРНК Е. coli («РНК»), смеси (10:1) плазмидной ДНК и рРНК («ДНК+РНК»), нуклеиновых кислот крови («НКК») на ОТ-ПЦР Ю4 молекул плазмидной ДНК pQ[57 (А) или 105 молекул Qp РНК (Б) с помощью Tth ДНК-полимеразы в буферной системе бицин/Мп2+, или на размножение 105 молекул Q(3 РНК с помощью обратной транскриптазы superscript® II (ОТ) и Tth ДНК-полимеразы (ПЦР) (В). Стрелка показывает положение специфического продукта.

4800 нт, что гарантирует сохранность значительно более коротких участков РНК (80600 нт), которые обычно служат диагностическими мишенями (рис. 2А, дорожки 4 и 5).

Выбор обратной транскриптазы. При использовании обратных транскриптаз ретровирусов, стадии обратной транскрипции и ПЦР обычно разделяют из-за несовместимости буферных систем. ОТ-ПЦР можно осуществлять в одной реакционной смеси, используя ДНК-полимеразу Thermus thermophilus, которая в присутствии ионов Мп2+ является как ДНК-, так и РНК-зависимой ДНК-полимеразой. Однако мы обнаружили, что относительно большая концентрация нуклеиновых кислот, как РНК, так и ДНК (¿4,5 нг/мкл), неспецифически ингибирует обратнотранскриптазную (РНК-зависимую) активность Tth ДНК-полимеразы (рис. ЗБ), хотя не влияет на ее ДНК-зависимую активность (рис. ЗА). Таким образом, использование Tth ДНК-полимеразы в качестве обратной транскриптазы может приводить к ложноотрицательным результатам при анализе клинических образцов, содержащих большое количество отличных от мишени нуклеиновых кислот. В этом случае предпочтительно использовать обратную транскриптазу ретровируса MMLV SuperScript® II, которая не чувствительна к присутствию большого количества неспецифических нуклеиновых кислот (рис. ЗВ).

Снижение неспецифического синтеза кДНК при уменьшении количества обратной транскриптазы. При ОТ-ПЦР образцов РНК крови с использованием рекомендованного фирмой-производителем количества обратной транскриптазы

K1 K2

wWw®

200 20 2 0,2 Обратная транскриптаэа, ед.

Рис. 4. Зависимость роста колоний ДНК от количества обратной транскриптазы.

А - Колонии, выросшие из 50 молекул плазмиды pTZ19-AML1-ETO в отсутствие (К1) или в присутствии РНК из 90 мкл крови здорового донора, не проходившей (К2) или проходившей ОТ, осуществленной с использованием указанных количеств обратной транскриптазы superscript® II. Б - Колонии, выросшие из продуктов ОТ, полученных при использовании 100 молекул мРНК AML1-ETO и указанных количеств обратной транскриптазы в отсутствие РНК крови. Колонии выявляли посредством гибридизации в геле с FRET-зондами.

Superscript® II мы наблюдали ингибирование роста колоний, причем даже если в качестве матрицы использовали ДНК (плазмиду, несущую кДНК AML1-ETO), которую добавляли после ОТ. Ингибирования не наблюдали в отсутствие препарата суммарной РНК крови или если препарат РНК добавляли к образцу после ОТ (рис. 4). Вероятно, причиной подавления роста колоний служит конкуренция со стороны неспецифических кДНК, которые синтезируются на РНК крови в результате ошибочной гибридизации праймера. Оказалось, что ингибирование можно полностью убрать, если в 100 раз понизить количество обратной транскриптазы (рис. 4А). Важно, что при этом также увеличивается выход ОТ чистой РНК-мишени, судя по числу колоний ДНК (рис. 4Б).

2. Ложнололожительные результаты и их устранение

Возникновение рекомбинантной кДНК на стадии обратной транскрипции.

Известно, что обратные транскриптазы ретровирусов, обычно используемые для синтеза кДНК/'л vitro, могут осуществлять гомологичную рекомбинацию по типу смены матриц с образованием рекомбинантной кДНК, которой не соответствует ни одна из содержащихся в образце мРНК. Такая рекомбинация может приводить к ложноположительным результатам при изучении рекомбинации между молекулами РНК или при диагностике. Чтобы оценить масштаб проблемы, мы исследовали частоту возникновения ложных рекомбинантов при обратной транскрипции смеси 5'- и З'-фрагментов RQ135_i(-) РНК (сателлитной РНК фага 0(3), ранее использованных для исследования рекомбинации РНК в бесклеточной системе репликации фага Q(3. Данные фрагменты снабжены гомологичными довесками длиной 23 нт и получены транскрипцией плазмид, несущих соответствующие кДНК.

М-М1Л/ М-М1Л/ РНКаза Н+ РНКаза Н"

Рис. 5. Частота возникновения рекомбинантных кДНК в результате смены матриц обратной транскриптазой.

Результаты электрофореза продуктов ОТ-ПЦР указанного числа молекул либо смешанных 5'- и З'-фрагментов 1ЧС!135-1(-) РНК (А), либо полноразмерной РЮСТ1п1 РНК (Б). Обратную транскрипцию проводили в присутствии 3 х Ю10 молекул каждого РНК-фрагмента, 200 ед обратной транскриптазы М-М1_\/, обладающей (РНКаза Н+) и не обладающей (РНКаза Н") активностью РНКазы Н, и праймера А (комплементарного 3'-концу З'-фрагмента). Продукты обратной транскрипции осаждали спиртом, осадок растворяли, и разведения, соответствующие указанному стартовому количеству РНК, размножали в ПЦР с использованием праймеров А и Б (идентичного 5'-концу 5'-фрагмента). Гель окрашивали бромистым этидием. Стрелка указывает на специфический продукт ОТ-ПЦР.

Смесь 5'- и 3'- фрагментов РЮ135_1(-) РНК отжигали с олигодезоксинукпеотидом, комплементарным З'-фрагменту, проводили ОТ и полученную кДНК обнаруживали с помощью жидкостной ПЦР, используя праймеры, соответствующие началу 5'-фрагмента и концу З'-фрагмента; поэтому специфический продукт ОТ-ПЦР мог образоваться, только если эти фрагменты оказались объединенными в одной молекуле кДНК. Частоту ложной рекомбинации фрагментов оценивали, сравнивая выход рекомбинантной кДНК с выходом обратной транскрипции истинного РНК-рекомбинанта (РЮСТ1п1 РНК), который был ранее выделен из продуктов спонтанной рекомбинации между этими фрагментами. Сравнивая количества РНК, при которых наблюдается образование примерно одинаковых количеств специфического продукта ОТ-ПЦР (указан стрелкой) в вариантах, где в качестве матрицы служил готовый полноразмерный рекомбинант, с вариантами, где в качестве матрицы служила смесь 5'- и З'-фрагментов 14(2135_-|(-) РНК, можно сказать, что частота ложной рекомбинации составляет примерно 10"3 (рис. 5). Это значительно выше частоты рекомбинации между теми же фрагментами, катализируемой 0(3-

А Б А Б

2 200 Количество обратной транскриптазы, ед

Рис. 6. Уменьшение частоты ложной рекомбинации РНК при понижении концентрации обратной транскриптазы.

Результат электрофореза продуктов ОТ-ПЦР с использованием праймеров А и Б (см. подпись к рис. 5) смеси 5'- и З'-фрагментов RQ135-i(-) РНК (А) либо ранее выделенной рекомбинантной РНК RQ187 (Б). ОТ проводили в 20 мкл среды, содержащей указанные количества обратной транскриптазы M-MLV, не обладающей активностью РНКазы Н. Продукты обратной транскрипции обессоливали с помощью гель-фильтрации и соответствующие разведения добавляли в ПЦР. Гель окрашивали бромистым этидием.

репликазой (=10"5), и тем более выше частоты их спонтанной рекомбинации (=10~э). Учитывая длину гомологичных довесков фрагментов, можно сделать вывод, что частота ложной рекомбинации больше, чем 10"5 на 1 нуклеотид.

Зависимость частоты ложной рекомбинации РНК от наличия активности РНКазы Н. В литературе отмечалось, что частота смены матриц существенно снижается, если обратная транскриптаза не имеет активности РНКазы Н (Luo and Taylor 1990. J. Virol. 64, 4321-4328; Negroni et al. 1995. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92, 6971-6975).

Поэтому мы надеялись снизить уровень ложной рекомбинации, используя обратную транскриптазу, не обладающей активностью РНКазы Н. Однако из рисунка 5 следует, что обратная транскриптаза M-MLV, лишенная активности РНКазы Н (SuperScript® II) осуществляет смену матриц не менее эффективно, чем обратная транскриптаза M-MLV дикого типа, обладающая активностью РНКазы Н.

Влияние концентрации обратной транскриптазы на частоту ложной рекомбинации РНК. В литературе описано, что увеличение концентрации обратной транскриптазы повышает частоту смены матриц (Negroni et al. 1995. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92, 6971-6975). Мы проверили, можно ли понизить ложную рекомбинацию РНК-фрагментов путем уменьшения количества обратной транскриптазы M-MLV в реакционной смеси по сравнению со стандартной, рекомендуемой фирмами-производителями (200 ед на 20 мкл среды). Для этого 5'- и 3'- фрагменты RQ135_i(-) РНК (рис. 6Б) либо ранее выделенный РНК-рекомбинант RQ187 (рис. 6А) отжигали с

RQ187 РНК 5'-и З'-фрагменты RQ135(-)-i РНК

ОТ в жидкости

^ q5 ^ q7 стартовое число молекул РНК

26 число колоний

О

40 >100 число колоний

Рис. 7. Уменьшение частоты ложной рекомбинации в ходе обратной транскрипции при проведении реакции в геле.

Выход рекомбинантов определяли путем подсчета колоний ДНК, полученных в результате проведения и ОТ, и ПЦР в геле (верхний ряд), либо ОТ в жидкости, а ПЦР в геле (нижний ряд) с использованием праймеров А и Б (см. подпись к рис. 5). В качестве матрицы использовали либо смесь 5'- и З'-фрагментов RQ1 Зб-^-) РНК, либо рекомбинантную РНК RQ187. Обратную транскрипцию проводили в присутствии 200 ед обратной транскриптазы M-MLV (USB). Колонии выявляли посредством гибридизации на мембране с флуоресцентно меченным олигодезоксинуклеотидом.

олигодезоксинуклеотидом, комплементарным З'-фрагменту, а затем проводили ОТ с использованием 200 или 2 ед обратной транскриптазы. Оказалось, что 100-кратное понижение концентрации обратной транскриптазы снижает частоту ложной рекомбинации приблизительно в 100 раз (рис. 6Б), но при этом не существенно влияет на эффективность обратной транскрипции рекомбинантной РНК (рис. 6А). Таким образом, уменьшая концентрацию обратной транскриптазы, можно понижать частоту ложной рекомбинации.

Снижение частоты ложной рекомбинации РНК при проведении обратной транскрипции в геле. Мы предположили, что проведение обратной транскрипции в геле поможет снизить частоту ложной рекомбинации из-за пространственного разделения участников рекомбинации.

Оказалось, что это действительно так. Частота ложной рекомбинации при обратной транскрипции фрагментов RQ135_i(-) РНК в геле составила примерно 10"5, а в жидкости 10"3 (рис. 7, ср. число колоний, образованных смесью РНК-фрагментов и продуктом их рекомбинации). Таким образом, проведение обратной транскрипции в геле позволяет снизить частоту ложной рекомбинации примерно в 100 раз.

+олигонуклеотид -олигонуклеотид

гибрид

РНК и олигонуклеотида—+цтшшшш , свободная РНК—»

олигонуклеотид ► , # # ^

§ о о о g о о о

о о

концентрация добавленного Mg2*, мМ

Рис. 8. Зависимость фосфоролиза РНК Tth-ПНФазой от концентрации ионов Мд2+.

Результат электрофореза в 8% полиакриламидном геле 0,5 пмоль З'-фрагмента RQ135.i(-) РНК, отожженного в присутствии либо в отсутствие 2,5 пмоль олигодезоксинуклеотида, комплементарного З'-концу РНК, после инкубации с 2 пмоль Tth-ПНФазы и 1 мМ Na-фосфатом при указанных концентрациях MgCI2 при 65°С. Каждая проба содержала 0,056 мМ ЭДТА. Гель окрашивали серебром.

3. Избирательное уничтожение РНК с помощью полинуклеотидфосфорилазы

Проблемы обратной транскрипции, являющиеся источником как ложноотрицательных результатов (неспецифический синтез кДНК), так и ложноположительных результатов (ложная рекомбинация), можно было бы решить, уничтожив перед обратной транскрипцией посторонние РНК, но сохранив искомые. Например, можно было бы избирательно уничтожить посторонние РНК с помощью 3'—>5'-экзорибонукпеазы, тем или иным способом защитив З'-конец целевой РНК. Ранее было показано, что 3'—>5' экзорибонуклеаза полинукпеотидфосфорилаза (ПНФаза) из клеток Escherichia coli разрушает поли(А)-последовательность на З'-конце эукариотических мРНК, но не разрушает остальную часть мРНК, если реакцию проводят в условиях, когда вся РНК, за исключением поли(А)-последовательности, сохраняет вторичную структуру (Soreq et al. 1974. J. Mol. Biol. 88, 233-245). Однако данная экзорибонуклеаза не может быть использована для уничтожения любой РНК, так как она не активна в условиях, разрушающих вторичную структуру РНК. Мы предположили, что с этой целью можно использовать ПНФазы из термофильных организмов, так как они остаются активными при высокой температуре, дестабилизирующей вторичную структуру РНК. Однако способность ПНФаз из термофильных организмов осуществлять фосфоролиз РНК не была исследована.

Свойства полинуклеотидфосфорилазы Thermus thermophilus. В 1977 году был выделен препарат ПНФазы из Т. thermophilus (Tth-ПНФазы), однако оказалось,

А

Б

Обработано Не обработано ПНФазой ПНФазой

Рис. 9. Уменьшение частоты ложной рекомбинации фрагментов РНК в результате избирательной деградации одного из фрагментов перед обратной транскрипцией.

(А) Результат электрофореза в 8% полиакриламидном геле отожженной смеси 5'- и 3'-фрагментов RQ135.-i(-)PHK и олигодезоксинуклеотида, комплементарного З'-концу 3'-фрагмента, после инкубации в отсутствие (-) или в присутствии Tth-ПНФазы (+) при 65°С в течение 15 мин. Гель окрашивали серебром.

(Б) Продукты ОТ-ПЦР отожженной смеси 5'-, З'-фрагмента RQ135_i(-) РНК и олигодезоксинуклеотида, комплементарного З'-фрагменту RQ1354(-) РНК, либо предынкубированных, либо не предынкубированных с Tth-ПНФазой при 65°С в течение 15 мин перед ОТ-ПЦР. Гель окрашивали бромистым этидием. Стрелка указывает положение продукта рекомбинации фрагментов по механизму смены матриц.

что он полностью лишен фосфорилазной активности - вероятно, в результате его протеолитической деградации в процессе выделения (Hishinuma et al. 1977. Eur. J. Biochem. 77, 575-583). Мы показали, что этот же фермент, очищенный из клеток £. coli, содержащих плазмиду, несущую ген Tth-ПНФазы, обладает фосфорилазной активностью и позволяет полностью уничтожить при 65°С З'-фрагмент RQ135.i(-) РНК, который обладает очень стабильной вторичной структурой. В то же время Tth-ПНФаза не разрушает РНК, З'-конец которой гибридизован с комплементарным олигодезоксирибонуклеотидом (рис. 8). Из этого следует, что исследуемый препарат действительно обладает 3'—>5'-экзонуклеазной активностью, а также то, что РНК можно специфически защитить олигонукпеотидом, комплементарным ее З'-концу.

Мд2+ и некоторые другие двухвалентные катионы являются кофакторами Tth-ПНФазы, однако при высокой температуре, необходимой для разрушения вторичной структуры, они могут также вызывать неэнзиматическую деградацию РНК. Мы выяснили, что полный фосфоролиз незащищенной РНК наблюдается при эквимолярных концентрациях Мд2+ и ЭДТА (рис. 8). Это позволяет проводить энзиматическую деградацию РНК при очень низкой концентрации свободных ионов Мд2+, когда неэнзиматическая деградация минимальна. В последующих экспериментах концентрацию ионов Мд2+ поддерживали на уровне 40 - 100 мкМ.

исходная смесь после анилина после фосфатазы 3 БИО

НЮ 0.2 0.5 1 №0 0.2 0,5 1 НЮ 0,2 0,5 1

З'ОН- Ы Ы З'ОН

З'Р — ^ ,„. З'ОН—' %Ы

Рис. 10. Влияние модификаций З'-конца на деградацию РНК ТИт-ПНФазой.

(А) Результат электрофореза в 6% полиакриламидном геле, содержащем 7 М мочевину, смеси ¿'-фрагмента (нижняя полоса) и З'-фрагмента (верхняя полоса) ИСШб.^-) РНК, в которой 5'-фрагмент окислен периодатом (З'ох!), а З'-фрагмент не модифицирован (З'ОН). Смесь не обрабатывали (Н/О) или обрабатывали "ПИ-ПНФазой (ее количества указаны в пмоль), либо не подвергая предварительным обработкам («исходная смесь»), либо предварительно обрабатывая анилином («после анилина»), в результате чего на З'-конце 5'-фрагмента оказывался фосфат (З'Р), либо обрабатывая анилином, а затем фосфатазой («после фосфатазы»), снимающей фосфатную модификацию (З'ОН).

(Б) Результат электрофореза в 6% полиакриламидном геле З'-фрагмента РС!135_1(-) РНК, либо модифицированного биотином на З'-конце (З'БИО), либо без модификаций (З'ОН), который был либо не обработан (-), либо обработан 2 пмоль "ПИ-ПНФазы (+), либо смешан со стрептавидином перед электрофорезом (Стр). Гели окрашивали серебром.

Снижение частоты ложной рекомбинации РНК путем уничтожения одного из субстратов 'Ш-ПНФазой. Рис. 9А демонстрирует, что если ТШ-ПНФазой обработать отожженную смесь 5'- и З'-фрагментов Я0135_1(-)РНК, а также олигодезоксинуклеотида, комплементарного З'-концу З'-фрагмента, то защищенный олигонукпеотидом З'-фрагмент остается целым, а 5-фрагмент полностью уничтожается. Таким образом, Т1И-ПНФаза позволяет осуществлять селективную деградацию РНК.

Рис. 9Б демонстрирует, что такая обработка на 2-3 порядка снижает частоту ложной рекомбинации 5'- и З'-фрагментов при обратной транскрипции.

Защита РНК модификацией З'-конца. В данном эксперименте смесь немодифицированного З'-фрагмента и 5'-фрагмента К<3135_1(-) РНК, окисленного периодатом натрия с образованием диальдегидной группы на З'-конце, инкубировали с Т1:И-ПНФазой либо сразу, либо после обработки анилином (в результате чего на З'-конце 5'-фрагмента оказывалась фосфатная группа), либо после дополнительной обработки фосфатазой (что восстанавливало З'-гидроксил на 5'-фрагменте). Рис. 10А демонстрирует, что для защиты от деградации ПНФазой можно использовать не только олигонуклеотид, но и модификацию З'-конца РНК, причем высокая устойчивость З'-фосфорилированной РНК к ТШ-ПНФазе не связана с химической модификацией полирибонуклеотидного остова в процессе обработки периодатом или

А Б

■юлигонуклеотид

+олигонуклеотид

вта! ЕсоШ РуиИ исх- - - —— . , , . с

-.,+ - + .+ РНК -+-.+ - + 1 2 3 4 5

|Я$ Ц®* ''ЗИ!

•..-

18 нт

Рис. 11. Защита от ПНФазы трех «вложенных» РНК, различающихся длиной 3'-концевой части, олигонуклеотидом, комплементарным З'-концу наименьшей из РНК.

Результат электрофореза в 6% полиакриламидном геле: (А) РНК, обработанных (+) или не обработанных (-) Т(И-ПНФазой в отсутствие или в присутствии олигодезоксинуклеотида Р-38, комплементарного каждой из РНК в позиции 72-109; (Б) наиболее длинной (РуиИ) РНК, не обработанной (-) или обработанной (+) Т№-ПНФазой в присутствии олигодезоксинуклеотида 13-38, либо не модифицированного (б/м), либо содержащего 6 ЬМА-модифицированных звеньев, сгруппированных вблизи 5'-конца (ША1), или распределенных по его длине (1_МА2). Стрелками показано положение продуктов, устойчивых к деградации. Гели окрашивали серебром. (В) - Радиоавтограф 6% секвенирующего полиакриламидного геля после электрофореза в денатурирующих условиях [у-32Р]РНК (Бта!, ЕсоИ, РуиИ). 1 - полноразмерная Зта1-РНК, 5 - ЕсоШ-РНК, частично деградированная слабой щелочью с целью получения 1-нуклеотидной «лесенки». 2-4 - продукты деградации БтаК ЕсоИ- и РуиМ-РНК, соответственно, гибридизованных с олигодезоксинуклеотидом Р-38.

анилином, так как РНК становится вновь подверженной фосфоролизу после удаления З'-фосфата фосфатазой.

Если окисленную РНК обработать гидразидом биотина, что приводит к добавлению биотиновой группы на З'-конец РНК, то РНК также становится устойчивой к действию ПНФазы (рис. 10Б). Наличие биотиновой группы на З'-конце РНК подтверждается изменением подвижности РНК при электрофорезе в полиакриламидном геле при образовании ее комплекса со стрептавидином.

Защита РНК от действия ПИ-ПНФазы олигонуклеотидом, комплементарным внутреннему участку РНК. Не всегда олигонуклеотид, комплементарный З'-концу, может обеспечить избирательную защиту РНК. Например, большинство эукариотических мРНК имеют на З'-конце поли(А)-последовательность. В этом случае, избирательную защиту мог бы обеспечить олигонуклеотид, комплементарный внутреннему участку РНК. Чтобы проверить такую возможность, мы использовали точный З'-фрагмент Р0135--|(-) РНК (Эта!) и его удлиненные на 28 нт (ЕсоК1) и 194 нт (РуиИ) варианты, полученные путём транскрипции плазмиды, несущей кДНК З'-фрагмента и линеаризованной, соответственно, по сайту рестрикции

SmaI и нижележащим сайтам EcoRI и PvuW. Полученные РНК гибридизовали с олигодезоксинуклеотидом, комплементарным З'-концевой последовательности наиболее короткой РНК (Smal) и внутренним последовательностям более длинных РНК (EcoRI и Pvull), а затем инкубировали с Tth-ПНФазой. Видно, что олигонуклеотид защищает всю Smal-PHK, но лишь часть EcoRI- и Pvull-PHK (рис. 11А), то есть Tth-ПНФаза удаляет одноцепочечный участок, выступающий на З'-конце. В результате образуется устойчивый продукт, который оказывается примерно на 8 нт длиннее, чем Smal-PHK, что было показано с использованием электрофореза высокого разрешения (рис. 11В). Из рисунка 11А также следует, что, выход укороченных EcoRI- и Pvull-PHK существенно ниже 100%. Следовательно, олигонуклеотид, гибридизованный с внутренним участком, не может полностью остановить ПНФазу, начавшую деградацию РНК. Это, по-видимому, вызвано тем, что в ходе инкубации гибрид «дышит»: как только олигонуклеотид частично диссоциирует от РНК, он вытесняется связанной с РНК ПНФазой.

Мы предположили, что стабилизация гибрида может повысить защитный эффект олигонуклеотида. С этой целью использовали олигонуклеотиды, часть звеньев которых содержат рибозные кольца, фиксированные в З'-эндо-конфигурации путем введения 2'-0,4'-С-метиленового мостика (LNA-модификация, от «locked nucleic acid»). Оказалось (рис. 11 Б), что введение LNA-аналогов нуклеотидов в состав олигодезоксинуклеотида, комплементарного внутреннему участку РНК, действительно улучшает защиту РНК от действия ПНФазы. После деградации наблюдается примерно одинаковое количество укороченной РНК независимо от того, как распределены LNA-модифицированные звенья (сгруппированы у 5'-конца или распределены по длине олигонуклеотида). Полученные результаты демонстрируют, что РНК можно эффективно защитить от ПНФазы олигонуклеотидом, комплементарным внутреннему участку РНК. Помимо борьбы с артефактами обратной транскрипции, это можно использовать для выделения РНК определенного вида из сложных природных смесей, а также для получения РНК, укороченных с 3'-конца на заданную величину.

4. Применение разработанных подходов для изучения истинной рекомбинации РНК, осуществляемой QP-репликазой

Поскольку рекомбинация РНК - редкое событие, то для того, чтобы обнаружить продукты рекомбинации, их необходимо размножить. В нашей лаборатории была создана система для размножения рекомбинантных РНК, использующая QP-

А Б

н го

S М

стартовое число молекул РНК

+репликаза -репликаза

Рис. 12. Применение селективной деградации РНК для наблюдения рекомбинации РНК, осуществляемой QP-репликазой in vitro.

(А) Колонии ДНК, выросшие из продуктов ОТ, осуществленной с использованием 20 ед обратной транскриптазы M-MLV, смеси 5'- и З'-фрагментов RQ135.,(-) РНК, предынкубированной в отсутствие (нижний ряд) или в присутствии (верхний ряд) Q(3-репликазы в течение 45 с, а затем с Tth-ПНФазой в условиях, обеспечивающих избирательную деградацию 5'-фрагмента.

(Б) Электрофоретический анализ в 8% полиакриламидном геле содержимого колоний (элюат). М - продукт ложной рекомбинации смеси 5'- и З'-фрагментов RQ135_i(-) РНК (157 п.о.).

репликазу, которая в изотермических условиях экспоненциально размножает полноразмерные реплицирующиеся РНК, но не может размножать их фрагменты (Chetverin et al. 1997. Cell 88, 503-513). Такой подход позволил впервые наблюдать и изучать рекомбинацию РНК in vitro, но у него есть ряд ограничений. Во-первых, из-за узкой матричной специфичности 0(3-репликазы, определённые виды рекомбинантов обладают преимуществом при размножении; иными словами, продукты рекомбинации подвергаются селекции, что искажает результаты. Во-вторых, в этой системе нельзя изучать рекомбинацию молекул РНК, не являющихся матрицами для 0(3-репликазы.

Избежать указанных ограничений помог бы праймер-зависимый способ размножения, такой как ОТ-ПЦР, позволяющий приблизительно с равной эффективностью размножать практически любые последовательности, заключенные между заданными праймер-специфичными участками. Однако до настоящего времени применению ОТ-ПЦР с этой целью препятствовала ложная рекомбинация РНК при обратной транскрипции, частота которой превышает частоту истинной рекомбинации.

Разработанные способы подавления ложной рекомбинации мы использовали для размножения с помощью ОТ-ПЦР продуктов рекомбинации между 5'- и 3'-фрагментами RQ135_i(-) РНК, катализируемой 0|3-репликазой (Chetverin et al. 1997. Cell 88, 503-513). Были выбраны два приёма: 1) избирательная деградация 5'-фрагмента перед ОТ с помощью Tth-ПНФазы и 2) осуществление ОТ при пониженной концентрации обратной транскриптазы. Фрагменты РНК - субстраты рекомбинации

106 107

А 5'-фрагмент У---CCCGCGCGUCCCaUCUGCAGOTCG»CUCUAGAGQAUf-3' 5' -GGCGCUGCAGCUCGAGUCUAGAGGAlTCCU.^.CGAiiGOA---3' u , , ' ^qy З'-фрагмент

Б 5'-фрагмент 5'---CCCtiUGCGUCCCOUCUGCAGeUCGACUCUAGAGGAUf-3' 11%r- jfi89% 5'-GGCGCUGCXGCUCGAGOCUAGAG<5AUCCUACGAGGGfi---3' З'-фрагмент

Рис. 13. Содержание разных типов рекомбинантных РНК при использовании различных способов их размножения.

Относительная частота (в %) встречаемости рекомбинантов двух типов, размноженных с помощью (А) ОТ-ПЦР в данной работе и (Б) Qp-реппиказы (Chetverin ef al. 1997. Cell 88, 503-513). Фрагменты RQ135-i(-)PHK показаны частично. Последовательности гомологичных чужеродных довесков выделены жирным шрифтом. Стрелки соединяют нуклеотиды, между которыми произошла рекомбинация.

инкубировали с репликазой и нуклеозидтрифосфатами в течение короткого промежутка времени (45 с), чтобы исключить экспоненциальное размножение продуктов рекомбинации. После фенольной экстракции, РНК отжигали с олигодезоксинукпеотидом, комплементарным З'-концу З'-фрагмента RQ135_i(-) РНК, а значит и рекомбинантной РНК того же знака, и подвергали фосфоролизу Tth-ПНФазой. Tth-ПНФазу убирали фенольной депротеинизацией и проводили ОТ, используя 20 ед обратной транскриптазы M-MLV. ПЦР проводили в геле, а выросшие колонии ДНК выявляли посредством гибридизации на мембране с флуоресцентно-меченным олигонуклеотидом, гомологичным чужеродным довескам фрагментов (рис. 12А). О том, что эти колонии образованы продуктами истинной рекомбинации РНК, говорит тот факт, что колоний нет в вариантах, где репликазу не добавляли. Электрофоретическая подвижность материала колоний, элюированного из геля (рис. 12Б, дорожка 1), отличается от подвижности ложного рекомбинанта, образованного из тех же фрагментов РНК обратной транскриптазой (рис. 12Б, дорожка М).

Клонирование и секвенирование содержимого колоний показало, что они не содержат рекомбинантов гомологичного типа, которые могли бы образоваться при рекомбинации по механизму смены матриц. Все обнаруженные рекомбинанты являются негомологичными (рис. 13А), как и рекомбинанты, размноженные 0(3-репликазой (рис. 13Б). В каждом случае можно выделить два типа рекомбинантов. Первый тип представлен молекулами, включающими оба субстрата рекомбинации

целиком, а второй тип - молекулами, включающими целый 5'-фрагмент, но укороченный с 5-конца З'-фрагмент. Однако относительное содержание этих типов в продуктах рекомбинации является диаметрально противоположным. Так, первый тип составляет более 80% продуктов рекомбинации, размноженных с помощью ОТ-ПЦР, но лишь чуть более 10% продуктов рекомбинации, размноженных 0(3-репликазой.

Таким образом, при использовании разных способов размножения частота встречаемости различных типов рекомбинантов существенно отличается. По-видимому, это отражает преимущественное размножение 0|3-репликазой рекомбинантов второго типа. Размножение же с помощью ОТ-ПЦР, особенно в формате молекулярных колоний, где отсутствует конкуренция между ампликонами, происходит практически в отсутствие селекции. Поэтому следует сделать вывод, что именно первый тип рекомбинантов, включающих оба субстрата рекомбинации целиком, является основным продуктом рекомбинации, катализируемой 0(3-репликазой.

5. Применение разработанных подходов для высокочувствительной и специфичной диагностики

Определение вирусных РНК и ДНК в крови. Определение одиночных молекул вирусных РНК и ДНК в крови позволяет выявлять зараженную донорскую кровь на станциях переливания крови и таким образом препятствовать распространению опасных инфекций, а также отслеживать стадию заболевания и эффективность лечения инфицированных пациентов. На рис. 1Б показан результат одного из модельных экспериментов, в котором в лизат 100 мкл крови здорового донора добавили 150 молекул фрагмента РНК вируса СПИД (HIV-1) и 50 молекул фрагмента ДНК вируса гепатита В (HBV), затем суммарные нуклеиновые кислоты выделили с помощью разработанного нами метода и, после ОТ в жидкости, кДНК HIV-1 и HBV обнаружили в виде молекулярных колоний. Результаты демонстрируют, что разработанные нами подходы позволяют специфически обнаруживать в клинических образцах 50% вирусной РНК-мишени и 100% ДНК-мишени. Это соответствует чувствительности, равной 2 молекулам РНК и 1 молекуле ДНК на фоне 50-100 мкг нуклеиновых кислот человека, содержащихся в 100 мкл крови, что более чем в триллион раз превышает массу искомой мишени.

Обнаружение маркера острого миелоидного лейкоза мРНК AML1-ETO в образцах пациентов. Разработанные подходы, включающие усовершенствованный метод выделения РНК, оптимизированную стадию обратной транскрипции и ПЦР в

А Б А Б

+ AML1-ET0 РНК

11-2005 05-2006

Дата забора образца

Рис. 14. Отсутствие мРНК AML1-ETO в крови и костном мозге пациента 1.

РНК, выделенную с помощью усовершенствованного метода из 90 мкл костного мозга (А) или цельной крови (Б), взятых в указанные даты, подвергли обратной транскрипции с 2 ед фермента superscript® и ПЦР в геле, либо без добавления (верхний ряд), либо с добавлением 135 молекул мРНК AML1-ETO (нижний ряд). Колонии ДНК выявляли посредством гибридизации в геле с FRET-зондами.

гелях, мы применили для ретроспективного анализа минимальной остаточной болезни у прошедших химиотерапию больных острым миелоидным лейкозом, ассоциированным с хромосомной транслокацией t(8;21). Молекулярным маркером этого вида лейкоза является мРНК АМН-ЕЮ, синтезирующаяся в трансформированных лейкоцитах при транскрипции химерного гена, образованного в результате указанной транслокации. Были исследованы образцы крови и костного мозга двух пациентов, взятые через определенные промежутки времени.

Оказалось, что у пациента 1 маркерная РНК не выявляется в пробах крови и костного мозга, взятых с интервалом в шесть месяцев (рис. 14, верхний ряд). Когда к тем же образцам добавили по 135 молекул фрагмента мРНК AML1-ETO, то наблюдали рост специфических колоний кДНК, число которых составляло примерно 50% от числа добавленных молекул (рис. 14, нижний ряд). Отсюда следует, что чувствительность выявления маркера лейкоза - 2 молекулы РНК, такая же, как и чувствительность выявления вирусной РНК. Кроме того, этот контроль демонстрирует, что отрицательный результат был получен потому, что маркерная РНК отсутствует в образцах крови и костного мозга данного пациента, а не потому, что она не была выявлена, например, из-за подавления ОТ-ПЦР примесями или неспецифическим синтезом. Первые пробы костного мозга и крови пациента 2 также дали отрицательный результат (рис. 15).

08-2005

Дша забора обрата 11-2005 03-2006

05-2006

90 90 6

Объем образца, мкл

Рис. 15. Изменение количества мРНК AML1-ETO в крови и костном мозге пациента 2.

РНК, выделенную с помощью усовершенствованного метода из образцов костного мозга (А) или цельной крови (Б), подвергли обратной транскрипции с 2 ед фермента superscript® II и ПЦР в геле. Колонии ДНК выявляли посредством гибридизации в геле с FRET-зондами. Указаны даты отбора и объемы анализируемых образцов.

Однако, в пробе, взятой через три месяца, было обнаружено небольшое количество мРНК AML1-ETO, а спустя еще четыре месяца титр этой РНК вырос более чем на порядок, что сопровождалось проявлением признаков заболевания. Повторный курс химиотерапии снизил содержание маркерной РНК до нуля. Таким образом, маркерную РНК удалось обнаружить в образцах, взятых у пациента за четыре месяца до клинического рецидива. Если бы это было сделано вовремя, то наступление рецидива можно было бы предотвратить.

Чувствительность диагностики принято выражать в минимальной детектируемой доле лейкемических клеток от общего числа ядерных клеток. Чтобы сопоставить чувствительность нашей процедуры с чувствительностью диагностических процедур, используемых в настоящее время, мы перевели полученное нами абсолютное значение в общепринятую форму, допустив, что в одной лейкемической клетке содержится около 100 молекул мРНК AML1-ETO. При чувствительности 2 молекулы маркерной РНК в 90 мкл препарата можно обнаружить одну лейкемическую клетку в 4,5 мл клинического образца, если весь образец подвергнуть лизису и для анализа взять РНК, выделенную из 1/50 части лизата. Это соответствует чувствительности диагностики 10"7-10"8 (одна лейкемическая клетка на фоне 107 - 108 здоровых лейкоцитов в крови и костном мозге соответственно). Исследования по программе «Европа против рака» показали, что чувствительность детекции лейкемических клеток типа t(8;21) на основе ОТ-ПЦР в реальном времени составляет 10"4. Таким образом, чувствительность разработанной процедуры на несколько порядков выше чувствительности существующих методов.

выводы

1. Разработаны способы выделения нуклеиновых кислот из цельной крови, обеспечивающие близкий к 100% выход РНК и ее освобождение от ингибиторов обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции.

2. Оптимизирована реакция обратной транскрипции (ОТ) в присутствии большого количества посторонних нуклеиновых кислот. Выход «ДНК при использовании специфического праймера увеличен до 50% от количества РНК-матрицы.

3. Показано, что с помощью полинуклеотидфосфорилазы Thermus thermophilus (Tth-ПНФазы) можно полностью разрушить РНК даже с прочной вторичной структурой. В то же время, РНК можно защитить от Tth-ПНФазы комплементарным олигонуклеотидом либо З'-концевой модификацией.

4. Установлено, что частота ложной рекомбинации РНК при ОТ in vitro превышает 10~5 на 1 нуклеотид и не зависит от того, обладает ли обратная транскриптаза активностью РНКазы Н.

5. Показано, что ложную рекомбинацию РНК при ОТ можно понизить в 100 или более раз с помощью каждого из следующих способов:

- избирательной деградации одного из субстратов рекомбинации Tth-ПНФазой;

- проведения обратной транскрипции в геле;

- понижения концентрации обратной транскриптазы.

6. С помощью разработанных способов подавления ложной рекомбинации РНК при ОТ удалось размножить практически в отсутствие селекции и изучить продукты рекомбинации РНК, катализируемой QP-репликазой (РНК-зависимой РНК-полимеразой бактериофага ОР). Установлено, что продукт рекомбинации, включающий оба субстрата рекомбинации целиком, выявляемый при размножении с помощью QP-репликазы как минорный, на самом деле является основным.

7. С помощью разработанных способов выделения нуклеиновых кислот, оптимизированной обратной транскрипции и размножения кДНК в виде молекулярных колоний продемонстрирована возможность специфического выявления РНК-онкомаркера или вирусной РНК с чувствительностью две молекулы РНК-мишени в 100 мкл цельной крови.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах

Статьи в научных журналах:

1. Фалалеева М.В., Четверина Е.В., Кравченко A.B., Четверин А.Б. 2009. Применение наноколоний для выявления минимальной остаточной болезни при лейкозе t(8;21). Мопекупяр. Биология. 43, 180-189.

2. Falaleeva M.V., Chetverina H.V., Ugarov V.l., Uzlova E.A., Chetverin A.B. 2008. Factors influencing RNA degradation by Thermus thermophilus polynucleotide Phosphorylase. FEBS J. 275, 2214-2226.

3. Четверина E.B., Кравченко A.B., Фалалеева M.B., Четверин А.Б. 2007. Экспресс-гибридизация молекулярных колоний с флуоресцентными зондами. Биоорган, химия. 33,456-463.

4. Chetverina H.V., Falaleeva M.V., Chetverin A.B. 2004. Simultaneous assay of DNA and RNA targets in the whole blood using novel isolation procedure and molecular colony amplification. Anal. Biochem. 334, 376-381.

Тезисы конференций:

1. Четверина E.B., Фалалеева М.В., Саматов Т.Р., Четверин А.Б. 2008. Количественная диагностика с помощью наноколоний. Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 1215 мая 2008 г. С. 303.

2. Falaleeva M.V., Chetverina H.V., Ugarov V.l., Uzlova E.A., Chetverin A.B. 2007. Polynucleotide Phosphorylase from Thermus thermophilus as a tool for studies on RNA recombination. Abstracts of the International Conference "Protein Biosynthesis, Structure and Function". Pushchino, Russia, June 9-13, 2007. P. 31.

3. Chetverina H.V., Falaleeva M.V., Samatov T.R., Kravchenko A.V., Zabolotneva Y.A., Chetverin A.B. 2007. Diagnostic potential of the molecular colony technique. Abstracts of the International Conference "Protein Biosynthesis, Structure and Function". Pushchino, Russia, June 9-13, 2007. P. 29.

4. Фалалеева M.B., Четверина E.B., Кравченко A.B., Заболотнева Ю.А., Саматов Т.Р., Бобрынина В.О., Масчан М.А., Четверин А.Б. 2006. Выявление минимальной остаточной болезни при лейкозах посредством детекции одиночных молекул химерных РНК-онкомаркеров. Сборник докладов научно-практическая конференция «Живые системы» в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники в 2002-2006 гг.». Москва, 21-22 декабря 2006 г. С. 238-243.

5. Chetverina H.V., Falaleeva M.V., Chetverin A.B. 2006. Detecting single DNA and RNA molecules in the whole blood. Abstracts of the International Conference "Basic Science for Biotechnology and Medicine". Novosibirsk, September 3-7,2006. P. 110.

6. Falaleeva M.V., Chetverina H.V., Chetverin A.B. 2006. Precise diagnostics of viral target using simultaneous isolation of DNA and RNA from human whole blood and molecular colony amplification. EU/EMBO-course "Advanced Techniques in Molecular Medicine". Uppsala, Sweden, June 13-20, 2006. P. 7.

7. Фалалеева M.B., Четверина E.B., Четверин А.Б. 2005. Сравнение РНК-зависимых ДНК полимераз при помощи метода молекулярных колоний. Сборник тезисов 9 международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века». Пущино, 18-22 апреля 2005 г. С. 58.

8. Фалалеева М.В., Четверина Е.В., Четверин А.Б. 2005. Универсальный метод выделения нуклеиновых кислот из цельной крови для точной диагностики вирусных инфекций. Тезисы XVII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, 7-10 февраля 2005 г. С. 96.

9. Русинова A.B., Фалалеева М.В., Четверина Е.В., Четверин А.Б. 2005. Разработка диагностики лейкемии t(8;21) с помощью метода молекулярных колоний. Тезисы XVII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, 7-10 февраля 2005 г. С. 23.

10. Фалалеева М.В., Четверина Е.В., Четверин А.Б. 2004. Обнаружение одиночных молекул вирусных нуклеиновых кислот в цельной крови. Сборник тезисов III Конференции молодых ученых России с иностранным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». Москва, Научно-исследовательский центр ММА им. И.М.Сеченова, 20-24 января 2004 г. С. 172-173.

Заявки на получение патентов:

1. Четверин А.Б., Четверина Е.В., Фалалеева М.В., Угаров В.И., Узлова Е.А. 2008. Способ деградации структурированных полирибонуклеотидов и препарат полинуклеотидфосфорилазы. Заявка на получение патента РФ 2008120324.

2. Четверин А.Б., Фалалеева М.В., Четверина Е.В., Алексеев Я.И. 2008. Способ повышения специфичности обратной транскрипции. Заявка на получение патента РФ 2008138626.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фалалеева, Марина Витальевна

Использованные сокращения.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Методы прямого выявления РНК.

1.1.1 Б л от-гибри диз ация РНК.

1.1.2 Анализ РНК, основанный на её защите с помощью комплементарной РНК от действия РНКаз (ribonuclease protection assay).

1.1.3 Выявление РНК с помощью гибридизации in situ.

1.1.4 Выявление РНК с помощью QP-репликазы.

1.2 Методы обнаружения РНК, основанные на определении её кДНК.

1.2.1 Общая характеристика обратных транскриптаз ретровирусов.

1.2.2 ДНК-микрочипы.

1.3 Полимеразная цепная реакция.

1.3.1 Проведение ОТ-ПЦР в смеси, содержащей одну ДНК-полимеразу.

1.3.2 Рекомбинация, происходящая в ходе ПНР.

1.3.3 Неспецифический синтез ДНК при ПЦР.

1.3.4 Способы обнаружения продуктов ПЦР.

1.3.5 Виды количественной ПЦР.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Чувствительное и специфическое определение редких молекул РНК"

Многие клеточные события, такие как размножение, рост, дифференцировка и гибель сопровождаются изменением экспрессии генов, и возможность оценивать изменение уровня транскрипции всегда занимала центральное место в исследованиях функции генов. Кроме того, появление и развитие молекулярной медицины привело к более широкому использованию методов количественной оценки уровня РНК в клинической диагностике. Определение уровня мРНК используется во многих диагностических приложениях, таких как отслеживание экспрессии генов, ответственных за лекарственную устойчивость раковых клеток, определение молекулярного ответа при химиотерапии, молекулярная оценка этапа развития опухоли, обнаружение циркулирующих опухолевых клеток в крови больных раком, а также обнаружение бактериальных и вирусных патогенов. Для всех перечисленных приложений наиболее важно определять редкие молекулы.

Редкими молекулами, в данном случае, называются РНК или ДНК, находящиеся в образце в малом количестве среди огромного избытка посторонних (отличных от мишени) нуклеиновых кислот. В связи с этим возникают две главные проблемы при определении редких молекул: одна из них связана с чувствительностью, а другая со специфичностью детекции.

Об ограниченной чувствительности говорят тогда, когда изучаемый образец содержит искомую РНК (мишень), но её невозможно обнаружить по ряду причин, из-за чего исследователь получает ложноотрицательный результат.

По какой причине можно не определить мишень, не смотря на то, что она присутствует в анализируемом образце? Мишени могут деградировать при хранении образца, могут быть потеряны в ходе выделения. Кроме этого, вместе с изучаемой мишенью могут выделяться примеси, являющиеся ингибиторами последующих реакций, служащих для размножения и детекции мишени.

В настоящее время для того, чтобы надежно обнаружить малые количества ДНК, изучаемую мишень размножают при помощи ПЦР. Несмотря на огромное разнообразие методов амплификации, ПЦР является наиболее широко используемым методом (Saiki et al. 1985, Saiki et al. 1988). РНК также можно размножить в ПЦР, если её предварительно перевести в кДНК с помощью обратной транскрипции (ОТ). Теоретически, с помощью ПЦР можно размножить и обнаружить единственную молекулу мишени. Однако, в том случае, когда нужно определить малое число молекул мишени на фоне огромного избытка посторонних нуклеиновых кислот, которые часто присутствуют в анализируемом образце, чувствительность и специфичность ПЦР могут значительно снижаться из-за ограниченной специфичности праймеров (LeDuc et al. 2002). Основной причиной является конкуренция размножению мишени со стороны неспецифического синтеза ДНК, являющегося следствием ошибочной гибридизации праймеров с отличающимися от мишени РНК и ДНК. В связи с этим, даже если мишень не потерялась в ходе выделения и не содержит ингибиторов ОТ-ПЦР, она может быть не выявлена из-за конкуренции со стороны неспецифического синтеза. Проблема ограниченной чувствительности ПЦР была решена в нашей лаборатории (Биохимии вирусных РНК Института белка РАН). Был создан способ размножения нуклеиновых кислот в геле, названный методом молекулярных колоний или наноколоний (Четверин и Четверина 1995). При проведении ПЦР в геле образуются колонии ДНК, росту которых не мешает даже большое число неспецифических колоний благодаря пространственному разделению ампликонов. Данный метод не требует использования внутренних контролей, а простой подсчет мишень-специфичных колоний позволяет прямо определять титр мишени в анализируемом образце.

Вопрос сохранности нуклеиновых кислот при хранении анализируемого препарата был решен в нашей лаборатории ранее (Кравченко и др. 2006). Однако открытыми оставались вопросы, связанные со способами выделения изучаемых мишеней, а также с проблемой низкого выхода стадии обратной транскрипции.

Другой проблемой является низкая специфичность выявления редких РНК-мишеней, вследствие того, что в ходе анализа образуются ложные мишени, которых до анализа не было в анализируемом образце. Это приводит к получению ложноположительного результата. Ложные мишени могут образовываться, например, в результате ложной рекомбинации РНК на стадии обратной транскрипции. В отличие от истинной рекомбинации, в которой рекомбинантная РНК образуется из других молекул РНК, в ходе ложной рекомбинации из РНК-предшественников образуется рекомбинантная кДНК. Происходит это из-за природного свойства РНК-зависимых ДНК-полимераз ретровирусов, которые обычно используются для обратной транскрипции in vitro, осуществлять рекомбинацию по типу смены матриц. В ходе данной рекомбинации обратная транскриптаза прочитывает одну РНК, используя праймер, затем комплекс обратной транскриптазы и вновь синтезированной кДНК диссоциирует от одной РНК и продолжает синтез на другой (Luo & Taylor 1990, Ouhammouch & Brody 1992). Такой перескок обратные транскриптазы способны осуществлять как между двумя молекулами РНК, так и между двумя участками одной молекулы РНК. Эта рекомбинация может приводить к ложноположительным результатам при изучении такого редкого события, как 8 рекомбинация между молекулами РНК, а также при диагностике. Данная проблема часто остаётся недооцененной многими исследователями. Так техника ОТ-ПЦР широко применяется для размножения продуктов рекомбинации между РНК-содержащими вирусами в препаратах суммарной РНК, выделенных из инфицированных клеток (Jarvis & Kirkegaard 1991, Nagy & Bujarski 1995). Однако суммарная РНК содержит не только изучаемый рекомбинант, но и большое количество исходных вирусных РНК, при обратной транскрипции которых могут образовываться ложные рекомбинанты. Поэтому было необходимо определить частоту образования ложной рекомбинации на стадии обратной транскрипции и оценить ограничение, которые она накладывает на применение ретровирусных обратных транскриптаз для рутинного анализа.

Целью данной работы явилась разработка количественной высокочувствительной и высокоспецифичной молекулярной диагностики, а также определение продуктов рекомбинации РНК с помощью ОТ-ПЦР в отсутствие ложной рекомбинации.

Данная работа была выполнена в лаборатории биохимии вирусных РНК Учреждения Российской Академии Наук Института белка РАН. В диссертации использованы данные, полученные в совместной работе с Е. В. Четвериной, О. В. Трофимовым, А. В. Кравченко, Е. А. Узловой.

Автор искренне благодарит сотрудников лаборатории: В. И. Угарова, Т. Р. Саматова, Н. Н. Васильева, 3. К. Тнимова, 3. В. Валину, Д. С. Копеина,

A. А. Гордеева, И. А. Дё, А. С. Коновалова, Ю. А. Заболотневу и технический персонал, за помощь в планировании и проведении экспериментов, моральную поддержку, создание дружеской атмосферы, обучение и критичное обсуждение результатов.

Автор благодарен сотрудникам НИИ детской гематологии Минздрава РФ

B. О. Бобрыниной и М. А. Масчану - за предоставление образцов пациентов, больных острым миелоидным лейкозом, ассоциированным с транслокацией t(8;21).

Автор благодарен научному директору ЗАО «Синтол» Я. И. Алексееву за совместную работу в области применения олигонуклеотидов, имеющих LNA-производные.

Особую признательность автор выражает своим научным руководителям А. Б. Четверину и Е. В. Четвериной за искренний интерес, постоянное участие, подробное обсуждение работы на семинарах, помощь в написании диссертации и прекрасную школу научной работы.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

СПОСОБЫ ВЫЯВЛЕНИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ РНК

Молекулы РНК содержатся в клетках всех живых организмов, а также во многих вирусах, и выполняют разнообразные функции. В частности, образование мРНК является первым этапом экспрессии генов и первым шагом на пути реализации функции, запрограммированной в геноме организмов. Изменение экспрессии генов находится в основе регулирующих механизмов, которые контролируют клеточные процессы, контролируя нашу жизнь. Высшие эукариоты содержат > 40 ООО генов (Lewin 2004), из которых около 15%, как считается, экспрессируются в какой-либо отдельной клетке, чтобы обеспечить такие разнообразные жизненные процессы, как развитие и дифференцировку, гомеостаз, ответ на повреждение, регуляцию клеточного цикла, старение, запрограммированную клеточную смерть и рак.

Для изучения изменения клеточных процессов следят за появлением или изменением количества определенных РНК. Поскольку большая часть мРНК представлена в клетке в малом количестве (2-100 копий) (Soares et al. 1994, Holstege et al. 1998), то предпочтение отдаётся методам, обладающим высокой чувствительностью и специфичностью. Чувствительность и специфичность особенно важны при выявлении вирусных РНК или РНК-онкомаркеров в диагностических целях.

Существует большое число подходов выявления и оценки количества РНК, среди них методы прямого выявления РНК, а также методы, полагающиеся на определение ДНК-копии этой РНК.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Фалалеева, Марина Витальевна

выводы

1. Разработаны способы выделения нуклеиновых кислот из цельной крови, обеспечивающие близкий к 100% выход РНК и ее освобождение от ингибиторов обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции.

2. Оптимизирована реакция обратной транскрипции (ОТ) в присутствии большого количества посторонних нуклеиновых кислот. Выход кДНК при использовании специфического праймера увеличен до 50% от количества РНК-матрицы.

3. Показано, что с помощью полинуклеотидфосфорилазы Thermus thermophilus (Tth-ПНФазы) можно полностью разрушить РНК даже с прочной вторичной структурой. В то же время, РНК можно защитить от Tth-ПНФазы комплементарным олигонуклеотидом либо З'-концевой модификацией.

4. Установлено, что частота ложной рекомбинации РНК при ОТ in vitro превышает Ю-5 на 1 нуклеотид и не зависит от того, обладает ли обратная транскриптаза активностью РНКазы Н.

5. Показано, что ложную рекомбинацию РНК при ОТ можно понизить в 100 или более раз с помощью каждого из следующих способов:

- избирательной деградации одного из субстратов рекомбинации Tth-ПНФазой;

- проведения обратной транскрипции в геле;

- понижения концентрации обратной транскриптазы.

6. С помощью разработанных способов подавления ложной рекомбинации РНК при ОТ удалось размножить практически в отсутствие селекции и изучить продукты рекомбинации РНК, катализируемой QP-репликазой (РНК-зависимой РНК-полимеразой бактериофага QP). Установлено, что продукт рекомбинации, включающий оба субстрата рекомбинации целиком, выявляемый при размножении с помощью QP-репликазы как минорный, на самом деле является основным.

7. С помощью разработанных способов выделения нуклеиновых кислот, оптимизированной обратной транскрипции и размножения кДНК в виде молекулярных колоний продемонстрирована возможность специфического выявления РНК-онкомаркера или вирусной РНК с чувствительностью две молекулы РНК-мишени в 100 мкл цельной крови.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фалалеева, Марина Витальевна, Москва

1. Гмыль А.П., Агол В.И. 2005. Многообразие механизмов РНК-рекомбинации. Молекуляр. биология, 39, 618—632.

2. Кравченко А.В., Четверина Е.В., Четверин А.Б. 2006. Сохранность нуклеиновых кислот в гуанидинтиоцианатных лизатах цельной крови. Биоорган, химия, 32, 547-551.

3. Четверин А.Б. 1998. Бактериофаг QP как объект молекулярной биологии. Успехи Биол. Хим., 38, 3—75.

4. Четверин А.Б., Саматов Т.Р., Четверина Е.В. 2006. Бесконтактные способы обнаружения молекулярных колоний, наборы реагентов и устройство для их осуществления. Заявка на патент РФ № 2006109271.

5. Четверин А.Б., Четверина Е. В. 2002. Точная диагностика с помощью молекулярных колоний. Молекуляр. биология, 36, 320—327.

6. Четверин А.Б., Четверина Е.В. 1995. Способ размножения нуклеиновых кислот, способ их экспрессии и среда для их осуществления. Патент РФ № 2048522.

7. Четверин А.Б., Четверина Е.В. 1995. Способ размножения нуклеиновых кислот, способ их экспрессии и среда для их осуществления. Патент РФ № 2048522.

8. Четверин А.Б., Четверина Е.В. 1998. Способ диагностики нуклеиновых кислот. Патент РФ № 2114915.

9. Четверин А.Б., Четверина Е.В. 1998. Способ клонирования нуклеиновых кислот. Патент РФ № 2114175.

10. Четверин А.Б., Четверина Е.В. 2003. Преодоление проблем ПЦР-диагностики с помошью метода молекулярных колоний. Молекляр. медицина, 2, 30—40.

11. Четверина Е.В. и Четверин А.Б. 2008. Наноколонии: обнаружение, клонирование и анализ индивидуальных молекул. Успехи Биол. Химии, 48, 3—64.

12. Al-Soud A., Radstrom Р. 1998. Capacity of nine thermostable DNA polymerases to mediate DNA amplification in the presence of PCR-inhibiting samples. Appl. Environ. Microbiol, 64, 3748-3753.

13. Agranovsky A. 1992. Exogenous primer-independent cDNA synthesis with commercial reverse transcriptase preparations on plant virus RNA templates. Anal. Biochem., 203,163-165.

14. Alberts В., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D. 1994. Molecular Biology of the Cell, edn. 3. NY: Garland Publishing.

15. Alimov A.P., Khmelnitsky A.Y., Simonenko P.N., Spirin A.S. and Chetverin A.B. 2000. Cell-frees and affinity isolation of proteins on a nanomole scale. BioTechniques, 28, 338344.

16. Al-Soud, W. A., Radstrom, P. 2001. Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells. J. Clin. Microbiol., 39, 485—493.

17. Alwine J.C., Kemp D.J., Stark G.R. 1977. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74(12), 5350-5354.

18. Andras S.C., Power J.B., Cocking E.C., Davey M.R. 2001. Strategies for signal amplification in nucleic acid detection. Mol. Biotechnol., 19(1), 29-44.

19. Asou H., Tashiro S., Hamamoto K., Otsuji A, Kita K, Kamada N. 1991. Establishment of a human acute myeloid leukemia cell line (Kasumi-1) with 8;21 chromosome translocation. Blood. 77(9), 2031-2036.

20. Baltimore D. 1970. RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature, 27, 1209-1211.

21. Baltimore D., Smoler D. 1971. Primer Requirement and Template Specificity of the DNA Polymerase of RNA Tumor Viruses. Proc. Nat. Acad. Sci., 68, 1507—1511.

22. Battula N., Loeb L.A. 1975. On the fidelity of DNA replication. Characterization of polynucleotides with errors in base-pairing synthesized by avian myeloblastosis virus deoxyribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem., 250(12), 4405—4409.

23. Bengtsson M., Karlsson H.J., Westman G., Kubista M. 2003. A new minor groove binding asymmetric cyanine reporter dye for real-time PCR. Nucleic Acids Res., 31(8), e45.

24. Bermudez-Cruz R.M., Garci'a-Mena J., Montanez C. 2002. Polynucleotide phosphorylase binds to ssRNA with same affinity as to ssDNA. Biochimie 84, 321—328.27